JPS62188963A - 液体クロマトグラフイ−用移動相および蛋白質精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に
関する。一層特定的には、本発明は蛋白質の回収に特に
適している逆相ＨＰＬＣで用いるための移動相に関する
。

（従来の技術と発明が解決しようとする問題点）ＨＰＬ
Ｃは生物生産物を高純度で回収するための分析及び分取
の両方の技術において有効な手段として確立されている
。結合された保持体（例えばＣ１８−シリカ）を備えた
逆相ＨＰＬＣは高度に極性の溶質にたいして最適である
。逆相ＨＰＬＣは一般的には非極性保持体と共に極性溶
離液の使用を伴う。高度に極性の溶質はその保持体よυ
はその溶離液にたいして大きな親和力を持ちそれで醪Ｉ
Ｘは極性の逆の順序で溶離される。

蛋白質のような高分子量生物分子は複雑な三次元構造を
持ち、この構造はサンプルの生物機能を維持するように
保存されなければならない。逆相クロマトグラフ分離に
おいては、最適の分離は保持体の炭化水素基と蛋白質分
子上の疎水性表面特性との間の相互作用を伴う。それゆ
えに疎水性カラムでの蛋白質混合物の分離は個々の蚕白
質種の固有の位相的特質に関連し、一層低く又は一層小
さく接近できる疎水性表面部分の成分が最初に溶離され
ることとなる。この分離機構の故に、　ＨＰＬＣは高度
に分離的なりロフトグラフ法である。諸蛋白質間の僅か
の組成的な差異でさえも位相的差異に導き、この位相的
差異は有効な分離に帰着することができる。例えば、ツ
タのインシュリン及びヒトのインシュリンは、その２つ
の分子はたった一つのアミノ酸残基において小さな差異
を持つにすぎないが、ＨＰＬＣによって容易に分離され
る。

目標の蛋白質分子と逆相カラムとの間の疎水的相互作用
は注意深く調節されなければならない。

もしも蛋白質分子がクロマトグラフ媒質中で有意に不安
定にされるならば、蛋白質分子の三次元構造の変性はお
おい隠されていた疎水性基を露出させることがあ夛、こ
のことは逆相カラムとの追加の疎水的相互作用に導きそ
して蛋白質の溶離を妨げることもある。溶質と固定相と
の間の上記のような増加した相互作用は、溶質の不可逆
的多部位結合に起因して蛋白質分子の変性及び／又は低
い回収率に導くことができる。現在用いられている移動
相は蛋白質サンプルをしばしば不安定にし、それで高い
収率での分取分離は見込まれない。加えて、逆相カラム
によって保持されているポリペプチドサンプルを溶離す
るためにアセトニトリルのような溶剤が広く用いられて
いる。そのような溶剤は極めて毒性であるので、分取分
離には用いることができない。

蛋白質の逆相クロマトグラフィーにおいては、アクリロ
ニトリル、イソプロパツール又はグロパノールの諸溶媒
が広く用いられている。燐酸とアミンと過弗素化カルボ
ン酸、特にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、との混合物は
移動相に添加すべきイオン性変性剤として一般の評判が
よい。分析ＨＰＬＣにおいてはこれらの溶剤及びＭ＠液
系は許容されるが、分取りロマトグラフィーにおいては
溶剤及びイオン性変性剤は非青性で且つ容易に除去され
なければならず、それでこの理由で分析の場合の試薬の
あるものは適さない。

分取ＨＰＬＣで用いるための移動相は、蛋白質を変性し
ないように蛋白質にたいして温和でなければならず又保
持体にたいして不活性でなければならない。保持体にた
いする損傷は保持体自体に関して固有的に不利益である
ばかりでなく、例えば製薬用途に用いられるかもしれな
い蛋白質にとっては許容されない毒性副生物を作ること
もあシ得る。

本発明の目的はこれらの不利益を避けること又はこれら
の切実な要求を成就することにたいして何とか成功する
こと、又は少なくとも、有用な選択を社会に提供するこ
とである。

（問題点′Ｉ！ｉ″解決するための手段および作用効果
）構造式ＹＣＯＯＨ（式中、Ｙは珪素質保持体中のシラ
ノール基を水素結合することのできる極性電子吸引基で
ある）で表される生理学的カルボン酸を選択すると、こ
れらの切実な要求を成就するのに何とか成功することが
予想外にも見出だされた。

好ましい生理学的カルボン酸は解糖系又はクエン酸回路
のような生化学経路で生体内に存在するカルボン酸であ
る。これらの酸は天然産のものであシそれで製薬用途に
適しているだけでなく、予想外にもこれらの酸は（固定
相と溶質との間の望ましくない相互作用を調節するよう
に）生蛋白質構造の安定化を可能にし並びに一層温和な
りロマトグラフ条件下での蛋白質サンプルの溶離を可能
にする。蛋白質構造の安定化（及びそのことによシ、逆
相との疎水的接触の数を制限すること）の故に、蛋白質
分子を溶離するのに一層低い濃度の有機溶剤又は一層低
い溶離力の溶剤を用いることができる。

従って、本発明は移動相でのエタノールの使用を可能に
し、それでその後の製薬用途で利益がある。エタノール
は固定相との多数の非極性的相互作用を持つ蛋白質サン
プルを溶離するのに十分なようには極性ではない。本発
明はまた、蛋白質の逆相クロマトグラフィーで現在用い
られている移動相中での−＜２．２又は−〉５の値では
なくて（２，２と５との間の）適度な一値の使用を可能
にする。適度なμ値のの使用は蛋白質サンプル及び固定
相の両方の一層大きな安定性に帰着する。それゆえにそ
の精製された蛋白質は一層高い生物活性を持って回収さ
れ、又Ｃ１８−シリカ又はその高い又は低いμ値のいず
れかでＣ１８−シリカの加水分解によって引き起こされ
るようなその他の分解生成物で汚染されてはいない。

本発明のその他の予想外の利益は、構造式ＹＣＯＯＨで
表される生理学的カルボン酸が逆相カラムのシラノール
基と水素結合相互作用によって会合していることである
。これらの相互作用は下に横たわるシリカと会合されて
いる生理学的酸の動的層に帰着しそしてそれによって蛋
白質分子のアンモニウム基と逆相充填材料中に存在する
シラノール基との間の直接の相互作用を防止する。これ
らの望ましくない相互作用は不可逆的結合による蛋白質
物質の損失と関連しそしてピークの広がシ及びティリン
グと関連しその結果として分離効率の低下となる。

