KR20210132095A - 크라베병의 치료에 유용한 조성물 - Google Patents

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제임스 엠. 윌슨
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더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아
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Abstract

크라베 환자에게 투여하기 위한 인간 갈락토실세라미다제(GALC) 유전자를 보유하는 AAVhu68 캡시드를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터의 척수강내 전달용으로 제형화된 조성물이 제공된다. 또한 신규한 유전자 서열 및 이의 용도가 제공된다.

Description

크라베병의 치료에 유용한 조성물
파보바이러스 과의 구성원인 아데노-연관 바이러스(AAV)는 길이가 약 4.7 킬로베이스(kb)인 단일-가닥 선형 DNA(ssDNA) 게놈을 가지는 외피가 없는 작은 이십면체 바이러스이다. 야생형 게놈은 DNA 가닥의 양쪽 말단에 반전 말단 반복부(ITR), 및 rep 및 cap의 2개의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함한다. rep는 AAV 생활사에 필요한 rep 단백질을 인코딩하는 4개의 중첩 유전자로 구성되고, cap는 캡시드 단백질인 VP1, VP2 및 VP3의 중첩 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 이들 단백질은 자가 조립하여 이십면체 대칭의 캡시드를 형성한다.
복제 결함이 있는 인간 파보바이러스로부터 유래한 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터는 유전자 전달에 적합한 비히클로 설명되었다. 전형적으로, 기능성 rep 유전자 및 cap 유전자는 벡터로부터 제거되어, 복제-불능 벡터를 생성한다. 이러한 기능은 벡터 생성 시스템 동안 제공되지만, 최종 벡터에는 없다.
현재까지, 인간 또는 비-인간 영장류(non-human primate: NHP)로부터 단리된 특성이 잘 규명된 상이한 AAV가 여러 가지 있었다. 상이한 혈청형의 AAV는 상이한 형질감염 효율을 나타내고, 상이한 세포 또는 조직에 대해 향성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 내부에 단지 3가지 구성원, 즉, AAV9, AAVhu31 및 AAVhu32를 가지는 것으로 확인된 클레드(Clade) F를 포함하여 다수의 상이한 AAV 클레드가 WO 2005/033321호에 기재되어 있다. AAV9의 구조 분석은 문헌[M. A. DiMattia et al, J. Virol. (June 2012) vol. 86 no. 12 6947-6958]에 제공되어 있다. 이 논문은 AAV9가 cap 유전자에 의해 인코딩되고 중첩 서열을 가지는 3개의 가변 단백질(vp)의 (총) 60개 복사체를 가진다고 보고한다. 이는 VP1(87 kDa), VP2(73 kDa), 및 VP3(62 kDa)을 포함하며, 이들은 각각 1:1:10의 예상 비율로 존재한다. VP3의 전체 서열은 VP2 내에 있고, VP2의 전부는 VP1 내에 있다. VP1은 고유한 N-말단 도메인을 가진다. 정교한 좌표 및 구조 인자는 RCSB PDB 데이터베이스로부터 수탁 번호 3UX1 하에서 이용 가능하다.
상이한 조직을 탈표적화하거나 표적화하기 위해 여러 가지 상이한 AAV9 변이체가 조작되었다. 예를 들어, 문헌[N. Pulicheria, "Engineering Liver-detargeted AAV9 Vectors for Cardiac and Musculoskeletal Gene Transfer", Molecular Therapy, Vol, 19, no. 6, p. 1070-1078 (June 2011)]을 참조한다. 혈액뇌장벽을 가로질러 유전자를 전달하는 AAV9 변이체의 개발이 또한 보고된 바 있다. 예를 들어, 문헌[B.E. Deverman et al, Nature Biotech, Vol. 34, No. 2, p 204 - 211 (2016년 2월 1일자로 온라인으로 공개됨), 및 Caltech 보도 자료, A. Wetherston, www.neurology-central.com/2016/02/10/successful-delivery-of-genes-through-the-blood-brain-barrier/, 10/05/2016 접속함]을 참조한다. 또한, WO 2016/0492301호 및 US 8,734,809호를 참조한다.
최근, 천연 공급원 유래의 캡시드 유전자의 증폭 후 확인된 AAVhu68이 새로운 AAV 캡시드로서 확인되었다. 예를 들어, WO 2018/160582호를 참조한다. 이 AAV는 AAV9와 마찬가지로, 클레드 F 내에 있다.
크라베병(공세포백색질장애: GLD)은 가수분해 효소인 갈락토실세라미다제(GALC)를 인코딩하는 유전자의 돌연변이에 의해 유발되는 상염색체 열성 리소좀 축적 질환(LSD)이다(Wenger D.A., et al. (2000) Mol Genet Metab. 70(1):1-9). 이 효소는 갈락토실세라마이드(세라마이드) 및 갈락토실스핑고신(사이코신(psychosine))을 포함한 특정 갈락토리피드의 분해를 담당하며, 상기 갈락토리피드는 미엘린초에서 거의 독점적으로 발견된다. 크라베병에서, GALC 결핍은 리소좀에서 사이코신(갈락토실세라마이드가 아님)의 독성 축적을 유발한다(Svennerholm et al., 1980). 사이코신의 축적은 CNS의 미엘린-생성 희소돌기아교세포와 PNS의 슈반 세포에 대해 특히 독성이 있어, 이들 세포 유형의 신속하고 광범위한 사멸을 초래한다. CNS 및 PNS 둘 다에서 미엘린 파괴는 반응성 성상세포 신경아교증 및 거대 다핵 대식세포("공세포")의 침윤을 동반한다(Suzuki K. (2003) J Child Neurol. 18(9):595-603). 갈락토실세라마이드는 주로 다른 효소인 GM1 강글리오시드 β-갈락토시다제에 의한 가수분해(Kobayashi T., et al. (1985) J Biol Chem. 260(28):14982-7) 및 갈락토실세라마이드 합성의 저지에 기여하는 희소돌기아교세포의 사멸(Svennerholm L., et al. (1980) J Lipid Res. 21(1):53-64)로 인해 GALC 활성의 부재 시 축적되지 않는다.
현재 크라베병에 이용 가능한 유일한 질병 경과변형 치료법은 조혈모세포 이식(HSCT)이며, 이는 종종 제대혈 이식(UCBT), 동종이계 말초 혈액 줄기 세포, 또는 동종이계 골수에 의해 제공된다. 전형적으로 첫 번째 생일 전에 증상이 나타나는 유아 크라베병이 있는 환자를 치료하기 위해 HSCT를 사용하여 단지 약간의 성공만 있었다. 유아 크라베병에서 명백한 증상의 발병 후에 수행되는 경우, HSCT는 단지 최소한의 신경학적 개선만을 제공하고 생존을 실질적으로 개선시키지 않는다(Escolar M.L., et al. (2005) N Engl J Med. 352(20):2069-81). HSCT는 증상 전(pre-symptomatic) 환자에서 수행될 경우에 효과적일 수 있지만, 그렇더라도 운동 결과는 좋지 않다(Escolar M.L., et al. (2005) N Engl J Med. 352(20):2069-81; Wright M.D., et al. (2017) Neurology. 89(13):1365-1372; van den Broek B.T.A ., et al. (2018) Blood Adv. 2(1):49-60). 생후 30일 전에 이식받은 유아는 더 나중에 이식받은 유아와 비교하여 더 나은 생존 및 기능적 결과를 보였다(Allewelt H., et al. (2018) Biol Blood Marrow Transplant. 24(11):2233-2238). 증상 전 이식은, 증상 발병 후 치료를 받지 않았거나 치료를 받은 유아 크라베병 환자와 비교하여 진행성 중심 수초화, 정상적인 수용 언어, 증상 중증도의 약화, 및 더 긴 생존과 함께 현저하게 더 우수한 결과를 초래하는 것으로 보고되어 있다(Escolar M.L., et al. (2005) N Engl J Med. 352(20):2069-81; Duffner P.K., et al. (2009) Genet Med. 11(6):450-4; Wright M.D., et al. (2017) Neurology. 89(13):1365-1372). 그렇기는 하지만, 증상이 나타나기 전에 치료를 받은 대부분의 어린이는 신장 및 체중이 평균보다 훨씬 작고 경미한 경직에서 독립적으로 걸을 수 없는 정도에 이르기까지 점진적인 대근육 운동 지연을 가진다(Escolar M.L., et al. (2005) N Engl J Med. 352(20):2069-81; Duffner P.K., et al. (2009) Genet Med. 11(6):450-4). 일부 어린이는 또한 후천적 소두증, 위루형성술에 대한 필요, 및 조음장애를 포함한 잔류 장애를 가진다(Duffner P.K., et al. (2009) Genet Med. 11(6):450-4). 더욱이, HSCT는 CNS-특이적 질환 병리에만 영향을 미치는 것으로 보인다. 말초신경병증과 같은 PNS 병리와 연관된 임상 특징은 HSCT에 의한 영향을 받지 않는다. 이러한 결과는, 조혈모세포가 생착, CNS로의 이동, 분화, 및 GALC 분비 및 교차 교정(cross-correction)(즉, 교정 세포에 의해 분비된 효소가 GALC-결핍 세포에 의해 흡수되는 과정)을 통해 치료 효과를 제공하는 데 필요한 시간보다 질환 진행 속도가 더 빠른 경우, 특히 초기 발병 형태에서 HSCT의 한계를 강조한다.
당업계에는 크라베병 환자에 대한 개선된 치료법에 대하여 여전히 필요성이 남아 있다.
중추신경계에서 세포를 표적화하는 AAV 캡시드, 및 (i) 단백질의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어 하에 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지는 성숙한 갈락토실세라미다제 단백질을 인코딩하는 갈락토실세라미다제 코딩 서열, 및 (ii) AAV 캡시드에 벡터 게놈을 패키징하는 데 필요한 AAV 반전 말단 반복부를 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 벡터 게놈은 AAV 캡시드에 패키징된다. 특정 실시형태에서, AAV 캡시드는 AAVhu68 캡시드이다. 특정 실시형태에서, 코딩 서열은 서열번호 9의 핵산 서열 또는 이와 95% 내지 99.9% 동일한 서열을 가진다. 특정 실시형태에서, 코딩 서열은 서열번호 10의 성숙한 단백질 및 중추신경계에서 인간 세포에 적합한 외인성 신호 펩타이드를 인코딩한다. 특정 실시형태에서, 조절 서열은, 베타-액틴 프로모터, 인트론, 및/또는 토끼 글로빈 폴리A를 포함한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 벡터 게놈 CB7.CI.hGALC.rBG를 가지는 rAAV를 포함한다.
특정 실시형태에서, 중추신경계에서 세포를 표적화하는 AAV 캡시드, 및 (i) 성숙한 갈락토실세라미다제 단백질의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어 하에 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지는 성숙한 갈락토실세라미다제 단백질을 인코딩하는 갈락토실세라미다제 코딩 서열, 및 (ii) AAV 캡시드에 벡터 게놈을 패키징하는 데 필요한 AAV 반전 말단 반복부를 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스가 제공된다. 특정 실시형태에서, AAV 캡시드는 AAVhu68 캡시드이다. 특정 실시형태에서, 코딩 서열은 서열번호 9의 핵산 서열 또는 이와 95% 내지 99.9% 동일한 서열을 가진다. 특정 실시형태에서, 코딩 서열은 서열번호 10의 성숙한 단백질 및 중추신경계에서 인간 세포에 적합한 외인성 신호 펩타이드를 인코딩한다. 특정 실시형태에서, 조절 서열은, 베타-액틴 프로모터, 인트론, 및/또는 토끼 글로빈 폴리A를 포함한다. 특정 실시형태에서, 벡터 게놈은 CB7.CI.hGALC.RBG이다.
특정 실시형태에서, 크라베병의 치료에 유용한 rAAV의 스톡을 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 실시형태에서, 약제 제조에 있어서 rAAV의 스톡을 포함하는 조성물의 용도가 제공된다. 특정 실시형태에서, 제공되는 조성물은 말초 신경의 기능장애를 치료하고/하거나 크라베병을 치료하는 데 유용하다. 특정 실시형태에서, rAAV는 조혈모세포 요법, 골수 이식, 및/또는 기질 감소 요법과 함께 공동 요법으로서 투여 가능하다.
특정 실시형태에서, 신호 펩타이드를 인코딩하는 갈락토실세라미다제 코딩 서열 및 서열번호 10의 아미노산 서열(aa 43 내지 685번)을 가지는 성숙한 인간 갈락토실세라미다제 단백질을 포함하는 플라스미드가 제공된다. 특정 실시형태에서, 플라스미드는 서열번호 9의 핵산 서열 또는 이와 95% 내지 99.9% 동일한 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)의 스톡을 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 크라베병의 치료, 크라베병에 의해 유발되는 호흡부전 및 운동 기능 상실을 유발하는 말초 신경의 기능장애의 교정, 또는 크라베병에 의해 유발되는 발작의 개시 또는 빈도의 지연에 있어서 조성물의 용도가 제공되며, 상기 rAAV는 (a) 중추신경계에서 세포를 표적화하는 AAV 캡시드; 및 (b) 단백질의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어 하에 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지는 성숙한 갈락토실세라미다제 단백질을 인코딩하는 갈락토실세라미다제 코딩 서열을 포함하는 벡터 게놈을 포함하고, 상기 벡터 게놈은 AAV 캡시드에 벡터 게놈을 패키징하는 데 필요한 AAV 반전 말단 반복부를 추가로 포함하며, 여기서 벡터 게놈은 AAV 캡시드에 패키징된다. 특정 실시형태에서, 환자는 후반기 유아 크라베병(Late infantile Krabbe disease; LIKD)을 가진다. 특정 실시형태에서, 환자는 소아 크라베병(Juvenile Krabbe disease; JKD)을 가진다. 특정 실시형태에서, 환자는 청소년/성인 발병 크라베병을 가진다. 특정 실시형태에서, rAAV는 조혈모세포 이식(HSCT), 골수 이식, 및/또는 기질 감소 요법에 대한 공동 요법으로서 투여된다. 특정 실시형태에서, rAAV는 척수강내, 측뇌실내, 또는 뇌실질내 투여를 통해 전달된다.
특정 실시형태에서, 제공되는 조성물은 척수강내, 측뇌실내, 뇌실질내 투여용으로 제형화된다. 특정 실시형태에서, 조성물은 대조(대조내)로의 전산화 단층촬영-(CT-) 유도 후두하 주사를 통해 단일 용량으로 투여된다.
본 발명의 이들 및 다른 양태는 본 발명의 하기 상세한 설명으로부터 명백하게 될 것이다.
도 1은 AAV9(서열번호 4) 및 AAVhu68(서열번호 2) 캡시드 서열의 정렬을 제공하는 도면. AAV9 및 AAVhu68 캡시드 간에 상이한 2개의 아미노산은 캡시드의 VP1(67, 157) 및 VP2(157) 영역에 위치한다. 약어: AAV9, 아데노-연관 바이러스 혈청형 9; AAVhu68; 아데노-연관 바이러스 혈청형 hu68; VP1, 바이러스 단백질 1; VP2, 바이러스 단백질.
도 2는 CB7.CI.hGALC.rBG 벡터 게놈의 개략도. 선형 지도는 벡터 게놈을 도시하며, 이는 유비쿼터스 CB7 프로모터의 제어 하에 인간 GALC를 발현하도록 설계되어 있다. CB7은 CMV IE 인핸서와 닭 β-액틴(CB) 프로모터 사이의 하이브리드로 구성된다. 약어: CMV IE, 거대세포바이러스 급초기; GALC, 갈락토실세라미다제; ITR, 반전 말단 반복부; 폴리A, 폴리아데닐화; rBG, 토끼 β-글로빈.
도 3은 조작된 cGALC 유전자(cGALCco)가 삽입된 pENN.AAV.CB7.CI.RBG(p1044)에 대한 벡터 지도.
도 4A는 트위처(Twitcher) 마우스(twi/twi)에 대한 신경병리 및 행동 표현형의 진행을 나타내는 도면. 마우스는 세포독성 사이코신의 축적 후 식세포 공세포에 의한 PNS 및 CNS 백질의 침윤을 나타낸다. 수초화 초기 기간 후에, 각각 미엘린-형성 슈반 세포 및 희소돌기아교세포의 사멸로 인해 탈수초화가 PNS에 이어 CNS에서 더 적은 정도로 관찰된다. 행동 표현형은 진전, 경련(twitching), 뒷다리 약화로 이루어진 PND 20 주위에서 나타난 다음, PND 40 주위에서 안락사를 필요로 하는 후속 마비 및 체중 감소가 일어난다. 문헌[Nicaise A.M., et al. (2016) J Neurosci Res. 94(11):1049-61]로부터 조정된다. 약어: CNS, 중추신경계; PND, 생후 일수; PNS, 말초신경계; twi, 트위처 기능 상실 대립유전자.
도 4B는 트위처 마우스 모델을 사용한 AAV.CB7.cGALCco.rBG 유전자 요법의 평가를 위한 연구 설계를 나타내는 도면.
도 5는 증상 전 트위처 마우스에게 rAAVhu68.hGALC를 정맥내 또는 측뇌실내 투여한 후 생존 곡선을 나타내는 도면. PND 0에서 신생 트위처 마우스에 대한 rAAVhu68.hGALC(1.00×1011개 GC[1.00×1014개 GC/kg에 상응함])의 고용량 IV 투여는 49일의 생존기간 중앙값을 유도하였다(N=6). PND 0에서 신생 트위처 마우스에 대해 ICV로 투여된 5배 더 낮은 용량의 rAAVhu68.hGALC(2.00×1010개 GC)는 61.5일의 생존기간 중앙값을 유도하였다(N=10). rAAVhu68.hGALC를 투여한 트위처 마우스의 생존을 대조군으로서 비히클(PBS)을 ICV-투여한 연령이 일치하는 트위처 마우스와 비교하였다(N=8). 약어: GC, 게놈 복사체; ICV, 측뇌실내; IV, 정맥내; N, 동물 수; PND, 생후 일수.
도 6은 상이한 AAV 캡시드를 사용하여 증상 전 트위처 마우스에 GALC를 측뇌실내 전달한 후 생존 곡선을 나타내는 도면. PND 0에 2.00×1010개 GC의 용량으로 AAVhu68 벡터(rAAVhu68.hGALC)의 ICV 투여는 61.5일의 생존기간 중앙값을 부여하였다(N=10). PND 0에 2.00×1010개 GC의 용량으로 AAV1, AAV3b, 또는 AAV5 벡터의 ICV 투여는 60일 미만의 생존기간 중앙값을 유도한 한편(AAV1: 57일[N=6], AAV3b: 51일[N=9], AAV5: 51일[N=6]), PND 0에 비히클(PBS)만 ICV-투여한 대조군 트위처 마우스는 43일의 생존기간 중앙값을 나타내었다(N=8). 약어: AAV3b, AAV 혈청형 3b; AAV5, AAV 혈청형 5; AAV1, AAV 혈청형 1; 및 AAVhu68, AAV 혈청형 hu68(rAAVhu68.hGALC); GC, 게놈 복사체; ICV, 측뇌실내; N, 동물 수; PBS, 인산염-완충 식염수; PND, 생후 일수.
도 7은 증상 전 트위처 마우스에 상이한 용량의 rAAVhu68.hGALC를 측뇌실내 투여한 후 신경운동 기능을 나타내는 도면. 증상 전 트위처 마우스(twi / twi)에 PND 0에 2.00×1010개 GC(N=10), 5.00×1010개 GC(N=12), 또는 1.00×1011개 GC(N=12)의 용량으로 rAAVhu68.hGALC를 ICV-투여하였다. 뇌 질량 그램(신생 마우스의 경우 0.15g)당 용량은 각각 1.30×1011개 GC/g, 3.30×1011개 GC/g, 및 6.70×1011개 GC/g에 해당하였다. 대조군으로서, PND 0에 PBS를 연령이 일치하는 증상 전 트위처 마우스(twi / twi)(N=8) 및 연령이 일치하는 비이환된 마우스(twi /+ 또는 +/+; N=14)에 ICV-투여하였다. PND 35에, 처음에 5 RPM으로 회전하고 120초에 걸쳐 40 RPM으로 증가하는 가속 막대 위에서 달리는 마우스의 낙하 시간(초)으로 신경운동 기능을 평가하였다. ** p<0.01, 일원 ANOVA에 이어 던 다중 비교 검정(Dunn's multiple comparison test)에 의해 결정됨. 약어: ANOVA, 분산분석; GC, 게놈 복사체; ICV, 측뇌실내; N, 동물 수; PBS, 인산염-완충 식염수; PND, 생후 일수; RPM, 분당 회전수.
도 8은 증상 전 트위처 마우스에 상이한 용량의 rAAVhu68.hGALC를 측뇌실내 투여한 후 생존 곡선을 나타내는 도면. 비히클(PBS)를 ICV-투여한 대조군 트위처 마우스(twi/twi)는 제43일에 생존기간 중앙값을 나타내었다(N=8). PND 0에 rAAVhu68.hGALC를 ICV-투여한 트위처 마우스(twi / twi)는 2.00×1010개 GC의 용량으로 61.5일(N=10), 5.00×1010개 GC의 용량으로 99일(N=12), 및 1.00×1011개 GC의 용량으로 130일(N=12)의 생존기간 중앙값을 나타내었다. 뇌 질량의 그램(신생 마우스의 경우 0.15g)당 rAAVhu68.hGALC 용량은 각각 1.30×1011개 GC/g, 3.30×1011개 GC/g, 및 6.70×1011개 GC/g에 해당하였다. 약어: GC, 게놈 복사체; ICV, 측뇌실내; N, 동물 수; PBS, 인산염-완충 식염수; PND, 생후 일수.
도 9는 증상이 있는 트위처 마우스에 rAAVhu68.hGALC를 측뇌실내 투여한 후 신경운동 기능을 나타내는 도면. 증상 전 신생 트위처 마우스(twi / twi)에 PND 0에 1.00×1011개 GC(N=12)의 용량으로 rAAVhu68.hGALC를 ICV-투여하였다. 초기-증상이 있는 트위처 마우스(twi / twi)에 PND 12에 1.00×1011개 GC(N=12) 또는 2.00×1011개 GC(N=11)의 용량으로 rAAVhu68.hGALC를 ICV-투여하였다. 후기-증상이 있는 트위처 마우스(twi / twi)에 PND 21에 2.00×1011개 GC(N=16)의 더 높은 용량으로 rAAVhu68.hGALC를 ICV-투여하였다. PND 12에 대조군으로서 연령이 일치하는 비이환된 마우스(twi /+ 및 +/+; N=27) 및 이환된 트위처 마우스(twi / twi ; N=15)에 비히클(PBS)을 ICV-투여하였다. PND 35에, 처음에 5 RPM으로 회전하고 120초에 걸쳐 40 RPM으로 증가하는 가속 막대 위에서 달리는 마우스의 낙하 시간(초)으로 신경운동 기능을 평가하였다. ** p<0.01 및 *** p<0.001, 일원 ANOVA에 이어 던 다중 비교 검정에 의해 결정됨. 약어: ANOVA, 분산분석; GC, 게놈 복사체; ICV, 측뇌실내; N, 동물 수; PBS, 인산염-완충 식염수; PND, 생후 일수; RPM, 분당 회전수.
도 10은 증상이 있는 트위처 마우스에 rAAVhu68.hGALC를 측뇌실내 투여한 후 생존 곡선을 나타내는 도면. 1.00×1011개 GC(N=12) 또는 2.00×1011개 GC(N=11)의 용량으로 PND 12에 rAAVhu68.hGALC를 ICV-투여한 초기-증상이 있는 트위처 마우스(twi/twi)는 생존기간 중앙값이 각각 71일 또는 81일이었다. 2.00×1011개 GC(N=16)의 용량으로 PND 21에 rAAVhu68.hGALC를 ICV-투여한 후기-증상이 있는 트위처 마우스(twi / twi)는 생존기간 중앙값이 51.5일이었다. 그에 비해, PND 0 또는 PND 12에 비히클(PBS)을 ICV-투여한 대조군 트위처 마우스(twi / twi ; 역사적 대조군; 연구 1의 N=8[PND 0] 및 연구 2의 N=4[PND 12])는 50일 미만의 생존기간 중앙값을 나타내었다. 약어: GC, 게놈 복사체; ICV, 측뇌실내; N, 동물 수; PBS, 인산염-완충 식염수; PND, 생후 일수.
도 11A 및 도 11B는 증상이 있는 트위처 마우스에 rAAVhu68.hGALC를 측뇌실내 투여한 후 임상 기록 및 신경운동 기능을 나타내는 도면. 초기-증상이 있는 트위처 마우스(twi / twi; N=9)에 PND 12에 2.00×1011개 GC의 용량으로 rAAVhu68.hGALC를 ICV-투여하였다. PND 12에 대조군으로서 연령이 일치하는 초기-증상이 있는 트위처 마우스(twi / twi; N=9), 비이환된 트위처 이형접합체(twi /+; N=10), 및 야생형 마우스(N=8)에 PBS를 ICV-투여하였다. (도 11A) PND 22에 시작하여, PND 40에 부검할 때까지 임상 기록 평가를 사용하여 쥐는 능력, 보행, 진전, 척추후만증, 및 털의 질에 대하여 각각의 마우스를 매일 평가하였다. 누적 점수를 각각의 동물에 할당한 다음, 연구 기간 동안 AAV 처리에 의해 정규화하였다. 점수가 더 높을수록 임상 상태가 더 좋지 않음을 나타낸다. (도 11B) PND 35에, 처음에 5 RPM으로 회전하고 120초에 걸쳐 40 RPM으로 증가하는 가속 막대 위에서 달리는 마우스의 낙하 시간(초)으로 신경운동 기능을 평가하였다. * p<0.05, 일원 ANOVA에 이어 던 다중 비교 검정에 의해 결정됨. 약어: GC, 게놈 복사체; ICV, 측뇌실내; N, 동물 수; PBS, 인산염-완충 식염수; PND, 생후 일수; RPM, 분당 회전수.
도 12는 증상이 있는 트위처 마우스에 rAAVhu68.hGALC를 측뇌실내 투여한 후 좌골신경 조직학을 나타내는 도면. 초기-증상이 있는 트위처 마우스(twi/twi; N=9)에 PND 12에 2.00×1011개 GC의 용량으로 rAAVhu68.hGALC를 ICV-투여하였다. PND 12에 대조군으로서 연령이 일치하는 초기-증상이 있는 트위처 마우스(twi/twi; N=9) 및 비이환된 야생형 마우스(N=8)에 PBS를 ICV-투여하였다. 28일 후 PND 40에, 마우스를 부검하고, 좌골신경 샘플을 얻었다. 조직 절편에 대하여 룩솔 블루(Luxol blue) 및 PAS 반응 염색을 수행하여 미엘린(어두운 염색) 및 공세포(밝은 염색)를 각각 시각화하였다. 약어: GC, 게놈 복사체; ICV, 측뇌실내; N, 동물 수; PBS, 인산염-완충 식염수; PAS, 과요오드산-쉬프; PND, 생후 일수.
도 13A 내지 도 13C는 생후 제12일에 증상이 있는 트위처 마우스에 rAAVhu68.hGALC를 측뇌실내 투여하고 28일 후 GALC 활성을 나타내는 도면. 초기-증상이 있는 트위처 마우스(twi / twi; N=9)에 PND 12에 2.00×1011개 GC의 용량으로 rAAVhu68.hGALC를 ICV-투여하였다. PND 12에 대조군으로서 연령이 일치하는 초기-증상이 있는 트위처 마우스(twi / twi; N=9) 및 비이환된 야생형 마우스(N=8)에 PBS를 ICV-투여하였다. 28일 후 PND 40에, 마우스를 부검하고, 뇌, 간, 및 혈청 샘플을 얻었다. 형광단-기반 분석을 사용하여 GALC 효소 활성 수준(상대적인 FU)을 정량화하였다. 약어: FU, 형광 단위; GALC, 갈락토실세라미다제; GC, 게놈 복사체; ICV, 측뇌실내; N, 동물 수; PBS, 인산염-완충 식염수; PND, 생후 일수.
도 14A 및 도 14B는 rAAVhu68.hGALC 및 골수 이식의 병용 요법 후 중간 생존 곡선을 나타내는 도면. 트위처 마우스(twi / twi)를 BMT 단독(N=13, PND 10), rAAVhu68.hGALC 단독(PND 0에 N=12 또는 PND 12에 N=13; ICV; 1.00×1011개 GC), rAAVhu68.hGALC 후 BMT(N=7; 각각 PND 0 및 PND 10), 또는 BMT 후 rAAVhu68.hGALC(N=7; 각각 PND 10 및 PND 12)로 처리하였다. PBS만 투여한 트위처 마우스(twi/twi)는 역사적 대조군으로서 사용되었다(N=8, 연구 1, PND 0; N=4, 연구 2, PND 12). 중간 생존 결과가 도시되어 있으며, 실험은 여전히 진행 중이다. 약어: BMT, 골수 이식; GC, 게놈 복사체; ICV, 측뇌실내; N, 동물 수; PBS, 인산염-완충 식염수; PND, 생후 일수.
도 15는 크라베 개에 대한 신경병리학적 및 행동적 표현형의 진행이 제시된 것을 나타내는 도면(Wenger D.A., et al. (1999) J Hered. 90(1):138-42; Bradbury A., et al. (2016) Neuroradiol J. 29(6):417-424; Bradbury A.M., et al. (2016b) 94(11):1007-17; Bradbury A.M., et al. (2018) Hum Gene Ther. 29(7):785-801). 점선은 명시된 표현형에 대한 이전 시점에 대한 데이터가 기재되어 있지 않음을 나타낸다. *별표는 조직학에 의해 관찰되는 탈수초화를 지칭한다. 약어: BAER, 뇌간 청력 유발 반응: CNS, 중추신경계; MRI, 자기 공명 영상; NCV, 신경 전도 속도; PNS, 말초신경계.
도 16은 1/2상 인간에서 최초의 임상 시험의 설계를 나타내는 도면. 3명의 대상체 각각은 코호트 1(저용량) 및 코호트 2(고용량)로 투약된 후 대상체 #3 및 #6 후에 필수 안전성 위원회의 검토가 이어졌다. 코호트 1 및 코호트 2의 첫 번째 대상체를 등록한 후 30일의 간격 후에, 각각의 코호트의 다음 2명의 대상체를 동시에 등록한다. 후속적으로, 코호트 3(MTD)의 6명의 대상체를 시차 투약 없이 동시에 등록한다. 약어: FIH, 인간에서 최초; LTFU, 장기 추적; MTD: 최대 내약 용량.
도 17은 제안된 1/2상 시험에 대한 안전성 평가를 위한 결정 트리를 나타내는 도면. *연구 보류 기준은 조사자가 평가한 바와 같이 조사 제품 또는 ICM 주사 절차와 관련된 등급 3 이상의 AE를 1명 초과의 대상체가 경험하는 임의의 사건을 포함한다. **의학적 검토는 주요 조사관과 함께 의료용 모니터가 수행한다. ***코호트 3 대상체는 동시에 등록된다. 코호트 3의 처음 3명의 대상체를 등록한 후 MTD에서의 투약은 각각의 대상체 사이에 4주 안전성 관찰 기간으로 시차를 두지 않으며, 안전성 위원회 검토가 필요하지 않다. 약어: AE, 이상반응, ICM, 대조내; MTD, 최대 내약 용량; STR, 안전성 검토 트리거.
도 18A, 도 18B, 및 도 18C는 1/2상 시험에 대한 사건의 스케쥴에 대한 표.
도 19는 HSCT 8주 후에 야생형 및 트위처(크라베) 마우스의 소뇌에서 GFP+ 공여 세포의 뇌 생착을 나타내는 도면.
도 20은 조작된 GALC(cGALCco) 또는 천연 개 GALC(cGALnat) 서열을 가지는 rAAVhu68을 투여한 트위처 마우스에서 혈청 GALC 활성의 비교를 나타내는 도면. 천연 서열을 가지는 rAAVhu68과 비교하여, rAAVhu.cGALCco를 투여한 트위처 마우스에서 생존 개선이 관찰되었다.
