KR20160030251A - 이온 교환 크로마토그래피 입력 최적화의 설명 - Google Patents

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다니엘 맥도날드
토마스 페타포프
야준 왕
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 크로마토그래피 분리 조건; 예를 들어 폴리펩티드 및 그의 전하 변이체의 분리 조건을 결정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 크로마토그래피 분리 조건에 대한 완충 조건을 결정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 다중 폴리펩티드 산물을 분석하는 강력한 방법을 제공한다.

Description

이온 교환 크로마토그래피 입력 최적화의 설명 {ELUCIDATION OF ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY INPUT OPTIMIZATION}
<관련 출원에 대한 인용참조>
본원은 2013년 7월 12일자로 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/845,890에 대한 우선권을 주장하며; 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
<발명의 분야>
본 발명은 단백질 전하 변이체에 대한 이온 강도 구배 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 폴리펩티드 제제를 분석하는 방법을 제공한다.
모노클로날 항체 (mAb)와 같은 단백질은 수성 환경에서 표면에 대부분 하전된 극성 아미노산을 갖는다 (Barlow, DJ and Thornton, JM (1986) Biopolymers 25:1717). 용액 구성성분과의 분자 상호작용 때문에, 표면 잔기는 다수의 화학적 및 효소적 변형을 경험할 수 있으며, 이는 그의 정전기적 표면 상에서 약간의 차이를 갖는 단백질 변이체의 불균질 혼합물을 유도한다 (Dick, LW et al., (2009) J. Chromatogr. B 877:3841; Liu, HW et al., (2008) Rapid Commun. Mass Spectrom. 22:4081; Miller, AK, et al., (2011) J. Pharm. Sci. 100:2543; Wang, WR et al., (2011) Mol. Immunol. 48:860). 양이온-교환 크로마토그래피 (CEC)는 최근 검토에 따라 단백질 치료제의 전하 이종성을 프로파일링하는 황금 표준인 것으로 여겨진다 (Vlasak, J and Ionescu, R (2008 Curr. Pharm. Biotechnol. 9:468)). 제조 동안 생산 일관성을 확실하게 하고 단백질 치료제의 분해 수준을 모니터링하기 위해 전하 감수성 분리 방법이 규제청에 의해 전형적으로 요구된다 (Miller, AK, et al., (2011) J. Pharm. Sci. 100:2543; He, XPZ (2009) Electrophoresis 30:714; Sosic, Z et al., (2008) Electrophoresis 29:4368; Kim, J et al.,(2010) J. Chromatogr. B 878:1973: Teshima, G et al., (2010) J. Chromatogr. A 1218:2091).
이온 교환 크로마토그래피 (IEC)는 전형적으로 결합 및 용리 모드로 수행된다. 일반적으로 단백질 샘플, 예컨대 mAb는 칼럼에의 단백질 결합을 용이하게 한 조건 하에 고정상에 도입된다 (즉, 100% 완충제 A 중). 염 또는 pH 구배 (즉 완충제 B의 %를 증가시킴)를 적용하여 상이한 하전된 단백질이 차례로 용리되도록 유도한다. IEC 방법은 전형적으로 단백질 특이적이다. 견실한 두 방법, 즉 온도 및 pH에서의 변동을 견딜 수 있는 방법 및 전하 이종성을 충분히 해결할 수 있는 방법의 개발은 자원 집약적이다. 다중 폴리펩티드 산물 중 오염물의 존재를 결정하기 위한 강력한 검정의 개발을 가능하게 하는 최적의 완충제 시스템을 개발하는 방법이 바람직하다. 본 발명은 폴리펩티드 및 완충 시스템 둘 다의 수학적 모델링에 기초하는 이온 교환을 위한 최적의 조건을 예측하는 방법을 제공한다.
특허 출원 및 공개를 포함하여 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그의 전문이 참조로 포함된다.
