TW202340467A - 有用於治療c9orf72介導之病症之組成物及方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供者為有用於治療具有C9orf72患者之rAAV及其他載體及組成物，包含工程化hC9orf72編碼序列及至少一個miRNA編碼序列，其中該工程化人類C9orf72編碼序列在編碼的miRNA的靶位點中具有不同於患者中的內源性人類C9orf72的序列。亦提供用於治療與C9orf72相關的ALS、FTD及相關病症之方法。

Description

有用於治療C9ORF72介導之病症之組成物及方法
電子序列表引用
在此提交的電子序列表名稱為「UPN-18-8536TW.xml」(台灣申請案序列表的檔案名稱，中文本：PD1227626_Sequence.xml)；外文本：PD1227626_Foreign Sequence.xml)，大小為157,533位元組，創建於2023年1月5日，電子序列表的內容(例如，其中的序列和文字)在此全部藉由引用而併入。
本文提供有用於治療具有C9orf72的患者之rAAV及其他載體及組成物。亦提供用於治療與C9orf72相關的ALS、FTD及相關病症之方法。
肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis (ALS))為一種慢性進行性且致命的神經退化疾病，由上下運動神經元的退化所引起。其特徵為進行性肌肉無力和萎縮，最終導致呼吸衰竭。約5-50%的ALS患者有額顳葉癡呆症(frontotemporal dementia (FTD))的臨床症狀(Hudson, 1981, Amyotrophic lateral sclerosis and its association with dementia, parkinsonism and other neurological disorders：a review. Brain 104, 217-247. doi：10.1093/brain/104.2.217；Lomen-Hoerth et al., 2003, Are amyotrophic lateral sclerosis patients cognitively normal? Neurology 60, 1094–1097. doi：10.1212/01.wnl.0000055861.95202.8d)。FTD為第二種最常見的早發性癡呆形式，表現為額葉及/或顳葉萎縮，伴隨有性格及行為改變以及語言功能障礙。事實上，一部分罹患FTD的患者亦會發展為ALS。除了臨床重疊外，泛蛋白陽性tau陰性包涵體(TDP-43)(ubiquitin-positive tau-negative inclusion bodies (TDP-43))被認為是ALS及FTD病理學研究中的主要病理蛋白質(Neumann et al., 2006, Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science 314, 130-133. doi：10.1126/science.1134108)。於2011年，取得一項連結ALS和FTD的重大發現:C9orf72基因之擴展的GGGGCC六核苷酸重複序列為ALS/FTD的重要遺傳原因，約佔家族性ALS患者的40%，佔家族性FTD患者的25%，並且在家族性ALS/FTD患者中高達88%(DeJesus-Hernandez et al., 2011, Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron 72, 245–256. doi：10.1016/j.neuron.2011.09.011)。ALS和FTD存在顯著的臨床、遺傳及組織病理學的重疊；因此，它們被視為同一疾病連續區域的兩個極端。
需要的是有用於減輕C9orf72相關的ALS、FTD及相關病症之症狀、嚴重性及/或進展的治療。
本文提供用於治療具有與人類C9ORF72表現缺陷相關的症狀的患者及/或患有ALS或FTD的患者之病毒及非病毒載體和組成物。
於某些具體實施例中，提供一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含AAV衣殼及載體基因體。該rAAV包含：(a)編碼人類C9orf72的工程化核酸序列；(b)位於(a)與(c)之間的間隔子序列；(c)編碼至少一個miRNA序列的核酸序列，該miRNA序列對ALS或FTD患者的內源性人類C9orf72具有特異性，且該miRNA序列位於(a)和(b)序列的3’端；其中(a)的工程化核酸序列缺少所編碼的至少一種miRNA的靶位點，從而防止所編碼的miRNA靶向工程化的人類C9orf72編碼序列；及(c)可操作連接至(a)和(c)之調節序列。於某些具體實施例中，該AAV衣殼選自AAV9、AAVhu68、AAV1或AAVrh91。於某些具體實施例中，該間隔子長度為75個核苷酸至約250個核苷酸。於一態樣，提供一種載體，其包含可操作連接至調節序列的工程化人類C9orf72編碼序列，該調節序列指導其在人類標靶細胞中的表現。於某些具體實施例中，提供一種載體，其包含編碼至少一個髮夾miRNA的核酸序列，其中該編碼的miRNA對人類受試者中的內源性人類C9orf72具有特異性且可操作連接至指導其在受試者中表現的調節序列。於某些具體實施例中，載體或其他組成物包含工程化人類C9orf72編碼序列及至少一個miRNA的編碼序列兩者。於此種具體實施例中，該工程化C9orf72編碼序列缺少對於至少一個miRNA的靶位點，從而防止miRNA靶向工程化人類C9orf72編碼序列。
於某些具體實施例中，載體為一複製缺陷型病毒載體，其包含載體基因體，該載體基因體包含人類C9orf72編碼序列、至少一個miRNA的編碼序列及調節序列。於某些具體實施例中，該病毒載體為具有AAV衣殼的重組腺相關病毒(rAAV)粒，其具有包裝於其中的載體基因體。於某些具體實施例中，該AAV衣殼為AAVhu68、AAV1或AAVrh91。
於某些具體實施例中，提供一種載體，其包含工程化C9orf72編碼序列，該序列具有SEQ ID NO：13的核酸序列或與其至少90%相同的序列，條件為藉由編碼的miRNA靶向的核酸序列係不同於內源性人類C9orf72序列 。
於某些具體實施例中，組成物包含可操作連接至調節序列之編碼工程化人類C9orf72編碼序列的重組核酸序列(該調節序列指導該核酸序列在人類標靶細胞中的表現)以及可操作連接至調節序列之編碼至少一個對患者內源性人類C9orf72特異的miRNA的核酸序列(該調節序列指導其在受試者中的表現)，其中該工程化C9orf72編碼序列缺少對於編碼的至少一個miRNA的靶位點，從而防止miRNA靶向工程化C9orf72編碼序列。
於某些具體實施例中，一種醫藥組成物包含載體、rAAV、或組成物、及醫藥上可接受的水性懸浮液、賦形劑及/或稀釋劑。
於某些具體實施例中，提供一種治療患有C9orf72相關病症(例如，ALS或FTD)的患者的方法，其包含將有效量的載體、重組AAV或組成物遞送至有需要的患者。
於某些具體實施例中，提供一種治療患有C9orf72相關病症的患者之組合給藥方案，其包含共同投予： (a)可操作連接至調節序列的編碼工程化人類C9orf72編碼序列之重組核酸序列，該調節序列指導其在人類標靶細胞中的表現，其中該人類c9orf72編碼序列具有SEQ ID NO：13的序列或與其至少95%相同的序列且該序列不同於患者中的內源性人類c9，由於(b)的miRNA標靶序列中有錯誤配對(mismatch)， (b)對人類受試者中內源性人類c9序列特異性的至少一個miRNA，其中該mRNA可操作連接至指導其在受試者中表現的調節序列。
此等及其他優點將由下列發明詳細說明中顯而易見。
本文提供序列、載體及組成物，用於共同投予表現人類c9orf72蛋白質之核酸序列及編碼至少一個miRNA的核酸序列至患者，該miRNA特異性靶向人類C9orf72基因第一個內含子中內源性六核苷酸重複擴增的位點，該靶位點不存在於工程化C9orf72編碼序列上。適當地，工程化c9orf72編碼序列被工程化以移除miRNA的特定靶位點。本文提供新穎的工程化C9orf72及新穎的miRNA標靶序列。此等可單獨使用或彼此組合及/或與其他療法組合使用，用於治療C9orf72相關的ALS、FTD和相關病症。
如本文所使用，「內源性C9orf72」係指在人類中編碼C9蛋白質的C9orf72基因(染色體9開讀框72)。人類C9orf72基因位於染色體9開讀框72的短(p)臂，從鹼基對27,546,546至鹼基對27,573,866 (GRCh38)。其細胞遺傳學位置位於9p21. 2。此亦稱為C9orf72、染色體9開讀框72、ALSFTD、FTDALS、FTDALS1、DENNL72、C9orf72-SMCR8複合次單元、DENND9。C9orf72的功能異常與ALS、家族性FTD或相關病症有關。
於某些具體實施例中，功能性C9蛋白質具有SEQ NO：14之序列。然而，於某些具體實施例中，與SEQ ID NO：14的胺基酸序列具有小於100%同一性的蛋白質可藉由本文提供的組成物遞送(例如，與SEQ ID NO：14具有97%至100%同一性的ORF蛋白質)。
於一具體實施例中，提供之工程化C9orf72編碼序列具有SEQ ID NO：13之核酸序列或與SEQ ID NO：13約90%、至少95%相同的、至少97%相同的、至少98%相同的、或99%至100%相同的序列，其表現在非C9orf72相關的ALS及FTD患者中發現的人類C9蛋白質。參見例如，SEQ ID NO：14。
於某些具體實施例中，提供之工程化C9orf72編碼序列具有SEQ ID NO：13之核酸序列或與其至少90%相同的序列，當工程化編碼序列與miR487序列(包含至少5’側翼區、至少SEQ ID NO：15 (miR487)或與SEQ ID NO：15至少99%相同的序列、及3’側翼區)共同投予時，其中至少一個miRNA不與(a)之工程化C9orf72編碼序列或其編碼的傳訊RNA(mRNA)結合。於某些具體實施例中，5’側翼選自SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：22之序列。適合地，具有與SEQ ID NO：13同一性的序列表現相同蛋白質。
「5’ UTR」位於基因產物編碼序列起始密碼子的上游。該5’ UTR通常比3’ UTR短。一般而言，5’ UTR長度為約3個核苷酸至約200個核苷酸，但可選擇為更長。
「3’ UTR」位於基因產物編碼序列的下游，通常比5’ UTR長。於某些具體實施例中，3’ UTR長度為約200個核苷酸至約800個核苷酸，但可選擇為較長或較短。
如本文所使用，「miRNA」係指微小RNA(microRNA)，其為小的非編碼RNA分子，其調節mRNA並停止mRNA被轉譯成蛋白質。一般而言，形成髮夾的RNA具有自互補(self-complementary)的「主幹-環圈(stem-loop)」結構，其包括編碼具有雙鏈體(duplex)的主幹部分的單一核酸，該雙鏈體包含藉由環圈序列連接至反義股(例如，引導股(guide strand))的正義股(例如，隨從股(passenger strand))。隨從股及引導股共有互補性。於一些具體實施例中，隨從股及引導股共有100%互補性。於一些具體實施例中，隨從股及引導股共有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少99%互補性。隨從股及引導股可能由於鹼基對錯誤配對而缺少互補性。於一些具體實施例中，形成髮夾的RNA之隨從股及引導股具有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、或至少10個錯誤配對。一般而言，主幹的最初2-8個核苷酸(相對於環圈)被稱為「種子」殘基，在標靶識別及結合中扮演重要角色。主幹的第一個殘基(相對於環圈)被稱為「錨」殘基。於一些具體實施例中，形成髮夾的RNA在錨殘基處具有錯誤配對。如本文所使用，miRNA含有「種子序列」，其為藉由互補鹼基配對而與mRNA(例如，在內源性C9orf72中)特異性結合的核苷酸區域，導致mRNA的破壞或緘默化(silencing)。此種緘默化可能會造成內源性hC9orf72的向下調節而不是完全消除。除非另有指明，術語「miRNA」涵括人工微小RNA(amiRNA)，其為人工設計的。
「自互補核酸」係指由於核酸股中的核苷酸的互補性(例如鹼基配對)，而能夠與自身雜交(即，自身折疊)以形成單股雙鏈體結構的核酸。自互補核酸可形成多種二級結構，如髮夾環圈、環圈、凸起(bulge)、連接點(junction)及內部凸起。某些自互補核酸(例如，miRNA或AmiRNA)會進行調節功能，如基因緘默化。
本文提供的經編碼的miRNA已設計為特異性地靶向患有與C9ORF72相關病症諸如ALS或FTD的患者中的內源性人類C9orf72基因。於某些具體實施例中，miRNA編碼序列包含反義序列。
於某些具體實施例中，種子序列與表中描述的反義序列100%相同。於某些具體實施例中，種子序列位於成熟miRNA (5’至3’)且一般起始於miRNA之miRNA正義股的5'端起(正義(+)股的5'端起)的位置2至7、2至8、或約6個核苷酸，儘管其長度可能更長。於某些具體實施例中，種子序列的長度不少於miRNA序列的長度的約30%，其長度可為至少7個核苷酸至約28個核苷酸、長度可為至少8個核苷酸至約28個核苷酸、長度可為7個核苷酸至28個核苷酸、8個核苷酸至18個核苷酸、12個核苷酸至28個核苷酸、約20個至約26個核苷酸、約21個核苷酸、約24個核苷酸、或約26個核苷酸。於本文提供之例中，miRNA係以主幹-環圈miRNA前驅物序列的形式遞送，例如，長度為約50至約80個核苷酸、或約55個核苷酸至約70個核苷酸、或長度為60至65個核苷酸。於某些具體實施例中，此miRNA前驅物包含約5個核苷酸、約21個核苷酸種子序列、約19個核苷酸主幹環圈及約19個核苷酸正義序列，其中正義序列對應於具有一個或兩個錯誤配對的核苷酸的反義序列。適合的miRNA編碼序列之例為miR487序列(參見例如，於SEQ ID NO：17之載體基因體： 5’側翼(nt 3438)..(nt 3460)(SEQ ID NO：5之1-23)、miR487(nt 3461)..(nt 3524)、反義(nt 3466)..(nt 3486)、環圈(nt 3487)..(nt 3505)、正義(nt 3506)..(nt 3524)、及3’側翼(nt 3525)..(nt 3568)。亦參見SEQ ID NO：9。
於某些具體實施例中，核酸分子(例如，表現匣或載體基因體)可含有至少一個或多於一個之miRNA編碼序列。於某些具體實施例中，核酸分子(例如，表現匣或載體基因體)可含有SEQ ID NO：15 (miR487)之一個、二個或以上之miRNA編碼序列、或進一步包含側翼區的miR487(例如，SEQ ID NO：16)。於某些具體實施例中，核酸分子(例如，表現匣或載體基因體)可含有SEQ ID NO：15 (miR487，64 nt)之一個、二個或以上miRNA編碼序列或SEQ ID NO：16。
如本文所使用，「miRNA標靶序列」為位於DNA正向股(5’至3’)(例如，C9orf72之正向股)的序列且與miRNA序列(包括miRNA種子序列)至少部分互補。miRNA標靶序列對於編碼的轉基因產物的非轉譯區為外源的(exogenous)，且被設計為在需要抑制轉基因表現的細胞中被miRNA所特異性地靶向。不欲受限於理論，因為hC9orf72為一種普遍存在的蛋白質，且過度表現可能與毒性及/或其他負向副作用有關，miRNA優先靶向內源性hC9orf72基因，同時避免靶向被遞送至患者的工程化hC9orf72基因。更特別地，經由載體遞送的編碼hC9orf72的序列被設計為在靶位點含有改變的密碼子序列。
典型地，miRNA標靶序列係長度為至少7個核苷酸至約28個核苷酸，長度為至少8個核苷酸至約28個核苷酸，長度為7個核苷酸至28個核苷酸、8個核苷酸至18個核苷酸、12個核苷酸至28個核苷酸，約20至26個核苷酸、約22個核苷酸、約24個核苷酸、或約26個核苷酸，且其含有至少一個連續區域(例如，7或8個核苷酸)，其與miRNA種子序列互補。於某些具體實施例中，標靶序列包含與miRNA種子序列具有精確互補性(100%)或具有一些錯誤配對之部分互補性的序列。於某些具體實施例中，標靶序列包含至少7至8個核苷酸，其與miRNA種子序列100%互補。於某些具體實施例中，標靶序列由與miRNA種子序列100%互補的序列所組成。於某些具體實施例中，標靶序列含有與種子序列100%互補的序列之多個拷貝(例如，二或三個拷貝)。於某些具體實施例中，100%互補的區域包含標靶序列長度的至少30%。於某些具體實施例中，標靶序列的其餘部分與miRNA具有至少約80%至約99%的互補性。於某些具體實施例中，在含有DNA正向股的表現匣中，miRNA標靶序列為miRNA的反向互補序列。
