JP5977733B2 - 分析方法 - Google Patents
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Description
(1)試料中に含まれるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのアミノ酸配列中に存在するアスパラギン酸のペプチド結合を切断し、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドをペプチド断片にする切断工程;前記切断工程で切断されたペプチド断片を液体クロマトグラフィーにより分離精製し、測定対象物質であるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのN末端側のペプチド断片を選定する分離精製工程;前記分離精製されたペプチド断片を質量分析し、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのN末端側のペプチド断片を検出する分析工程;を含む、試料中に含まれるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの分析方法。
(2)前記切断工程において、配列特異的切断プロテアーゼ又は酸から選択される切断物質を用いてアスパラギン酸のペプチド結合を切断する、(1)に記載の分析方法。
(3)前記切断物質が、エンドペプチダーゼASP-N、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、 (2)に記載の分析方法。
(4)前記分離精製工程において、液体クロマトグラフィーが、流速50nL/min〜50μL/minの液体クロマトグラフィーである、(1)〜(3)のいずれかに記載の分析方法。
(5)前記グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドが、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド、グルカゴン様ペプチド-1、グルカゴン様ペプチド-2、グルカゴン、及びそれらの類縁体からなる群から選択される、(1)〜(4)のいずれかに記載の分析方法。
(6)前記分離精製工程において、プレカーサーイオンの質量選択により測定対象物質を選定する、(1)〜(5)のいずれかに記載の分析方法。
(7)さらに、前記分離精製工程において、前記ペプチド断片を固相抽出する工程を含む、(1)〜(6)のいずれかに記載の分析方法。
(8)前記分離精製工程及び分析工程が、高速液体クロマトグラフィー/マススペクトロメトリー/マススペクトロメトリー/マススペクトロメトリーにより行われる、(1)〜(7)のいずれかに記載の分析方法。
(9)(1)〜(8)のいずれかに記載の分析方法を用いて検量線を作成し、前記検量線を用いて、試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを定量する、試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの定量方法。
(10)2種以上のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのペプチド断片を、同時にそれぞれ測定することにより、試料中の2種以上のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを区別して同時に定量する、(9)に記載の定量方法。
(11)活性型グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのペプチド断片と、非活性型グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのペプチド断片とを、同時にそれぞれ測定することにより、試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの活性型と非活性型とを区別して同時に定量する、(9)又は(10)に記載の定量方法。
(12)前記検量線を、安定同位体で標識された内標準物質を試料に加えて作成する、(9)〜(11)のいずれかに記載の定量方法。
(13)測定対象のペプチド断片及び内標準物質のペプチド断片の各ピーク面積比を用いて定量する、(12)に記載の定量方法。
(14)前記内標準物質が、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのアミノ酸配列において1位〜15位から選択される1又はそれ以上のアミノ酸を、安定同位体で標識されたアミノ酸で置換したペプチドである、(12)又は(13)に記載の定量方法。
(15)(a)コントロール用マトリクス、(b)内標準物質又はその溶液、(c)グルカゴン・セクレチンファミリーペプチド又はそれらの標準物質、若しくはそれらの溶液、(d)切断物質、(e)固相抽出プレートを含む、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの定量用キット。
(16)前記切断物質が、エンドペプチダーゼASP-N、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、(15)に記載の定量用キット。
(17)前記グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドが、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド、グルカゴン様ペプチド-1、グルカゴン様ペプチド-2、グルカゴン、及びそれらの類縁体からなる群から選択される、(15)又は(16)に記載の定量用キット。
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln[配列番号13]