도 21은 트랜스 플라스미드 pAAV2/hu68.KanR(p0068)의 선형 벡터 지도를 나타내는 도면. 약어: AAV2, 아데노-연관 바이러스 혈청형 2; AAVhu68, 아데노-연관 바이러스 혈청형 hu68; bp, 염기쌍; Cap, 캡시드; KanR, 카나마이신 내성; Ori, 복제 기점; Rep, 레플리카제.
도 22A 및 도 22B는 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 pAdDeltaF6(KanR)을 나타내는 도면. (도 22A) 모 플라스미드 pBHG10으로부터 중간체 pAd△F1 및 pAd△F5를 통한 헬퍼 플라스미드 pAd△F6의 유도. (도 22B) pAdF6에서 암피실린 내성 유전자를 카나마이신 내성 유전자로 대체하여 pAd△F6(Kan)을 생성하였다.
도 23은 크라베 개에서 AAV.CB7.cGALCco.rBG 유전자 요법의 평가를 위한 연구 설계를 나타내는 도면.
도 24A 내지 도 24C는 크라베 개에게 AAVhu68.cGALC를 ICM 투여 후 생존 및 CSF로의 효소 분비를 나타내는 도면. (도 24A) 생존 곡선(진행 중). (도 24B 및 도 24C). CSF에서 GALC 활성은 형광 기질(Marker Gene Techonologies, Inc., Cat. No. M2774)을 사용하여 측정하였다.
도 25A 내지 도 25D는 AAVhu68.cGALC를 투여한 후 크라베 개에서 경골 운동 신경(도 25A), 및 요골 감각 신경(도 25B), 좌골 운동 신경(도 25C), 및 척골 운동 신경(도 25D)에서 신경 전도 속도(NCV)를 나타내는 도면. 주기적인 NCV 기록은 크라베 모의-처리 개에서 신호가 느려지거나(도 25A) 또는 검출되지 않음(도 25B)을 나타내는 반면, 4마리의 rAAVhu68.cGALC 처리된 동물 모두는 연령이 일치하는 WT 대조군 개와 유사한 정규화된 속도를 가진다.
도 25E는 모의 및 rAAVhu68.cGALC 처리 크라베 개의 신경학적 검사 결과를 나타내는 도면.
도 26A 내지 도 26C는 모의 처리된 크라베 개 및 AAVhu68.cGALC 처리된 크라베 개 유래의 뇌 절편의 조직학 결과를 나타내는 도면. (도 26A) 미엘린에 대한 룩솔 블루 염색. (도 26B) IBA1 면역염색(미세아교세포 마커) 및 (도 26C) 정량화.
도 27은 비히클 또는 AAVhu68.cGALC를 받은 야생형(비히클 처리) 및 크라베 개에 대한 체중 곡선을 나타내는 도면.
도 28A 및 도 28B는 모의 처리 크라베 개 및 야생형 개, 및 AAVhu68.cGALC를 투여한 크라베 개에서 CSF 및 감각 뉴런 안전성 모니터링을 나타내는 도면. (도 28A) CSF 세포증다증. (도 28B) AAVhu68.cGALC 처리된 크라베 개 유래의 배근신경절 조직학.
도 29A는 모의-처리 크라베 및 야생형 개, 및 AAVhu68.cGALC를 투여한 크라베 개에 대한 MRI 측정을 나타내는 도면. 도 29B는 도 29A의 MRI 측정에 대한 누적 점수 결과를 나타내는 도면.
도 30은 벡터 생성을 위한 제조 공정 흐름도를 나타내는 도면. 약어: AEX, 음이온 교환; CRL, Charles River Laboratories; ddPCR, 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응; DMEM, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium); DNA, 데옥시리보핵산; FFB, 최종 제형 완충액; GC, 게놈 복사체; HEK293, 인간 배아 신장 293 세포; ITFFB, 척수강내 최종 제형 완충액; PEI, 폴리에틸렌이민; SDS-PAGE, 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동; TFF, 접선 흐름 여과; USP, 미국 약전; WCB, 제조용 세포 은행.
도 31은 벡터 제형화를 위한 제조 공정 흐름도를 나타내는 도면. 약어: Ad5, 아데노바이러스 혈청형 5; AUC, 분석적 초원심분리; BDS, 대량 원료의약품; BSA, 소 혈청 알부민; CZ, Crystal Zenith; ddPCR, 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응; E1A, 초기 영역 1A(유전자); ELISA, 효소-결합 면역흡착 측정법; FDP, 최종 의약품; GC, 게놈 복사체; HEK293, 인간 배아 신장 293 세포; ITFFB, 척수강내 최종 제형 완충액; KanR, 카나마이신 내성(유전자); MS, 질량분석법; NGS, 차세대 염기서열분석; qPCR, 정량적 중합효소 연쇄 반응; SDS-PAGE, 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동; TCID50 50% 조직 배양 감염 용량; UPLC, 초고성능 액체 크로마토그래피; USP, 미국 약전.
인간 갈락토실세라미다제(GALC) 단백질을 발현하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV), rAAV를 포함하는 조성물 및 이의 용도가 제공된다. 특정 실시형태에서, rAAV.hGALC는 처음으로 증상이 있는 유아 크라베 환자(초기 유아 크라베병(early infantile Krabbe disease, EIKD)에 대한 질병 경과변형 치료법을 제공한다. 특정 실시형태에서, rAAV.hGALC는 증상 전 유아 환자에 대한 치료법을 제공한다. 특정 실시형태에서, rAAV.hGALC는 호흡부전 및 운동 기능 상실을 유발하는 말초 신경을 교정할 수 있는 요법을 제공한다. 특정 실시형태에서, rAAV.hGALC는 이익-위험 비율이 현재 유일한 질병 경과변형 치료법인 조혈모세포 이식(HSCT)에 유리하지 않은 후반기-발병 환자의 치료에 대한 추가적인 옵션을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "rAAV.GALC"는 최소한 갈락토실세라미다제 단백질(효소)에 대한 코딩 서열을 포함하는 벡터 게놈을 내부에 패키징한 AAV 캡시드를 가지는 rAAV를 지칭한다. rAAVhu68.GALC는 AAV 캡시드가 본 명세서에 정의된 AAVVhu68 캡시드인 rAAV를 지칭한다. 하기 예는 또한 다른 AAV 캡시드를 예시한다.
용어 "cGALC"는 개에서의 연구를 위해 하기 실시예에서 사용된 개 GALC를 발현하는 코딩 서열을 지칭한다. 개 GALC는 26 bp 신호 펩타이드를 가지고 단백질의 총 길이가 669개 아미노산이다.
용어 "hGALC"는 인간 GALC에 대한 코딩 서열을 지칭한다.
hGALC의 동형단백질 1은 표준 서열이며 길이가 685개 아미노산이다. 이 아미노산 서열은 서열번호 6으로 재현된다. 성숙한 단백질은 아미노산 약 43번 내지 약 685번에 위치하고 신호 펩타이드는 1번 내지 42번 위치에 위치하지만, 개시 Met가 1번 위치보다 17번 위치에 있다는 일부 제안이 있다. GALC의 다수의 동형단백질이 알려져 있고(동형단백질 1 내지 5), 36개가 넘는 천연 변이체가 설명되었지만, 본 발명자들은 641번 위치에서 트레오닌(T)에서 알라닌(A)으로의 돌연변이가 있는 변이가 특히 바람직하다는 것을 발견하였다. 이러한 서열은 서열번호 10에서 제공된다. 이 변이체는 본 명세서에서 제공되는 rAAV 및 벡터 게놈의 실시예에서 예시된 인간 갈락토실세라미다제(hGALC) 코딩 서열에 의해 인코딩되는 단백질 서열이다. 갈락토실세라미다제(GALC)는 또한 갈락토세레브로시다제로 알려져 있으며 이들 명칭은 호환 가능하게 사용된다. 특정 실시형태에서, 이 변이체는 효소 대체 요법 또는 공동 요법에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "CB7.CI.hGALC.rBG"는 유비쿼터스 CB7 프로모터의 제어 하에 인간 GALC에 대한 코딩 서열을 포함하고 적어도 CMV IE(거대세포바이러스 급초기) 인핸서, 키메라 인트론, 및 토끼 β-글로빈(rBG) 폴리A 서열을 포함하며, 이들 모두 5'ITR 및 3'ITR이 측접하는 벡터 게놈(예를 들어, 도 2에 도시된 바와 같음)을 지칭한다. 특정 실시형태에서, CB7.CI.hGALC.rBG는 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지는 성숙한 GALC 단백질을 인코딩하는 GALC 코딩 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, CB7.CI.hGALC.rBG는 서열번호 9의 핵산 서열 또는 이와 95% 내지 99.9% 동일한 서열을 포함하는 GALC에 대한 코딩 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CB7.CI.hGALC.rBG 벡터 게놈은 서열번호 19를 포함한다. 특정 실시형태에서, CB7.CI.hGALC.rBG는 서열번호 10의 성숙한 단백질에 대한 코딩 서열 및 외인성 신호 펩타이드를 포함한다.
특정 실시형태에서, 천연 신호 펩타이드의 전부 또는 일부가 제거되고(aa 1번 내지 17번, 또는 aa 1번 내지 42번) 외인성 신호 펩타이드로 치환된 적어도 성숙한 GALC를 포함하는 융합 단백질이 고려된다. 이와 같은 융합 단백질은 외인성 신호 펩타이드를 포함하고 적어도 성숙한 인간 GALC 단백질(예를 들어, 서열번호 6 또는 서열번호 10의 아미노산 43번 내지 695번)을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 융합 단백질은 CNS에서 인간 세포에 적합한 외인성 신호 펩타이드, 즉, 천연 신호 펩타이드에 대해 치환되어 인간 CNS에 존재하는 세포에서 단백질(즉, hGALC)의 생성, 세포내 수송, 및/또는 분비를 개선시키는 신호 펩타이드를 포함한다. CNS에서 인간 세포에 적합한 외인성 신호 펩타이드는 면역글로불린(예를 들어, IgG), 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL12, IL18 등), 인슐린, 알부민, β-글루쿠로니다제, 알칼리성 프로테아제, 폰빌레브란드 인자(VWF), 또는 피브로넥티 분비 신호 펩타이드에서 천연적으로 발견되는 것들을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(또한, 예를 들어, www.signalpeptide.de/index.php?m=listspdb_mammalia 참조).
또한 본 발명은 본 명세서에서 제공되는 GALC 단백질(들)(서열번호 6, 서열번호 10, 또는 성숙한 GALC를 포함하는 융합 단백질)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 코딩 서열은 단백질을 인코딩하는 cDNA 서열이다. 그러나, 또한 상응하는 RNA 서열도 포함된다.
특정 실시형태에서, 핵산 코딩 서열은 서열번호 5의 cDNA 서열 또는 이와 95% 내지 99.9% 동일한 서열, 또는 이들의 단편을 가진다. 적합한 단편은 성숙한 단백질에 대한 코딩 서열(약 nt 127번 내지 약 nt 2058번), 또는 신호 펩타이드의 단편이 있는 성숙한 단백질에 대한 코딩 서열(예를 들어, 약 nt 54번 내지 약 nt 2058번)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 코딩 서열은 서열번호 5의 성숙한 hGALC(nt 127번 내지 2058번) 또는 이를 포함하는 융합 단백질 및 외인성 리더를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이와 95% 내지 99.9% 동일한 서열을 가진다. 특정 실시형태에서, 코딩 서열은 서열번호 5의 성숙한 hGALC(nt 127번 내지 2058번)를 인코딩하는 핵산 서열 또는 이와 95% 내지 99.9% 동일한 서열, 또는 리더 서열의 단편 및 성숙한 hGALC를 포함하는 이의 단편을 가진다. 특정 실시형태에서, 코딩 서열은 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지는 전장 인간 GALC 단백질을 인코딩한다. 특정 실시형태에서, 코딩 서열은 서열번호 5의 hGALC 리더(핵산 1번 내지 126번) 및 성숙한 단백질(핵산 127번 내지 2058번에 의해 인코딩됨)을 인코딩한다.
특정 실시형태에서, 발현 카세트는 배근신경절(drg)에서 hGALC의 발현을 억제하는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함한다(예를 들어, 2020년 2월 12일자로 출원된 국제 특허출원 PCT/US19/67872호를 참조하며, 이는 본 명세서에 참조에 의해 원용된다).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 공세포백색질장애(GLD)로도 알려진 크라베병은 미엘린 갈락토리피드의 분해를 담당하는 효소인 갈락토실세라미다제(GALC)의 활성에 영향을 미치는 돌연변이에 의해 유발되는 리소좀 축적 질환이다. 효소 결핍의 중증도에 따라 여러 유형의 크라베병이 설명되었다. 가장 심각한 효소 결핍으로부터 가장 덜 심각한 효소 결핍까지, 생후 6개월 이하의 발병으로 정의되는 초기 유아 크라베병(EIKD); 생후 7 내지 12개월의 발병으로 정의되는 후반기 유아 크라베병(LIKD); 생후 13개월 내지 10세의 발병으로 정의되는 소아 크라베병(JKD); 및 청소년/성인 발병 크라베병이 있다.
특정 실시형태에서, 유효량의 rAAV.GALC 벡터는 CSF에서 GALC 효소 수준을 정상 수준의 약 30% 내지 약 100% 이내로 증가시킨다. 다른 실시형태에서, 유효량의 rAAV.GALC 벡터는 혈장에서 GALC 효소 수준을 정상 수준의 약 30% 내지 약 100% 이내로 증가시킨다. 특정 실시형태에서, GALC의 더 적은 양의 증가된 CSF 또는 혈장 수준이 관찰되지만, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 크라베병과 연관된 하나 이상의 증상에서 개선이 관찰된다.
"재조합 AAV" 또는 "rAAV"는 2개의 요소, 즉, AAV 캡시드 및 AAV 캡시드 내에 패키징된 적어도 비-AAV 코딩 서열을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 DNAse-내성 바이러스 입자이다. 달리 명시되지 않는 한, 이 용어는 어구 "rAAV 벡터"와 호환 가능하게 사용될 수 있다. rAAV는 임의의 기능성 AAV rep 유전자 또는 기능성 AAV cap 유전자가 없고 자손을 생성할 수 없기 때문에, rAAV는 "복제-결함 바이러스" 또는 "바이러스 벡터"이다. 특정 실시형태에서, 유일한 AAV 서열은, 반전 말단 반복부 서열(ITR) 사이에 위치한 유전자 및 조절 서열이 AAV 캡시드 내에 패키징되는 것을 가능하게 하기 위해서 전형적으로 벡터 게놈의 5' 및 3' 말단 끝에 위치하는 AAV 반전 말단 반복부 서열(ITR)이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "벡터 게놈"은 바이러스 입자를 형성하는 rAAV 캡시드 내부에 패키징된 핵산 서열을 지칭한다. 이와 같은 핵산 서열은 AAV 반전 말단 반복부 서열(ITR)을 포함한다. 본 명세서의 예에서, 벡터 게놈은 최소한 5'에서 3'으로, AAV 5' ITR, 코딩 서열(들), 및 AAV 3' ITR을 포함한다. 캡시드와 상이한 공급원의 AAV인 AAV2 유래의 ITR, 또는 전장 ITR이 아닌 다른 ITR이 선택될 수 있다. 특정 실시형태에서, ITR은 생성 동안 rep 기능을 제공하는 AAV 또는 트랜스상보성(transcomplementing) AAV와 동일한 AAV 공급원으로부터 유래된다. 또한, 다른 ITR이 사용될 수 있다. 또한, 벡터 게놈은 유전자 산물의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함한다. 벡터 게놈의 적합한 구성성분은 본 명세서에서 보다 상세히 논의된다.
AAVhu68
하기 실시예에 기재된 바와 같이, 본 명세서에서 제공되는 rAAV는 AAVhu68 캡시드를 포함한다. 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 WO 2018/160582호를 참조한다. AAVhu68은 클레드 F에 속한다. AAVhu68(서열번호 2)은 vp1의 67번 및 157번 위치에서 2개의 인코딩된 아미노산에 의해 다른 클레드 F 바이러스 AAV9(서열번호 4)와 다르다. 대조적으로, 다른 클레드 F AAV(AAV9, hu31, hu31)는 67번 위치에서 Ala를 가지고 157번 위치에서 Ala를 가진다.
rAAVhu68은 AAVhu68 캡시드 및 벡터 게놈으로 구성된다. 일 실시형태에서, rAAVhu68을 포함하는 조성물은 vp1의 이종 집단, vp2의 이종 집단, 및 vp3 단백질의 이종 집단의 집합체를 포함한다. vp 캡시드 단백질을 지칭하는 데 사용될 때 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이질적" 또는 이의 임의의 문법적 변형어는, 예를 들어 상이한 변형된 아미노산 서열이 있는 vp1, vp2 또는 vp3 단량체(단백질)를 가지는 동일하지 않은 요소로 이루어지는 집단을 지칭한다. 서열번호 2는 AAVhu68 vp1 단백질의 인코딩된 아미노산 서열을 제공한다. AAVhu68 캡시드는 vp1 단백질 내, vp2 단백질 내 및 vp3 단백질 내에 서열번호 2에서 예측된 아미노산 잔기로부터 변형을 가지는 하위집단을 포함한다. 이러한 하위집단은 최소한 특정 탈아미드화된 아스파라긴(N 또는 Asn) 잔기를 포함한다. 예를 들어, 특정 하위집단은 서열번호 2의 아스파라긴-글리신 쌍에서 적어도 1개, 2개, 3개 또는 4개의 고도로 탈아미드화된 아스파라긴(N) 위치를 포함하고, 선택적으로 다른 탈아미드화된 아미노산을 추가로 포함하며, 여기서 탈아미드화는 아미노산 변화 및 다른 선택적인 변형을 초래한다. 이들 및 다른 변형의 다양한 조합이 본 명세서에 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, vp 단백질의 "하위집단"은 달리 명시되지 않는 한, 공통적으로 적어도 하나의 정의된 특징을 가지고 참조 그룹의 모든 구성원보다 적은 적어도 하나의 그룹 구성원으로 이루어지는 vp 단백질의 그룹을 지칭한다. 예를 들어, vp 단백질의 "하위집단"은 달리 명시되지 않는 한, 적어도 하나(1)의 vp1 단백질 및 조립된 AAV 캡시드의 모든 vp1 단백질보다 적다. vp3 단백질의 "하위집단"은 달리 명시되지 않는 한, 하나(1)의 vp3 단백질 내지 조립된 AAV 캡시드의 모든 vp3 단백질보다 적은 단백질일 수 있다. 예를 들어, vp1 단백질은 vp 단백질의 하위집단일 수 있고; vp2 단백질은 vp 단백질의 별도의 하위집단일 수 있으며, vp3은 조립된 AAV 캡시드에서 vp 단백질의 추가의 하위집단이다. 또 다른 예에서, vp1, vp2 및 vp3 단백질은, 예를 들어 아스파라긴-글리신 쌍에서, 상이한 변형, 예를 들어 적어도 1개, 2개, 3개 또는 4개의 고도로 탈아미드화된 아스파라긴을 가지는 하위집단을 포함할 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 고도로 탈아미드화된 것은 참조 아미노산 위치에서 예상되는 아미노산 서열과 비교하여 적어도 45% 탈아미드화, 적어도 50% 탈아미드화, 적어도 60% 탈아미드화, 적어도 65% 탈아미드화, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 97%, 99%, 최대 약 100% 탈아미드화를 지칭한다(예를 들어, 총 vp1 단백질을 기준으로 서열번호 2의 아미노산 57번에서 아스파라긴의 적어도 80%가 탈아미드화될 수 있거나 총 vp1, vp2 및 vp3 단백질을 기준으로 서열번호 2의 아미노산 409번에서 아스파라긴의 20%가 탈아미드화될 수 있음). 이와 같은 백분율은 2D-겔, 질량 분석 기법, 또는 기타 적합한 기법을 사용하여 결정될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 바와 같이, 서열번호 2의 각각의 탈아미드화된 N은 독립적으로 아스파르트산(Asp), 아이소아스파르트산(isoAsp), 아스파테이트, 및/또는 Asp 및 isoAsp, 또는 이들의 조합물의 상호전환 배합물일 수 있다. 임의의 적합한 비율의 α- 및 아이소아스파르트산이 존재할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 비율은 10:1 내지 1:10 아스파르트산 대 아이소아스파르트산, 약 50:50 아스파르트산 대 아이소아스파르트산, 또는 약 1:3 아스파르트산:아이소아스파르트산, 또는 또 다른 선택된 비율일 수 있다. 특정 실시형태에서, 서열번호 2의 하나 이상의 글루타민(Q)은 일반적인 글루타린이미드 중간체를 통해 상호전환될 수 있는 글루탐산(Glu), 즉, α-글루탐산, γ-글루탐산(Glu), 또는 α- 및 γ-글루탐산의 배합물로 탈아미드화된다. α- 및 γ-글루탐산의 임의의 적합한 비율이 존재할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 비율은 10:1 내지 1:10 α 대 γ, 약 50:50 α:γ, 또는 약 1:3 α:γ, 또는 또 다른 선택된 비율일 수 있다.
따라서, rAAVhu68은, 최소한 적어도 하나의 고도로 탈아미드화된 아스파라긴을 포함하는 적어도 하나의 하위집단을 포함하는, 탈아미드화된 아미노산이 있는 vp1, vp2 및/또는 vp3 단백질의 rAAVhu68 캡시드 내의 하위집단을 포함한다. 추가적으로, 다른 변형은, 특히 선택된 아스파르트산(D 또는 Asp) 잔기 위치에서 이성질체화를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 변형은 Asp 위치에서 아미드화를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, AAVhu68 캡시드는 적어도 4개 내지 적어도 약 25개의 탈아미드화된 아미노산 잔기 위치를 가지는 vp1, vp2 및 vp3의 하위집단을 포함하며, 이 중 적어도 1 내지 10%는 서열번호 2의 인코딩된 아미노산 서열과 비교하여 탈아미드화된다. 이들 대부분은 N 잔기일 수 있다. 그러나, Q 잔기도 또한 탈아미드화될 수 있다.
특정 실시형태에서, AAVhu68 캡시드는 하기 중 하나 이상에 의해 추가로 특징지어진다. AAVhu68 캡시드 단백질은, 서열번호 2의 1번 내지 736번의 예측된 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열로부터의 발현에 의해 생성된 AAVhu68 vp1 단백질, 서열번호 1로부터 생성된 vp1 단백질, 또는 서열번호 2의 1번 내지 736번의 예측된 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 1과 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성된 vp1 단백질; 서열번호 2의 적어도 약 아미노산 138 내지 736번의 예측된 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열로부터의 발현에 의해 생성된 AAVhu68 vp2 단백질, 서열번호 1의 적어도 뉴클레오타이드 412번 내지 2211번을 포함하는 서열로부터 생성된 vp2 단백질, 또는 서열번호 2의 적어도 약 아미노산 138번 내지 736번의 예측된 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 1의 적어도 뉴클레오타이드 412번 내지 2211번과 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성된 vp2 단백질, 및/또는 서열번호 2의 적어도 약 아미노산 203번 내지 736번의 예측된 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열로부터의 발현에 의해 생성된 AAVhu68 vp3 단백질, 서열번호 1의 적어도 뉴클레오타이드 607번 내지 2211번을 포함하는 서열로부터 생성된 vp3 단백질, 또는 서열번호 2의 적어도 약 아미노산 203번 내지 736번의 예측된 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 1의 적어도 뉴클레오타이드 607번 내지 2211번과 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성된 vp3 단백질을 포함한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 선택적으로 157번 위치에서 발린을 포함하는 vp1 단백질의 이종 집단, 선택적으로 157번 위치에서 발린을 포함하는 vp2 단백질의 이종 집단, 및 vp3 단백질의 이종 집단을 포함하는 AAV 캡시드가 제공되며, 여기서 적어도 vp1 및 vp2 단백질의 하위집단은 157번 위치에서 발린을 포함하고 선택적으로 서열번호 2의 vp1 캡시드의 번호매김을 기준으로 하여 67번 위치에서 글루탐산을 추가로 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로 서열번호 2의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열의 산물인 vp1 단백질의 이종 집단, 서열번호 2의 적어도 약 아미노산 138번 내지 736번의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열의 산물인 vp2 단백질의 이종 집단, 및 서열번호 2의 적어도 아미노산 203번 내지 736번을 인코딩하는 핵산 서열의 산물인 vp3 단백질의 이종 집단을 포함하는 AAVhu68 캡시드가 제공되며, 여기서 vp1, vp2 및 vp3 단백질은 아미노산 변형이 있는 하위집단을 포함한다.
AAVhu68 vp1, vp2 및 vp3 단백질은 전형적으로 서열번호 2의 전장 vp1 아미노산 서열(아미노산 1번 내지 736번)을 인코딩하는 동일한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 대안적인 스플라이스 변이체로서 발현된다. 선택적으로, vp1-인코딩 서열은 vp1, vp2 및 vp3 단백질을 발현하기 위해 단독으로 사용된다. 대안적으로, 이 서열은 vp1-고유 영역(약 aa 1번 내지 약 aa 137번) 및/또는 vp2-고유 영역(약 aa 1번 내지 약 aa 202번), 또는 이에 상보적인 가닥, 상응하는 mRNA 또는 tRNA(서열번호 1의 약 nt 607번 내지 약 nt 2211번), 또는 서열번호 2의 aa 203번 내지 736번을 인코딩하는 서열번호 1과 적어도 70% 내지 적어도 99%(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 서열 없이 서열번호 2의 AAVhu68 vp3 아미노산 서열(약 aa 203번 내지 736번)을 인코딩하는 핵산 서열 중 하나 이상과 공동 발현될 수 있다. 추가적으로, 또는 대안적으로, vp1-인코딩 및/또는 vp2-인코딩 서열은 vp1-고유 영역(약 aa 1번 내지 약 137번), 또는 이에 상보적인 가닥, 상응하는 mRNA 또는 tRNA(서열번호 1의 nt 412번 내지 22121번), 또는 서열번호 2의 약 aa 138번 내지 736번은 인코딩하는 서열번호 1과 적어도 70% 내지 적어도 99%(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 서열 없이 서열번호 2(약 aa 138번 내지 736번)의 AAVhu68 vp2 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산과 공동 발현될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, rAAVhu68은 서열번호 2의 vp1 아미노산 서열을 인코딩하는 AAVhu68 핵산, 및 선택적으로, 예를 들어 vp1 및/또는 vp2-고유 영역이 없는 vp3 단백질을 인코딩하는, 추가적인 핵산 서열로부터 캡시드를 발현하는 생성 시스템에서 생성된 rAAVhu68 캡시드를 가진다. 단일 핵산 서열 vp1을 사용하여 생성된 rAAVhu68은 vp1 단백질, vp2 단백질 및 vp3 단백질의 이종 집단을 생성한다. 보다 특히, rAAVhu68 캡시드는 서열번호 2의 예측된 아미노산 잔기로부터 변형을 가지는 vp1 단백질 내, vp2 단백질 내 및 vp3 단백질 내의 하위집단을 포함한다. 이러한 하위집단은 최소한 탈아미드화된 아스파라긴(N 또는 Asn)을 포함한다. 예를 들어, 아스파라긴-글리신 쌍의 아스파라긴은 고도로 탈아미드화되어 있다.
일 실시형태에서, AAVhu68 vp1 핵산 서열은 서열번호 1의 서열, 이에 상보적인 가닥, 예를 들어 상응하는 mRNA 또는 tRNA를 가진다. 특정 실시형태에서, vp2 및/또는 vp3 단백질은, 예를 들어 선택된 발현 시스템에서 vp 단백질의 비율을 변경하기 위해, vp1과 상이한 핵산 서열로부터 추가적으로 또는 대안적으로 발현될 수 있다. 특정 실시형태에서, 또한 vp1-고유 영역(약 aa 1번 내지 약 aa 137번) 및/또는 vp2-고유 영역(약 aa 1번 내지 약 aa 202번), 또는 이에 상보적인 가닥, 상응하는 mRNA 또는 tRNA(서열번호 1의 약 nt 607번 내지 약 nt 2211번) 없이 서열번호 2의 AAVhu68 vp3 아미노산 서열(약 aa 203번 내지 736번)을 인코딩하는 핵산 서열이 제공된다. 특정 실시형태에서, 또한 vp1-고유 영역(약 aa 1번 내지 약 137번), 또는 이에 상보적인 가닥, 상응하는 mRNA 또는 tRNA(서열번호 1의 nt 412번 내지 2211번) 없이 서열번호 2의 AAVhu68 vp2 아미노산 서열(약 aa 138번 내지 736번)을 인코딩하는 핵산 서열이 제공된다.
그러나, 서열번호 2의 아미노산 서열을 인코딩하는 다른 핵산 서열은 rAAVhu68 캡시드를 생성하는 데 사용하기 위해 선택될 수 있다. 특정 실시형태에서, 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열 또는 서열번호 2를 인코딩하는 서열번호 1과 적어도 70% 내지 99% 동일한, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 가진다. 특정 실시형태에서, 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열 또는 서열번호 2의 vp2 캡시드 단백질(약 aa 138번 내지 736번)을 인코딩하는 서열번호 1의 약 nt 412번 내지 약 nt 2211번과 적어도 70% 내지 99%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 가진다. 특정 실시형태에서, 핵산 서열은 서열번호 1의 약 nt 607번 내지 약 nt 2211번의 핵산 서열 또는 서열번호 2의 vp3 캡시드 단백질(약 aa 203번 내지 736번)을 인코딩하는 서열번호 1의 약 nt 607번 내지 약 nt 2211번과 적어도 70% 내지 99.%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 가진다.
DNA(게놈 또는 cDNA), 또는 RNA(예를 들어, mRNA)를 포함하여 이러한 rAAVhu68 캡시드를 인코딩하는 핵산 서열을 설계하는 것은 당업계의 기술 범위 내에 있다. 특정 실시형태에서, AAVhu68 vp1 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1에서 제공된다. 다른 실시형태에서, 서열번호 1과 70% 내지 99.9% 동일한 핵산 서열은 AAVhu68 캡시드 단백질을 발현하도록 선택될 수 있다. 다른 특정 실시형태에서, 핵산 서열은 서열번호 1과 적어도 약 75% 동일하거나, 적어도 80% 동일하거나, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 동일하거나, 적어도 99% 내지 99.9% 동일하다. 이와 같은 핵산 서열은 선택된 시스템(즉, 세포 유형)에서 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있으며, 다양한 방법에 의해 설계될 수 있다. 이러한 최적화는 온라인으로 이용 가능한 방법(예를 들어, GeneArt), 공개된 방법, 또는 코돈 최적화 서비스를 제공하는 회사, 예를 들어 DNA2.0(미국 캘리포니아주 멘로파크 소재)을 사용하여 수행될 수 있다. 한 가지 코돈 최적화 방법이, 예를 들어 미국 국제 특허 출원 WO 2015/012924호에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다. 또한, 예를 들어 미국 특허 공개 제2014/0032186호 및 미국 특허 공개 제2006/0136184호를 참조한다. 적합하게는, 생성물에 대한 오픈 리딩 프레임(ORF)의 전체 길이가 변형된다. 그러나, 일부 실시형태에서, ORF의 단편만이 변경될 수 있다. 이들 방법 중 하나를 사용함으로써, 임의의 주어진 폴리펩타이드 서열에 빈도를 적용하고 폴리펩타이드를 인코딩하는 코돈-최적화된 코딩 서열의 핵산 단편을 생성할 수 있다. 코돈에 대한 실제 변경을 수행하거나 본 명세서에 기재된 바와 같이 설계된 코돈-최적화 코딩 영역을 합성하기 위해 다수의 옵션이 이용 가능하다. 이와 같은 변형 또는 합성은 당업자에게 잘 알려진 표준 및 일상적인 분자 생물학 조작을 사용하여 수행될 수 있다. 하나의 접근법에서, 각각 길이 및 원하는 서열의 길이에 걸쳐 있는 80 내지 90개 뉴클레오타이드의 일련의 상보적 올리고뉴클레오타이드 쌍이 표준 방법에 의해 합성된다. 이러한 올리고뉴클레오타이드 쌍은 어닐링시, 결합 말단을 포함하는 80 내지 90개 염기쌍의 이중 가닥 단편을 형성하도록 합성되며, 예를 들어 쌍에서 각각의 올리고뉴클레오타이드는 쌍에서 다른 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 영역을 넘어서 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 염기로 확장되도록 합성된다. 올리고뉴클레오타이드의 각각의 쌍의 단일-가닥 말단은 올리고뉴클레오타이드의 또 다른 쌍의 단일-가닥 말단과 어닐링하도록 설계된다. 올리고뉴클레오타이드 쌍은 어닐링될 수 있으며, 그 다음 이러한 이중-가닥 단편의 대략 5 내지 6개는 결합 단일 가닥 말단을 통해 함께 어닐링될 수 있고, 그 다음 이들은 함께 결찰되어 표준 박테리아 클로닝 벡터, 예를 들어 Invitrogen Corporation(미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)로부터 입수 가능한 TOPO® 벡터로 클로닝된다. 그 다음 작제물은 표준 방법에 의해 염기서열이 결정된다. 함께 결찰된 80 내지 90개 염기쌍 단편의 5 내지 6개 단편, 즉, 약 500개 염기쌍의 단편으로 이루어지는 이러한 몇 개의 작제물은, 전체 원하는 서열이 일련의 플라스미드 작제물에 나타나도록 제조된다. 그 다음 이들 플라스미드의 삽입물은 적절한 제한 효소로 절단되고 함께 결찰되어 최종 작제물을 형성한다. 그 다음 최종 작제물은 표준 박테리아 클로닝 벡터로 클로닝되고, 염기서열이 결정된다. 추가적인 방법은 숙련된 기술자에게 즉시 명백할 것이다. 추가적으로, 유전자 합성은 상업적으로 용이하게 이용 가능하다.