従って、本発明は分取）ＩＰＬＣにおける移動相として
用いるのに適した溶液であって、七の溶液が０．００５
〜１Ｍの生理学的に許容されるカルボン酸を含有する実
質的に純粋な水を含んでおり、その酸が一般式ＹＣＯＯ
Ｈ（式中、Ｙは珪素質保持体中のシラノール基を水素結
合することのできる極性電子吸引基である）で表される
ものであり、その溶液が９５容量係までの生理学的に許
容される有機溶剤もまた含有していることを特徴とする
上記の溶液にあると概括的に言うことができる。

好ましくはＹはＸ（ＣＲ４Ｒ２）ｎ−であるか、又はヒ
ドロキシル基で置換された環式又は複素環式化合物であ
り、上記式中のＸは一層、−ＯＨ又は−ＣＯＯＨであ’
）　＊　Ｒ１及びＲ２（これらは同一でも異なっていて
もよい）は−Ｈ１−ＯＨ１−ＣＯＯＨｌ又は−Ｒ３ＣＯ
ＯＨＣ式中、Ｒ３は低級アルキル基である）であり；そ
してｎは０又は１〜５の整数である。

好ましくは該カルボン酸はマロン酸、クエン酸、ガラク
ツロン酸、グルクロン酸又は蟻酸のいずれか１つである
。

好ましくは溶液はＮａＣＬ、　ＫＣｌ又はＮＨ４Ｃｌの
ような塩を含有する。

最も好１しくは核カルボン酸はクエン酸又は蟻酸である
。

好ましくは該有機溶剤はエタノールである。

別の態様としては該有機溶剤はメタノール、プロ・やノ
ール又はイソプロパツールである。

他の態様として本発明は移動相として前記で定義した溶
液を用いる逆相ＨＰＬＣの使用によって蛋白質を回収す
ることにあると概括的に言うことができる。

好ましくは該溶液の有機溶剤はエタノールである。

好１しくは該方法は、オクタデシル基、アルキルニトリ
ル基又はアルキルフェニル基のようなペンダント炭化水
素基を持つシリカからなる保持体の使用を含む。

好ましくは該移動相は１％ＮａＣＬを含有する。

好ましくは該保持体は（２０００ｐｉｌ　：　１４０．
６に９／ｃｒｎ２までの）中圧にたいして良好な安定性
を持ち且つポリペプチドサンプルと共存性であシそして
オクタデシル基、アルキルニトリル基又はアルキルフェ
ニル基のようなペンダント炭化水素基を持りている、Ｔ
ＳＫ−ＰＷのような、有機コポリマーである。

好ましくは該保持体は疎水的相互作用クロマトグラフィ
ー（ＨＩＣ）　Ｋ適している。

一層好ましくは該保持体は、ジオールのような極性中性
相の被覆及びブチル基のような疎水性基の軽被覆を持つ
シリカ系又は有機コポリマーである。

最も好ましくは該保持体は比較的軽負荷の、例えば３０
０ｍ”／１１のシリカについて９〜１４％の炭化水素基
を持つ、Ｃ４８−シリカである。

好ましくは蛋白質サンプルをクロマトグラフ分離の後に
限外濾過又は透析によって単離する。

好ましくは、適した大きさの気孔を持つ膜が移動相中に
存在する低分子量分子を通過させるが高分子量蛋白質サ
ンプルを通過させないように移動相中の生理学的カルボ
ン酸及び有機溶剤の組み合わせを選ぶ。

（実施例） 本発明は添付の図面を参照することによって一層十分に
理解されるであろう。第１〜２０図は下記の物質及び下
記の条件下でのクロマトグラムである二 第１図：カラム：パーティシル（Ｐａｒｔｉｓ口）１０
　０ＤＳ（３００Ｘ４匍）。

緩衝液： Ａ）　　Ｈ２０／２−プロノやノール（９：１）中の０
．１％クエン酸。

Ｂ）　　Ｈ２０／２−プロノやノール（１：９）中の０
．１％クエン酸。

１ｍｌ／ｍｉｎで１時間で０％から１００％までの線状
勾配。

検出器：　Ｗａｔｅｒｓ　Ｍｏｄ＠ｌ　４５０可変波長
検出器、２２０ｔ＋ｍ、Ａ２．Ｏで。

チーｗ　　　）　：　２００ｗ／　ｈｒａインシュリン
（ツタ）保持時間−１７〜１８ｍ１ｎ。

アルブミン（ウシ）保持時間＝２５〜 ２７ｍ１１゜ 第２図：カラム：　Ｒｈ　ｄ　−Ｐ　＊　ｋ　−Ｃ、ｓ
。

緩衝液：（第１図の場合と同じ）。

１　ｄｌ　ｍＩ　ｎで１時間で０％から１００％までの
線状勾配。

検出器：　２８０ｎｍ、Ａｏ、１゜ チャート：　２００ｗｎ／ｈｒ　。

アルブミン（ウシ）。

第３ａ図：計器：　Ｐｒ５ｐ／ｉ、ｃ−５００（Ｗａｔ
ｅｒｓ）。

カラム：　Ｐｒｅｐ−Ｐａｋ−Ｃ１Ｂ　（カートリッジ
１個）。

緩衝液： Ａ）　　Ｈ２０／９５％ＥｔＯＨ（９：　１　）中の０
．１％クエン酸　３１゜ Ｂ）　　Ｈ２０／９５％ＥｔＯＨ（１：　９　）中の０
．１％クエン酸　３１゜ 勾配：５０１１Ｉｔ／ｍｉｎで凹形。

検出：　２８０　ｎｍ　；　Ａ　１．０及び２．０（チ
ャート診照）。

チ＊　　）　：　２００ｗｎ／ｈｒ。

インシュリン（ブタ：Ｎｏｒｄｉｓｋ）　１．０１１保
持時間６５　ｍｉｎ。

第３ｂ図：　Ｐｒｅｐ／ＬＣ−５００でクロマトグラフ
ィー後のインシュリン（上記３ａ参照）。

カラムニＲａ　ｄ　−Ｐ　ａ　ｋ　−Ｃ、ｓ。

緩衝液゛： Ａ）　　Ｈ２０／２−ノロノぐノール（９：１）中の０
．１％クエン酸。

Ｂ）　　Ｈ２０／２−ノロノリール（１：９）中の０．
１％クエン酸。

勾配二１　ｗｔ／　ｍｉｎで１時間で０％から１００％
までの線状。

検出：　２２０ｎｍ、Ａ２．Ｏ。

インシュリン１２５μＩ０保持時開２３ｍ１ｎ。

第４図二計器二Ｐｒｅｐ／’ＬＣ−５００Ｗａｔｅｒｓ
　。

ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　１．０　ＩＩ。

カラムニＰｒｅｐ−Ｐａｋ−Ｃ１６（カート９２２１個
）。

緩衝液： Ａ）　　Ｈ２０／９５％Ｅｔｏａ　（９：　１　）中０
，１％クエン酸　２１゜ Ｂ）　　Ｈ２０／９５％Ｅｔｏａ　（１：　９　）中０
．１％クエン酸　３１゜ 勾配：５０ｄ１ｍｉｎで凹形 検出器　２８０ｎｍ、Ａ２．０ チャート：２００ｓ＋ａ／ｈｒ 保持時間８５ｍ１ｎ（ピークの頂点）。