[N-Acetyl]-GIP[配列番号13のN-Acetyl変異体]、 [N-Pyroglutamyl]-GIP[配列番号13のN-Pyroglutamyl変異体]、 [N-Glucitol]-GIP[配列番号13のN-Glucitol変異体]、 [N-Palmitate]-GIP[配列番号13のN-Palmitate変異体]、 [N-Fmoc]-GIP[配列番号13のN-Fmoc変異体]、 [N-alkyl]-GIP[配列番号13のN-alkyl変異体]、 [N-glycosyl]-GIP[配列番号13のN-glycosyl変異体]、 [N-isopropyl]-GIP[配列番号13のN-isopropyl変異体]、 [Gly2]-GIP[配列番号15]、 [D-Ala2]-GIP[配列番号16](但し、D-Alaは、D型Alanineを意味する。下記においても同じ)。、 [Aib2]-GIP[配列番号17](但し、Aibは、Aminoisobutylic acidを意味する。下記においても同じ。)、 [Phosphoserine2]-GIP[配列番号18]、 [Sar2]-GIP[配列番号19](但し、Sarは、N-Methylglycine(MeGly), sarcosineを意味する。下記においても同じ。)、 [Pro3]-GIP[配列番号20]、 [Hyp3]-GIP[配列番号21](但し、Hypは、Hydroxyprolineを意味する。下記においても同じ。)、 [Lys3]-GIP[配列番号22]、 [Tyr3]-GIP[配列番号23]、 [Phe3]-GIP[配列番号24]、[Ser2]-GIP[配列番号113]
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly[配列番号26]
[Ser8]-GLP-1(7-37)[配列番号31]、[Gly8]-GLP-1(7-37) [配列番号32]、[Val8]-GLP-1(7-37) [配列番号33]、[Glu22]-GLP-1(7-37) [配列番号34]、[Lys22]-GLP-1(7-37) [配列番号35]、[Val8,Glu22]-GLP-1(7-37) [配列番号36]、[Val8,Lys22]-GLP-1(7-37) [配列番号37]、[Gly8,Glu22]-GLP-1(7-37) [配列番号38]、[Gly8,Lys22]-GLP-1(7-37) [配列番号39]、[Val8,Glu30]-GLP-1(7-37) [配列番号40]、[Gly8,Glu30]-GLP-1(7-37) [配列番号41]、[Val8,His37]-GLP-1(7-37) [配列番号42]、[Gly8,His37]-GLP-1(7-37) [配列番号43]、[Arg34]-GLP-1(7-37) [配列番号44]、[Lys18]-GLP-1(7-37) [配列番号45]、[Gly8,Glu22,Gly36]-GLP-1(7-37) [配列番号46]、[Aib8,Aib22]-GLP-1(7-37) [配列番号47]、[Aib8,Aib35]-GLP-1(7-37) [配列番号48]、[Aib8,Aib22,Aib35]-GLP-1(7-37) [配列番号49]、[Glu22,Glu23]-GLP-1(7-37) [配列番号50]、[Gly8,Glu22,Glu23]-GLP-1(7-37) [配列番号51]、[Val8,Glu22,Glu23]-GLP-1(7-37) [配列番号52]、[Val8,Glu22,Val25]-GLP-1(7-37) [配列番号53]、[Val8,Glu22,Ile33]-GLP-1(7-37) [配列番号54]、[Val8,Glu22,Val25,Ile33]-GLP-1(7-37) [配列番号55]、及びこれらの37位が欠失したGLP-1(7-36)型、並びにこれらの36位と37位とが欠失したGLP-1(7-35)型
[Ser2]-GLP-2[配列番号66]、[Gly2]-GLP-2 [配列番号67]、[Val2]-GLP-2[配列番号68]
[Arg12]-Glucagon[配列番号70]、[Arg12,Lys20]-Glucagon[配列番号71]、[Arg12,Lys24]-Glucagon[配列番号72]、[Arg12,Lys29]-Glucagon[配列番号73]、[Glu9]-Glucagon[配列番号74]、[Glu9,Glu16,Lys29]-Glucagon[配列番号75]、[Lys13,Glu17]-Glucagon[配列番号76]、[Glu20,Lys24]-Glucagon[配列番号77]
式:X1-X2-X3-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-X4[配列番号78]
[式中、
X1は、Tyr、D-Tyr、N-Acetyl-Tyr、N-Pyroglutamyl-Tyr、N-Glucitol-Tyr、N-Palmitate-Tyr、N-Fmoc-Tyr、N-alkyl-Tyr、N-glycosyl-Tyr、N-isopropyl-Tyr又は欠失、
X2は、Ala、D-Ala、Gly、Ser、2-Aminobutylic acid、Aminoisobutylic acid、Phosphoserine、Sarcosine、又は欠失、
X3は、Glu、D-Glu、Pro、Hydroxyproline、Lys、Tyr、又はPhe、
X4は、Asp又は欠失、
を意味する。]
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号1]、N-Acetyl-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号1のN-Acetyl変異体]、N-Pyroglutamyl-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号1のN-Pyroglutamyl変異体]、N-Glucitol-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号1のN-Glucitol変異体]、N-Palmitate-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号1のN-Palmitate変異体]、N-Fmoc-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号1のN-Fmoc変異体]、N-alkyl-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号1のN-alkyl変異体]、N-glycosyl-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号1のN-glycosyl変異体]、N-isopropyl-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号1のN-isopropyl変異体]、Tyr-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号79]、Tyr-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号5]、Tyr-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号80]、Tyr-Abu-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号81](但し、Abuは、2-Aminobutylic acidを意味する。