일부 측면에서, 본 발명은 a) 2종 이상의 조성물 중 폴리펩티드의 아미노산 조성을 기초로 하여, 선택된 온도에서의 알짜 전하 대 pH 곡선을 플롯팅하는 단계, 및 b) 단계 a)의 플롯의 이차 도함수를 결정함으로써 중성 또는 거의 중성 pH에서의 알짜 전하 대 pH 곡선의 변곡점을 결정하는 단계를 포함하며; 여기서 최적의 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건은 1종 이상의 조성물 중 폴리펩티드에 대한 대략 공통의 변곡점에서의 pH인, 각각 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 다수의 조성물을 분석하기 위한 최적의 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건을 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 c) 2종 이상의 조성물 중 폴리펩티드에 대하여 온도에서의 변화에 대한 알짜 전하 대 pH 곡선의 변곡점 pH에서의 변화 (dIP/dT)를 결정하는 단계, d) 온도에서의 변화에 대한 완충제의 산 해리 상수에서의 변화 (dpKa/dT)가 폴리펩티드의 dIP/dT와 본질적으로 동일한, 크로마토그래피에 사용하기 위한 완충제를 선택하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 a) 폴리펩티드의 아미노산 조성을 기초로 하여, 선택된 온도에서의 알짜 전하 대 pH 곡선을 플롯팅하는 단계, 및 b) 단계 a)의 플롯의 이차 도함수를 결정함으로써 중성 또는 거의 중성 pH에서의 알짜 전하 대 pH 곡선의 변곡점을 결정하는 단계를 포함하며; 여기서 최적의 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건은 폴리펩티드에 대한 대략 변곡점에서의 pH인, 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 조성물을 분석하기 위한 최적의 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건을 확인하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 변곡점에서의 알짜 전하가 양성인 경우에, 양이온 교환 물질은 이온 교환 크로마토그래피에 사용된다. 일부 실시양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 술폰화 크로마토그래피 물질 또는 카르복실화 크로마토그래피 물질이다. 다른 실시양태에서, 변곡점에서의 알짜 전하가 음성인 경우에, 음이온 교환 물질은 크로마토그래피에 사용된다. 일부 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 4급 아민 크로마토그래피 물질 또는 3급 아민 크로마토그래피 물질이다. 또 다른 실시양태에서, 혼합 모드 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피에 사용된다. 일부 실시양태에서, 혼합 모드 이온 교환 물질은 순차적으로 패킹된 술폰화 크로마토그래피 물질 또는 카르복실화 크로마토그래피 물질 및 4급 아민 크로마토그래피 물질 또는 3급 아민 크로마토그래피 물질의 혼합물이다.
일부 실시양태에서, 완충제는 변곡점 pH에서 유효 완충 용량을 제공한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 조성물 중 폴리펩티드의 dIP/dT는 약 -0.02 pH 단위이다. 일부 실시양태에서, 온도에서의 변화는 약 20℃에서 약 70℃이다. 추가 실시양태에서, 온도에서의 변화는 약 20℃에서 약 50℃이다. 일부 실시양태에서, dpKa/dT = dIP/dT ± 50%이다. 일부 실시양태에서, 단계 d)에서 선택된 완충제 중 폴리펩티드의 알짜 전하는 30℃에 걸쳐 0.5 미만 변화한다. 일부 실시양태에서, 단계 d)에서 선택된 완충제는 약 5 mM 내지 약 250 mM 범위의 농도로 크로마토그래피에 사용된다.
상기 실시양태의 일부 실시양태에서, 완충제 조성물은 염을 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 염은 NaCl, KCl, (NH4)2SO4 또는 Na2SO4이다. 일부 실시양태에서, 염의 농도는 약 1 mM 내지 약 1M의 범위이다.
본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 또는 이뮤노어드헤신 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 모노클로날 항체 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 다른 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 단편이다.
본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 오염물은 폴리펩티드의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 오염물은 폴리펩티드의 분해 산물이다. 일부 실시양태에서, 오염물은 폴리펩티드의 전하 변이체이다.
일부 측면에서, 본 발명은 a) 각각 본 발명의 방법에 따른 표적 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 다수의 조성물에 대한 최적의 pH 및 온도 이온 교환 분리 조건을 결정하는 단계; b) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 조성물로부터 이온-교환 크로마토그래피 물질에 로딩 완충제를 사용하여 결합시키며, 여기서 로딩 완충제는 본 발명의의 방법에 의해 확인된 완충제를 포함하는 것인 단계; c) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 이온-교환 크로마토그래피 물질로부터 용리 완충제의 구배를 사용하여 용리시키며, 여기서 용리 완충제는 완충제 및 염을 포함하고, 염의 농도는 시간 경과에 따라 구배로 증가하고, 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물은 구배에 의해 분리되는 것인 단계; 및 d) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 검출하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 오염물로부터 효과적으로 분리하여 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 조성물을 분석하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 이온-교환 크로마토그래피 물질에 로딩 완충제를 사용하여 결합시키며, 여기서 로딩 완충제는 완충제를 포함하고, 크로마토그래피의 pH 및 온도는 다수의 표적 폴리펩티드에 대하여 i) 선택된 온도에서의 알짜 전하 대 pH 곡선을 플롯팅하며, 여기서 곡선은 2종 이상의 표적 폴리펩티드 중 폴리펩티드의 아미노산 조성을 기초로 하는 것, 및 ii) 단계 i)의 플롯의 이차 도함수를 결정함으로써 알짜 전하 대 pH 곡선의 변곡점을 결정하는 것에 의해 최적화되며; 여기서 최적의 이온 교환 크로마토그래피 조건은 2종 이상의 표적 폴리펩티드에 대한 공통의 변곡점에서의 pH인 단계; b) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 이온-교환 크로마토그래피 물질로부터 용리 완충제의 구배를 사용하여 용리시키며, 여기서 용리 완충제는 완충제 및 염을 포함하고, 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물은 구배에 의해 분리되는 것인 단계; 및 c) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 검출하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 오염물로부터 효과적으로 분리하여 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 조성물을 분석하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 a) 2종 이상의 표적 폴리펩티드에 대하여 온도에서의 변화에 대한 알짜 전하 대 pH 곡선의 변곡점 pH에서의 변화 (dIP/dT)를 결정하는 단계, b) 온도에서의 변화에 대한 완충제의 산 해리 상수에서의 변화 (dpKa/dT)가 공통의 변곡점을 갖는 1종 이상의 표적 폴리펩티드의 dIP/dT와 본질적으로 동일한 완충제를 선택하는 단계에 의해 확인된다. 일부 실시양태에서, 완충제는 변곡점 pH에서 유효 완충 용량을 제공한다.