第５図二カラムニＲａｄ−Ｐａｋ−Ｃ，８゜緩衝液： Ａ）　　Ｈ２０／２−プロパツール（９：１）中の０．
１％クエン酸。

Ｂ）　　Ｈ２０／２−プロパツール（１：９）中の０．
１％クエン酸。

検出：２２０ｎｍ。

インシュリン（ブタ：　Ｎｏｒｄｉｓｋ）　５０　＃Ｊ
Ｆ。

アルブミン（ウシ：　５１ｇｍｍ　）　５０　ｆｉｌｌ
。

β−ラクトグロブリンＡ　　５０μＩ０β−ラクトグロ
ブリンＢ　　５０μｇ。

検出：　２８０ｎｍ、Ａ２．Ｏ。

チャート：２００ｍ／ｈｒ。

第６図：第５図の場合と同じ条件。

β−ラクトグロブリンＡ　　５０μ１０β−ラクトグロ
ブリンＢ　　５０μＩ０検出：２８０ｍｍ、Ａ２．０゜ チャート：　１００＋ｗ／　ｈｒ　。

勾配：　ｏ、　ｓ　７／ｗｉｎで１時間で２５％から５
０％までの線状。

第７図：第６図の場合と同じ条件。

乳清蛋白質　１００μＩ０ 第８ｉ図；ヒト成長ホルモン（Ｎｏｒ＋１ｉａｋ　Ｉｎ
５ｕｌｉｎＬａｂｏｒａｔｏｒｌｅｓ）の分離。

第５図の場合と同じ条件。

勾配：　０．５ｄ／ｍｉｎで１．５時間で２５％から１
００％までの線状。

第８ｂ図：ヒト成長ホルモン（Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ
Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｈｏｒｍｏｎ＠Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　）の分離。

第５図の場合と同じ条件。

勾配：　０．５ｄ／ｍｉｎで１時間で２５％か・ら５０
％までの線状。

第９９二カラムを酸で被程。

カラム：　Ｗａｔｅｒｓ　：　８　ＭＢＣ１８１０μ。

Ｐ４１９４ＡＯ１。

溶剤：水／２−ｆロバノール　９：１゜１％（ｖ／ｖ）
クエン酸（繰シ返し）注入（２０μｌ）。

検出：示差屈折計Ｒ４０１感度×２ 第１０図二カラムニＷａｔｅｒｓ　：　８　ＮＶＣｌ３
　５１１　＋Ｐ４１３６ＤＯ１゜ 溶剤；水／２−プロノ母ノール　９：１゜１％クエン酸
注入（２０μｌ）。

検出：　Ｒ２Ｏ３感度ｘ１゜ 第１１図−８種の異なるカラムでの試験蛋白質混合物を
示す。

カラム： カラムＡ　：　５ＵＰＥＬＣＯ：　ＬＣ−３ＤＰＢ　：
　ＷＡＴＥＲ８：　８ＭＢＣｌ３１０μＣ：　５ＵＰＥ
ＬＣＯ：　ＬＣ−３１８Ｄ　：　ＷＡＴＥＲ８：Ｎ０Ｖ
ＡＰＡＫ−０１８Ｅ：ＷＡＴＥＲ８二８ＮＶＣ１８５μ Ｆ　：　ＶＹＤＡＣ：　ＰＲＯＴＥＩＮ−Ｃ４Ｇ　：　
ＷＨＡＴＭＡＮ　：　ＰＲＯＴＥＳＩＬ−３０００ＣＴ
ＹＬ−２５ Ｈ二ＳＹＮＣＨＲＯＭ、ＩＮＣ：５ＹＮＣＨＲＯＰＡＫ
Ｐ−Ｐ 緩衝液：クエン酸／塩系 プログラム：１ｒｄ／ｍｌｎで１時間で普通には１５％
から１００％Ｂまでの線状勾配。

サンプル：ビーク１：　インシュリン（ブタ）２：シト
クロムＣ（ウマの心ル蒙） ３：つ７の血清アルブミン ４：α−ラクトアルブミン ５（＋８）：　　ミオグロビン （ウマの骨格筋肉） ６：β−ラクトグロブリンＢ ７：β−ラクトグロブリンＡ 第１２９二乳清蛋白質の分離 次のものを含む混合物：　　　　　・ ビーク４：α−ラクトアルブミン ６：β−ラクトグロブリンＢ ７：β−ラクトグロブリンＡ カラム：　Ａ　：　ＹＹＤＡＣ：　Ｃ４Ｂ　：　５ＵＰ
ＥＬＣＯ：　ＬＣ−３１８Ｃ：　５ＵＰＥＬＣＯ：　Ｌ
Ｃ−３ＤＰＤ　：　５ＹＮＣＨ預Ｍ、　［：聞にＨＲＯ
ＰＡＫＰ−Ｐ 緩衝液：クエン酸系 グログラム：　１ｆｎｔ／ｍｉｎで１時間で２５％から
５０％Ｂまでの線状勾配。