下記においても同じ。)、Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号82]、Tyr-Phosphoserine-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号83]、Tyr-Sar-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号84]、Tyr-Ala-Pro-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号85]、Tyr-Ala-Hyp-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号86]、Tyr-Ala-Lys-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号87]、Tyr-Ala-Tyr-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号88]、Tyr-Ala-Phe-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号89]、Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号2]、N-Acetyl-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号2のN-Acetyl変異体]、N-Pyroglutamyl-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号2のN-Pyroglutamyl変異体]、N-Glucitol-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号2のN-Glucitol変異体]、N-Palmitate-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号2のN-Palmitate変異体]、N-Fmoc-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号2のN-Fmoc変異体]、N-alkyl-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号2のN-alkyl変異体]、N-glycosyl-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号2のN-glycosyl変異体]、N-isopropyl-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号2のN-isopropyl変異体]、Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号4]、Tyr-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号90]、Tyr-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号91]、Tyr-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号92]、Tyr-Abu-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号93]、Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号94]、Tyr-Phosphoserine-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号95]、Tyr-Sar-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号96]、Tyr-Ala-Pro-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号97]、Tyr-Ala-Hyp-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号98]、Tyr-Ala-Lys-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号99]、Tyr-Ala-Tyr-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号100]、Tyr-Ala-Phe-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号101]、
式:His-X8-X9-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-X15[配列番号102]
[式中、
X8は、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Lys、又はAib、
X9は、Glu、Gly、又はLys、
X15は、Asp又は欠失、
を意味する。]
