CN106470736B - 包括表达双抗体构建体的aav的组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

描述了一种重组腺伴随病毒(AAV)，该病毒具有一个AAV衣壳并且其中包装一种在细胞中表达两种功能性抗体构建体的异源核酸。还描述了包含来自异源抗体的一条重链和一条轻链的抗体。在一个实施例中，这些抗体由包含以下各项的载体共表达：一个第一表达盒，该第一表达盒在指导其表达的调节控制序列控制下编码第一免疫球蛋白的至少一个第一开放阅读框(ORF)；以及一个第二表达盒，该第二表达盒包含在指导其表达的调节控制序列控制下的一个第二ORF、一个接头和一个第三ORF，其中该第二ORF和该第三ORF是针对第二免疫球蛋白构建体和第三免疫球蛋白构建体。在一个实施例中，共表达这两种抗体构建体的载体是AAV，其中该5’和3’ITR侧接这些表达盒和调节序列。

Description

包括表达双抗体构建体的AAV的组合物及其用途
以电子形式提交的材料的通过引用结合
申请人特此通过引用结合与此同时以电子形式提交的序列表材料。此文件标记为“14-7032PCT_Seq Listing_ST25.txt”。
背景技术
已证实单克隆抗体为癌症和其他疾病的有效治疗剂。目前抗体治疗通常涉及与许多缺点有关的重复给药和长期治疗方案，这些缺点诸如每次给药的不一致血清水平和有限的功效持续时间，使得需要频繁的重复给药以及高成本。使用抗体作为诊断工具和治疗模态已在最近几年发现逐渐增加的用途。用于癌症治疗的第一个FDA批准的单克隆抗体
Figure BDA0001150733040000011
(利妥昔单抗)在1997年批准用于治疗患有非霍奇金淋巴瘤的患者并且随后在1995年批准一种人源化单克隆抗体
Figure BDA0001150733040000012
用于治疗患有转移性乳腺癌的患者。许多基于抗体的治疗剂在临床发展的不同阶段中显示是有前景的。如果不同单克隆抗体治疗获得成功，则表明下一代生物药物将涉及抗体鸡尾酒，即抗体混合物。
抗体技术的广泛临床应用的一个限制是，典型地对于治疗功效需要大量的抗体并且与生产有关的成本是显著的。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、SP20和NSO2骨髓瘤细胞是最常使用的用于商业规模生产糖基化人类蛋白诸如抗体的哺乳动物细胞系。从哺乳动物细胞系生产中获得的产率的范围典型地在分批发酵罐中培养5-7天后是50-250mg/L或者在补料分批发酵罐中培养7-12后是300-1000mg/L。
腺伴随病毒(AAV)是用于递送治疗性基因的希望的载体，因为它具有安全特性和在体内长期基因表达的能力。重组AAV载体(rAAV)先前已用于在体内表达单链和全长抗体。由于AAV有限的转基因包装能力，使用单一AAV载体使紧密调节的***表达抗体的重链和轻链以便生成全长抗体是一种技术性的挑战。
在本领域中仍需要以用于治疗用途的单一组合物递送两种抗体。
发明内容
在此提供了一种重组腺伴随病毒(AAV)，该病毒具有一个AAV衣壳，该AAV衣壳中已包装一种在细胞中表达两种功能性抗体的异源核酸。在一个实施例中，该重组AAV包含编码一条免疫球蛋白轻链的一个ORF、编码一条第一免疫球蛋白重链的一个第二ORF和编码一条第二重链的一个第三ORF，由此这些表达的功能性抗体构建体包含具有不同特异性的两条不同重链，共享一条轻链。在一个实施例中，具有不同特异性的两种抗体与具有两种单特异性抗体的特异性的第三种双特异性抗体共表达。
在一个实施例中，该rAAV包含：一个5’AAV反向末端重复序列(ITR)；一个第一表达盒，该第一表达盒在指导其表达的调节控制序列控制下编码第一免疫球蛋白的至少一个第一开放阅读框(ORF)；一个第二表达盒，该第二表达盒包含在指导其表达的调节控制序列控制下的一个第二ORF、一个接头和一个第三ORF，其中该第二ORF和第三ORF编码一种第二免疫球蛋白构建体和第三免疫球蛋白构建体；以及一个3’AAV ITR。
提供了一种药物组合物，该药物组合物包括表达至少两种功能性抗体构建体的一种重组AAV和药学上可接受的载体。在一个实施例中，该至少两种功能性抗体具有不同特异性。任选地，还共表达一种双特异性抗体。
提供一种组合物，该组合物包括具有不同特异性的至少两种功能性抗体，其中这些抗体各自具有相同的轻链和一条不同的重链。该轻链是来自与这些抗体之一或二者的重链不同的来源。在一个实施例中，表达了两种功能性单特异性抗体和一种双功能抗体。在一个实施例中，抗体的比率是约25:约50:约25的同源二聚体抗体:双特异性抗体:同源二聚体抗体。
提供一种递送两种功能性抗体至受试者的方法，该方法包括向该受试者给予一种重组AAV。
本发明的其他方面和优点将从本发明的以下详细描述中显而易见。
附图简要说明
图1A是示出一种表达含有第一重链和第二重链以及一条轻链的两种单特异性抗体构建体以及第三种双特异性抗体的载体的一种示例性排列的动画，该轻链可以是来自与该第一重链和第二重链所来源的抗体之一或二者异源的抗体。此排列利用一个共享增强子，该增强子是双向的并且分开了一个第一表达盒与一个第二表达盒。示出了三个开放阅读框(ORF)。L是指一个接头。pA1是指第一polyA并且pA2是指第二polyA。MP1是指第一最小启动子并且MP2是指第二最小启动子。对于每个表达盒而言，该polyA和该MP可以是相同或不同的。
图1B是示出一种表达含有第一重链和第二重链以及一条轻链的两种抗体构建体以及第三种双特异性抗体的载体的一种替代性示例性排列的动画，该轻链可以是来自与该第一重链和第二重链所来源的抗体之一或二者异源的抗体。此排列利用了一个共享polyA。E1是指第一增强子并且E2是指第二增强子。对于每种表达盒而言，这些可以是相同或不同的增强子。类似地，MP1和MP2可以是相同或不同的。
图2示出由包装到AAV衣壳内的质粒携带的一种核酸分子，该核酸分子用于共表达抗-TSG 101重链、FI6流感重链和FI6轻链。这些抗体链利用了来自白细胞介素2(IL2)的异源前导序列。人类CMV增强子与CMV启动子结合使用。双顺反子表达盒包含弗林蛋白酶(furin)识别位点以及分开含有FI6VL和CL区的ORF与含有FI6重链的ORF的一个2A接头。在右侧的表达盒的polyA是截短的胸苷激酶polyA。在左侧的表达盒的polyA是合成的polyA序列。
图3示出由在此所述地制备的重组AAV8与C05抗体共表达的FI6v3k2抗体的结合能力。结果显示预期的FI6与全长HA和HA茎的特征性结合和C05与HA和仅HA头(非茎)的特征性结合。
图4A-图4B示出由在此所述地制备的重组AAV8与1A6抗体(抗-TSG101)共表达的FI6v3k2抗体的结合能力。图4A是示出与蛋白A的结合捕捉混合物中的总单克隆抗体的条形图(阴性对照由左侧的竖条表示，抗体混合物由右侧的竖条表示)。图4B是示出与TSG101肽的结合仅捕捉含有1A6重链的MAB(上线)的图。这些数据表明当与FI6v3k2共表达时，1A6抗体保留其重链所来源的抗体的结合特异性。
图5示出在以1×1011基因组拷贝(GC)或1×1010GC剂量给予由AAV共表达的FI6和第二抗体的小鼠中的全身性表达水平。
图6A-图6B示出以1×1011GC进行肌内(IM)递送以免于受到流感病毒株PR8攻击的影响的AAV9.BiD.FI6v3_CR8033mAb的评估。图6A是示出体重变化百分比的线状图。圆圈表示具有双向启动子的表达具有相同异源轻链的合成FI6v3和CR8033单克隆抗体的AAV9构建体。正方形表示也以1×1011GC递送的阳性对照，即表达单一抗体类型FI6的AAV9，并且三角形表示初试动物。图6B示出攻击后的存活。
图7A-图7B示出以1×1011GC进行肌内(IM)递送以免于受到流感病毒株B/Lee/40攻击的影响的AAV9.BiD.FI6v3_CR8033mAb的评估。图7A是示出体重变化百分比的线状图。圆圈表示具有双向启动子的表达具有相同异源轻链的合成FI6和CR8033单克隆抗体的AAV9构建体。正方形表示也以1×1011GC递送的阳性对照，即表达单一抗体类型CR8033的AAV9，并且三角形表示初试动物。图7B示出攻击后的存活。
图8A是示出小鼠模型中在给予表达FI6v3和TCN两种单克隆抗体的AAV之后的保护的图，如由几天内小鼠体重表示的。顶线(菱形)表示25微克(μg/mL)的剂量并且底线表示0.4μg/mL。
图8B是示出小鼠模型中在给予表达FI6v3和IA6两种单克隆抗体的AAV之后的保护，如由几天内小鼠体重表示的。顶线(菱形)表示263.2微克(μg/mL)的剂量并且底线表示36.5μg/mL。
图8C是示出小鼠模型中在给予表达FI6v3和CR8033两种单克隆抗体的AAV之后的保护，如由几天内小鼠体重表示的。顶线(菱形)表示126.3微克(μg/mL)的剂量并且底线表示6.9μg/mL。
发明详细描述
在此提供了一种载体，该载体通过共表达两条不同重链和单一轻链来递送至少两种功能性抗体，这些重链和轻链当在细胞中表达时形成具有不同特异性的两种功能性抗体，即识别不同抗原(或配体)的抗体。还表达一种第三功能性抗体并且该功能性抗体是双特异性的，具有两种单特异性抗体各自的重链。典型地，第三抗体以低于两种单特异性抗体的水平表达。一种载体可以用于在体内有效产生将利用至少两种抗体的组合物，或者一种产生抗体的宿主细胞可以被工程化为包含针对两条不同重链和一条单一类型的轻链的表达盒。因此，本发明还包括一种表达两种单特异性抗体和一种双特异性的第三抗体的混合物的宿主细胞，单特异性抗体中的每种抗体具有不同的特异性但含有相同的轻链。在一个希望的实施例中，载体被设计为在载体所给予的受试者中递送三种不同的抗体构建体。
在一个实施例中，该载体是一种包装在AAV衣壳内的重组AAV，该重组AAV是一种含有编码两条不同重链和一条单一轻链的序列的核酸分子，这些重链和轻链当共表达时形成两种功能性单特异性抗体，即具有第一重链和该轻链的第一抗体和具有第二重链和该轻链的第二抗体，以及具有这些重链各自之一和相同轻链以使成为双特异性抗体的第三抗体。
“功能性抗体”可以是以足够结合亲和力结合选定的靶标(例如，在癌细胞或病原体诸如病毒、细菌或寄生虫上的抗原)以实现希望的生理学结果的一种抗体或免疫球蛋白，该生理学结果可以是保护性(例如，被动免疫)或治疗性的。
在此提供的AAV载体可以含有多至十个免疫球蛋白结构域的1、2或3个开放阅读框(ORF)。如在此所用的，“免疫球蛋白结构域”是指参考常规全长抗体所定义的抗体重链或轻链的结构域。更具体地说，一种全长抗体包含一种具有以下四个结构域的重链(H)多肽：一个N-末端可变区(VH)和三个C-末端恒定区(CH1、CH2和CH3)；以及一种具有以下两个结构域的轻链(L)多肽：一个N-末端可变区(VL)和一个C-末端恒定区(CL)。一个Fc区含有两个结构域(CH2-CH3)。一个Fab区可以含有重链和轻链各自的一个恒定结构域和一个可变结构域。
于在此所述的AAV载体中，可以表达两种全长重链多肽(各自有4个结构域)和一种轻链多肽(两个结构域)。在一个希望的实施例中，两种重链多肽具有不同的特异性，即针对不同靶标。因此，这些载体适用于单独或组合地表达抗体混合物。