일부 측면에서, 본 발명은 a) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 이온-교환 크로마토그래피 물질에 로딩 완충제를 사용하여 결합시키며, 여기서 로딩 완충제는 완충제를 포함하고, 크로마토그래피의 pH 및 온도는 다수의 표적 폴리펩티드에 대하여 최적화된 것인 단계; b) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 이온-교환 크로마토그래피 물질로부터 용리 완충제의 구배를 사용하여 용리시키며, 여기서 용리 완충제는 완충제 및 염을 포함하고, 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물은 구배에 의해 분리되는 것인 단계; 및 c) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 검출하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 오염물로부터 효과적으로 분리하여 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 조성물을 분석하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산 (ACES) 또는 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES)이다. 추가 실시양태에서, 완충제의 농도는 약 5 mM 내지 약 20 mM의 범위이다. 일부 실시양태에서, 온도에서의 변화는 약 20℃에서 약 70℃이다. 추가 실시양태에서, 온도에서의 변화는 약 20℃에서 약 50℃이다. 일부 실시양태에서, dpKa/dT = dIP/dT ± 50%이다. 일부 실시양태에서, 완충제 중 폴리펩티드의 알짜 전하는 30℃에 걸쳐 0.5 미만 변화한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 약 5 mM 내지 약 250 mM 범위의 농도로 크로마토그래피에 사용된다.
상기 실시양태의 일부 실시양태에서, 완충제 조성물은 염을 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 염은 NaCl, KCl, (NH4)2SO4 또는 Na2SO4이다. 일부 실시양태에서, 염의 농도는 약 1 mM 내지 약 1M의 범위이다. 일부 실시양태에서, 염 농도는 약 0 mM에서 약 100 mM로 약 100분 내에 상승한다. 다른 실시양태에서, 염 농도는 약 0 mM에서 약 80 mM로 약 40분 내에 상승한다.
본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 또는 이뮤노어드헤신 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 모노클로날 항체 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 다른 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 단편이다.
본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 오염물은 폴리펩티드의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 오염물은 폴리펩티드의 분해 산물이다. 일부 실시양태에서, 오염물은 폴리펩티드의 전하 변이체이다.
일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 추가 실시양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 술폰화 크로마토그래피 물질 또는 카르복실화 크로마토그래피 물질이다.
일부 측면에서, 본 발명은, 각 폴리펩티드 조성물에 대하여, a) 폴리펩티드 및 1종 이상의 전하 변이체를 이온-교환 크로마토그래피 물질에 로딩 완충제를 약 1 mL/min의 유량으로 사용하여 결합시키며, 여기서 로딩 완충제는 약 40℃에서 약 pH 7.6에서 10 mM HEPES 완충제를 포함하는 것인 단계; b) 폴리펩티드 및 전하 변이체 오염물을 이온-교환 크로마토그래피 물질로부터 용리 완충제의 구배를 사용하여 용리시키며, 여기서 용리 완충제는 약 pH 7.6에서 약 10 mM HEPES 완충제 및 NaCl을 포함하고, NaCl의 농도는 약 40분 내에 약 0 mM에서 약 80 mM로의 구배로 증가시키고, 폴리펩티드 및 그의 전하 변이체는 구배에 의해 분리되는 것인 단계; 및 c) 폴리펩티드 및 1종 이상의 전하 변이체를 검출하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 그의 전하 변이체로부터 효과적으로 분리하여 각각 폴리펩티드 및 1종 이상의 전하 변이체를 포함하는 다수의 폴리펩티드 조성물을 분석하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 다수의 폴리펩티드 조성물은 상이한 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 폴리펩티드 조성물은 다양한 pI를 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 조성물은 항체 조성물이다.
도 1은 모노클로날 항체 mAb1 (솔리드 블랭크 라인) 및 그의 2종의 전하 변이체에 대하여 계산된 알짜 전하 대 pH를 플롯팅한 그래프이다. 파선은 나타낸 바와 같이 2개의 음전하를 갖는 산성 변이체 및 2개의 양전하를 갖는 염기성 변이체를 나타낸다. 곡선은 mAb1 및 그의 변이체의 아미노산 서열 조성을 사용하여 생성되었다. 별표는 곡선의 변곡점을 나타낸다. 변곡점 pH에서의 플랫폼 IEC 방법 실행은 pH와 관련된 최적의 해상도(resolution) 및 견실성(robustness)을 제공할 수 있을 것이다.
도 2A는 pH 척도에 대한 집단 (예를 들어 폴리펩티드 용액) 중 양성자화 히스티딘 (양으로 하전됨)의 백분율의 그래프를 보여준다.
