JP2016512345A - 多重化組織用のデジタル的に強化された顕微鏡 - Google Patents
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Abstract
Description
[0001] 本願は、2013年9月13日に出願された米国通常出願第14,027,093号、および2013年3月12日に出願された米国仮特許出願第61/778,093号の恩恵を主張する。これらの出願をここで引用したことにより、その内容全体が本願にも含まれるものとする。
技術分野
[0002] 本開示は、組織学用のコントラストが強調された顕微鏡に関する。特に、本技術は、顕微鏡、デジタル強調、色再分類、および/または試料の画像/ビデオのデジタル処理に関する。
[0046] 別段注記されなければ、技術用語は、従来の使用にしたがって使用されることとする。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes VII(遺伝子VII)、published by Oxford University Press, 2000 (ISBN 019879276X)、Kendrew et al. (eds.)、 The Encyclopedia of Molecular Biology(分子生物学の百科事典)、 published by Blackwell Publishers, 1994 (ISBN 0632021829)、および Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference(分子生物学およびバイオテクノロジ:総合的添付文書集)、published by Wiley, John & Sons, Inc., 1995 (ISBN 0471186341) 、ならびに他の同様の参考文献に見出すことができる。
[0052] 「増幅共役体」とは、例えば、ハプテン−チラミド共役体のような、ハプテンに結合された潜在反応種を含む分子を指す。増幅共役体は、例えば、ハプテンに特異的に結合するアンチハプテン抗体のような、特異的な結合対のメンバとして作用することができる。増幅の態様(aspect)は、1つの酵素が多数の反応種を生成できるように、反応種に酵素によって変換される潜在反応種に関する。米国特許第7,695,929号を参考に挙げる。
[0059] 「誘導体」は、1つの原子または原子のグループを他の原子または原子のグループと置き換えることによって、同様の化合物から得られる化合物を指す。
[0064] 「ハプテン」は、抗体と特異的に結合することができるが、通例では、それ自体では免疫原性であることが実質的にできない分子、通例では、小さい分子を指す。
[0067] 「部分」とは、分子の断片、または共役体の一部を指す。
[0068] 「着目分子」または「ターゲット」とは、各々、存在、位置、および/または濃度が決定される分子を指す。着目分子の例には、タンパク質および核酸シーケンスが含まれる。
[0076] 「TMR」とは、テトラメチルローダミン、赤みがかったローダミン発色団を指す。「TSA」は、チラミド信号増幅を指す。
II.撮像システムおよび撮像技法
[0078] 図1は、一実施形態にしたがって試料支持顕微鏡スライド134上に配置された試料を撮像するための撮像システム100の正面図である。撮像システム100は、顕微鏡110、マルチスペクトル撮像装置112(「撮像装置112」)、およびディスプレイ114を含むことができる。撮像装置112は、画像キャプチャ・デバイス120、および処理デバイス122を含むことができる。画像キャプチャ・デバイス120は、顕微鏡110上に装着され、処理デバイス122と通信することができる。レンズ128、130は、ディスプレイ114がIHC、ISH等について着目特徴(関心のある特徴)間でコントラストを強める出力144を表示する間に、生体試料を直接視認するために使用することができる。着目特徴は、ターゲット(例えば、核酸、抗原等)、標識(例えば、発色標識、蛍光標識、発光標識、放射測定標識等)、あるいは細胞成分または構造とすることができる。
III.スキャナ付き撮像システム