如在此所用的，“不同特异性”是指参考的免疫球蛋白构建体(例如，全长抗体、重链或能够结合特异性靶标的其他构建体)结合不同靶位点。适合的是，在一种双表达的抗体构建体中，两种特异性是非重叠和/或非干预的，并且可以任选地彼此增强。如在此所述的两种抗体(免疫球蛋白)构建体通过结合相同病原体上的不同靶位点或相同靶位点(例如，病毒蛋白或肿瘤)来赋予不同特异性。此类不同靶抗原可以是相同病毒类型的不同病毒株(例如，两种不同流感病毒株)或者两种不同抗原(例如，抗病毒和抗癌抗原、两种不同抗癌构建体、以及其他抗原)。例如，第一重链多肽可以与轻链组合以形成具有第一特异性的一种抗体构建体，第二重链多肽可以与轻链组合以形成具有第二特异性的一种第二抗体构建体，并且第一重链和第二重链可以与该轻链组合以形成一种双特异性抗体。这些抗体可以任选地针对单一靶标(例如，选定的病毒、细菌、真菌或寄生虫病原体上的不同靶位点)上的不同抗原位点(表位)或者针对不同靶标。例如，来自两种抗体的重链可以针对流感病毒，并且可以共表达以形成两种单特异性抗体(例如，可以选择来自流感病毒FI6、CR8033和CO5的重链)并且表达为具有一条选定的轻链，并形成一种双特异性抗体。适合的流感抗体和其他抗空气传播病原体抗体构建体的实例以及一种用于递送它们的方法描述于例如WO 2012/145572A1。这些抗体还可以针对不同靶标(例如，抗病毒抗体，包括慢性病毒感染、与癌症相关的病毒感染、或不同抗肿瘤细胞表面蛋白或其他靶标)。适合的病毒靶标的实例包括流感血球凝集素蛋白或其他病毒蛋白、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人***瘤病毒(HPV)、埃-巴二氏病毒、人疱疹病毒、呼吸道合胞体病毒、以及其他病毒蛋白。因此，本发明特别适用于治疗和被动预防需要抗体组合的病症。
在此使用的术语“免疫球蛋白”包括抗体以及其功能性片段。抗体可以许多形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、骆驼源化单一结构域抗体、细胞内抗体(“胞内抗体”)、重组抗体、多特异性抗体(双特异性)、抗体片段诸如Fv、Fab、F(ab)2、F(ab)3、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、单链可变片段抗体(scFv)、串联/双-scFv、Fc、pFc’、scFvFc(或scFv-Fc)、二硫键Fv(dsfv)、双特异性抗体(bc-scFv)诸如BiTE抗体；骆驼抗体、表面重构抗体、人源化抗体、完全人抗体、单一结构域抗体(sdAb，也称为
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)、嵌合抗体、包含至少一个人类恒定区的嵌合抗体、以及类似抗体。“抗体片段”是指免疫球蛋白可变区中结合其靶标例如肿瘤细胞的至少一部分。在一个实施例中，免疫球蛋白是IgG。然而，可以选择其他类型的免疫球蛋白。在另一个实施方案中，所选定的IgG亚型是IgG1。然而，可以选择其他同种型。另外，可以选择IgG1同种异型中的任一项。
术语“异源性”当结合蛋白质或核酸使用时表明该蛋白质或核酸包含在自然界中未发现彼此间的相同关系的两个或更多个序列或子序列。例如，该核酸典型地是重组产生的，具有来自不相关基因的排列成产生一种新的功能性核酸的两个或更多个序列。例如，在一个实施例中，核酸具有来自一种基因的排列成指导编码序列从一个不同基因表达的一个启动子。因此，相对于该编码序列，该启动子是异源的。术语“异源轻链”是含有来自一种抗体的可变结构域和/或恒定结构域的一条轻链，该抗体具有不同于重链特异性的靶特异性。
由包装在载体内的核酸分子携带的两个或更多个ORF可以由两个表达盒表达，这两个表达盒之一或二者可以是双顺反子的。由于表达盒含有来自两种不同抗体的重链，则希望的是在这两个重链序列之间引入序列变化，以使得同源重组的可能性最小化。典型地，在两种抗体的可变结构域之间存在足够的变化(VH-Ab1和VH-Ab2)。然而，希望的是确保在第一抗体(Ab1)和第二抗体(Ab2)的恒定结构域之间，最优选地在每个CH1区、CH2区和CH3区中存在足够的编码序列变化。例如，在一个实施例中，第一抗体的重链恒定区可以具有SEQID NO:1的nt 1至705的序列(该序列编码了SEQ ID NO:2的氨基酸1-233)或与其约95％至约99％相同而未引入任何氨基酸变化的一个序列。在一个实施例中，这些区的序列的变化以同义密码子形式引入(即引入核酸序列的变化而无任何氨基酸水平的变化)。例如，第二重链可以具有相对于CH1、CH2和/或CH3至少15％、至少约25％、至少约35％不同(即，约65％至约85％相同)的恒定区。
一旦选定靶标和免疫球蛋白，就可以获得和/或合成所选定免疫球蛋白(例如，一条或多条重链和/或轻链)的编码序列。用于对核酸(例如，RNA和DNA)进行测序的方法是本领域技术人员已知的。一旦核酸序列已知，就可以推导出氨基酸并且接着存在将氨基酸序列转换回到核酸编码序列的基于网络的和可商购获得的计算机程序，以及服务类公司。参见，例如EMBOSS的backtranseq，http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/；Gene Infinity(http://www.geneinfinity.org/sms/sms_backtranslation.html)；ExPasy(http:// www.expasy.org/tools/)。在一个实施例中，RNA和/或cDNA编码序列被设计用于在人类细胞中进行最佳表达。用于合成核酸的方法是本领域技术人员已知的并且可以用于所有或部分在此所述的核酸构建体。
密码子优化的编码区可以通过各种不同方法来设计。此优化可以使用在线可用的方法(例如，GeneArt)、公开的方法或提供密码子优化服务的公司例如像DNA2.0(加利福尼亚州门洛帕克(Menlo Park,CA))来进行。一种密码子优化算法描述于例如美国专利申请号WO 2015/012924中，该专利申请通过引用结合在此。还参见例如美国专利公开号2014/0032186和美国专利公开号2006/0136184。适合的是，修改产物的开放阅读框(ORF)的整个长度。然而，在一些实施例中，仅可以改变该ORF的一个片段。通过使用这些方法之一，可以将频率应用于任何给定的多肽序列，并且产生编码该多肽的密码子优化的编码区的一个核酸片段。
许多选项可用于对密码子进行实际改变或者可用于合成如在此所述地设计的密码子优化的编码区。此类改变或合成可以使用本领域普通技术人员已熟知的标准和常规分子生物学操作来进行。在一种方法中，通过标准方法合成各自长度为80-90个核苷酸且跨越希望的序列的长度的一系列互补寡核苷酸对。这些寡核苷酸对被合成为使得在退火时它们形成80-90个碱基对的双链片段，这些双链片段含有黏性末端，例如在该对中的各寡核苷酸被合成来延伸超过与该对中另一寡核苷酸互补的区域3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个碱基。每对寡核苷酸的单链末端被设计为用另一对寡核苷酸的单链末端退火。允许这些寡核苷酸对退火，并且然后允许约五至六个这些双链片段经由粘性单链末端一起退火，并且随后它们连接在一起并克隆到标准细菌克隆载体中，例如可获自加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen Corporation,Carlsbad,Calif)的
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载体。然后通过标准方法对该构建体测序。制备由连接在一起的80至90个碱基对片段的5至6个片段(即约500个碱基对的片段)组成的这些构建体中的若干构建体，以使得整个希望的序列以一系列质粒构建体表示。然后用适当的限制性酶切割这些质粒的***物并且将其连接在一起以形成最终构建体。然后将最终构建体克隆到标准细菌克隆载体中，并进行测序。另外的方法对于技术人员而言将立即是清楚的。另外，基因合成易于商购获得。
任选地，为了增加两条抗体重链之间的序列多样性和/或出于另一目的，氨基酸取代可以引入到一个重链恒定区中。用于进行此类比对的方法和计算机程序是可用的并且是本领域技术人员已熟知的。取代还可以书写为(由单个字母代码鉴别的氨基酸)-位置#-(由单个字母代码鉴别的氨基酸)，由此第一氨基酸是被取代的氨基酸并且第二氨基酸是在指定位置进行取代的氨基酸。如在此所用的术语“取代”和“氨基酸的取代”以及“氨基酸取代”是指氨基酸序列中的一个氨基酸被另一个氨基酸置换，其中后者不同于被置换的氨基酸。用于置换氨基酸的方法是本领域技术人员已熟知的并且包括但不限于编码该氨基酸序列的核苷酸序列的突变。制备IgG中的氨基酸取代的方法描述于例如WO 2013/046704，该专利通过引用结合在此，以讨论氨基酸修饰技术。
术语“氨基酸取代”及其上述同义词旨在包括通过用另一种进行取代的氨基酸置换一种氨基酸来修饰氨基酸序列。该取代可以是一种保守性取代。参考两个氨基酸，术语保守性旨在意指这些氨基酸共享由本领域技术人员识别的一种共有性质。参考两个氨基酸，术语非保守性旨在意指这些氨基酸在由本领域技术人员识别的至少一种性质中具有差异性。例如，此类性质可以包括具有疏水性非酸性侧链的氨基酸、具有疏水性侧链(可以进一步分成酸性或非酸性)的氨基酸、具有脂族疏水性侧链的氨基酸、具有芳族疏水性侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有带电荷侧链的氨基酸、具有带电荷酸性侧链的氨基酸、以及具有带电荷碱性侧链的氨基酸。天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸二者均是本领域已知的并且在实施例中可以用作进行取代的氨基酸。因此，一种保守性氨基酸取代可以涉及用具有疏水性侧链的一种不同氨基酸转换具有疏水性侧链的第一氨基酸；而一种非保守性氨基酸取代可以涉及用具有不同侧链例如碱性疏水性侧链或亲水性侧链的一种不同氨基酸转换具有酸性疏水性侧链的第一氨基酸。可以通过本领域技术人员测定其他保守性或非保守性转换。在其他实施例中，为了实现在此所鉴定的目标，在一个给定位置的取代将是一个氨基酸或一组氨基酸之一，这对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
为了表达选定的免疫球蛋白结构域，可以设计一种核酸分子，该核酸分子包含已选择用于在选定的哺乳动物种类例如人类中最佳表达免疫球蛋白多肽的密码子。另外，核酸分子可以包含用于所选定抗体的每条重链和轻链的一个异源前导序列，该前导序列编码在由可变区和恒定区组成的重链多肽上游融合的野生型或突变型IL-2信号前导肽。然而，另一个异源前导序列可以被取代为IL-2信号肽之一或二者。对于每个重链和轻链免疫球蛋白构建体而言，信号肽/前导肽可以是相同或不同的。这些肽可以是在免疫球蛋白(例如，IgG)中天然可见的信号序列，或者可以是来自一个异源来源。此类异源来源可以是细胞因子(例如，IL-2、IL12、IL18或类似细胞因子)、胰岛素、白蛋白、β-葡糖醛酸糖苷酶、碱性蛋白酶或纤连蛋白分泌信号肽、以及其他来源。
如在此所用的，“表达盒”是指包含至少一个第一开放阅读框(ORF)和任选地第二ORF的核酸序列。一个ORF可以包含两个、三个或四个抗体结构域。例如，ORF可以包含一条全长重链。或者，ORF可以包含一个或两个抗体结构域。例如，该ORF可以包含一个重链可变结构域和一个单一重链恒定结构域。在另一个实例中，该ORF可以包含一个轻链可变区和一个轻链恒定区。因此，一个表达盒可以被设计成双顺反子的，即设计成包含指导其上的ORF从共享调节序列表达的调节序列。在此情况下，两个ORF典型地被一个接头分开。适合的接头诸如内部核酶结合位点(IRES)和/或弗林蛋白酶-2a自身裂解肽接头(F2a)[参见例如，拉德克利夫(Radcliffe)和米特罗法诺斯(Mitrophanous)，基因治疗(Gene Therapy)(2004),11,1673-1674]是本领域已知的。适合的是，该ORF可操作地连接至指导靶细胞内的表达的调节控制序列。此类调节控制序列可以包括polyA、启动子和增强子。为了促进来自AAV载体的共表达，第一表达盒和第二表达盒可以共享该增强子和/或polyA序列中的至少一个。