도 2B는 pH 6.5 및 pH 7.5에서 10개의 히스티딘 잔기를 함유하는 폴리펩티드 중 탈양성자화 히스티딘의 개수 (전하 빈도)를 나타낸다. 이는 변곡점 (pH 7.5)에서 대부분의 히스티딘 잔기가 탈양성자화되고 하전되지 않았음을 보여준다.
도 2C는 각각 2개의 히스티딘 잔기를 갖는 4개의 폴리펩티드 분자의 예를 보여준다. His의 pKa (pH 6.0)에서, 50%의 His 잔기는 양성자화되고, 50%는 탈양성자화된다. 이들 4개 분자 상에 있는 His 잔기의 전하 상태 조합은 pKa에서 이항 분포이며: 하나는 양성자화 His 둘 다를 갖고; 둘은 1개의 양성자화 및 또 다른 탈양성자화 His를 갖고; 하나는 탈양성자화 His 둘 다를 갖는다.
도 3은 pH의 함수로서 극성 아미노산에 있어서 전하 빈도와 관련된 전형적 모노클로날 항체의 그래프이다. 37℃에서 전하 계산에 기여하는 6종의 아미노산에 대해 다양한 pH에서 가장 풍부한 전하 상태의 확률을 실선으로 플롯팅하고, mAb1에 대해 이들 아미노산 잔기의 가중된 조합을 파선으로서 플롯팅한다.
도 4는 22℃에서 다양한 pH에서 mAb1의 샤논(Shannon) 엔트로피를 보여준다. 알짜 전하 계산에 기여하는 아미노산 잔기의 유형 및 개수는 표 3에 열거된다.
도 5는 37℃에서 다양한 pH에서 mAb1의 집단에서의 전하 분포 및 전하 분포의 빈도의 3D 도면을 보여준다. 이는 알짜 전하 vs. pH 곡선의 변곡점에서, 전하 분포가 약 0.7의 빈도로 가장 균질하고; 반면 변곡점으로부터 떨어진 pH에서는, 전하 분포는 0.15의 빈도로 더 넓어진다는 것을 보여준다. IEC 분리가 전하를 기반으로 하기 때문에, 전하 분포 빈도가 더 높을수록, 피크가 더 좁아지고, 해상도가 더 높아진다.
도 6은 mAb1에 대한 알짜 전하 vs. pH 곡선인 도 5의 2D 삽화이다. 변곡점은 온도가 37℃인 경우에 pH 7.5에 존재한다.
도 7은 37℃에서 다수의 mAb 산물에 대한 pH의 함수로서 알짜 전하를 보여주는 그래프이다. 각 mAb에 대한 계산된 알짜 전하는 mAb의 아미노산 서열을 기초로 하여 계산되었다. 일부의 mAb는 상이한 프레임워크 아미노산 서열을 가졌다. 모든 곡선의 변곡점은 37℃에서 약 pH 7.5이다.
도 8은 22℃ (다이아몬드), 37℃ (삼각형) 및 50℃ (정사각형)에서 다수의 mAb 산물에 대한 계산된 변곡점을 보여주는 그래프이다.
도 9는 22℃ 내지 50℃ 범위의 온도에서 mAb2에 대한 알짜 전하 대 pH의 관계를 보여주는 그래프이다.
도 10a는 변곡점 변화율을 보여준다. 도 10b는 선택된 mAb에 대한 온도의 함수로서 dIP에서의 변화를 보여준다. 변화율은 거의 동일하다.
도 11은 주어진 완충제 (포스페이트, HEPES, ACES 및 트리스(Tris)) 중에서 온도의 함수로서 mAb2에 대한 알짜 전하를 보여주는 그래프이다.
도 12는 동일한 크로마토그래피 절차를 사용하여 다양한 pI를 갖는 다수의 mAb의 중첩 크로마토그램을 보여준다. 완충제 A는 37℃에서 5 mM ACES pH 7.5이다. 완충제 B는 완충제 A 중 180 mM NaCl이다. 염 구배는 37℃에서 100분 내에 또는 1 mM/min으로 0 mM NaCl에서 100 mM NaCl이었다. 유량은 0.8 mL/min이었다. 칼럼은 MabPac SCX-10 칼럼 (4×250 mm)이었다.
도 13은 pH의 함수로서 mAb4에 대한 IEC의 견실성을 보여준다. 크로마토그래피 조건은 구배가 1.5 mM NaCl/min인 것을 제외하고는 도 12와 같다.
도 14는 온도의 함수로서 3종의 mAb에 대한 IEC의 견실성을 보여준다. 크로마토그래피 조건은 모든 3종의 항체에 대해 동일하고, 도 13에 기재된 바와 같다.
도 15는 온도의 함수로서 3종의 mAb에 대한 IEC의 견실성을 보여준다. 크로마토그래피 조건은 모든 3종의 항체에 대해 동일하다. 크로마토그래피 조건은 완충제가 10 mM HEPES인 것을 제외하고는 도 13에서와 같다.