[00113] 図8は、開示する技術の実施形態による、組織試料を分析するためのコンピュータ・ベース・システム300および環境を示す。システム300は、マルチスペクトル撮像装置310の形態としたデジタル・スキャナ、およびクライアント・コンピュータ・システム320を含む。試料支持顕微鏡スライドを撮像装置311に装填することができ、撮像装置311は、試料支持顕微鏡スライドの狭い波長帯または波長の撮像、明視野撮像、および/または蛍光撮像に備えることができる。狭い波長帯または波長の撮像では、撮像装置311は、図1〜図4に関連付けて論じた方法を実行するために、照明装置312およびスキャナ・ヘッドを含むことができる。更に、撮像装置311は、ホール・スライド・スキャナであってもよい。ホール・スライド・スキャナの一例は、本願の譲受人であるVentana Medical Systems, Inc. (ベンタナ・メディカル・システムズ社)(Tucson, AZ)のVENTANA iScan HT製品を多数の光源を含む照明装置(例えば、図3の照明装置140)で変更したものとすることができる。撮像システム310は、スライド・ハンドラ・メカニズム318を含むことができる。スライド・ハンドラ・メカニズム318は、1つ以上の顕微鏡スライドをマルチスペクトル撮像装置に送るように移動可能であり、更に1つ以上の顕微鏡スライドをマルチスペクトル撮像装置311から取り出すように移動可能である。スライド・ハンドラ・メカニズム318は、種々の場所の間で顕微鏡スライドを移送することができる、1つ以上のロボット・アーム、XYZスライド・ハンドラ、把持メカニズム、移送デバイス等を含むことができる。画像は、直接接続(図示せず)によって、またはネットワーク330を介して、クライアント・コンピュータ・システム320に送ることができる。クライアント・コンピュータ・システム320は、画像を、病理医、組織技師(histotechnologist)等のようなユーザに表示する。
IV.サンプルにおいてターゲットを検出する技法
[00118] 本明細書において開示する撮像システムは、IHC、ISH、または他の分析に使用される広範囲の染料によって染色された組織サンプルの強調デジタル画像を供給することができる。種々の実施形態において、組織サンプルに適用される物質は、限定ではなく、染料、湿潤剤、プローブ、抗体(例えば、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体等)、抗原回復流体(例えば、水性または非水性系抗原光源緩衝液(retrieval solutions)、抗原光源回復緩衝剤(buffer)等)、溶剤(例えば、アルコール、リモニン等)等を含むことができる。染料は、限定ではなく、染料(dye)、ヘマトキシリン染料、エオジン染料、ハプテン、酵素、または蛍光部分のような検出可能な標識がある抗原または核酸の共役体、あるいは色を分与するためおよび/またはコントラストを強調するための他のタイプの物質を含み、更に、物質は、抗原緩衝のため、または視覚的検査、蛍光可視化、顕微鏡検査等のための試料を準備するための他のタイプのプロトコル(例えば、免疫組織化学プロトコル、イン・サイチュー・ハイブリダイゼーション・プロトコル等)とすることができる。非限定的な染料、共役体、シグナリング共役体、増幅共役体、発色団部分、色原体、プローブ、対比染色法、および組成の例について、以下で論ずる。
方法
[00127] 生体サンプルにおいてターゲットを検出する方法は、生体サンプルを検出プローブと接触させ、生体サンプルを標識共役体と接触させ、更に生体サンプルをシグナリング共役体と接触させるステップを含むことができる。図9は、ターゲットを検出するためのフローチャートである。具体的には、この方法は、サンプルを検出プローブ(1つまたは複数)と接触させるステップ401を含む。このステップは、1つの検出プローブ、または複数の異なるターゲットに特異的な複数の検出プローブのいずれかを含むことができる。続くステップ402は、サンプルを標識共役体と接触させる動作を含む。更に続くステップ407は、サンプルをシグナリング共役体と接触させる動作を含む。サンプルを増幅共役体と接触させるステップ403、およびサンプルを副標識共役体と接触させるステップ405への破線(dashed line)は、これらのステップが任意であることを表す。サンプルを酵素抑制剤と接触させるステップ410への破線は、多重化手法にしたがって多数のターゲットを検出するために任意のループを使用できることを示す。特定の開示する実施形態では、酵素抑制剤が生体サンプルに添加される1つ以上のステップが使用されてもよい。例えば、2つ以上のシグナリング共役体がサンプルに添加される実施形態では、1つのシグナリング共役体が共有結合的に付着された後で、第2の異なるシグナリング共役体が添加される前に、あらゆる残留酵素活動を抑制するまたは排斥するために酵素抑制剤(例えば、ペルオキシダーゼ抑制剤)を添加することができる。
発色対蛍光