如此，本文提供的序列與SEQ ID NO：13的變異C9編碼序列95%至99.9%相同，被設計以避免回復成構築體中選擇的miRNA所靶向的天然人類序列。較佳地，此等序列編碼與任何病症無關的天然功能性人類C9蛋白質。例如，此蛋白質可具有SEQ ID NO：14之序列或與SEQ ID NO：14約95至約100%相同、或至少97%、至少98%、或至少99%相同的序列。
於某些具體實施例中，miRNA優先靶向內源性hC9基因，同時避免靶向工程化hc9基因，其中內源性C9orf72同功型2核酸序列再現於SEQ ID NO：44且經編碼的蛋白質再現於SEQ ID NO：45[參見例如，NCBI NM_018325.4(C9orf72變異體2)及Ensembl ENST00000380003.8(C9orf72-203)]。於某些具體實施例中，miRNA編碼序列包含(i) 15或16之一或多者。於某些具體實施例中，工程化hC9核酸序列為SEQ ID NO：13。於某些具體實施例中，工程化hC9核酸序列為SEQ ID NO：13，其中存有1、2、3或4個核苷酸錯誤配對。
於某些具體實施例中，單一核酸(例如，表現匣或含有其之載體基因體)含有工程化hC9編碼序列及至少一個miRNA編碼序列兩者，其中該miRNA特異性地靶向在工程化hC9序列中不存在的內源性人類C9序列之區域。於某些具體實施例中，人類C9編碼序列為至少一個miRNA之上游(5’)且這二個元件被間隔子或連接子序列分開。於某些具體實施例中，hC9編碼序列的終止密碼子與最5'的miRNA編碼序列的起始之間至少有75個核苷酸。於某些具體實施例中，間隔子為約75個核苷酸至約300個核苷酸、或約75個核苷酸至約250個核苷酸、或約75個核苷酸至約200個核苷酸、或約75個核苷酸至約150個核苷酸、或約75個核苷酸至約100個核苷酸、或約80個核苷酸至約300個核苷酸、或約80個核苷酸至約250個核苷酸、或約80個核苷酸至約200個核苷酸、或約80個核苷酸至約150個核苷酸、或約80個核苷酸至約100個核苷酸。可選擇地，工程化hC9編碼序列及至少一個miRNA編碼序列被約75個核苷酸分開。適合地，間隔子序列為非編碼序列，其缺少任何限制酶位。可選擇地，間隔子可包括一或多個內含子序列。於某些具體實施例中，一或多個之miRNA序列可位於該內含子中。
於某些具體實施例中，工程化hC9編碼序列及miRNA編碼序列係經由不同的核酸序列遞送，例如，二個以上的不同載體、包含一載體及一LNP的組合等。於某些具體實施例中，兩種不同載體為AAV載體。於某些具體實施例中，此等載體具有不同表現匣。於其他具體實施例中，此等載體具有相同衣殼。於其他具體實施例中，載體具有不同具體化。於某些具體實施例中，miRNA編碼序列經由LNP或另一非病毒遞送系統遞送。於某些具體實施例中，工程化hC9序列經由LNP或另一非病毒遞送系統遞送。於某些具體實施例中，使用二種以上的不同遞送系統(例如，病毒及非病毒、兩種不同的非病毒)之組合。於此等及其他具體實施例中，二種以上的不同載體或其他遞送系統可實質上被同時投予，或者此等系統之一或多個可於另一個之前遞送。於某些具體實施例中，工程化hC9序列為SEQ ID NO：13、或與其90%至100%相同之序列，其編碼mRNA，該mRNA不被與其共同投予的miR結合且編碼功能性人類C9orf72。
如本文所使用，術語「AAV.C9orf72」或「rAAV.h9ORF72」用於指一種重組腺相關病毒，其具有AAV衣殼，於衣殼中具有載體基因體，該載體基因體包含於調節序列控制下的人類C9orf72編碼序列(例如，cDNA)。如本文所使用，術語「AAV.C9orf72.miRXXX」或「rAAV.C9orf72.miRXXX」用於指一種重組腺相關病毒，其具有AAV衣殼，於衣殼中具有載體基因體，該載體基因體包含靶向內源性人類C9ORF72編碼序列之miR。
可指定特定的衣殼類型，諸如例如，AAV.C9orf72或rAAV1.C9orf72，其係指具有AAV1衣殼之重組AAV；AAVhu68.C9orf72或AAVhu68.C9orf72，其係指具有AAVhu68衣殼之重組AAV。AAVrh91.C9orf72或AAVrh91.C9orf72，其係指具有AAVrh91衣殼之重組AAV。
「重組AAV」或「rAAV」為一種DNA酶抗性病毒顆粒，含有兩個元件，AAV衣殼及載體基因體，該載體基因體至少含有包裝在AAV衣殼內的非AAV編碼序列。除非另有說明，否則此術語可與短語「rAAV載體」互換使用。該rAAV為一種「複製缺陷型病毒」或「病毒載體」，因為其缺少任何功能性AAV rep基因或功能性AAV cap基因且不能產生子代。於某些具體實施例中，唯一的AAV序列為AAV反向末端重複序列(ITR)，通常位於載體基因體的5'及3'末端，以便使位於ITR之間的基因及調節序列包裝在AAV衣殼內。一般而言，AAV衣殼係由60個衣殼(cap)蛋白質次單元VP1、VP2、及VP3所構成，該等次單元以二十面體對稱的方式排列，比例約為1:1:10至1:1:20，取決於所選擇的AAV。可選擇各種AAV作為如上述的AAV病毒載體衣殼的來源。於一具體實施例中，AAV衣殼為AAV9衣殼或其工程化變異體。參見，SEQ ID NO：30及31。於某些具體實施例中，變異體AAV9衣殼為AAV9.PhP.eB衣殼。於某些具體實施例中，PhP.eB衣殼被選擇用於小鼠研究，且為人類中演化支F載體(例如，AAVhu68)的適合模式。於某些具體實施例中，衣殼蛋白質係藉由rAAV載體名稱中術語「AAV」後的數字、或數字及字母的組合所指定。
除非另有指明，本文所述的AAV衣殼、ITR、及其他選擇的AAV組件可容易地選自任何AAV，包括但不限於定義如下的AAV：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVhu37、AAVrh32.33、AAV8bp、AAV7M8及AAVAnc80、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh74、AAV-DJ8、AAV-DJ、AAVhu68、AAV9變異體(例如，PCT/US21/61312，2021年12月1日申請；及US臨時申請案第63/119,863號，2020年12月1日申請；及US臨時申請案第63/178,881號，2021年4月23日申請)、AAVhu95及AAVhu96 (參見，US臨時申請案第63/251,599號，2021年10月2日申請)，並未限制。參見例如，WO 2019/168961及WO 2019/169004，兩者關於具有減少的衣殼脫醯胺的新穎AAV載體及其用途；US公開專利案第2007-0036760-A1號；US公開專利案第2009-0197338-A1號；EP 1310571。亦參見WO 2003/042397 (AAV7及其他猴AAV)、US專利7790449及US專利7282199 (AAV8)、WO 2005/033321及US 7,906,111 (AAV9)、及WO 2006/110689、及WO 2003/042397 (rh.10)、WO 2005/033321、WO 2018/160582 (AAVhu68)，其在此藉由引用而併入。亦參見WO 2019/168961及WO 2019/169004，描述此等及其他AAV衣殼的脫醯胺概貌。於某些具體實施例中，與另一個演化支F衣殼AAV9相比，衣殼具有兩個編碼胺基酸差異，差異位於位置67及157，基於SEQ ID NO：34所示之VP1蛋白質的編號(參見，核苷酸序列之SEQ ID NO：32及33)。相比之下，另一個演化支F AAV (AAV9、hu31、hu31)在位置67具有Ala且在位置157具有Ala。參見例如，WO 2022/082109，提供工程化AAVhu68編碼序列，WO 2018/160582；WO 2019/169004；及WO 2019/168961，其全部藉由引用而完整併入本文。
於某些具體實施例中，AAVhu68衣殼進一步具有下列一或多個特徵。AAVhu68衣殼蛋白質包含：由編碼SEQ ID NO：34之1至736的胺基酸序列的核酸序列的表現所產生的AAVhu68 vp1蛋白質、由SEQ ID NO：32或33所產生的vp1蛋白質、或由編碼SEQ ID NO：34之1至736預測的胺基酸序列之與SEQ ID NO：33至少70%相同的核酸序列所產生的vp1蛋白質；由編碼SEQ ID NO：34之至少約胺基酸138至736的胺基酸序列之核酸序列的表現所產生之AAVhu68 vp2蛋白質、由包含SEQ ID NO：32或33之至少核苷酸412至2211的序列所產生的vp2蛋白質、或由編碼SEQ ID NO：34之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列之與SEQ ID NO：32或33之至少核苷酸412至2211至少70%相同的核酸序列所產生的vp2蛋白質；及/或由編碼SEQ ID NO：34之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現所產生的AAVhu68 vp3蛋白質、由包含SEQ ID NO：32或33之至少核苷酸607至2211 的序列所產生的vp3蛋白質、或由編碼SEQ ID NO：34之至少約胺基酸203至736之胺基酸序列之與SEQ ID NO：32或33之至少核苷酸607至2211至少70%相同的核酸序列所產生的vp3蛋白質。於某些具體實施例中，一種AAVhu68衣殼包含：(i) AAVhu68 vp1蛋白質、AAVhu68 vp2蛋白質及AAVhu68 vp3蛋白質的異質族群(heterogenous population)，由編碼SEQ ID NO：34的核酸序列所產生，其中AAVhu68vp1蛋白質包含在位置67的麩胺酸及在位置157的纈胺酸且AAVhu68vp2蛋白質包含在位置157的纈胺酸，編號基於SEQ ID NO：34；或(ii) AAVhu68 vp1、AAVhu68 vp2及AAVhu68 vp3蛋白質之異質族群，其中AAVhu68 vp1蛋白質為SEQ ID NO：34之胺基酸1至736(vp1)，包含在位置67的麩胺酸及在位置157的纈胺酸且進一步包含vp1蛋白質的子群體，包含基於SEQ ID NO：34中胺基酸位置之經修飾的胺基酸，其中AAVhu68 vp2蛋白質為SEQ ID NO：34之胺基酸138至736(vp2)，包含在位置157的纈胺酸且進一步包含vp2蛋白質的子群體，包含基於SEQ ID NO：34中的胺基酸位置之經修飾的胺基酸，其中AAVhu68 vp3蛋白質為SEQ ID NO：34之胺基酸203至736(vp3)，其包含vp3蛋白質的子群體，包含基於SEQ ID NO：34中胺基酸位置之經修飾的胺基酸，其中在(i)及(ii)之AAVhu68 vp1、AAVhu68 vp2及AAV hu68 vp3蛋白質包含在相對於SEQ ID NO：34中的胺基酸的位置57、329、452、512的每一者上的天冬醯胺酸-甘胺酸對中至少50%至100%脫醯胺的天冬醯胺酸(N)，其中如使用光譜測定法測定，脫醯胺的天冬醯胺酸被脫醯胺成天冬胺酸、異天冬胺酸、互變天冬胺酸/異天冬胺酸對、或其組合。於某些具體實施例中，AAVhu68衣殼包含：(a) vp1蛋白質之子群體，其中如使用質譜測定法測定，75%至100%之在vp1蛋白質位置57的N被脫醯胺；及/或(b) vp1蛋白質、vp2蛋白質、及/或vp3蛋白質之子群體，其中基於SEQ ID NO：34的編號，如使用質譜測定法測定，75%至100%之在位置329的N被脫醯胺；及/或(c)vp1蛋白質、vp2蛋白質、及/或vp3蛋白質之子群體，如使用質譜測定法測定，75%至100%之基於SEQ ID NO：34的編號在位置452的N被脫醯胺；及/或(d)vp1蛋白質、vp2蛋白質、及/或vp3蛋白質之子群體，其中如使用質譜測定法測定，75%至100%之基於SEQ ID NO：34的編號在位置512的N被脫醯胺。
其他適合的序列可包括例如AAVhu95[工程化VP1核酸序列SEQ ID NO：26；胺基酸序列SEQ ID NO：27及35]；AAVhu96[工程化AAVhu96 VP1核酸序列，SEQ ID NO：28；AAV hu96 VP1胺基酸序列，SEQ ID NO：29]。
其他適合的AAV可包括但不限於AAVrh90 [PCT/US20/30273，2020年4月28日申請]、AAVrh91 [參見，SEQ ID NO：37及38；PCT/US20/30266，2020年4月28日申請及US臨時專利申請案第63/109,734號，2020年11月4日申請及US臨時專利申請案第63/065,616號，2020年8月14日申請]AAVrh92、AAVrh93、AAVrh91.93 [PCT/US20/30281，2020年4月28日申請]，其在此藉由引用而併入。其他適合的AAV包括AAV3B變異體，其被描述於PCT/US20/56511，2020年10月20日申請，描述AAV3B.AR2.01、AAV3B.AR2.02、AAV3B.AR2.03、AAV3B.AR2.04、AAV3B.AR2.05、AAV3B.AR2.06、AAV3B.AR2.07、AAV3B.AR2.08、AAV3B.AR2.10、AAV3B.AR2.11、AAV3B.AR2.12、AAV3B.AR2.13、AAV3B.AR2.14、AAV3B.AR2.15、AAV3B.AR2.16、或AAV3B.AR2.17，其在此藉由引用而併入。此等文件亦描述其他AAV衣殼，其可被選擇用來生產rAAV且藉由引用而併入。在從人類或非人類靈長類動物(NHP)中分離或工程化並得到充分表徵的AAV中，人類AAV2係第一個被開發為基因轉移載體的AAV；它已被廣泛用於不同標靶組織及動物模型的高效基因轉移實驗。
如本文所使用，「載體基因體」係指包裝在形成病毒顆粒的小病毒(parvovirus)(例如，rAAV)衣殼內部的核酸序列。此種核酸序列含有AAV反向末端重複序列(ITRs)。於本文之例中，載體基因體由5’至3’最低限度含有AAV 5’ ITR、編碼序列(即，轉基因(一或多個))及AAV 3’ ITR。可選擇來自AAV2之ITR，一種異於衣殼之不同來源AAV，或可選擇除全長ITR以外者。於某些具體實施例中，ITR係來自與生產過程中提供rep功能的AAV或反式互補(transcomplementing)AAV相同的AAV來源。再者，可使用其他ITR，例如，自互補(scAAV) ITR。單股AAV及自互補(sc) AAV二者皆包含於rAAV。轉基因為一種核酸編碼序列，與載體序列異源，其編碼有興趣之多肽、蛋白質、功能性RNA分子(例如，miRNA、miRNA抑制劑)或其他基因產物。該核酸編碼序列係以在標靶組織的細胞中允許轉基因轉錄、轉譯及/或表現的方式與調節組件可操作地連接。載體基因體的適當組件係於本文中更詳細地討論。
於一例中，「載體基因體」由5’至3’，最低限度含有載體特異性序列、可操作地連接至調節控制序列之包含工程化人類C9orf72編碼序列的核酸序列與可選擇含有之靶向內源性C9orf72的miRNA序列(該調節控制序列於標靶細胞中指導其表現)，其中該載體特異性序列可為末端重複序列，該末端重複序列特異性地包裝載體基因體至病毒載體衣殼或套膜蛋白質中。例如，AAV反向末端重複用於包裝至AAV及某些其他小病毒衣殼中。
於某些具體實施例中，提供一組成物，其包含適合鞘內注射的水性液體及載體儲料(stock)(例如，具有AAV衣殼的rAAV，其優先靶向中樞神經系統及/或背根神經節中的細胞(例如，CNS，包括例如神經細胞(如錐狀細胞、浦金埃氏細胞(Purkinje's cell)、顆粒細胞、梭狀細胞及聯絡神經元細胞)及神經膠細胞(如星狀細胞、寡樹突細胞、小神經膠質細胞、及室管膜細胞)，其中具有工程化hC9orf72編碼序列及/或至少一個miRNA特異性內源性hC9orf72的載體用於遞送至中樞神經系統(CNS)。於某些具體實施例中，調配包含一或多個如本文所述的載體的組成物用於枕骨下注射到腦大池內(intra-cisterna magna)。於某些具體實施例中，組成物係經由電腦斷層造影-(CT-)rAAV注射而投予。於某些具體實施例中，組成物係使用歐氏貯存器(Ommaya reservoir)而投予。於某些具體實施例中，投予患者單劑量的組成物。