도 16은 다중-산물 절차를 사용한 및 각 mAb에 대해 개발된 절차를 사용한 3종의 mAb의 IEX 크로마토그래피를 비교하는 그래프를 보여준다. 다중-산물 방법은, 50분 내에 0 mM NaCl에서 75 mM NaCl로의 구배 (1.5 mM/min)로 및 0.8 mL/min의 유량으로 37℃에서 5 mM ACES pH 7.5였다. 산물-특이적 방법을 위한 완충제 및 온도는 다양하였다. mAb8의 경우에, 이는 30℃에서 20 mM MES pH 6.5이고; mAb25의 경우에, 이는 42℃에서 20 mM HEPES pH 7.6이고; mAb26의 경우에, 이는 40℃에서 20 mM ACES pH 7.1이다. 칼럼은 MabPac SCX-10 칼럼 (4×250 mm)이었다.
도 17은 4종의 상이한 크로마토그래피 칼럼; ProPac WCX-10 (10 μm, 4×250 mm), YMC (5 μm, 4×100 mm), 안티보딕스 (5 μm, 4×250 mm) 및 MabPac SCX-10 (10 μm, 4×250 mm) 상에서 mAb8을 사용하는 다중-산물 크로마토그래피 조건의 사용을 보여준다. 크로마토그래피 조건은 도 13에 기재된 바와 같다. 삽입도는 변이체 피크의 확대를 보여준다.
도 18은 상이한 크기의 ProPac WCX-10 크로마토그래피 칼럼; 4×250 mm, 4×100 mm, 4×50 mm 상에서 mAb8을 사용하는 다중-산물 크로마토그래피 조건의 사용을 보여준다. 실행 시간은 칼럼이 짧을수록 더 짧아진다. 크로마토그램은 주요 피크에 대해 정규화된다. 크로마토그래피 조건은 구배 시간을 제외하고는 도 15에 기재된 바와 같았다.
도 19는 GMP 로부스트네스트(Robustnest) DOE 연구의 주요 피크 상대 백분율의 그래프를 보여준다.
도 20은 GMP 로부스트네스트 DOE 연구의 주요 피크 상대 백분율의 그래프를 보여준다.
도 21은 GMP 로부스트네스트 DOE 연구의 주요 피크 상대 백분율의 그래프를 보여준다.
본 발명은 a) 폴리펩티드의 아미노산 조성을 기초로 하여, 선택된 온도에서의 알짜 전하 대 pH 곡선을 플롯팅하는 단계, 및 b) 단계 a)의 플롯의 이차 도함수를 결정함으로써 중성 또는 거의 중성 pH에서의 알짜 전하 대 pH 곡선의 변곡점(IP)을 결정하는 단계를 포함하며; 여기서 최적의 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건은 폴리펩티드에 대한 대략 변곡점에서의 pH인, 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 조성물을 분석하기 위한 최적의 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건을 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 전하 분포의 빈도는 주어진 온도에 대하여 다양한 pH 값에서 폴리펩티드의 샤논 엔트로피를 계산함으로써 결정된다. 샤논 엔트로피가 감소함에 따라, 조성물 중 폴리펩티드의 전하 분포는 보다 균질해진다. 결과적으로, 폴리펩티드 및 그의 전하 변이체 사이의 분할 능력이 개선된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 조성물을 분석하기 위해 최적의 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건에 사용하는 완충제를 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 온도에 대한 산 해리 상수에서의 변화 (dpKa/dT)가 온도에 대한 상기 기재된 바와 같은 변곡점에서의 변화 (dIP/dT)와 대략 동일하도록 선택된다.
일부 측면에서, 본 발명은 a) 2종 이상의 조성물 중 폴리펩티드의 아미노산 조성을 기초로 하여, 선택된 온도에서의 알짜 전하 대 pH 곡선을 플롯팅하는 단계, 및 b) 단계 a)의 플롯의 이차 도함수를 결정함으로써 중성 또는 거의 중성 pH에서의 알짜 전하 대 pH 곡선의 변곡점을 결정하는 단계를 포함하며; 여기서 최적의 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건은 1종 이상의 조성물 중 폴리펩티드에 대한 대략 공통의 변곡점에서의 pH인, 각각 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 다수의 조성물을 분석하기 위한 최적의 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건을 확인하는 방법을 제공한다. 이와 같이, 방법은 각 산물에 대한 특정한 프로토콜을 개발할 필요 없이 다중 산물을 분석하는데 사용될 수 있다.
I. 정의
용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 본원에서 교환가능하게 사용되며, 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 이러한 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산이 개재될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로, 또는 개입, 예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분 또는 독소와의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한 상기 정의에는, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함) 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 포함된다. 본원에 사용된 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 특히 항체를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드 전하 변이체"는 그의 천연 상태로부터 변형되어 폴리펩티드의 전하가 달라진 폴리펩티드를 말한다. 일부 예에서, 전하 변이체는 모 폴리펩티드보다 더 산성이며; 즉, 모 폴리펩티드보다 낮은 pI를 갖는다. 다른 예에서, 전하 변이체는 모 폴리펩티드보다 더 염기성이며; 즉, 모 폴리펩티드보다 높은 pI를 갖는다. 이러한 변형은 조작되거나 자연 과정, 예컨대 산화, 탈아미드화, 리신 잔기의 C-말단 프로세싱, N-말단 피로글루타메이트 형성, 및 비효소적 당화의 결과일 수 있다. 일부 예에서, 폴리펩티드 전하 변이체는 단백질에 부착된 글리칸이, 예를 들어 시알산 또는 그의 유도체의 첨가에 의해 변형되어 당단백질의 전하가 모 당단백질과 비교하여 달라진 당단백질이다. 본원에서 사용된 "항체 전하 변이체"는 그의 천연 상태로부터 변형되어 항체 또는 그의 단편의 전하가 달라진 항체 또는 그의 단편이다.