在一个实施例中，该rAAV已包装在选定的AAV衣壳内，该衣壳是包含以下各项的一种核酸分子：5’ITR、第一表达盒、双向增强子和第二表达盒、以及3’ITR，其中双向增强子分开该第一表达盒和该第二表达盒。图1A在此被提供为此实施例的一个实例。例如，在这个实施例中，第一表达盒的第一启动子是位于双向增强子左侧，接着是至少一个第一开放阅读框、以及一个polyA序列、以及第二启动子。另外，第二表达盒的第二启动子是位于双向增强子右侧，接着是至少一个第二开放阅读框和一个polyA序列。第一启动子和第二启动子以及第一polyA序列和第二polyA序列可以是相同或不同的。为了节省空间，可以选择最小启动子和/或最小polyA。典型地，在此实施例中，每个启动子位于增强子序列附近(在左侧或右侧(或者5’或3’))并且这些polyA序列位于ITR附近，其中ORF位于它们之间。虽然图1A是说明性的，但是ORF的顺序可以改变，由它们编码的免疫球蛋白结构域也一样。例如，轻链恒定序列和可变序列可以位于增强子左侧并且两条重链可以由位于增强子右侧的ORF编码。或者，这些重链之一可以位于该增强子左侧并且这些ORF位于该增强子右侧，编码一条第二重链和一条轻链。或者，相反的构型是可能的，在该增强子左侧的表达盒可以是双顺反子的。或者，根据所编码的结构域，两个表达盒可以是单顺反子的(例如，编码两种免疫黏附素)，或者二者可以是双顺反子的(例如，编码两个完整的FAB)。
在另一个实施例中，该rAAV已包装在选定的AAV衣壳内，该衣壳是包含以下各项的一种核酸分子：5’ITR、第一表达盒、双向起作用的polyA、以及第二表达盒、以及3’ITR，其中双向polyA分开该第一表达盒和该第二表达盒并对它们起作用。图1B在此被提供为此实施例的一个实例。在此实施例中，第一增强子和第二启动子(或增强子/启动子组合)位于5’ITR的右侧，接着是一个或多个ORF和双向polyA。第二表达盒通过双向polyA与第一表达盒分开并且在相反定向中转录。在此表达盒中，增强子和启动子(或者启动子/增强子组合)位于3’ITR附近并且该一个或多个ORF位于双向polyA附近。虽然图1B是说明性的，但是ORF的顺序可以改变，由它们编码的免疫球蛋白结构域也一样。例如，轻链恒定序列和可变序列可以位于polyA左侧并且两条重链可以由位于polyA右侧的一个或多个ORF编码。或者，这些重链之一可以位于该polyA左侧并且位于该polyA右侧的这些ORF编码一条第二重链和一条轻链。或者，相反的构型是可能的，在该polyA左侧的表达盒可以是双顺反子的。或者，根据所编码的结构域，两个表达盒可以是单顺反子的(例如，编码两种免疫黏附素)，或者二者可以是双顺反子的。
任选地，在图1A和图1B中举例说明的且在此所述的表达构型可以用于共表达其他免疫球蛋白构建体。例如，两种免疫黏附素(IA)可以由两个单顺反子表达盒表达的。免疫黏附素包括作为含有融合至Fc结构域(CH2-CH3)的单链可变片段(scFv)单元(即连接至VL的VH或连接至VH的VL)(例如，VH-VL-CH2-CH3或VL-VH-CH2-CH3)的单一开放阅读框表达的抗体形式。或者，多至四个scFv可以由两个双顺反子表达盒表达。在另一个替代方案中，IA可以与全长抗体共表达。在另一个替代方案中，一个完整FABS可以与全长抗体共表达或者两个完整FAB可以共表达。在另一个实施例中，可以共表达全长抗体、IA或FAB片段的其他组合。
适合的调节控制序列可以选自并获自各种来源。在一个实施例中，可以利用最小启动子和/或最小polyA，以节省空间。
如在此所用的，术语“最小启动子”意指包含TATA-盒和用于指定转录起始位点的其他序列的短DNA序列，在该转录起始位点处添加用于控制表达的调节元件。在一个实施例中，启动子是指包含最小启动子和能够控制编码序列或功能性RNA的表达的调节元件的一个核苷酸序列。此类型的启动子序列由近端元件和更远端的上游元件组成，后者的元件通常被称为增强子。在一个实施例中，最小启动子是巨细胞病毒(CMV)最小启动子。在另一个实施例中,最小启动子是源自人类CMV(hCMV)诸如hCMV立即早期启动子来源的最小启动子(参见，US 20140127749、以及戈森(Gossen)和布杰德(Bujard)(美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，1992,89:5547-5551)，这些文献通过引用结合在此)。在另一个实施例中，最小启动子是源自病毒来源，例如像：SV40早期或晚期启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、或劳氏肉瘤病毒(RSV)早期启动子；或源自真核细胞启动子，例如β肌动蛋白启动子(Ng，核酸研究(Nuc.Acid Res.)17:601-615,1989；昆彻(Quitsche)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)264:9539-9545,1989)、GADPH启动子(亚历山大，M.C.(Alexander,M.C.)等人，美国国家科学院院刊85:5092-5096,1988；埃尔科拉尼，L.(Ercolani,L.)等人，生物化学杂志263:15335-15341,1988)、TK-1(胸苷激酶)启动子、HSP(热休克蛋白)启动子、UbB或UbC启动子、PGK、Ef1-α启动子或任何含有TATA盒的真核生物启动子(美国公开申请号2014/0094392)。在另一个实施例中，最小启动子包括迷你启动子，诸如美国公开申请号2014/0065666中所述的CLDN5迷你启动子。在另一个实施例中，最小启动子是胸苷激酶(TK)启动子。在一个实施例中，最小启动子是组织特异的，诸如肌肉细胞特异性启动子最小TnISlow启动子、最小TnIFast启动子或肌肉肌酸激酶启动子中的一个(美国公开申请号2012/0282695)。这些文件各自通过引用结合在此。
在一个实施例中，聚腺苷酸化(poly(A))信号是最小poly(A)信号，即有效聚腺苷酸化所需要的最小序列。在一个实施例中，最小poly(A)是合成的poly(A)，诸如在莱维特(Levitt)等人，基因发育(Genes Dev.)，1989年7月，3(7):1019-25；以及夏(Xia)等人，自然生物技术(Nat Biotechnol.)2002年10月；20(10):1006-10.电子版2002年9月16日中所述的poly(A)。在另一个实施例中，poly(A)是源自兔的β-珠蛋白poly(A)。在一个实施例中，polyA双向起作用(安(An)等人，2006,美国国家科学院院刊(PNAS)，103(49):18662–18667。在一个实施例中，poly(A)是源自SV40早期poly A信号序列。这些文件各自通过引用结合在此。
如在此所述的，在一个实施例中，单一增强子或相同增强子可以调节质粒构建体中多个异源基因的转录。适用于本发明的各种增强子是本领域已知的并且包括例如CMV早期增强子、Hoxc8增强子、nPE1和nPE2。在此适用的另外的增强子描述于安德森(Andersson)等人，自然(Nature)，2014年3月，507(7493):455-61中，该文献通过引用结合在此。其他增强子元件可以包括例如载脂蛋白增强子、斑马鱼增强子、GFAP增强子元件、以及组织特异性增强子(诸如WO 2013/1555222中所述的增强子)、土拨鼠肝炎后的转录后调节元件。另外地或可替代地，可以选择其他元件例如混合的人巨细胞病毒(HCMV)-立即早期(IE)-PDGR启动子或其他启动子-增强子元件。为了增强表达，其他元件可以是内含子(如普洛麦格(promega)内含子或嵌合的鸡珠蛋白样人免疫球蛋白内含子)。在此适用的其他启动子和增强子可见于哺乳动物启动子/增强子数据库(Mammalian Promoter/Enhancer Database)，可见于http://promoter.cdb.riken.jp/。
在此所述的构建体可以进一步包含其他表达控制或调节序列，例如像包括适当转录起始序列、终止序列、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及当需要时，增强所编码产物的分泌的序列。启动子可以是选自组成型启动子、组织特异性启动子、细胞特异性启动子、响应于生理信号的启动子或可调节启动子[参见，例如，WO 2011/126868和WO 2013/049492]。
这些控制序列“可操作地连接”至免疫球蛋白构建体基因序列。如在此所使用，术语“可操作地连接”是指与感兴趣的基因邻接的表达控制序列，以及在相反侧或在远处起作用以控制感兴趣的基因的表达控制序列两者。
适用于控制抗体结构域的表达的组成型启动子的实例包括但不限于鸡β-肌动蛋白(CB)或来自其他种类的β肌动蛋白启动子、人巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)的早期和晚期启动子、U6启动子、金属硫蛋白启动子、EFlα启动子、泛素启动子、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)启动子、二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子(斯查夫曼(Scharfmann)等人，美国国家科学院院刊88:4626-4630(1991))、腺苷脱氨酶启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子、丙酮酸激酶启动子、磷酸甘油变位酶启动子、β-肌动蛋白启动子(赖(Lai)等人，美国国家科学院院刊86:10006-10010(1989))、UbB、UbC、莫洛尼白血病毒和其他逆转录酶病毒的长末端重复序列(LTR)、单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子以及本领域技术人员已知的其他组成型启动子。适用于本发明的组织特异性或细胞特异性启动子的实例包括但不限于，对于内皮细胞特异的内皮素-I(ET-I)和Flt-I、FoxJ1(它靶向纤毛细胞)。
适用于控制抗体结构域的表达的诱导型启动子包括对外源物质(例如，药理学试剂)或生理学信号反应的启动子。这些反应元件包括但不限于，结合HIF-Iα和β的低氧反应元件(HRE)；金属离子反应元件，诸如由梅奥(Mayo)等人(1982，细胞(Cell)29:99-108)；布林斯特(Brinster)等人(1982，自然(Nature)296:39-42)和塞尔(Searle)等人(1985，分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)5:1480-1489)所述的元件；或者热休克反应元件，诸如努尔(Nouer)等人(于：热休克反应(Heat Shock Response)，编者努尔，L.，CRC，佛罗里达州博卡拉顿(Boca Raton,Fla.)，第I67-220页,1991)所述的反应元件。
在一个实施例中，开放阅读框的表达是由提供对ORF(基因)转录的紧密控制的可调节型启动子控制的，该启动子例如药理学试剂或由药理学试剂活化的转录因子，或者在替代性实施例中是生理学信号。作为可以使用的配体依赖性转录因子复合物的可调节型启动子的实例包括但不限于，由其对应配体(例如，糖皮质激素、***、孕酮、类视色素、蜕皮激素、以及其类似物和模拟物)活化的细胞核受体超家族成员以及由四环素活化的rTTA。此类***的实例包括但不限于，ARGENTTM转录技术(马萨诸塞州坎布里奇ARIAD医药公司(ARIAD Pharmaceuticals,Cambridge,Mass.))。此类启动子***的实例描述于例如WO2012/145572中，该专利通过引用结合在此。