如本文所使用，「表現匣」係指包含生物學上有用的核酸序列(例如，編碼蛋白質、酵素或其他有用的基因產物之基因cDNA、mRNA等)及與其可操作地連接的調節序列之核酸分子，該調節序列指導或調節核酸序列及其基因產物之轉錄、轉譯及/或表現。如本文所使用，「可操作地連接的」序列包括與核酸序列連續或不連續的調節序列、及在反式(trans)或順式(cis)核酸序列中作用的調節序列兩者。此種調節序列典型上包括例如：一或多個之啟動子、強化子、內含子、科札克序列(Kozak sequence)、多腺苷酸化(polyadenylation)序列、及TATA訊息。除此之外，表現匣還可含有基因序列之上游(相對於其為5’側)的調節序列，例如，一或多個啟動子、強化子、內含子等；以及基因序列的下游(相對於其為3’側)的一或多個強化子或調節序列，例如，包含多腺苷酸化位之3’未轉譯區(3’ UTR)。於某些具體實施例中，調節序列可操作地連接至基因產物之核酸序列，其中該調節序列藉由***的核酸序列(即，5’-未轉譯區(5’UTR))而與基因產物的核酸序列分開。於某些具體實施例中，表現匣包含一或多種基因產物之核酸序列。於一些具體實施例中，表現匣可為單順反子(monocistronic)或雙順反子(bicistronic)表現匣。於其他具體實施例中，術語「轉基因」係指***標靶細胞的來自外源的一或多個DNA序列。
通常，此類可用於產生病毒載體且含有本文所述基因產物的編碼序列的表現匣，其兩側為病毒基因體的包裝訊息及其他表現控制序列(諸如本文所述者)。於某些具體實施例中，載體基因體可含有二個以上的表現匣。
於某個具體實施例中，表現匣包含C9orf72編碼序列及靶向內源性C9orf72的miRNA序列)、啟動子，且可包括其之其他調節序列，其匣可被包裝至載體(例如，rAAV、慢病毒(lentivirus)、反轉錄病毒(retrovirus)等)中。
AAV 重組小病毒特別適合作為載體。如本文所述，重組小病毒可含有AAV衣殼(或波卡病毒(bocavirus)衣殼)。於某些具體實施例中，衣殼靶向背根神經節中的細胞及/或下運動神經元及/或初級感覺神經元中的細胞。於某些具體實施例中，本文提供的組成物可具有單一rAAV儲料，其包含rAAV，該rAAV包含工程化hC9orf72及特異性地靶向內源性hC9orf72的miRNA以便向下調節內源性hC9orf72水平並減少任何與hC9orf72過度表現有關的毒性。於其他具體實施例中，rAAV可包含hC9orf72且可與包含向下調節內源性hC9orf72之miRNA的不同載體共同投予。於其他具體實施例中，rAAV可包含至少一個向下調節內源性hC9orf72的miRNA及第二載體(或其他組成物)，其用來遞送hC9orf72。
例如，使用來自演化支F(例如，AAVhu68或AAV9)的AAV衣殼所產生的載體可被使用以生產載體，該載體於CNS靶向並表現hC9orf72。或者，可選擇使用來自演化支A(例如，AAV1、AAVrh91)的AAV衣殼所產生的載體。於再其他具體實施例中，其他小病毒或其他AAV病毒可為AAV衣殼的適合來源。
AAV1衣殼係指具有AAV vp1蛋白質、AAV vp2蛋白質及AAV vp3蛋白質的衣殼。於特定的具體實施例中，AAV1衣殼包含約1:1:10之預定比例的AAV vp1蛋白質、AAV vp2蛋白質及AAV vp3蛋白質，組裝成全部60個vp蛋白質的T1二十面體衣殼。AAV1衣殼能夠包裝基因體序列以形成AAV顆粒(例如，重組AAV，其中基因體為載體基因體)。典型地，編碼最長的vp蛋白質(即VP1)的衣殼核酸序列，於具有AAV1衣殼的rAAV生產期間係反式表現，被描述於例如US專利6,759,237、US 專利7,105,345、US專利7,186,552、US專利8,637,255、及US專利9,567,607，其在此藉由引用而併入。亦參見WO 2018/168961，其藉由引用併入。於某些具體實施例中，AAV1的特徵在於VP同功型(isoform)之異質族群的衣殼組成物，其如WO 2018/160582所定義被脫醯胺，藉由引用將其完整併入，基於如使用質譜測定法測定之衣殼中VP蛋白質總量。於某些具體實施例中，如使用質譜測定法測定，AAV衣殼在以下位置的一或多處並在以下提供的範圍內被修飾。適合的修飾包括在上述標識為脫醯胺化調節的段落中描述者，其藉由引用併入本文。於某些具體實施例中，一或多個下列位置、或N後面的甘胺酸係如本文所述地被修飾。於某些具體實施例中，構築AAV1突變體，其中位置57、383、512及/或718的N後的甘胺酸被保留(即，保持未經修飾)。於某些具體實施例中，前句中所識別的四個位置的NG與天然序列一起保留。於某些具體實施例中，將人工NG導入與WO 2018/160582中定義及識別的位置不同的位置，其藉由引用併入本文。
如本文所使用，AAVhu68衣殼係指如WO 2018/160582中所定義的衣殼，其藉由引用併入本文。如本文所述，rAAVhu68具有在生產系統中所生產的rAAVhu68衣殼，該生產系統係自AAVhu68核酸而表現衣殼。於某些具體實施例中，AAVhu68核酸序列為SEQ ID NO：32或33，編碼SEQ ID NO 34之胺基酸序列。於某些具體實施例中，AAVhu68核酸序列為SEQ ID NO：32或33，編碼SEQ ID NO：34之胺基酸序列。使用單個核酸序列vp1的生產所產生的rAAVhu68會產生vp1蛋白質、vp2蛋白質及vp3蛋白質的異質族群。此等子群體最低限度包括脫醯胺的天冬醯胺酸(N或Asn)殘基。例如，天冬醯胺酸-甘胺酸對中的天冬醯胺酸被高度脫醯胺。於某些具體實施例中，vp2及/或vp3蛋白質可被額外地或替代地從不同於vp1的核酸序列表現，例如，以改變所選擇的表現系統中vp蛋白質的比例。
包裝於AAV衣殼中並遞送到宿主細胞的基因體序列通常最低限度係由轉基因及其調節序列以及AAV反向末端重複(ITR)所組成。單股AAV及自互補(sc)AAV二者皆包含於rAAV。轉基因為與載體序列異源之核酸編碼序列，其編碼有興趣之多肽、蛋白質、功能性RNA分子(例如，miRNA、miRNA抑制劑)或其他基因產物。該核酸編碼序列係以在標靶組織的細胞中允許轉基因轉錄、轉譯及/或表現的方式與調節組件可操作地連接。
載體的AAV序列通常包含順式作用(cis-acting) 5'及3'反向末端重複序列(參見例如B. J. Carter, in“Handbook of Parvoviruses”, ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990))。ITR序列長度為約145 bp。儘管允許對此等序列進行某種程度的輕微修飾，但較佳為實質上在分子中使用編碼ITR的整個序列。修飾此等ITR序列的能力係於本領域技術範圍內。(參見例如，如texts such as Sambrook et al, “Molecular Cloning. A Laboratory Manual”, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)；及K. Fisher et al., J. Virol., 70:520 532 (1996)之文件)。本發明中所使用的此種分子之例為含有轉基因的「順式作用」質體，其中5’及3’ AAV ITR序列位於所選擇的轉基因序列及有關的調節元件之兩側。
ITR為在載體生產過程中負責基因體的複製及包裝的遺傳元件，且為生成rAAV所需的唯一病毒順式元件。於一具體實施例中，ITR來自不同於提供衣殼的AAV。於較佳具體實施例，為了方便及加速監管批准，可使用來自AAV2之ITR序列、或其經刪除版(ΔITR)。然而，可選擇來自其他AAV來源的ITR。於ITR之來源為來自AAV2且AAV衣殼來自另一AAV來源時，生成的載體可稱為假型(pseudotyped)。一般而言，AAV載體基因體包含AAV 5’ ITR、編碼基因產物之核酸序列、及任何調節序列、以及AAV 3’ ITR。然而，此等元件之其他型態可為適合的。於一具體實施例中，提供自互補AAV。已描述5’ITR的縮短版，稱為ΔITR，其中刪除了D序列(D-sequence)及末端分割位(terminal resolution site)(trs)。於某些具體實施例中，載體基因體包括包括130個鹼基對之縮短的AAV2 ITR，其中外部「a」元件被刪除。在使用內部A元件作為模板的載體DNA擴增過程中，縮短的ITR被回復為145個鹼基對的野生型長度。於其他具體實施例中，使用全長AAV 5’及3’ITR。
除了載體(例如，rAAV)之上列識別的主要元件之外，載體亦包括必需的習用控制元件，其以允許轉基因在細胞中轉錄、轉譯及/或表現的方式與轉基因可操作地連接。如本文所使用，術語「表現」或「基因表現」係指來自基因的訊息被用於合成功能性基因產物的過程。基因產物可為蛋白質、肽、或核酸聚合物(如RNA、DNA或PNA)。
如本文所使用，術語「調節序列」或「表現控制序列」係指核酸序列，如起始序列、強化子序列、及啟動子序列，其誘導、抑制、或以其他方式控制與彼等可操作地連接的蛋白質編碼核酸序列的轉錄。調節控制元件通常含有啟動子序列作為表現控制序列之一部分，例如，位於所選擇的5’ ITR序列及編碼序列之間。於特別理想的具體實施例中，選擇用於中樞神經系統的組織特異性啟動子。例如，啟動子可為神經細胞啟動子，例如，gfaABC(1)D啟動子(Addgene #50473))、或人類Syn啟動子(序列可由Addgene獲得，Ref. #50465)。
其他適合的啟動子可包括例如，組成型啟動子(constitutive promoter)、可調節的啟動子[參見例如，WO 2011/126808及WO 2013/04943]、組織特異性啟動子、或對生理提示有反應的啟動子可被用於本文所述的載體。啟動子可選自不同來源，例如，人類巨細胞病毒(CMV)立即早期強化子/啟動子、SV40早期強化子/啟動子、JC多瘤病毒(JC polymovirus)啟動子、髓鞘質鹼性蛋白(MBP)或神經膠纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein)(GFAP)啟動子、單純疱疹病毒(HSV-1)潛伏相關啟動子(latency associated promoter)(LAP)、勞氏肉瘤病毒(rouse sarcoma virus)(RSV)末端長重複序列(LTR)啟動子、神經元特異性啟動子(NSE)、血小板衍生的生長因子(PDGF)啟動子、hSYN、黑色素凝集激素(melanin-concentrating hormone)(MCH)啟動子、CBA、基質金屬蛋白啟動子(matrix metalloprotein promoter)(MPP)、及雞β-肌動蛋白啟動子。除了啟動子，載體可含有一或多個其他適當的轉錄起始、終止、強化子序列、有效的RNA加工訊息諸如剪接(splicing)及多腺苷酸化(polyA)訊息；穩定細胞質的mRNA之序列，例如WPRE；增強轉譯效率之序列(即，科札克共通序列(Kozak consensus sequence))；增強蛋白質穩定性之序列；及當需要時，增強所編碼的產物之分泌的序列。適合的強化子之例為CMV強化子。其他適合的強化子包括適合所欲標靶組織適應症者。於一具體實施例中，表現匣包含表現匣包含一或多個表現強化子。於一具體實施例中，表現匣含有二或多個表現強化子。此等強化子可相同或可彼此不同。例如，強化子可包括CMV立即早期(IE)強化子。於某些具體實施例中，強化子可包括包含SEQ ID NO：3之核酸序列的CMV IE強化子(C4)。此強化子能以位置彼此相鄰的兩個拷貝的方式存在。或者，強化子的雙重拷貝可被一個或多個序列分開。於再另一具體實施例中，表現匣進一步含有內含子，例如，雞β-肌動蛋白內含子。於某些具體實施例中，表現匣包含一內含子，該內含子為包含SEQ ID NO：47的β-肌動蛋白內含子。其他適合的內含子包括本技術領域中已知者，例如，諸如WO 2011/126808所述者。適合的polyA序列之例包括例如：SV40、SV50、牛生長激素(bGH)、人類生長激素、及合成的polyA。於某些具體實施例中，polyA為SV40 poly A。於某些具體實施例中，polyA為兔球蛋白poly A (RBG)。於某些具體實施例中，polyA為包含SEQ ID NO：10之RBG polyA。可選擇地，可選擇一或多個序列以穩定mRNA。此種序列之例為經修飾的WPRE序列，其可在polyA序列的上游及編碼序列的下游被工程化[參見例如MA Zanta-Boussif, et al, Gene Therapy (2009) 16：605-619。
於某些具體實施例中，載體基因體包含組織特異性啟動子。於一些具體實施例中，組織特異性啟動子為人類突觸蛋白(synapsin)啟動子。於某些具體實施例中，人類突觸蛋白啟動子包含SEQ ID NO：6之核酸序列。於某些具體實施例中，載體基因體包含組成型啟動子，其中該啟動子為CB7啟動子或其變異體，例如，CAG啟動子。於某些具體實施例中，CB7或其變異體為雜合(hybrid)啟動子(啟動子元件)，最低限度包含人類巨細胞病毒(CMV)立即早期(IE)強化子及雞β-肌動蛋白(CB或CBA)啟動子。於某些具體實施例中，CB7啟動子或變異體係指人類巨細胞病毒(CMV)立即早期(IE)強化子(C4)、雞β-肌動蛋白(CB)啟動子、可選擇的內含子、連接雜合啟動子的元件之可選擇的間隔子序列。參見例如，具有巨細胞病毒強化子的雞β-肌動蛋白啟動子。於某些具體實施例中，CB7啟動子或啟動子元件係指人類巨細胞病毒(CMV)立即早期(IE)強化子(C4)、雞β-肌動蛋白(CB)啟動子、內含子、及連接雜合啟動子的元件之可選擇的間隔子序列。於某些具體實施例中，CB7啟動子或啟動子元件係指人類巨細胞病毒(CMV)立即早期(IE)強化子(C4)、雞β-肌動蛋白(CB)啟動子、包含具有兔β球蛋白剪接供體的雞β-肌動蛋白內含子的內含子、及連接雜合啟動子的元件之可選擇的間隔子序列。於某些具體實施例中，CB7啟動子或啟動子元件係指人類巨細胞病毒(CMV)立即早期(IE)強化子(C4)(SEQ ID NO：3)、雞β-肌動蛋白(CB)啟動子(SEQ ID NO：46)、可選擇的內含子(SEQ ID NO：47)、及連接雜合啟動子的元件之可選擇的間隔子序列。於某些具體實施例中，CB7啟動子或啟動子元件係指人類巨細胞病毒(CMV)立即早期(IE)強化子(SEQ ID NO：51)、雞β-肌動蛋白(CB)啟動子(SEQ ID NO：52)、可選擇的內含子(SEQ ID NO：53)、及連接雜合啟動子的元件之可選擇的間隔子序列。於某些具體實施例中，CB7啟動子或啟動子元件包含SEQ ID NO：4之核酸序列。於某些具體實施例中，CB7啟動子或啟動子元件包含SEQ ID NO：43之核酸序列。於某些具體實施例中，CB7啟動子或啟動子元件包含SEQ ID NO：48之核酸序列。於某些具體實施例中，CB7啟動子或啟動子元件包含SEQ ID NO：49之核酸序列。於某些具體實施例中，CB7啟動子或啟動子元件包含SEQ ID NO：50之核酸序列。較佳地，間隔子序列為非編碼的且於某些具體實施例中，可為不同長度。
於一具體實施例中，載體基因體包含：AAV 5’ ITR、啟動子、可選擇的強化子、可選擇的內含子、人類C9orf72的編碼序列(hC9orf72或huC9orf72)、poly A、及AAV 3’ ITR。於某個具體實施例中，載體基因體為AAV2 5’ ITR、CB7啟動子或其變異體、工程化C9orf72、連接子、靶向內源性C9orf72序列的miR、兔β球蛋白 poly A、及AAV2 3’ ITR。於某個具體實施例中，載體基因體為AAV2 5’ ITR、CB7啟動子或其變異體、內含子、C9orf72、兔β球蛋白poly A、及AAV2 3’ ITR。於某個具體實施例中，載體基因體為AAV2 5’ ITR、CB7啟動子或其變異體、工程化huC9orf72、連接子、miR487序列、兔β球蛋白 poly A、及AAV2 3’ ITR。huC9orf72編碼序列選自本發明說明書中彼等定義者。參見例如，SEQ ID NO：13或與其至少95%至99.9%相同的序列、如本文定義的其片段。於某些具體實施例中，其他C9orf72編碼序列可與本文提供的miR487組合。對於本發明的某些具體實施例，可對載體基因體選擇載體基因體的其他元件或此等序列上的變異。