第１３図：インシュリンの分離 緩衝液：クエン酸系 プログラム：１ｗｔ／ｍｉｎで１時間で１３％から２０
％Ｂまでの線状勾配（カラムＡ）。

１１１ｄ／ｍｉｎで１時間で１５％から２５％Ｂまでの
線状勾配（その他）。

サンプル：ビークＡ）ウマインシュリンＢ）ウシインシ
ュリン Ｃ）ゲタインＶニリン 使用カラム：　Ａ　：　５ＵＰＥＬ、Ｃｏ：ＬＣ−３Ｄ
ＰＢ　：　５ＵＰＥＬＣＯ：ＬＣ−３１８Ｃ：　ＶＹＤ
ＡＣ：ＰＲＯＴＥＩＮ−Ｃ４Ｄ　：　ＰＲＯＴＥＳＩＬ
　−３００ ０ＣＴＹＬ−２５ 第１４図：ウシ血清アルブミン１．０２０分取りロマト
グラフィー 計器：　Ｐｒｏｐ−５００Ｗａｔｅｒｓカラム：　ｌ　
Ｃ１８−カートリッジ 緩＠’ｔＬ： Ａ　：　Ｈ２０／９５％ＥｔＯＨ３：　１中の０．１％
りｘン酌＋１％ＮａＣｌ０ Ｂ　二　Ｈ２０／９５　％　ＥｔＯＨ４５二　５５中の
０．１％クエン酸＋１％Ｎ＆Ｃｔ。

勾配は凹形であり、緩衝液ＡＩＪと緩衝液Ｂ５１とから
作った。

第１５（ａ−ｃ）図：前記の一般の試験混合物ｆ　５ｕ
ｐｅｌｃ。

ＬＣ−３１８カラムに注入した。

緩衝液： 第１５ａ図： Ａ　：　Ｈ２０／ＩＰＡ　９　：　１中の０．１％クエ
ン酸＋１％塩 Ｂ　：　Ｈ２ｏ／１ｐＡ１　：　４中の０．１％クエン
酸＋１％塩 第１５ｂ図： Ａ　：　Ｈ２０／ｆＰＡ　９　：　１中の０．１％ｖ／
ＶＨ３Ｐ０４＋１％塩 Ｂ　：　Ｈ２０／ＩＰＡ　１　：　４中の０．１％ｖ／
ｖＨ，ＰＯ４＋　１％垣 第１５ｃ図− Ａ　：　Ｈ２０／ＩＰＡ　９　：　１中の０．１％ＴＦ
Ａ　＋１０；ｂ塩 Ｂ　：　Ｈ２０／ＩＰＡ　１　：　４中（７）　０．１
４　ＴＦＡ＋１％塩 第１５ｍ及び１５ｂ図については１ｍ／ｍ１ｎで１時間
で１５％から６０％までの線状勾配。

第１５ｃ図については１ＩＲｔ／ｍｉｎで１時間で５％
から６０％Ｂまでの線状勾配。

第１６１二次の混合物を５ｕｐｅｌｅｏ　ＬＣ−３１８
カラムに注入した： （＆）ウマインシュリン （ｂ）ウシインシュリン （ｅ）プタインシ、リン 緩衝液は第１５ａ図の場合と同じ。

勾配： （、）及び（ｂ）は１ｍ＋／／ｍｉｎで１時間で１５％
から２５％Ｂまで。

（、）は１ｍ／ｍｉｎで１時間で１０％から２５％Ｂま
で。

第１７図；下記のものｆ、８ｙｎｅｈｒｏｐｒｅｐカラ
ムに注入した： Ａ：ヒト血清アルブミン（ＢＳＡ） Ｂ：ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） Ｃニブタインシュリン その他のノ４２メーターは実施例１ＩＫ記載されている
。

第１８１二図面に記載のカラムに一般の蛋白質混合物を
注入した。その他のパラメーターは実施例１２に記載さ
れている。

第１９図：実施例１２に例示されているようにしてイン
シュリンを注入した以外は第１８図の場合と同じ。

第２０図：実施例１２に例示されているように乳清蛋白
質を注入した以外は第１８図の場合と同じ。

下記の文献に記載されている技術に従って？ＬＣｔ−実
施した： １、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ
ｐｈｙ　　１９２（１９８０）　　２２２〜２２７゜ ２、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｌｌｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏ
ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ４．６６１〜６８０　（１９８１
）。

３、　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒａｐｈｙ　　２４９（１９８２）　　１９３〜１９
８゜ これらの論文で使用されたＣ１１１−シリカカラムに加
えて、例えば、アルキルフェニルカラム又はＣ８カラム
を使用することも可能であった。

実施例１及び２おいては、インシュリン及び血清アルブ
ミンを小さな蛋白質及び大きな蛋白質のそれぞれの例と
して試験した。アルブミンの分離はインシュリンよシも
かな）過酷であることが見出だされた。式ＹＣＯＯＨで
表されるイオン性変性剤の優れた溶ｇ１％性のみがエタ
ノール−水混合物の存在下でアルブミンの良好な回収及
び分離を可能にした。実施例８は有機溶剤の勾配の本性
が１要であることを示している。

実施例１：緩衝液系の試験 水／イソグロパノールの９＝１で開始して１：９で終わ
る勾配系を生じさせ、それに０．１％の酸（第１及び２
表）を加えた。→＋の印のある化合物は蛋白質の浴１Ｉ
Ｉｌ：を可能にするだけでなくピークの形状及び回収も
良好であった。

その勾配は２つのＷａｔｅｒｓ　ＨＰＬＣポンプＭｏｄ
ｅ１６０００ＡとＭｏｄｅｌ　６６０の溶剤プログラフ
−の組合せで作られた。

検出：　Ｗａｔｓｒａ　Ｍｏｄｅｌ　４５０可変波長検
出器、２２０　ｎｍ及び２．０Ａｕｆｓで。

カラム：　Ｃ１８−Ｒａｄｌｍｌ　Ｐａｋ　、　８ｍｋ
−ｄ−（８ＭＢＣＩ８１０μ、　Ｐ３１７１ＤＯ２）緩
衝液Ａ：水／イソプロパツール９：１１４＃）０．１％
試薬緩衝液Ｂ二水／イングロパノールｌ：９中の０．１
％試薬溶剤は新たに洲製されそしてＭｌｌｌｉｐｏｒｅ
フィルター（０，４５μｍ＞”’ｘ通して濾過された。

ウシアルブミン（Ｓｉｇｍａ　、　ＡＡ−４５０３）１
００　ｐｇ　ｆ、１．０ｍｌ／ｍｌｎで１時間でＭｌ液
ＡからＢへの線状勾配操作で注入した。

Ｃ１８−シリカ（３７−７５μ）の充填された小さなガ
ラスカラムを用いて徳々の方法で強熱＠酸、塩酸及び硫
酸、を試験した。アルブミンはｇＫ＝されたが、ワック
ス状Ｃ１８−カラム被膜の浴ね出によって示されるよう
に、カラムへの損傷は明らかであった。