[00138] 本明細書において開示する実施形態は、発色および蛍光検出に使用することができる。発色検出と蛍光検出との間の差を、図13(A)および図13(B)に図式的に示す。図13(A)は、赤色原体例451、青色原体例453、ならびに赤および青多重化色原体例452を示す。色原体が光に露出されると(即ち、P0の入射パワーを有する光に露出される)、色原体は、種々の波長を吸収することによって、光と相互作用する。例えば、光源180a〜dまたは他の光源/照明装置によって光を放出することができる。色原体の吸光度、および存在する色原体の量に応じて、透過光は特定のパワー(図13(A)のP1、P2、およびP3)を有する。検出イベントが良い程、多くの色原体が付着され、より多くの光を吸収し、観察される信号が小さくなる。着色色原体についてでも、透過光の減少は、最終的に、色原体が暗くまたは黒く現れる原因となる。何故なら、光が透過しないからである。赤および青多重化色原体例452に示されるように、多重化は、この効果を悪化させることが多い。従前からの赤色原体および青色原体が空間において重複すると、吸光度が広くなり、検出イベントは、P1およびP2よりも小さいP3信号によって例示されるように、黒っぽくそして暗く現れる。本質的に、重複する信号による発光検出は、減算的な効果を生ずる可能性がある。これは、図13(B)に示される蛍光とは対照的である。図13(B)を参照すると、紫蛍光体例462、緑蛍光体例463、ならびに紫および緑多重化蛍光体例462が示されている。励起光(図ではλexとして示す)が、蛍光体461、462、463と相互作用することができ、発光を生ずることができる。励起光は、3つの例にわたって同一とすることができ、461はλf1(紫蛍光)を呈し、463はλf2(緑蛍光)を呈し、462はλf1(紫蛍光)よびλf2(緑蛍光)を呈する。サンプル上に付着する蛍光体が多い程、強い蛍光信号が生成される。同様に、多重化のシナリオでは、蛍光体には加算的影響があり、一方発色団では減算的効果が生ずる。この減算的特徴対加算的特徴は、色原体を使用する多重化の難しさを著しく激化させる。本明細書において開示する撮像システムは、発色検出および蛍光検出に使用することができ、擬似色複合画像を使用することによって、信号の色知覚を強化することができる。例えば、図1の照明装置140は、蛍光検出のために、スライドの前側に配置することができる。
検出および照明
[00139] シグナリング共役体は、検出可能な信号を供給し易くする種々の特性を提供するように構成される。シグナリング共役体は、明視野信号を供給するのに適した発色団部分を含むことができる。発色団部分が明視野信号を供給する場合、信号を視覚的に検出するために明視野顕微鏡を使用することができる。また、信号の検出を容易にするために、デジタル処理を使用することもできる。例えば、本明細書において開示する発色団は、本明細書において開示するターゲットを視覚的に検出するのに適した光信号を生成するように選択することができる。特定の開示する実施形態では、発色団は、以下で論ずるような、シグナリング共役体が所望の信号を供給するように構成することを可能にする光学的プロパティを有する。
ISH三色ブレーク・アパート・プローブ
[00152] シグナリング共役体は、特に、多重化検定、および転座プローブを使用する検定には有用となることができる。図16(A)は、非小細胞肺癌に関連付けられたALK再配列に対する肺組織検査の切片上における2つの遺伝子プローブの二重染色の明視野顕微鏡写真であり、図16(B)は、エチル・アセテート溶液におけるファスト・レッドおよびファスト・ブルーのUV−Visスペクトルである。3’プローブが、ファスト・レッドを使用して検出され、5’プローブがファスト・ブルーを使用して検出された。図17(A)および図17(B)は、図16(B)のトレースを別々に示す。図16(B)は、ファスト・レッドおよびファスト・ブルーが広く明確なスペクトル吸収特性を有することを示す。ファスト・レッドは、約475nmおよび約560nmの間で強い吸収を示す。この範囲をカラー・ホイールと比較すると、スペクトル吸収特性に対応する予想色は、赤またはオレンジのいずれかとなる。この吸収範囲は非常に広いので、赤またはオレンジ・カラーになると予想する波長の全てを本質的に覆う。ファスト・ブルーは、約525nmおよび約625nmの間に強い吸収を呈し、ファスト・レッドよりも更に広い範囲である。再度図14(A)のカラー・ホイールを参照すると、525〜625nmの吸収は、カラー・ホイールのほぼ半分を覆い、青、インディゴ、および紫は補色となる。ファスト・レッドとファスト・ブルーとの間のコントラストを強調するために、光源はファスト・レッドを撮像するために475nm〜560nmの波長を放出することができ、他の光源は、ファスト・ブルーを撮像するために525〜625nm内の波長を放出することができる。強調画像(図示せず)は、吸収に基づいて生成することができる。
照明