특정 실시형태에서, rAAVhu68 vp1, vp2 및 vp3 단백질의 N-G 쌍에서 아스파라긴(N)은 고도로 탈아미드화된다. rAAVhu68 캡시드 단백질의 경우에, 4개의 잔기(N57, N329, N452, N512)는 일상적으로 70% 초과의 탈아미드화 수준을 나타내며, 대부분의 경우 다양한 로트에 걸쳐서 90% 초과이다. 추가적인 아스파라긴 잔기(N94, N253, N270, N304, N409, N477, 및 Q599)는 또한 다양한 로트에 걸쳐 최대 약 20%의 탈아미드화 수준을 나타낸다. 탈아미드화 수준은 처음에 트립신 소화를 사용하여 확인되었고 키모트립신 소화를 이용하여 확인되었다.
특정 실시형태에서, rAAVhu68 캡시드는 고도로 탈아미드화된 rAAVhu68 캡시드 단백질에 적어도 4개의 아스파라긴(N) 위치를 가지는 AAV vp1, vp2 및/또는 vp3 캡시드 단백질의 하위집단을 포함한다. 특정 실시형태에서, N-N 쌍(N-N-N 삼중쌍은 제외)의 약 20 내지 50%는 탈아미드화를 나타낸다. 특정 실시형태에서, 제1 N은 탈아미드화된다. 특정 실시형태에서, 제2 N은 탈아미드화된다. 특정 실시형태에서, 탈아미드화는 약 15% 내지 약 25%의 탈아미드화이다. 서열번호 2의 259번 위치에서 Q에서의 탈아미드화는 AAVhu68 단백질의 AAVhu68 vp1, vp2 및 vp3 캡시드 단백질의 약 8% 내지 약 42%이다.
특정 실시형태에서, rAAVhu68 캡시드는 vp1, vp2 및 vp3 단백질의 D297에서 아미드화에 의해 추가로 특징지어진다. 특정 실시형태에서, 서열번호 2의 번호매김을 기준으로 하여, AAVhu68 캡시드에서 vp1, vp2 및/또는 vp3 단백질의 297번 위치에서 D의 약 70% 내지 약 75%는 아미드화된다. 특정 실시형태에서, 캡시드의 vp1, vp2 및/또는 vp3에서 적어도 하나의 Asp는 D-Asp로 이성질체화된다. 이와 같은 이성질체는 일반적으로 서열번호 2의 번호매김을 기준으로 하여, 잔기 위치 97, 107, 384번 중 하나 이상에서 Asp의 약 1% 미만의 양으로 존재한다.
특정 실시형태에서, rAAVhu68은 하기 표에 제시된 위치에서 1, 2, 3, 4개 이상의 탈아미드화된 잔기의 조합을 포함하는 하위집단을 가지는 vp1, vp2 및 vp3 단백질을 가지는 AAVhu68 캡시드를 가진다. rAAV의 탈아미드화는 2D 겔 전기영동, 및/또는 질량 분석법, 및/또는 단백질 모델링 기법을 사용하여 결정될 수 있다. 온라인 크로마토그래피는 NanoFlex 소스가 있는 Q Exactive HF(Thermo Fisher Scientific)와 커플링되어 있는 Acclaim PepMap 컬럼 및 Thermo UltiMate 3000 RSLC 시스템(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 수행될 수 있다. MS 데이터는 Q Exactive HF에 대한 데이터-종속적 상위 20개 방법을 사용하여 획득되며, 서베이 스캔(200 내지 2000 m/z)으로부터 아직 염기서열이 결정되지 않은 가장 풍부한 전구체 이온을 동적으로 선택한다. 염기서열결정은 예측 자동 획득 제어로 결정된 1e5 이온의 목표 값으로 더 높은 에너지 충돌 해리 단편화를 통해 수행되고 전구체의 분리는 4 m/z의 창으로 수행되었다. 서베이 스캔은 m/z 200에서 120,000의 분해능으로 획득되었다. HCD 스펙트럼에 대한 분해능은 m/z 200에서 30,000으로 설정될 수 있으며, 이때 최대 이온 주입 시간은 50㎳이고 정규화된 충돌 에너지는 30이다. S-렌즈 RF 수준은 소화로부터 펩타이드가 차지하는 m/z 영역의 최적 전송을 제공하기 위해, 50으로 설정될 수 있다. 전구체 이온은 단편화 선택에서 단일의 할당되지 않은, 또는 6개 이상의 전하 상태로 제외될 수 있다. BioPharma Finder 1.0 소프트웨어(Thermo Fischer Scientific)가 획득된 데이터의 분석에 사용될 수 있다. 펩타이드 맵핑을 위해, 고정 변형으로 카바미도메틸화가 설정되고; 다양한 변형, 즉, 10-ppm 질량 정확도, 높은 프로테아제 특이성, 및 MS/MS 스펙트럼에 대한 0.8의 신뢰 수준으로 산화, 탈아미드화, 및 인산화가 설정된 단일 항목 단백질 FASTA 데이터베이스를 사용하여 검색이 수행된다. 적합한 프로테아제의 예는, 예를 들어 트립신 또는 키모트립신을 포함할 수 있다. 탈아미드화가 온전한 분자의 질량에 +0.984 Da(-OH와 -NH2 기 사이의 질량 차이)를 추가하기 때문에, 탈아미드화된 펩타이드의 질량 분광학적 확인은 비교적 간단하다. 특정 펩타이드의 탈아미드화 백분율은 탈아미드화 펩타이드의 질량 면적을 탈아미드화 펩타이드 및 천연 펩타이드의 면적의 합으로 나눈 것으로 결정된다. 가능한 탈아미드화 부위의 수를 고려할 때, 상이한 부위에서 탈아미드화되는 등비중(isobaric) 종은 단일 피크에서 함께 이동할 수 있다. 결과적으로, 여러 잠재적 탈아미드화 부위가 있는 펩타이드에서 비롯되는 단편 이온을 사용하여 탈아미드화의 다중 부위를 찾거나 상기 부위를 구별할 수 있다. 이러한 경우에, 관찰된 동위원소 패턴 내의 상대 강도를 사용하여 상이한 탈아미드화된 펩타이드 이성질체의 상대 풍부도를 구체적으로 결정할 수 있다. 이러한 방법은 모든 이성질체 종에 대한 단편화 효율이 동일하고 탈아미드화 부위에 독립적이라고 가정한다. 당업자는 이러한 예시적인 방법에 대한 다수의 변형이 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 적합한 질량 분석기는, 예를 들어 Waters Xevo 또는 Agilent 6530과 같은 사중극자 비행시간 질량 분석기(QTOF) 또는 Orbitrap Fusion 또는 Orbitrap Velos(Thermo Fisher)와 같은 오비트랩 기기를 포함할 수 있다. 적합하게는 액체 크로마토그래피 시스템은, 예를 들어 Waters의 Acquity UPLC 시스템 또는 Agilent 시스템(1100 또는 1200 시리즈)를 포함한다. 적합한 데이터 분석 소프트웨어는, 예를 들어 MassLynx(Waters), Pinpoint 및 Pepfinder(Thermo Fischer Scientific), Mascot(Matrix Science), Peaks DB(Bioinformatics Solutions)를 포함할 수 있다. 또 다른 기법은, 예를 들어 문헌[X. Jin et al, Hu Gene Therapy Methods, Vol. 28, No. 5, pp. 255-267, 2017년 6월 16일 온라인 공개]에 기재되어 있을 수 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
특정 실시형태에서, AAVhu68 캡시드는 N 잔기의 적어도 45%가 서열번호 2의 아미노산 서열의 번호매김을 기준으로 하여, N57, N329, N452, 및/또는 N512번 위치 중 적어도 하나가 탈아미드화된 캡시드 단백질을 가짐을 특징으로 한다. 특정 실시형태에서, 이들 N-G 위치(즉, 서열번호 2의 아미노산 서열의 번호매김을 기준으로 하여 N57, N329, N452, 및/또는 N512) 중 하나 이상에서 N 잔기의 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 90%가 탈아미드화된다. 이들 및 다른 실시형태에서, AAVhu68 캡시드는 N 잔기의 약 1% 내지 약 20%가 서열번호 2의 아미노산 서열의 번호매김을 기준으로 하여, N94, N253, N270, N304, N409, N477, 및/또는 Q599 위치 중 하나 이상에서 탈아미드화된 단백질의 집단을 가짐을 추가의 특징으로 한다. 특정 실시형태에서, AAVhu68은 서열번호 2의 아미노산 서열의 번호매김을 기준으로 하여, 적어도 N35, N57, N66, N94, N113, N252, N253, Q259, N270, N303, N304, N305, N319, N328, N329, N336, N409, N410, N452, N477, N515, N598, Q599, N628, N651, N663, N709, N735 위치 중 하나 이상에서, 또는 이들의 조합에서 탈아미드화된 vp1, vp2 및/또는 vp3 단백질의 하위집단을 포함한다. 특정 실시형태에서, 캡시드 단백질은 하나 이상의 아미드화된 아미노산을 가질 수 있다.
또 다른 변형이 관찰되며, 대부분은 하나의 아미노산의 상이한 아미노산 잔기로의 전환을 초래하지 않는다. 선택적으로, 캡시드의 vp1, vp2 및 vp3에서 적어도 하나의 Lys는 아세틸화된다. 선택적으로 캡시드의 vp1, vp2 및/또는 vp3에서 적어도 하나의 Asp는 D-Asp로 이성질체화된다. 선택적으로, 캡시드의 vp1, vp2 및/또는 vp3에서 적어도 하나의 S(Ser, 세린)는 인산화된다. 선택적으로 캡시드의 vp1, vp2 및/또는 vp3에서 적어도 하나의 T(Thr, 트레오닌)는 인산화된다. 선택적으로, 캡시드의 vp1, vp2 및/또는 vp3에서 적어도 하나의 W(trp, 트립토판)는 산화된다. 선택적으로, 캡시드의 vp1, vp2 및/또는 vp3에서 적어도 하나의 M(Met, 메티오닌)은 산화된다. 특정 실시형태에서, 캡시드 단백질은 하나 이상의 인산화를 가진다. 예를 들어, 특정 vp1 캡시드 단백질은 149번 위치에서 인산화될 수 있다.
특정 실시형태에서, rAAVhu68 캡시드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열의 산물인 vp1 단백질의 이종 집단으로서, vp1 단백질은 67번 위치에 글루탐산(Glu) 및/또는 157번 위치에 발린(Val)을 포함하는 vp1 단백질의 이종 집단; 선택적으로 157번 위치에 발린(Val)을 포함하는 vp2 단백질의 이종 집단; 및 vp3 단백질의 이종 집단을 포함한다. AAVhu68 캡시드는, 서열번호 2의 아미노산 서열의 잔기 번호매김을 기준으로 하여, vp1 단백질의 57번 위치에 위치하는 아스파라긴-글리신 쌍에서 적어도 65%의 아스파라긴(N), 및 vp1, v2 및 vp3 단백질의 329, 452 및/또는 512번 위치에서 아스파라긴-글리신 쌍에서 적어도 70%의 아스파라긴(N)이 탈아미드화된 적어도 하나의 하위집단을 포함하며, 여기서 탈아미드화는 아미노산 변화를 초래한다.
본 명세서에서 보다 상세히 논의된 바와 같이, 탈아미드화된 아스파라긴은 아스파르트산, 아이소아스파르트산, 상호전환 아스파르트산/아이소아스파라트산 쌍, 또는 이들의 조합으로 탈아미드화될 수 있다. 특정 실시형태에서, rAAVhu68은 다음 중 하나 이상에 의해 추가로 특징지어진다: (a) vp2 단백질 각각은 독립적으로 서열번호 2의 적어도 vp2 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 산물임; (b) vp3 단백질 각각은 독립적으로 서열번호 2의 적어도 vp3 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 산물임; (c) vp1 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 1과 적어도 70% 내지 적어도 99%(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 서열임. 선택적으로 해당 서열은 vp1, vp2 및 vp3 단백질을 발현하는 데 단독으로 사용된다. 대안적으로, 이 서열은 vp1-고유 영역(약 aa 1번 내지 약 aa 137번) 및/또는 vp2-고유 영역(약 aa 1번 내지 약 aa 202번), 또는 이에 상보적인 가닥, 상응하는 mRNA 또는 tRNA(서열번호 1의 약 nt 607번 내지 약 nt 2211번), 또는 서열번호 2의 aa 203번 내지 736번을 인코딩하는 서열번호 1과 적어도 70% 내지 적어도 99%(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 서열 없이 서열번호 2의 AAVhu68 vp3 아미노산 서열(약 aa 203번 내지 736번)을 인코딩하는 핵산 서열 중 하나 이상과 함께 공동 발현될 수 있다. 추가적으로, 또는 대안적으로, vp1-인코딩 및/또는 vp2-인코딩 서열은 vp1-고유 영역(약 aa 1번 내지 약 137번), 또는 이에 상보적인 가닥, 상응하는 mRNA 또는 tRNA(서열번호 1의 nt 412번 내지 2211번), 또는 서열번호 2의 약 aa 138번 내지 736번을 인코딩하는 서열번호 1과 적어도 70% 내지 적어도 99%(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 서열 없이 서열번호 2의 AAVhu68 vp2 아미노산 서열(약 aa 138번 내지 736번)을 인코딩하는 핵산 서열과 함께 공동 발현될 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, rAAVhu68 캡시드는 서열번호 2의 번호매김을 기준으로 하여, 적어도 N57, N66, N94, N113, N252, N253, Q259, N270, N303, N304, N305, N319, N328, N329, N336, N409, N410, N452, N477, N512, N515, N598, Q599, N628, N651, N663, N709 위치 중 하나 이상, 또는 이들의 조합에서 탈아미드화된 vp1, vp2 및/또는 vp3 단백질의 하위집단을 포함하고; (e) rAAVhu68 캡시드는 서열번호 2의 번호매김을 기준으로 하여, N66, N94, N113, N252, N253, Q259, N270, N303, N304, N305, N319, N328, N336, N409, N410, N477, N515, N598, Q599, N628, N651, N663, N709 위치 중 하나 이상, 또는 이들의 조합에서 1% 내지 20% 탈아미드화를 포함하는 vp1, vp2 및/또는 vp3 단백질의 하위집단을 포함하며; (f) rAAVhu68 캡시드는 서열번호 2의 번호매김을 기준으로 하여, vp1 단백질의 57번 위치에서 N의 65% 내지 100%가 탈아미드화된 vp1의 하위집단을 포함하고; (g) rAAVhu68 캡시드는 vp1 단백질의 57번 위치에서 N의 75% 내지 100%가 탈아미드화된 vp1 단백질의 하위집단을 포함하며; (h) rAAVhu68 캡시드는 서열번호 2의 번호매김을 기준으로 하여, 329번 위치에서 N의 80% 내지 100%가 탈아미드화된 vp1 단백질, vp2 단백질, 및/또는 vp3 단백질의 하위집단을 포함하고; (i) rAAVhu68 캡시드는 서열번호 2의 번호매김을 기준으로 하여, 452번 위치에서 N의 80% 내지 100%가 탈아미드화된 vp1 단백질, vp2 단백질, 및/또는 vp3 단백질의 하위집단을 포함하며; (j) rAAVhu68 캡시드는 서열번호 2의 번호매김을 기준으로 하여, 512번 위치에서 N의 80% 내지 100%가 탈아미드화된 vp1 단백질, vp2 단백질, 및/또는 vp3 단백질의 하위집단을 포함하고; (k) rAAV는 약 1 vp1 대 약 1 내지 1.5 vp2 대 3 내지 10 vp3 단백질의 비율로 약 60개의 총 캡시드 단백질을 포함하며; (l) rAAV는 약 1 vp1 대 약 1 vp2 대 3 내지 9 vp3 단백질의 비율로 약 60개의 총 캡시드 단백질을 포함한다.
특정 실시형태에서, AAVhu68은 탈아미드화를 감소시키기 위해 아스파라긴-글리신 쌍에서 글리신을 변화시키도록 변형된다. 다른 실시형태에서, 아스파라긴은 상이한 아미노산, 예를 들어 더 느린 속도로 탈아미드화되는 글루타민; 또는 아미드기가 없는 아미노산(예를 들어, 글루타민 및 아스파라긴은 아미드기를 포함함); 및/또는 아민기가 없는 아미노산(예를 들어, 리신, 아르기닌 및 히스티딘은 아미드기를 포함함)으로 변경된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 아미드 또는 아민 측기가 없는 아미노산은, 예를 들어 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 세린, 트레오닌, 시스틴, 페닐알라닌, 타이로신, 또는 트립토판, 및/또는 프롤린을 지칭한다. 기재된 바와 같은 변형은 인코딩된 AAVhu68 아미노산 서열에서 발견되는 아스파라긴-글리신 쌍 중 1, 2, 또는 3개에 있을 수 있다. 특정 실시형태에서, 이와 같은 변형은 4개의 아스파라긴-글리신 쌍 모두에서 이루어지지 않는다. 따라서, 더 낮은 탈아미드화율을 가지는 rAAVhu68 및/또는 조작된 rAAVhu68 변이체의 탈아미드화를 감소시키는 방법이 제공된다. 추가적으로, 하나 이상의 다른 아미드 아미노산은 비-아미드 아미노산으로 변화되어 rAAVhu68의 탈아미드화를 감소시킬 수 있다.
이러한 아미노산 변형은 통상적인 유전자 공학 기법에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 서열번호 2의 58, 330, 453 및/또는 513번 위치(아스파라긴-글리신 쌍)에서 글리신을 인코딩하는 코돈 중 1 내지 3개가 글리신 이외의 아미노산을 인코딩하도록 변형된, 변형된 AAVhu68 vp 코돈을 포함하는 핵산 서열이 생성될 수 있다. 특정 실시형태에서, 변형된 아스파라긴 코돈을 포함하는 핵산 서열은 서열번호 2의 57, 329, 452 및/또는 512번 위치에 위치한 아스파라긴-글리신 쌍 중 1 내지 3개에서 조작되어, 변형된 코돈은 아스파라긴 이외의 아미노산을 인코딩할 수 있게 된다. 각각의 변형된 코돈은 상이한 아미노산을 인코딩할 수 있다. 대안적으로, 변경된 코돈 중 하나 이상은 동일한 아미노산을 인코딩할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이들 변형된 AAVhu68 핵산 서열은 천연 hu68 캡시드보다 탈아미드화가 더 낮은 캡시드를 가지는 돌연변이 rAAVhu68을 생성하는 데 사용될 수 있다. 이와 같은 돌연변이 rAAVhu68은 감소된 면역원성을 가질 수 있고/있거나 저장, 특히 현탁액 형태로의 저장시 안정성을 증가시킬 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "코돈"은 아미노산을 인코딩하는 서열에서 3개의 뉴클레오타이드를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "인코딩된 아미노산 서열"은 아미노산으로 번역되는 참조된 핵산 서열의 알려진 DNA 코돈의 번역에 기초하여 예측되는 아미노산을 지칭한다. 하기 표는 단일 문자 코드(SLC)와 3문자 코드(3LC)를 둘 다 나타내는 DNA 코돈 및 20개의 일반적인 아미노산을 예시한다.
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rAAVhu68 캡시드는 특정 실시형태에서 유용할 수 있다. 예를 들어, 이와 같은 캡시드는 단클론성 항체를 생성하고/하거나 유전자 요법 환자에서 AAVhu68 농도 수준을 모니터링하기 위한 분석에 유용한 시약을 생성하는 데 사용될 수 있다. 유용한 항-AAVhu68 항체를 생성하기 위한 기법, 이와 같은 항체 또는 빈 캡시드를 표지하는 기법, 및 적합한 분석 형식은 당업자에게 알려져 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형(예를 들어, 탈아미드화된 아미노산)이 있는 서열번호 2의 vp1 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 1의 핵산 서열 또는 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%인 서열이 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, vp1 아미노산 서열은 서열번호 2로 재현된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, AAV 그룹과 관련된 용어 "클레드"는 AAV vp1 아미노산 서열의 정렬을 기반으로 하여, (적어도 1000개의 복제물의) 적어도 75%의 부트스트랩값 및 0.05 이하의 포아송 보정 거리(Poisson correction distance) 측정에 의해 이웃-연결 알고리즘(Neighbor-Joining algorithm)을 사용하여 결정될 때 계통발생적으로 서로 관련된 AAV 그룹을 지칭한다. 이웃-연결 알고리즘은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[M. Nei and S. Kumar, Molecular Evolution and Phylogenetics (Oxford University Press, New York (2000)]을 참조한다. 이러한 알고리즘을 시행하기 위해 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램이 이용 가능하다. 예를 들어, MEGA v2.1 프로그램은 변형된 Nei-Gojobori 방법을 시행한다. 이러한 기법과 컴퓨터 프로그램, 및 AAV vp1 캡시드 단백질의 서열을 사용하여, 당업자는 선택된 AAV가 본 명세서에서 확인된 클레드 중 하나에 포함되는지, 다른 클레드에 포함되는지, 또는 이들 클레드 외부에 있는지 여부를 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 문헌[G Gao, et al, J Virol, 2004 Jun; 78(10: 6381-6388]을 참조하며, 이는 클레드 A, B, C, D, E 및 F, GenBank 수탁 번호 AY530553 내지 AY530629를 확인한다. 또한, WO 2005/033321호를 참조한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "AAV9 캡시드"는 다수의 AAV9 vp 단백질로 구성된 자가-조립된 AAV 캡시드이다. AAV9 vp 단백질은 전형적으로 서열번호 4(GenBank 수탁: AAS99264)의 vp1 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 3의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 대안적인 스플라이스 변이체로 발현된다. 이들 스플라이스 변이체는 서열번호 4의 길이가 상이한 단백질을 생성한다. 특정 실시형태에서, "AAV9 캡시드"는 AAS99264와 99% 동일하거나 서열번호 4와 99% 동일한 아미노산 서열을 가지는 AAV를 포함한다. 또한 US 제7906111호 및 WO 제2005/033321호를 참조한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "AAV9 변이체"는, 예를 들어 WO2016/049230호, US 제8,927,514호, US 제2015/0344911호, 및 US 제8,734,809호에 기재된 것을 포함한다.
캡시드를 생성하는 방법, 이에 대한 코딩 서열, 및 rAAV 바이러스 벡터의 생성 방법이 기재된 바 있다. 예를 들어, 문헌[Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6081-6086 (2003)] 및 US 제2013/0045186A1호를 참조한다.
핵산, 또는 이의 단편을 지칭할 때 용어 "실질적 상동성" 또는 "실질적 유사성"은 적절한 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실을 가지고 또 다른 핵산(또는 이의 상보적 가닥)과 최적으로 정렬될 때, 정렬된 서열의 적어도 약 95% 내지 99%의 뉴클레오타이드 서열 동일성이 있음을 나타낸다. 바람직하게, 상동성은 전장 서열, 또는 이의 오픈 리딩 프레임, 또는 길이가 적어도 15개 뉴클레오타이드인 또 다른 적합한 단편에 걸쳐 있다. 적합한 단편의 예는 본 명세서에 기재되어 있다.
핵산 서열과 관련하여 용어 "서열 동일성", "서열 동일성 백분율" 또는 "동일성 백분율"은 최대 일치성을 위해 정렬될 때 동일한 2개 서열 내의 잔기를 지칭한다. 서열 동일성 비교 길이는 게놈의 전장에 걸쳐 있을 수 있거나, 유전자 코딩 서열의 전장, 또는 적어도 약 500 내지 5000개 뉴클레오타이드의 단편이 바람직하다. 그러나, 더 작은 단편 사이의 동일성, 예를 들어 적어도 약 9개 뉴클레오타이드, 보통 적어도 약 20 내지 24개 뉴클레오타이드, 적어도 약 28 내지 32개 뉴클레오타이드, 적어도 약 36개 이상의 뉴클레오타이드의 동일성이 또한 바람직할 수 있다. 유사하게, "서열 동일성 백분율"은, 단백질 또는 이의 단편의 전장에 걸쳐 아미노산 서열에 대해 용이하게 결정될 수 있다. 적합하게는, 단편은 길이가 적어도 약 8개의 아미노산이고, 최대 약 700개 아미노산일 수 있다. 적합한 단편의 예는 본 명세서에 기재되어 있다.
아미노산 또는 이의 단편을 지칭할 때 용어 "실질적 상동성" 또는 "실질적 유사성"은 적절한 아미노산 삽입 또는 결실을 가지고 또 다른 아미노산(또는 이의 상보적 가닥)과 최적으로 정렬될 때, 정렬된 서열의 적어도 약 95 내지 99%의 아미노산 서열 동일성이 있음을 나타낸다. 바람직하게, 상동성은 전장 서열, 또는 이의 단백질, 예를 들어 cap 단백질, rep 단백질, 또는 길이가 적어도 8개 아미노산, 또는 더 바람직하게는 적어도 15개 아미노산인 단편에 걸쳐 있다. 적합한 단편의 예는 본 명세서에 기재되어 있다.
용어 "고도로 보존된"은 적어도 80% 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 더 바람직하게는 97% 초과의 동일성을 의미한다. 동일성은 당업자에게 알려진 알고리즘 및 컴퓨터 프로그램을 의존함으로써 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
일반적으로, 2개의 상이한 아데노-연관 바이러스 사이의 "동일성", "상동성", 또는 "유사성"을 지칭할 때, "동일성", "상동성", 또는 "유사성"은 "정렬된" 서열에 관하여 결정된다. "정렬된" 서열 또는 "정렬"은, 종종 참조 서열과 비교하여 누락되거나 추가적인 염기 또는 아미노산에 대한 보정을 포함하는, 다수의 핵산 서열 또는 단백질(아미노산) 서열을 지칭한다. 예에서, AAV 정렬은 참조점으로서 공개된 AAV9 서열을 사용하여 수행된다. 정렬은 공개적으로 또는 상업적으로 이용 가능한 다양한 다중 서열 정렬 프로그램(Multiple Sequence Alignment Programs) 중 임의의 것을 사용하여 수행된다. 이와 같은 프로그램의 예는 "Clustal Omega", "Clustal W", "CAP Sequence Assembly", "MAP", 및 "MEME"를 포함하며, 이들은 인터넷 웹 서버를 통해 접근 가능하다. 이와 같은 프로그램에 대한 다른 공급원은 당업자에게 알려져 있다. 대안적으로, Vector NTI 유틸리티가 또한 사용된다. 또한, 상기 기재된 프로그램에 포함된 것을 포함하여, 뉴클레오타이드 서열 동일성을 측정하는 데 사용될 수 있는 당업계에 알려진 다수의 알고리즘이 있다. 또 다른 예에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 GCG 버전 6.1의 프로그램인 Fasta™를 사용하여 비교될 수 있다. Fasta™는 질의 서열과 검색 서열 사이의 최적의 중첩 영역의 정렬 및 서열 동일성 백분율을 제공한다. 예를 들어, 핵산 서열 사이의 서열 동일성 백분율은 본 명세서에 참조에 의해 원용된 GCG 버전 6.1에서 제공되는 바와 같은 디폴트 매개변수(단어 크기 6, 스코어링 매트릭스에 대한 NOPAM 인자)와 함께 Fasta™를 사용하여 결정될 수 있다. 다중 서열 정렬 프로그램, 예를 들어 "Clustal Omega", "Clustal X", "MAP", "PIMA", "MSA", "BLOCKMAKER", "MEME", 및 "Match-Box" 프로그램은 또한 아미노산 서열에 대해 이용 가능하다. 일반적으로 이들 프로그램 중 임의의 것은 디폴트 설정으로 사용되지만, 당업자는 필요에 따라 이러한 설정을 변경할 수 있다. 대안적으로, 당업자는 적어도 참조 알고리즘 및 프로그램에 의해 제공되는 바와 같은 동일성 또는 정렬 수준을 제공하는 또 다른 알고리즘 또는 컴퓨터를 이용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., "A comprehensive comparison of multiple sequence alignments", 27(13):2682-2690 (1999).]을 참조한다.
rAAV 벡터
상기 나타낸 바와 같이, AAVhu68 서열 및 단백질은 rAAV의 생성에 유용하고, 또한 안티센스 전달 벡터, 유전자 요법 벡터, 또는 백신 벡터일 수 있는 재조합 AAV 벡터에 유용하다. 추가적으로, 본 명세서에 기재된 조작된 AAV 캡시드, 예를 들어 서열번호 2의 vp1 캡시드 단백질의 번호매김에 대해 67번, 157번, 또는 둘 다의 위치에서 돌연변이 아미노산을 가지는 것이 표적 세포 및 조직에 적합한 다수의 핵산 분자의 전달을 위한 rAAV 벡터를 조작하는 데 사용될 수 있다.
AAV 캡시드로 패키징되고 숙주 세포에 전달되는 게놈 서열은 전형적으로 최소한 이식유전자 및 이의 조절 서열, 및 AAV 반전 말단 반복부(ITR)로 구성된다. 단일-가닥 AAV 및 자가-상보성(sc) AAV 둘 다 rAAV에 포함된다. 이식유전자는 관심이 있는 폴리펩타이드, 단백질, 기능성 RNA 분자(예를 들어, miRNA, miRNA 저해제) 또는 다른 유전자 산물을 인코딩하는, 벡터 서열에 이종성인 핵산 코딩 서열이다.
구체적으로, 본 개시내용은 인간 갈락토실세라미다제(GALC)의 코딩 서열을 포함하는 rAAV를 제공한다. 일부 실시형태에서, 코딩 서열은 조작된 GALC 코딩 서열이다. 일부 실시형태에서, 코딩 서열은 서열번호 9의 cGALC 유전자(cGALCco)의 서열이다.
핵산 코딩 서열은 표적 조직의 세포에서 이식유전자의 전사, 번역, 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 조절 구성요소에 작동적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 조절 서열은 베타-액틴 프로모터, 인트론, 및 토끼 글로빈 폴리A를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조절 서열은 서열번호 13을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조절 서열은 서열번호 15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조절 서열은 서열번호 16을 포함한다.