載體生產 於生產AAV病毒載體(例如，重組(r)AAV)的使用，表現匣可被攜帶於任何適合的載體上，例如質體，其被遞送至包裝宿主細胞(packaging host cell)。有用於本發明之質體可經工程化而適合於原核細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等中之活體外複製及包裝。適合的轉染技術及包裝宿主細胞為本技術領域中具有通常知識者已知及/或可輕易設計。
於某些具體實施例中，生產質體包含用以包裝於衣殼內的載體基因體，其包含：(a)編碼人類C9orf72的工程化核酸序列；(b)位於(a)與(c)之間的間隔子序列；(c)至少一種對患者中的內源性人類C9orf72具有特異性的miRNA序列，其位於(a)及(b)之序列的3’；其中(a)之工程化核酸序列缺乏至少一個miRNA之靶位點，從而防止miRNA靶向工程化人類C9orf72編碼序列；(c)可操作連接至(a)和(c)之調節序列。於某些具體實施例中，生產質體包含載體基因體，該載體基因體包含SEQ ID NO：1之核酸序列、或5’ ITR–SEQ ID NO：4之表現匣–3’ ITR。
生產及單離適合作為載體使用之AAV之方法為本技術領域已知。一般參見例如例如，Grieger & Samulski, 2005, “Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production and clinical applications,” Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 99：119-145；Buning et al., 2008, “Recent developments in adeno-associated virus vector technology,” J. Gene Med. 10:717-733；及下列引述的參考文獻，其每一者藉由引用將其完整併入。為了將轉基因包裝到病毒粒子(virion)中，ITR是唯一需要在與包含表現匣的核酸分子相同的構築體順式的AAV組分。cap及rep基因可反式提供。
於一具體實施例中，本文所述之表現匣被工程化至遺傳元件(例如，穿梭質體(shuttle plasmid)))，該遺傳元件將攜帶在其上的免疫球蛋白構築體序列轉移至包裝宿主細胞中以生產病毒載體。於一具體實施例中，選擇的基因元件可藉由任何適合的方法而被遞送至AAV包裝細胞(AAV packaging cell)，包括轉染、電穿孔、微脂體遞送、膜融合技術、高速DNA被覆顆粒(high velocity DNA-coated pellet)、病毒感染及原生質體(protoplast)融合。亦可製作穩定的AAV包裝細胞。或者，表現匣可用於產生AAV以外的病毒載體，或者用於活體外抗體混合物之製造。用於製作此種構築體之方法為核酸操作領域中具有通常知識者所知悉，且包括基因工程、重組工程、及合成技術。參見例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual, ed. Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012)。
術語「AAV中間體」或「AAV載體中間體」係指缺少包裝在其中的所欲基因體序列的組裝的rAAV衣殼。此等亦被稱為「空的(empty)」衣殼。此種衣殼可不含有表現匣的可檢測的基因體序列，或者僅含有不足以達成基因產物表現的部分包裝的基因體序列。此等空的衣殼不會將感興趣的基因轉移至宿主細胞的功能。
本文所述重組腺相關病毒(AAV)可使用已知技術生產。參見例如，WO 2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；US 7588772 B2。此種方法涉及培養宿主細胞，該宿主細胞含有編碼AAV衣殼蛋白質的核酸序列；功能性rep基因；如本文所述表現匣，兩側為AAV反向末端重複(ITR)及轉基因；及足夠的輔助功能，以允許將表現匣包裝至AAV衣殼蛋白質中。本文亦提供宿主細胞，其含有編碼AAV衣殼的核酸序列；功能性rep基因；如本文所述的載體基因體；及足夠的輔助功能，以允許將載體基因體包裝至AAV衣殼蛋白質中。於一具體實施例中，宿主細胞為HEK 293細胞。此等方法在WO2017160360 A2中有更詳細的描述，其藉由引用併入本文。生產衣殼之方法、其編碼序列、及生產rAAV病毒載體之方法已被描述。參見例如，Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6081-6086 (2003)及US 2013/0045186A1。
於一具體實施例中，提供有用於生產重組AAV之生產細胞培養物。此類細胞培養物含有在宿主細胞中表現AAV衣殼蛋白質的核酸；適於包裝至AAV衣殼中的核酸分子，例如，含有AAV ITR及編碼基因產物的非AAV核酸序列的載體基因體，該非AAV核酸序列可操作地連接至指導產物在宿主細胞中表現的序列；以及足夠的AAV rep功能及腺病毒輔助者功能，以允許將核酸分子包裝至重組AAV衣殼中。於一具體實施例中，細胞培養物係由哺乳動物細胞(例如人類胚腎293細胞等)或昆蟲細胞(例如桿狀病毒(baculovirus))組成。
典型地，rep功能來自與提供位於載體基因體兩側的ITR之AAV相同的AAV來源。於本文之例中，選擇AAV2 ITR並使用AAV2 rep。可選擇地，可選擇其他rep序列或另一rep來源(及可選擇另一ITR來源)。例如，rep可為但未限於：AAV1 rep蛋白質、AAV2 rep蛋白質；或rep 78、rep 68、rep 52、rep 40、rep68/78及rep40/52；或其片段；或其他來源。可選擇地，rep及cap序列位於細胞培養物中的相同遺傳元件上。在rep序列及cap基因之間可能有一個間隔子。此等AAV或突變體AAV衣殼序列之任一者可於指導其在宿主細胞中表現的外源調節控制序列的控制下。
於一具體實施例中，細胞在合適的細胞培養(例如，HEK 293)細胞中製造。本文所述的基因療法載體的製備方法包括本領域眾所周知的方法，諸如用於生產基因療法載體的質體DNA的生產、載體的生產、及載體的純化。於一些具體實施例中，基因療法載體為AAV載體，且所產生的質體為編碼AAV基因體及感興趣之基因的AAV順式質體、含有AAV rep及cap基因的AAV反式質體、及腺病毒輔助質體。載體產生製程可包括諸如細胞培養之起始、細胞繼代、細胞接種、以質體DNA轉染細胞、轉染後培養基交換為無血清培養基、及含有載體的細胞及培養基的收取之方法步驟。
於某些具體實施例中，rAAV.C9orf72.miR之製造過程涉及以質體DNA短暫轉染HEK293細胞。藉由在PALL iCELLis生物反應器中的PEI介導之三重轉染HEK293細胞而生產單批或多批次。依序藉由澄清、TFF、親和性層析及陰離子交換層析，在可能的一次性、封閉式生物處理系統中純化所收取的AAV材料。
所收取的含有載體的細胞及培養基在本文中稱為粗細胞收取物。於另一系統中，藉由以基於桿狀病毒的載體感染而將基因療法載體導入昆蟲細胞中。此等生產系統的綜述，一般參見例如，Zhang et al., 2009, “Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production,” Human Gene Therapy 20:922-929，其各自之內容藉由引用將其完整併入。製造及使用此等之方法及其他AAV生產系統亦描述於下列U.S.專利，其各自之內容藉由引用而將其完整併入：5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823；及7,439,065，其在此藉由引用而併入。亦參見US臨時專利申請案第63/371,597號，2022年8月16日申請，標題為「Scalable Methods for Producing rAAV with Packaged Vector Genomes」、及US臨時專利申請案第63/371,592號，2022年8月16日申請，標題為「Scalable Methods for Downstream Purification of Recombinant Adeno-associated Virus」，兩者藉由引用而完整併入本文。粗細胞收取物之後可經歷另外的方法步驟，諸如載體收取物的濃縮、載體收取物的透析過濾、載體收取物的微流體化、載體收取物的核酸酶消化、微流體化中間體的過濾、藉由層析法的粗純化、藉由超高速離心的粗純化、藉由切向流過濾的緩衝液交換、及/或調配及過濾以製備大量載體。
使用高鹽濃度下的兩步驟親和性層析純化，接著使用陰離子交換樹脂層析，以純化載體藥物產物並移除空的衣殼。在2016年12月9日申請的國際專利申請案第PCT/US2016/065970號中更詳細地描述此等方法，其藉由引用併入本文。AAV8之純化方法，2016年12月9日申請的國際專利申請案第PCT/US2016/065976號；及rh10之純化方法，2016年12月9日申請的國際專利申請案第PCT/US16/66013號，標題為「Scalable Purification Method for AAVrh10」，亦於2015年12月11日申請；及AAV1之純化方法，2016年12月9日申請的國際專利申請案第PCT/US2016/065974號，標題為「Scalable Purification Method for AAV1」，2015年12月11日申請，此等所有皆藉由引用併入本文。
為了計算空的(empty)及完整的(full)顆粒含量，將所選擇的樣品(例如，在本文的實施例中之碘克沙醇(iodixanol)梯度純化的製劑，其中GC的#=顆粒的#)的VP3帶(band)體積對裝載的GC顆粒作圖。所生成的線性方程式(y=mx+c)係用於計算測試物品峰的帶體積中的顆粒數量。然後將每20µL裝載的顆粒數(pt)乘以50，得到顆粒(pt)/mL。Pt/mL除以GC/mL，得到顆粒對基因體拷貝的比例(pt/GC)。Pt/mL–GC/mL得到空的pt/mL。空的pt/mL除以pt/mL並×100，得到空的顆粒的百分比。
一般而言，用於分析空衣殼及具有包裝的基因體之AAV載體顆粒的方法為技術領域中已知，參見例如，Grimm et al., Gene Therapy (1999) 6:1322-1330；Sommer et al., Molec. Ther. (2003) 7:122-128。為了測試變性的衣殼，該方法包括對處理過的AAV儲料進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，該電泳由能夠分離三種衣殼蛋白質的任何凝膠所組成，例如，在緩衝液中含有3-8%的Tris-乙酸鹽的梯度凝膠，然後運行凝膠直到分離樣品材料，然後將凝膠印漬到尼龍或硝化纖維素膜上，較佳為尼龍。然後將抗AAV衣殼抗體使用作為結合至變性的衣殼蛋白質的一級抗體，較佳為抗AAV衣殼單株抗體，最佳為B1抗AAV-2單株抗體(Wobus et al., J. Virol. (2000) 74:9281-9293)。然後使用二級抗體，該二級抗體與一級抗體結合且含有用於檢測與一級抗體的結合的手段，更佳為含有與其共價鍵結的檢測分子的抗IgG抗體，最佳為與辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)共價鍵結的綿羊抗小鼠IgG抗體。使用檢測結合的方法，以半定量地確定一級抗體與二級抗體之間的結合，較佳為能夠檢測放射性同位素發射、電磁輻射或比色變化的檢測方法，最佳為化學發光檢測套組。例如，對於SDS-PAGE，可從管柱流份中取樣品，並於含有還原劑(例如DTT)的SDS-PAGE裝載緩衝液(loading buffer)中加熱，將衣殼蛋白質於預鑄的梯度聚丙烯醯胺凝膠(例如Novex)進行解析。可根據製造商的說明使用SilverXpress (Invitrogen，CA)進行銀染色或其他適合的染色方法(即SYPRO ruby或考馬斯(coomassie)染色)。於一具體實施例中，可藉由定量即時PCR(Q-PCR)測量管柱流份中的AAV載體基因體(vg)的濃度。稀釋樣品並以DNase I(或其他合適的核酸酶)消化以移除外源的DNA。核酸酶失活後，使用引子及對引子之間的DNA序列具有特異性的TaqMan™螢光探針進行進一步稀釋及擴增樣品。在Applied Biosystems Prism 7700序列檢測系統上測量每個樣品達到定義的螢光水準所需的循環數(閾值循環，Ct)。使用含有與AAV載體中含的序列相同序列的質體DNA，以於Q-PCR反應中生成標準曲線。從樣品獲得的循環閾值(Ct)數值係用於藉由將其標準化為質體標準曲線的Ct值來確定載體基因體效價(titer)。亦可使用基於數位PCR的終點分析。
於一態樣，使用最適化的q-PCR方法，其利用廣效絲胺酸蛋白酶，例如蛋白酶K(如可由Qiagen購得)。更具體而言，最適化的qPCR基因體效價分析與標準分析相似，除了於DNase I消化後，將樣品以蛋白酶K緩衝液稀釋並以蛋白酶K處理，然後進行熱失活之外。適合地，以與樣品量相等的量的蛋白酶K緩衝液稀釋樣品。蛋白酶K緩衝液可濃縮至2倍以上。通常，蛋白酶K處理為約0.2mg/mL，但可於0.1mg/mL至約1mg/mL之間變化。該處理步驟通常於約55℃下進行約15分鐘，但可於較低溫度(例如約37℃至約50℃)下進行較長時間(例如約20分鐘至約30分鐘)；或者於較高的溫度(例如，高至約60℃)下進行較短的時間(例如，約5至10分鐘)。相似地，熱失活通常係於約95℃下約15分鐘，但溫度可降低(例如約70至約90℃)且時間延長(例如約20分鐘至約30分鐘)。然後將樣品稀釋(例如1000倍)，並如標準分析中所述進行TaqMan分析。
另外或替代地，可使用液滴式數位PCR (droplet digital PCR)(ddPCR)。例如，已描述一種藉由ddPCR確定單股及自互補的AAV載體基因體效價的方法。參見例如，M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr；25(2):115-25. doi：10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14。
簡而言之，用於從基因體缺陷的AAV中間體中分離具有包裝的基因體序列的rAAV顆粒的方法，涉及對包含重組AAV病毒顆粒及AAV衣殼中間體的懸浮液進行快速高效液相層析，其中AAV病毒顆粒及AAV中間體結合至一種經平衡於高pH的強陰離子交換樹脂，並經過鹽梯度，同時以約260及約280的紫外線吸光度來監測洗提物。可取決於所選擇的AAV而調整pH值。參見例如，WO2017/160360 (AAV9)、WO2017/100704 (AAVrh10)、WO 2017/100676 (例如，AAV8)、及WO 2017/100674 (AAV1)，其在此藉由引用而併入。於此方法中，從A260/A280之比達到反曲點時洗提的流份中收集AAV完整的衣殼。於一例中，對於親和性層析步驟，可將經透析過濾的產物應用於有效捕捉AAV2血清型的Capture Select TMPoros- AAV2/9親和性樹脂(Life Technologies)。於此等離子條件下，顯著百分比之殘留的細胞DNA及蛋白質流過管柱，而AAV顆粒被有效捕獲。
非AAV及非病毒載體 如本文使用的「載體」為一包含核酸序列之生物學或化學部分，其可被導入適當之複製或表現該核酸序列用的標靶細胞中。載體之例包括但未限於重組病毒、質體、微脂體複合物(Lipoplexes)、聚合物囊泡(Polymersome)、聚合複合物(Polyplexes)、樹枝狀聚合物(dendrimer)、細胞穿透肽(cell penetrating peptide) (CPP)結合物、磁性顆粒、或奈米顆粒。於一具體實施例中，載體為一種核酸分子，其中可***外源的或異源的或經工程化的hC9orf72編碼序列(及/或至少一miRNA)，然後可將其導入適當的標靶細胞。此種載體較佳具有一或多個複製起點、及可被***重組DNA的一或多個部位。載體通常具有可自未帶有載體的細胞中選擇帶有載體的細胞的手段，例如，彼等編碼抗藥性基因。通常的載體包括質體、病毒基因體、及「人工染色體」。本領域中具有通常知識者可使用載體之生產、製造、特性分析或定量之習用方法。