[00155] 当業者によって通例使用されるような、従前の白色光源およびフィルタ・システムを使用することができる。例えば、図1の照明装置140は、白色光源およびフィルタを含み、1組の単色画像を生成することができる。単色画像の色は、再定義し、組み合わせて強調デジタル画像を生成することができる。他の開示する実施形態では、図3に関連付けて論じたように、より狭い照明光を生成するために、検出ステップにおいてLED光源を使用してもよい。このような光源は、1つ以上の異なるシグナリング共役体が使用される実施形態において、特に3つ以上の異なる共役体が使用されるときに、使用されるとよい。LED抗原は、開示されるシグナリング共役体によって吸収することができる波長の範囲に柔軟性を与えることができる。特定の開示する実施形態では、シグナリング共役体は、色原体が吸収する波長の光で試料を照明することにより、こうして色原体が光背景に対して暗く見えるようにして、独立して可視化することができる(光は光原体によって吸収され、そのスポットにおける光強度を低下させる)。例えば、図5(A)の試料を照明する光は、色原体210によって吸収され、色原体210が比較的暗く見える結果となる。特定の開示する実施形態では、色原体によって吸収されない光で試料を照明すると、色原体を「消失」させる。何故なら、 光の強度が色原体スポットを通過するときに変化させられない(吸収されない)からである。例えば、図5(A)の試料を照明する光は、色原体211によって吸収されない。つまり、色原体211は、色原体210と比較すると、比較的明るく見える。組織特徴は、何らかの透過損失の原因になることもあり、光を吸収しない組織特徴が可視化される結果となる。単なる一例として、生体サンプル・スライドを緑色光で照明すると、ローダミン色原体が暗く見える原因となり、一方Cy5色原体は消える。逆に、赤色光でスライドを照明すると、Cy5色原体が暗く見える原因となり、ローダミン色原体が消える原因となる。
チロシン強調
[00158] チラミド信号増幅および本明細書において説明するシグナリング共役体は、サンプルからおよびまたはターゲットを検出し標識するために使用される分子/共役体から入手可能なチロシン残基と反応することができる。検出されるバイオマーカを包囲するタンパク質の量は、組織サンプル間における自然なばらつきに基づいて可変である。高いレベルで存在するバイオマーカを検出したとき、または多数のバイオマーカの同時局在を検出したとき、チラミド分子が付くことができるタンパク質の量は、付着プロセスにおける限界反応物質になる場合がある。組織におけるタンパク質の量が不十分であると、チラミドに基づく検出の拡散、バイオマーカの表現レベルをアンダーコールする(under-call)する潜在的可能性、および同時局在するバイオマーカの検出不能に至る可能性がある。これらの問題に対する1つの解決手段は、組織にタンパク質性溶液を塗布し、ホルマリンまたは他の固定手段を使用して、永続的にタンパク質を組織に架橋することによって、より多くのタンパク質結合部位(即ち、チロシン)を設けることである。
対比染色法
[00166] 対比染色法とは、1つ以上のターゲットを検出するためにサンプルが既に薬剤によって染色された後に、それらの構造が一層容易に可視化できるように、サンプルを後処理する方法である。例えば、対比染色法は、任意に、免疫組織化学染料を一層はっきりさせるために、封入処理の前に使用される。対比染色は主染色とは色が異なる。ヘマトキシリン、エオシン、メチル・グリーン、メチレン・ブルー、ギムザ、アルシアン・ブルー、およびヌクレア・ファースト・レッドというように、多数の対比染色が周知である。ある例では、1つよりも多い染料を互いに混合して、対比染料を生成することができる。これによって、柔軟性および染料を選択する能力が得られる。例えば、第1染料は、特定の属性を有するが、異なる所望の属性を有さない混合物のために選択することができる。第2染料は、所望の属性がなくなったことを表示する混合物に添加することができる。例えば、トルイジン・ブルー、DAPI、およびポンタミン・スカイ・ブルーを一緒に混合して対比染料を形成することができる。本開示の1つの態様は、当技術分野において周知の対比染色方法が、開示する方法および組成物と組み合わせることが可能であり、染色サンプルが読み手によって容易に解釈可能にすることである。
V.共役体
[00167] ここに開示するのは、開示するシステムおよび方法における使用に適した種々の異なる共役体である。本開示によって想定される共役体の種々のクラスについて、以下で説明する。広範囲の異なる共役体を多重化に使用することができる。
検出プローブ
[00168] 検出プローブは、サンプル、例えば、生体サンプルにおいてターゲットを検出するために使用することができる。検出プローブは、ターゲットに特異的に結合することができる特異的結合部分を含むことができる。検出プローブは、標識共役体によって検出を可能にする1つ以上の特徴を含む。代表的な検出プローブは、核酸プローブおよび主抗体プローブを含む。