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser[配列番号6]、His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser[配列番号10]、His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser[配列番号103]、His-Val-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser[配列番号104]、His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser[配列番号105]、His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp[配列番号7]、His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp[配列番号106]、His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp[配列番号107]、His-Val-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp[配列番号108]、His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp[配列番号109]
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser[配列番号110]、His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp[配列番号111]
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser[配列番号11]、His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp[配列番号12]
方法
グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドであるGIPの測定対象となるペプチド断片の安定性を比較した。固相合成により合成した下記(a)(b)のペプチド断片に、0.1%TFA-20%アセトニトリルを加えて2.0μM溶液とした。この溶液をLC/MS/MS(Applied Biosystems:QSTAR(登録商標)Elite)にて測定した。測定は、調製直後及び調製後17日目に行った。
(a)GIP1-8:GIP1-42の9位のアスパラギン酸がN末端側で切断されたGIP1-8を用いた。GIP1-8のアミノ酸配列は、Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号1]である。
(b)GIP1-16:GIP1-42の16位のリジンがC末端側で切断されたGIP1-16を用いた。尚、GIP1-42をTrypsinで切断すると16位のリジンがC末端側で切断される。GIP1-16のアミノ酸配列は、Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys[配列番号112]である。
調製直後の測定値を図1に示し、調製後17日目の測定値を図2に示す。
GIP1-8では、1つのピークが観測された(m/z887.4([M+H]+))。GIP1-16では、2つのピークが観測された(m/z905.9([M+2H]2+)及びm/z913.9([M+2H]2+))。GIP1-16で観測されたピークの1つは、冷蔵保存した際に経時的に大きくなり、調製後17日目では、もう一方のピークとのピーク強度比はほぼ1:1となった。経時的に変化するピークは、GIP1-16のメチオニン(Met)が酸化された酸化体のピークであった。ピークが経時的に大きくなることは、経時的にペプチドの分子量が変化し、試料中の濃度を正確に測定できないことを示している。GIP1-8のペプチド断片は、GIP1-16のペプチド断片より安定性が勝っていた。
方法
グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドであるGIP類縁体(2S-GIP-NH2)[配列番号113のC末端アミド誘導体]を測定する一実施形態を示す。このGIP類縁体は、活性型GIPの2位のアラニンをセリンに置換し、C末端をアミド化したGIP類縁体である。切断物質はASP-Nを用いた。当該GIP類縁体を、50mMのTris/HCl及び2.5mMのZnSO4溶液(pH8.0)で溶解した。この溶液に、Asp-Nを1μg加え、37℃で15時間インキュベートして、当該GIP類縁体を切断した。その後、試料をLC/MS(LCQ Deca XP Plus)で分析した。
結果
GIP類縁体をAsp-Nにより切断し、分析した結果を図3に示す。1つのピーク(m/z 903([M+H]+))が観察された。このピークは、活性型GIP類縁体の9位のアスパラギン酸のN末側が切断された2S-GIP1-8であった。
2S-GIP1-8:Tyr-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号5]
方法
グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドである活性型GIP[配列番号13]を測定する一実施形態を示す。切断物質はギ酸を用いた。活性型GIP1-42を精製水で溶解し100μM溶液とした。この溶液50μLに、2%ギ酸を500μL加え、108℃で18時間までインキュベートして、経時的に活性型GIP1-42の切断を確認した。その後、各試料をLC/MS(LCQ Deca XP Plus)で分析した。
結果
活性型GIP1-42をギ酸により切断し、分析した結果を図4に示す。m/z 887([M+H]+)、及びm/z 1002([M+H]+)のピークが観察された。これら2つのピークは、活性型GIP1-42の9位のアスパラギン酸のN末端側が切断されたGIP1-8、及び活性型GIP1-42の9位のアスパラギン酸のC末端側が切断されたGIP1-9であった。
GIP1-8:Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号1]
GIP1-9:Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp[配列番号2]
グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドである活性型GIP[配列番号13]を測定する他の実施形態を示す。切断物質は酢酸を用いた。2%ギ酸500μLに代えて2%酢酸500μLを加えた他は、実施例2と同様の方法で分析した。分析結果を図5に示す。活性型GIP1-42の9位のアスパラギン酸のN末端側が切断されたGIP1-8[配列番号1]、及び活性型GIP1-42の9位のアスパラギン酸のC末端側が切断されたGIP1-9[配列番号2]のピークが観察された。
グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドである活性型GIP[配列番号13]を測定する他の実施形態を示す。切断物質はトリフルオロ酢酸を用いた。2%ギ酸500μLに代えて1%トリフルオロ酢酸500μLを加えた他は、実施例2と同様の方法で分析した。分析結果を図6に示す。活性型GIP1-42の9位のアスパラギン酸のN末端側が切断されたGIP1-8[配列番号1]、及び活性型GIP1-42の9位のアスパラギン酸のC末端側が切断されたGIP1-9[配列番号2]のピークが観察された。
方法
グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドであるGLP-1(7-36)[配列番号25]を測定する一実施形態を示す。切断物質はASP-Nを用いた。GIP類縁体に代えてGLP-1(7-36)とした他は、実施例1と同様の方法で分析した。
結果
分析結果を図7に示す。GLP-1(7-36)の15位のアスパラギン酸のN末端側が切断されたGLP-1(7-14)のピークが観察された(m/z 425([M+2H]2+))。
GLP-1(7-14):His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser[配列番号6]
方法
グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドであるGlucagon[配列番号69]を測定する一実施形態を示す。切断物質はASP-Nを用いた。GIP類縁体に代えてGlucagonとした他は、実施例1と同様の方法で分析した。
結果
分析結果を図8に示す。Glucagonの9位のアスパラギン酸のN末端側が切断されたGlucagon1-8のピークが観察された(m/z 864([M+H]+))。
Glucagon1-8:His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser[配列番号11]
方法
グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドであるGLP-1類縁体(8S-GLP-1)[配列番号31]を測定する一実施形態を示す。この類縁体は、GLP-1(7-36)の8位のアラニンをセリンに置換したGLP-1類縁体である。切断物質はASP-Nを用いた。GIP類縁体5nmolに代えてGLP-1類縁体5nmolとし、Asp-Nの量を1μgから2μgに代えた他は、実施例1と同様の方法で分析した。
結果
分析結果を図9に示す。GLP-1類縁体の14位のアスパラギン酸のN末端側が切断された8S-GLP-1(7-14)のピークが観察された(m/z 865([M+H]+))。
8S-GLP-1(7-14):His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser[配列番号10]
試料中の活性型GIP[配列番号13]の濃度を、検量線を用いて定量する一実施形態を示す。
方法
1.検量線用試料の調製
内標準物質として、GIPの6位のPheが安定同位体ラベル化アミノ酸である13C9,15N-Pheに置換された、以下の内標準物質を合成した。以下(1)〜(3)の手順に従い、検量線用の試料を調製した。
[標準物質]
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln[配列番号13]
[内標準物質]
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr- 13 C 9 , 15 N-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln(アミノ酸配列は、配列番号13に同じ)
(1)活性型GIP標準溶液の調製:活性型GIP1-42(ペプチド研究所より購入)を精製水で溶解し、100μM溶液を調製した。この溶液を希釈し、20.0pM、200pM、2.00nM、20.0nM、及び1.00μM標準溶液を調製した。
(2)内標準物質標準溶液の調製:合成した上記内標準物質を溶解し、100μM溶液を調製した。この溶液を希釈し、2.00nM、20.0nM、及び1.00μM内標準物質標準溶液を調製した。
(3)検量線用試料の調製:2mLチューブに、DPP-4阻害剤(Diprotin A、0.3M)2μLを加え、氷冷下で活性炭処理したヒトのEDTA添加血漿200μL、活性型GIP標準溶液、及び内標準物質標準溶液を加え検量線用試料を調製した。活性型GIP標準溶液、及び内標準物質標準溶液の添加割合を表2に示す。尚、DPP-4阻害剤は、前処理過程におけるGIP1-42のGIP3-42への分解、あるいはGIP1-8のGIP3-8への分解を抑制するために添加した。
(1)除タンパク
上記検量線用試料に180mM炭酸アンモニウム溶液100μL及びエタノール900μLを加え、20分氷冷した。遠心分離後上清を濃縮乾固した。
(2)試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの切断
前記除タンパク後の検量線用試料をプロテアーゼ(ASP-N)によって切断した。前記除タンパク後の検量線用試料に、50mMのTris/HCl、2.5mMのZnSO4溶液(pH8.0)を100μL加え、更に0.1mg/mLのAsp-N水溶液を8μL加え、37℃で16時間インキュベートした。
(3)固相抽出
固相プレート(Waters製;Oasis MAX 96-well μElution Plate)を使用し、上記(2)で得られた検量線用試料に5%アンモニア水300μLを添加し、これをコンディショニングされた固相プレートに負荷した。固相プレートを洗浄後、0.1%ギ酸-75%アセトニトリル50μLで溶出した。溶出液は、HPLC用バイヤルに移し、遠心エバポレータを用いて濃縮乾固した。さらに、0.1%TFA-10%アセトニトリル20μLで再溶解した。
(4)フィルターろ過