벡터의 AAV 서열은 전형적으로 시스-작용 5' 및 3' 반전 말단 반복부 서열을 포함한다(예를 들어, 문헌[B. J. Carter, in "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990)] 참조). ITR 서열은 길이가 약 145 bp이다. 바람직하게는, 실질적으로 ITR을 인코딩하는 전체 서열이 분자에 사용되지만, 이들 서열의 약간의 사소한 변형은 허용 가능하다. 이들 ITR 서열을 변형시키는 능력은 당업계의 기술 범위 내에 있다. (예를 들어, 문헌[Sambrook et al, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); 및 K. Fisher et al., J. Virol., 70:520 532 (1996)]과 같은 텍스트 참조). 본 발명에 이용되는 이와 같은 분자의 예는, 선택된 이식유전자 서열 및 연관된 조절 요소에 5' 및 3' AAV ITR 서열이 측접한, 이식유전자를 포함하는 "시스-작용" 플라스미드이다. 일 실시형태에서, ITR은 캡시드를 공급하는 것과 상이한 AAV로부터 유래된다. 일 실시형태에서, ITR 서열은 AAV2로부터 유래된다. D-서열과 말단 분해 분위(terminal resolution site; trs)가 결실된, △ITR로 칭해지는 5' ITR의 단축 형태가 설명된 바 있다. 다른 실시형태에서, 전장 AAV 5' 및 3' ITR이 사용된다. 그러나, 다른 AAV 공급원 유래의 ITR이 선택될 수 있다. ITR의 공급원이 AAV2로부터 유래되고 AAV 캡시드가 또 다른 AAV 공급원으로부터 유래되는 경우, 생성된 벡터는 위형화된 것으로 칭해질 수 있다. 그러나, 이들 요소의 다른 구성이 적합할 수 있다.
재조합 AAV 벡터에 대해 상기에서 확인된 주요 요소에 추가적으로, 벡터는 또한 플라스미드 벡터로 형질감염되거나 본 발명에 의해 생성된 바이러스로 감염된 세포에서 이식유전자의 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 이식유전자에 작동 가능하게 연결된 필요한 통상적인 제어 요소를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "작동 가능하게 연결된" 서열은 관심이 있는 유전자와 인접한 발현 제어 서열 및 관심이 있는 유전자를 제어하기 위해 트랜스로 또는 떨어져서 작용하는 발현 제어 서열을 둘 다 포함한다.
조절 제어 요소는 전형적으로, 예를 들어 선택된 5' ITR 서열과 코딩 서열 사이에 위치한, 발현 제어 서열의 일부로서 프로모터 서열을 포함한다. 구성적 프로모터, 조절 가능한 프로모터[예를 들어, WO 2011/126808호 및 WO 2013/04943호 참조], 조직 특이적 프로모터, 또는 생리적 신호에 반응하는 프로모터가 본 명세서에 기재된 벡터에 사용될 수 있다. 프로모터(들)는 상이한 공급원, 예를 들어 인간 거대세포 바이러스(CMV) 급초기 인핸서/프로모터, SV40 초기 인핸서/프로모터, JC 폴리모바이러스 프로모터, 수초 염기성 단백질(MBP) 또는 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP) 프로모터, 단순 포진 바이러스(HSV-1) 잠복 연관 프로모터(LAP), 라우스 육종 바이러스(RSV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 뉴런-특이적 프로모터(NSE), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 프로모터, hSYN, 멜라닌 응집 호르몬(MCH) 프로모터, CBA, 기질 금속단백질 프로모터(MPP), 및 닭 베타-액틴 프로모터로부터 선택될 수 있다. 프로모터에 추가적으로, 벡터는 하나 이상의 다른 적절한 전사 개시, 종결, 인핸서 서열, 스플라이싱 및 폴리아데닐화(폴리A) 신호와 같은 효율적인 RNA 가공 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열, 예를 들어 WPRE; 전사 효율을 향상시키는 서열(즉, 코작(Kozak) 공통 서열); 단백질 안정화를 향상시키는 서열; 및 원하는 경우, 인코딩된 산물의 분비를 향상시키는 서열을 포함할 수 있다. 적합한 인핸서의 예는 CMV 인핸서이다. 다른 적합한 인핸서는 원하는 표적 조직 적응증에 적절한 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 발현 카세트는 하나 이상의 발현 인핸서를 포함한다. 일 실시형태에서, 발현 카세트는 2개 이상의 발현 인핸서를 포함한다. 이들 인핸서는 동일할 수 있거나 서로 상이할 수 있다. 예를 들어, 인핸서는 CMV 급초기 인핸서를 포함할 수 있다. 이러한 인핸서는 서로 인접하여 위치하는 2개의 복사체로 존재할 수 있다. 대안적으로, 인핸서의 이중 복사체는 하나 이상의 서열에 의해 분리될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 발현 카세트는 인트론, 예를 들어 닭 베타-액틴 인트론을 추가로 포함한다. 다른 적합한 인트론은, 예를 들어 WO 2011/126808호에 기재된 것과 같은 당업계에 알려진 것을 포함한다. 적합한 폴리A 서열의 예는, 예를 들어 SV40, SV50, 소 성장 호르몬(bGH), 인간 성장 호르몬, 및 합성 폴리A를 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 서열이 mRNA를 안정화시키는 데 선택될 수 있다. 이와 같은 서열의 예는, 폴리A 서열의 상류 및 코딩 서열의 하류에서 조작될 수 있는 변형된 WPRE 서열이다[예를 들어, 문헌[MA Zanta-Boussif, et al, Gene Therapy (2009) 16: 605-619] 참조].
이러한 rAAV는 보호 면역 유도를 포함하여, 치료 목적 및 면역화를 위한 유전자 전달에 특히 매우 적합하다. 또한, 본 발명의 조성물은 또한 시험관내에서 원하는 유전자 산물의 생성에 사용될 수 있다. 시험관내 생성을 위해, 원하는 산물(예를 들어, 단백질)은 원하는 산물을 인코딩하는 분자를 포함하는 rAAV로 숙주 세포를 형질감염시키고 발현을 허용하는 조건 하에서 세포 배양물을 배양한 후 원하는 배양물로부터 얻을 수 있다. 그 다음 발현된 산물을 원하는 대로 정제하고 단리할 수 있다. 형질감염, 세포 배양, 정제, 및 단리에 적합한 기법은 당업자에게 알려져 있다.
rAAV 벡터 생성
AAV 바이러스 벡터(예를 들어, 재조합(r) AAV)를 생성하는 데 사용하기 위해, 발현 카세트는 패키징 숙주 세포로 전달되는 임의의 적합한 벡터, 예를 들어 플라스미드로 운반될 수 있다. 본 발명에 유용한 플라스미드는 특히 원핵 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포에서 시험관내 복제 및 패키징에 적합하도록 조작될 수 있다. 적합한 형질감염 기법 및 패키징 숙주 세포는 알려져 있고/있거나 당업자에 의해 용이하게 설계될 수 있다.
벡터로서 사용하기에 적합한 AAV를 생성하고 단리하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 일반적으로, 예를 들어 문헌[Grieger & Samulski, 2005, "Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production and clinical applications," Adv . Biochem . Engin / Biotechnol . 99: 119-145; Buning et al., 2008, "Recent developments in adeno-associated virus vector technology," J. Gene Med . 10:717-733]; 및 하기 인용된 참조문헌을 참조하며, 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다. 유전자를 비리온으로 패키징하기 위해, ITR은 발현 카세트(들)를 포함하는 핵산 분자와 동일한 작제물에서 시스로 필요한 유일한 AAV 구성성분이다. cap 및 rep 유전자는 트랜스로 공급될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 발현 카세트는 바이러스 벡터를 생성하기 위한 패키징 숙주 세포로 운반되는 면역글로불린 작제물 서열을 이송시키는 유전 요소(예를 들어, 셔플 플라스미드)로 조작된다. 일 실시형태에서, 선택된 유전 요소는 형질감염, 전기천공, 리포솜 전달, 막 융합 기법, 고속 DNA-코팅 펠릿, 바이러스 감염 및 원형질체 융합을 포함하여, 임의의 적합한 방법에 의해 AAV 패키징 세포로 전달될 수 있다. 안정적인 AAV 패키징 세포가 또한 제조될 수 있다. 대안적으로, 발현 카세트는 AAV 이외의 바이러스 벡터를 생성하는 데, 또는 시험관내에서 항체 혼합물의 생성을 위해 사용될 수 있다. 이와 같은 작제물을 제조하는 데 사용되는 방법은 핵산 조작의 숙련가에게 알려져 있으며, 유전자 조작, 재조합 조작, 및 합성 기법을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ed. Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012)]을 참조한다.
용어 "AAV 중간체" 또는 "AAV 벡터 중간체"는 내부에 패키징된 원하는 게놈 서열이 결여된 조립된 rAAV 캡시드를 지칭한다. 이들은 또한 "빈" 캡시드로 칭해질 수 있다. 이와 같은 캡시드는 발현 카세트의 검출 가능한 게놈 서열을 포함하지 않거나, 유전자 산물의 발현을 달성하기에 불충분한 단지 부분적으로 패키징된 게놈 서열만을 포함할 수 있다. 이들 빈 캡시드에는 관심이 있는 유전자를 숙주 세포로 이송시키는 기능이 없다.
본 명세서에 기재된 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV)는 알려진 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, WO 2003/042397호; WO 2005/033321호, WO 2006/110689호; US 7588772 B2호를 참조한다. 이와 같은 방법은 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산 서열; 기능성 rep 유전자; 최소한 AAV 반전 말단 반복부(ITR) 및 이식유전자로 구성되는 발현 카세트; 및 AAV 캡시드 단백질로 발현 카세트의 패키징을 허용하기에 충분한 헬퍼 기능을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 캡시드를 생성하는 방법, 이에 대한 코딩 서열, 및 rAAV 바이러스 벡터의 생성 방법은, 예를 들어 문헌[Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6081-6086 (2003)] 및 US 제2013/0045186A1호를 참조한다.
일 실시형태에서, 재조합 rAAVhu68을 생성하는 데 유용한 생산 세포 배양물이 제공된다. 이와 같은 세포 배양물은 숙주 세포에서 rAAVhu68 캡시드 단백질을 발현하는 핵산; rAAVhu68 캡시드로 패키징하기에 적합한 핵산 분자, 예를 들어 숙주 세포에서 생성물의 발현을 지시하는 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자 산물을 인코딩하는 비-AAV 핵산 서열 및 AAV ITR을 포함하는 벡터 게놈; 및 재조합 rAAVhu68 캡시드로 핵산 분자의 패키징을 허용하는 충분한 AAV rep 기능 및 아데노바이러스 헬퍼 기능을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양물은 포유동물 세포(예를 들어, 특히 인간 배아 신장 293 세포) 또는 곤충 세포(예를 들어, 바큘로바이러스)로 구성된다.
적합하게, rep 기능은 벡터 게놈에 존재하는 ITR과 동일한 공급원, 또는 벡터 게놈을 AAV 캡시드로 패키징하는 또 다른 공급원(예를 들어, AAVhu68) 유래의 AAV에 의해 제공된다. 특정 실시형태에서, rep 단백질은 AAV2 유래이다. 그러나, 다른 실시형태에서 또 다른 실시형태에서, rep 단백질은 AAVhu68rep 이외의 이종 rep 단백질이지만, 예를 들어 AAV1 rep 단백질, AAV2 rep 단백질, AAV3 rep 단백질, AAV4 rep 단백질, AAV5 rep 단백질, AAV6 rep 단백질, AAV7 rep 단백질, AAV8 rep 단백질; 또는 rep 78, rep 68, rep 52, rep 40, rep68/78 및 rep40/52; 또는 이들의 단편; 또는 또 다른 공급원이지만, 이들로 제한되지 않는다. 이들 AAVhu68 또는 돌연변이 AAV 캡시드 서열 중 임의의 것은 생성 세포에서 이들 서열의 발현을 지시하는 외인성 조절 제어 서열의 제어 하에 있을 수 있다.
일 실시형태에서, 세포는 적합한 세포 배양물(예를 들어, HEK 293) 세포에서 제조된다. 본 명세서에 기재된 유전자 요법 벡터를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려진 방법, 예컨대, 유전자 요법 벡터의 생성에 사용되는 플라스미드 DNA의 생성, 벡터의 생성, 및 벡터의 정제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자 요법 벡터는 AAV 벡터이고 생성된 플라스미드는 AAV 게놈 및 관심이 있는 유전자를 인코딩하는 AAV 시스-플라스미드, AAV rep 및 cap 유전자를 포함하는 AAV 트랜스-플라스미드, 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드이다. 벡터 생성 과정은, 세포 배양의 개시, 세포 계대, 세포 접종, 플라스미드 DNA로 세포의 형질감염, 무혈청 배지로의 형질감염후 배지 교환, 및 벡터-포함 세포 및 배양 배지의 수확과 같은 방법 단계를 포함할 수 있다. 수확된 벡터-포함 세포 및 배양 배지는 본 명세서에서 조(crude) 세포 수확물로 지칭된다. 또 다른 시스템에서, 유전자 요법 벡터는 바큘로바이러스-기반 벡터를 이용하는 감염에 의해 곤충 세포로 도입된다. 이러한 생성 시스템에 대한 검토를 위해, 일반적으로 예를 들어 문헌[Zhang et al., 2009, "Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production," Human Gene Therapy 20:922-929]을 참조하며, 이의 각각의 내용은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다. 이들 및 다른 AAV 생성 시스템을 제조하고 사용하는 방법은 또한 다음 미국 특허에 기재되어 있으며, 이들 각각의 내용은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다: 제5,139,941호; 제5,741,683호; 제6,057,152호; 제6,204,059호; 제6,268,213호; 제6,491,907호; 제6,660,514호; 제6,951,753호; 제7,094,604호; 제7,172,893호; 제7,201,898호; 제7,229,823호; 및 제7,439,065호.
특정 실시형태에서, rAAV.hGALC에 대한 제조 공정은 플라스미드 DNA를 이용한 HEK293 세포의 일시적 형질감염을 포함한다. 단일 배치 또는 다중 배치는 PALL iCELLis 바이오리액터에서 HEK293 세포의 PEI-매개 삼중 형질감염에 의해 생성된다. 수확된 AAV 물질은 가능한 경우 일회용 폐쇄 바이오프로세싱 시스템에서 정화, TFF, 친화성 크로마토그래피, 및 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 순차적으로 정제된다.
조 세포 수확물은 이후에 방법 단계, 예컨대, 벡터 수확물의 농축, 벡터 수확물의 정용여과, 벡터 수확물의 미세유동화, 벡터 수확물의 뉴클레아제 분해, 미세유동화 중간체의 여과, 크로마토그래피에 의한 조 정제, 초원심분리에 의한 초 정제, 접선 흐름 여과에 의한 완충액 교환, 및/또는 벌크 벡터를 제조하기 위한 제형화 및 여과를 거칠 수 있다.
높은 염 농도에서 2 단계의 친화성 크로마토그래피 정제 후 음이온 교환 수지 크로마토그래피를 사용하여 벡터 의약품을 정제하고 빈 캡시드를 제거한다. 이러한 방법은 명칭이 "Scalable Purification Method for AAV9"인 2016년 12월 9일자로 출원된 국제 특허출원 PCT/US2016/065970호, 및 이의 우선권 문서인 2016년 4월 13일자로 출원된 US 특허 출원 제62/322,071호 및 2015년 12월 11일자로 출원된 US 특허 출원 제62/226,357호에 보다 상세하게 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 2016년 12월 9일자로 출원된 국제 특허출원 PCT/US2016/065976호, 및 이의 우선권 문서인 2016년 4월 13일자로 출원된 US 특허 출원 제62/322,098호 및 2015년 12월 11일자로 출원된 US 특허 출원 제62/266,341호의 AAV8에 대한 정제 방법, 명칭이 "Scalable Purification Method for AAVrh10"인 2016년 12월 9일자로 출원된 국제 특허출원 PCT/US16/66013호, 및 이의 우선권 문서인 2016년 4월 13일자로 출원된 US 특허 출원 제62/322,055호 및 또한 명칭이 "Scalable Purification Method for AAV1"인 2015년 12월 11일자로 출원된 US 특허출원 제62/266,347의 rh10에 대한 정제 방법, 및 명칭이 "Scalable Purification Method for AAV1"인 2016년 12월 9일자로 출원된 국제 특허출원 PCT/US2016/065974호, 및 이의 우선권 문서인 2016년 4월 13일자로 출원된 US 특허 출원 제62/322,083호 및 2015년 12월 11일자로 출원된 US 특허 출원 제62/26,351호의 AAV1에 대한 정제 방법은 모두 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
빈 입자 및 전(full) 입자 함량을 계산하기 위해, 선택된 샘플(예를 들어, 본 명세서의 예에서 이오딕사놀 구배-정제된 제제, 여기서 GC의 # = 입자의 #)에 대한 VP3 밴드 부피를 로딩된 GC 입자에 대해 플롯팅한다. 생성된 선형 방정식(y = mx+c)을 사용하여 테스트 물질 피크의 밴드 부피에에서 입자 수를 계산한다. 그 다음 로딩된 20㎕당 입자의 수(pt)에 50을 곱하여 입자(pt)/㎖를 제공한다. pt/㎖를 GC/㎖로 나눈 값은 게놈 복제물에 대한 입자의 비율(pt/GC)을 제공한다. pt/㎖-GC/㎖는 빈 pt/㎖를 제공한다. 빈 pt/㎖를 pt/㎖로 나누고 100을 곱하여 빈 입자의 백분율을 제공한다.
일반적으로, 패키징된 게놈이 있는 AAV 벡터 입자 및 빈 캡시드를 분석하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Grimm et al., Gene Therapy (1999) 6:1322-1330; Sommer et al., Molec. Ther. (2003) 7:122-128]을 참조한다. 변성된 캡시드를 테스트하기 위해, 방법은 처리된 AAV 스톡을, 3가지 캡시드 단백질을 분리할 수 있는 임의의 겔, 예를 들어 완충액에 3 내지 8% Tris-아세테이트를 포함하는 구배 겔로 이루어진 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 적용하는 단계, 그 다음 샘플 물질이 분리될 때까지 겔을 실행하는 단계, 및 겔을 나일론 또는 나이트로셀룰로스 막, 바람직하게는 나일론에 블롯팅하는 단계를 포함한다. 그 다음, 항-AAV 캡시드 항체를 변성 캡시드 단백질에 결합하는 일차 항체, 바람직하게는 항-AAV 캡시드 단클론성 항체, 가장 바람직하게는 B1 항-AAV-2 단클론성 항체로서 사용된다(Wobus et al., J. Virol. (2000) 74:9281-9293). 그 다음, 1차 항체에 결합하고, 1차 항체, 보다 바람직하게는 이에 공유 결합된 검출 분자를 포함하는 항-IgG 항체, 가장 바람직하게는 호스래디쉬 퍼옥시다제에 공유 결합된 양 항-마우스 IgG 항체와의 결합을 검출하기 위한 수단을 포함하는 2차 항체를 사용한다. 결합을 검출하기 위한 방법은 1차 및 2차 항체 사이의 결합을 반-정량적으로 결정하는 데 사용되며, 바람직하게는 방사성 동위원소 방출, 전자기 방사, 또는 비색 변화를 검출할 수 있는 검출 방법, 가장 바람직하게는 화학발광 검출 키트가 사용된다. 예를 들어, SDS-PAGE의 경우, 컬럼 분획으로부터의 샘플을 취하고 환원제(예를 들어, DTT)를 포함하는 SDS-PAGE 로딩 완충액에서 가열될 수 있고, 캡시드 단백질은 미리 주조된 구배 폴리아크릴아마이드 겔(예를 들어, Novex) 상에서 분해되었다. 은 염색은 제조업체의 지침에 따라 SilverXpress(Invitrogen, CA)를 사용하거나 다른 적합한 염색 방법, 즉, SYPRO 루비 또는 쿠마시 염색을 사용하여 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, 컬럼 분획 중 AAV 벡터 게놈(vg)의 농도는 정량적 실시간 PCR(Q-PCR)에 의해 측정될 수 있다. 샘플을 희석하고 DNase I(또는 또 다른 적합한 뉴클레아제)로 분해하여 외인성 DNA를 제거한다. 뉴클레아제의 비활성화 후, 샘플을 추가로 희석하고 프라이머 및 프라이머 사이의 DNA 서열에 특이적인 TaqMan™ 형광 프로브를 사용하여 증폭시킨다. 정의된 형광 수준(역치 주기, Ct)에 도달하는 데 필요한 주기 수를 Applied Biosystems Prism 7700 Sequence Detection System에서 각 샘플에 대해 측정한다. AAV 벡터에 포함된 것과 동일한 서열을 포함하는 플라스미드 DNA를 이용하여 Q-PCR 반응에서 표준 곡선을 생성한다. 샘플로부터 얻은 주기 임계(Ct) 값을 사용하여 이를 플라스미드 표준 곡선의 Ct 값으로 정규화함으로써 벡터 게놈 역가를 결정한다. 디지털 PCR에 기반한 종말점 분석도 또한 사용될 수 있다.
일 양태에서, 광역 세린 프로테아제, 예를 들어 프로테이나제 K(예컨대, Qiagen으로부터 상업적으로 입수 가능한 것)를 이용하는 최적화된 q-PCR 방법이 사용된다. 보다 특히, 최적화된 qPCR 게놈 역가 분석은, DNase I 분해 후 샘플을 프로테이나제 K로 희석하고 프로테이나제 K로 처리한 다음 열 불활성화시킨다는 점을 제외하고, 표준 분석과 유사하다. 적합하게는 샘플은 샘플 크기와 동일한 양의 프로테이나제 K 완충액으로 희석된다. 프로테이나제 K 완충액은 2배 이상으로 농축될 수 있다. 전형적으로, 프로테아나제 K 처리는 약 0.2 ㎎/㎖이지만, 0.1 ㎎/㎖ 내지 약 1 ㎎/㎖로 다양할 수 있다. 처리 단계는 일반적으로 약 55℃에서 약 15분 동안 수행되지만, 더 낮은 온도(예를 들어, 약 37℃ 내지 약 50℃)에서 더 긴 기간(예를 들어, 약 20분 내지 약 30분)에 걸쳐, 또는 더 높은 온도(예를 들어, 최대 약 60℃)에서 더 짧은 기간(예를 들어, 약 5 내지 10분) 동안 수행될 수 있다. 유사하게, 열 불활성화는 일반적으로 약 95℃에서 약 15분 동안이지만, 온도가 더 낮아지고(예를 들어, 약 70 내지 약 90℃) 시간이 연장될 수 있다(예를 들어, 약 20분 내지 약 30분). 그 다음 샘플을 희석하고(예를 들어, 1000배), 표준 분석에 기재된 바와 같이 TaqMan 분석을 수행한다.
추가적으로, 또는 대안적으로, 액적 디지털 PCR(ddPCR)이 사용될 수 있다. 예를 들어, ddPCR에 의해 단일-가닥 및 자가-상보성 AAV 벡터 게놈 역가를 결정하는 방법이 설명된 바 있다. 예를 들어, 문헌[M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods. 2014 Apr;25(2):115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14]을 참조한다.
요약하면, 게놈-결핍 rAAVhu68 중간체로부터 패키징된 게놈 서열을 가지는 rAAVhu68 입자를 분리하는 방법은 재조합 rAAVhu68 바이러스 입자 및 rAAVhu689 캡시드 중간체를 포함하는 현탁액을 고속 액체 크로마토그래피에 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 rAAVhu68 바이러스 입자 및 rAAVhu68 중간체는 pH 10.2에서 평형화된 강한 음이온 교환 수지에 결합되고, 약 260 및 약 280에서 자외선 흡광도에 대해 용출액을 모니터링하면서 염 구배가 적용된다. rAAV9hu68에 대해 덜 최적이지만, pH는 약 10.0 내지 10.4의 범위일 수 있다. 이 방법에서, AAVhu68 전체 캡시드는 A260/A280 비율이 변곡점에 도달할 때 용출되는 분획으로부터 수집된다. 일 예에서, 친화성 크로마토그래피 단계의 경우, 정용여과된 생성물이 AAV2/hu68 혈청형을 효율적으로 포획하는 Capture SelectTM Poros- AAV2/9 친화성 수지(Life Technologies)에 적용될 수 있다. 이러한 이온 조건 하에서, 상당한 비율의 잔류 세포 DNA 및 단백질이 컬럼을 통해 흐르는 한편, AAV 입자가 효율적으로 포획된다.
조성물 및 용도
적어도 하나의 rAAV.hGALC 스톡(예를 들어, rAAVhu68 스톡 또는 돌연변이 rAAV 스톡) 및 선택적인 담체, 부형제 및/또는 보존제를 포함하는 조성물이 본 명세서에서 제공된다. rAAV 스톡은, 예를 들어 농도 및 투약량 단위의 논의에서 하기 기재된 양과 동일한 복수의 rAAV 벡터를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅제, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약학 활성 성분을 위한 이와 같은 매질 및 작용제의 사용은 당업게에 잘 알려져 있다. 보충 활성 성분이 또한 조성물에 포함될 수 있다. 어구 "약학적으로 허용 가능한"은 숙주에게 투여될 때 알레르기 반응 또는 유사한 부반응을 나타내지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 전달 비히클, 예컨대, 리포솜, 나노캡슐, 마이크로입자, 마이크로스피어, 지질 입자, 소포 등이 본 발명의 조성물을 적합한 숙주 세포로 도입하는 데 사용될 수 있다. 특히, rAAV 벡터로 전달되는 벡터 게놈은 지질 입자, 리포솜, 소포, 나노스피어, 또는 나노입자 등에 캡슐화된 전달을 위해 제형화될 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 대상체에게 전달하기에 적합한 최종 제형을 포함하고, 예를 들어 생리학적으로 양립 가능한 pH 및 염 농도로 완충된 수성 액체 현탁액이다. 선택적으로, 하나 이상의 계면활성제가 제형에 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 대상체에 투여하기 위해 희석되는 농축물로서 수송될 수 있다. 다른 실시형태에서, 조성물은 동결건조되고 투여시 재구성될 수 있다.
적합한 계면활성제, 또는 계면활성제의 조합물이 무독성인 비이온성 계면활성제 중에서 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, 예를 들어 중성 pH를 가지고 평균 분자량이 8400인 Pluronic® F68[BASF](폴록사머(Poloxamer) 188로도 알려짐)과 같은 일차 하이드록실기로 종결되는 이작용성 블록 공중합체 계면활성제가 선택된다. 다른 계면활성제 및 다른 폴록사머, 즉, 폴리옥시에틸렌(폴리(에틸렌 옥사이드))의 2개의 친수성 사슬이 측접한 폴리옥시프로필렌(폴리(프로필렌 옥사이드))으로 구성된 비이온성 삼중블록 공중합체, SOLUTOL HS 15(마크로골-15 하이드록시스테아레이트), LABRASOL(폴리옥시 카프릴릭 글리세라이드), 폴리옥시 10 올레일 에터, TWEEN(폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스터), 에탄올 및 폴리에틸렌 글라이콜이 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, 제형은 폴록사머를 포함한다. 이러한 공중합체는 일반적으로 문자 "P"(폴록사머의 경우)와 그 다음의 세 자리 숫자로 명명되며; 처음 2자리 숫자×100은 폴리옥시프로필렌 코어의 대략적인 분자량을 나타내고, 마지막 숫자×10은 폴리옥시에틸렌 함량 백분율을 나타낸다. 일 실시형태에서, 폴록사머 188이 선택된다. 계면활성제는 현탁액의 최대 약 0.0005% 내지 약 0.001%의 양으로 존재할 수 있다.
벡터는 세포를 형질감염시키고 과도한 부작용 없이, 또는 의학적으로 허용 가능한 생리학적 효과와 함께 치료적 이익을 제공하는 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하기에 충분한 양으로 투여되며, 이는 의학 업계의 당업자에 의해 결정될 수 있다. 통상적이고 약학적으로 허용 가능한 투여 경로는 원하는 기관(예를 들어, 간(선택적으로 간동맥을 통함), 폐, 심장, 눈, 신장)으로의 직접 전달, 경구, 흡입, 비강내, 기관내, 척수강내, 기관내, 동맥내, 안내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 및 다른 비경구 투여 경로를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 원하는 경우 투여 경로는 조합될 수 있다.
바이러스 벡터의 투약량은 주로 치료될 병태, 환자의 연령, 체중 및 건강상태와 같은 요인에 따라 달라지므로, 환자마다 다를 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터의 치료적으로 유효한 인간 투약량은 일반적으로 약 1×109 내지 1×1016개 게놈 바이러스 벡터의 농도를 포함하는 용액의 약 25 내지 약 1000 마이크로리터 내지 약 100 ㎖의 범위이다. 투약량은 임의의 부작용에 대한 치료적 이익의 균형을 맞추기 위해 조정될 것이며 이와 같은 투약량은 재조합 벡터가 이용되는 치료적 적용에 따라 달라질 수 있다. 이식유전자 산물의 발현 수준은 바이러스 벡터, 바람직하게는 꼬마유전자를 포함하는 AAV 벡터를 생성하는 투약 빈도를 결정하기 위해 모니터링될 수 있다. 선택적으로, 치료 목적으로 기재된 것과 유사한 투약 요법이 본 발명의 조성물을 사용한 면역화에 이용될 수 있다.
복제-결함 바이러스 조성물은 (체중이 70 ㎏인 평균 대상체를 치료하기 위해) 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여 약 1.0×109개 GC 내지 1.0×1016개 GC, 바람직하게는 인간 환자에 대하여 1.0×1012개 GC 내지 1.0×1014개 GC의 범위인 복제-결함 바이러스의 양을 포함하는 투약 단위로 제형화될 수 있다. 일 실시형태에서, 조성물은 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여 용량당 적어도 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 또는 9×109개 GC를 포함하도록 제형화된다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여 용량당 적어도 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 또는 9×1010개 GC를 포함하도록 제형화된다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여 용량당 적어도 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 또는 9×1011개 GC를 포함하도록 제형화된다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여 용량당 적어도 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 또는 9×1012개 GC를 포함하도록 제형화된다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여 용량당 적어도 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013, 또는 9×1013개 GC를 포함하도록 제형화된다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여 용량당 적어도 1×1014, 2×1014, 3×1014, 4×1014, 5×1014, 6×1014, 7×1014, 8×1014, 또는 9×1014개 GC를 포함하도록 제형화된다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여 용량당 적어도 1×1015, 2×1015, 3×1015, 4×1015, 5×1015, 6×1015, 7×1015, 8×1015, 또는 9×1015개 GC를 포함하도록 제형화된다. 일 실시형태에서, 인간 적용에 있어서 용량은 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여 용량당 1×1010 내지 약 1×1012개 GC의 범위일 수 있다. 일 실시형태에서, 인간 적용을 위해, 용량은 범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함하여 용량당 1.4×1013 내지 약 4×1014개 GC의 범위일 수 있다.
상기 이들 용량은 치료될 영역의 크기, 사용되는 바이러스 역가, 투여 경로, 및 원하는 방법의 효과에 따라 약 25 내지 약 1000 마이크로리터, 또는 더 높은 부피 범위(범위 내의 모든 숫자를 포함함)의 다양한 부피의 담체, 부형제 또는 완충액 제형으로 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 담체, 부형제 또는 완충액의 부피는 적어도 약 25㎕이다. 일 실시형태에서, 부피는 약 50㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 75㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 100㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 125㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 150㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 175㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 200㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 225㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 250㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 275㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 300㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 325㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 350㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 375㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 400㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 450㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 500㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 550㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 600㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 650㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 700㎕이다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 약 700 내지 1000㎕이다.
rAAV.hGALC의 치료적으로 유효한 척수강내/수조내 용량은 약 1×1011 내지 7.0×1014개 GC(고정 용량)(환자의 뇌 질량 g당 109 내지 5×1010개 GC에 해당함)의 범위이다. 대안적으로, 하기 치료적으로 유효한 고정 용량이 표시된 연령 그룹의 환자에게 투여될 수 있다:
· 신생아: 약 1×1011 내지 약 3×1014개 GC;
· 3 내지 9개월: 약 6×1012 내지 약 3×1014개 GC;
· 9개월 내지 6세: 약 6×1012 내지 약 3×1014개 GC;
· 3 내지 6세: 약 1.2×1013 내지 약 6×1014개 GC;
· 6 내지 12세: 약 1.2×1013 내지 약 6×1014개 GC;
· 12세 이상: 약 1.4×1013 내지 약 7.0×1014개 GC;
· 18세 이상(성인): 약 1.4×1013 내지 약 7.0×1014개 GC.