其他启动子可以包括例如人巨细胞病毒(CMV)立即-早期增强子/启动子、SV40早期增强子/启动子、JC多瘤病毒启动子、髓磷脂碱性蛋白(MBP)或神经胶质元纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、单纯疱疹病毒(HSV-1)潜伏相关启动子(LAP)、劳氏肉瘤病毒(RSV)长末端重复序列(LTR)启动子、神经元特异性启动子(NSE)、血小板衍生生长因子(PDGF)启动子、hSYN、黑素浓集激素(MCH)启动子、CBA、神经胶质元纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、基质金属蛋白启动子(MPP)、以及鸡β-肌动蛋白启动子。对于每个表达盒而言，这些启动子可以是相同或不同的。
供产生AAV病毒载体(例如，重组(r)AAV)之用，表达盒可以被携带在递送至包装宿主细胞中的任何适合的载体(例如质粒)上。可以对在本发明中有用的质粒进行工程化，这样使得它们适用于在原核细胞、哺乳动物细胞、或两者中复制和包装。适合的转染技术和包装宿主细胞是已知的并且/或者可以容易通过本领域技术人员来设计。
用于生成并分离适用作载体的AAV的方法是本领域已知的。通常参见，例如里格尔(Grieger)和萨穆尔斯基(Samulski)，2005，“作为基因治疗载体的腺相关病毒：病毒发展、产生和临床应用(Adeno-associated virus as a gene therapy vector:Vectordevelopment,production and clinical applications)”，生物化学工程化/生物技术的进展(Adv.Biochem.Engin/Biotechnol.)99:119-145；步宁(Buning)等人，2008，“腺相关病毒载体技术的最新发展(Recent developments in adeno-associated virus vectortechnology)”，基因医学杂志(J.Gene Med.)10:717-733；以及以下引用的参考文献，这些文献各自通过引用以其整体结合在此。对于将转基因包装到病毒体中，ITR是在与含有这些表达盒的核酸分子相同的构建体中需要的顺式的唯一AAV组分。可以提供反式的cap和rep基因。
如上所述的，除非另外指明，否则术语“约”当用于修饰一个数值时意指±10％的变化。
如贯穿本说明书和权利要求书所用的，术语“包括(comprise)”和“含有(contain)”以及其变体(包括“包括了(comprises)”、“包括的(comprising)”、“含有了(contains)”和“含有的(containing)”)以及其他变体是包括其他组件、元件、整体、步骤等。术语“由...组成(consists of或consisting of)”是将其他组件、元件、整体、步骤等排除在外的。
在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下，术语“相同的”或“一致性”百分比是指相同的或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即相对于指定区域约70％一致性，优选地75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高一致性(例如，当相对于比较窗或指定区域对最大对应性进行比较和比对时在此提供的修饰ORF中的任一种)的两个或更多个序列或子序列，如使用采用下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动比对和目视观测所测量的(参见，例如，NCBI网站或类似网站)。作为另一个实例，可以使用GCG 6.1版本的程序Fasta比较多核苷酸序列。Fasta提供了查询序列与搜索序列之间最佳重叠区域的比对和序列一致性百分比。例如，核酸序列之间的序列一致性百分比可以是使用采用其默认参数(字号6和评分矩阵的NOPAM系数)的Fasta所测量的，如以GCG 6.1版本所提供的，该程序通过引用结合在此。总体上，这些程序以默认设置使用，尽管本领域技术人员可以根据需要改变这些设置。或者，本领域技术人员可以利用另一种算法或计算机程序，该算法或程序提供至少与通过参考算法和程序所提供的一样的一致性或比对水平。此定义还是指或者可以应用于序列的互补。此定义还包括具有缺失和/或添加的序列、以及具有取代的序列。如以下所述的，优选的算法可以说明间隙等。优选地，在一个区域上存在长度是至少约25、50、75、100、150、200个氨基酸或核苷酸的一致性，并且常常在一个区域上存在长度是225、250、300、350、400、450、500个氨基酸或核苷酸的一致性或者在全长氨基酸或核酸序列上存在一致性。
典型地，当基于氨基酸序列制备比对时，该比对包含相对于参考AAV序列鉴定的***和缺失并且氨基酸残基的编号是基于针对比对所提供的参考尺度。然而，任何给定的AAV序列可以具有比该参考尺度更少的氨基酸残基。在本发明中，当讨论亲本序列时，术语“相同位置”或“对应位置”是指相对于比对序列的参考尺度，氨基酸位于每个序列中的相同残基编号处。然而，当不是进行比对时，每种蛋白质可以具有位于不同残基编号处的这些氨基酸。使用许多公用或商购获得的多序列比对程序中的任一种进行比对。序列比对程序可供用于氨基酸序列，这些程序例如“Clustal X”、“MAP”、“PIMA”、“MSA”、“BLOCKMAKER”、“MEME”、以及“Match-Box”程序。总体上，任何这些程序均以默认设置使用，尽管本领域技术人员可以根据需要改变这些设置。或者，本领域技术人员可以利用另一种算法或计算机程序，该算法或程序提供至少与通过参考算法和程序所提供的一样水平的一致性或比对。参见，例如，J.D.汤姆斯(J.D.Thomson)等人，核酸研究(Nucl.Acids.Res.)，“多序列比对的综合性比较(A comprehensive comparison of multiple sequence alignments)”，27(13):2682-2690(1999)。
在一个实施例中，在此所述的表达盒被工程化到一个遗传元件(例如，穿梭质粒)中，该遗传元件将其中携带的免疫球蛋白构建体序列转移到包装的宿主细胞中，以产生一种病毒载体。在一个实施例中，选定的遗传元件可以通过任何适合的方法递送至AAV包装细胞中，该方法包括转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA涂覆粒子、病毒感染以及原生质体融合。还可以制备稳定的AAV包装细胞。或者，这些表达盒可以用于生成除AAV之外的病毒载体，或者用于在体外产生抗体混合物。用于制备此类构建体的方法对核酸操作技术人员而言是已知的并且包括基因工程、重组工程和合成技术。参见，例如，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，编者格林(Green)和萨姆布鲁克(Sambrook)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Press)，纽约冷泉港(ColdSpring Harbor,NY)(2012)。
AAV载体
重组AAV载体(AAV病毒颗粒)可以包含包装在AAV衣壳内的含有5’AAV ITR、在此所述的表达盒和3’AAV ITR的的核酸分子。如在此所用的，表达盒可以包含用于每个表达盒内的一个或多个开放阅读框的调节元件并且该核酸分子可以任选地包含另外的调节元件。
该AAV载体可以包含全长AAV 5’反向末端重复序列(ITR)和全长3’ITR。已描述截短形式的5’ITR，它也称为ΔITR，其中D-序列和末端分离位点(trs)缺失。缩写“sc”是指自身互补。“自身互补AAV”是指其中由重组AAV核酸序列携带的编码区已被设计为形成分子内双链DNA模板的一种构建体。在感染时，未等待细胞介导的第二条链合成，而是两条互补的半scAAV将缔合以形成易于立即复制和转录的一条双链DNA(dsDNA)。参见D M·麦卡迪(D MMcCarty)等人，“自身互补重组腺相关病毒(scAAV)载体独立于DNA合成而促进高效转导(Self-complementary recombinant adeno-associated virus(scAAV)vectors promoteefficient transduction independently of DNA synthesis)”，基因治疗(GeneTherapy)，(2001年8月)，第8卷，第16期，第1248-1254页。自身互补的AAV描述于例如美国专利号6,596,535；7,125,717；以及7,456,683，这些专利各自通过引用以其整体结合在此。
在假型AAV将产生的情况下，ITR是选自不同于AAV衣壳来源的来源。例如，AAV2ITR可以被选择来与具有针对选定的细胞受体、靶组织或病毒靶标的特定功效的AAV衣壳一起使用。在一个实施例中，为了方便起见使用来自AAV2的ITR序列或者其缺失形式(ΔITR)，以加速法规性审批。然而，可以选择来自其他AAV来源的ITR。在ITR的来源是来自AAV2并且AAV衣壳是来自另一种AAV来源的情况下，所得载体可以被称为假型。然而，可以使用其他来源的AAV ITR。
已描述许多AAV衣壳。生成AAV载体的方法已广泛描述于文献和专利文件中，包括例如WO 2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；US 7588772B2。AAV衣壳的来源可以是选自靶向希望的组织的AAV。例如，适合的AAV可以包括例如AAV9[US 7,906,111；US2011-0236353-A1]、rh10[WO 2003/042397]和/或hu37[参见，例如US 7,906,111；US 2011-0236353-A1]。然而，其他AAV，包括例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、[美国专利7790449；美国专利7282199]以及其他AAV。然而，可以选择其他AAV衣壳的来源和其他病毒元件，其他免疫球蛋白构建体和其他载体元件也可以一样。
提供了一种单链AAV病毒载体。用于生成并分离适用于递送至受试者的AAV病毒载体的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利7790449；美国专利7282199；WO 2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；以及US 7588772B2]。在一个***中，用编码由ITR侧接的转基因的构建体和编码rep和cap的构建体瞬时转染生产细胞系。在第二***中，用编码由ITR侧接的转基因的构建体瞬时转染稳定供应rep和cap的包装细胞系。在这些***的每种***中，响应于用辅助腺病毒或疱疹病毒感染而产生AAV病毒体，从而需要从污染的病毒中分离rAAV。最近，已开发了不需要用辅助病毒感染来回收AAV的***—通过该***还反式地提供需要的辅助功能(即，腺病毒E1、E2a、VA和E4或疱疹病毒UL5、UL8、UL52和UL29、以及疱疹病毒聚合酶)。在这些较新的***中，可以通过用编码需要的辅助功能的构建体瞬时转染***来提供辅助功能，或者这些细胞可以被工程化为稳定包含编码这些辅助功能的基因，这些基因的表达可以被控制在转录水平或转录后水平下。在另一种***中，通过用基于杆状病毒的载体进行感染来将由ITR侧接的转基因和rep/cap基因引入到昆虫细胞中。关于这些产生***的评论，通常参见，例如，张(Zhang)等人，2009，“用于大规模重组腺相关病毒产生的腺病毒腺相关病毒杂交体(Adenovirus-adeno-associated virushybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production)”，人类基因治疗(Human Gene Therapy)20:922-929，这些文献各自的内容通过引用以其整体结合在此。用于制备和使用这些和其他AAV产生***的方法还描述于以下专利中，这些专利的内容通过引用以其整体结合在此：5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823；以及7,439,065。