ｈ　セ λ　羅 −ｑ。

＜　１ −４　過 へ　餌　儀　　が　　は　ペ　　ト　　ｉ　　　　む＼
セ λ価 ＜　シ ？　　　　　　　　　　　　　　　　　＋トＳへ　　幹
　　へ　　腋　　置　　ベ　　ト　　ｎ　　　　ε実施
例２： アルブミンの分取規模での精製（クエン酸）計器：　Ｐ
ｒｅｐ　ＬＣ／Ｓｙｓｔｅｍ　５００Ａ　（Ｗａｔｅｒ
ｓ）検出：　Ｍｏｄｅｌ　５５０Ａ可変波長検出器、２
８０ｎｍ、Ａ２．０で（Ｗａｔｅｒｓ） カラム：Ｃ１８−シリカ　カートリッジ　１個緩衝液Ａ
：水／９５％エタノール９：１中の０．１％クエン酸（
２，２ｊり 緩衝液Ｂ：水／９５％エタノール１：９中の０，１％ク
エン酸（３１） 緩衝液Ａｉ収容している簡単な混合用フラスコによって
凹形勾配ｔ−得た。このフラスコをゴム栓で密閉し、こ
のゴム栓を通過させて１本の”テフロン＃（登録商標）
チューブ全クロマトグラフに導き、もう１本のテフロン
チューブを緩衝液Ｂに導いた。ポンプの動作時に緩衝液
Ｂは自動的にこの混合用フラスコ中に流入した。

アルブミンサンプル（１，０Ｊ’）’ｅ水２００　ｍｅ
に溶解させセしてカラムにポンプ移送し、その系全２０
０艷の緩衝液Ａで洗い、その後勾配を開始させた。

約１．５１の緩衝液が使用された後にアルブミンが溶離
され、そしてこの時点ではアルコール／水の比は約１：
１であった（第３ａ図）。

処理法 上記で得たアルブミン溶液を約２０％アルコールに稀釈
し、限界濾過した。この技術によって緩衝液成分を除去
した。次いでアルブミンは凍結乾燥させて無色粉末とし
てもよい。他の方法としては、アルブミン溶液は直接使
用するために望ましい緩衝液組成物に調節することがで
きる。

実施例３； 半精製インシュリンの調製 使用すべきイオン交換体が“ＩＮＤＩＯＮ−ψＢ１であ
る以外は、英国特許第１，２８５，０２４号明細書の実
施例２に記載されている方法によってインシュリンを処
理してもよい。このイオン交換体は強塩基型イオン交換
体であり、その官能基は第四アミンであシそれらの対イ
オンは塩素イオンである。

それは再生セルロースから誘導された架橋された親水性
マトリックスである。“ＩＮＤＩＯＮ−ＱＡＥ”はニュ
ージランドのＰｈｏｅｎｉｘ　Ｃｂｓ＋ｍ１ｃａＬｓ　
Ｌｌｍｔｔｅｄ。

ｃｌｏ　Ｗａｌｔａｋｔ　Ｎ２　Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔ
ｉｎｇ　Ｌｉｍ１ｔ＠ｄの登録商標である。

実施例４： 蛋白質のその他の分離 一般的には、最初の緩衝浪人（水と２−プロ／ｅノール
の比９：１中の０．１％クエン酸）から緩衝液Ｂ（水と
２−ｆロバノールの比１：９中の０．１係クエン酸）へ
の勾配を用いた。（注二これらの実施例においてはクエ
ン酸濃度はその勾配傘体にわたって一定である。）これ
らの分離の結果を下記するように添付の図面に示す。

第１図及び第２図はそれぞれウシアルブミンからブタイ
ンシュリンの分離及びβ−ラクトグロブリンＡ及びＢか
らのアルブミンの分１１４ｔ−示している。

第３ａ図はクエン酸−エタノール系を用いてのブタイン
シュリン（ＩＩ）の分取りロマトグラフィー操作（Ｐｒ
ｅｐ−５００）を示している（笑話例１参照）。

第３ｂ図は３ｍでの分取操作の分析クロマトグラムであ
る。

ウシアルブミンについての分取操作である同様なりロマ
トダラムを第４図に示す。

第５図は第１及び２図の組合せを示しておシ、インシュ
リン、アルブミン及びβ−ラクトグロブリンＡ及びＢの
優秀な分離を例証している。

第６図は、微調整でβ−ラクトグロブリンの分離ができ
ることを例証している。

第７図は乳清成分の明白な分離を示している。

第８ａ図は、市販のヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）がどの
ように、幾らかの非常に少ない汚染物から明確に分離で
きるかを示している。

第８ｂ図はニュージランドにおける源からのＨＧＨサン
プルを例証している。

実施例５： 移動相に添加された酸でのカラムの被覆緩衝液系金力ラ
ムに通す際に、緩衝液成分の一部がカラムに結合される
こと考えられる。これは永久的に又は動力的に平衡であ
る。緩衝液が逆相カラムに結合するとシラノール基が脱
活し、その結果蛋白質のクロマトグラフィーが改良され
ると思われる。この相互作用の生起は、メタノール及び
８０％インプロノぐノールで、勾配全１０％イソプロパ
ツールにセットして洗浄された新たらしいＲａｄ　Ｐａ
ｋ　−Ｃ１０カラム（Ｗａｔｅｒｓ　；　８ＭＤＣ１８
１０μ。

Ｐ４１９４ＡＯ１）　　で立証される。１０％イソプロ
パツール／水を用いる等階級系（１ｓｏｃｒａｔｉｃ　
Ｓｙｓｔｅｍ）においては、同じ溶剤に溶解したクエン
酸の１％浴液２０μＡｔ−繰シ返し注入した。そのピー
ク（検出Ｒ１）ｉ捕集し、そのサンプルを０．０ＩＲＩ
Ｉ水酸化ナトリウムで滴定した。最初の注入においては
、酸ピークはそれに続く全ての注入よシもＩＭ広であっ
た（第９図及び第３表参照）。少廿の酸がカラムに結合
された。普通にはピークの滴定にはＯ，ＳＯ−の水酸化
ナトリウムを要した。しかしながら、第一ピークについ
ては０．６−必要であった。

最初の注入の間にある仏（約１〜２μモル相当）の酸が
結合されと思われ、またそのピークは、カラムとクエン
酸との間の相互作用が生起したことを示す。

十分な洗浄の後、実験の繰シ返しでカラムが同様な量の
酸を再び吸収したという事実は、多くの酸がカラムに不
可逆的に結合されるのではなくて、それとの動力的平衡
であることを示唆している。