특정 실시형태에서, 용량은 약 1×109개 GC/뇌 질량 g 내지 약 1×1012개 GC/뇌 질량 g의 범위일 수 있다. 특정 실시형태에서, 용량은 약 3×1010개 GC/뇌 질량 g 내지 약 3×1011개 GC/뇌 질량 g의 범위일 수 있다. 특정 실시형태에서, 용량은 약 5×1010개 GC/뇌 질량 g 내지 약 1.85×1011개 GC/뇌 질량 g의 범위일 수 있다. 유아와 청소년/성인 사이의 크기 조정을 위해, 뇌 질량은 일부 경우에 4 내지 12개월의 경우 약 600g 내지 약 800g; 9개월 내지 18개월의 경우 약 800g 내지 약 1000g, 18개월 내지 3세의 경우 약 1000g 내지 약 1100g; 청소년 또는 성인 인간의 경우 1100g 내지 약 1300g, 또는 성인 인간의 경우 약 1300g인 것으로 추정된다.
일 실시형태에서, 바이러스 작제물은 적어도 약 적어도 1×109개 GC 내지 약 1×1015개, 또는 약 1×1011 내지 5×1013개 GC의 용량으로 전달될 수 있다. 이들 용량 및 농도의 적합한 전달 부피는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 약 1㎕ 내지 150 ㎖의 부피가 선택될 수 있으며, 성인의 경우 더 많은 부피가 선택될 수 있다. 전형적으로, 신생아의 경우 적합한 부피는 약 0.5 ㎖ 내지 약 10 ㎖이고, 더 나이가 든 유아의 경우 약 0.5 ㎖ 내지 약 15 ㎖가 선택될 수 있다. 토들러의 경우 약 0.5 ㎖ 내지 약 20 ㎖의 부피가 선택될 수 있다. 어린이의 경우, 최대 약 30 ㎖의 부피가 선택될 수 있다. 십대 초반 및 십대의 경우, 최대 약 50 ㎖의 부피가 선택될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 환자는 선택된 약 5 ㎖ 내지 약 15 ㎖, 또는 약 7.5 ㎖ 내지 약 10 ㎖ 부피로 척수강내 투여를 받을 수 있다. 다른 적합한 부피 및 투약량이 결정될 수 있다. 투약량은 임의의 부작용에 대한 치료적 이익의 균형을 맞추기 위해 조정될 것이며 이와 같은 투약량은 재조합 벡터가 이용되는 치료적 적용에 따라 달라질 수 있다.
상기 기재한 재조합 벡터는 공개된 방법에 따라 숙주 세포에 전달될 수 있다. 바람직하게는 생리학적으로 양립 가능한 담체에 현탁된 rAAV는 인간 또는 비인간 포유동물 환자에게 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 인간 환자에의 투여를 위해, rAAV는 식염수, 계면활성제, 및 생리학적으로 양립 가능한 염 또는 염의 혼합물을 포함하는 수용액에 적합하게 현탁된다. 적합하게는, 제형은 생리학적으로 허용 가능한 pH, 예를 들어, pH 6 내지 9, 또는 pH 6.5 내지 7.5, pH 7.0 내지 7.7, 또는 pH 7.2 내지 7.8의 범위로 조정된다. 뇌척수액의 pH는 약 7.28 내지 약 7.32이므로, 척수강내 전달을 위해 이 범위 내의 pH가 바람직할 수 있는 반면; 정맥내 전달을 위해서는, 약 6.8 내지 약 7.2의 pH가 바람직할 수 있다. 그러나, 가장 광범위한 범위 내의 다른 pH 및 이러한 하위범위가 다른 전달 경로를 위해 선택될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 조성물은 담체, 희석제, 부형제 및/또는 아쥬반트를 포함한다. 적합한 담체는 전달 바이러스가 지시되는 적응증을 고려하여 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 적합한 한 가지 담체는 식염수를 포함하며, 이는 다양한 완충 용액(예를 들어, 인산염 완충 식염수)과 함께 제형화될 수 있다. 다른 예시적인 담체는 멸균 식염수, 락토스, 수크로스, 인산칼슘, 젤라틴, 덱스트란, 한천, 펙틴, 땅콩유, 참기름, 및 물을 포함한다. 완충액/담체는 rAAV가 주입 튜브에 달라붙는 것을 방지하지만 생체내에서 rAAV 결합 활성을 방해하지 않는 성분을 포함하여야 한다.
일 예에서, 제형은, 예를 들어 물에 염화나트륨, 중탄산나트륨, 덱스트로스, 황산마그네슘(예를 들어, 항산마그네슘·7H2O), 염화칼륨, 염화칼슘(예를 들어, 염화칼슘·2H2O), 제2인산나트륨, 및 이들의 혼합물 중 하나 이상을 포함하는 완충생리식염수를 포함할 수 있다. 적합하게, 척수강내 전달을 위해, 삼투압몰농도는 뇌척수액과 양립 가능한 범위 내(예를 들어, 약 275 내지 약 290)에 있으며; 예를 들어 emedicine.medscape.com/article/2093316-overview를 참조한다. 선택적으로, 척수강내 전달을 위해, 상업적으로 이용 가능한 희석제가 현탁화제로 또는 다른 현탁화제 및 다른 선택적인 부형제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, Elliotts B® solution[Lukare Medical]을 참조한다.
특정 실시형태에서, 제형은 중탄산나트륨을 포함하지 않는 완충된 식염수 수용액을 포함할 수 있다. 이와 같은 제형은 하버드 완충액(Harvard's buffer)과 같은, 물에 인산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 염화마그네슘 및 이들의 혼합물 중 하나 이상을 포함하는 완충된 식염수 수용액을 포함할 수 있다. 수용액은 이전에 상표명 Lutrol® F68로 판매되었던 BASF로부터 상업적으로 이용 가능한 폴록사머인 Kolliphor® P188을 추가로 포함할 수 있다. 수용액은 pH가 7.2일 수 있다.
다른 실시형태에서, 제형은 하나 이상의 투과 증진제를 포함할 수 있다. 적합한 투과 증진제의 예는, 예를 들어 만니톨, 소듐 클라이코콜레이트, 소듐 타우로콜레이트, 소듐 데옥시콜레이트, 소듐 살리실레이트, 소듐 카프릴레이트, 소듐 카프레이트, 소듐 라우릴 설페이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우렐 에터, 또는 EDTA를 포함할 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 조성물은, rAAV 및 담체(들)에 추가적으로, 다른 통상적인 약학성분, 예컨대, 보존제, 또는 화학적 안정화제를 포함할 수 있다. 적합한 예시적인 보존제는 클로로뷰탄올, 솔빈산칼륨, 솔빈산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀, 및 파라클로로페놀을 포함한다. 적합한 화학적 안정화제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은 상기 정의된 바와 같인 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 적합하게, 본 명세서에 기재된 조성물은 약학적으로 적합한 담체에 현탁되고/되거나 주사, 삼투 펌프, 척수강내 카테터를 통한 대상체에의 전달, 또는 다른 장치 또는 경로에 의한 전달을 위해 설계된 적합한 부형제와 혼합된 유효량의 하나 이상의 AAV를 포함한다. 일 예에서, 조성물은 척수강내 전달을 위해 제형화된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "척수강내 전달" 또는 "척수강내 투여"는 약물이 뇌척수액(CSF)에 도달하도록, 척추관, 보다 구체적으로 지주막하공간으로의 주사를 통한 약물에 대한 투여 경로를 지칭한다. 척수강내 전달은 요추 천자, 뇌실내(측뇌실내(ICV)를 포함함), 후두하/수조내, 및/또는 C1-2 천자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 물질은 요추 천자를 통해 지주막하 공간 전체에의 확산을 위해 도입될 수 있다. 또 다른 예에서, 주사는 대조 내로 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "수조내 전달" 또는 "수조내 투여"는 대조 소뇌연수조(cisterna magna cerebellomedularis)의 뇌척수액으로 직접, 보다 구체적으로 후두하 천자를 통한 또는 대조로의 직접 주사 또는 영구적으로 위치한 튜브를 통한 약물에 대한 투여 경로를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 전산화 단층촬영(CT)은 신체 구조의 3차원 영상이 축을 따라 만들어진 일련의 평면 단면 영상으로부터 구축되는 방사선 투과 검사를 지칭한다.
본 명세서에서 제공되는 rAAV.GALC 벡터 및 조성물은 GALC 효소 활성의 결핍 수준과 연관된 병태를 교정하는 데 유용하다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 rAAV.GALC 벡터 및 조성물은 GALC의 결핍에 의해 유발되는 말초 신경의 기능장애를 치료하는 데 유용하고/하거나, GALC 결핍에 의해 유발되는 호흡부전 및/또는 운동 기능 상실을 치료하는 데 유용하고/하거나, 크라베병을 치료하는 데 유용하고/하거나 환자에서 크라베병과 연관된 증상을 치료하는 데 유용하다.
특정 실시형태에서, 유효량의 rAAV.hGALC를 포함하는 조성물은 초기 유아 크라베병(EIKD)이 있는 생후 6개월 미만의 환자에게 투여된다. 특정 실시형태에서, 환자는 6개월 미만이고 EIKD보다 덜 심각한 GALC 효소 결핍증을 가진다.
특정 실시형태에서, 유효량의 rAAV.hGALC를 포함하는 조성물은 후반기 유아 크라베병(LIKD)이 있는 생후 6개월 초과, 예를 들어 생후 7개월 내지 약 12개월의 환자에게 투여된다. 특정 실시형태에서, 환자는 생후 6개월 초과, 또는 약 7개월 내지 12개월이고, LIKD보다 덜 심각한 GALC 효소 결핍증을 가진다.
특정 실시형태에서, 환자는 1세 초과(예를 들어, 13개월 내지 10세)이고 소아 크라베병(JKD)을 가진다. 특정 실시형태에서, 환자는 13개월 내지 10세이고 JKD보다 덜 심각한 GALC 효소 결핍증을 가진다.
특정 실시형태에서, 환자는 10세 초과(예를 들어, 10세 초과 내지 12세, 또는 10세 내지 18세 이상)이고 청소년 또는 성인 발병 크라베병을 가진다.
상기 기재된 임의의 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 rAAV.hGALC 요법은 조혈모세포 대체 요법, 골수 이식(BMT), 및/또는 기질 감소 요법(SRT)과 함께 공동 요법으로서 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, rAAV.hGALC 요법(예를 들어, EIKD) 후에 HSCT 또는 BMT와 같은 공동 요법, 또는 효소 대체 요법이 뒤따른다. 특정 실시형태에서, 요법은 치료 후 1주 이내를 포함하여, 벡터의 투여 후 신속한 효소 생성을 초래한다.
특정 실시형태에서, 효소 대체 요법은 서열번호 10의 인간 GALC 단백질의 투여를 포함한다. 다른 실시형태에서, 다른 hGALC 단백질 변이체(예를 들어, 본 명세서에서 확인된 표준 서열, 또는 조작된 단백질)는 효소 대체 요법에서 사용될 수 있다. 상이한 hGALC 단백질의 조합이 효소 대체 요법에서 사용될 수 있다. 이와 같은 실시형태에서, hGALC 단백질은 적합한 생성 시스템을 사용하여 시험관내에서 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[C. Lee et al, 2005/10/01, Enzyme replacement therapy results in substantial improvements in early clinical phenotype in a mouse model of globoid cell leukodystrophy, FASEB journal, The FASEB Journal 19(11):1549-51, October 2005]을 참조한다. hGALC 단백질은, 정맥내, 복강내, 또는 척수강내 경로를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 적합한 경로에 의해 전달을 위해 제형화(예를 들어, 생리학적으로 양립 가능한 식염수 용액에 현탁됨)될 수 있다. 적합한 용량은 1 ㎎/㎏ 내지 20 ㎎/㎏, 또는 5 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏의 범위일 수 있으며 필요에 따라 1주일에 1번, 또는 그보다 더 자주 또는 덜 자주(예를 들어 2일에 1번, 2주에 1번 등) 재투여될 수 있다. hAAVhu68.GALC 벡터의 CSF 투여를 사용하여, 뇌 및 혈청에서의 GALC 수준은 독성 없이 초생리적일 수 있고 CNS 및 PNS에서 개선된 신경운동 기능 및 수초화가 관찰될 수 있다. 출생 후 컨디셔닝된 동물 모델에서 신생아 CSF 투여 후 골수 이식이 뒤따르는 경우, 명백한 징후가 없는 경우 생존이 연장될 수 있다(예를 들어, 300일 초과). 증상 전 크라베 환자에서, AAV.cGALC의 단일 대조 주입은 표현형 교정, 생존 증가, 신경 전도 정상화, 및/또는 개선된 뇌 MRI를 제공할 수 있다.
특정 실시형태에서, rAAV.hGALC 요법은 HSCT 또는 BMT(예를 들어, LIKD 또는 JKD) 후에 제공된다. 그러나, 특정 실시형태에서, rAAV.hGALC는 HSCT 또는 BMT가 필요하지 않은 충분한 GALC 수준을 제공한다.
치료 목적은 rAAV-기반 CNS- 및 PNS-유도 유전자 요법을 통해 환자의 결함이 있는 GALC를 기능적으로 대체하는 것이다. EIKD 또는 LIKD 환자에 대한 요법의 효능은 EIKD 또는 LIKD의 증상, 즉, 울기 및 자극과민성, 경직, 주먹진 손, 미소 상실, 목을 잘 가누지 못함 및 섭식 곤란; 정신 및 운동 악화, 과긴장성 또는 저긴장성, 발작, 실명, 난청, 및 생존 증가(EIKD의 경우 치료 없이 전형적으로 2세 이전에 사망하고; LIKD의 경우, 3 내지 5세까지 생존이 증가할 수 있음) 중 하나 이상의 개선을 평가함으로써 측정될 수 있다. 추가적으로, 이들 및 다른 크라베 환자에 있어서, 치료 효능은, 영상화(예를 들어, 자기 공명 영상(MRI))를 통해 모니터링될 수 있는 말초 신경 및 CNS 백색질(심부뇌백색질 및 치아상/소뇌 백색질) 둘 다에 영향을 미치는 수초형성장애 및 탈수초화; 비정상적인 신경 전도 속도(NCV) 및/또는 뇌간 청력 유발 전위(BAEP)의 감소; 뇌척수액 및/또는 혈장에서 관찰될 수 있는 GALC의 수준 증가; 및/또는 사이코신의 축적 감소에 의해 평가될 수 있다.
중추신경계의 세포를 표적으로 하고 단백질의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어 하에 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지는 성숙한 갈락토실세라미다제 단백질을 인코딩하는 갈락토실세라미다제 코딩 서열을 포함하는 벡터 게놈을 내부에 패키징한 AAV 캡시드를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)를 포함하는 조성물이 제공되며, 상기 벡터 게놈은 AAV 캡시드에 벡터 게놈을 패키징하는 데 필요한 AAV 반전 말단 반복부를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, CB7.CI.hGALC.rBG의 벡터 게놈을 가지는 rAAVhu68을 포함하는 크라베병을 치료하는 데 유용한 조성물이 제공된다. 일 실시형태에서, 벡터 게놈은 서열번호 19의 코딩 서열을 가진다.
특정 실시형태에서, GALC의 결핍에 의해 유발되는 말초 신경의 기능장애를 교정하는 방법 및/또는 GALC 결핍에 의해 유발되는 호흡부전 및 운동 기능 상실을 치료하는 방법에 있어서 조성물의 용도가 제공된다. 특정 실시형태에서, 방법은, (a) 중추신경계에서 세포를 표적화하고 내부에 패키징된 (b)의 벡터 게놈을 가지는 AAV 캡시드; 및 (b) 단백질의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어 하에 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지는 성숙한 갈락토실세라미다제 단백질을 인코딩하는 갈락토실세라미다제 코딩 서열을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)의 스톡을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 벡터 게놈은 AAV 캡시드에 벡터 게놈을 패키징하는 데 필요한 AAV 반전 말단 반복부를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 rAAV.hGALC 조성물은 초기 유아 크라베병 환자의 치료를 위해 척수강내로 전달된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 조성물은 후반기 유아 크라베병(LIKD) 환자의 치료를 위해 척수강내로 전달된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 rAAV.hGALC 조성물은 소아 크라베병(JKD) 환자의 치료를 위해 척수강내로 전달된다. 특정 실시형태에서, rAAV.hGALC 조성물은 청소년 또는 성인 발병 크라베병 환자의 치료를 위해 척수강내로 전달된다. 특정 실시형태에서, 조혈모세포 이식(HSCT), 골수 이식, 및/또는 기질 감소 요법에 대한 공동 요법으로서 투여된다. 특정 실시형태에서, rAAV.hGALC는 대조(대조내)로의 전산화 단층촬영-(CT-) 유도 후두하 주사를 통해 단일 용량으로 투여된다.
rAAV.hGALC의 투여는 생존에 의해 측정되는 바와 같이 질환 진행을 안정화시켜, 잠재적으로 발작의 새로운 발달단계, 발병 및 빈도의 획득을 지원하는 발달 및 운동 발달단계의 손실을 방지한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 예를 들어 30일, 90일 및/또는 6개월, 그 이후 예를 들어 2년의 단기 추적 기간 동안 6개월 마다 평가변수를 측정하는 치료를 모니터링하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 측정 빈도는 장기간 연장 동안 12개월마다 1회로 감소된다. 표적 집단에서 질환의 중증도를 고려해볼 때, 대상체는 등록에 의해 운동 기술을 달성하고 발달되어 이후에 다른 운동 발달단계를 상실했을 수 있거나, 아직 운동 발달단계 발달 징후를 나타내지 않았을 수 있다. 따라서 평가는 모든 발달단계에 대한 성취 연령 및 상실 연령을 추적한다. 특정 실시형태에서, 발달단계는, 예를 들어 도움없이 앉기, 손과 무릎으로 기어가기, 도움을 받아 서기, 도움을 받아 걷기, 혼자 서기, 및/또는 혼자 걷기 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시형태에서, 치료는 발작 활성의 개시 지연 및/또는 발작 사건의 빈도 감소를 초래한다.
특정 실시형태에서, 대상체에서 치료를 모니터링하는 방법은 적응행동, 인지, 언어, 운동 기능, 및/또는 건강-관련 삶의 질의 발달 및 변화에 대한 치료 효과를 정량화하기 위해 임상 척도를 사용한다. 척도 및 영역은, 예를 들어 베일리 영유아 발달 검사(Bayley Scales of Infant and Toddler Development)(5가지 영역, 즉, 인지, 언어, 운동, 사회-정서, 및 적응행동에 걸쳐 영유아의 발달을 평가함), 바인랜드 적응행동 척도(III판)(Vineland Adaptive Behavior Scales (Edition III))(5가지 영역, 즉, 의사소통, 일상생활 기술, 사회화, 운동 기술, 및 부적응행동에 걸쳐 출생시부터 성인기(0 내지 90세)까지의 적응행동을 평가함), 피바디 운동발달 척도-2판(Peabody Developmental Motor Scales- Second Edition)(출생시부터 5세의 어린이까지의 밀접한 관계에 있는 운동 기능을 측정함; 평가는 6개의 영역, 즉, 반사, 정적인 움직임, 이동, 물체 조작, 쥐기, 및 시각-운동 통합에 초점을 둠), 영유아 삶의 질 설문지(Infant Toddler Quality of Life Questionnaire; ITQOL)(생후 2개월의 영아부터 최대 5세의 토들러에 대해 설계된 건강-관련 삶의 질에 대해 부모가 기록하는 측정), 및 조기 학습의 뮬런 척도(Mullen Scales of Early Learning)(최대 68개월까지 영유아의 언어, 운동, 및 지각 능력을 평가함)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 치료 효과는 수초화, 수초화와 관련된 기능적 결과, 및 잠재적인 질환 바이오마커의 변화를 평가함으로써 모니터링되거나 측정된다. 특정 실시형태에서, 중추 및 말초 탈수초화는 대상체의 치료 후 진행이 느려지거나 중단된다. 중추 탈수초화는 백색질 영역의 확산-텐서 자기 공명 영상(CT-MRI) 이방성 측정 및 피질척수 운동로의 섬유 추적에 의해 추적될 수 있으며, 여기서 변화는 질환 상태 및 진행의 지표이다. 말초 탈수초화는 생물학적으로 활성인 미엘린의 변화를 나타내는 변동(즉, F-파 및 원위 잠복기, 진폭 또는 응답 유무)을 모니터링하기 위한 운동 신경(심비골신경, 경골신경, 및 척골신경) 및 감각 신경(비복신경, 및 정중신경)에 대한 신경 전도 속도(NCV) 연구를 통해 간접적으로 측정될 수 있다.
특정 실시형태에서, rAAV.hGALC 투여 후 치료를 모니터링하는 방법이 제공되며, 여기서 대상체는 치료 전에 상당한 시력 손실이 발생하지 않은 대상체에 대해 시력 손실 지연 또는 시력 손실 부재에 대해 평가된다. 따라서 시각적 유발 전위(VEP)의 측정은 중심 시력 장애 또는 손실의 지표로서 시각 자극에 대한 반응을 객관적으로 측정하는 데 사용된다. 특정 실시형태에서, 대상체는, 예를 들어 뇌간 청력 유발 반응(BAER) 테스트를 사용하여 치료 후 청력 손실에 대해 모니터링된다. 특정 실시형태에서, rAAV.hGALC 투여 후 치료를 모니터링하는 방법이 제공되며, 여기서 대상체의 사이코신 수준이 측정된다.
용어 "하나"("a" 또는 "an")는 하나 이상을 지칭한다는 점에 유의해야 한다. 이와 같이, 용어 "하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다.
단어 "포함하다", "포함한다", "포함하는(comprising)", "함유하는", 및 "포함하는(including)"은 배타적이 아니라 포괄적으로 해석되어야 한다. 단어 "이루어지다", "이루어지는", 및 이의 변형어는 포괄적이 아니라 배타적으로 해석되어야 한다. 명세서의 다양한 실시형태가 "포함하는" 언어를 사용하여 제시되지만, 다른 상황 하에서 관련된 실시형태도 또한 "~로 이루어진" 또는 "~로 본질적으로 이루어진" 언어를 사용하여 해석 및 설명되는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 달리 명시되지 않는 한, 주어진 참조값으로부터 10%의 가변성(±10%)을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "질환", "장애" 및 "병태"는 대상체에서 비정상적인 상태를 나타내기 위해 호환 가능하게 사용된다.
용어 "발현"은 가장 광범위한 의미로 본 명세서에서 사용되며 RNA 또는 RNA 및 단백질의 생성을 포함한다. RNA와 관련하여, 용어 "발현" 또는 "번역"은 특히 펩타이드 또는 단백질의 생성과 관련된다. 발현은 일시적일 수 있거나 안정적일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "발현 카세트"는 코딩 서열, 프로모터를 포함하고, 이에 대한 다른 조절 서열을 포함할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 벡터 게놈은 2개 이상의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 용어 "이식유전자"는 "발현 카세트"와 호환 가능하게 사용될 수 있다. 전형적으로, 이와 같은 바이러스 벡터를 생성하기 위한 발현 카세트는 바이러스 게놈의 신호 및 본 명세서에 기재된 것과 같은 다른 발현 제어 서열의 패키징에 의해 측접된 본 명세서에 기재된 유전자 산물에 대한 코딩 서열을 포함한다.
약어 "sc"는 자가-상보성을 지칭한다. "자가-상보성 AAV"는 재조합 AAV 핵산 서열에 의해 운반되는 코딩 영역이 분자 내 이중-가닥 DNA 주형을 형성하도록 설계된 작제물을 지칭한다. 감염시, 제2 가닥의 세포 매개 합성을 기다리지 않고 scAAV의 2개의 상보적인 반쪽이 회합하여 즉각적인 복제 및 전사 준비가 된 하나의 이중 가닥 DNA(dsDNA) 단위를 형성한다. 예를 들어, 문헌[D M McCarty et al, "Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis", Gene Therapy, (August 2001), Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254]을 참조한다. 자가-상보성 AAV는, 예를 들어 미국 특허 제6,596,535호; 제7,125,717호; 및 제7,456,683호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
단백질 또는 핵산과 관련하여 사용될 때 용어 "이종"은 단백질 또는 핵산이 자연에서 서로 동일한 관계에서 발견되지 않는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 포함함을 나타낸다. 예를 들어, 새로운 기능성 핵산을 만들기 위해 배열된 관련되지 않은 유전자로부터의 2개 이상의 서열을 가지는 핵산은 전형적으로 재조합으로 생성된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 핵산은 상이한 유전자로부터 코딩 서열의 발현을 지시하도록 배열된 하나의 유전자 유래의 프로모터를 가진다. 따라서, 코딩 서열과 관련하여, 프로모터는 이종성이다.
"복제-결함 바이러스" 또는 "바이러스 벡터"는 관심 유전자를 포함하는 발현 카세트가 바이러스 캡시드 또는 외피에 패키징되어 있는 합성 또는 인공 바이러스 입자를 지칭하며, 여기서 또한 바이러스 캡시드 또는 외피에 패키징되어 있는 임의의 바이러스 게놈 서열은 복제-결함이고; 즉, 이들은 자손 비리온을 생성할 수 없지만 표적 세포를 감염시킬 수 있는 능력을 보유한다. 일 실시형태에서, 바이러스 벡터의 게놈은 복제에 필요한 효소를 인코딩하는 유전자를 포함하지 않지만(게놈은 인공 게놈의 증폭 및 패키징에 필요한 신호가 측접된 관심이 있는 유전자만 포함하는 "거트리스(gutless)"가 되도록 조작될 수 있음), 이들 유전자는 생성 동안 공급될 수 있다. 따라서, 복제에 필요한 바이러스 효소가 존재하는 경우를 제외하고 자손 비리온에 의한 복제 및 감염이 일어나지 못하므로 유전자 요법에서 사용하기에 안전한 것으로 여겨진다.
많은 경우에, rAAV 입자는 DNase 내성이라고 지칭된다. 그러나, 이러한 엔도뉴클레아제(DNase)에 추가적으로, 오염 핵산을 제거하기 위해 다른 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제가 또한 본 명세서에 기재된 정제 단계에서 사용될 수 있다. 이와 같은 뉴클레아제는 단일 가닥 DNA 및/또는 이중-가닥 DNA, 및 RNA를 분해하도록 선택될 수 있다. 이와 같은 단계는 단일 뉴클레아제, 또는 상이한 표적에 대한 뉴클레아제의 혼합물을 포함할 수 있으며, 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제일 수 있다.
용어 "뉴클레아제-내성"은 AAV 캡시드가 유전자를 숙주 세포에 전달하도록 설계된 발현 카세트 주위에 완전히 조립되었음을 나타내며 생성 과정으로부터 존재할 수 있는 오염 핵산을 제거하도록 설계된 뉴클레아제 인큐베이션 단계 동안 분헤(소화)로부터 이들 패키징된 게놈 서열을 보호한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "유효량"은 벡터 게놈으로부터 일정 양의 유전자 산물을 표적 세포에 전달하고 표적 세포에서 발현하는 rAAV 조성물의 양을 지칭한다. 유효량은 인간 환자가 아닌 동물 모델을 기준으로 결정될 수 있다. 적합한 뮤린 모델의 예가 본 명세서에 기재되어 있다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 기술적 및 과학적 용어는 본 출원에서 사용되는 다수의 용어에 대한 일반적인 가이드를 당업자에게 제공하는 공개된 텍스트를 참조하여 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시적인 것이며 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
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Figure pct00005
Figure pct00006
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실시예 1 - 재조합 AAVhu68.hGALC
rAAVhu68.hGALC는 인간 GALC를 인코딩하는 조작된 서열을 보유하는 AAV이다. rAAVhu68.hGALC의 AAVhu68 캡시드는 아미노산 수준에서 AAV9와 99% 동일하다. AAV9[서열번호 4]와 AAVhu68 캡시드[서열번호 2] 사이에 상이한 2개의 아미노산은 VP1(67번 및 157번)과 VP2(157번) 영역에 위치하며 도 1에서 확인된다. 또한 본 명세서에서 참조에 의해 원용되는 WO 2018/160852호를 참조한다.
AAV ITR이 측접하는 이식유전자 카세트를 인코딩하는 AAV 시 스 플라스미드, AAV2 rep 및 AAVhu68 cap 유전자를 인코딩하는 AAV 트랜스 플라스미드(pAAV2/hu68.KanR), 및 헬퍼 아데노바이러스 플라스미드(pAdΔF6.KanR)로 HEK293 세포를 삼중 플라스미드 형질감염시킴으로써 rAAVhu68.hGALC를 생성한다.
A. AAV 벡터 게놈 플라스미드 서열 요소
벡터 게놈의 선형 지도가 도 2에 도시되어 있다. 벡터 게놈은 다음 서열 요소를 포함한다:
반전 말단 반복부(ITR): ITR은 벡터 게놈의 모든 구성성분에 측접하는 AAV2(130개 bp, GenBank: NC_001401)로부터 유래된 동일하고 역상보적인 서열이다. ITR은 AAV 및 아데노바이러스 헬퍼 기능이 트랜스로 제공될 때 벡터 DNA 복제 기점 및 벡터 게놈에 대한 패키징 신호 둘 다로서 기능한다. 이와 같이, ITR 서열은 벡터 게놈 복제 및 패키징에 필요한 유일한 시스 서열을 나타낸다.
인간 거대세포바이러스 급초기 인핸서(CMV IE): 인간-유래 CMV(382 bp, GenBank: K03104.1)로부터 얻은 이러한 인핸서 서열은 하류 이식유전자의 발현을 증가시킨다.
닭 β-액틴 프로모터(BA): 이러한 유비쿼터스 프로모터(282 bp, GenBank: X00182.1)는 모든 CNS 세포 유형에서 이식유전자 발현을 구동시키기 위해 선택되었다.
키메라 인트론(CI): 하이브리드 인트론은 닭 β-액틴 스플라이스 공여체(973 bp, GenBank: X00182.1) 및 토끼 β-글로빈 스플라이스 수용체 요소로 이루어진다. 인트론은 전사되지만 스플라이싱에 의해 성숙한 mRNA로부터 제거되어 인트론의 양쪽에 있는 서열을 함께 모은다. 발현 카세트에서 인트론의 존재는 핵에서 세포질로 mRNA의 수송을 촉진시켜 번역을 위한 mRNA의 정상 수준의 축적을 향상시키는 것으로 나타났다. 이는 유전자 발현의 수준 증가를 위해 의도된 유전자 벡터의 일반적인 특징이다.
코딩 서열: 인간 GALC 유전자의 조작된 cDNA는 미엘린 갈락토리피드의 가수분해 및 분해를 담당하는 리소좀 효소인 인간 갈락토실세라미다제 단백질을 인코딩한다(2055 bp; 685 아미노산 [aa], GenBank: EAW81361.1).
토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 신호(rBG 폴리A): rBG 폴리A 신호(127 bp, GenBank: V00882.1)는 시스로 이식유전자 mRNA의 효율적인 폴리아데닐화를 촉진시킨다. 이 요소는 전사 종결, 초기 전사체의 3' 말단에서 특이적 절단 사건 및 긴 폴리아데닐 꼬리의 추가에 대한 신호로 기능한다.