再溶解後の試料を遠心式フィルターユニット(0.2μm)で遠心ろ過し、HPLC用試料とした。
前記前処理を施したHPLC用試料5μLをnanoFlowLC-MS/MS/MSに注入し、HPLC用試料に含まれる標準物質及び内標準物質由来ペプチドを測定した。測定条件を表3及び表4に示す。
(1)HPLC条件
検量線用試料を測定し、活性型GIP由来のペプチド断片(Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号1])及び内標準物質由来のペプチド断片(Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr- 13 C 9 , 15 N-Phe-Ile-Ser(アミノ酸配列は、配列番号1に同じ))をそれぞれ独立したピークとして検出できた(図10)。活性型GIP濃度と両者のピーク面積比(活性型GIP由来ペプチドのピーク面積/内標準物質由来ペプチドのピーク面積)を線形最小二乗法により直線回帰して、傾きと切片及び相関係数(r)を求めた。1pM〜500pMの範囲で検量線を作成した結果、相関係数(r)は0.990以上であり、定量限界は1pMであった(図11)。
方法
実施例8と同様にしてヒト血漿中活性型GIP[配列番号13]を定量し、各検量線に、得られたピーク面積比をあてはめて、各サンプルの濃度を算出した。濃度毎に、得られた測定値(n=3)の真度(Bias%)、精度(%CV)を算出した。判定基準は、真度±15%以内(定量限界は±20%以内)、精度15%以内(定量限界は20%以内)であること、とした。
結果
結果を表5に示す。各濃度における活性型GIPは、同時再現性の判定基準を満たした。このことは、定量値の再現性が良好であることを示している。
方法
1.検量線用の試料の調製
実施例8と同様にして、標準物質及び内標準物質を含む測定用試料を調製した。内標準物質として、GIPの6位のPheを13C9,15N-Pheに置換した、以下のペプチドを合成し加えた。尚、非活性型GIPの内標準物質は、活性型GIP内標準物質のN末端2残基が欠除したものである。
[活性型GIPの標準物質]
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln[配列番号13]
[非活性型GIP標準物質]
Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln(GIP3-42:[配列番号14])
[活性型GIPの内標準物質]
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr- 13 C 9 , 15 N-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln(アミノ酸配列は、配列番号13に同じ)
[非活性型GIPの内標準物質]
Glu-Gly-Thr- 13 C 9 , 15 N-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln(アミノ酸配列は、配列番号14に同じ)
(1)活性型GIP標準溶液の調製:活性型GIP(ペプチド研究所より購入)に精製水を加えて溶解し、100μM溶液とした。この溶液を50%エタノールで希釈し、20.0pM、200pM、2.00nM、20.0nM、及び1.00μM標準溶液を調製した。
(2)活性型GIP用内標準物質標準溶液の調製:合成した内標準ペプチドを溶解し、100μM溶液を調製した。この溶液を希釈し、1.00nM、10.0nM、及び1.00μM標準溶液を調製した。
(3)非活性型GIP標準溶液の調製:購入した非活性型GIPを溶解し、100μM溶液を調製した。この溶液を希釈し、20.0pM、200pM、2.00nM、20.0nM、及び1.00μM標準溶液を調製した。
(4)非活性型GIP用内標準物質標準溶液の調製:合成した内標準ペプチドを50%エタノールで溶解し、100μM溶液を調製した。この溶液を50%エタノールで希釈し、1.00nM、10.0nM、及び1.00μM標準溶液を調製した。
(5)検量線用試料の調製:2mLチューブにDPP-4阻害剤(Diprotin A、0.3M)2μLを加え、氷冷下で活性炭処理したヒトのEDTA添加血漿200μL、活性型GIP標準溶液、及び活性型GIP用内標準物質標準溶液、ならびに非活性型GIP標準溶液、及び非活性型GIP用内標準物質標準溶液を表6のように加え、検量線用試料を調製した。
実施例8と同様の方法で前処理を行った。
3.測定
実施例8と同様にして測定した。測定条件は表7及び表8に示す。
(1)HPLC条件
検量線用試料を測定し、活性型GIP由来のペプチド断片(Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号1])と活性型GIP用内標準物質由来のペプチド断片(Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr- 13 C 9 , 15 N-Phe-Ile-Ser(アミノ酸配列は、配列番号1に同じ))をそれぞれ独立したピークとして検出できた(図12)。また、非活性型GIP由来のペプチド断片(Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser[配列番号3])と非活性型GIP用内標準物質由来のペプチド断片(Glu-Gly-Thr- 13 C 9 , 15 N-Phe-Ile-Ser(アミノ酸配列は、配列番号3に同じ))をそれぞれ独立したピークとして検出できた(図13)。活性型GIP濃度と両者のピーク面積比(活性型GIP由来ペプチドのピーク面積/内標準物質由来ペプチドのピーク面積)を線形最小二乗法により直線回帰して傾きと切片及び相関係数(r)を求めた。1pM〜500pMの範囲で検量線を作成した結果、重み付け1/xを設定して相関係数(r)は0.990以上であった(図14)。非活性型GIP濃度と両者のピーク面積比(非活性型GIP由来ペプチドのピーク面積/非活性型GIP用内標準物質由来ペプチドのピーク面積)を線形最小二乗法により直線回帰して傾きと切片及び相関係数(r)を求めた。10pM〜500pMの範囲で検量線を作成した結果、重み付け1/xを設定して相関係数(r)は0.990以上であった(図15)。