於一具體實施例中，載體為非病毒質體，其包含其所描述的表現匣，例如，「裸露DNA」、「裸露質體DNA」、RNA、mRNA、shRNA、RNAi等。可選擇地，經由適當裝置遞送質體或其他核酸序列，例如，經由電噴灑、電穿孔。於其他具體實施例中，核酸分子與各種組成物及奈米顆粒結合，包括例如，微胞(micelle)、微脂體(liposome)、陽離子性脂質-核酸組成物、多聚醣(poly-glycan)組成物、及其他聚合物、脂質及/或膽固醇系-核酸結合物、及其他構築體，如本文所述。參見例如，WO2014/089486、US 2018/0353616A1、US2013/0037977A1、WO2015/074085A1、US9670152B2、及US 8,853,377B2、X. Su et al, Mol. Pharmaceutics, 2011, 8 (3), pp 774–787；網路公開：March 21, 2011；WO2013/182683、WO 2010/053572及WO 2012/170930，此等全部藉由引用併入本文。
於某個具體實施例中，非病毒載體用於遞送miRNA轉錄本，該miRNA轉錄本靶向內源性hC9orf72，在不存在於共同投予的經工程化的hC9orf72序列之位點。於一些具體實施例中，miRNA以每劑量大於約0.5 mg/kg體重的miRNA的量遞送(例如，大於約1.0 mg/kg、1.5 mg/kg、2.0 mg/kg、2.5 mg/kg、3.0 mg/kg、4.0 mg/kg、5.0 mg/kg、6.0 mg/kg、7.0 mg/kg、8.0 mg/kg、9.0 mg/kg、或10.0 mg/kg)。於一些具體實施例中，miRNA以每劑量約0.1-100 mg/kg體重之範圍的miRNA的量遞送(例如，約0.1-90 mg/kg、0.1-80 mg/kg、0.1-70 mg/kg、0.1-60 mg/kg、0.1-50 mg/kg、0.1-40 mg/kg、0.1-30 mg/kg、0.1-20 mg/kg、0.1-10 mg/kg)。於一些具體實施例中，miRNA以每劑量為下列的量或大於下列的量遞送：1 mg、5 mg、10 mg、15 mg、20 mg、25 mg、30 mg、35 mg、40 mg、45 mg、50 mg、55 mg、60 mg、65 mg、70 mg、75 mg、80 mg、85 mg、90 mg、95 mg、100 mg、150 mg、200 mg、250 mg、300 mg、350 mg、400 mg、450 mg、或500 mg。
於某些具體實施例中，miRNA轉錄本被包封於脂質奈米顆粒(LNP)中。如本文所使用，短語「脂質奈米顆粒」係指包含一種或多種脂質(例如，陽離子性脂質、非陽離子性脂質及PEG修飾的脂質)的轉移媒劑。較佳地，脂質奈米顆粒被調配以將一種或多種miRNA遞送至一種或多種標靶細胞(例如，背根神經節、下運動神經元及/或上運動神經元、或於上述CNS所述的細胞類型)。適合的脂質之例包括例如磷脂醯基(phosphatidyl)化合物(例如，磷脂醯甘油、磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯乙醇胺、神經鞘脂、腦苷脂、及神經節苷脂)。亦考慮到聚合物作為轉移媒劑之使用，無論是單獨使用或是與其他轉移媒劑組合使用。適合的聚合物可包括例如聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸烷酯、聚乳酸、聚乳酸-聚甘胺酸交酯共聚物、聚己內酯、葡聚醣、白蛋白、明膠、藻酸鹽、膠原蛋白、幾丁聚醣、環糊精、樹枝狀聚合物及聚乙亞胺。於一具體實施例中，轉移媒劑之選擇係基於其促進miRNA轉染至標靶細胞的能力。用於miRNA的有用脂質奈米顆粒包含陽離子性脂質，以包封及/或增強miRNA遞送至標靶細胞中，該標靶細胞將作為蛋白質生產的貯庫。如本文所使用，短語「陽離子性脂質」係指在選定的pH、如生理pH下，帶有淨正電荷的多種脂質種類中的任一種。考慮的脂質奈米顆粒可藉由包括採用一種或多種陽離子性脂質、非陽離子性脂質及PEG修飾的脂質的不同比例的多成分脂質混合物而製備。文獻中已描述數種陽離子性脂質，其許多為市售的。參見例如，WO2014/089486、US 2018/0353616A1、及US 8,853,377B2，其藉由引用而併入。於某些具體實施例中，LNP調配係使用常規程序進行，包含膽固醇、可離子化脂質、輔助脂質、PEG-脂質及聚合物，在被包封的mRNA周圍形成脂質雙層(Kowalski et al., 2019, Mol. Ther. 27(4):710-728)。於一些具體實施例中，LNP包含陽離子性脂質(即，N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)、或1,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷(DOTAP))與輔助脂質DOPE。於一些具體實施例中，LNP包含可離子化脂質Dlin-MC3-DMA可離子化脂質、或哌二酮(diketopiperazine)系可離子化脂質(cKK-E12)。於一些具體實施例中，聚合物包含聚乙亞胺(PEI)、或聚(β-胺基)酯(PBAEs)。參見例如，WO2014/089486、US 2018/0353616A1、US2013/0037977A1、WO2015/074085A1、US9670152B2、及US 8,853,377B2，其藉由引用而併入。
於某些具體實施例中，本文所述載體為「複製缺陷型病毒」或「病毒載體」，係指合成或人工病毒顆粒，其中表現匣含有編碼經工程化的C9orf72及/或至少一個miRNA的核酸序列，該miRNA靶向在經工程化的C9orf72之序列上不存在的位點之內源性C9orf72。複製缺陷型病毒無法產生子代病毒粒子，但保留感染標靶細胞的能力。於一具體實施例中，病毒載體之基因體不包括編碼複製所需酵素的基因(該基因體可被工程化為「無膽的(gutless)」-僅含有編碼E2的核酸序列，兩側為增幅及包裝人工基因體所需的訊息)，但可能在生產過程中提供此等基因。因此，由於除非存在複製所需的病毒酵素，否則子代病毒粒子的複製及感染不會發生，而被認為可安全地用於基因療法。
如本文所使用，重組病毒載體可為任何適合的複製缺陷型病毒載體，包括例如重組腺相關病毒(AAV)、腺病毒、波卡病毒、雜合AAV/波卡病毒、單純疱疹病毒或慢病毒。
如本文所使用，術語「宿主細胞」可指其中產生載體(例如，重組AAV)的包裝細胞株。宿主細胞可為原核或真核細胞(例如，人類、昆蟲、或酵母菌)，其含有藉由任一手段而被導入細胞中的外源的或異源的DNA，該手段例如為電穿孔、磷酸鈣沉澱、微注射、轉形、病毒感染、轉染、微脂體遞送、膜融合技術、高速DNA被覆顆粒、病毒感染及原生質體融合。宿主細胞之例可包括但未限於經單離的細胞、細胞培養物、大腸桿菌細胞、酵母菌細胞、人類細胞、非人類細胞、哺乳動物細胞、非哺乳動物細胞、昆蟲細胞、HEK-293細胞、肝臟細胞、腎臟細胞、中樞神經系統細胞、神經元、神經膠細胞、或幹細胞。
如本文所使用，術語「標靶細胞」係指欲在其中表現hC9orf72及/或miRNA之任何標靶細胞。於某些具體實施例，術語「標靶細胞」意圖指待治療C9orf72相關病症諸如ALS的受試者之細胞。標靶細胞之例包括但不限於中樞神經系統中的細胞。
組成物 本文提供一組成物，其含有至少一包含C9orf72.miR的載體(例如，rAAV.C9orf72.miR儲料)及/或至少一包含miR的載體及/或至少一包含儲料的載體，且含有可選擇的載劑、賦形劑及/或防腐劑。
如本文所使用，如本文所使用，rAAV之「儲料(stock)」係指一群rAAV。儘管由於脫醯胺作用而彼等之衣殼蛋白質具有異質性，但是儲料中的rAAV被預期有5個共有相同的載體基因體。儲料可包括具有衣殼之rAAV，該衣殼具有例如所選擇的AAV衣殼蛋白質及所選擇的生產系統的異質性脫醯胺樣式特徵。該儲料可從單一生產系統生產，或從生產系統的多次運行中儲集。可選擇各種生產系統，包括但不限於本文所述者。
於某些具體實施例中，組成物至少包含病毒儲料，其為重組AAV (rAAV)，適合用於單獨或與其他載體儲料或組成物組合以治療C9orf72介導的ALS或FTD。於某些具體實施例中，組成物適合用於製備治療患者的藥物。於某些具體實施例中，組成物包含病毒儲料，其為適合用於治療患者的重組AAV (rAAV)，該rAAV包含：(a)腺相關病毒衣殼、及(b)包裝於AAV衣殼中的載體基因體，該載體基因體包含AAV反向末端重複、工程化C9orf72的編碼序列、間隔子序列、至少一種miRNA的編碼序列(該miRNA特異性地靶向在不存在於工程化的人類C9orf72編碼序列之位點上的內源性人類C9orf72)、及指導編碼的基因產物表現的調節序列。於某些具體實施例中，組成物包含：獨立的載體儲料，其包含rAAV，該rAAV包含(a)腺相關病毒衣殼、及(b)包裝於AAV衣殼中的載體基因體，該載體基因體包含AAV反向末端重複、工程化人類C9orf72的編碼序列、及指導編碼的基因產物表現的調節序列；及/或獨立的載體儲料，其包含(a)腺相關病毒衣殼、及(b)包裝於AAV衣殼中的載體基因體，該載體基因體包含AAV反向末端重複、至少一個miRNA的編碼序列(該miRNA特異性地靶向在不存在於工程化C9orf72編碼序列的位點之內源性人類C9orf72)、及指導編碼的基因產物表現的調節序列。於某些具體實施例中，載體基因體包含啟動子、強化子、內含子、人類C9orf72編碼序列、及多腺苷酸化訊息。於某些具體實施例中，內含子由雞β肌動蛋白剪接供體及兔β剪接受體元件組成。於某些具體實施例中，載體基因體進一步包含位於載體基因體所有元件兩側的AAV2 5’ ITR及AAV2 3’ ITR。
rAAV.C9orf72.miR (rAAV.hC9orf72或另一載體)可被懸浮於生理學上相容的載劑以投予至人類患者。於某些具體實施例中，為了投予至人類患者，適合地將載體懸浮於水性溶液，該水性溶液含有鹽水、界面活性劑、及生理上可相容的鹽或鹽之混合物。適合地，調整此調配物至生理上可接受的pH，例如，範圍為pH 6至9、或pH 6.5至7.5、pH 7.0至7.7、或pH 7.2至7.8。由於腦脊髓液的pH為約7.28至約7.32、或pH為7.2至7.4，對於鞘內遞送，可能期望為在此範圍內的pH；而對於靜脈內遞送，可能期望為約pH 6.8至約7.2。然而，可選擇最廣範圍及此等子範圍內的其他pH用於其他遞送途徑。
於某些具體實施例中，調配物可含有不包含碳酸氫鈉的緩衝食鹽水溶液。此種調配物可含有於水中包含磷酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂及其混合物之一或多者的緩衝食鹽水溶液，諸如Harvard緩衝液。水溶液可進一步含有Kolliphor® P188，一種由BASF販售的泊洛沙姆(poloxamer)，其之前以商標名Lutrol® F68販賣。水溶液可具有7.2之pH或7.4之pH。
於另一具體實施例中，調配物可含有緩衝食鹽水溶液，該緩衝食鹽水溶液包含1mM磷酸鈉(Na 3PO 4)、150 mM氯化鈉(NaCl)、3mM氯化鉀(KCl)、1.4 mM氯化鈣(CaCl 2)、0.8 mM氯化鎂(MgCl 2)、及0.001% Kolliphor® 188。參見例如，harvardapparatus. com/harvard-apparatus-perfusion-fluid.html。於某些具體實施例中，較佳為Harvard緩衝液。
於其他具體實施例中，調配物可含有一或多個滲透增強劑。適合的滲透增強劑之例可包括例如甘露醇、甘膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、去氧膽酸鈉、水楊酸鈉、辛酸鈉、癸酸鈉、月桂硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂醚或EDTA。
於另一具體實施例中，組成物包括載劑、稀釋劑、賦形劑及/或佐劑。鑑於轉移病毒所針對的適應症，本技術領域中具有通常知識者可容易地選擇適合的載劑。例如，一適合的載劑包括鹽水，其能以許多種緩衝溶液來調配(例如，磷酸鹽緩衝食鹽水)。其他示例性載劑包括無菌的鹽水、乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、葡聚醣、瓊脂、果膠、花生油、芝麻油、及水。緩衝液/載劑應包括防止rAAV黏附到輸液管上但不干擾活體內rAAV結合活性的成分。
可選擇地，除了載體(例如rAAV)及載劑之外，組成物可含有其他習用的醫藥成分，諸如防腐劑、或化學穩定劑。適合的示例性防腐劑包括氯丁醇、山梨酸鉀、山梨酸、二氧化硫、沒食子酸丙酯、對羥基苯甲酸酯類(parabens)、乙基香草醛、甘油、苯酚及對氯苯酚。適合的化學穩定劑包括明膠及白蛋白。
如本文所使用，「載劑」包括任何及所有的溶劑、分散介質、媒劑、塗劑、稀釋劑、抗細菌及抗真菌劑、等張及吸收延遲劑、緩衝液、載劑溶液、懸浮液、膠體等。此種用於醫藥活性物質的介質及藥劑的用途為本技術領域中所熟知。補充的活性成分亦可併入該組成物中。用語「醫藥上可接受」係指當投予至宿主時不會產生過敏或類似的不良反應的分子實體及組成物。遞送媒劑諸如微脂體、奈米膠囊、微粒、微球、脂質顆粒、囊泡等，可用於將本發明之組成物導入適當的宿主細胞中。特別是，可將遞送轉基因的rAAV載體包封於脂質顆粒、微脂體、囊泡、奈米球或奈米顆粒等之任一者中進行調配而用於遞送。
於一具體實施例中，組成物包括適於遞送至受試者之最終調配物，例如，為緩衝至生理上可相容的pH及鹽濃度的水性液體懸浮液。可選擇地，調配物中存在一種或多種界面活性劑。於另一具體實施例中，可將組成物作為濃縮物運輸，其進行稀釋以投予至受試者。於其他具體實施例中，組成物可被冷凍乾燥並在投予時復原。
適合的界面活性劑或界面活性劑的組合可選自無毒的非離子界面活性劑。於一具體實施例中，選擇末端為一級羥基的雙官能嵌段共聚物界面活性劑，例如，諸如Pluronic® F68 [BASF]，亦稱為泊洛沙姆188 (Poloxamer 188)，其具有中性pH，其平均分子量為8400。可選擇其他界面活性劑及其他泊洛沙姆，即由一個聚氧伸丙基(聚(環氧丙烷))之中央疏水鏈及兩側的兩個聚氧伸乙基(聚(環氧乙烷))之親水鏈所構成的非離子三嵌段共聚物、SOLUTOL HS 15(聚乙二醇-15 羥基硬脂酸酯)、LABRASOL(聚乙二醇辛酸甘油酯(Polyoxy capryllic glyceride))、聚乙二醇10油基醚(polyoxy 10 oleyl ether)、TWEEN(聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯)、乙醇及聚乙二醇。於一具體實施例中，調配物含有泊洛沙姆。此等共聚物通常以字母「P」(用於泊洛沙姆)跟三個數字命名：前兩個數字×100給出聚氧伸丙基核心的近似分子量，最後一個數字×10給出聚氧伸乙基含量百分比。於一具體實施例，選擇泊洛沙姆188。界面活性劑能以高至懸浮液的約0.0005%至約0.001%之量存在。
以足夠的量投予載體以轉染細胞並提供基因轉移及表現之足夠的水準，以提供治療益處而沒有不適當的副作用，或具有醫學上可接受的生理作用，此可由醫學領域中具有通常知識者確定。可選擇地，可使用鞘內投予以外的途徑，諸如，例如直接遞送至所欲器官(例如，肝臟(可選擇地經由肝動脈)、肺臟、心臟、眼、腎臟)、口服、吸入、鼻內、氣管內、動脈內、眼內、靜脈內、肌內、皮下、皮內、及其他腸胃外投予途徑。若需要，可合併投予途徑。