B. 트랜스 플라스미드: pAAV2/1.KanR(p0068)
AAV2/hu68 트랜스 플라스미드 pAAV2/hu68.KanR(p0068)은 도 21에 제시되어 있다.
AAV2/hu68 트랜스 플라스미드는 pAAV2/hu68.KanR(p0068)이다. pAAV2/hu68.KanR 플라스미드는 길이가 8030 bp이고 AAV 벡터 게놈의 복제 및 패키징에 필요한 4가지 야생형 AAV2 레플리카제(Rep) 단백질을 인코딩한다. pAAV2/hu68.KanR 플라스미드는 또한 3가지 WT AAVhu68 비리온 단백질 캡시드(Cap) 단백질을 인코딩하며, 상기 단백질은 AAV 혈청형 hu68의 비리온 쉘로 조립되어 AAV 벡터 게놈을 수용한다.
pAAV2/hu68.KanR 트랜스 플라스미드를 생성하기 위해, 플라스미드 pAAV2/9n(p0061-2)(pBluescript KS 벡터로부터 유래된 플라스미드 백본 상의 야생형 AAV2 rep 및 AAV9 cap 유전자를 인코딩함) 유래의 AAV9 cap 유전자를 제거하고 AAVhu68 cap 유전자로 대체하였다. 암피실린 내성(AmpR) 유전자를 또한 카나마이신 내성(KanR) 유전자로 대체하여, pAAV2/hu68.KanR(p0068)을 산출하였다. 이러한 클로닝 전략은 rep의 5' 말단에서 cap의 3' 말단으로 AAV p5 프로모터 서열(일반적으로 rep 발현을 구동시킴)을 이전시켜, rep의 상류에 절단된 p5 프로모터를 남긴다. 이러한 절단된 프로모터는 rep의 발현을 하향-조절하고, 결과적으로 벡터 생성을 최대화하는 역할을 한다(도 21).
플라스미드의 모든 구성성분 부분을 직접 염기서열결정에 의해 확인하였다.
C. 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드: pAdDeltaF6(KanR)
아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 pAdDeltaF6(KanR)이 도 22B에 제시되어 있다.
플라스미드 pAdDeltaF6(KanR)은 크기가 15,770 bp이다. 플라스미드는 AAV 복제에 중요한 아데노바이러스 게놈의 영역, 즉, E2A , E4, 및 VA RNA를 포함한다(아데노바이러스 E1 기능은 HEK293 세포가 제공함). 그러나, 플라스미드는 다른 아데노바이러스 복제 또는 구조 유전자를 포함하지 않는다. 플라스미드는 아데노바이러스 ITR과 같은 복제에 중요한 시스 요소를 포함하지 않으며; 따라서 감염성 아데노바이러스가 생성되지 않을 것으로 예상된다. 플라스미드는 Ad5의 E1, E3-결실 분자 클론(pBHG10, pBR322-기반 플라스미드)으로부터 유래되었다. Ad5에 결실을 도입하여 불필요한 아데노바이러스 유전자의 발현을 제거하고 아데노바이러스 DNA의 양을 32 kb에서 12 kb로 감소시켰다(도 22A). 마지막으로, 암피실린 내성 유전자를 카나마이신 내성 유전자로 대체하여 pAdeltaF6(KanR)을 생성하였다(도 22B). HEK293 세포에 존재하는 E1과 함께 이 플라스미드에 남아 있는 E2, E4, 및 VAI 아데노바이러스 유전자는 AAV 벡터 생성에 필요하다. 도 30 및 도 31에 각각 나타낸 흐름도에 따라 벡터를 생성하고 제형을 준비한다.
실시예 2 - GALC-결핍 트위처 마우스 모델에서 AAVhu68.hGALC 전달
하기에 기재된 연구는 트위처 마우스 모델을 사용하여 조작된 인간 GALC 서열(서열번호 9)을 인코딩하는 rAAVhu68 벡터(도 2)를 CSF로 전달하여 치료 수준의 GALC 발현 수준을 달성하고 질환의 여러 바이오마커를 구제할 가능성을 확립하였다. 트위처 마우스 연구에 대한 개요는 도 4B에 제공되어 있다.
트위처 마우스는 1976년 the Jackson Laboratory에서 자발적 돌연변이로 확인된 크라베병의 자연 발생 근친교배 모델이다(Kobayashi T., et al. (1980) Brain Research. 202(2):479-483). 이환된 마우스는, Galc 유전자에서 G에서 A로의 돌연변이로 이루어지는 트위처 기능 상실 대립유전자(twi)에 대해 동형접합이다. 이러한 돌연변이는 조기 정지 코돈(W339X)을 유발한다. 절단된 GALC 단백질은 0%에 가까운 잔류 효소 활성을 가지며, 이는 유아 형태의 크라베병 환자에서 관찰되는 GALC 활성 수준과 유사하다. 이형접합 보인자 마우스(twi/+)는 표현형이 정상이다.
트위처 마우스에서 질환의 진행은 잘 문서화되어 있으며(도 4A), 다양한 신경병리학적 및 행동적 결함 표현형모사 유아 크라베병은 표 5에 제시되어 있다. 유아 크라베 환자에서와 같이, 마우스의 GALC 결핍은 세포독성 지질 중간체인 사이코신의 축적을 초래한다. 트위처 마우스는 마찬가지로, 대식세포 및/또는 미세아교세포 계통으로부터 유래된 것으로 생각되는 식세포의, 사이코신으로 채워진 공세포에 의해 PNS 및 CNS 백색질의 대규모 침윤을 나타낸다(Tanaka K., et al. (1988) Brain Research. 454(1):340-346; Levine S.M., et al. (1994) Intl J Dev Neuro. 12(4):275-288). 이는 크라베 환자에서 질환의 주요 특징 중 하나인 탈수초화를 초래한다. 정상적인 수초화의 초기 기간 후, 이환된 트위처 마우스는 미엘린-형성 슈반 세포의 사멸로 인해 생후 10일 이후에 PNS에서 미엘린이 손실되고(Jacobs J.M., et al. (1982) J Neurol Sci. 55(3):285-304) 미엘린-형성 희소돌기아교세포의 사멸로 인해 생후 20일 이후에 CNS에서 미엘린이 손실된다. 이러한 지연때문에 탈수초화가 이들 마우스의 CNS보다 말초 신경에서 더 심각할 가능성이 있다(Suzuki K. & Suzuki K. (1983) The American journal of pathology. 111(3):394-397). 마지막으로, 트위처 마우스는 증상이 발병된 후 일관되고 빠른 신경학적 악화를 나타내며, 이는 증상 발병시 유아 크라베 환자에서 유사하게 관찰된다. 이러한 마우스의 행동 증상은 대략 20일령에 나타나는 진전, 경련, 및 뒷다리 약화를 포함하여 인간 환자에서 관찰되는 것을 연상시키는 운동 표현형을 포함한다. 마우스는 궁극적으로 약 40일령까지 심각한 체중 감소 및 마비를 특징으로 하는 인도적 종점으로 진행한다(Wenger D.A. (2000) Molec Med Today. 6(11):449-451).
유아 크라베 환자는 트위처 마우스와 유사한 임상 특징을 나타낸다. 따라서, 트위처 마우스 모델은 유아 크라베 적응증을 지지하기 위해 rAAVhu68.hGALC의 효능(생존, 운동 기능, 및 뇌 및 신경 병리를 개선하는 효소 활성의 구제)을 평가하는 데 적합하다. 하기 기재된 트위처 마우스를 사용하는 연구는, 관련 조직에서 단일 ICV 투여(ICM이 기술적으로 가능하지 않은 마우스 모델에서 가장 효율적인 투여 경로) 후 활성 GALC 효소를 발현하고, 생존을 구제하며, 운동 기능을 개선시키고, CNS 및 PNS 조직병리를 개선시키는 rAAVhu68.hGALC의 효능을 입증하였다.
증상 전 신생 트위처 마우스
이 연구의 목적은 트위처 마우스 모델에서 최대 효능을 달성하기 위해 최적의 ROA, 캡시드 혈청형, 및 용량 범위를 확립하는 것이었다. 증상 전 신생 마우스를 이 연구를 위해 선택하여 질환 구제 관찰의 변화를 최대화하였다.
최적의 ROA를 확립하기 위해, 측두 정맥으로의 주사를 통한 IV 경로를 ICV 경로와 비교하였는데, 이는 두 경로 모두 신생 동물에서 CNS 및 PNS에 형질도입할 수 있기 때문이다. PND 0에 1.00×1011개 GC 용량의 IV 또는 2.00×1010개 GC의 5배 더 낮은 용량의 ICV로 증상 전 트위처 마우스(twi / twi)에 rAAVhu68.hGALC를 투여하였다. 1.00×1014개 GC/㎏에 해당하여 CNS 형질도입을 달성하는 데 높은 용량이 필요하기 때문에 상기 IV 용량을 선택하였고, CSF로의 직접 투여는 더 낮은 용량에서 CNS 형질도입을 촉진시키기 때문에 5배 더 낮은 ICV 용량을 선택하였다. 대조군으로서, 증상 전 연령이 일치하는 트위처 마우스에 비히클(PBS)을 ICV 주사하였다. 최대 체중의 20%를 초과하는 체중 감소 및/또는 뒷다리 마비로 정의되는 인도적 종점에 도달하면 동물을 안락사시키고, 생존을 기록하였다. 더 높은 용량(1.00×1011개 GC)에서 rAAVhu68.hGALC의 IV 투여는 미처리 대조군과 비교하여 일부 생존 이익을 제공하였다. 그러나, IV 투여와 비교하여, 5배 더 낮은 용량(2.00×1010개 GC)으로 ICV-투여된 rAAVhu68.hGALC는 우수한 생존 이익을 부여하였다(도 5). 따라서, 후속 연구를 위해 ICV ROA를 선택하였다.
인간 GALC를 인코딩하는 벡터 게놈의 신경계 전달을 위한 최상의 AAV 캡시드를 확인하기 위해, 4가지 상이한 AAV 캡시드를 테스트하였다. 캡시드는 AAV 혈청형 3b(AAV3b), AAV 혈청형 5(AAV5), AAV 혈청형 1(AAV1), 및 AAV 혈청형 hu68(rAAVhu68.hGALC)을 포함하였다. 각각의 AAV 벡터는 2.00×1010개 GC의 용량으로 ICV 투여되었으며, 상기 용량은 단기 연구 기간을 가능하게 하면서 증상 전 트위처 마우스에서 효과적으로 생존을 연장시키는 것으로 이전에 확립된 저용량 및 ROA이었다(도 5). 대조군으로서, 증상 전 트위처 마우스의 그룹에 PND 0에 비히클 단독(PBS)을 ICV-투여하였다. 4가지 캡시드 모두 비히클-처리 대조군과 비교하여 생존을 향상시킨 한편, AAVhu68 캡시드(rAAVhu68.hGALC)는 AAV3b, AAV5, 및 AAV1보다 우수한 생존을 나타내었다(도 6). 따라서 후속 연구를 위해 AAVhu68 캡시드(rAAVhu68.hGALC)를 선택하였다.
용량 범위를 결정하기 위해, PND 0에 신생 증상 전 트위처 마우스에게 2.00×1010개 GC, 5.00×1010개 GC, 또는 1.00×1011개 GC의 용량으로 rAAVhu68.hGALC를 ICV-투여하였다. 대조군으로서, PND 0에 비히클(PBS)을 연령이 일치하는 증상 전 트위처(twi / twi) 마우스 및 비이환 이형접합체(twi /+) 및 야생형 마우스에 ICV-투여하였다.
PND 35에, 막대 분석을 사용하여 마우스의 이동성 및 조정력을 평가하였다(도 7). 로타로드(rotarod)는 마우스가 달리는 가속 막대로서, 분석 개시와 마우스가 막대에서 떨어지는 사이의 시간 지연은 운동 조정과 상관관계가 있는 것으로 잘 확립되어 있다. PND 35 시점은 이환된 트위처 마우스가 인도적 안락사 종점에 도달하기 전에 측정 가능한 운동 결함을 나타내는 시점이기 때문에 이 시점을 선택하였다. 로타로드 분석은 rAAVhu68.hGALC 투여 후 운동 및 조정력의 부분적 구제를 나타내었다. 구제 정도는 용량-의존적인 것으로 보였으며, 1.00×1011개 GC의 가장 높은 rAAVhu68.hGALC 용량에서 현저하게 더 긴 낙하 지연이 관찰되었다(p<0.01)(도 7).
로타로드 분석 후, 모든 처리 그룹에 대해 생존을 추적하였다. 비히클-처리된 트위처(twi / twi) 대조군과 비교하여 PND 0에 증상 전에 rAAVhu68.hGALC를 투여한 트위처(twi / twi) 마우스에 대하여 용량-의존적 생존 증가가 관찰되었다. 1.00×1011개 GC의 가장 높은 rAAVhu68.hGALC 용량을 투여한 마우스에 대하여 가장 긴 생존기간 중앙값(130일)이 관찰되었다(도 8).
누적적으로, 최적의 ROA, 캡시드, 및 용량 범위를 확인하기 위한 이러한 POC 실험은 트위처 마우스에서 증상 발병 전에 투여되는 경우 신경운동 기능을 보존하고 생존을 연장시키는 데 있어서 rAAVhu68.hGALC의 효능을 입증한다.
증상이 있는 트위처 마우스
본 발명자들은 증상 발병 후 등록된 환자와 유사한 맥락을 재현하기를 원했기 때문에, 이 연구의 목적은 행동 증상의 발병 전 질환 병리의 초기 단계 동안(PND 12; "초기-증상이 있는"이라 지칭함) 또는 마우스가 행동 증상을 나타낼 때 질환 병리의 후기 단계 동안(PND 21; "후기-증상이 있는"이라 지칭함) 투여될 때 rAAVhu68.hGALC의 효능을 조사하는 것이었다. 게다가, PND 0 마우스는 미숙아와 동등한 뇌 성숙도를 가지는 반면, PND 12 및 PND 21은 각각 2개월령 및 9개월령으로 해석되며(www.translatingtime.org), FIH에 대한 의도된 유아 모집단을 더 밀접하게 재현한다.
PND 12에 1.00×1011개 GC 또는 2.00×1011개 GC의 용량으로 rAAVhu68.hGALC를 초기-증상이 있는 트위처에 ICV-투여한 한편, PND 21에 2.00×1011개 GC의 더 높은 용량으로 rAAVhu68.hGALC를 후기-증상이 있는 투위처 마우스의 또 다른 코호트에 ICV-투여하였다. 1.00×1011개 GC의 더 낮은 용량이 트위처 마우스의 생존 증가에 가장 효과적인 용량으로 밝혀졌기 때문에(상기 기재함) 투여를 위해 이 용량을 선택하였다. 더 심각한 탈수초화가 있는 마우스에 있어서 더 높은 용량이 필요할 수 있다고 가정하였기 때문에 2.00×1011개 GC의 더 높은 rAAVhu68.hGALC 용량도 또한 PND 21에 마우스의 처리에 이용하였다. 대조군으로서, PND 12에 초기-증상이 있는 트위처 마우스(twi / twi) 및 비이환 이형접합체(twi /+)에 비히클 단독(PBS)을 ICV-투여하였고, 연구 1로부터의 연혁 데이터를 사용하여 PND 0에 1.11×1011개 GC를 투여한 투위처 마우스(twi / twi)와 비교하였다.
PND 35에, 막대 분석을 사용하여 마우스의 이동성 및 조정력을 평가하였으며, 이는 투위처 마우스(twi / twi)가 측정 가능한 운동 결핍을 나타내는 시점이다. 로타로드 분석은 1.00×1011개 GC(p<0.01)의 용량으로 PND 0에 증상 전 트위처 마우스에 또는 1.00×1011개 GC(p<0.001) 또는 2.00×1011개 GC(p<0.01)의 용량으로 PND 12에 초기-증상이 있는 트위처 마우스에 rAAVhu68.hGALC를 투여할 때 운동 및 조정력의 부분적 구제를 나타내었다. 2.00×1011개 GC의 rAAVhu68.hGALC 용량이 PND 21에 후기-증상이 있는 트위처 마우스에 투여될 때 운동 및 조정력의 유의한 구제가 관찰되지 않았다(도 9).
로타로드 분석 후, 모든 처리 그룹에 대해 생존을 추적하였다. 비히클-처리된 트위처 대조군과 비교하여, PND 12에 초기-증상이 있는 트위처 마우스 및 PND 21에 후기-증상이 있는 트위처 마우스 둘 다에서 rAAVhu68.hGALC 투여 후 더 긴 생존이 관찰되었다. 그러나, PND 12에 2.00×1011개 GC의 고용량으로 초기-증상이 있는 트위처 마우스에 rAAVhu68.hGALC를 투여하였을 때 최대 생존이 관찰되었다(도 10).
누적적으로, 트위처 마우스의 생존 및 신경운동 기능의 개선은 rAAVhu68.hGALC가 질환의 보다 이른 단계에서 투여되는 경우 더 효과적일 수 있음을 시사하였다.
증상이 있는 트위처 마우스에서의 약리학 연구
이 연구의 목적은 rAAVhu68.hGALC 투여 후 약리학, 기능, 및 조직병리학 판독값을 평가하는 것이었다. 이전 연구는 생존 분석을 용이하게 하기 위해 인도적 종점에서 동물을 희생시켰기 때문에, 이는 트위처 마우스 및 비히클-처리 대조군의 연령 일치 시점에서 약리학 및 조직학 판독값의 수집을 배제하였다. 따라서, 이 연구는 이들 종점을 조사하였다.
PND 12에 2.00×1011개 GC의 용량으로 초기-증상이 있는 트위처 마우스(twi/twi)에 rAAVhu68.hGALC를 ICV-투여하였다. 대조군으로서 PND 12에 PBS를 연령이 일치하는 비이환 트위처 이형접합체(twi/+) 및 야생형 마우스에 ICV-투여하였다. 최대 효능을 달성하는 POC에 대해 2.00×1011개 GC의 rAAVhu68.hGALC 용량을 선택하였고, PND 12는 2개월 영아에 해당하는 뇌 성숙이 있는 동물에서 PNS 탈수초화의 개시 직후이기 때문에(www.translatingtime.org) 투약일로서 선택하였으며, 이는 FIH 시험에 대한 의도된 영아 모집단을 반영한다.
PND 22에 시작하여, 임상 징후에 대해 매일 모든 마우스를 모니터링하였다. PND 22는 트위처 마우스에에서 행동 표현형을 관찰할 수 있는 가장 이른 날 중 하나이기 때문에, 이 평가에 대한 첫 번째 시점으로서 선택하였다. 표 1에 상술한 바와 같이 쥐는 능력, 보행, 진전, 척추후만증, 및 털의 질에 대한 미공개 평가를 사용하여 임상 징후의 점수를 매겼다. 이러한 측정은 전형적으로 나타나는 증상을 기반으로 트위처 마우스의 임상 상태를 효과적으로 평가한다. 0점 초과의 점수는 임상적 악화를 나타낸다.
Figure pct00008
이 평가를 사용하여, PND 12에 rAAVhu68.hGALC를 투여한 초기-증상이 있는 트위처 마우스(twi / twi)는 0에 가까운 임상 점수를 나타내었으며, 이는 야생형 및 비이환 트위처 이형접합체(twi /+)의 점수와 비슷하였다. 대조적으로, 연령이 일치하는 비히클-처리 트위처(twi / twi) 마우스는 대부분의 시간 경과에 따라 더 높은 평가 점수를 나타내었으며, 이는 임상적 악화를 나타낸다(도 11A).
보완적인 기능 분석으로서, PBD 35에 로타로드 테스트를 수행하여 신경운동 표현형을 평가하였다. PND 12에 rAAVhu68.hGALC를 투여한 초기-증상이 있는 트위처 마우스(twi/twi)는 야생형 및 비이환 트위처 이형접합체(twi /+)와 비슷한 낙하 지연을 나타낸 반면, 연령이 일치하는 비히클-처리 트위처 마우스(twi / twi)는 현저하게 더 짧은 낙하 지연(p<0.05)을 나타내었으며, 이는 신경운동 기능의 악화를 나타낸다(도 11B).
기능적 종점에 대한 rAAVhu68.hGALC 투여의 관찰된 이익이 조직학적 개선과 상관관계에 있는지 여부를 결정하기 위해, 모든 마우스를 PND 40에 부검하고, 뒷다리의 좌골신경을 조직학적으로 조사하였다. PBD 40은 비처리 또는 비히클-처리 트위처 마우스가 인도적 종점에 이르는 대략적인 나이이고 신경병리가 가장 심각한 시점이기 때문에 부검 시점으로서 선택하였다. 좌실신경은 CNS와 비교하여 트위처 마우스에서 탈수초화에 의해 말초 신경이 더 영향을 많이 받기 때문에 조직학을 위해 좌골신경을 선택하였다. 또한, 환자에서 HSCT에 의한 PNS의 교정 부족은 유아 환자에서 주요한 미충족 수요로 남아 있으므로, PNS에 대한 rAAVhu68.hGALC 투여 효과에 대한 조사가 관심이 있다.
미엘린(어두운 염색) 및 공세포(밝은 염색)를 시각화하기 위하여, 좌골신경의 절편을 처리하였다(도 12). PND 40에, 비히클-처리 야생형 대조군의 좌골신경은 미엘린이 풍부하였고 일반적으로 공세포 침윤물이 없었다. 그러나, 비히클-처리 증상이 있는 마우스(twi / twi)에서, 좌골신경에서 심한 부분적 탈수초화가 관찰되었으며, 이는 신경 비후 및 공세포의 침윤이 동반되었다. 대조적으로, 연령이 일치하는 야생형 마우스에서 정상적으로 관찰되는 정도는 아니지만, PND 12에 rAAVhu68.hGALC를 투여한 증상이 있는 트위처 마우스(twi / twi)의 좌골신경에서 미엘린이 보존되었다. 비히클-처리 트위처 마우스와 비교하여 rAAVhu68.hGALC-처리 트위처 마우스의 신경에서 더 적은 공세포가 또한 관찰되었다. 이러한 데이터는 기능적 종점과 상관관계가 있으며, 이는 질화 진행의 초기 단계 동안 rAAVhu68.hGALC를 투여한 증상이 있는 트위처 마우스에서 임상 점수 및 신경운동 기능의 개선이 기저 질환 신경병리 발병의 역전 또는 지연과 관련될 수 있음을 시사한다.
마지막으로, 부검일(PND 40)에 야생형 및 트위처 마우스(twi / twi) 뇌, 간, 및 혈청 샘플을 수득하여 이식유전자 산물인 GALC의 활성 수준을 정량화하였다. GALC를 형광단-기반 GALC 활성 분석을 사용하여 정량화하여 rAAVhu68.hGALC 투여 후 AAV 벡터가 형질도입되고 기능적 효소가 발현됨을 확인하였다. 이 분석을 위해 야생형 동물을 대조군으로 사용하였고, 트위처 이형접합체(twi /+)는 제외하였는데, 이는 관찰 가능한 표현형이 없음에도 불구하고 해당 마우스에서 GALC 활성 수준이 감소하였기 때문이다. 신경계는 GALC 전달에 대한 표적 조직이기 때문에 뇌를 검사하였고, 말초 기관계에서의 형질도입을 평가하기 위해 간 및 혈청을 검사하였다. 2.00×1011개 GC의 용량으로 rAAVhu68.hGALC를 ICV 투여하고 28일 후, GALC 활성의 초생리적 수준이 트위처(twi/twi)의 뇌, 간, 및 혈청에서 관찰되었으며, 이는 비히클-처리 트위처(twi / twi) 마우스 및 야생형 대조군의 동일한 조직에서 관찰되는 수준보다 더 높았다(도 13A 내지 도 13C).
누적적으로, 데이터는 초기-증상이 있는 트위처 마우스에 대한 rAAVhu68.hGALC의 투여가 덜 심각한 임상 증상, 신경운동 기능장애, PNS 탈수초화, 및 구세포 신경병리와 상관관계가 있는 GALC 활성의 초생리적 수준을 초래한다는 것을 입증하였다.
rAAVhu68.hGALC 투여와 조합한 골수 이식의 효과
이 연구는 rAAVhu68.hGALC와 골수 이식(BMT)의 이중 요법의 잠재적인 이익을 조사하였다. 본 발명자들은 크라베병의 두드러진 신경염증 성분 때문에 이러한 조합 요법을 조사하였다. 이론적으로, HSCT는 (이식된 세포 및 rAAVhu68.hGALC-형질도입된 뉴런에서 유래된 대식세포/미세아교세포 유래) CNS에서 GALC 효소의 추가적인 공급원을 제공하기 때문에 상승 효과가 있는 반면, rAAVhu68.hGALC는 HSCT에 의한 영향을 받지 않는 PNS에 대한 교정을 제공한다. 더욱이, 상이한 병용 치료 설계를 이 연구에서 검사하여, 1) NBS 프로그램을 통해 먼자 HSCT를 받은 다음 유전자 요법을 받은 환자, 및/또는 2) 먼저 유전자 요법을 받은 다음 적격인 경우 HSCT를 받은 환자에서 rAAVhu68.hGALC가 효능적인지 여부를 평가하였다.
병용 요법 연구는 표 2에 요약되어 있다.
Figure pct00009
Figure pct00010
본 발명자들은 병용 요법으로 인한 더 우수한 반응을 예상하기 때문에 1.00×1011개 GC의 rAAVhu68.hGALC 용량을 이용하였으며, 병용 요법은 rAAVhu68.hGALC 단독요법의 이전 연구에서 사용된 것보다 더 낮은 용량의 rAAVhu68.hGALC를 허용한다. 생존, 체중, 및 신경학적 관찰(예를 들어, 진전 및 비정상적인 쥐기 반사)의 관점에서 rAAVhu68.hGALC의 효능을 평가한다.
그룹 1 내지 3에 대한 생존 데이터가 도 14A 내지 도 14B에 도시되어 있다. 지금까지, 가장 우수한 생존은 증상 전 트위처 마우스(twi / twi)를 PND 0에서 rAAVhu68.hGALC를 ICV-투여한 다음 PND 10에 BMT로 치료하는 조합으로 달성되었다(그룹 2). 명백한 징후가 없는 경우 생존은 300일 초과로 연장되었다. 이 마우스는 앞서 기재된 임상 평가(표 1)를 기반으로 더 우수한 신체 상태에 있는 것으로 보이며, 뚜렷한 보행 이상이 없고 잡기가 없는 약간의 진전을 나타낸다(분석이 여전히 진행 중이며; 데이터는 나타내지 않음). rAAVhu68.hGALC 전에 BMT를 받은 마우스(그룹 3)는 현재 여전히 살아있지만(N=3/7), 이들 마우스는 현저한 진전, 일부 보행 이상, 및 더 낮은 체중을 나타낸다. 그러나, BMT와 결합된 부설판 컨디셔닝 요법은 10일령 미만의 마우스에서 독성이 있으며, 그룹 2 및 3 둘 다에서 마우스는 병용 요법의 순서에 관계없이, BMT 전 또는 직후에 사망률 증가를 나타내었다. 그룹 4는 초기 증상이 있는 환자에게 유전자 요법을 투여한 다음 BMT를 수행하는 임상적 관련 상황을 모방하기 위해 주입된다.
누적적으로, 이들 데이터는 rAAVhu68.hGALC 처리를 후속 BMT와 조합하는 것이 크라베병의 뮤린 모델에서 각각의 처리 단독보다 더 많은 효능을 제공할 수 있음을 시사한다.
실시예 3 - 트위처 마우스 모델에서 rAAVhu68.GALC의 최소 유효량(MED)의 확인
비인간 영장류 약리학-독성 연구를 위해 제조된 독성 벡터 로트를 사용하여 트위처 마우스에서 MED 연구를 수행한다. 이 연구는 적어도 2개의 시점을 포함하고 4개의 용량 수준을 평가하여 MED, 약리학, 및 조직병리학(효능 및 안전성)을 결정한다. 파일럿 용량 범위 연구와 인간으로 확장될 때 가능한 최대 용량을 기반으로 용량 수준을 선택하였다. 동물에게 PND 12에 ICV 주사하여 초기 증상이 있는 환자를 모방한다. 일부 동물을 주사하고 1개월 후(비히클 처리가 인도적 종점에 도달한 경우)에 희생시켜 연령이 일치하는 대조군과 비교하여 약리학 및 효능 판독값을 얻는다(연구 3과 유사한 설계). 생존에 대한 치료의 효능을 평가하기 위해 인도적 종점까지 나머지 마우스를 추적한다. 평생 평가(체중, 임상 점수 및 로타로드 분석)를 수행하는 인원은 마우스 처리 및 유전자형에 대해 모른다.
MED는 생존 이익, 임상 점수, 체중, 로타로드 분석을 사용한 신경운동 기능, 표적 기관에서 GALC 활성 수준, 및 CNS 및 PNS에서 신경병리학 교정(즉, 수초화 개선, 공세포 침윤 감소)의 분석에 따라 결정된다.
연구 설계 및 연구 스케줄은 하기 표 3 및 표 4에 제시되어 있다.
Figure pct00011
Figure pct00012
실시예 4 - 크라베 개를 치료하기 위한 AAV-매개 유전자 요법의 효능 - 대조를 통한 rAAVhu68.CB7.CI.cGALCco.rBG의 주사
트위처 마우스는 유익한 질환 모델이지만, 일부 제한을 가진다. 마우스는 뇌 위축의 탈수초화의 더 심각한 CNS 특징을 나타내는 유아 크라베 환자와 구별되는, 단지 경증의 CNS 침범만을 나타낸다. 또한, 마우스의 작은 크기는 실험적인 문제를 제기한다. 마우스의 작은 크기는 의도된 임상 경로(ICM)를 통해 AAV 벡터를 확실하게 주사하는 것을 어렵게 하기 때문에, 마우스에서는 ICV 경로가 사용되어야 한다. 또한 원하는 모든 약리학적 분석에 대해 마우스로부터 충분한 양의 CSF 및 혈액의 연속 샘플을 얻을 수 없다. 따라서 rAAVhu68.GALC를 이용한 처리는, 이러한 기술적 제약을 극복하고 본 발명자들의 치료적 접근법의 확장성을 확인할 수 있는 더 큰 동물인 크라베병의 개 모델에서 평가되었다.
트위처 마우스와 마찬가지로, 크라베 개는 GALC 유전자의 자발적인 A에서 C로의 돌연변이에서 유래하여 미스센스 돌연변이(Y158S)를 유발하는 자연적으로 발생하는 상염색체 열성 질환 모델이다. 돌연변이체 GALC 단백질은 0%에 가까운 잔류 효소 활성을 가지며, 이는 유아 형태의 크라베병이 있는 환자에서 관찰되는 GALC 활성 수준과 유사하다. 이형접합체 개는 증상을 나타내지 않지만, 돌연변이에 대해 동형접합인 개는 이환된다.
크라베 개는 표 5에 요약된 바와 같이 유아 크라베병과 유사한 심각한 표현형을 제시한다. 크라베 개 표현형의 진행은 트위처 마우스보다 특성화가 잘 되어 있지 않지만, 이환된 크라베 개는 CNS 및 말초 신경 둘 다에 영향을 미치는 탈수초화 및 공세포 축적을 나타낸다. 크라베 개는 대략 4 내지 6주령에 뒷다리 약화, 흉부 사지 겨냥이상(dysmetria), 및 진전이 생긴다. 유아 크라베 환자와 마찬가지로, 크라베 개는 증상의 발병 후 일관되고 빠른 신경학적 악화를 나타낸다. 궁극적으로, 이러한 증상은 약 15주령까지 심각한 운동실조, 하지 마비, 소모(wasting), 요실금, 및 감각 결손을 특징으로 하는 인도적 종점으로 진행된다(Fletcher T.F. & Kurtz H.J. (1972) Am J Pathol. 66(2):375-8; Wenger D.A. (2000) Molec Med Today. 6(11):449-451; Bradbury A.M., et al. (2018) Hum Gene Ther. 29(7):785-801).