α-グルコシダーゼ阻害剤服用(50mg,1日3回)糖尿病患者6例の食前及び食後1時間における血漿中活性型GIP[配列番号13]と非活性型GIP[配列番号14]の同時定量を行った。
1.試料の調製
(1)検量線用の試料の調製
実施例9と同様にして、表9のように試料を調製した。
α-グルコシダーゼ阻害剤を服用中の患者からたんぱく安定化剤入り採血管(べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー製)を用いて採血し、血漿を得た。この血漿200μLに上記検量線作成時と同量の活性型GIP用内標準物質及び非活性型GIP用内標準物質を添加した。
2.測定
実施例8と同様にして、前処理を施した試料を測定した。測定条件は、表10〜表12に示す。
糖尿病患者血漿試料を測定し、活性型GIP由来のペプチド断片[配列番号1]と活性型GIP用内標準物質由来のペプチド断片(アミノ酸配列は、配列番号1に同じ)をそれぞれ独立したピークとして検出できた(図16)。また、非活性型GIPも同様にそれぞれ独立したピークとして検出できた(図17)。活性型GIP濃度と両者のピーク面積比(活性型GIP由来ペプチドのピーク面積/内標準物質由来ペプチドのピーク面積)を線形最小二乗法により直線回帰して1pM〜500pMの範囲で重み付け1/xを設定して検量線を作成した。糖尿病患者血漿試料から得られたピーク面積比(活性型GIP由来ペプチドのピーク面積/内標準物質由来ペプチドのピーク面積)をこの検量線に当てはめ、血漿中活性型GIP濃度を算出した。非活性型GIPは、10pM〜500pMの範囲で重み付け1/xを設定して、活性型GIPと同様に検量線を作成し、糖尿病患者の血漿中非活性型GIP濃度を算出した。その結果を表13に示す。表中の数値は、それぞれの平均血漿中濃度±標準偏差を示す。
Claims (14)
- 試料中に含まれるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのアミノ酸配列中に存在するアスパラギン酸のペプチド結合を切断し、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドをペプチド断片にする切断工程;
前記切断工程で切断されたペプチド断片を液体クロマトグラフィーにより分離精製し、測定対象物質であるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのN末端側のペプチド断片を選定する分離精製工程;
前記分離精製工程で分離精製されたペプチド断片を質量分析し、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのN末端側のペプチド断片を検出する分析工程;
を含む、試料中に含まれるグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの分析方法。 - 前記切断工程において、配列特異的切断プロテアーゼ及び酸からなる群から選択される切断物質を用いてアスパラギン酸のペプチド結合を切断する、請求項1に記載の分析方法。
- 前記切断物質が、エンドペプチダーゼASP-N、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項2に記載の分析方法。
- 前記分離精製工程において、液体クロマトグラフィーが、流速50nL/min〜50μL/minの液体クロマトグラフィーである、請求項1〜3のいずれかに記載の分析方法。
- 前記グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドが、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド、グルカゴン様ペプチド-1、グルカゴン様ペプチド-2、グルカゴン、及びそれらの類縁体からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれかに記載の分析方法。
- 前記分離精製工程において、プレカーサーイオンの質量選択により測定対象物質を選定する、請求項1〜5のいずれかに記載の分析方法。
- さらに、前記分離精製工程において、前記ペプチド断片を固相抽出する工程を含む、請求項1〜6のいずれかに記載の分析方法。
- 前記分離精製工程及び分析工程が、高速液体クロマトグラフィー/マススペクトロメトリー/マススペクトロメトリー/マススペクトロメトリーにより行われる、請求項1〜7のいずれかに記載の分析方法。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の分析方法を用いて検量線を作成し、前記検量線を用いて、試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを定量する、試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの定量方法。
- 2種以上のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのペプチド断片を、同時にそれぞれ測定することにより、試料中の2種以上のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドを区別して同時に定量する、請求項9に記載の定量方法。
- 活性型グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのペプチド断片と、非活性型グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのペプチド断片とを、同時にそれぞれ測定することにより、試料中のグルカゴン・セクレチンファミリーペプチドの活性型と非活性型とを区別して同時に定量する、請求項9又は10に記載の定量方法。
- 前記検量線を、安定同位体で標識された内標準物質を試料に加えて作成する、請求項9〜11のいずれかに記載の定量方法。
- 測定対象のペプチド断片及び内標準物質のペプチド断片の各ピーク面積比を用いて定量する、請求項12に記載の定量方法。
- 前記内標準物質が、グルカゴン・セクレチンファミリーペプチドのアミノ酸配列において1位〜15位から選択される1又はそれ以上のアミノ酸を、安定同位体で標識されたアミノ酸で置換したペプチドである、請求項12又は13に記載の定量方法。
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