他のカラムＮｏｖａＰａｋ　−Ｃ１Ｂ　（Ｗａｔｅｒｓ
　＊８ＮＶＣ１８５μ二Ｐ４１３６ＤＯ１）を用いて実
験を繰シ返した。

今度も、前記の現象を観察した（第１Ｏ図）。

水酸化ナトリウム（１ｎＡ） カラム８ＭＢＣｌ３１０μ 実＠１：クエン酸　　　　０．１５　０．２５　０．３
０　０．３０カラム８ＮＶＣ１８５μ 実験２：クエン酸　　　　０．２０　０．３０　０．３
０　０．３０以下７）、白 実施例６： 逆相カラムからの蛋白質の回収 カラムからの蛋白質の回収率は、クロマトグラフ法の実
施法に強く依存する。

ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をＯ％有機溶剤で注入し
そして線状勾配を８０％以上の有機溶剤にまで操作する
ならば、ＢＳＡは通常は約５０％有機物で溶離される。

その回収率は１０％までもの非常に小さいものであシ得
る。

しかしながらＢＳＡを一層高い有機溶剤水準（２５％）
で注入しそして勾配を開始するならば、上記よシも低い
有機溶剤の百分率で溶離しそして回収率はかなシ改良さ
れて９５％以上に達し得る。最良の可能な分離を回収を
確実にするために、次の計画を用いることができる： １）蛋白質が５％段階で保持を示す有機溶剤の最高百分
率を見出だす。

例えば、ＢＳＡが３０％有機物で全く保持を示さないな
らば、クロマトグラフィーを２５％でし：］２）蛋白質
を溶離する有機溶剤の最も低い可能な百分率まで浅い勾
配を設定する。

例：Ａ）ウシインシュリン及びブタインシュリンの分離 普通には１時間で１５％から２５％までのＶ衝液Ｂ（水
／イソプロパツールに４中に０．１％の酸＋１％の塩を
含有するもの）で実施。

普通には１時間で２５％から５叶口で緩′Ｉ＃液Ｂで実
施 極性が広い範囲にわたる蛋白質混合物全注入するならば
、移動相及び勾配条件を注意深く選択しないならば、回
収率はかなシ変化するであろう。

実施例７： 種々の溶剤系を用いて試験した２０ｓの分析カラムの結
果から、高分子並蛋白質の分離については非常に幅広の
気孔の充填剤のみが適しているこ）−は明ち≠瓢であＡ
Ｃカラムのノぐラメ−よ−ｆっ−ては第４表を参照のこ
と）。一般的には最良の分離は５ｕｐｓｌｅｏ　ＬＣ−
３１８及びＶｙｄｉｃ　Ｃ−４の各カラム（両方とも３
００Ｘ）で得られる。

種々のインシュリンのクロマトグラフィーに対して非常
によく機能するカラム（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃ。

Ｎ０ＶＡＰＡＫ　ｃｔｓ）は、その気孔が約１０ｎｍ（
１００ｉ）のように小さいので、ＢＳＡのように一層大
きい蛋白質ではあまシ成功しない。

ｗｈａｔｍａｎ　Ｐｒｏｔｅｓｌｌ−３０００ＣＴＹＬ
２５及び５ｙｎｃｂｒｏｐａｋＲＰ−Ｐ　（ＣＲ１０３
−２５）のような２５０ｍカラムはかなり高い背圧奮起
こし、それ故に高粘度の溶剤系では理想的ではない。

最後に、前記した系において分析のための蛋白質分離に
ついてのｊＩｌ的なカラムは短か＜（５０簡又はせいぜ
いＺｏｏｍの長さであシ）、そして約３０ｎｍ（３００
Ｘ）の大きさの気孔をもつと言える。

蛋白質の分取液体クロマトグラフィーについては、一層
長いカラムが必要であろう。しかしながそれらは一層幅
床でもあるので、背圧の問題は起らない。

へ　　＋十＋十＋十 そ 光 Ａ）一般的な蛋白質分離（第１１図、クエン酸）普通に
は下記のものを含有する混合物を注入した：インシュリ
ン　　　　　　　　　ピーク１チトクロムＣ（ウマの心
臓）　　　　　　２ウシの血清アルブミン　　　　　　
　　　３α−ラクトアルブミン　　　　　　　　　４ミ
オグロビン（ウマの骨格筋肉）　　　　　　　　５（＋
８）β−ラクトグロブリンＢ６ β−ラクトグロブリンＡ７ Ｂ）β−ラクトグロブリンＡ及びＢの分離（第１２図、
クエン酸） 下記のものを含有する、乳清から単離した蛋白質混合物
を注入した： α−ラクトアルブミン　　　　　　ピーク４β−ラクト
グロブリンＢ６ β−ラクトグロブリンＡ７ カラムを試験するためにウシインシュリン及びブタイン
シュリンの混合物を用いた。分離が非常に自鮮−Ｆ＠龜
、吟曲にウマインシーリン本注入１涜８ビークａ）ウマ
インシュリン　連鎖　Ａｌａ８−８ｅｒ−Ｖａｌｂ）ウ
シインシュリン　連鎖　ＴｈｒＢ−８ｅｔ−１１ｅＣ）
ツタインシュリン　連鎖　Ｔｈｒ８−Ｇｌｙ−１１ｅ実
施例８： ウシ血清アルブミン１．Ｏｇの分取りロマトグラフイー
（クエン酸÷塩） 計器：　Ｐｒｏｐ　ＬＣ／Ｓｙｓｔｅｍ　５００Ａ　（
Ｗａｔｅｒｓ）検出：・２００ｉｍ、Ａ２．０ 緩衝液Ａ： Ｈ２０／９５％ＥｔＯＨ（７５：２５）中の０．１％ク
エン酸＋１％ＮａＣＬ 緩衝液Ｂ： Ｈ２０／９５％ＥｔＯＨ（４５：５５）中の０．１％ク
エン酸＋１％ＮａＣｔ 緩衝液Ａ２００−中に溶解させたＢＳＡ　１．０．９を
カラム（１カラムＣ１Ｂ−シリカ２５０×５０ＩＩＩｌ
、ｗａｔｓｒａ　）にポンプ移送し、次いで更に緩衝液
１００ｆＲ１を移送した。