ポドフィロトキシンおよびポドフィロトキシン誘導体によって例示されるシクロリグナン、ならびにその組み合わせを含むことができる。フルオレセイン誘導体(FITC、TAMRA、テキサス・レッド等)、ジゴキシゲニン(DIG)、5−ニトロ−3−ピラゾールカルバミド(ニトロピラゾール、NP)、4,5−ジメトキシ−2−ニトロシンナミド(ニトロシナミド、NCA)、2−(3,4−ジメトキシフェニル)キノリン−4−カルバミド(フェニルキノロン、DPQ)、2,1,3−ベンゾキサジアゾール−5−カルバミド(ベンゾフラザン、BF)、3−ヒドロキシ−2−キノキサリンカルバミド(ヒドロキシ・キノキサリン、HQ)、4−(ジメチルアミノ)アゾベンゼン−4’−スルホンアミド(DABSYL)、ロテノン・イソオキサゾリン(Rot)、(E)−2−(2−(2−オキソ−2,3−ジヒドロ−1H−ベンゾ[b][1,4]ジアゼピン−4−イル)フェノキシ)アセトアミド(ベンゾヂアゼピン、DB)、7−(ジエチルアミノ)−クマリン−3−カルボン酸(クマリン343、CDO)、2−アセトアミド−4−メチル−5−チアゾール・スルホンアミド(チアゾール・スルホンアミド、TS)、およびp−メトキシフェニルピラゾポドフィルアミド(ポド)。これらのハプテン、およびプローブにおけるこれらの使用については、米国特許第7,695,929号において更に詳細に記載されている。
標識共役体および副標識共役体
[00174] 例示的な実施形態では、標識共役体は、特異的に検出プローブに結合し、ターゲットに酵素で標識するように構成される。先に説明したように、第2種からまたはハプテンを含むように構成された検出プローブは、抗種抗体または抗ハプテン抗体のいずれかによって検出することができる。標識共役体を構成する1つの手法は、酵素を抗種または抗ハプテン抗体に直接結合することであった。この種の共役体は、種々のリンカを含んでも含まなくてもよく、米国特許第7,695,929号にも記載されている。標識共役体は、1つ以上の酵素を含む。酵素の例には、酸化還元酵素またはパーオキシダーゼを含む。シグナリング共役体は、潜在反応部分および発光部分を含む。酵素は、潜在反応部分の反応部分への変換に触媒作用を及ぼし、反応部分は、ターゲットに近接してまたは直接その上において、生体サンプルに共有結合的に結合する。
シグナリング共役体
[00176] 本明細書において開示する他のタイプの共役体にシグナリング共役体がある。シグナリング共役体は、本明細書において説明する方法にしたがって、ターゲットを検出するために使用される、検出可能な信号を供給する。特定の開示する実施形態では、シグナリング共役体は潜在反応部分および発色団部分を含む。
発色団部分
[00180] 発色団部分は、一般に、その色に関与する分子の部分として説明される。色が発生するのは、分子が可視光のある波長を吸収し、他を透過または反射させるときである。発色団は、2つの異なる分子軌道間のエネルギ差が、可視スペクトルの範囲に入る分子内の領域であり、その領域と相互作用する可視光を吸収することができる。吸光度は、通常、その基底状態から励起状態への電子遷移に関連付けられる。可視スペクトル内において基底状態から励起状態へのエネルギ差を有する分子は、多くの場合、共役炭素構造である。これらの化合物では、電子は、多くの場合芳香系における、一連の交互する1つおよび二重結合によって作られる、拡張パイ軌道であるエネルギ・レベル間で遷移する。共通例には、種々の食品着色料、繊維用染料(アゾ化合物)、pHインディケータ、リコペン、β−カロチン、およびアントシアニンを含む。分子の構造は、エネルギ・レベルとなるパイ軌道の特性を分与する。通例、分子においてより非飽和な(多数の)接合によって共役系を延ばす、即ち、延長すると、吸収が長い方の波長にずれる傾向がある。ウッドワード・フィーザー則は、共役パイ結合系がある有機化合物において、紫外線−可視最大吸収波長を近似するために使用することができる。
[00184] 実際の実施形態は、通例、少なくとも1つのリンカ、チラミド、またはチラミド誘導体結合位置を有する融合A−D環系を含み、可能な1つの結合位置を以下に示す。
[00186] 本明細書における使用に適した他のクラスの発色部分は、ジアゾ含有色原体を含む。これらの特異的な発色団は、以下に示すような式を有する。
潜在反応部分
[00199] 潜在反応部分は、サンプルまたは他の検出成分と共有結合的に結合できる反応種を形成するために、触媒活動を受けるように構成される。触媒活動は、1つ以上の酵素(例えば、酸化還元酵素、およびホースラディッシュ・ペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼ酵素)によって駆動される。ペルオキシドがあると、これらの酵素は反応種の形成に対して触媒作用を及ぼす。これらの反応種、例えば、フリー・ラジカルは、それらの生成に近接する、即ち、酵素の近くにあるフェノール類と反応することができる。サンプルにおいて入手可能なフェノール類は、多くの場合、タンパク質内部にあるチロシル残基である。したがって、ペルオキシターゼ酵素およびペルオキサイド(例えば、過酸化水素)の存在下で潜在反応部分をタンパク質含有サンプルに添加することができる。ペルオキシターゼ酵素およびペルオキサイドは、ラジカル形成に対して触媒作用を及ぼし、続いて反応部分に、生体サンプルとの共有結合を形成させることができる。