用途和方案
该rAAV，优选地悬浮于生理相容性载体中，可以被给予至人类或非人类哺乳动物患者。适合的载体可以容易由本领域技术人员根据传递的病毒所针对的适应症来选择。例如，一种适合的载体包括可以用许多缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)配制的盐水。其他示例性载体包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、麦芽糖、以及水。对载体的选择不是对本发明的限制。任选地，本发明的组合物除了rAAV和一种或多种载体之外，还可以包含其他常规药物成分如防腐剂、或化学稳定剂。
用于使用这些rAAV例如进行被动免疫的方法描述于例如WO 2012/145572中。其他递送方法和用途对于本领域技术人员而言将是显而易见的。例如，如在此所述的一种方案除在此所述的一种或多种组合之外，还包括与生物药物、小分子药物、化学治疗剂、免疫增强剂、辐射、手术等中的一种或多种的其他组合。如在此所述的一种生物药物是基于肽、多肽、蛋白质、酶、核酸分子、载体(包括病毒载体)或类似物。
在一种组合治疗中，在用另一种药剂实施治疗之前、过程中或之后、以及其任何组合，即在实施该治疗之前和过程中、之前和之后、过程中和之后、或者之前、过程中和之后给予在此所述的递送AAV的免疫球蛋白构建体。例如，该AAV可以是在实施辐射治疗之前的1与30天之间，优选地在3与20天之间，更优选地在5与12天之间给予。在本发明的另一个实施例中，化学治疗与AAV介导的免疫球蛋白(抗体)治疗同时给予，或者更优选地在此之后给予。仍在其他实施例中，本发明的组合物可以与其他生物药剂例如重组单克隆抗体药物、抗体-药物缀合物或类似药物组合。另外，在此类方案中可以使用不同的递送AAV的免疫球蛋白构建体的组合诸如以上所讨论的组合。
任何适合的方法或路径可以用于给予如在此所述的含AAV组合物，并且任选地用于共同给予其他活性药物或治疗剂与在此所述的AAV介导的抗体的组合。给予路径包括例如全身性给药、口服给药、静脉内给药、腹膜内给药、皮下给药、或肌肉内给药。
在此所述的免疫球蛋白构建体的靶标可以是选自许多病原体，包括例如细菌、病毒、真菌、以及寄生虫感染剂。适合的靶标可以进一步包括癌症或癌症相关抗原或类似靶标。其他靶标可以包括自身免疫病状，诸如类风湿性关节炎(RA)或多发性硬化症(MS)。
病毒靶标的实例包括来自正粘液病毒科的流感病毒，该病毒科包括：A型流感、B型流感和C型流感。A型病毒是毒性最大的人类病原体。A型流感与流行病相关的血清型包括在1918年引起西班牙流感并在2009年引起猪流感的H1N1；在1957年引起亚洲流感的H2N2；在1968年引起香港流感的H3N2；在2004年引起禽流感的H5N1；H7N7；H1N2；H9N2；H7N2；H7N3；以及H10N7。
已描述针对A型流感的广泛中和性抗体。如在此使用的，“广泛中和性抗体”是指一种可以中和来自多种亚型的多种病毒株的中和抗体。例如，CR6261[斯克瑞普斯研究所/库赛尔公司(Scripps Institute/Crucell)]已被描述为结合广泛范围的流感病毒、包括1918年“西班牙流感”(SC1918/H1)并结合2004年在越南从鸡跳跃至人类的禽流感H5N1类病毒(Viet04/H5)的单克隆抗体。CR6261识别在血球凝集素(流感病毒表面上的主要蛋白质)的膜近端茎中的高度保守性螺旋形区域。此抗体描述于WO 2010/130636中，该专利通过引用结合在此。另一种中和抗体F10[XOMA Ltd]已描述为适用于对抗H1N1和H5N1。[瑞(Sui)等人，自然结构和分子生物学(Nature Structural and Molecular Biology)(瑞等人，2009，16(3):265-73)]可以选择针对流感的其他抗体，例如Fab28和Fab49。参见，例如，WO 2010/140114和WO 2009/115972，这些专利通过引用结合在此。可以容易选择其他抗体，诸如WO2010/010466、美国公开专利公开US/2011/076265和WO 2008/156763中所述的那些抗体。
其他靶病原体病毒包括砂粒病毒(包括funin、马丘波病毒(machupo)和拉沙热病毒(Lassa))、丝状病毒(包括马尔堡病毒(Marburg)和埃博拉病毒(Ebola))、汉坦病毒、小核糖核酸病毒(picornoviridae)(包括鼻病毒、艾柯病毒)、冠状病毒、副粘病毒、麻疹病毒、呼吸道融合病毒、披盖病毒、柯萨奇病毒、细小病毒B19、副流感病毒、腺病毒、呼肠孤病毒、来自痘病毒科的天花病毒(重型天花(天花(Smallpox)))和牛痘(Vaccinia)(牛痘(Cowpox))、以及水痘-带状疱疹病毒(伪狂犬病)。
病毒性出血热是由沙粒病毒科(拉沙热)(该病毒科也与淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(LCM)相关)、线状病毒属(埃博拉病毒)、以及汉坦病毒属(普马拉病毒(puremala))的成员引起的。细小核糖核酸病毒(鼻病毒亚科)的成员与人类的感冒有关。冠状病毒科包括许多非人类病毒，诸如传染性支气管炎病毒(家禽)、猪传染性胃肠炎病毒(猪)、猪血凝脑脊髓炎病毒(猪)、猫传染性腹膜炎病毒(猫)、猫肠道冠状病毒(猫)、狗冠状病毒(狗)。人类呼吸道冠状病毒已推定与感冒、非A型肝炎、B型肝炎或C型肝炎、以及严重急性呼吸道综合症(SARS)有关。副粘病毒科包括1型副流感病毒、3型副流感病毒、3型牛副流感病毒、腮腺炎病毒(rubulavirus)(腮腺炎病毒(mumps virus))、2型副流感病毒、4型副流感病毒、新城疫病毒(鸡)、牛伤寒病毒、麻疹病毒(包括麻疹和犬温病病毒)、以及肺病毒(包括呼吸道合胞体病毒(RSV))。细小病毒科包括猫细小病毒(猫肠炎)、猫全白细胞减少病病毒(felinepanleucopeniavirus)、犬细小病毒、以及猪细小病毒。腺病毒科包括引起呼吸性疾病的病毒(EX、AD7、ARD、O.B.)。
还可以选择一种针对细菌病原体的中和抗体构建体用于本发明中。在一个实施例中，中和抗体构建体是针对细菌本身。在另一个实施例中，中和抗体构建体是针对由该细菌产生的毒素。空气传播的细菌病原体的实例包括例如脑膜炎奈瑟菌(脑膜炎)、肺炎克雷伯菌(肺炎)、铜绿假单胞菌(肺炎)、伪鼻疽假单胞菌(肺炎)、鼻疽假单胞菌(肺炎)、不动杆菌(肺炎)、卡他莫拉菌、腔隙莫拉菌、产碱杆菌属、心杆菌属、流感嗜血杆菌(流感)、副流感嗜血杆菌、百日咳博代氏杆菌(百日咳)、土拉弗朗西斯菌(肺炎/发热)、肺炎军团菌(军团病)、鹦鹉热衣原体(肺炎)、肺炎衣原体(肺炎)、结核分枝杆菌(结核病(TB))、堪萨斯分枝杆菌(TB)、鸟分枝杆菌(肺炎)、星状诺卡氏菌(肺炎)、炭疽杆菌(炭疽)、金黄色葡萄球菌(肺炎)、酿脓链球菌(猩红热)、肺炎链球菌(肺炎)、白喉杆菌(白喉)、肺炎支原体(肺炎)。
炭疽的致病因子是由炭疽杆菌产生的毒素。已描述了针对保护剂(PA)的中和抗体，三种肽之一形成类毒素。另外两种多肽由致死因子(LF)和水肿因子(EF)组成。抗-PA中和抗体已描述为有效于进行针对炭疽的被动免疫。参见，例如，美国专利号7,442,373；R.沢田-平井(R.Sawada-Hirai)等人，基于免疫的疗法和疫苗的杂志(J Immune Based TherVaccines.)2004；2:5.(2004年5月12日在线)。已描述和/或可以生成其他抗炭疽毒素中和抗体。类似地，可以使用针对其他细菌和/或细菌毒素的中和抗体来生成如在此所述的递送AAV的抗病原体构建体。
其他感染性疾病可以由空气传播的真菌引起，该真菌包括例如曲霉属种类、伞枝梨头霉、匍枝根霉(Rhixpus stolonifer)、密丛毛霉(Mucor plumbeaus)、新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌、皮炎芽生菌、粗球孢子菌、青霉菌属种类、干草小多孢菌、普通高温放线菌、交链格孢菌、分枝孢子菌属种类、长蠕孢属、以及葡萄状穗霉属种类。
另外，可以使用被动免疫预防真菌感染(例如，运动员脚)、癣菌病、或者病毒、细菌、寄生虫、真菌、以及可以通过直接接触传输的其他病原体。另外，许多病状影响家庭宠物、牛和其他家畜、以及其他动物。例如，在狗中，狗鼻窦曲霉菌对上呼吸道的感染引起显著疾病。在猫中，如果未处理在鼻中起源的上呼吸道疾病或猫呼吸性疾病复合物，则它们会引起发病率和死亡率。牛易于被传染性牛鼻气管炎(通常称为IBR或红鼻)感染，该鼻气管炎是一种急性牛传染性病毒疾病。另外，牛易于感染牛呼吸道合胞病毒(BRSV)，该病毒引起轻度至重度呼吸性疾病并且可以损害对其他疾病的抵抗性。其他病原体和疾病对于本领域技术人员而言将是显而易见的。参见，例如，US 5,811,524，该专利描述了抗呼吸道合胞体病毒(RSV)中和抗体的生成。在此所述的技术适用于其他病原体。此抗体可以使用完整的序列或其被修饰来生成人工或重组中和抗体构建体的序列(支架)。已描述此类方法[参见，例如，WO 2010/13036；WO 2009/115972；WO 2010/140114]。
如在此所述的抗肿瘤免疫球蛋白可以靶向人类表皮生长因子受体(HER)，诸如HER2。例如，曲妥珠单抗是一种重组IgG1κ的人源化单克隆抗体，该抗体在基于细胞的测定中(Kd＝5nM)以高亲和力选择性结合人类表皮生长因子受体蛋白的细胞外结构域。可商购产品是在CHO细胞培养中产生的。参见，例如，http://www.drugbank.ca/drugs/DB00072。曲妥珠单抗轻链1和2与重链1和2的氨基酸序列以及通过研究曲妥珠单抗的X-托架结构来获得的序列以登录号DB00072被提供此数据库上，这些序列通过引用结合在此。还参见212-Pb-TCMC-曲妥珠单抗[马里兰州贝塞斯达阿海珐医药公司(Areva Med,Bethesda,MD)]。感兴趣的另一种抗体包括例如帕妥珠单抗，它是一种靶向人类表皮生长因子受体2蛋白(HER2)的细胞外二聚化结构域(子结构域II)的重组人源化单克隆抗体。它由分别具有448和214个残基的两条重链和两条轻链组成。FDA在2012年6月8日批准。在此数据库上还以登录号DB06366提供其重链和轻链的氨基酸序列，例如在www.drugbank.ca/drugs/DB06366(同义词包括2C4、MOAB 2C4、单克隆抗体2C4和rhuMAb-2C4)中。除HER2之外，可以选择其他HER靶标。
例如，MM-121/SAR256212是一种靶向HER3受体[梅里马克氏网络生物学(Merrimack’s Network Biology)]并且已报道为适用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌和卵巢癌的完全人源性单克隆抗体。SAR256212是一种靶向HER3(ErbB3)受体[赛诺菲肿瘤学(Sanofi Oncology)]的研究性完全人源性单克隆抗体。另一种抗-Her3/EGFR抗体是RG7597[基因泰克公司(Genentech)]，它被描述为适用于头颈癌。还可以使用另一种抗体马帕木单抗(margetuximab)(或MGAH22)，它是一种靶向HER[MacroGenics]的下一代Fc-优化的单克隆抗体(mAb)。