載體的劑量將主要取決於諸如待治療的病況、患者的年齡、體重、及健康狀況之因子，因此於患者間可能會變化。例如，病毒載體之治療上有效的人類劑量，一般為範圍約25至約1000微升至約100 mL之溶液含有濃度約1×10 9至1×10 16的基因體病毒載體(以治療平均體重70 kg的受試者)，包括該範圍內的所有整數或分數量，且對於人類患者較佳為1.0×10 12GC至1.0×10 14GC。於一具體實施例中，調配組成物以使每劑含有至少1x10 9、2x10 9、3x10 9、4x10 9、5x10 9、6x10 9、7x10 9、8x10 9、或9x10 9GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例中，調配組成物以使每劑含有至少1x10 10、2x10 10、3x10 10、4x10 10、5x10 10、6x10 10、7x10 10、8x10 10、或9x10 10GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例中，調配組成物以使每劑含有至少1x10 11、2x10 11、3x10 11、4x10 11、5x10 11、6x10 11、7x10 11、8x10 11、或9x10 11GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例中，調配組成物以使每劑含有至少1x10 12、2x10 12、3x10 12、4x10 12、5x10 12、6x10 12、7x10 12、8x10 12、或9x10 12GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例中，調配組成物以使每劑含有至少1x10 13、2x10 13、3x10 13、4x10 13、5x10 13、6x10 13、7x10 13、8x10 13、或9x10 13，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例中，調配組成物以使每劑含有至少1x10 14、2x10 14、3x10 14、4x10 14、5x10 14、6x10 14、7x10 14、8x10 14、或9x10 14GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例中，調配組成物以使每劑含有至少1x10 15、2x10 15、3x10 15、4x10 15、5x10 15、6x10 15、7x10 15、8x10 15、或9x10 15GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於一具體實施例中，對於人類應用，劑量範圍可為每劑1x10 10至約1x10 12GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。
於某些具體實施例中，劑量為範圍約1 x 10 9GC/g腦質量至約1 x 10 12GC/g腦質量。於某些具體實施例中，劑量為範圍約1 x 10 10GC/g腦質量至約3.33 x 10 11GC/g腦質量。於某些具體實施例中，劑量為範圍約3.33 x 10 11GC/g腦質量至約1.1 x 10 12GC/g腦質量。於某些具體實施例中，劑量為範圍約1.1 x 10 12GC/g腦質量至約3.33 x 10 13GC/g腦質量。於某些具體實施例中，劑量為低於3.33 x 10 11GC/g腦質量。於某些具體實施例中，劑量為低於1.1 x 10 12GC/g腦質量。於某些具體實施例中，劑量為低於3.33 x 10 13GC/g腦質量。於某些具體實施例中，劑量為約1 x 10 10GC/g腦質量。於某些具體實施例中，劑量為約2 x 10 10GC/g腦質量。於某些具體實施例中，劑量為約2 x 10 10GC/g腦質量。於某些具體實施例中，劑量為約3 x 10 10GC/g腦質量。於某些具體實施例中，劑量為約4 x 10 10GC/g腦質量。於某些具體實施例中，劑量為約5 x 10 10GC/g腦質量。於某些具體實施例中，劑量為6 x 10 10GC/g腦質量。於某些具體實施例中，劑量為約7 x 10 10GC/g腦質量。於某些具體實施例中，劑量為約8 x 10 10GC/g腦質量。於某些具體實施例中，劑量為約9 x 10 10GC/g腦質量。於某些具體實施例中，劑量為約1 x 10 11GC/g腦質量。於某些具體實施例中，劑量為約2 x 10 11GC/g腦質量。於某些具體實施例中，劑量為約3 x 10 11GC/g腦質量。於某些具體實施例中，劑量為約4 x 10 11GC/g腦質量。於某些具體實施例中，劑量係以rAAV的約1.44×10 13至4.33×10 14GC範圍內的固定劑量(flat dose)投予至人類。於某些具體實施例中，劑量係以rAAV的約1.44×10 13至2×10 14GC範圍內的固定劑量投予至人類。於某些具體實施例中，劑量係以rAAV的約3×10 13至1×10 14GC範圍內的固定劑量投予至人類。於某些具體實施例中，劑量係以rAAV的約5×10 13至1×10 14GC範圍內的固定劑量投予至人類。於一些具體實施例中，組成物可調配成劑量單位，以含有AAV的約1×10 13至8×10 14GC範圍內之AAV的量。於一些具體實施例中，組成物可調配成劑量單位，以含有rAAV的約1.44×10 13至4.33×10 14GC範圍內之AAV的量。於一些具體實施例中，組成物可調配成劑量單位，以含有rAAV的約3×10 13至1×10 14GC範圍內之AAV的量。於一些具體實施例中，組成物可調配成劑量單位，以含有rAAV的約5×10 13至1×10 14GC範圍內之AAV的量。
於某些具體實施例中，載體係以單劑投予至受試者。於某些具體實施例，冀望載體可經由多次注射(例如2劑)遞送。
將調整劑量以平衡治療益處與任何副作用，且此種劑量可依據採用重組載體的治療應用而變化。可監測轉基因之表現水準以確定產生病毒載體的劑量頻率，較佳為含有袖珍基因(minigene)的AAV載體。可選擇地，類似於為了治療目的所描述的劑量方案可被用於使用本文提供的組成物之免疫。
如本文所使用，術語「鞘內遞送」或「鞘內投予」係指經由注射至脊髓管、更具體而言為注射至蜘蛛膜下腔的投予途徑，以使其到達腦脊髓液(CSF)。鞘內遞送可包括腰椎穿刺、室內(包括腦室內(ICV))、枕骨下/腦池內穿刺、及/或C1-2穿刺。例如，可藉由腰椎穿刺手段而導入物質以在整個蜘蛛膜下腔擴散。於另一例，可注射至腦大池。
如本文所使用，術語「腦池內遞送」或「腦池內投予」係指直接進入腦大池小腦延髓之腦脊髓液中的投予途徑，更具體而言係經由枕骨下穿刺或藉由直接注射至腦大池，或者經由永久定位的管子。
包含本文所述用於抑制內源性C9orf72 (例如，在ALS患者中)的miR標靶序列的組成物，通常靶向中樞神經系統中的一種或多種不同細胞類型，包括但不限於神經元(包括例如下運動神經元及/或初級感覺神經元。此等可能包括例如錐狀細胞、浦金埃氏細胞、顆粒細胞、梭狀細胞及聯絡神經元細胞)。
用途 本文提供的載體及組成物有用於治療具有下列的患者：C9orf72相關的病症(例如，ALS或FTD)、神經病變或與其有關的各種症狀。提供治療具有ALS或FTD的患者之組合方案或共同療法。於某些具體實施例中，此方案或共同療法包含共同投予：(a)可操作連接至調節序列的編碼工程化人類C9orf72編碼序列之重組核酸序列，該調節序列指導其在人類標靶細胞中的表現，其中人類C9orf72編碼序列具有SEQ ID NO：13的序列或與其至少95%相同的序列且由於在(b)之miRNA標靶序列中具有錯誤配對而不同於患者中的內源性人類C9orf72，及(b)至少一個miRNA的編碼序列，該miRNA對人類ALS受試者中的內源性人類C9orf72序列具有特異性，其中該mRNA可操作連接至指導其在受試者中表現的調節序列。於某些具體實施例中，miR標靶序列為miR487，具有至少SEQ ID NO：16之序列、或至少SEQ ID NO：15與5’側翼區(例如，SEQ ID NO：5)、連接子、及3’側翼區(例如，SEQ ID NO：7)之組合。於某些具體實施例中，miR標靶序列為miR.NT序列，具有至少SEQ ID NO：6之序列與5’側翼區、連接子、及一連接子和3’側翼區。參見例如，SEQ ID NO：8；或SEQ ID NO：6與SEQ ID NO：5及/或SEQ ID NO：7之組合。
於某些具體實施例中，此治療具有C9orf72的患者之方案或共同療法包含共同投予：(a)可操作連接至調節序列的編碼工程化人類C9orf72編碼序列之重組核酸序列，該調節序列指導其在人類標靶細胞中的表現，其中人類C9orf72編碼序列經工程化成為由於在(b)之miRNA標靶序列中具有錯誤配對而不同於患者中的內源性人類C9orf72，及(b) a至少一個miRNA的編碼序列，該miRNA對人類受試者中的內源性人類C9orf72序列具有特異性，其中該mRNA編碼序列可操作連接至指導其在受試者中表現的調節序列，其中至少一個miRNA編碼序列具有一或多個以下序列：包含SEQ ID NO：16的miRNA編碼序列(具側翼區的miR487)。於某些具體實施例中，核酸分子進一步包含miR標靶序列為miR.NT序列，具有至少SEQ ID NO：6的序列、與5’側翼區、連接子、及一連接子和3’側翼區。參見例如，SEQ ID NO：8；或SEQ ID NO：6與SEQ ID NO：5及/或SEQ ID NO：7的組合。於某些具體實施例中，第一載體包含核酸(a)及一第二之不同的載體，包含至少一個miRNA(b)。於某些具體實施例中，第一載體為病毒載體及/或第二載體為病毒載體，且第一及第二病毒載體可為相同病毒來源或可為不同。於某些具體實施例中，第一載體為非病毒載體，第二載體為非病毒載體且第一及第二載體可為相同組成或可為不同。
可選擇地，本文提供的載體及組成物可用於與一或多種選自下列的協同療法組合：可用於降低某些患者發病率的ALS管理的可取得的批准治療包括利魯唑(riluzole)及依達拉奉(edaravone)。利魯唑為一種口服麩胺酸鹽抑制劑，已被證明可延緩某些ALS患者的呼吸器依賴或氣管切開術的開始。依達拉奉為一種IV投予的神經保護劑，在減緩ALS患者的身體功能喪失方面取得了適度的成功。具ALS的患者亦可受益於多專科照護，包括輔助通訊裝置的實施、營養支持、呼吸器輔助、控制疾病症狀的藥物治療、心理支持以及身體、職業和言語治療。其他適合的協同療法可包括乙醯胺酚(acetaminophen)、及/或非類固醇消炎藥(NSAIDs)。於某些具體實施例中，載體可與涉及一種或多種類固醇(例如強體松(prednisone))的免疫調節方案組合遞送。
如本文所使用，術語電腦斷層造影(CT)係指放射線攝影術，其中藉由電腦自沿軸線製成的一系列平面截面影像而建構身體結構的三維影像。
當指核酸或其片段時，術語「實質上同源」或「實質上相似」係指在與另一核酸(或其互補股)的適當的核苷酸***或刪除進行最佳比對時，於至少約95%至99%的比對序列中有核苷酸序列同一性。較佳地，該同源為全長序列、或其開讀框、或長度至少為15個核苷酸的其他適合的片段。本文描述適合的片段之例。
於核酸序列之上下文中，術語「序列同一性」、「序列同一性百分比」、或「百分比相同」係指兩個序列中當比對以獲得最大對應性時為相同的殘基。序列同一性比較之長度理想可為整個基因體之全長、基因編碼序列之全長、或至少約500至5000個核苷酸之片段。然而，較小片段中的同一性亦為理想，例如至少約9個核苷酸、通常至少約20至24個核苷酸、至少約28至32個核苷酸、至少約36個以上之核苷酸。相似地，可容易地確定整個蛋白質之全長、或其片段的胺基酸序列的「序列同一性百分比」。適合地，片段為至少約8個胺基酸長且可多至約700個胺基酸。本文描述適合的片段之例。
術語「高度保留」意指至少80%同一性，較佳為至少90%同一性，更佳為超過97%同一性。藉由使用本技術領域中具有通常知識者已知的演算法及電腦程式，本技術領域中具有通常知識者可容易地確定同一性。
除非上限範圍另有說明，否則應理解，同一性百分比為最低同一性水準，涵括所有更高水準的同一性，多至與參考序列具有100%同一性。除非另有說明，否則應理解，同一性百分比為最低同一性水準，涵括所有更高水準的同一性，多至與參考序列具有100%同一性。例如，「95%同一性」及「至少95%同一性」可交換地使用且包括與參考序列具有95、96、97、98、99、多至100%及其間的所有分數之同一性。
除非另有指明，數值將被理解為遵從常規的數學四捨五入規則。
一般而言，當提及兩個不同腺相關病毒之間的「同一性」、「同源性」、或「相似性」時，參照「比對」序列來確定「同一性」、「同源性」、或「相似性」。「比對」序列或「比對」係指多個核酸序列或蛋白質(胺基酸)序列，與參考序列相比，通常含有缺失或增加的鹼基或胺基酸的校正。在示例中，使用公開的AAV9序列作為參考點進行AAV比對。使用多種公開或市售的多序列比對程式中的任何一種進行比對。此種程式之例包括：「Clustal Omega」、「Clustal W」、「CAP Sequence Assembly」、「MAP」、及「MEME」，此等可通過網際網路上的網站伺服器進行。此種程式之其他來源為本技術領域中具有通常知識者所知悉。或者，亦可使用Vector NTI應用程式。本領域中亦有許多可用於測量核苷酸序列同一性的已知演算法，包括彼等含於上述程式中者。作為另一例，可使用GCG版本6.1的程式Fasta™，而比較多核苷酸序列。Fasta™提供查詢序列及檢索序列之間最佳重疊區域的比對及序列同一性百分比。例如，核酸序列之間的序列同一性百分比可使用Fasta™及其如GCG版本6.1中所提供的內定參數(字長為6，得分矩陣的NOPAM因子)而確定，其藉由引用併入本文。多序列比對程式亦可用於胺基酸序列，例如，「Clustal Omega」、「Clustal X」、「MAP」、「PIMA」、「MSA」、「BLOCKMAKER」、「MEME」、及「Match-Box」程式。一般而言，儘管本技術領域中具有通常知識者可依需要改變此等設定，但此等程式之任一者皆可於內定設定下使用。或者，本技術領域中具有通常知識者可利用另一種演算法或電腦程式，該演算法或電腦程式至少提供如所引用的演算法及程式所提供的同一性或比對水準。參見例如，J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., “A comprehensive comparison of multiple sequence alignments”, 27(13):2682-2690 (1999)。
應注意的是，術語「一(a或an)」係指一個(種)或多個(種)。如此，術語「一」(a或an)、「一個(種)或以上」及「至少一個(種)」於本文中可互換使用。
詞語「包含」(comprise、comprises、及comprising)被包括性地而不是排他性地解釋。詞語「由…組成」(consist、consisting)及其變體被排他性地而不是包括性地解釋。儘管說明書中的多個具體實施例使用「包含」語句來呈現，但在其他情況下，相關具體實施例亦意圖使用「由…組成」或「實質上由…組成」語句來解釋及描述。
如本文所使用，除非另有指明，術語「約」意指與給定參考值間有10% (±10%，例如，±1、±2、±3、±4、±5、±6、±7、±8、±9、±10、或其兩者之間的值)的變動。
如本文所使用，「疾病」、「病症」及「病況」可互換使用，以表示受試者的不正常狀態。
如本文所使用，術語「C9orf72相關症狀」或「症狀」係指具有ALS症狀的患者中的症狀，包括例如，持續性無力，此可能有不同的表現，一些患者有一個或多個肢體的孤立無力，而其他人最初表現出延髓無力(bulbar weakness)，其會影響控制言語、吞嚥和咀嚼的肌肉。其他表現包括肌張力和肌腱反射異常、進行性肌肉無力的跡象、尤其是在軀幹及四肢的肌肉萎縮、與無法控制運動相關的痙攣。臨床症狀從肌束震顫、肌肉痙攣、步態障礙、無法步行、手臂和手部功能喪失，到言語和吞嚥困難以及呼吸困難。吸入性肺炎和呼吸功能不全為此等患者的常見死因。大約29%的C9orf72重複擴增攜帶者沒有出現ALS 症狀。反而，他們被診斷出患有額顳葉癡呆症(FTD)，其係一種進行性腦部疾病，會影響人格、行為、語言和認知。有些人甚至會出現這兩種病況的特徵，並被診斷為患有ALS-FTD變體。
如本文所使用，「患者」或「受試者」意指用於臨床研究的雄性或雌性人類、及動物模型(包括例如狗、非人類齡長類、囓齒類或其他適合的模型)。於一具體實施例中，此等方法及組成物之受試者為診斷具有C9orf72相關病症的人類。此種病症可包括於C9orf72基因具有缺陷的患者，例如，如與肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)或額顳葉癡呆症(FTD)、或兩者(C9FTD/ALS)相關者。C9orf72重複擴增亦被鑑定為其他神經退行性疾病的罕見原因，包括帕金森氏症(Parkinson's disease)、進行性核上性麻痺(progressive supranuclear palsy)、共濟失調、皮質基底節症候群(corticobasal syndrome)、類亨丁頓氏病症候群(Huntington disease-like syndrome)、庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)及阿茲海默症。於某些具體實施例中，此等方法及組成物之人類受試者為出生前、新生兒、嬰兒、學步兒、學齡前、小學生、青少年、年輕成人或成人。於另一具體實施例中，此等方法及組成物之受試者為兒科患者。