[00207] また、本明細書では、本明細書において開示した方法を実行することによって得られる信号を増幅するのに適した共役体も開示する。増幅共役体は、通例、潜在反応部分、検出可能な標識、および任意のリンカを含む。
VI.組成
[00210] 例示的な組成は、生体サンプルおよび複数のシグナリング共役体を含む試料とすることができる。特定の開示する実施形態では、組成は、可視化のために1つ以上の酵素標識ターゲットを含む生体サンプルを含む。ターゲットに標識するために使用される酵素は、酵素共役体のような標識共役体から発するのでよい。また、組成は1つ以上の検出プローブを更に含んでもよい。複数のシグナリング共役体は、本明細書において開示された通りであり、明視野信号を供給するように構成される。複数のシグナリング共役体は、1つ以上のターゲットに近接して、または直接その上に共有結合的に結合される。特定の開示する実施形態では、明視野信号を供給するように構成され、入射光の約5%以上を吸収することができるシグナリング共役体のために特異的な発色部分を選択することを含む。特定の開示する実施形態では、入射光の約20%が吸収されてもよい。
VII.キット
[00215] また、本明細書では、本明細書において開示した撮像システムと共に使用するためのシグナリング共役体を含むキットの実施形態も開示する。他の実施形態では、キットは検出プローブを含む。他の実施形態では、キットは標識共役体を含む。他の実施形態では、キットは増幅共役体および副標識共役体を含む。他の実施形態では、キットは更にペルオキシド溶液を含んでもよい。例示的な実施形態では、キットは検出プローブを含む。例示的な実施形態では、キットの試薬は、自動スライド染色プラットフォーム上での使用のために構成されたコンテナ内に封入される。例えば、コンテナは、BENCHMARK Series自動IHC/ISHスライド染色装置との使用のために構成されたディスペンサであってもよい。
VIII.結論
[00219] 本明細書において開示した技術は、生体サンプルの異なるタイプに対して使用することができる。生体サンプルは、被験者から取り出された1つまたは複数の組織サンプル(例えば、任意の細胞の集合体)とすることができる。組織サンプルは、有機体内において同様の機能を行う、相互接続された細胞の集合体とすることができる。生体サンプルは、 限定ではなく、細菌、酵母、原生動物、およびアメーバというような、単細胞有機体、多細胞生物(例えば植物または動物、健康であるかまたは見かけ上健康であるヒト被験体、あるいは診断または研究しようとする状態または疾患、例えば癌に罹患しているヒト患者由来のサンプルを含む)を含む、任意の生存有機体から得られるか、有機体によって排出されるかまたは分泌される、任意の固体または液体試料であってもよい。ある実施形態では、生体サンプルは、顕微鏡スライド上に載せることができ、限定ではなく、 組織の切片、臓器、腫瘍切片、塗抹標本、冷凍切片、細胞診プレップ(cytology prep)、または細胞株を含む。サンプルを得るためには、切開生検、コア生検、摘出生検、針吸引生検、コア針生検、定位生検、開創生検、または直視下生検を使用することができる。
Claims (32)
- 顕微鏡スライド上に位置する試料を撮像するためのマルチスペクトル撮像システムであって、
撮像装置であって、
前記試料の少なくとも一部を順次照明するために光を順次生成する複数の異なるカラー光源を含む照明装置と、
複数の試料画像を取り込むように位置付けられた画像キャプチャ・デバイスであって、各試料画像が、前記光源のそれぞれからの光に露出される前記試料に対応する、画像キャプチャ・デバイスと、
コントラスト強調色画像データおよび/またはスペクトル的にデコンボリュートされた画像データを、前記画像キャプチャ・デバイスによって取り込まれた前記試料画像に基づいて生成するように構成された処理デバイスと、
を含む、撮像装置と、
前記試料から前記画像キャプチャ・デバイスまで延びる光路に沿って位置付けられた少なくとも1つのレンズと、
前記撮像装置と通信し、前記試料のコントラスト強調出力および/またはスペクトル的にデコンボリュートされた出力を、前記処理デバイスからの前記コントラスト強調色画像データおよび/またはスペクトル的にデコンボリュートされた画像データに基づいて表示するように構成されたディスプレイと、
を含む、マルチスペクトル撮像システム。 - 請求項1記載のマルチスペクトル撮像システムであって、更に、前記顕微鏡スライドを保持するホルダ・デバイスと、前記少なくとも1つのレンズと、前記ディスプレイが前記試料のコントラスト強調出力および/またはスペクトル的にデコンボリュートされた出力を表示する間、ユーザが前記試料を見ることができる少なくとも1つの接眼レンズとを含む顕微鏡を含む、マルチスペクトル撮像システム。
- 請求項2記載のマルチスペクトル撮像システムにおいて、前記コントラスト強調出力が、2フレーム/秒以上のフレーム・レートで表示されるビデオとなるように、前記処理デバイスが前記強調色画像データを出力するように構成される、マルチスペクトル撮像システム。