或者，可以靶向人类上皮细胞表面标志和/或其他肿瘤受体或抗原。其他细胞表面标志靶标的实例包括例如5T4、CA-125、CEA(例如，由拉贝珠单抗靶向的)、CD3、CD19、CD20(例如，由利妥昔单抗靶向的)、CD22(例如，由依帕珠单抗或维妥珠单抗靶向的)、CD30、CD33、CD40、CD44、CD51(也是整合素αvβ3)、CD133(例如，成胶质细胞瘤细胞)、CTLA-4(例如，在例如成神经细胞瘤的治疗中使用的伊匹木单抗))、趋化因子(C-X-C基序)受体2(CXCR2)(在大脑的不同区域表达；例如，抗-CXCR2(细胞外)抗体编号ACR-012(阿罗蒙实验室公司(Alomene Labs)))；EpCAM、成纤维细胞活化蛋白(FAP)[参见，例如WO2012020006A2，脑癌]、叶酸受体α(例如，小儿室管膜脑肿瘤、头颈癌)、成纤维细胞增长因子受体1(FGFR1)(参见，用于讨论使用抗-FGFR1抗体进行的癌症治疗的WO2012125124A1等)、FGFR2(参见，例如，WO2013076186A和WO2011143318A2中描述的抗体)、FGFR3(参见，例如，US8187601和WO2010111367A1中描述的抗体)、FGFR4(参见，例如，WO2012138975A1中描述的抗-FGFR4抗体)、肝细胞生长因子(HGF)(参见，例如，WO2010119991A3中的抗体)、整合素α5β1、IGF-1受体、神经节苷脂(gangioloside)GD2(参见，例如，在WO2011160119A2中描述的抗体)、神经节苷脂GD3、跨膜糖蛋白NMB(GPNMB)(与神经胶质瘤有关)、以及其他靶标和抗体格莱木单抗(glembatumumab，CR011)的靶标、粘蛋白、MUC1、磷脂酰丝氨酸(例如，由佩莱格林制药公司(Peregrine Pharmaceuticals,Inc)的巴土昔单抗靶向的]、***癌细胞、PD-L1(例如，纳武单抗(nivolumab)(BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538)、完全人类gG4[例如，转移性黑色素瘤]、血小板源性生长因子受体α(PDGFRα)或CD140、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、腱生蛋白C、肿瘤坏死因子(TNF)受体(TRAIL-R2)、血管内皮生长因子(VEGF)-A(例如，由贝伐单抗所靶向的)以及VEGFR2(例如，由雷莫芦单抗(ramucirumab)所靶向的)。
其他抗体及其靶标包括例如一种单克隆抗体APN301(hu14.19-IL2)[儿童恶性黑色素瘤和成神经细胞瘤，Apeiron Biolgics，奥地利维也纳(Vienna,Austria)]。还参见，例如，已描述为适用于治疗实体瘤(包括转移性脑癌)的单克隆抗体8H9。单克隆抗体8H9是一种具有针对B7H3抗原的特异性的小鼠IgG1抗体[联合治疗公司(United TherapeuticsCorporation)]。此小鼠抗体可以被人源化。在本发明中可以使用靶向B7-H3和/或B7-H4抗原的其他免疫球蛋白构建体。另一种抗体是S58(抗-GD2，成神经细胞瘤)。CotaraTM[佩莱格林制药公司]是一种用于治疗复发性成神经胶质细胞瘤的所述单克隆抗体。其他抗体可以包括例如阿瓦斯丁、非拉珠单抗(ficlatuzumab)、medi-575和索拉非尼(olaratumab)。还可以选择其他免疫球蛋白构建体或单克隆抗体用于本发明中。参见，例如，发展性生物制剂的药物(Medicines in Development Biologics)，2013年报道，第1-87页，这是PhRMA通信与公共事务部门(PhRMA’s Communications&Public Affairs Department)的出版物(202)835-3460，该文献通过引用结合在此。
例如，免疫原可以是选自许多病毒科。免疫反应将希望针对的病毒科的实例包括细小核糖核酸病毒科，该病毒科包括鼻病毒属，它是约50％感冒病例发生的原因；肠道病毒属，该病毒属包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、以及人类肠道病毒诸如A型肝炎病毒；以及口疮病毒(apthoviruses)属，它是***产生的原因，主要是在非人动物中。在细小核糖核酸病毒科内，靶抗原包括VP1、VP2、VP3、VP4、以及VPG。另一种病毒科包括杯状病毒(calcivirus)科，它包括诺瓦克病毒组，这是传染性肠胃炎的重要致病因子。希望用于靶向抗原以诱导在人类和非人类动物中的免疫反应的另一种病毒科是披膜病毒科，该病毒科包括甲病毒属，该病毒属包括辛德毕斯病毒、罗斯河病毒、以及委内瑞拉、东方和西方马脑炎、以及风疹病毒属(包括风疹病毒)。黄病毒科包括登革热、黄热病、日本脑炎、圣路易脑炎、以及蜱传脑炎的病毒。其他靶抗原可以由C型肝炎病毒或冠状病毒科生成，该病毒科包括许多非人类病毒诸如传染性支气管炎病毒(家禽)、猪传播性胃肠炎病毒(猪)、猪血凝脑炎病毒(猪)、猫传染性腹膜炎病毒(猫)、猫肠道冠状病毒(猫)、狗冠状病毒(狗)、以及人类呼吸道冠状病毒，这些病毒可以引起感冒和/或非A型、B型或C型肝炎。在冠状病毒科内，靶抗原包括E1(还称为M或基质蛋白)、E2(还称为S或纤突蛋白)、E3(还称为HE或血球凝集素-依尔替糖(elterose))糖蛋白(不存在于所有冠状病毒中)、或者N(壳包核酸)。其他抗原可以是针对弹状病毒科被靶向的，该病毒科包括水泡性病毒属(例如，水泡性口炎病毒)和狂犬病病毒属(例如，狂犬病)。
在弹状病毒科内，适合的抗原可以是源自G蛋白或N蛋白。丝状病毒科可以是一种适合的抗原来源，该病毒科包括出血热病毒诸如马尔堡病毒和埃博拉病毒。副粘病毒科包括1型副流感病毒、3型副流感病毒、3型牛副流感病毒、腮腺炎病毒(rubulavirus)(腮腺炎病毒(mumps virus))、2型副流感病毒、4型副流感病毒、新城疫病毒(鸡)、牛伤寒病毒、麻疹病毒(包括麻疹和犬温病病毒)、以及肺病毒(包括呼吸道合胞体病毒)。流感病毒被分类在正黏病毒科内并且是一种适合的抗原来源(例如，HA蛋白、N1蛋白)。布尼病毒科包括布尼病毒属(加利福尼亚脑炎，拉克罗斯(La Crosse))、白蛉病毒(裂谷热)、汉坦病毒(普马拉病毒是一种出血热(hemahagin fever)病毒)、纳伊罗病毒(内罗毕绵羊病)以及各种未命名银环蛇病毒(bungavirus)。沙粒病毒科提供一种针对LCM和拉沙热病毒的抗原来源。呼肠孤病毒科包括呼肠孤病毒属、轮状病毒属(引起儿童急性胃肠炎)、环状病毒属、以及科罗拉多蜱热病毒属(cultivirus)(科罗拉多壁虱热)、莱邦博病(Lebombo)(人类)、马脑炎、蓝舌病)。
逆转录病毒科包括致癌病毒(oncorivirinal)亚科，该亚科包括此类人类和兽类疾病病毒诸如猫白血病病毒、HTLVI和HTLVII、慢病毒(包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病毒、以及泡沫病毒)。在慢病毒属中，已描述许多适合的抗原并且这些抗原可以容易选择为靶标。适合的HIV和SIV抗原的实例包括但不限于，gag、pol、Vif、Vpx、VPR、Env、Tat、Nef、以及Rev蛋白、以及其各种片段。例如，适合的Env蛋白片段可以包括其长度为至少约8个氨基酸的任何亚基诸如gp120、gp160、gp41或其更小片段。类似地，可以选择tat蛋白片段。[参见，美国专利5,891,994和美国专利6,193,981。]还参见以下所述的HIV和SIV蛋白：D.H.巴鲁奇(D.H.Barouch)等人，病毒学杂志(J.Virol.)，75(5):2462-2467(2001年3月)，以及R.R.阿马拉(R.R.Amara)等人，科学(Science)，292:69-74(2001年4月6日)。在另一个实例中，HIV和/或SIV免疫原性蛋白或肽可以用于形成融合蛋白或其他免疫原性分子。参见，例如，在2001年8月2日公开的WO01/54719和在1999年4月8日公开的WO 99/16884中所述的HIV-1Tat和/或Nef融合蛋白和免疫方案。本发明不限于在此所述的HIV和/或SIV免疫原性蛋白或肽。另外，已描述了对这些蛋白的许多修饰或者这些修饰可以容易通过本领域技术人员来进行。参见，例如，在美国专利5,972,596中所述的修饰gag蛋白。
乳多孔病毒科包括多瘤病毒亚科(BKU和JCU病毒)和***瘤病毒亚科(与癌症或***状瘤的恶性进展相关)。腺病毒科包括引起呼吸性疾病和/或肠炎的病毒(EX、AD7、ARD、O.B.)。细小病毒科包括猫细小病毒(猫肠炎)、猫全白细胞减少病病毒、犬细小病毒、以及猪细小病毒。疱疹病毒科包括疱疹病毒甲亚科，包括单纯疱疹病毒属(HSVI、HSVII)、水痘病毒属(伪狂犬病、水痘-带状疱疹)；以及疱疹病毒乙亚科，包括巨细胞病毒属(HCMV、鼠巨细胞病毒)；以及疱疹病毒丙亚科，包括淋巴隐病毒属、EBV(伯基特淋巴瘤)、传染性鼻气管炎、马立克氏病病毒、以及细长病毒属。痘病毒科包括脊椎动物痘病毒亚科，该亚科包括正痘病毒属(天花属(天花)和牛痘属(牛痘))、副痘病毒、禽痘病毒、山羊痘病毒、野兔痘病毒、猪痘病毒、以及昆虫痘病毒亚科。嗜肝DNA病毒科包括B型肝炎病毒。一种可以作为适合抗原来源的未分类病毒是丁型肝炎病毒。其他病毒来源可以包括禽类传染性粘液囊病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒。甲病毒科包括马动脉炎病毒和各种脑炎病毒。
抗体的其他病原性靶标可以包括例如细菌、真菌、寄生性微生物或多细胞寄生虫，它们感染人类和非人类脊椎动物或者是来自癌细胞或肿瘤细胞。细菌性病原体的实例包括病原性革兰氏阳性球菌，该革兰氏阳性球菌包括肺炎双球菌；葡萄球菌；以及链球菌。病原性革兰氏阴性球菌包括脑膜炎球菌；***。病原性肠道革兰氏阴性杆菌包括肠杆菌属；假单胞菌属、不动杆菌属和艾肯菌属；类鼻疽菌属；沙门氏菌属；志贺氏菌属；嗜血杆菌属；莫拉氏菌属；杜克嗜血杆菌(引起软下疳)；布鲁氏菌属；土拉热弗朗西丝菌(引起兔热病)；耶尔森菌属(巴斯德菌属)；念珠状链杆菌和螺菌属；革兰氏阳性杆菌包括单核细胞增生李斯特菌；红斑丹毒丝菌；白喉棒状杆菌(白喉)；霍乱菌；炭疽杆菌(炭疽)；杜诺凡病菌(***)；以及巴尔通体病菌。由病原性厌氧细菌引起的疾病包括破伤风；肉毒杆菌中毒；其他梭状芽孢杆菌病；结核病；麻风病；以及其他分枝杆菌病。病原性螺旋体病包括梅毒；密螺旋体病：雅司病、斑点病和地方性梅毒；以及钩端螺旋体病。由高等病原性细菌和病原性真菌引起的其他感染包括放线菌病；诺卡氏放线菌病；隐球菌病、芽生菌病、组织胞浆菌病以及球孢子菌病；念珠菌病、曲霉菌病和毛霉病；孢子丝菌病；副球孢子菌病、霉样真菌病、光滑假丝酵母病、足分枝菌病以及着色芽生菌病；以及皮肤真菌病。立克次氏体感染包括斑疹伤寒、落基山斑疹热、Q热、以及立克次氏体痘。支原体和衣原体感染的实例包括：支原体肺炎；性病性淋巴肉芽肿；鹦鹉热；以及围产期衣原体感染。病原性真核生物包括病原性原生动物和蠕虫并且由其产生的感染包括：阿米巴病；疟疾；利什曼病；锥虫病；弓形虫病；卡氏肺孢菌病；倒睫症(Trichans)；刚地弓形虫病；巴贝虫病；贾弟虫病；旋毛虫病；丝虫病；血吸虫病；线虫病；吸虫(trematode)或吸虫(fluke)病；以及绦虫(cestode)(绦虫(tapeworm))感染。