如本文所使用，術語「治療水平」意指C9orf72活性為健康對照之至少約5%、約8%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%、大於100%、約2倍、約3倍、或約5倍。用於測量hC9orf72活性的適合分析為本領域已知。於一些具體實施例中，一種或多種次單元蛋白質的此種治療水平可造成C9orf72相關的ALS或FTD症狀的緩解；逆轉某些C9orf72相關的症狀及/或防止ALS或FTD相關的某些症狀進行；或其任何組合。於某些具體實施例中，藉由無氣管切開述的存活、肺功能改善措施來衡量治療效果，例如，如藉由用力肺活量(FVC)或緩慢肺活量(SVC)來衡量。可使用ALS功能評定量表(ALSFRS-R)確定治療效果的其他合適測量值，其評量粗大動作任務(gross motor tasks)(在床上翻身、走路和爬樓梯)、精細動作任務(fine motor tasks)(切食物、寫字和穿衣/衛生狀況)、延髓功能(說話、吞嚥和流涎)及呼吸功能(呼吸困難、端坐呼吸和需要換氣支持))(Cedarbaum et al., (1999). "The ALSFRS-R：a revised ALS functional rating scale that incorporates assessments of respiratory function. BDNF ALS Study Group (Phase III)." J Neurol Sci. 169(1-2):13-21)。精確的肢體等長強度測試(ATLIS)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症-特異性生活質量簡表(ALSSQOL-SF)。另外或可選擇地，可測量適合的生物標誌物以評估功效。適合的生物標誌物包括例如神經絲重鏈(NFH)和神經絲輕鏈(NFL)、二肽重複蛋白、tau蛋白及/或神經影像學。
於某些具體實施例中，藉由本文提供的組成物及方案遞送的人類C9orf72具有功能性內源性野生型蛋白質的胺基酸序列。於某些具體實施例中，該序列為SEQ ID NO：14或45之胺基酸序列或與功能性人類C9orf72蛋白質為約95至100%同一性之功能性蛋白質。
在本文中的術語「表現」以其最廣泛的含義使用，且包含RNA的產生或RNA及蛋白質的產生。關於RNA，術語「表現」或「轉譯」特別涉及肽或蛋白質的產生。表現可為短暫的或可為穩定的。
另外可選擇地，表現匣(及載體基因體)於UTR中可包含一或多個背根神經節(drg)-miRNA靶向序列，例如，以降低drg-毒性及/或軸突病變(axonopathy)。參見例如，2019年12月20日申請之PCT/US2019/67872，現已公開為WO 2020/132455；PCT/US2021/032002、現已公開為WO2021/231579、2020年5月12日申請之US臨時專利申請案第63/023593號、及2020年6月12日申請之US臨時專利申請案第63/038488號、及US臨時專利申請案第63/279,561號，所有標題皆為「Compositions for Drg-Specific Reduction of Transgene Expression」，此等完整併入本文。於一些具體實施例中，表現匣可經由遺傳元件(例如，質體)遞送至包裝宿主細胞並包裝到病毒載體的衣殼中(例如，病毒顆粒)。
如本文所使用，術語「可操作地連接的」係指與有興趣的基因鄰接的表現控制序列、及以反式或以一距離地作用而控制有興趣的基因之表現控制序列兩者。
當使用於提及之蛋白質或核酸時，術語「異源的」表示該蛋白質或核酸包含在自然界中彼此之間未發現有相同關係的兩個以上的序列或子序列。例如，通常重組產生的核酸，具有二個以上來自無關基因的序列，其排列以產生新的功能性核酸。例如，於一具體實施例中，核酸具有來自一個基因的啟動子，其被安排以指導來自不同基因的編碼序列的表現。如此，參照編碼序列，該啟動子為異源的。
如本文所述，調節元件包含但未限於：啟動子；強化子；轉錄因子；轉錄終止子；有效的RNA加工訊息，如剪接及多腺苷酸化訊息(polyA)；穩定細胞質mRNA的序列，例如土撥鼠肝炎病毒(WHP)轉錄後調節元件(WPRE)；提高轉譯效率的序列(即，科札克共通序列)。
本發明上下文中的術語「轉譯」係關於一個在核糖體的過程，其中mRNA股控制胺基酸序列的組裝以產生蛋白質或肽。
於一具體實施例中，本文提供用於包裝質體的載體基因體包含SEQ ID NO：17，包括縮短的AAV2-5’ ITR；包含C4強化子、CB7啟動子、工程化C9orf72編碼序列及C9miR487標靶序列的表現匣；WPRE元件；及polyA訊息(例如，SEQ ID NO：18或與其至少97%相同的序列之表現匣)、及縮短的AAV2-3’ AAV。於某些具體實施例中，例如，經包裝的rAAV載體，載體基因體包含全長5’ ITR及全長3’ ITR。於某些具體實施例中，載體基因體包含上述載體元件，不具WPRE元件。於某些具體實施例中，載體基因體包含scAAV。
於某些具體實施例中，rAAV或另一載體可含有表現匣，該表現匣在單獨載體中含有miR487靶向序列及C9orf72編碼序列[參見例如，SEQ ID NO：19]或單獨表現匣。於某些具體實施例中，WPRE元件可從表現匣去除及/或以另一基因體元件替代。
除非於本說明書中另有定義，否則本文所用的技術及科學術語具有與本領域中具有通常知識者及參照公開文本所通常理解的相同含義，公開文本為本領域中具有通常知識者提供了本申請案中所使用之許多術語的一般指引。
下列實施例僅為說明性的且未意圖限制本發明。
實施例 下列實施例為說明性且未意圖限制本發明。
實施例1：C9orf72載體策略 我們生成rAAV，該rAAV包含：(1)包含靶向內源性C9orf72之miR序列的表現匣，(2)包含此等miR序列及工程化C9orf72 cDNA的組合的表現匣，該工程化C9orf72 cDNA在表達匣中被miR靶向的C9orf72區域中具有修飾，因此不會被miR靶向。為了減弱(knock down)內源性C9orf72，檢查具有表現各種miRNA序列的載體基因體的rAAV：miR.NT(陰性對照)、miR32-101(陽性對照)、及miR487。
在293 HEK細胞株中以順式質體使用習用三重轉染法構築載體，該順式質體包含要包裝的載體基因體，由5’ ITR、間隔子序列、表現匣、間隔子序列、及3’ ITR所構成。縮短的(130 bp) 5’-及3’ ITRs位於此順式質體中；在複製及包裝期間，此等恢復到全長145 bp 5’及3’ ITRs。此順式質體與包含轉染和包裝所需的Ad輔助基因的反式質體及包含編碼AAV衣殼的VP1基因的反式質體共轉染。於某些小鼠研究中，使用稱為AAV9-eB的AAV9突變體。
實施例2：Tg(C9orf72_3)系112小鼠模型的概念驗證研究 在Tg(C9orf72_3)系112小鼠模型中評估本文所述的rAAV構築體減弱突變體C9orf72 RNA及DPR的能力。經由單次腦室內(ICV)注射，將rAAV投予至成年Tg(C9orf72_3)系112小鼠。選擇劑量範圍以評估從最大可行劑量開始的半對數增量。媒劑處理的轉基因和非轉基因小鼠作為對照。注射後30天，犧牲小鼠，收集腦及脊髓用於分析。選擇30天的時間點以允許有足夠的時間達到C9orf72 RNA和DPR蛋白質的穩態水平。藉由定量rtPCR使用外顯子特異性引子測量總C9orf72 mRNA，並對GAPDH表現進行標準化。使用對C9orf72的第一內含子具有特異性的引子，藉由rtPCR對含有異常重複的轉錄本進行量化。使用Mesoscale Discovery平台，藉由免疫測定法測量DPRs (poly-GP)。
實施例3：Tg(C9orf72_3)系112小鼠模型中最小有效劑量(MED)的鑑定 在Tg(C9orf72_3)系112小鼠模型中評估多劑量的選定的rAAV載體。劑量包括最大可行劑量和超過30倍劑量範圍的半對數增量。rAAV由受過訓練的人員經由單次腦室內(ICV)注射投予至成年Tg(C9orf72_3)系112小鼠。媒劑處理的轉基因和非轉基因小鼠作為對照。每天進行兩次臨床觀察，每週測量體重。對於所有非計劃的死亡，將對完整的組織列表進行全面的大體病理學和組織病理學分析，並酌情進行其他分析以確定可能的死因。注射後90天，犧牲小鼠。選擇90天的時間點來評估突變轉錄本減弱的持久性。收集腦、脊髓、心臟、肺、肝臟、脾臟、腎臟、食道、胃、大腸和小腸、腸系膜和頸部淋巴結、腎上腺、及性腺，檢查大體病理學，並進行組織病理學處理。在組織病理學發現的情況下，對免疫細胞浸潤進行適用的免疫組織化學染色。收集血液用於血清化學檢測和全血細胞計數。如上述，在腦和脊髓中測量含有內含子的C9orf72 RNA及DPR。顯著降低突變體C9orf72 mRNA及DPR表現水平的最低劑量被認為是MED。顯著性將藉由與媒劑對照組的適當統計比較而確定。腦和脊髓的部分以及收集的所有其他組織被固定並包埋在石蠟中用於組織病理學分析。
圖1A至1D提供來自11-14週齡小鼠(C9 L112 Het)脊髓的qPCR結果，該小鼠注射(靜脈內-尾靜脈)3x10 11GC/100 µl之rAAV-PHP.eb-CB7.CI.C9miR. WPRE.rBG，miR為NT或PBS、miR487、miR32、或miR32-101。圖1A提供C9內含子剪接的引子在脊髓的結果。圖1B提供C9內含子保留的引子在脊髓的結果。圖1C及1D提供來自腦的C9內含子剪接的引子(圖1C)或C9內含子保留的引子(圖1D)的qPCR結果。
圖2A-2D提供在poly(GP) Meso Scale Discovery (MSD)-免疫分析中可溶部分DPR蛋白質病理學評估的結果。C57BL/6J-Tg(C9orf72_i3)112Lutzy/J (JR：023099)小鼠顯示在1及3個月齡時在腦溶胞產物及在12個月齡時在脊髓溶胞產物中poly(GP)可溶部分顯著增加，與作為對照之NCAR相比。隨著小鼠年齡的增長，在(G 4C2)149小鼠中觀察到小鼠腦中可溶性部分的DPR減少。數據表示為平均值±SD。以rAAV和媒劑或包含miRNA的rAAV處理C9缺陷小鼠中的poly (GP)反應。圖2A顯示在6、9 & 12個月齡的腦溶胞產物中(G 4C 2) 149小鼠顯示顯著增加poly(GP)可溶部分，與(G 4C 2) 149對照比較。圖2B及2C顯示隨著小鼠年齡的增長，預計(G 4C 2) 149小鼠中可溶部分中的DPR會減少(圖2B)，因為它們在不溶部分中積累(圖2C)。
圖3提供存活曲線，其中對不同組的野生型對照(WT/NCAR)雌性或雄性小鼠或僅接受PBS(VEH)或接受3x10 11之兩種不同的rAAV其中之一的半合子/TG小鼠在數週至14週齡內繪製存活百分比：AAV-1係具有載體基因體為CB7.CI.C9miR487.WPRE.rBG之AAV PHP.eB衣殼，以及AAV-2係具有載體基因體為CB7.CI.C9miR487.WPRE.rBG之AAV PHP.eB衣殼，在4週齡時經由尾靜脈注射。
圖4提供來自圖3描述的動物研究的按組別(雄性和雌性一起)的體重，如從開始(4週齡)到終止的研究。
圖5提供來自圖3描述的動物研究的按組別的雌性體重，如從開始(4週齡)到終止的研究。
圖6提供來自圖3描述的動物研究的按組別的雄性體重，如從開始(4週齡)到終止的研究。
圖7A及7B提供野生型小鼠(WT/NCAR媒劑)(第1組)、僅接受PBS(媒劑)的半合子/TG小鼠及接受3x10 11兩種不同rAAV之一者的兩個治療組的腦中poly(GP)反應：AAV-1係具有載體基因體為CB7.CI. C9miR487.WPRE.rBG之AAV PHP.eB衣殼，及AAV-2係具有載體基因體為CB7.CI.C9miR487.WPRE.rBG 之AAV PHP.eB衣殼；在4週齡時經由尾靜脈注射。圖7A已對背景進行校正且圖7B未對背景進行校正。
實施例4：人類iPSC衍生的運動神經元樣的細胞之脫靶分析 此研究評估rAAV轉導人類運動神經元樣細胞後的脫靶基因減弱。運動神經元樣細胞將根據標準規程從誘導的多能幹細胞(iPSC)中分化(Bianchi et al, 2018, Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Res. 2018 Oct;32:126-134. doi：10.1016/j.scr.2018.09.006. Epub 2018 Sep 26. PMID：30278374.)。藉由形態學和膽鹼乙醯轉移酶染色確認表型。以rAAV轉導細胞。對照細胞以rAAV載體處理，該rAAV載體具有與rAAV測試載體相同的衣殼，其中rAAV測試載體不攜帶miRNA或對照細胞將不接受任何處理。收集細胞用於RNA分離和RNA-seq分析。鑑定了被rAAV測試載體下調的轉錄本。對於每個下調的轉錄本，藉由序列同源性鑑定潛在的miRNA標靶序列，並將評估恒河猴中相應標靶序列之間的同源性程度，以便預測與脫靶基因減弱相關的毒性藉由NHP毒理學研究可被預測的可能性。
實施例5：非人類靈長類的毒理學研究 在成年恒河猴(大約3-10歲)中進行一項為期90天之符合GLP的安全性研究，以研究ICM投予後rAAV測試載體的毒理學。選擇90天評估期是因為此允許轉基因表現有足夠的時間達到穩定高原。選擇動物的年齡以代表意圖的成年患者群體。下表中概述研究設計。恒河猴接受三種劑量水平的rAAV.C9orf72.MiR (3.00 x 10 12GC總量、1.00 x 10 13GC總量、或3.00 x 10 13GC總量；每劑N=3)或媒劑(ITFFB；N=2)。選擇的劑量水平與計劃的MED中評估的劑量水平相當，當按腦質量縮放時(假設成年小鼠大腦為0.4克，成年恒河猴腦為90克)，此等劑量涵蓋建議的臨床劑量水平範圍。使用相同於用於臨床試驗的載體遞送裝置對NHP進行投劑。在毒理學研究開始之前優化載體遞送裝置和投予程序，以確保可重複和準確的載體遞送。實際投予的載體劑量水平和任何與設備相關的載體損失將在此研究報告中提供。將進行基線神經系統檢查、完整的身體檢查、體重和日常觀察，包括食慾評估、臨床病理學(具有差異的細胞計數、臨床化學和凝血組)、CSF化學和CSF細胞學。在rAAV測試載體或媒劑投予後，每天監測動物的痛苦跡象和異常行為。血液和CSF臨床病理學評估和神經學檢查在rAAV測試載體或媒劑投予後30天每週進行一次，之後每30天進行一次。在基線和此後的每個30天時間點，抗AAV NAb和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)對rAAV的反應藉由干擾素γ(IFN-γ)酶聯免疫斑點(ELISpot)試驗進行評估。
rAAV或媒劑投予後90天，將動物安樂死。收穫了一份完整的組織清單(腦、脊髓、DRG、周圍神經、心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、食道、胃、大腸和小腸、腸系膜和頸部淋巴結、腎上腺、及性腺），適當稱重，並進行組織病理學分析。此外，從肝臟、脾臟和骨髓中採集淋巴細胞，以評估屍檢時此等器官中是否存在對載體衣殼有反應的T細胞。藉由組織樣本中的qPCR評估載體生物分布。載體基因體亦可在血清和CSF樣本中進行量化。藉由分析在尿液和糞便中檢測到的載體基因體來評估載體分泌。
表.符合恒河猴GLP的毒理學研究
組名
1 2 3 4
N 2 3 3 3
性別/年齡 M+F M+F M+F M+F
年齡 3–10歲 3–10歲 3–10歲 3–10歲
體重 3–12 kg 3–12 kg 3–12 kg 3–12 kg
測試物 媒劑 rAAV.C9orf72.MiR rAAV.C9orf72.MiR rAAV.C9orf72.MiR
ROA ICM ICM ICM ICM
載體劑量 (總劑量) N/A 3.00 x 10 12GC 1.00 x 10 13GC 3.00 x 10 13GC
屍檢日 90 90 90 90
媒劑將由ITFFB (具0.001% Pluronic F-68的人工CSF)所組成。 縮寫：CSF，腦脊髓液； F，女性； GLP，良好實驗室規範； GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；M，男性；N，動物數量；N/A，不適用；ROA，投予途徑。
實施例6：首次人體臨床試驗計畫書概要