"정제된" 폴리펩티드 (예를 들어, 항체 또는 이뮤노어드헤신)는 폴리펩티드가 이들이 그의 천연 환경에서 존재하는 경우보다 더 순수한 형태로 존재하도록 및/또는 실험실 조건 하에 처음 합성 및/또는 증폭될 때에 순도가 증가한 것을 의미한다. 순도는 상대적 용어이고, 반드시 절대 순도를 의미하지는 않는다.
용어 "길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 천연 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화하는 임의의 분자를 포함한다. 유사한 방식으로, 용어 "효능제"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 천연 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 임의의 분자를 포함한다. 적합한 효능제 또는 길항제 분자는 구체적으로 효능제 또는 길항제 항체 또는 항체 단편, 천연 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체 등을 포함한다. 폴리펩티드의 효능제 또는 길항제를 확인하는 방법은 폴리펩티드를 후보 효능제 또는 길항제 분자와 접촉시키고, 폴리펩티드와 통상적으로 연관되는 하나 이상의 생물학적 활성의 검출가능한 변화를 측정하는 것을 포함할 수 있다.
관심 항원, 예를 들어 종양-연관 폴리펩티드 항원 표적에 "결합하는" 결합 폴리펩티드는 폴리펩티드가 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 표적화하는 데에 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하기에 충분한 친화도로 항원에 결합하고, 다른 폴리펩티드와 유의하게 교차 반응하지 않는 것이다. 이러한 실시양태에서, "비-표적" 폴리펩티드에 대한 폴리펩티드의 결합 정도는 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석 또는 방사성면역침전법 (RIA)으로 결정할 때 그의 특정 표적 폴리펩티드에 대한 폴리펩티드 결합의 약 10% 미만일 것이다.
표적 분자에 대한 폴리펩티드의 결합과 관련해서, 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프와의 "특이적 결합" 또는 이것과 "특이적으로 결합" 또는 이에 대해 "특이적"이라는 용어는 비-특이적 상호 작용과 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어 분자의 결합을 일반적으로 결합 활성을 보유하지 않는 유사한 구조의 분자인 대조 분자의 결합과 비교하여 결정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조 분자, 예를 들어 과량의 비-표지 표적과의 경쟁에 의해 측정할 수 있다. 이 경우, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 비표지 표적에 의해 경쟁적으로 억제된다면 특이적 결합이다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다. 용어 "이뮤노글로불린" (Ig)은 본원에서 항체와 교환가능하게 사용된다.
항체는 모두 이뮤노글로불린 폴드를 기본으로 하여 다양한 구조를 갖는 자연 발생 이뮤노글로불린 분자이다. 예를 들어, IgG 항체는 디술피드-결합된 2개의 "중"쇄 및 2개의 "경"쇄를 가져 기능적 항체를 형성한다. 각각의 중쇄 및 경쇄 자체는 "불변" (C) 및 "가변" (V) 영역을 포함한다. V 영역은 항체의 항원 결합 특이성을 결정하고, C 영역은 구조 지지체를 제공하고, 면역 이펙터와 비-항원-특이적 상호작용에서 기능한다. 항체 또는 항체의 항원-결합 단편의 항원 결합 특이성은 특정한 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 능력이다.
항체의 항원 결합 특이성은 V 영역의 구조적인 특성에 의해 결정된다. 가변성이 가변 도메인의 110개 아미노산 범위에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 대신, V 영역은, 각각 9-12개 아미노산 길이인 "초가변 영역"(HVR)이라 불리는 극도의 가변성의 보다 짧은 영역에 의해 분리되어 있는, 15-30개 아미노산으로 이루어진 프레임워크 영역 (FR)이라 불리는 상대적으로 불변성인 스트레치로 이루어진다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은, 3개의 초가변 영역에 의해 연결되고 주로 β-시트 형태를 취하는 4개의 FR을 각각 포함하며, 상기 초가변 영역은 상기 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 쇄의 초가변 영역은 FR에 의해 서로 근접하게 위치하고, 다른 쇄의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접 관여하지는 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)에 있어서의 항체의 참여를 나타낸다.