许多这些生物体和/或由其产生的毒素已通过疾病控制中心(Centers forDisease Control)[(CDC)，美国健康与人类服务部门(Department of Health and HumanServices,USA)]鉴别为具有用于生物侵袭的可能性的药剂。例如，这些生物药剂中的一些包括炭疽杆菌(炭疽)、肉毒梭菌及其毒素(肉毒杆菌中毒)、鼠疫耶尔森菌(鼠疫)、重型天花(天花)、土拉热弗朗西丝菌(兔热病)、以及病毒性出血热[丝状病毒(例如，埃博拉病毒和马尔堡病毒]、以及沙粒病毒[例如，拉沙热病毒、马丘波病毒])，所有这些生物药剂目前均分类为A类药剂；贝氏柯克斯体(Q热)；布鲁菌种类(布鲁菌病)、鼻疽伯克菌(鼻疽)、类鼻疽伯克霍尔德菌(类鼻疽)、蓖麻及其毒素(蓖麻毒素)、产气荚膜梭菌及其毒素(ε毒素)、葡萄球菌属种类及其毒素(肠毒素B)、鹦鹉热衣原体(鹦鹉热)、水的安全性威胁(例如，霍乱弧菌、隐孢子虫)、斑疹伤寒(普氏立克次体)、以及病毒性脑炎(甲病毒，例如委内瑞拉马脑炎；东方马脑炎；西方马脑炎)；所有这些目前均分类为B类药剂；以及立百病毒(Nipan virus)和汉坦病毒，它们目前被分类为C类药剂。另外，在未来可以出于此目的鉴别和/或使用如此分类或不同分类的其他生物体。将容易理解的是，在此所述的病毒载体和其他构建体适用于靶向来自这些生物体、病毒、其毒素或其副产物的抗原，这将预防并且/或者治疗感染或使用这些生物药剂的其他不良反应。
以下实例仅是说明性的并且不是对在此所述的发明的限制。
实例1：含有全长抗体共表达盒的载体的生成
制备一系列顺式质粒，以用于生成含有用于递送至宿主靶细胞的核酸分子的AAV病毒粒子。该核酸分子包含在各末端的AAV25’和3’ITR序列、在相反定向中由两个表达盒侧接的共有CMV增强子，其中第一表达盒由第一最小CMV启动子控制并且第二表达盒由第二最小CMV启动子控制。通过商业供应商(GeneArt)重新合成位于AAV2ITR之间的所有序列。使免疫球蛋白可变结构域的所有编码序列侧接独特的限制性酶，以允许希望的可变结构域进行常规穿梭。为了创建具有异源轻链序列(kgl)的构建体，重新合成编码种系轻链(IGKV4-1*01)的编码序列并且将其用于置换FI6可变轻链序列。
在图2中示出了一种示例性抗体共表达穿梭质粒。此穿梭质粒包含增强子左侧的第一表达盒，该表达盒从右至左包含CMV最小启动子、连接至-TSG101抗体(1A6)可变重链(VH)结构域、CH’1结构域、以及已被优化用于在人类中表达的CH’2-3结构域的的异源IL2前导序列、以及合成的polyA。在增强子右侧定位有CMV最小启动子、异源IL2前导序列、FI6k2(抗流感抗体)轻链可变结构域和轻链恒定结构域、弗林蛋白酶裂解位点、来自***病毒的2a接头、IL2前导序列、FI6v3VH、CH1、CH2-3、以及胸苷激酶短polyA序列。CH命名是指已知抗体同种异型G1m17,1。
SEQ ID NO:1提供了FI6恒定区的序列。在SEQ ID NO:2中提供了FI6氨基酸轻链的氨基酸序列。
在如先前所述的(例如，如美国专利申请号12/226,558所述的)三重转染方法中使用了图2的顺式质粒，以生成用于在此所述的后续研究中的AAV8和AAV9载体。所得质粒pN509_ACE Fi6-1A6MAB_p3160的长度是7722bp，该质粒的序列被提供在SEQ ID NO:3中，该序列通过引用与其特征一起结合在此。还提供了FI6可变轻链(VL)[SEQ ID NO:4]、FI6可变重链[SEQ ID NO:5]、CH1(SEQ ID NO:6)、CH2-3[SEQ ID NO:7]。
通过使用允许可变结构域容易改组的预先定位的独特限制性位点将季节性流感抗体(CR8033)或大流行的流感抗体(C05)或抗-M2e抗体(TCN-032)亚克隆在图2的1A6重链可变结构域位置中，从而生成类似的抗体共表达顺式质粒。进而将这些顺式质粒用于三重转染(例如，如美国专利申请号12/226,588所述地进行)，以生成用于随后的研究中的AAV8和AAV9载体。在SEQ ID NO:8中提供了用于pN510_ACE Fi6-C05MAB穿梭的序列；在SEQ IDNO:9中提供了可变轻链的氨基酸序列，在SEQ ID NO:10中提供了恒定轻链，在SEQ ID NO:11中提供了F16可变重链，在SEQ ID NO:12中提供了CH1，并且在SEQ ID NO:13中提供了CH2-3。在SEQ ID NO:19中提供了用于pN514_ACE Fi6-C05MAB穿梭的序列；在SEQ ID NO:20中提供了恒定轻链的氨基酸序列，在SEQ ID NO:21中提供了F16可变重链，在SEQ ID NO:22中提供了CH1，并且在SEQ ID NO:23中提供了CH2-3。然后将这些穿梭用于生成AAV8和AAV9载体，这些载体用于随后的研究中。
实例2：由共表达F16单克隆抗体(MAB)和IA6MAB的AAV8载体表达的产物的表征
进行一系列ELISA测定，以表征与来自顺式质粒的IA6MAB共表达的FI6MAB的表达水平并测定其结合，该顺式质粒在转染到HEK 293细胞中之后如实例1所述地生成。使用f-Moc化学法通过模拟表位合成TSG101肽。由商业供应商免疫技术公司(ImmuneTechnologies,Inc)生产所有流感抗原。蛋白A购自西格玛-奥德里奇公司并且用于监控总人类IgG1的表达。通过抗原特异性或蛋白A捕捉的ELISA测量组织培养上清液中的人类IgG1的检测。用2μg/ml HA蛋白或肽或者用以PBS稀释的5μg/ml蛋白A涂覆高结合ELISA板，并且在4℃下孵育过夜。将孔洗涤5-8次并且在室温下用1mM EDTA、5％热灭活的PBS、PBS中的0.07％Tween 20封闭一小时。将组织培养上清液一式两份地以不同稀释液加入板中并且在37℃下孵育一小时。将板洗涤，封闭，并且以1∶10,000稀释液添加Bio-SP-缀合的Affinipures山羊抗人类IgG抗体(杰克逊免疫研究实验室公司(Jackson ImmunoResearchLaboratories,Inc.)，美国宾夕法尼亚州西格罗夫(West Grove,PA,USA))。在一小时后，将板洗涤并且以1∶30,000稀释液添加链霉亲和素缀合的辣根过氧化物酶(HRP)。在一个小时后，将板洗涤并且添加3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。在30分钟后在室温下用2N硫酸停止反应并且在450nm下使用BioTekμQuant板读取器(美国佛蒙特州威努斯基(Winooski,VT,USA))对板进行读取。
正如所料，未观察到FI6与TSG101肽、HA(B/马来西亚(Malaysia)/2506/2/004)或者HA(仅流感病毒株A/布里斯班(Brisbane)/59/2007的头部区域)的结合。当存在全长HA时观察到此同一流感病毒株的F16结合，流感病毒株HA(dTM)(A/北京(Beijing)/01/2009,H1N1))也一样。正如所料，还观察到蛋白A的F16结合。
根据公开的报道，根据现有技术方法产生的F16结合全长HA和HA茎，而不结合仅头部区域。这些数据表明共表达的F16单克隆抗体保留其特征性结合特性。
实例3：由共表达F16单克隆抗体(MAB)和大流行流感MAB C05的AAV8载体表达的产物的表征
在捕捉试验中测定两种不同单克隆抗体的示差检测的可能性。对由如实例1所述地制备的并且转染到HEK293细胞中的顺式质粒表达的单克隆抗体FI6和C05的结合进行测定。预期F16结合全长HA和HA茎，而不结合仅头部区域。图3中示出的结合研究的结果表明共表达的抗体保留其特征性结合。更具体地说，观察到FI6与全长HA和HA茎的特征性结合并且还观察到C05与HA和仅HA头(非茎)的特征性结合。如实例2所述地进行ELISA测定。
实例4：由共表达F16单克隆抗体(MAB)和第二全长MAB的AAV8载体表达的产物的表征
宾夕法尼亚大学转化研究实验室(University of Pennsylvania'sTranslational Research Laboratories)在无病原体条件下饲养6-8周大的雄性RAG KO小鼠(杰克逊实验室，美国缅因州巴尔港(Bar Harbor,ME,USA))。所有动物程序和方案均得到了实验动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)的批准。通过二氧化碳窒息处死小鼠并且通过颈脱位法确认死亡。对于载体给药，通过腹膜内(IP)注射用70mg/kg体重的***和7mg/kg体重的甲苯噻嗪的混合物麻醉小鼠。以磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释载体并且用哈密尔顿(Hamilton)注射器进行IM注射。每周经由眶后采血收集血清。
通过蛋白A捕捉的ELISA测量组织培养上清液中的人类IgG1的检测。用以PBS稀释的5μg/ml蛋白A涂覆高结合ELISA板，并且在4℃下孵育过夜。将孔洗涤5-8次并且用1mMEDTA、5％热灭活的PBS、PBS中的0.07％Tween 20封闭。将小鼠血清样品加热灭活并一式两份地以不同稀释液加入板中并且在37℃下孵育一小时。将板洗涤，封闭，并且以1∶10,000稀释液添加Bio-SP-缀合的Affinipures山羊抗人类IgG抗体(杰克逊免疫研究实验室公司，美国宾夕法尼亚州西格罗夫)。在一小时后，将板洗涤并且用以1∶30,000稀释的链霉亲和素缀合的辣根过氧化物酶(HRP)孵育。在一个小时后，将板洗涤并且添加3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。在30分钟后在室温下用2N硫酸停止反应并且在450nm下使用BioTekμQuant板读取器(美国佛蒙特州威努斯基)对板进行读取。
图5示出了总体人类IgG1在给予共表达FI6与IA6抗体的AAV载体的小鼠中的全身性表达水平。以1×1011基因组拷贝(GC)或1×1010GC的剂量肌内注射小鼠。在第7、15、21、28、34、42、49以及56天测定表达水平并且以μg/mL的浓度测量。观察到剂量依赖性的表达增加。
实例5：由共表达F16单克隆抗体(MAB)和三种不同全长单克隆抗体的AAV8载体表达的产物的表征
下表示出了在给予共表达FI6与全长CR8033、C05或1A6单克隆抗体的AAV载体的小鼠中的表达水平。如先前的实例所述的，以1×1011基因组拷贝(GC)或1×1010GC的剂量肌内注射RAG敲除(KO)小鼠。在第7、15、21、28、34、42、49以及49天每周一次地测定表达水平并且以μg/mL的浓度测量。对于所表达的抗体，观察到剂量依赖性的表达增加。用于测定中的捕捉抗原是如先前的实例所述的蛋白A ELISA。
Figure BDA0001150733040000271
Figure BDA0001150733040000272
Figure BDA0001150733040000281
Figure BDA0001150733040000282
实例6：抗病毒作用是在肌内通过由单一AAV9和/或AAV8载体表达的全长双抗体赋予的
A.AAV9.BiD.FI6_CR8033mAb和A型流感攻击
用AAV9.BiD.FI6_CR8033mAb肌内注射BALB/c小鼠，该抗体是以1×1011GC肌内(IM)递送的。两周后，用5LD50的小鼠适应的PR8(A型流感)鼻内地攻击小鼠。圆圈表示具有双向启动子的表达具有相同异源轻链的合成FI6和CR8033单克隆抗体的AAV9构建体。正方形表示也以1×1011GC递送的阳性对照，即表达单一抗体类型FI6的AAV9，并且三角形表示初试动物。图6B示出攻击后的存活。以1011GC/小鼠给予AAV9.BiD.FI6_CR8033mAb允许在体重减轻方面有显著延迟的部分保护。