第1/2期開放標籤、多中心劑量遞增研究以評估遞送至具有肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)的成年受試者的腦大池(ICM)中的單劑量rAAV.C9orf72.miR之安全性及耐受性，該肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)係由 C9orf72基因的第一內含子中致病性六核苷酸重複擴增所引起。
受試者數量： 多至12個可評估之受試者
目的： 主要的安全性：●      通過以下評量，評估rAAV.C9orf72.miR在投予單次ICM劑量後12個月內的安全性及耐受性： ○      不良事件(AEs)及嚴重不良事件(SAEs) ○      生命體徵和身體檢查 ○      神經學檢查 ○      心電圖(ECG) ○      感覺神經傳導研究(用於評估DRG毒性) ○      實驗室評估(血清化學、血液學、凝血研究、肝功能測試[LFTs]、尿液分析及CSF化學和細胞學) ○      載體(衣殼)之免疫原性 主要功效：●      評估rAAV.C9orf72.miR對治療後12個月內無氣管切開存活率的影響 次要：●      基於以下終點，評估在單次ICM劑量投予後rAAV.C9orf72.MiR在12個月內的藥效學及生物學活性： ○      在CSF中之DPR (polyGP蛋白質)水平 ○      在CSF及血清中之神經絲輕鏈(NFL)水平 ●      評估rAAV.C9orf72.MiR在投予單次ICM劑量後12個月的功效，如以下方式測量： ○      永久換氣時間 ○      ALS功能評定量表(ALSFRS-R) ○      肺功能，肺計量(SVC) 探測：●      進一步評估rAAV.C9orf72.MiR在投予單次ICM劑量後12個月內的功效，如下方式測量： ○      肢體等長強度精確測試(ATLIS)試驗 ○      肌肉萎縮性脊髓側索硬化症-特異性生活質量簡表(ALSSQOL-SF) ●      進一步評估在單次ICM劑量後12個月內rAAV.C9orf72.MiR的藥效學作用，如下方式測量： ○      CSF中的神經絲重鏈(NFH) ○      CSF中的p-Tau：t-Tau比率 ○      腦MRI上運動皮質區和皮質下結構的腦室體積變化及萎縮 ○      皮質脊髓束的擴散張量磁共振影像(Diffusion-tensor magnetic resonance imaging (DT-MRI))
研究設計： 此為在具有ALS的成年受試者中藉由單次ICM注射投予的rAAV.C9orf72.MiR之第1/2期、FIH、多中心、開放標籤、單臂、劑量遞增研究，ALS係由 C9orf72基因的第一內含子中致病性六核苷酸重複擴增所引起。將在12個月內評估安全性及耐受性、藥效學、及臨床功效，並在rAAV.C9orf72.MiR投予後5年內對所有受試者進行追蹤，以長期評估安全性及耐受性、藥效學、疾病進展、及臨床結果。此試驗將由一個篩選階段所組成，以確定從大約第–35天到第–1天，群組1和群組2中每個潛在受試者的資格。確認合格後，受試者將接受基線評估，包括腦部MRI、CSF收集的LP、抽血、尿液收集、生命體徵(vitals)、EGG、身體檢查及臨床評估。基線評估將在第–1天和第0天進行，資格將在投予rAAV.C9Oorf72.MiR之前的基線處重新確認。加入群組3的受試者將從大約第–120天到第–90天經歷上述相同的篩選評估，然後將進入90天的觀察期，在此期間將評量疾病表現。在預治療階段結束時，將評估疾病進展，進展迅速的受試者將接受rAAV.C9orf72.MiR。疾病進展緩慢的受試者將不會繼續參加試驗。 在治療期期間，受試者將在第0天早上入院。受試者將在第0天接受單次ICM劑量的rAAV.C9orf72.MiR，並在投劑後至少留院24小時進行觀察。隨後的研究訪視將在治療後第7天、第14天、第30天、3個月、6個月、9個月和12個月進行，以及LTFU訪視將在投劑後18個月、24個月和每年至5年進行。 此試驗將由以下三個作為單次ICM注射投予的rAAV.C9orf72.MiR之群組所組成： ●      群組1 (低劑量)：三名符合條件的受試者(受試者#1-3)將依次編入群組中並投予低劑量的rAAV.C9orf72.MiR，每個受試者間有4週的安全觀察期。若未觀察到SRT，則在群組1中的第三名受試者投予rAAV.C9orf72.MiR後4週，獨立的安全委員會將評估所有可用的安全數據。 ●      群組2 (高劑量)：若決定繼續進行，將依次編入三名符合條件的受試者(受試者#4–6)並給予高劑量的rAAV.C9orf72.MiR，每個受試者間有4週的安全觀察期。若未觀察到SRT，安全委員會將在受試者#6投劑後4週評估所有可用的安全性數據，包括來自群組1受試者的安全性數據。 ●      群組3 (MTD)：在安全委員會提出積極建議之前，將編入大約6名被定義為快速進展者(受試者#7–12)的符合條件的受試者，並以MTD投予單次ICM劑量的rAAV.C9orf72.MiR。此群組中受試者的投劑不會與每個受試者之間的4週安全觀察期錯開，且在沒有SRTs的情況下，於此群組不需要安全委員會審查。基於已發布的存活及生物標記物數據的建模以及預期的效果大小，可在最終方案中進一步調整建議的樣本大小。 累計地，我們預期在高劑量或低劑量群組任一者有9名受試者入組，而總共有12名受試者(跨所有劑量)。
納入標準 群組1及群組2： ●      ≥25歲且≤75歲的男性及女性 ●      基於世界神經病學聯合會修訂標準的明確、很可能或臨床可能的ALS診斷 ●      C9orf72GGGGCC致病的重複擴增＞36次重複 ●      ECAS總分數≥105 ●      在篩選訪視後18個月內出現ALS疾病症狀，包括四肢無力 ●      用力肺活量(FVC)測量值≥性別、身高和年齡預測值的70% ●      未使用過利魯唑，或者，若有使用利魯唑，在篩選訪視前至少30天使用穩定劑量的利魯唑，並願意在試驗期間維持利魯唑劑量。 群組3： ●      必須符合上述所有納入標準才有資格編入預處理階段。 ●      在90天治療前導入期(run-in phase)結束時，必須確認上述資格標準，並且受試者必須在90天導入期期間經歷ALSFRS-R總分下降3分或以上。
排除標準 ●      永久性氣管切開術或換氣 ●      被診斷患有ALS-FTD或ALS並伴有認知障礙的患者 ●      任何肢體的Ashworth改良評分≥4 ●      無法提供完全同意或缺乏充分接觸之可以提供同意的具合法授權的看護者 ●      MRI、ICM遞送或LP的禁忌症(例如，局部感染、血小板減少症、凝血病、顱內壓升高(由於佔位性病灶(space occupying lesion)、螢光影像的禁忌症的[ICP]) ●      免疫功能不全的患者 ●      具有人類免疫缺陷病毒(HIV)或者C型肝炎的陽性檢測結果的患者 ●      非由於 C9orf72重複擴增所引起的惡性腫瘤或慢性中樞神經系統疾病 ●      研究者的意見認為可能對患者構成風險的藥物，諸如免疫抑制藥物或全身性皮質類固醇。非類固醇類抗炎藥(NSAID)若在篩選前30天以穩定劑量使用並且同意在試驗期間保持相同劑量，則可接受 ●      研究者的意見認為可能導致與C9orf72重複擴增無關的認知障礙的任何併發疾病，包括神經梅毒、腦積水、中風、小血管缺血性疾病、不受控制的甲狀腺功能減退症或維生素缺乏症 ●      於有生育能力的女性，在篩選訪視時通過血清妊娠試驗證實為陽性尿液，在投予研究產品前第1天通過血清結果證實為陽性尿液，或不願在試驗期間進行額外的妊娠試驗。 ●      於有生育潛力的男性和女性，不願使用醫學上可接受的雙重屏障避孕方法(諸如與殺***劑一起使用的避孕套/隔膜)或從篩選之日到載體投予後12個月期間禁慾 ●      在篩選前30天內或在該臨床試驗中使用的研究產品的5個半衰期內，以較長者為準，以研究產品編入任何其他臨床試驗 ●      先前的基因治療 ●      編入30天內需要住院的任何急性疾病 ●      任何當前或先前的病況、身體檢查或實驗室試驗發現，研究者認為，此等發現會使受試者處於不適當的風險或會干擾研究產品的評估或受試者安全性或研究結果的解釋
研究產品 rAAV.C9orf72.MiR
投予途徑及程序 rAAV.C9orf72.MiR將在第0天通過實時CT引導下枕下注射到腦大池，以作為單劑投予給住院受試者。 在第0天，與研究相關的研究藥房將準備含有適當力價的5.6 mL rAAV.C9orf72.MiR的注射器，並將其運送到手術室。在研究藥物投予之前，受試者將被麻醉、插管，準備注射部位並使用無菌技術覆蓋。將進行LP以移除預定體積的CSF，之後將IT注射碘造影劑以幫助可視化腦大池的相關解剖結構。IV造影劑可在針***之前或期間作為IT造影劑的替代方法進行投予。使用IV或IT造影劑的決定由執行該程序的介入醫生自行決定。在CT螢光鏡引導下，將一根脊椎穿刺針(22–25 G)送入腦大池。可使用更大的穿刺針來協助針的放置。確認穿刺針放置後，將擴充組連接到脊髓穿刺針上並注入CSF。根據介入醫生的判斷，可以將含有造影劑的注射器連接到延長裝置並注射少量以確認穿刺針放置在腦大池中。確認穿刺針放置後，將含有rAAV.C9orf72.MiR的注射器連接到擴充組。注射器內容物將在1-2分鐘內緩慢注射，遞送5.0 mL的體積。
安全性評估 在研究計劃中指定的時間進行安全性評估，包括AEs及SAEs的收集、身體和神經學檢查、生命體徵、臨床實驗室測試（血清化學、血液學、凝血、LFT、尿液分析）、ECG、神經傳導研究、以及CSF細胞學和化學(細胞計數、蛋白質、葡萄糖)。
本說明書中列出的所有專利、專利公開案及其他出版物，如2022年1月10日申請之US臨時專利申請案第63/298,046號，以及其序列表，藉由引用併入本文。儘管已經參考特定較佳具體實施例描述本發明，但應當理解，可於不脫離本發明的精神的情況下進行修改。此種修改意圖落入所附申請專利權利的範疇內。
無
圖1A至1D提供來自11-14週齡小鼠(C9 L112 Het)脊髓的qPCR結果，該小鼠注射(靜脈內-尾靜脈) 3 x 10 11GC/100 µl之rAAV-PHP.eb-CB7.CI.C9miR.WPRE.rBG，miR為NT或PBS、miR487、miR32、或miR32-101。圖1A提供C9內含子剪接的引子在脊髓的結果。圖1B提供C9內含子保留的引子在脊髓的結果。圖1C及1D提供來自腦的C9內含子剪接的引子(圖1C)或C9內含子保留的引子(圖1D)的qPCR結果。 圖2A-2D提供在poly(GP) Meso Scale Discovery (MSD)-免疫分析中可溶部分DPR蛋白質病理學評估的結果。C57BL/6J-Tg(C9orf72_i3)112Lutzy/J (JR：023099)小鼠顯示在1及3個月齡時在腦溶胞產物及在12個月齡時在脊髓溶胞產物中poly(GP)可溶部分顯著增加，與作為對照之NCAR相比。隨著小鼠年齡的增長，在(G 4C 2)149小鼠中觀察到小鼠腦中可溶性部分的DPR減少。數據表示為平均值±SD。以rAAV和媒劑或包含miRNA的rAAV處理C9缺陷小鼠中的poly (GP)反應。圖2A顯示在6、9 & 12個月齡的腦溶胞產物中(G 4C 2) 149小鼠顯示顯著增加poly(GP)可溶部分，與(G 4C 2) 149對照比較。圖2B及2C顯示隨著小鼠年齡的增長，預計(G 4C 2) 149小鼠中可溶部分中的DPR會減少(圖2B)，因為它們在不溶部分中積累(圖2C)。 圖3提供存活曲線，其中對不同組的野生型對照(WT/NCAR)雌性或雄性小鼠或僅接受PBS(VEH)或接受3x10 11之兩種不同的rAAV其中之一的半合子/TG小鼠在數週至14週齡內繪製存活百分比：AAV-1係具有載體基因體為CB7.CI.C9miR487.WPRE.rBG之AAV PHP.eB衣殼，以及AAV-2係具有載體基因體為CB7.CI.C9miR487.WPRE.rBG之AAV PHP.eB衣殼，在4週齡時經由尾靜脈注射。 圖4提供來自圖3描述的動物研究的按組別(雄性和雌性一起)的體重，如從開始(4週齡)到終止的研究。 圖5提供來自圖3描述的動物研究的按組別的雌性體重，如從開始(4週齡)到終止的研究。 圖6提供來自圖3描述的動物研究的按組別的雄性體重，如從開始(4週齡)到終止的研究。 圖7A及7B提供野生型小鼠(WT/NCAR媒劑)(第1組)、僅接受PBS(媒劑)的半合子/TG小鼠及接受3x10 11兩種不同rAAV之一者的兩個治療組的腦中poly(GP)反應：AAV-1係具有載體基因體為CB7.CI.C9miR487.WPRE.rBG之AAV PHP.eB衣殼，及AAV-2係具有載體基因體為CB7.CI.C9miR487.WPRE.rBG 之AAV PHP.eB衣殼；在4週齡時經由尾靜脈注射。圖7A已對背景進行校正且圖7B未對背景進行校正。
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無。

Claims (16)

  1. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含AAV衣殼及包裝於其中的載體基因體，其中該載體基因體包含： (a)編碼功能性人類C9蛋白質之工程化人類C9orf72編碼序列； (b)位於(a)與(c)之間的間隔子序列； (c)至少一個miRNA編碼序列，該miRNA編碼序列對C9orf72患者中的內源性人類c9orf72核酸序列的靶位點具有特異性； 其中(a)之該工程化核酸序列缺少(c)之至少一個miRNA的靶位點，因而防止至少一個miRNA靶向該工程化c9orf72編碼序列；及 (d)可操作連接至(a)和(c)之調節序列，該調節序列指導其在細胞中的表現。
  2. 如請求項1之rAAV，其中該AAV衣殼係選自AAVhu68、AAVrh91、AAV9、AAVhu95、AAVhu96、或AAV1衣殼。
  3. 如請求項1或2之rAAV，其中該工程化C9ORF72編碼序列具有SEQ ID NO：13之核酸序列或與其至少80%相同的序列。
  4. 如請求項1至3中任一項之rAAV，其中該工程化C9orf72編碼序列具有SEQ ID NO：13之核酸序列或與其至少約90%相同的序列。
  5. 如請求項1至4中任一項之rAAV，其中該至少一個miRNA包含一或多個miRNA靶向序列之序列，其包含5’側翼區、至少SEQ ID NO：15 (miR487)或與SEQ ID NO：15至少99%相同的序列、及3’側翼區，其中該至少一個miRNA不結合至(a)之該工程化C9orf72編碼序列或其編碼的傳訊RNA(mRNA)。
  6. 如請求項5之rAAV，其中該5’側翼選自SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：22之序列。
  7. 如請求項1至6中任一項之rAAV，其中該間隔子的長度為75個核苷酸至約250個核苷酸。
  8. 如請求項1至7中任一項之rAAV，其中該至少一個miRNA編碼序列係在該工程化C9orf72編碼序列的3’側。
  9. 如請求項1至7中任一項之rAAV，其中該至少一個miRNA編碼序列係位於內含子序列中。
  10. 如請求項1至9中任一項之rAAV，其中該至少一個miRNA編碼序列進一步包含一個或多於一個的miRNA編碼序列。
  11. 如請求項1至10中任一項之rAAV，其中在該載體基因體中的該調節序列進一步包含組成型啟動子(constitutive promoter)。
  12. 如請求項11之rAAV，其中該啟動子為CB7啟動子，該CB7啟動子包含細胞巨大病毒(cytomegalovirus)立即早期強化子及雞β-肌動蛋白啟動子。
  13. 如請求項1至10中任一項之rAAV，其中該調節序列包含神經元特異性啟動子。
  14. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至13中任一項之rAAV、及醫藥上可接受的水性懸浮液、賦形劑、及/或稀釋劑。
  15. 一種適合治療具有C9orf72相關病症的患者之如請求項1至13中任一項之重組AAV或如請求項14之組成物。
  16. 一種於製造用於治療具有C9orf72相關病症的患者的藥物中使用的如請求項1至12中任一項之重組AAV。
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