Figure pct00013
이 연구의 목적은 대형 동물 질환 모델에서 rAAVhu68.hGALC와 유사한 AAV 벡터의 효능을 평가함으로써 본 발명자들의 치료적 접근법의 확장성을 평가하는 것이었다. 이를 달성하기 위해, 본 발명자들은 GALC의 조작된 개 버전을 인코딩하는 rAAVhu68.hGALC와 유사한 벡터(AAVhu68.CB7.CI.cGALCco.rBG)를 의도된 임상 경로(ICM)을 통해 투여한 크라베병의 자연 발생 개 모델을 이용하였다(도 3). GALC의 개 버전은 외래 이식유전자에 대한 과장된 면역 반응의 위험을 제한하기 위해 이식유전자로서 선택되었지만, 벡터의 다른 요소는 rAAVhu68.hGALC(유비쿼터스 CB7 프로모터 및 AAVhu68 캡시드를 포함함)와 동등하다.
연구 설계는 도 23에 제공되어 있다. 2 내지 3 주령에 3.00×1013개 GC(N=4 이환된 개) 용량의 GALC-발현 AAV 벡터 또는 비히클(인공 CSF; N=2 이환된 개; N=1 건강한 야생형 한배 새끼)을 ICM으로 개(총 N=7)에게 주사하였다. rAAVhu68.hGALC가 나중 시점에 처리된 증상이 있는 마우스와 비교하여 증상 전 트위처 마우스에서 더 효과적인 것으로 밝혀졌기 때문에, 행동 증상의 발병 전에 가능한 한 빨리 개가 처리되었음을 보장하기 위해 상기 동물의 연령을 선택하였다(실시예 2 참조).
그룹 지정
Figure pct00014
투약 후, 매일 모니터링하고(케이지 측 관찰), 매주 체중을 측정하였으며, 격주로 비디오 녹화를 하였다. 또한 상기 동물은 뇌 MRI를 받았고, 주기적으로 완전한 신체 검사, 신경학적 검사, 신경 전도 기록, 및 BAER 기록을 받았다. 이러한 검사의 목적은 CNS와 PNS의 무결성을 평가하는 것이었다. 효능 판독값은 뇌 수초화(주사하고 8주 후 MRI, BAER, 및 말단 종점에서 조직학에 의해 평가됨), 말단신경 수초화(말단 종점에서 NCV 및 조직학에 의해 평가됨), 신경학적 겸사, 및 신체 검사(체중, 보행, 반사, 고유수용성감각), 격주로 개방된 공간에서 놀고 있는 개의 비디오 녹화)를 포함하였다. 추가적으로, 주사된 벡터가 rAAVhu68.hGALC와 비슷하고 의도된 임상적 ROA(ICM 투여)가 사용되었기 때문에, 약리학, 안전성, 및 벡터 생체 분포를 평가하였다. 신경 전도 평가는 미엘린 무결성의 간접적인 측정으로서 신경의 무결성을 측정하였다. BAER 기록은, CNS의 청각 경로(즉, 뇌간)에서 전도 및 미엘린 무결성을 테스트하는 것을 제외하고, NCV와 유사하다. 안전성 판독값은 주기적인 세포혈구수(CBC), 혈청 화학, 및 주사 전 제0일, 및 제14일, 제28일, 제56일, 제70일, 제120일, 및 제180일(각각의 시간 ±2일)의 응집을 포함한다. CSF는 또한 안전성 판독값으로서 질환 교정(지질체학, 사이코신 농도) 및 WBC 수(세포증다증)를 조사하기 위해 부피가 허용된 경우 지질체(lipidomic) 바이오마커 분석 및 세포수에 대해 처리되었다. 제56일에, 개를 MRI(T1 및T2-가중)로 검사하여 CMS에서 수초화를 관찰하였다. 하기 나타낸 시점에서 기준선에서 CSF 및 혈청 둘 다에서의 GALC의 효소 활성을 평가하여 CSN 및 PNS에서 분비되는 활성 치료 효소의 양을 측정하였다. 개에서 알려진 크라베병 진행에 상응하는 적절한 시점에서 완전한 데이터를 수집하면서 동물의 진정을 최소화하기 위해 각각의 분석에 대한 연구일을 선택하였다(도 15).
안전성 및 바이오마커 분석을 위해 혈액 및 CSF를 수집하였다. rAAVhu68.hGALC의 투여가 탈수초화 및 신경염증을 감소시키는지 여부를 결정하기 위해 조직병리학을 위해 조직의 포괄적인 목록을 샘플링하였다. rAAVhu68.hGALC의 형질도입 및 발현을 생체분포에 의해 평가하였다. GALC 효소 활성 판독값(도 24B 및 도 24C)은 처리된 모든 크라베 개가 CSF로의 빠른 효소 분비를 가짐을 나타내었다.
증상 전 크라베 개에서, 3.00×1013개 GC로 rAAVhu68.cGALC의 단일 대조 주사는 표현형 교정(도 25E), 생존 증가(도 24A), 신경 전도 정상화(도 25A 내지 도 25D), 정상적인 혈액검사, 및 뇌 MRI 개선(도 29A 및 도 29B)을 제공하였고, 이는 접근법의 확장성을 입증한다. 뇌 조직학은 대조군에 비해 rAAVhu68.cGALC 크라베 개에서 수초화 개선(도 26A) 및 신경염증(소뇌 백색질에서 IBA1 염색)(도 26B) 감소를 나타내었다. 이 연구에서 GALC-발현 벡터 또는 비히클을 처음에 투약한 개 중 어느 것도 이상반응을 일으키지 않았다. rAAVhu68.cGALC를 투여한 크라베 개는 정상적인 성장을 나타내었고(도 27) CSF 세포증다증(도 28A) 및 조직병리학적 병변(도 28B)의 부재를 기반으로 하여 6개월째에 어떠한 독성도 관찰되지 않았다. 뒷다리의 심한 부전마비, 요실금, 머리 진전, 및 보행이 불가한 운동실조를 포함하여, 크라베병 진행으로 인해 비히클-처리 개를 8 및 12주째에 안락사시켜야 했다. 주사하고 45주를 초과하여, 모든 벡터-처리된 개는 밝고, 기민하며, 증상이 없는 것으로 보였고, 모두 크라베 개의 최대 기대 수명이 지나갔다.
연구 스케줄 및 종점은 하기 표 6에 제시되어 있다.
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Figure pct00016
실시예 5 - 비인간 영장류에서의 독성 연구
마우스 MED 연구에서 사용된 것과 동일한 rAAVhu68.hGALC 벡터 로트를 사용하여 독성 연구를 수행하고 이를 NHP에서 수행하는데, 이는 NHP가 인간의 크기와 CNS 해부학을 더 잘 복제하고 임상 ROA(ICM)를 사용하여 처리될 수 있기 때문이다. 크기, 해부학, 및 ROA의 유사성은 대표적인 벡터 분포 및 형질도입 프로파일을 초래하여, 마우스 또는 개에서 가능한 것보다 더 정확한 독성 평가가 가능할 것으로 예상된다. 추가적으로, 설치류 도는 개 모델에서보다 NHP에서 더 엄격한 신경학적 평가를 수행할 수 있어, CNS 독성의 더 민감한 검출을 가능하게 한다.
ICM 벡터 투여는 CSF 구획 내에서 즉각적인 벡터 분포를 초래한다. 용량은 CSF 구획 크기의 근사치를 제공하는 뇌 질량에 따라 조정된다. 용량 변환은 신생 마우스의 경우 0.15g(Gu Z., et al. (2012) PLoS One. 7(7):e41542.), 어린 마우스-성체 마우스의 경우 0.4g(Gu Z., et al. (2012) PLoS One. 7(7):e41542.), 어린 마우스 및 성체 붉은털 원숭이의 경우 90g(Herndon J.G., et al. (1998) Neurobiol Aging. 19(3):267-72), 개의 경우 60g, 4 내지 12개월 유아의 경우 800 h, 및 성인 인간의 경우 1300g(Dekaban A.S. (1978) Ann Neurol. 4(4):345-56)의 뇌 질량을 기반으로 한다. NHP 독성 연구, 뮤린 MED 연구에 대한 용량, 및 동등한 인간 용량은 표 7에 나타낸다.
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제안된 1/2상 연구 모집단과 해부학적으로 유사하도록 질환 표적에 따라 어린 붉은털 원숭이를 선택한다. NHP 독성 연구를 위한 용량은 1/2상 임상 연구에서 사용되니 용량을 반영하며, 1) 약리학 연구 결과 및 2) 약리학 연구의 용량을 NHP 및 인간으로 변환하는 것을 고려하여 선택되며, 이때 가능한 최대 용량을 고려한다.
따라서, 180일 GLP-준수 안전성 연구를 성체 붉은털 원숭이에서 수행하여 ICM 투여 후 rAAVhu68.CB7.CI.cGALCco.rBG(rAAVhu68.hGALC)의 독성을 조사한다. 180일 평가 기간은, ICM AAV 투여 후 분비된 이식유전자 산물이 안정적인 안정기 수준에 도달하는 데 충분한 시간을 가능하게 하기 때문에, 이 평가 기간을 선택하였다. 연구 설계는 표 8 및 표 9에 개괄되어 있다. 어린 붉은털 원숭이(대략 1.5연령)는 총 4.50×1012개 GC 또는 총 1.50×1013개 GC(또는 비히클)를 받는다. 뇌 질량으로 확장될 때(어린 마우스-성체 마우스의 경우 0.4g, 붉은털 원숭이의 경우 90g으로 가정함) MED 연구에서 평가된 것과 동등하도록 용량 수준을 선택한다. 고용량은 크라베 개 모델(뇌 중량을 60g으로 가정함)에서 평가된 용량과 동등하다. 기준 신경학적 검사, 임상 병리학(차이가 있는 세포 수, 임상 화학, 및 응고 패널), CSF 화학, 및 CSF 세포학을 수행한다. 벡터(또는 비히클) 투여 후, 고통 및 비정상적인 행동의 징후에 대해 동물을 매일 모니터링한다.
벡터 또는 비히클을 투여하고 30일 동안 매주, 그 이후에는 30일마다 혈액 및 CSF 임상 병리 평가 및 신경학적 검사를 수행한다. 기준선 및 이후 각각의 30일 시점에서, AAVhu68 및 GALC 산물에 대한 항-AAVhu68 NAb 및 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 인터페론 감마(IFN-γ) 효소-결합 면역점(ELISpot) 분석에 의해 평가한다.
rAAVhu68.hGALC 또는 비히클을 투여하고 90일 또는 180일 후에 동물을 안락사시키고, 포괄적인 현미경 조직병리학적 검사를 위해 조직을 수확한다. 조직병리학적 검사는 CNS 조직(뇌, 척수, 및 배근신경절) 및 간에 초점을 맞추며, 이는 이들이 rAAVhu68 벡터의 ICM 투여 후 가장 많이 형질도입된 조직이기 때문이다. 추가적으로, 전신순환(PBMC), 비장, 및 CNS-배액 림프절로부터 림프구를 수확하여 부검시 이들 기관에서 캡시드 및 이식유전자 산물 둘 다에 대해 반응성인 T 세포의 존을 평가한다. 벡터 생체분포의 추가 분석이 필요한 경우 조직을 수확하고 보관한다.
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실시예 6 - rAAVhu68.hGALC를 이용한 크라베병의 치료
FIH 시험은 GALC 유전자의 동형접합체 또는 복합 이형접합체 돌연변이에 의해 유발된 유아 형태의 크라베병이 있는 소아 환자에서 rAAVhu68.hGALC의 단일 ICM 투여에 대한 1/2상 용량 증량 연구이다. FIH 시험은 2년 동안 추적관찰되는 적어도 12명의 대상체를 등록하고 치료하며, 원고["FDA Guidance for Industry: Long Term Follow-Up after Administration of Human Gene Therapy Products" (July 2018)]에 기재된 아데노바이러스 벡터에 대한 권장 장기 추적(LTFU)에 따라 투약 후 총 5년 동안 LTFU이 지속된다. 주요 목적은 rAAVhu68.hGALC의 안전성 및 내약성을 평가하는 것이다. 이 연구의 이차 목적은 생존, 연령에 적합한 신경인지 측정, 및 연령에 적합한 운동 및/또는 언어 평가를 포함한, 질환-관련 평가에 대한 rAAVhu68.hGALC의 영향을 평가하는 것이다. 이러한 평가변수는 질환 전문가 및 임상의와의 협의 및 치료받지 않은 유아 크라베병 환자의 질환 진행에 대한 관찰을 기반으로 선택된다.
선택적으로, HSCT 및 AAV 유전자 요법의 병용 요법이 평가될 수 있다.
FIH는 유아 형태의 크라베병이 있는 소아 대상체에서 안전성, 내약성, 및 탐색적 효능 평가변수를 평가하기 위한 rAAVhu68.hGALC의 오픈-라벨 다기관 용량 증량 연구이다. 용량 증량 단계는 2가지 용량 수준의 rAAVhu68.hGALC의 단일 ICM 투여의 안전성 및 내약성을 평가하며, 이때 시차를 두고 순차적으로 대상체에게 투약한다. rAAVhu68.hGALC 용량 수준은 GLP NHP 독성 연구 및 뮤린(MED) 연구로부터의 데이터를 기반으로 하여 결정되며, 저용량(코호트 1에 투여됨) 및 고용량(코호트 2에 투여됨)으로 이루어진다. 허용되는 경우 더 높은 용량이 유리할 것으로 예상된다는 점을 포함해서, 두 가지 용량 수준 모두 치료 이익을 부여할 것으로 예상된다. 저용량에 이어 고용량의 순차적인 평가로 테스트된 용량의 최대 내약 용량(MTD)의 확인이 가능하다. 마지막으로, 확장 코호트(코호트 3)는 MTD의 rAAVhu68.hGALC를 받는다(도 16). 벡터의 투여 후(치료 후 1주일) 신속한 GALC 효소 생성은 연장된 치료 시기를 제공한다.
유아 크라베병은 일단 증상이 나타나면 빠른 질환 경과를 특징으로 하고, 일부 신생아가 출생시 질환의 징후를 보인다는 점을 고려할 때, 제안된 연구 설계는 대상체에 대한 조사자의 이익-위험 평가를 기반으로 하여 코호트 1(저용량) 및 코호트 2(고용량)에서 첫 번째 환자에게 투약하고 30일 후에 대상체의 동시 등록을 가능하게 한다. 이에 대한 근거는 환자가 질환 진행을 경험했기 때문에 치료 시기를 놓칠 위험이 다음 환자에게 투약하기 전에 장기간의 안전성 추적의 잠재적 이익보다 클 것이라는 점이다. 환자가 불과 몇 주만에 상당한 질환 진행을 경험하는 이와 같은 시나리오는 뉴욕의 NBS를 통해 확인된 EIKD 환자에서 관찰된 좋지 않은 이식 결과의 가능한 원인으로 인용되었으며(Wasserstein M.P ., et al. (2016) Genet Med. 18(12):1235-1243), 치료를 위해 환자를 신속하게 진료를 받게 할 필요성을 강조한다.
독립적인 안전성 위원회는 두 번째 코호트의 완전한 등록 후 코호트 간에 축적된 모든 안전성 데이터에 대한 안전성 검토를 수행하여 추가 시험 수행에 대하여 권고사항을 제시한다. 안전성 위원회는 또한 안전성 검토 트리거(SRT)가 관찰될 때마다 검토를 수행한다. 각각의 코호트에서 제1 대상체와 제2 대상체 사이의 1개월 투약 간격은 급성 면역 반응, 면역원성 또는 다른 용량-제한 독성을 나타내는 AE의 평가뿐만 아니라, 비임상 연구에서 2 내지 4주 내에 발생하는 DRG의 형질도입에 이차적인 감각 신경병리의 발달을 위한 예상된 시간 경과와 일치하여 나타날 수 있는 임의의 감각 신경병증의 임상 검토를 가능하게 한다.
추가적인 대상체는 MTD를 받는 확장 코호트에 등록된다. 이러한 추가적인 대상체의 등록은 대상체 간의 4주의 관찰 시기를 필요로 하지 않는다(도 16). 선택적으로, 이 코호트는 HSCT 및 rAAVhu68.hGALC를 이용한 병용 치료를 받는다.
모든 치료된 대상체는 안전성 프로파일을 평가하고 rAAVhu68.hGALC의 약력학 및 효능 특성을 특성화하기 위해 2년 동안 추적된다. 대상체는 장기간 임상 결과를 평가하기 위해 연구의 LTFU 기간 동안 추가적인 3년 동안(투약 후 총 5년 동안) 추적되며, 이는 원고["FDA Guidance for Industry: Long Term Follow-Up after Administration of Human Gene Therapy Products" (July 2018)]에 따른다.
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통계학적 방법
안전성 평가를 위한 통계학적 비교는 계획되어 있지 않으며; 모든 결과는 단지 기술적이다. 데이터를 열거하고 요약 표를 생성한다.
2차 및 탐색적 평가변수에 대해 통계학적 비교를 수행한다. 각각의 시점에서의 측정을 각각의 대상체에 대한 기준 값뿐만 아니라, 연령이 일치하는 건강한 대조군 및 각각의 평가변수에 대해 이용 가능한 경우 비슷한 코호트 특징을 가지는 크라베병 환자의 자연사 데이터를 비교한다.
모든 데이터는 주제 데이터 목록에 제시된다. 빈도 및 백분율을 사용하여 카테고리 변수를 요약하고, 기술 통계(비결측 관찰값의 수, 평균, SD, 중앙값, 최소값, 및 최대값)를 사용하여 연속 변수를 요약한다. 그래픽 디스플레이가 적절하게 제시된다.
모집단 근거
연구 모집단 - 소아 환자
FIH는 HSCT가 이러한 환자에 대해 표시되지 않기 때문에 충족되지 않은 요구가 가장 높은 모집단을 나타내는 생후 9개월 이전에 증상 발병이 있는 유아 대상체에 초점을 맞춘다. 또한, 이러한 환자는 운동 및 인지 장애 둘 다의 제시에서 균일한 신속하고 고도로 예측 가능한 쇠퇴와 함께 매우 파괴적인 질환 경과를 가진다(Bascou N., et al. (2018) Orphanet J Rare Dis . 13(1):126). 실제로, 생후 9개월 이전에 증상을 나타내는 환자는 초기 유아 크라베병과 유사한 질환 경과를 가지며, 빠르고 심각한 인지 및 운동 장애 진행이 있고, 질환의 초기 징후 및 증상 이후에 임의의 기능적 기술을 습득하지 못한다. 이들 환자 대부분은 생후 몇 년 이내에 사망할 것으로 예상된다(2년 생존 범위는 26 내지 50%임(Duffner P.K., et al. (2011) Pediatr Neurol. 45(3):141-8; Beltran - Quintero M.L ., et al. (2019) Orphanet J Rare Dis . 14(1):46). 생후 9개월 내지 12개월 사이에 발병한 영아의 표현형은 더 다양하며, 일부는 심각한 초기 유아 크라베병 표현형을 나타내는 한편, 다른 영아는 (거의) 정상적인 인지와 현저하게 더 우수한 적응 및 소근육 기술을 가지는 덜 심각한 질환을 나타내며, 이는 생후 9개월 내지 12개월 사이에 발병한 새로 진단된 환자의 표현형을 예측하기 어렵게 만든다(Bascou N., et al. (2018) Orphanet J Rare Dis . 13(1):126). 결과적으로, 모집단은 예측 가능하고 빠른 감소가 합리적인 추적 관찰 기간 이내에 강력한 연구 설계 및 기능적 결과에 대한 평가를 뒷받침하는 생후 9개월 미만의 증상이 발병한 대상체로 제한된다. 이 그룹의 경우, 치료는 질환 진행을 안정화시키고 후천적 발달 및 운동 단계와 같은 기술의 손실을 방지하고, 생존을 연장하며, 발작의 발생을 지연 또는 방지할 것으로 예상된다.
공유되는 근본적인 병태생리학에도 불구하고, 성인 크라베 표현형 및 질환 경과는 파괴적인 유아 크라베병 형태에서 현저히 더 경증이므로, 성인에서 질환 안정화의 입증은 유아 크라베병의 치료법을 믿을 수 있는 이유를 제공하지 않을 것이다. 중요한 점은, 성인 크라베병 발병은 매우 가변적이며, 진행이 수년에서 수십년에 걸쳐 일어나는 쇠퇴와 함께 더 느리고 더 가변적이라는 점이다(Jardim L.B ., et al. (1999) Arch Neurol . 56(8):1014-7; Debs R., et al. (2013) J Inherit Metab Dis . 36(5):859-68). 장기간의 자연적 과정의 맥락에서 조사 요법의 효능을 명백하게 입증할 수 있는 임상 시험을 설계하는 것은 매우 어려울 것이다. HSCT가 질환 징후를 안정화시키거나 심지어 개선시킬 수 있는 치료 옵션을 제공한다는 사실은 또 다른 중요한 고려사항이다(Sharp M.E ., et al. (2013) JIMD Rep. 10:57-9; Laule C., et al. ( 2018) Journal of Neuroimaging . 28(3):252-255). 마지막으로, NBS는 미국에서 널리 채택되지 않았고 유럽에서 이용 가능하지 않으며, 모호하고 비특이적인 임상 표현은 성인 크라베병이 계속 과소진단되고 따라서 이와 같은 환자에 대한 접근이 극히 드물다는 것을 의미한다(Wasserstein M.P ., et al. (2016) Genet Med . 18(12):1235-1243).
연구 모집단 - 중증 질환이 있는 대상체의 제외
대부분 돌이킬 수 없는 것으로 생각되는 CNS 손상이 있는 크라베병의 특성과 유아 모집단에서 매우 빠른 질환 진행을 고려할 때, rAAVhu68.hGALC는 난청, 실명, 원시반사 상실이 있는 심각한 쇠약을 포함하여 질환의 후기 단계와 특유하게 연관된 징후를 나타내지 않는 질환이 없거나 경증 내지 중등도의 질환을 나타내는 환자에서의 이익에 대하여 가장 큰 가능성을 부여할 것으로 예상된다(Escolar M.L ., et al. (2006) Pediatrics. 118(3):e879 -89). 추가적으로, 비정상적인 동공 반사, 빠른 안구 운동, 또는 시각적 추적 어려움은 중등도의 징후 및 증상이 있는 환자보다 매우 진행된 질환에서 더 일반적이며, 전형적으로 초기 질환 단계에서는 관찰되지 않는다(Escolar M.L ., et al. (2006) Pediatrics. 118(3):e879 -89). 따라서, 이러한 징후 중 하나 초과의 증거는 진행성 질환의 지표이며 시험으로부터의 제외를 초래한다. 중증 장애로 인해, 이러한 환자는 제외되는 낮은 수준의 임상 기능에서 질환의 안정화를 넘어 치료로부터 실질적인 이익을 얻을 가능성이 낮고, 이익/위험 프로파일이 유리하지 않을 것이며, rAAVhu68.hGALC의 효능 평가를 배제할 다양한 임상 및 기구 평가에 대하여 바닥 효과를 나타낼 것이다. 이 모집단은 또한 질환 후유증의 진행 상태로 인해 치료와 관련되지 않은 안전성 문제에 대한 더 높은 위험을 나타낼 수 있으며, 본 시험에서 제외된다.
조사자의 의견에 따라 아동이 진행성 질환의 다른 징후를 가지지 않고 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 낮지 않은 한 임상적 발작이 있는 환자는 시험에서 제외되지 않는다. 이는 1) 발작이 진행성 질환과 특유하게 연관되어 있지 않고, 2) 발작이 시험의 평가변수이고 발작이 있는 환자를 제외하면 발작을 경험할 가능성이 적은 모집단으로 연구가 편향될 수 있기 때문이다.
연구 모집단 - 증상 전 대상체의 포함
증상 전 유아 크라베병 환자는 rAAVhu68.hGALC가 단독으로 평가되는 연구(코호트 1 및 코호트 2)의 용량 증량 부분에서 제외된다. 이러한 환자의 경우, 적어도 미국에서는 HSCT가 질환 진행을 지연시키는 역할만 하더라도 치료 옵션 및 선택 치료로 간주된다. 미국 KOL의 지배적인 의견은 입증되지 않은 연구 요법을 테스트하는 것은 이 잡단에서 비윤리적인 것으로 간주될 수 있다는 것인데, 이는 과도하게 좁은 치료 시기가 환자에게서 적어도 부분적 이익을 제공하는 것으로 밝혀진 치료에 대한 접근을 효과적으로 박탈할 것이기 때문이다(즉, 유전자 요법이 비성공적인 것으로 증명되면 HSCT로 "구제"할 시간이 없을 것임). 따라서, rAAVhu68.hGALC는 가장 명확한 충족되지 않은 필요가 있는 환자(즉, HSCR에 적합하지 않은 징후 및 증상이 있는 유아 크라베병 환자)에 대해서만 예약되어야 한다.
본 발명자들의 전임상 연구는 유전자 요법과 HSCT 조합이 두 가지 접근법 단독에 비해 우수한 효능이 있음을 확인하므로, 따라서 HSCT와 rAAVhu68.hGALC의 병용 요법은 FIH 연구에서 확장 코호트(코호트 3)로서 평가된다. 이 코호트는 HSCT의 맥락에서 rAAVhu68.hGALC의 안전성 및 효능을 평가하고 전임상 데이터가 HSCT 단독에 비해 효능이 개선된 것으로 믿을 만한 이유를 제공하는 경우에만 진행되므로, 본 문서에 개괄된 기준을 충족하는 증상이 있는 환자와 증상 전 환자 둘 다 등록에 적격이다.
연구 모집단 - 하한 연령 제한의 이유
증상 발병이 주산기에, 또는 심지어 자궁 내에서도 일어날 수 있다는 점을 고려하면, 잠재적인 이익을 최대화하기 위해 치료는 가능한 한 빨리 이루어진다. 따라서, 연구의 최소 연령은 적격 환자에서 생후 1개월 이전의 HSCT를 권장하는 현행 합의된 가이드라인에 따라 투약시 생후 1개월인 것으로 선택되었다(Kwon J.M ., et al. (2018) Orphanet J Rare Dis . 13(1):30). 대상체가 생후 1개월 이상인 것을 요구하는 것은 대상체 및 가족이 이 시험에 대한 적격이 있기 전에 다른 형태의 표준 치료(standard-of-care) 치료법을 고려할 수 있게 한다.
하한 연령 제한을 선택함에 있어서 또 다른 고려사항은 치료, 구체적으로 ICM 절차가 이와 같은 어린 환자에서 안전하게 수행될 수 있음을 보장하는 것이다. 생후 1 내지 2주만큼 어린 유아의 영상 스캔을 주의깊게 검토한 후, 치료에 대한 근거가 뒷받침되는 경우, 펜실베이니아 대학교의 전문 중재 방사선전문의가 1개월된 유아에서 CT 유도 ICM 투여를 수행하는 데 특별한 해부학적 문제가 없음을 확인하였다.
평가변수
1차 평가변수로서 안전성 및 내약성을 측정하는 것에 추가적으로, 현재 문헌을 기반으로 하고 크라베병을 전문으로 하는 최고 임상의와 협의하여 이 연구를 위해 2차 및 탐색적 유효성 평가변수를 선택하였다. 이러한 평가변수는 이 모집단에서 의미있는 기능적 및 임상 결과를 입증할 것으로 예상된다. 평가변수는 30일째, 90일째 및 6개월째에 측정한 다음, 2년의 단기 추적 기간 동안 6개월마다 측정하되, 도 18A 내지 도 18C에 제시된 바와 같이 진정 및/또는 요추 천자를 필요로 하는 경우는 제외한다. 장기 연장 단계 동안, 측정 빈도는 12개월에 1번으로 감소된다. rAAVhu68.hGALC의 안전성 및 내약성의 철저한 평가를 용이하게 하기 위해 이 시점을 선택하였다. 치료받지 않은 유아 크라베 환자에서 빠른 질환 진행 속도를 고려하여 초기 시점 및 6개월 간격을 또한 선택하였다. 이는 치료받지 않은 비교 데이터가 존재하는 추적 기간에 걸쳐 치료받은 대상체에서 약력학 및 임상 효능 측정의 철저한 평가를 가능하게 한다. 대상체는 원고["Guidance for Industry: Long Term Follow-Up After Administration of Human Gene Therapy Products"(July 2018)]에 따라 rAAVhu68.hGALC의 투여 후 총 5년 동안 안전성 및 효능에 대해 계속 모니터링된다.
질환 진행 및 임상 결과
유아 모집단에서 질환 진행의 빠르고 균일한 속도를 고려해서(Duffner P.K., et al. (2011) Pediatr Neurol. 45(3):141-8; Bascou N., et al. (2018) Orphanet J Rare Dis . 13(1):126) 1차 결과 평가를 위한 2년의 추적은 시간 경과에 따른 rAAVhu68.hGALC의 영향을 평가하기에 충분한 것으로 간주된다. 추가적으로, 치료 후 5년까지의 LTFU는 장기 결과를 평가하고 치료가 HSCT 후 증상 전 환자에서 관찰된 결과와 유사하거나 더 우수한 기능 수준에서 생존을 연장시키고 환자를 안정화시키는 데 효과적인 경우 매우 유익하다.
rAAVhu68.hGALC의 투여는 생존에 의해 측정된 바와 같이 질환 진행을 안정화시켜, 잠재적으로 새로운 발달단계의 획득을 지지하는 발달 및 운동 단계의 손실, 발작의 개시 및 빈도를 방지한다. 사망은 전형적으로 초기 유아 크라베병으로 진단된 대다수 환자의 경우 생후 첫 3년 내에 일어나며, 7 내지 12개월에 증상이 발병한 환자를 포함하는 후반기 유아 모집단의 중앙 사망률은 5년으로 연장된다(Duffner P.K., et al. (2012) Pediatr Neurol . 46(5):298-306). 포함 기준을 생후 9개월 또는 그 이전에 발병한 환자로 제한함으로써, 모집단은 더 심각하고, 초기 유아형 표현형 및 질환 경과를 가진다(Bascou N., et al. (2018) Orphanet J Rare Dis . 13(1):126). 치료받지 않은 유아 크라베병의 경우에서 볼 수 있는 급속한 감소를 고려할 때, rAAVhu68.hGALC를 이용한 치료는 추적 기간 동안 기대 수명을 연장시킨다. 운동 단계 발달은 대상체 등록 시점의 질환의 단계 및 연령에 따라 다르다(Bascou N., et al. (2018) Orphanet J Rare Dis . 13(1):126; Beltran - Quintero M.L., et al. (2019) Orphanet J Rare Dis . 14(1):46). 표적 모집단에서 질환의 중증도를 고려할 때, 대상체는 등록에 의해 운동 기술을 획득할 수 있거나, 발달된 후 다른 운동 단계를 상실할 수 있거나, 운동 단계 발달의 징후를 아직 나타내지 않았을 수 있다. 따라서 평가는 모든 발달단계에 대하여 성취 연령 및 손실 연령을 추적한다. 운동 단계 달성은 표 11에 개괄된 세계보건기구(WHO) 기준을 기반으로 6개의 총 발달단계에 대해 정의된다.
Figure pct00027
유아 크라베병이 있는 대상체는 생후 처음 몇 주 또는 몇 개월 내에 증상이 발달할 수 있고, 첫 번째 WHO 운동 발달단계(도움없이 앉기)의 획득이 전형적으로 생후 4개월 전에 나타나지 않음(중앙값: 5.9개월)을 고려할 때, 이러한 평가변수는 특히 치료 당시 더 명백한 증상이 있었던 대상체에서 치료 이익의 정도를 평가하기 위한 민감도가 부족할 수 있다. 이러한 이유로, 유아에게 적용할 수 있는 연령에 적절한 발달 단계의 평가도 또한 포함된다(Sharp M.E ., et al. (2013) JIMD Rep. 10:57-9). 한 가지 단점은 공개된 도구가 임상의와 부모가 사용하는 것을 의도하고, 정상 범위를 참조하지 않고 발달단계 획득의 전형적인 연령 주위에 기술을 구성한다는 점이다. 그러나, 데이터는 유아 크라베병이 있는 치료를 받지 않은 아동 또는 신경전형적 아동에서 전형적인 획득 시간과 비교하여 시간 경과에 따른 발달 단계의 유지, 획득, 또는 손실을 요약하는 데 유익할 수 있다.