B.AAV9.BiD.FI6_CR8033mAb和B型流感攻击
对于AAV9载体注射：通过肌内注射PBS中的100mg/kg***/10mg/kg甲苯噻嗪混合物来麻醉BALB/c雌性小鼠，并且以每只小鼠1×1011GC肌内注射(IM)AAV9.BiD.FI6_CR8033mAb载体。将BiD载体与也以1×1011GC递送的表达单一抗体类型CR8033的AAV9相比较，并且作为阴性对照(初试动物)。图7B示出攻击后的存活。对于流感攻击，在载体处理两周后，称量AAV-处理的和初试的BALB/c小鼠并且在尾部以颜色编码，如上所述地进行麻醉，通过其背侧切牙悬挂起来，将其后肢支撑在平台上，并且用总体积50μl PBS中的5LD50B/Lee/40(B型流感)鼻内地给药，如上所述的。然后每天称量小鼠并监控疾病或危险的体征。通过CO2窒息处死显示危险行为体征或失去30％初始体重的动物。
图7A是示出体重变化百分比的线状图。这些数据显示完全的保护效应是通过此剂量的双表达抗体赋予的。图7B示出攻击后的存活。
C.IM给予的AAV8.FI6-TCN032、AAV8.FI6-1A6、以及AAV8.FI6-CR8033载体和小鼠适应的PR8A型流感攻击。
如实例1所述地制备这些载体。宾夕法尼亚大学转化研究实验室(University ofPennsylvania's Translational Research Laboratories)在无病原体条件下饲养6-8周大的雄性RAG KO小鼠(杰克逊实验室，美国缅因州巴尔港(Bar Harbor,ME,USA))。所有动物程序和方案均得到了实验动物护理和使用委员会的批准。对于载体给药，通过腹膜内(IP)注射用70mg/kg体重的***和7mg/kg体重的甲苯噻嗪的混合物麻醉小鼠。以磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释载体并且用哈密尔顿注射器进行IM注射。每周经由眶后采血收集血清。
通过蛋白A捕捉的ELISA测量组织培养上清液中的人类IgG1的检测。用以PBS稀释的5μg/ml蛋白A涂覆高结合ELISA板，并且在4℃下孵育过夜。将孔洗涤5-8次并且用1mMEDTA、5％热灭活的PBS、PBS中的0.07％Tween 20封闭。将小鼠血清样品加热灭活并一式两份地以不同稀释液加入板中并且在37℃下孵育一小时。将板洗涤，封闭，并且以1∶10,000稀释液添加Bio-SP-缀合的Affinipures山羊抗人类IgG抗体(杰克逊免疫研究实验室公司，美国宾夕法尼亚州西格罗夫)。在一小时后，将板洗涤并且用以1∶30,000稀释的链霉亲和素缀合的辣根过氧化物酶(HRP)孵育。在一个小时后，将板洗涤并且添加3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。在30分钟后在室温下用2N硫酸停止反应并且在450nm下使用BioTekμQuant板读取器(美国佛蒙特州威努斯基)对板进行读取。
参考图8C，在所有图上，指示在载体给药后第56天的表达水平。在第56天最后一次眶后取血之后的几天(Couple days)，称量小鼠并且在尾部以颜色编码，如上所述地进行麻醉，通过其背侧切牙悬挂起来，将其后肢支撑在平台上，并且用总体积50μl PBS中的5LD50小鼠适应的PR8(A型流感)鼻内地给药，如上所述的。然后每天称量小鼠并监控疾病或危险的体征。通过CO2窒息处死显示危险行为体征或失去30％初始体重的动物并且通过颈脱位法确认死亡。图8A显示仅仅25μg/ml抗流感抗体的全身性表达足以在PR8攻击中提供保护，但是0.4μg/ml的表达不足以提供保护。
D.AAV9.FI6_IA6mAb和A型流感攻击
评定表达人工FI6和抗-HIV免疫黏附素IA6的AAV9载体针对使用如上所述A型流感进行的攻击的保护。图8B显示表达36.5μg/ml抗流感抗体足以提供针对使用PR8进行的攻击的完整保护。图8C显示表达6.9ug/ml抗流感抗体不足以进行保护以免受PR8攻击的影响。
实例8—含有两个免疫黏附素共表达盒的载体的生成
使用与图2所示类似的穿梭载体，已生成含有两种免疫黏附素的载体。
在一个实施例中，创建一种含有FI6和C05免疫黏附素的载体。在SEQ ID NO:36中提供了来自携带FI6和CO5免疫黏附素表达盒的质粒的序列；其中翻译的编码序列被提供在SEQ ID NO:37(FI6可变重链)、SEQ ID NO:38(FI6可变轻链)、以及SEQ ID NO:39(CH2-3)中。这些序列及其特征通过引用结合在此。
在另一个实施例中，创建一种含有FI6和CR8033免疫黏附素的载体。在SEQ ID NO:40中提供了来自含有FI6和CR8033免疫黏附素的质粒的序列；其中翻译的编码序列被提供在SEQ ID NO:41(FI6VH)和SEQ ID NO:42(FI6可变轻链)中。这些序列及其特征通过引用结合在此。
AAV可以使用本领域技术人员已知的技术由上述免疫黏附素穿梭质粒生成。
另外的说明性穿梭质粒如下。
在SEQ ID NO:14中提供了含有对两条重链1A6和FI6v3的来源而言是异源的种系轻链的质粒pN512_ACE FI6v3kgl-1A6MAB_p3184的序列。在SEQ ID NO:15(恒定链)、SEQ IDNO:16(FI6可变重链)、SEQ ID NO:17(CH1)、以及SEQ ID NO:18(CH2-3)中提供了翻译的编码序列。
在SEQ ID NO:30中提供了携带TCN032重链和轻链免疫球蛋白的中间载体的序列。由此质粒编码的翻译的氨基酸序列包括SEQ ID NO:31中的TCN032重链；SEQ ID NO:32中的CH1序列；SEQ ID NO:33中的FI6VH链；SEQ ID NO:34中的CH1序列以及SEQ ID NO:35中的CH2-3序列。
在SEQ ID NO:43中提供了携带TCN032和FI6重链并共表达具有这些特异性的两种抗体的质粒的序列。TCN032可变重链的翻译的氨基酸是在SEQ ID NO:44中，CH1是在SEQ IDNO:45中，铰链-CH2'-CH3'是在SEQ ID NO:46中，Fi6VH是在SEQ ID NO:47中，CH1是在SEQID NO:48中，CH2-3是在SEQ ID NO:49中，并且氨苄青霉素抗性基因是在SEQ ID NO:50中。这些序列及其特征通过引用结合在此。
(序列表自由文本)
针对包含在数字标识符<223>下的自由文本的序列提供了以下信息。
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本申请包括序列和序列表，它们通过引用结合在此。所有在本申请中引用的公开文件、专利、以及专利申请、以及2014年5月13日提交的要求保护优先权的美国专利申请号61/992,649都通过引用以其整体结合在此，如同各个单独的公开文件或专利申请被确切地并且单独地指明为通过引用而结合。虽然上述发明已经通过说明以及实例的方式出于清楚理解的目标相当详细地进行了描述，但是本领域技术人员就本发明的传授内容而言很容易清楚可以对其进行某些变化和修改而不偏离所附权利要求的精神或范围。
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Claims (18)

1.一种重组腺伴随病毒（AAV），该病毒具有AAV衣壳并且其中包装在细胞内表达两种不同的功能性单特异性抗体的异源核酸序列，其中该核酸序列包含：
5’ AAV反向末端重复序列（ITR）；
第一表达盒，该第一表达盒在指导其表达的调节控制序列控制下编码第一免疫球蛋白链的至少第一开放阅读框（ORF）；
第二表达盒，该第二表达盒是双顺反子的并且包含第二ORF、接头和第三ORF，其中该第二ORF和该第三ORF可操作地连接到指导其表达的调节控制序列，其中该第二ORF和该第三ORF编码第二免疫球蛋白链和第三免疫球蛋白链；以及
3’ AAV ITR，
其中该ORF编码免疫球蛋白轻链，第一免疫球蛋白重链和与第一免疫球蛋白重链不同的第二免疫球蛋白重链，其中第一单特异性抗体包含该第一免疫球蛋白重链和该免疫球蛋白轻链，和第二单特异性抗体包含该第二免疫球蛋白重链和该免疫球蛋白轻链。
2.根据权利要求1所述的重组AAV，其中该重组AAV进一步表达双特异性抗体，其包含该第一免疫球蛋白重链和该第二免疫球蛋白重链和该免疫球蛋白轻链。
3.根据权利要求1所述的重组AAV，其中该重组AAV包含位于该第一表达盒与该第二表达盒之间的双向增强子。
4.根据权利要求1所述的重组AAV，其中该第一ORF编码免疫球蛋白轻链，该第二ORF编码第一免疫球蛋白重链并且第三ORF编码第二免疫球蛋白重链，由此所表达的功能性抗体构建体包含具有不同特异性的两条不同重链，共享一条轻链。
5.根据权利要求1所述的重组AAV，其中该第二ORF和该第三ORF中的至少一个包含修饰的Fc编码序列。
6.根据权利要求1所述的重组AAV，其中该第二表达盒中的该接头包括选自IRES或F2A的接头。
7.根据权利要求1所述的重组AAV，其中该第一表达盒和/或该第二表达盒的所述调节控制序列包含最小启动子。
8.根据权利要求1所述的重组AAV，其中该第一表达盒和/或该第二表达盒的所述调节控制序列包含最小或合成的polyA。
9.根据权利要求1所述的重组AAV，其中该第一表达盒是双顺反子的并且包含另外的ORF。
10.根据权利要求9所述的重组AAV，其中该第一、第二、第三和另外的ORF的每一个包含scFv。
11.根据权利要求1所述的重组AAV，其中该核酸序列包含在该第一表达盒与该第二表达盒之间的双向polyA。
12.根据权利要求10所述的重组AAV，其中该第一表达盒包含增强子和最小启动子。
13.根据权利要求12所述的重组AAV，其中该第二表达盒包含增强子和最小启动子。
14.根据权利要求8所述的重组AAV，其中该第一表达盒和该第二表达盒一起表达两个Fab。
15.根据权利要求1所述的重组AAV，其中该两个功能性单特异性抗体具有不同的特异性。
16.一种重组腺伴随病毒（AAV），该病毒具有AAV衣壳并且其中包装在细胞内表达两种不同的功能性单特异性抗体的异源核酸序列，其中该重组AAV表达具有第一特异性的第一单克隆抗体、具有不同于该第一单克隆抗体的特异性的第二单克隆抗体、以及双特异性抗体，
其中该重组AAV包含：
5’ AAV反向末端重复序列（ITR）；
第一表达盒，该第一表达盒在指导其表达的调节控制序列控制下编码第一免疫球蛋白的至少第一开放阅读框（ORF）；
第二表达盒，该第二表达盒是双顺反子的并且包含第二ORF、接头和第三ORF，其中该第二ORF和第三ORF可操作地连接到指导其表达的调节控制序列，其中该第二ORF和该第三ORF编码第二免疫球蛋白构建体和第三免疫球蛋白构建体；以及
3’ AAV ITR，
其中所述ORF编码免疫球蛋白轻链，第一免疫球蛋白重链和与第一免疫球蛋白重链不同的第二免疫球蛋白重链；其中第一单特异性抗体包含该第一免疫球蛋白重链和该免疫球蛋白轻链，第二单特异性抗体包含该第二免疫球蛋白重链和该免疫球蛋白轻链，且该双特异性抗体包含该第一和第二免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链。
17.一种药物组合物，包括根据权利要求1至16中任一项所述的重组AAV和药学上可接受的载体。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的重组AAV在制备药物中的用途。
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