각각의 V 영역은 전형적으로 3개의 HVR, 예를 들어 상보성 결정 영역 ("CDR", 이들 각각은 "초가변 루프"를 함유함), 및 4개의 프레임워크 영역을 포함한다. 따라서, 특정한 목적 항원에 실질적 친화도로 결합하는데 요구되는 최소 구조 단위인 항체 결합 부위는 전형적으로 3개의 CDR, 및 CDR을 적절한 입체형태로 유지 및 존재하도록 그 사이에 산재되어 있는 적어도 3개, 바람직하게는 4개의 프레임워크 영역을 포함할 것이다. 고전적인 4개 쇄 항체는 협력하여 VH 및 VL 도메인에 의해 한정된 항원 결합 부위를 갖는다. 특정 항체, 예컨대 낙타 및 상어 항체는 경쇄가 결여되어 있고, 단지 중쇄에 의해서만 형성되는 결합 부위에 의존적이다. 단일 도메인 조작된 이뮤노글로불린이 제조될 수 있고, 여기서 결합 부위는 VH 및 VL 사이의 협력의 부재 하에 단독 중쇄 또는 경쇄에 의해서만 형성된다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체마다 서열에서 광범위하게 상이하며, 이들 부분이 각각의 특정한 항체의 그의 특정한 항원에 대한 결합 및 특이성에 이용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 이는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 초가변 영역이라 지칭되는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 지칭된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 3개의 초가변 영역에 의해 연결되고 주로 β-시트 형태를 취하는 4개의 FR을 각각 포함하며, 상기 초가변 영역은 상기 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 쇄의 초가변 영역은 FR에 의해 서로 근접하게 위치하고, 다른 쇄의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접 관여하지는 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)에 있어서의 항체의 참여를 나타낸다.
용어 "초가변 영역" (HVR)은 본원에 사용되는 경우에 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, VL에서는 대략적으로 약 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 VH에서는 대략적으로 약 31-35B (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3)) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (예를 들어, VL에서는 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 VH에서는 26-32 (H1), 52A-55 (H2) 및 96-101 (H3)) (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))를 포함할 수 있다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
"항체 단편"은 바람직하게는 항원 결합 영역을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 탠덤 디아바디 (taDb), 선형 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,641,870, 실시예 2; 문헌 [Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)]); 1-아암 항체, 단일 가변 도메인 항체, 미니바디, 단일-쇄 항체 분자; 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들면, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3, (scFV)4-Fc, 디-scFv, 이중-scFv 또는 탠덤 (디,트리)-scFv를 포함하나, 이에 제한되지 않음); 및 이중-특이적 T-세포 연관체 (BiTE)를 포함한다.
항체를 파파인으로 소화시키면, "Fab" 단편으로 불리는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편 및 나머지 "Fc" 단편이 생성되며, 이러한 명칭은 그의 용이하게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이러한 영역은 긴밀, 비-공유 회합된 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 이러한 배위에서 각각의 가변 도메인의 3개의 초가변 영역은 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면 상에서 항원-결합 부위를 한정한다. 총괄적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 초가변 영역 3개만을 포함하는 Fv의 절반)도 전체 결합 부위보다는 낮은 친화도이지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서, Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 적어도 1개의 유리 티올 기를 보유하는 Fab'의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 가운데에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생성된다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체 (이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 지칭되는 명백하게 상이한 2가지 유형 중의 하나에 할당될 수 있다.
이들 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 상이한 부류로 지정될 수 있다. IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM인 무손상 항체의 5개의 주요 부류가 있고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분할될 수 있다. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배위는 널리 공지되어 있다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일부 실시양태에서, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성하도록 할 수 있는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 문헌 [Plueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]를 참조한다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하는데, 상기 단편은 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 동일 폴리펩티드 쇄 (VH - VL) 내에 포함한다. 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍형성하여 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강제된다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
용어 "다중특이적 항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체를 포함한다. 이러한 다중특이적 항체는 VHVL 유닛이 다중에피토프 특이성을 갖는, 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체, 각각의 VHVL 유닛이 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체, 각각의 단일 가변 도메인이 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 단일 가변 도메인을 갖는 항체, 전장 항체, 항체 단편, 예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디, 트리아바디, 삼중특이적 항체, 공유 또는 비-공유 연결된 항체 단편을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. "폴리에피토프 특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들) 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다. "단일특이적"은 1개의 에피토프에만 결합하는 능력을 지칭한다. 한 실시양태에 따르면, 다중특이적 항체는 각 에피토프에 5 μM 내지 0.001 pM, 3 μM 내지 0.001 pM, 1 μM 내지 0.001 pM, 0.5 μM 내지 0.001 pM, 또는 0.1 μM 내지 0.001 pM의 친화도로 결합하는 IgG 항체이다.
표현 "단일 도메인 항체" (sdAb) 또는 "단일 가변 도메인 (SVD) 항체"는 일반적으로 단일 가변 도메인 (VH 또는 VL)이 항원 결합을 부여할 수 있는 항체를 지칭한다. 즉, 단일 가변 도메인은 표적 항원을 인식하기 위해 또 다른 가변 도메인과의 상호작용을 필요로 하지 않는다. 단일 도메인 항체의 예는 낙타류 (라마 및 낙타) 및 연골 어류 (예를 들어, 너스 상어)로부터 유래된 것 및 인간 및 마우스 항체로부터 재조합 방법으로 유래된 것을 포함한다 (문헌 [Nature (1989) 341:544-546; Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56; Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Trends Biotechnol (2003):21:484-490]; WO 2005/035572; WO 03/035694; [Febs Lett (1994) 339:285-290]; WO00/29004; WO 02/051870).