발작이 유아 모집단에서 나타나는 증상은 아니지만, 유아 환자의 대략 30 내지 60%는 질환의 후기 단계에서 결국 발작을 일으킬 것이다(Duffner P.K ., et al. (2011) Pediatr Neurol . 45(3):141-8). 발작 활동의 발병 지연은 rAAVhu68.hGALC를 이용한 치료가 이 모집단에서 발작의 개시를 방지 또는 지연시킬 수 있는지, 또는 발작 사건의 빈도를 감소시킬 수 있는지 여부를 본 발명자들이 결정할 수 있게 한다. 부모는 발작의 개시, 빈도, 길이 및 유형을 추적하는 발직 일지를 작성하는 것을 요청받는다. 이러한 항복은 각각의 방문시 임상의와 논의되고 임상의에 의해 해석된다.
탐색적 측정으로서, 적응행동, 인지, 언어, 운동 기능, 및 건강-관련 삶의 질에서의 발달 및 변화에 대한 rAAVhu68.hGALC의 효과를 정량화하기 위해 임상 척도가 사용된다. 제안된 각각의 측정은 크라베 모집단 또는 관련 모집단에서 사용되었다.
척도 및 관련 영역은 하기에 간략하게 기재되어 있다:
· 베일리 영유아 발달 검사(III판): 5가지 영역, 즉, 인지, 언어, 운동, 사회-정서, 및 적응행동에 걸쳐 영유아의 발달을 평가한다. 모든 영역은 시험에서 평가된다.
· 바인랜드 적응행동 척도(III판): 5가지 영역, 즉, 의사소통, 일상생활 기술, 사회화, 운동 기술, 및 부적응행동에 걸쳐 출생시부터 성인기(0 내지 90세)까지의 적응행동을 평가한다. v2에서 v3으로의 개선은 발달 장애를 더 잘 이해할 수 있게 하는 질문을 포함한다.
· 피바디 운동발달 척도-2판: 출생시부터 5세의 어린이까지의 밀접한 관계에 있는 운동 기능을 측정한다. 평가는 6개의 영역, 즉, 반사, 정적인 움직임, 이동, 물체 조작, 쥐기, 및 시각-운동 통합에 초점을 둔다.
· 영유아 삶의 질 설문지(ITQOL): 생후 2개월의 영아부터 최대 5세의 토들러에 대해 설계된 건강-관련 삶의 질에 대해 부모가 기록하여 측정한다.
· 조기 학습의 뮬런 척도: 최대 68개월까지 영유아의 언어, 운동, 및 지각 능력을 평가한다.
질환 바이오마커
질환 병리에 대한 rAAVhu68.hGALC의 효과를 평가하기 위해, 수초화의 변화, 수초화와 관련된 기능적 결과, 및 잠재적인 질환 바이오마커를 측정한다. 질환의 주요 특징으로서, 중추 및 말초 탈수초화는 rAAVhu68.hGALC 투여에 의해 진행이 느려지거나 중단된다. 중추 탈수초화는 백색질 영역의 확산-텐서 자기 공명 영상(DT-MRI) 이방성 측정 및 피질척수 운동로의 섬유 추적에 의해 추적되며, 여기서 변화는 질환 상태 및 진행의 지표이다(McGraw P., et al. (2005) Radiology. 236(1):221-30; Escolar M.L., et al. (2009) AJNR Am J Neuroradiol. 30(5):1017-21). 말초 탈수초화는 생물학적으로 활성인 미엘린의 변화를 나타내는 변동(즉, F-파 및 원위 잠복기, 진폭 또는 응답 유무)을 모니터링하기 위한 운동 신경(심비골신경, 경골신경, 및 척골신경) 및 감각 신경(비복신경, 및 정중신경)에 대한 신경 전도 속도(NCV) 연구를 통해 간접적으로 측정된다.
한 연구에 따르면 시각 장애의 발달은 초기 유아 크라베에서 흔하며, 모집단의 61.2%가 질환의 어느 시점에서 시력 손실을 나타낸다(Duffner P.K ., et al. (2011) Pediatr Neurol . 45(3):141-8). 발작과 유사하게, 시력 손실은 일반적으로 나타나는 증상이 아니다. 이는 치료 전에 상당한 시력 손실이 발생하지 않은 대상체에 대해 시력 손실을 지연 또는 예방하는 rAAVhu68.hGALC의 능력을 평가할 기회를 제공한다. 따라서, 시각적 유발 전위(VEP)의 측정은 중심 시력 장애 또는 손실의 지표로서 시각 자극에 대한 반응을 객관적으로 측정하는 데 사용된다. 청력 손실은 또한 질환 진행 동안에 일반적으로 발생하며 청력 이상의 초기 징후는 뇌간 청력 유발 반응(BAER) 테스트를 통해 측정된다.
GALC는 사이코신의 가수분해를 담당한다. 크라베병에서 GALC의 결핍은 중추 및 말초 둘 다에서 사이코신의 축적을 초래한다. 사이코신의 수준 증가는 크라베병의 지표로서 제안되어 왔다(Escolar M.L ., et al. (2017) Mol Genet Metab . 121(3):271-278). 유아 크라베의 초기 및 중증 사례의 탐지에서 이의 용도를 뒷받침하는 증거가 있지만, 사이코신 수준은 또한 말기 질환에서 감소할 수 있기 때문에, 치료 후 시간 경과에 따른 사이코신 수준의 변동을 해석하는 것은 어려울 수 있다. 따라서, 사이코신 수준의 감소 증거만으로는 임상적 질환 안정화가 동반되지 않는 한, 치료 효과의 충분한 증거가 되지 않을 것이다.
(서열목록 자유 텍스트)
숫자 식별자 <223> 하에서 자유 텍스트를 포함하는 서열에 대해 하기 정보가 제공된다.
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Figure pct00029
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Figure pct00031
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SEQUENCE LISTING <110> The Trustees of the University of Pennsylvania <120> COMPOSITIONS USEFUL IN TREATMENT OF KRABBE DISEASE <130> 18-8584PCT <140> PCT/US2020/019794 <141> 2020-02-26 <150> US 62/810,708 <151> 2019-02-26 <150> US 62/817,482 <151> 2019-03-12 <150> US 62/877,707 <151> 2019-07-23 <150> US 62/916,652 <151> 2019-10-17 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2211 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAVhu68 vp1 capsid <220> <221> CDS <222> (1)..(2211) <400> 1 atg gct gcc gat ggt tat ctt cca gat tgg ctc gag gac aac ctc agt 48 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 gaa ggc att cgc gag tgg tgg gct ttg aaa cct gga gcc cct caa ccc 96 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 aag gca aat caa caa cat caa gac aac gct cgg ggt ctt gtg ctt ccg 144 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 ggt tac aaa tac ctt gga ccc ggc aac gga ctc gac aag ggg gag ccg 192 Gly Tyr Lys 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Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 ctt ggt ctg gtt gag gaa gcg gct aag acg gct cct gga aag aag agg 432 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 cct gta gag cag tct cct cag gaa ccg gac tcc tcc gcg ggt att ggc 480 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 aaa tcg ggt gca cag ccc gct aaa aag aga ctc aat ttc ggt cag act 528 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 ggc gac aca gag tca gtc cca gac cct caa cca atc gga gaa cct ccc 576 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 gca gcc ccc tca ggt gtg gga tct ctt aca atg gct tca ggt ggt ggc 624 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 gca cca gtg gca gac aat aac gaa ggt gcc gat gga gtg ggt agt tcc 672 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 tcg gga aat tgg cat tgc gat tcc caa tgg ctg ggg gac aga gtc atc 720 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 acc acc agc acc cga acc tgg gcc ctg ccc acc tac aac aat cac ctc 768 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 tac aag caa atc tcc aac agc aca tct gga gga tct tca aat gac aac 816 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 gcc tac ttc ggc tac agc acc ccc tgg ggg tat ttt gac ttc aac aga 864 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 ttc cac tgc cac ttc tca cca cgt gac tgg cag cga ctc atc aac aac 912 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 aac tgg gga ttc cgg cct aag cga ctc aac ttc aag ctc ttc aac att 960 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 cag gtc aaa gag gtt acg gac aac aat gga gtc aag acc atc gcc aat 1008 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 aac ctt acc agc acg gtc cag gtc ttc acg gac tca gac tat cag ctc 1056 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 ccg tac gtg ctc ggg tcg gct cac gag ggc tgc ctc ccg ccg ttc cca 1104 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 gcg gac gtt ttc atg att cct cag tac ggg tat ctg acg ctt aat gat 1152 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 gga agc cag gcc gtg ggt cgt tcg tcc ttt tac tgc ctg gaa tat ttc 1200 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 ccg tcg caa atg cta aga acg ggt aac aac ttc cag ttc agc tac gag 1248 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 ttt gag aac gta cct ttc cat agc agc tac gct cac agc caa agc ctg 1296 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 gac cga cta atg aat cca ctc atc gac caa tac ttg tac tat ctc tca 1344 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 aag act att aac ggt tct gga cag aat caa caa acg cta aaa ttc agt 1392 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 gtg gcc gga ccc agc aac atg gct gtc cag gga aga aac tac ata cct 1440 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 gga ccc agc tac cga caa caa cgt gtc tca acc act gtg act caa aac 1488 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 aac aac agc gaa ttt gct tgg cct gga gct tct tct tgg gct ctc aat 1536 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 gga cgt aat agc ttg atg aat cct gga cct gct atg gcc agc cac aaa 1584 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 gaa gga gag gac cgt ttc ttt cct ttg tct gga tct tta att ttt ggc 1632 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 aaa caa gga act gga aga gac aac gtg gat gcg gac aaa gtc atg ata 1680 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 acc aac gaa gaa gaa att aaa act act aac ccg gta gca acg gag tcc 1728 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 tat gga caa gtg gcc aca aac cac cag agt gcc caa gca cag gcg cag 1776 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 acc ggc tgg gtt caa aac caa gga ata ctt ccg ggt atg gtt tgg cag 1824 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 gac aga gat gtg tac ctg caa gga ccc att tgg gcc aaa att cct cac 1872 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 acg gac ggc aac ttt cac cct tct ccg ctg atg gga ggg ttt gga atg 1920 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 aag cac ccg cct cct cag atc ctc atc aaa aac aca cct gta cct gcg 1968 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 gat cct cca acg gcc ttc aac aag gac aag ctg aac tct ttc atc acc 2016 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe 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tat atc aat ggc tat atg act tcc aca 912 Gly Arg Ile Leu Asn Gln Asn Tyr Ile Asn Gly Tyr Met Thr Ser Thr 290 295 300 atc gca tgg aat tta gtg gct agt tac tat gaa cag ttg cct tat ggg 960 Ile Ala Trp Asn Leu Val Ala Ser Tyr Tyr Glu Gln Leu Pro Tyr Gly 305 310 315 320 aga tgc ggg ttg atg acg gcc cag gag cca tgg agt ggg cac tac gtg 1008 Arg Cys Gly Leu Met Thr Ala Gln Glu Pro Trp Ser Gly His Tyr Val 325 330 335 gta gaa tct cct gtc tgg gta tca gct cat acc act cag ttt act caa 1056 Val Glu Ser Pro Val Trp Val Ser Ala His Thr Thr Gln Phe Thr Gln 340 345 350 cct ggc tgg tat tac ctg aag aca gtt ggc cat tta gag aaa gga gga 1104 Pro Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Thr Val Gly His Leu Glu Lys Gly Gly 355 360 365 agc tac gta gct ctg act gat ggc tta ggg aac ctc acc atc atc att 1152 Ser Tyr Val Ala Leu Thr Asp Gly Leu Gly Asn Leu Thr Ile Ile Ile 370 375 380 gaa acc atg agt cat aaa cat tct aag tgc ata cgg cca ttt ctt cct 1200 Glu Thr Met Ser His Lys His Ser Lys Cys Ile Arg Pro Phe Leu Pro 385 390 395 400 tat ttc aat gtg tca caa caa ttt gcc acc ttt gtt ctt aag gga tct 1248 Tyr Phe Asn Val Ser Gln Gln Phe Ala Thr Phe Val Leu Lys Gly Ser 405 410 415 ttt agt gaa ata cca gag cta cag gta tgg tat acc aaa ctt gga aaa 1296 Phe Ser Glu Ile Pro Glu Leu Gln Val Trp Tyr Thr Lys Leu Gly Lys 420 425 430 aca tcc gaa aga ttt ctt ttt aag cag ctg gat tct cta tgg ctc ctt 1344 Thr Ser Glu Arg Phe Leu Phe Lys Gln Leu Asp Ser Leu Trp Leu Leu 435 440 445 gac agc gat ggc agt ttc aca ctg agc ctg cat gaa gat gag ctg ttc 1392 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Thr Leu Ser Leu His Glu Asp Glu Leu Phe 450 455 460 aca ctc acc act ctc acc act ggt cgc aaa ggc agc tac ccg ctt cct 1440 Thr Leu Thr Thr Leu Thr Thr Gly Arg Lys Gly Ser Tyr Pro Leu Pro 465 470 475 480 cca aaa tcc cag ccc ttc cca agt acc tat aag gat gat ttc aat gtt 1488 Pro Lys Ser Gln Pro Phe Pro Ser Thr Tyr Lys Asp Asp Phe Asn Val 485 490 495 gat tac cca ttt ttt agt gaa gct cca aac ttt gct gat caa act ggt 1536 Asp Tyr Pro Phe Phe Ser Glu Ala Pro Asn Phe Ala Asp Gln Thr Gly 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acgtattagt catcgctatt ac 382 <210> 13 <211> 282 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> CB promoter <400> 13 tggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc tccccacccc 60 caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg gggggggggg 120 gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag 180 gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc 240 ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc gg 282 <210> 14 <211> 666 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> CB7 promoter <400> 14 ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 acgtattagt catcgctatt accatggtcg aggtgagccc 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aactccaaga ggacgagatc ttcaccctga ccacactgac 3300 cgtgggcagc aagggatctt accctctgcc tcctaagagc gagccctttc cacagatcta 3360 cgaggacgac ttcgacgtgg actacccatt ctttagcgag gcccctaact tcgccgatca 3420 gaccggcgtg ttcgagtact tcaccaacat cgaggacccc ggcgagcaca ggtttaccct 3480 gagacaggtg ctgaaccagc ggcctattac ctgggccgct gacgcctaca acaccatctc 3540 tatcatcggc gactacaagt ggtccaacct gaccgtcaga tgcgacgtgt acatcgagac 3600 acccgagaaa ggcggagtgt ttatcgccgg cagagtgaac aaaggcggca tcctgatcag 3660 aagcgccagg ggaatcttct tctggatctt cgccaacggc acctacagag tgacaggcga 3720 tctggccgga tgggtcatct atgccctggg aagagtggac gtgaccgcca agaagtggta 3780 cactctgacc ctgatcatca agggcagact gagcagcggc atgctgaatg gcaagaccgt 3840 gtggaagaac atccccgtgt ctttccccaa aaacggctgg gccgccatcg gaacccacag 3900 cttcgaattt gcccagttcg acaactttca cgtggaagcc accagatgat aacctcaggc 3960 tcgaggacgg ggtgaactac gcctgaggat ccgatctttt tccctctgcc aaaaattatg 4020 gggacatcat gaagcccctt gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca 4080 ttgcaatagt gtgttggaat 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agc cag agc ctg gac 1296 Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp 420 425 430 cgg ctg atg aat cct ctc atc gac caa tac ctg tat tac ctg aac aga 1344 Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg 435 440 445 act caa aat cag tcc gga agt gcc caa aac aag gac ttg ctg ttt agc 1392 Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Ser 450 455 460 cgt ggg tct cca gct ggc atg tct gtt cag ccc aaa aac tgg cta cct 1440 Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu Pro 465 470 475 480 gga ccc tgt tat cgg cag cag cgc gtt tct aaa aca aaa aca gac aac 1488 Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn 485 490 495 aac aac agc aat ttt acc tgg act ggt gct tca aaa tat aac ctc aat 1536 Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu Asn 500 505 510 ggg cgt gaa tcc atc atc aac cct ggc act gct atg gcc tca cac aaa 1584 Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 gac gac gaa gac aag ttc 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ggg gaa tac aga acc acc aga cct atc gga acc cga tac ctt 2160 Ser Thr Gly Glu Tyr Arg Thr Thr Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu 705 710 715 720 acc cga ccc ctt 2172 Thr Arg Pro Leu <210> 23 <211> 724 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 Met Ser Phe Val Asp His Pro Pro Asp Trp Leu Glu Glu Val Gly Glu 1 5 10 15 Gly Leu Arg Glu Phe Leu Gly Leu Glu Ala Gly Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Pro Asn Gln Gln His Gln Asp Gln Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly 35 40 45 Tyr Asn Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Arg Gly Glu Pro Val 50 55 60 Asn Arg Ala Asp Glu Val Ala Arg Glu His Asp Ile Ser Tyr Asn Glu 65 70 75 80 Gln Leu Glu Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp 85 90 95 Ala Glu Phe Gln Glu Lys Leu Ala Asp Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn 100 105 110 Leu Gly Lys Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Phe 115 120 125 Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Thr Gly Lys Arg Ile 130 135 140 Asp Asp His Phe Pro Lys Arg Lys Lys Ala Arg Thr Glu Glu 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Gly Tyr 355 360 365 Ala Thr Leu Asn Arg Asp Asn Thr Glu Asn Pro Thr Glu Arg Ser Ser 370 375 380 Phe Phe Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn 385 390 395 400 Asn Phe Glu Phe Thr Tyr Asn Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser 405 410 415 Phe Ala Pro Ser Gln Asn Leu Phe Lys Leu Ala Asn Pro Leu Val Asp 420 425 430 Gln Tyr Leu Tyr Arg Phe Val Ser Thr Asn Asn Thr Gly Gly Val Gln 435 440 445 Phe Asn Lys Asn Leu Ala Gly Arg Tyr Ala Asn Thr Tyr Lys Asn Trp 450 455 460 Phe Pro Gly Pro Met Gly Arg Thr Gln Gly Trp Asn Leu Gly Ser Gly 465 470 475 480 Val Asn Arg Ala Ser Val Ser Ala Phe Ala Thr Thr Asn Arg Met Glu 485 490 495 Leu Glu Gly Ala Ser Tyr Gln Val Pro Pro Gln Pro Asn Gly Met Thr 500 505 510 Asn Asn Leu Gln Gly Ser Asn Thr Tyr Ala Leu Glu Asn Thr Met Ile 515 520 525 Phe Asn Ser Gln Pro Ala Asn Pro Gly Thr Thr Ala Thr Tyr Leu Glu 530 535 540 Gly Asn Met Leu Ile Thr Ser Glu Ser Glu Thr Gln Pro Val Asn Arg 545 550 555 560 Val Ala Tyr Asn Val Gly Gly Gln Met Ala Thr Asn Asn Gln Ser Ser 565 570 575 Thr Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Leu Gln Glu Ile Val Pro 580 585 590 Gly Ser Val Trp Met Glu Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp 595 600 605 Ala Lys Ile Pro Glu Thr Gly Ala His Phe His Pro Ser Pro Ala Met 610 615 620 Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Met Met Leu Ile Lys Asn 625 630 635 640 Thr Pro Val Pro Gly Asn Ile Thr Ser Phe Ser Asp Val Pro Val Ser 645 650 655 Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Glu Met Glu 660 665 670 Trp Glu Leu Lys Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln 675 680 685 Tyr Thr Asn Asn Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Val Asp Phe Ala Pro Asp 690 695 700 Ser Thr Gly Glu Tyr Arg Thr Thr Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu 705 710 715 720 Thr Arg Pro Leu <210> 24 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> AAV3B VP1 Capsid <400> 24 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Val Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Arg Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr 435 440 445 Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser 450 455 460 Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro 465 470 475 480 Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln 565 570 575 Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr 580 585 590 Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 25 <211> 1227 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> UbC promoter <400> 25 ggcctccgcg ccgggttttg gcgcctcccg cgggcgcccc cctcctcacg gcgagcgctg 60 ccacgtcaga cgaagggcgc aggagcgtcc tgatccttcc gcccggacgc tcaggacagc 120 ggcccgctgc tcataagact cggccttaga accccagtat cagcagaagg acattttagg 180 acgggacttg ggtgactcta gggcactggt tttctttcca gagagcggaa caggcgagga 240 aaagtagtcc cttctcggcg attctgcgga gggatctccg tggggcggtg aacgccgatg 300 attatataag gacgcgccgg gtgtggcaca gctagttccg tcgcagccgg gatttgggtc 360 gcggttcttg tttgtggatc gctgtgatcg tcacttggtg agtagcgggc tgctgggctg 420 gccggggctt tcgtggccgc cgggccgctc ggtgggacgg aagcgtgtgg agagaccgcc 480 aagggctgta 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Claims (55)

  1. 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)를 포함하는 조성물로서, 상기 rAAV는,
    (a) 중추신경계에서 세포를 표적화하는 AAV 캡시드; 및
    (b) (i) 단백질의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어 하에 신호 펩타이드 및 적어도 서열번호 10의 aa 43번 내지 685번의 아미노산 서열을 가지는 성숙한 인간 갈락토실세라미다제 단백질을 인코딩하는 갈락토실세라미다제 코딩 서열, 및 (ii) AAV 캡시드에 벡터 게놈을 패키징하는 데 필요한 AAV 반전 말단 반복부를 포함하는 벡터 게놈
    을 포함하되, 상기 벡터 게놈은 상기 AAV 캡시드에 패키징되는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 AAV 캡시드는 AAVhu68 캡시드인, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 코딩 서열은 전장 인간 갈락토실세라미다제 신호 펩타이드 및 서열번호 10의 성숙한 인간 갈락토실세라미다제 단백질(아미노산 1번 내지 685번)을 인코딩하는, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코딩 서열은 외인성 펩타이드 코딩 서열의 핵산 서열 및 서열번호 9의 뉴클레오타이드 127번 내지 2055번 또는 이와 95% 내지 99.9% 동일한 서열, 또는 서열번호 9의 뉴클레오타이드 1번 내지 2055번의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 95% 내지 99.9% 동일한 서열을 가지는, 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 코딩 서열은 서열번호 10의 성숙한 인간 갈락토실세라미다제 단백질(아미노산 43번 내지 685번) 및 중추신경계에서 인간 세포에 적합한 외인성 신호 펩타이드를 인코딩하는, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절 서열은 베타-액틴 프로모터, 인트론, 및 토끼 글로빈 폴리A를 포함하는, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절 서열은 서열번호 13을 포함하는, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절 서열은 서열번호 15를 포함하는, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절 서열은 서열번호 16을 포함하는, 조성물.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 벡터 게놈은 서열번호 19의 nt 198번 내지 4168번의 서열을 가지는 CB7.CI.hGALC.RBG를 포함하는, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 게놈은 AAV2의 5' ITR, 코딩 서열, 조절 서열, 및 AAV2의 3' ITR을 추가로 포함하는, 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 환자에의 척수강내 전달에 적합한 수성 액체를 추가로 포함하는, 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 인공 뇌척수액 및 계면활성제를 포함하는, 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 척수강내 전달용으로 제형화되고 1.4×1013 내지 4×1014개 GC의 rAAV를 포함하는, 조성물.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 대조내 전달용으로 제형화되고 1.4×1013 내지 4×1014개 GC의 rAAV를 포함하는, 조성물.
  16. 재조합 아데노-연관 바이러스로서, (a) 중추신경계에서 세포를 표적화하는 AAV 캡시드; 및 (b) (i) 신호 펩타이드 및 신호 펩타이드의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어 하에 서열번호 10의 aa 43번 내지 685번의 아미노산 서열을 가지는 성숙한 인간 갈락토실세라미다제 단백질을 인코딩하는 갈락토실세라미다제 코딩 서열, 및 (ii) AAV 캡시드에 벡터 게놈을 패키징하는 데 필요한 AAV 반전 말단 반복부를 포함하는 벡터 게놈을 포함하되, 상기 벡터 게놈은 상기 AAV 캡시드에 패키징되는, 재조합 아데노-연관 바이러스.
  17. 제16항에 있어서, 상기 AAV 캡시드는 AAVhu68 캡시드인, rAAV.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 코딩 서열은 외인성 신호 펩타이드 코딩 서열 및 서열번호 9의 뉴클레오타이드 127번 내지 2055번 또는 이와 95% 내지 99.9% 동일한 서열, 또는 서열번호 9의 뉴클레오타이드 1번 내지 2055번의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 95% 내지 99.9% 동일한 서열을 가지는, rAAV.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코딩 서열은 서열번호 10의 아미노산 43번 내지 685번의 성숙한 단백질 및 외인성 신호 펩타이드를 인코딩하는, rAAV.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절 서열은 닭 베타-액틴 프로모터, 인트론, 및 토끼 글로빈 폴리A를 포함하는, rAAV.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절 서열은 서열번호 13을 포함하는, rAAV.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절 서열은 서열번호 15를 포함하는, rAAV.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절 서열은 서열번호 16을 포함하는, rAAV.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 게놈은 서열번호 19의 nt 198번 내지 4168번의 서열을 가지는 CB7.CI.hGALC.RBG를 포함하는, rAAV.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 게놈은 AAV2의 5' ITR, 코딩 서열, 조절 서열, 및 AAV2의 3' ITR을 포함하는, rAAV.
  26. AAVhu68 캡시드 및 CB7.CI.hGALC.RBG 벡터 게놈을 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스.
  27. 조성물로서, 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)의 스톡을 포함하되, 크라베병의 치료에 유용한, 조성물.
  28. 약제의 제조에 있어서의, 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)의 스톡을 포함하는 조성물의 용도.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 조성물은 말초 신경의 기능장애의 치료 및/또는 크라베병의 치료에 유용한, 조성물 또는 용도.
  30. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 rAAV는 조혈모세포 요법 또는 골수 이식과의 병용 요법으로서 투여 가능한, 조성물 또는 용도.
  31. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 rAAV는 기질 감소 요법에 대한 공동 요법으로서 투여 가능한, 조성물 또는 용도.
  32. 플라스미드로서, 신호 펩타이드 및 서열번호 10의 아미노산 43번 내지 685번의 아미노산 서열을 가지는 성숙한 인간 갈락토실세라미다제 단백질을 인코딩하는 갈락토실세라미다제 코딩 서열을 포함하는, 플라스미드.
  33. 제32항에 있어서, 상기 코딩 서열은 서열번호 9의 핵산 서열 또는 이와 95% 내지 99.9% 동일한 서열을 가지는, 플라스미드.
  34. 크라베병을 치료하는 방법으로서, 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)의 스톡을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 rAAV는 (a) 중추신경계에서 세포를 표적화하는 AAV 캡시드; 및 (b) 신호 펩타이드 및 단백질의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어 하에 서열번호 10의 아미노산 43번 내지 685번의 아미노산 서열을 가지는 성숙한 인간 갈락토실세라미다제 단백질을 인코딩하는 갈락토실세라미다제 코딩 서열을 포함하는 벡터 게놈을 포함하고, 상기 벡터 게놈은 상기 AAV 캡시드에 벡터 게놈을 패키징하는 데 필요한 AAV 반전 말단 반복부를 추가로 포함하며, 상기 벡터 게놈은 상기 AAV 캡시드에 패키징되는, 방법.
  35. 크라베병에 의해 유발되는 호흡부전 및 운동 기능 상실을 유발하는 말초 신경의 기능장애를 교정하는 방법으로서, 상기 방법은 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)의 스톡을 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 rAAV는 (a) 중추신경계에서 세포를 표적화하는 AAV 캡시드; 및 (b) 신호 펩타이드 및 단백질의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어 하에 서열번호 10의 아미노산 43번 내지 685번의 아미노산 서열을 가지는 성숙한 인간 갈락토실세라미다제 단백질을 인코딩하는 갈락토실세라미다제 코딩 서열을 포함하는 벡터 게놈을 포함하며, 상기 벡터 게놈은 상기 AAV 캡시드에 상기 벡터 게놈을 패키징하는 데 필요한 AAV 반전 말단 반복부를 추가로 포함하고, 상기 벡터 게놈은 상기 AAV 캡시드에 패키징되는, 방법.
  36. 크라베병에 의해 유발되는 발작의 개시 또는 빈도를 지연시키는 방법으로서, 상기 방법은 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)의 스톡을 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 rAAV는 (a) 중추신경계에서 세포를 표적화하는 AAV 캡시드; 및 (b) 신호 펩타이드 및 단백질의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어 하에 서열번호 10의 아미노산 43번 내지 685번의 아미노산 서열을 가지는 성숙한 인간 갈락토실세라미다제 단백질을 인코딩하는 갈락토실세라미다제 코딩 서열을 포함하는 벡터 게놈을 포함하며, 상기 벡터 게놈은 상기 AAV 캡시드에 상기 벡터 게놈을 패키징하는 데 필요한 AAV 반전 말단 반복부를 추가로 포함하고, 상기 벡터 게놈은 상기 AAV 캡시드에 패키징되는, 방법.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 초기 유아 크라베병(EIKD)을 가지는, 방법.
  38. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 후반기 유아 크라베병(LIKD)을 가지는, 방법.
  39. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 소아 크라베병(JKD)을 가지는, 방법.
  40. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 청소년/성인 발병 크라베병을 가지는, 방법.
  41. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 캡시드는 AAVhu68 캡시드인, 방법.
  42. 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코딩 서열은 외인성 펩타이드 코딩 서열 및 서열번호 9의 뉴클레오타이드 127번 내지 2055번 또는 이와 95% 내지 99.9% 동일한 서열, 또는 서열번호 9의 뉴클레오타이드 1번 내지 2055번의 뉴클레오타이드 서열 또는 이와 95% 내지 99.9% 동일한 서열을 가지는, 방법.
  43. 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코딩 서열은 서열번호 10의 아미노산 43번 내지 685번의 성숙한 인간 갈락토실세라미다제 단백질 및 외인성 신호 펩타이드를 인코딩하는, 방법.
  44. 제34항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절 서열은 베타-액틴 프로모터, 인트론 및 토끼 글로빈 폴리A를 포함하는, 방법.
  45. 제34항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV는 조혈모세포 이식(HSCT) 또는 골수 이식에 대한 공동 요법으로서 투여되는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 HSCT 또는 골수 이식은 rAAV 투여의 투여 전에 수행되는, 방법.
  47. 제34항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV는 기질 감소 요법에 대한 공동 요법으로서 투여되는, 방법.
  48. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 척수강내, 측뇌실내, 또는 뇌실질내 투여용으로 제형화되는, 조성물.
  49. 제34항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV는 척수강내, 측뇌실내, 또는 뇌실질내 투여를 통해 전달되는, 방법.
  50. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 대조(대조내)로의 전산화 단층촬영-(CT-) 유도 후두하 주사를 통해 단일 용량으로의 투여용으로 제형화되는, 조성물.
  51. 제34항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 대조(대조내)로의 전산화 단층촬영-(CT-) 유도 후두하 주사를 통해 단일 용량으로 투여되는, 방법.
  52. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 1×1010개 GC/뇌 질량 g 내지 5×1011개 GC/뇌 질량 g 용량의 rAAV의 척수강내 투여용으로 제형화되는, 방법.
  53. 제34항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 1×1010개 GC/뇌 질량 g 내지 5×1011개 GC/뇌 질량 g 용량의 rAAV로 척수강내로 투여되는, 방법.
  54. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 1.4×1013 내지 4×1014개 GC 용량의 rAAV의 투여용으로 제형화되는, 조성물.
  55. 제34항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 인간 환자에게 투여되고 1.4×1013 내지 4×1014개 GC 용량의 rAAV가 투여되는, 방법.
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