- 請求項1記載のマルチスペクトル撮像システムであって、更に、前記撮像装置とスライド・ホルダ・メカニズムとを含むデジタル顕微鏡スライド・スキャナを含み、前記スライド・ホルダ・メカニズムが、1つ以上の顕微鏡スライドを前記撮像装置に向けて送り出すように移動可能であり、更に1つ以上の顕微鏡スライドを前記撮像装置から取り出すように移動可能である、マルチスペクトル撮像システム。
- 請求項1記載のマルチスペクトル撮像システムにおいて、前記光源の各々が、少なくとも1つの発光ダイオードを含む、マルチスペクトル撮像システム。
- 請求項1記載のマルチスペクトル撮像システムにおいて、前記画像キャプチャ・デバイスが、前記光源のパルス動作と同期される、マルチスペクトル撮像システム。
- 請求項1記載のマルチスペクトル撮像システムにおいて、前記複数の異なる色光源が、
前記試料の1以上の第1着目特徴によって吸収される光を生成する第1光源と、
前記試料の1つ以上の第2着目特徴によって吸収される光を生成する第2光源であって、前記第1光源が、前記第2光源の第2平均波長とは異なる第1平均波長を有する、第2光源と、
を含む、マルチスペクトル撮像システム。 - 請求項7記載のマルチスペクトル撮像システムにおいて、前記処理デバイスが、前記試料が前記第1光源によって照明される間に前記画像キャプチャ・デバイスによって取り込まれる第1試料画像と、前記試料が前記第2光源によって照明される間に前記画像キャプチャ・デバイスによって取り込まれる第2試料画像とを格納する記憶デバイスを含み、前記処理デバイスが、前記試料の擬似色複合画像を生成するために、前記第1および第2試料画像の画像データをデジタル的に組み合わせるように構成される、マルチスペクトル撮像システム。
- 請求項1記載のマルチスペクトル撮像システムにおいて、前記複数の異なる色光源が、互いに異なるそれぞれの平均波長を有する少なくとも4つの光源を含む、マルチスペクトル撮像システム。
- 請求項1記載のマルチスペクトル撮像システムにおいて、前記照明装置が、互いに異なる平均波長を有する複数のエネルギ放出を生成し、前記エネルギ放出の総数が、4から8までの範囲である、マルチスペクトル撮像システム。
- 請求項1記載のマルチスペクトル撮像システムにおいて、前記処理デバイスが、前記試料の4から10個のスペクトル的にデコンボリュートされた画像を生成し、前記スペクトル的にデコンボリュートされた画像に基づいて、前記試料の擬似色画像を生成する、マルチスペクトル撮像システム。
- 請求項1記載のマルチスペクトル撮像システムにおいて、前記処理デバイスが、(a)前記試料の第1着目特徴と(b)前記試料の第2着目特徴との間でコントラストを強調するように構成され、
前記第1着目特徴が第1色原体または第1蛍光体を含み、
前記第2着目特徴が第2色原体または第2蛍光体を含む、マルチスペクトル撮像システム。 - 請求項1記載のマルチスペクトル撮像システムにおいて、前記光源の各々が、1つ以上の発光ダイオードを含み、前記画像キャプチャ・デバイスが、前記試料の単色画像を供給するように構成され、前記処理デバイスが、前記単色画像に基づいて擬似色画像を生成する、マルチスペクトル撮像システム。
- 請求項1記載のマルチスペクトル撮像システムにおいて、前記処理デバイスが、前記試料画像から生成された前記試料の擬似色複合画像を生成するように構成される、マルチスペクトル撮像システム。
- 請求項1記載のマルチスペクトル撮像システムにおいて、前記処理デバイスが、前記ディスプレイ上で見るために、毎秒10フレーム以上のフレーム・レートでマルチカラー画像を生成するように構成される、マルチスペクトル撮像システム。
- 請求項1記載のマルチスペクトル撮像システムにおいて、前記画像キャプチャ・デバイスが単色カメラを含む、マルチスペクトル撮像システム。
- 顕微鏡スライド上に位置する試料を撮像するためのコンピュータ・ベース撮像システムであって、
プログラム命令のシーケンスを格納するメモリと、
前記プログラム命令を実行するように構成された回路を有するプログラマブル・プロセッサと、
を含み、前記プログラム命令が、前記プログラマブル・プロセッサに、
少なくとも1つの第1着目特徴と相互作用するために第1波長または第1波長帯における光に露出される前記試料の第1画像を受けさせ、
少なくとも1つの第2着目特徴と相互作用するために第2波長または第2波長帯における光に露出される前記試料の第2画像を受けさせ、前記第2波長または前記第2波長帯が、それぞれ、前記第1波長または前記第1波長帯とは異なり、
前記少なくとも1つの第1着目特徴と前記少なくとも1つの第2着目特徴との間で色コントラストを強調するために、前記第1画像および前記第2画像に基づいて、前記試料の色画像を生成させる、コンピュータ・ベース撮像システム。 - 請求項17記載のコンピュータ・ベース撮像システムにおいて、前記メモリが、