緩衝液Ａ１ノ及び緩衝液Ｂ５１を用いて凹形勾配を開始
させた。

ピークを幾つかの画分に捕集した（第１４図）。

回収率９８〜１００％。

実施例９： クエン酸と燐酸及びトリフルオロ酢酸との比較決定的な
数の実験において、本発明の系を公知の燐酸系及びＴＦ
Ａ系と比較した。

第１５及び１６図には、一層弱い酸が一層強い酸よシも
一層多量の分離を与えること、言い換えると分離力はク
エン酸〉燐酸）ＴＦＡであることが立証されている。

実施例１０： カラム ３００Ｘの気孔をもつ５ｙｎｅｈｒｏｐｒｅｐの球状０
１Ｂ−シリカ３０１１−カラムに充填した。カラムの寸
法は２５０Ｘ１０ｍであった。蛋白ηの多数の自動精製
を実施した。

緩衝液 （４）水７９５％エタノール（９：１）中の０．１％ク
エン酸＋１％塩化ナトリウム （Ｂ）水７９５％エタノール（１：４）中の０．１％ク
エン酸＋１％塩化ナトリウム 実施例１０Ａ ヒト血清アルブミン 繰シ返し装入ｔ５０■のＢＳＡ　’ｉ注入しそして線状
勾配を１．５　ｍｅ／　ｍｉｎで２０分で４５％から開
始して５５％にした。最初のピークは、サンプルに添加
されたクエン酸と、安定剤としてサンプル中に存在した
Ｎ−アセチルトリプトファンとの混合物である。第二ピ
ークはアルブミンである。矢印は、捕集全開始したとこ
ろ及び終了させたところを示している。

３０分後に緩衝液混合物を最初の状態に戻した（開始条
件と最終条件との差は、勾配を操作すること力してこれ
を行なうことができるように十分に小さい）。

１０分間最初の条件でカラムを操作し、次いで新たらし
いサンプルを注入し、そして２分後に勾配を開始させた
。

実施例１０Ｂ ウシ血清アルブミン ＢＳＡ　（４０〜）を繰シ返し注入した。方法は実施例
１０Ａの場合と同様であったが、用いた勾配は１．５　
ｔｎｌ　／　ｍｌ　ｎで１５分で５０％Ｂから６０％Ｂ
までであった。最初の条件への急変は３０分後に可能で
あった。

多数回の操作の後に、カラム全清浄にするために勾配を
１００％まで実施した（画分Ｂ）勾配を不必要にする等
階級系全４５％Ｂで用いた。第１７Ｂ図は、インシュリ
ンを３６分毎に注入する擬装自動操作を示す。

この操作においては注入ｉ’に５ｍ９（図示されていな
い操作）から４０ｒｖ（ビーク［１）−ｔで増加させた
。後で、カラム全清浄にするために勾配を１００％Ｂま
で操作し、そのことによってビークＢを溶離させた（同
定はしなかった）。

サンプル調製 比較的多量を注入する時には蛋白質の保持時間はは影響
を受ける。好ましくはカラムが平衡している溶剤と同一
の溶剤中に蛋白質を溶解させる。

インシュリンの場合には、このことは、十分な固体クエ
ン酸が混合物に添加されているならば、可能である。

アルブミンの場合には、このことは可能ではなかった。

４５５ｉＪ！５０％の９５％エタノールを含有する溶剤
中に２０又は２５〜／−の高濃度でアルブミンを溶解さ
せることは可能ではない。しかしながら、サンプル溶剤
の極性を有意に変化させることなしで少量のイングロパ
ノールはエタノール’ｔｆき換えることができる。

ヒト血清アルブミン １−のアルブミン（ＢＳＡの２５％浴液）を７−の緩衝
液で怖釈し、次いで２ゴのイングロパノール全添加し、
そして固体クエンｗｔｐ＋（３，ｏ−ｚで添加した。

ウシ血清アルブミン ＢＳＡ（２００ｍ９、Ｓｉｇｍａ　）　ｋ　８−の緩衝
液Ａに溶解させ、２ｔｎ１．のイングロパノールを添加
し、そして固体クエン５’ｋｐ）ｉ３．０まで添加した
。

インシュリン（ブタ） インシュリン（２０（ｕ９、Ｎｏｒｄｌａｋ）　’ｔ”
、緩衝液Ｂ４５％と緩衝液Ａ５５％との混合ｖ！Ｊ１０
−中に懸濁させた。全てのインシュリンが酵解するまで
固体クエンを添加した。

実施例１１： マロン酸、グルクロン酸及び蟻酸を用いての蛋白質の分
離 この研究に用いた逆相カラムは幅広気孔（３００Ｘ）の
例として５ｕｐｅｌｃｏ　ＬＣ−３１８及びＶｙｄａｅ
Ｐｒｏｔｅｉｔ＋−Ｃ４並びに狭い気孔の０１８−シリ
カの例としてＷａｔｅｒｓ　Ｎｏｖａｐａｋ　Ｃ１８及
び８ＮＶＣ１８５ｔｉであった。

緩衝液系は次の通シであった。

緩衝液Ａ：水／イソグロ・やノール（９：１）中の０．
１％Ｆ＆＋１％ＮｈＣＬ 緩衝液Ｂ：水／イソプロノ母ノール（１：４）中の０．
１％酸＋１％ＮａＣＬ サンプル （１）（第１８図）嬉１１図に関して記載した一般的な
蛋白質混合物８ （２）（第１９図）第１２図に関して記載した乳清蛋白
質混合物。

（３）（第２０図）インシュリン；ウマ、ウシ及びブタ
。

結果 （ａ）前にも立証されているように、幅広気孔のカラム
は蛋白質研究に対して優秀である。

（ｂ）酸が一層弱い時に分離は良くなる。言い換えれば
、蟻酸はグルクロン酸よりも良好であり、グルクロン酸
はマロン酸よシも良好である。

（ｅ）これらの結果を、クエン酸で得られた結果と注意
深く比較することによって、販酸はこの研究に対して確
かに良好な酸であり、クエン酸の溶離力に近くなること
が示される。しかしながら、蟻酸は、健康の観点から、
医薬に用いるべき蛋白質の分取ＨＰＬＣには用いられな
いであろう。

実施例１２： 緩衝液中の塩 ０．５〜２．０％の塩の添加は分離を増強したことが多
くの先の実施例で示されてきている。満足な塩を第５表
に記載する。

第　　５　　表 塩　　　備考 塩化ナトリウム　　　　良　好 塩化カリウム　　　　　良　好 塩化アンモニウム　　　良　好 塩化リチウム　　　　　中　位 硫酸アンモニウム　　　不満足 硫酸ナトリウム　　　　不満足 グアニジン塩酸塩　　　良　好 塩の代りに、中性の非イオン化合物を移動相に添加した
。例えば尿素、グルコース及びグリセロールを試みたが
、有用な分離はもたらさなかった。

【図面の簡単な説明】

第１〜２０図はそれぞれクロマトグラムであり、第１図
及び第２図はそれぞれウシアルブミンからブタインシュ
リンの分離及びβ−ラクトグロブリンＡ及びＢからのア
ルブミンの分離を示している。 第３１図はクエン酸−エタノール系を用いてのツタイン
シュリンの分取りロマトグラフィー操作を示している。 第３ｂ図は３＆での分取操作の分析クロマトグラムであ
る。 第４図はウシアルブミンについての分取操作である同様
なりロマトダラムを示す。 第５図は第１及び２図の組合せを示しており、インシュ
リン、アルブミン及びβ−ラクトグロブリンＡ及びＢの
優秀な分離を例証している。 第６図は、微調整でβ−ラクトグロブリンの分離ができ
ることを例証している。 第７図は乳清成分の明白な分離を示している。 第８ａ図は、市販のヒト成長ホルモン（ＨＧ）Ｉ）がど
のように、幾らかの非常圧少ない汚染物から明確に分離
できるかを示している。 第８ｂ図はニュージランドにおける源からのＨＧＨサン
プル全例証している。 第９図及び第１０図は移動相に添加された酸でのカラム
の被覆を説明している。 第１１〜１３図はそれぞれ種々のカラムの蛋白質分離効
果を示している。 第１４図はウシ血清アルブミンの分取りロマトグラフィ
ーである。 第１５及び１６図はそれぞれ酸の強弱と分離力との関係
を示している。 第１７図は幅広気孔のＣ−１８シリカでの柚々の蛋白質
の自動分取りロマトダラムである。 第１８〜２０図はそれぞれマロン酸、グルクロン酸及び
蟻酸を用いての蛋白質の分離を示している。 以下余白 図面の１ｈ鶴１．内γ、に変更なし） Ｆｉｇ　１．　　　　　　　　　　　　　Ｆｉｇ　２存
持寺ｅ引す（を）　　　　　　　　係将時藺ｃ分）Ｆｉ
ｇ　３ａ　　　　　　　　Ｆｉｇ　３ｂｉｇ　６ ＩＭｆｆｔＲ−Ｍ−フ（、Ｑ）　　　　　　　　　　　
　イ掴キ１５号’時１／Ｉ　　／＋）Ｆ２Ｏ３日９フ イ呆４ｍＭ（１；ｐ）　　　Ｆｉ９Ｂ。 ヒ＋９ＬＪＦｉｇ　７１Ｊ 乳堵蚤ｈ＃、クエ〉酸系 １：ｉ＃ｎｆｒＰＪ　（／；ｐ） インシ≦１７ン°７エＳ−系 Ｆｉｇ　１３　Ｑ Ｆ幡１３ｃ Ｆ’Ｆ？巳Ｐ−’；ＯＯ＠、　ＯＡ／　ＮｏＬＯｌで’
　ＢＳＡ　１．Ｏｇｉｇ　１４ Ｆｏｇ　１５（ 人　ＬＣ−３１８７工ン西疑系 １ｇ１６ａ １ｇ１６ｂ ど） く　　　　　　　　　　　　０ （０′：″

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、逆相高性能液体クロマトグラフィーを分取規模で用
   いて蛋白質を精製するのに用いるための移動相であって
   、その移動相が０．００５〜１Ｍの生理学的に許容され
   るカルボン酸を含有する実質的に純粋な水を含んでおり
   、その酸が一般式ＹＣＯＯＨ（式中、Ｙは珪素質保持体
   中のシラノール基を水素結合することのできる極性電子
   吸引基である）で表されるものであり、その溶液が９５
   容量％までの生理学的に許容される有機溶剤もまた含有
   していることを特徴とする上記の移動相。 ２、ＹがＸ（ＣＲ＿１Ｒ＿２）＿ｎ−であるか、又はヒ
   ドロキシル基で置換された環式又は複素環式化合物であ
   り、上記式中のＸは−Ｈ及び−ＣＯＯＨからなる群から
   選ばれたものであり；Ｒ＿１及びＲ＿２（これらは同一
   でも異なっていてもよい）はそれぞれ−Ｈ、−ＯＨ、−
   ＣＯＯＨ、及び−Ｒ＿３ＣＯＯＨ（式中、Ｒ＿３は低級
   アルキル基である）からなる群から選ばれたものであり
   ；そしてｎは０及び１〜５の整数からなる群から選ばれ
   たものである、特許請求の範囲第１項記載の移動相。 ３、該カルボン酸がマロン酸、クエン酸、ガラクツロン
   酸及びグルクロン酸からなる群から選ばれたものである
   、特許請求の範囲第１項記載の移動相。 ４、該溶液がＫＣｌ、ＮａＣｌ及びＮＨ＿４Ｃｌからな
   る群から選ばれた塩を含有している、特許請求の範囲第
   １〜３項のいずれか１項に記載の移動相。 ５、該カルボン酸がクエン酸である、特許請求の範囲第
   １項記載の移動相。 ６、該有機溶剤がエタノールである、特許請求の範囲第
   １〜５項のいずれか１項に記載の移動相。 ７、該有機溶剤がメタノール、プロパノール及びイソプ
   ロパノールからなる群から選ばれたものである、特許請
   求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載の移動相。 ８、逆相高性能液体クロマトグラフィーによって蛋白質
   混合物から蛋白質を分取規模で精製する方法であって、 蛋白質の通過を許すのに十分な多孔性を持つ高性能液体
   クロマトグラフィー保持体の充填されたカラムを準備す
   る工程、 蛋白質混合物を該カラムの端に導入する工程、及び 移動相が０．００５〜１Ｍの生理学的に許容されるカル
   ボン酸を含有する実質的に純粋な水を含んでおり、その
   酸が一般式ＹＣＯＯＨ（式中、Ｙは珪素質保持体中のシ
   ラノール基を水素結合することのできる極性電子吸引基
   である）で表されるものであり、その溶液が９５容量％
   までの生理学的に許容される有機溶剤もまた含有してい
   る該移動相で該カラムを溶離する工程、 を含むことを特徴とする上記の方法。 ９、該有機溶剤がエタノールである、特許請求の範囲第
   ８項記載の方法。 １０、後続工程として限外ろ過及び透析からなる群から
   選ばれた方法によって該蛋白質を単離する工程を含む、
   特許請求の範囲第８又は９項記載の方法。