前記第1画像を第1擬似色画像に変換し、
前記第2画像を第2擬似色画像に変換するために、
前記回路によって実行可能な変換命令を格納し、
前記生成された色画像において、前記第1着目特徴がある場合、および前記第2着目特徴がある場合、これらの間の色コントラストが、前記第1着目特徴と前記第2着目特徴との間の自然な色コントラストよりも大きい、コンピュータ・ベース撮像システム。 - 請求項18記載のコンピュータ・ベース撮像システムにおいて、前記色画像を生成する動作が、前記第2擬似色画像からの第1擬似色データと、前記第2擬似色画像からの第2擬似色データとを組み合わせる動作を含む、コンピュータ・ベース撮像システム。
- 請求項19記載のコンピュータ・ベース撮像システムにおいて、前記生成された色画像が、前記試料の擬似色画像である、コンピュータ・ベース撮像システム。
- 請求項19記載のコンピュータ・ベース撮像システムにおいて、前記第1および第2着目特徴が、1つ以上の蛍光体または染色体を含む、コンピュータ・ベース撮像システム。
- 請求項18記載のコンピュータ・ベース撮像システムにおいて、前記回路が、前記プログラマブル・プロセッサに、追加の波長および/または波長帯に露出された前記試料に対応する前記試料の少なくとも2つの追加画像を受け取らせる前記プログラム命令を実行し、
前記試料の色画像を生成する動作が、前記試料の第1画像と、前記試料の第2画像と、前記試料の少なくとも2つの追加画像とを組み合わせる動作を含む、コンピュータ・ベース撮像システム。 - 顕微鏡スライドによって運ばれる試料を撮像する方法であって、
前記試料が第1ピーク波長または第1波長帯における光に露出される間に前記試料の第1画像を取り込むステップであって、前記第1ピーク波長または前記第1波長帯が前記試料の第1着目特徴の第1吸収波長または第1吸収波長帯に対応する、ステップと、
前記第1画像を取り込んだ後、前記試料が第2ピーク波長または第2波長帯における光に露出される間に、前記試料の第2画像を取り込むステップであって、前記第2ピーク波長または前記第2波長帯が、前記試料の第2着目特徴の第2吸収波長または第2吸収波長帯に対応する、ステップと、
前記第1画像および前記第2画像に基づいて擬似色画像を生成するステップと、
を含む、方法。 - 請求項23記載の方法において、前記擬似色画像を生成するステップが、
前記第1画像を第1擬似色画像に変換するステップと、
前記第2画像を第2擬似色画像に変換するステップと、
前記第1擬似色画像と前記第2擬似色画像とを組み合わせるステップと、
を含む、方法。 - 請求項23記載の方法において、前記擬似色画像を生成するステップが、前記第1画像と前記第2画像とを組み合わせるステップを含み、前記第1画像および前記第2画像がスペクトル的に離散する画像である、方法。
- 請求項23記載の方法において、前記擬似色画像を生成するステップが、前記第1画像と、前記第2画像と、前記試料が光に露出される間に取り込まれる追加の画像とを組み合わせるステップを含む、方法。
- 顕微鏡スライドによって運ばれる試料のコントラスト強調撮像方法であって、
複数の光源からの光に試料の少なくとも一部を順次露出するステップであって、前記光源の各々が、前記試料のそれぞれの着目特徴が吸収することができる平均波長を出力する、ステップと、
前記試料の複数の画像を取り込むステップであって、前記取り込まれた画像が、個々に、前記光源のそれぞれからの光に露出された前記試料に対応する、ステップと、
前記複数の取り込まれた画像に基づいて擬似色画像データを生成し、前記擬似色データが、異なる着目特徴間で色コントラストが強調された、前記試料の擬似色画像を表す、ステップと、
を含む、方法。 - 請求項27記載の方法において、前記試料の光に順次露出するステップが、
第1色光源からの光に前記試料を露出するステップと、
前記第1色光源によって照明された前記試料の第1試料画像を取り込むステップと、
前記第1試料画像を取り込んだ後、第2色光源からの光に前記試料を露出するステップと、
前記第2色光源によって照明された前記試料の第2試料画像を取り込むステップと、
を含む、方法。 - 請求項28記載の方法において、前記第1色光源が第1ピーク波長を有し、第2色光源が、前記第1ピーク波長とは異なる第2ピーク波長を有する、方法。
- 請求項27記載の方法であって、更に、前記擬似色画像における1つ以上のターゲットにした特徴のユーザの視覚的知覚を高めるために、前記取り込まれた画像のスペクトル特性を再定義することによって、前記取り込まれた画像を処理するステップを含む、方法。
- 請求項30記載の方法において、前記取り込まれた画像が単色画像である、方法。
- 請求項30記載の方法であって、更に、前記取り込まれた画像のスペクトル・アンミキシングを実行するステップを含む、方法。
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