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종의 항체 집단, 즉 집단을 구성하는 개별 항체가 모노클로날 항체의 생성 동안 발생할 수 있는 가능한 변이체 (이러한 변이체는 일반적으로 미량으로 존재함)를 제외하고는 동일하고/거나 동일한 에피토프와 결합하는 집단으로부터 수득한 항체를 지칭한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 그의 특이성에 더하여, 모노클로날 항체는 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않은 점에서 유익하다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 특징이 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 것임을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 요구한다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본원에 제공되는 방법에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567)에 의해 제조될 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 종으로부터 유래되거나 또는 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이지만, 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또는 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 (이뮤노글로불린), 뿐만 아니라 이들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]). 본원의 관심 키메라 항체는 비-인간 영장류 (예를 들어 구세계 원숭이, 예컨대 개코원숭이, 레서스 또는 시노몰구스 원숭이)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체를 포함한다 (미국 특허 번호 5,693,780).
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 정밀화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 상기 언급된 FR 치환(들)은 제외하고, 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 상세사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
본원에서 목적을 위해, "무손상 항체"는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 뿐만 아니라 Fc 영역을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 무손상 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖는다.
"천연 항체"는 통상적으로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 공유 디술피드 결합에 의해 중쇄에 연결되지만, 디술피드 연결의 수는 상이한 이뮤노글로불린 이소형의 중쇄마다 달라진다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정하게 이격된 쇄내 디술피드 가교를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (VH)을 갖고, 그 뒤에는 다수의 불변 도메인이 존재한다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (VL)을 다른쪽 말단에 불변 도메인을 갖고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되며, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면를 형성한다고 여겨진다.
"네이키드 항체"는 세포독성 모이어티 또는 방사성표지와 같은 이종 분자에 접합되지 않은 항체 (본원에 정의된 바와 같음)이다.
일부 실시양태에서, 항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 이소형에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예는 다음을 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개의 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체의 하향 조절.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식한 후에 이러한 표적 세포의 용해를 유발하는 세포-매개 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 기재된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 일부 실시양태에서, 이러한 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하며, PBMC 및 NK 세포가 바람직하다.
"보체-의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적을 용해시키는 분자의 능력을 지칭한다. 보체 활성화 경로는 동족 항원과 복합체를 형성한 분자 (예를 들어, 폴리펩티드 (예를 들어, 항체))에 보체계의 제1 성분 (C1q)이 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 추가로, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하고 상기 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함하여 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 주로 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재의 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다. (문헌 [Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토된다. 추후로 확인될 것들을 포함하여 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포괄된다. 이 용어는 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 또한 포함한다 (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976); 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]).
"오염물"은 바람직한 폴리펩티드 제품과 상이한 물질을 지칭한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 오염물은 폴리펩티드의 전하 변이체를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 오염물은 항체 또는 항체 단편의 전하 변이체를 포함한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 비제한적으로 숙주 세포 물질, 예컨대 CHOP; 침출된 단백질 A; 핵산; 바람직한 폴리펩티드의 변이체, 단편, 응집체 또는 유도체; 또 다른 폴리펩티드; 내독소; 바이러스 오염물; 세포 배양 배지 성분 등을 포함한다. 일부 예에서, 오염물은, 예를 들어 비제한적으로 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 세포, 곤충 세포, 원핵 세포, 진핵 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 조류 세포, 진균 세포로부터의 숙주 세포 단백질 (HCP)일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "이뮤노어드헤신"은 이종 폴리펩티드의 결합 특이성을 이뮤노글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 조합시킨 항체-유사 분자를 지정한다. 구조적으로, 이뮤노어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 다른 (즉, "이종") 목적하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열 및 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 이뮤노어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 전형적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 이뮤노어드헤신 내의 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG-1, IgG-2, IgG-3 또는 IgG-4 하위유형, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다.
본원에서 사용된 "본질적으로 동일하다"는 것은, 값 또는 파라미터가 유의한 영향에 의해 달라지지 않았다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 칼럼 배출구에서의 크로마토그래피 이동상의 이온 강도는, 이온 강도가 유의하게 변화하지 않았다면, 이동상의 초기 이온 강도와 본질적으로 동일하다. 예를 들어, 초기 이온 강도의 10%, 5% 또는 1% 이내에 있는, 칼럼 배출구에서의 이온 강도는 초기 이온 강도와 본질적으로 동일하다.
본원에서 값 또는 파라미터에 대해 언급되는 "약"은 해당 값 또는 파라미터 자체에 대해 지시된 변화를 포함 (및 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수형은 문맥상 달리 분명하게 언급되지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 본원에 기재된 본 발명의 측면 및 변경은 측면 및 변경으로 "이루어지는" 및/또는 "본질적으로 이루어지는" 것을 포함하는 것으로 이해된다.
II. 크로마토그래피의 방법
A. 최적의 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건의 결정
본 발명은 해상도 손실이 pH 및 온도에서의 변화에 대하여 최소화되도록 폴리펩티드에 대한 IEC를 수행하기 위한 최적의 이온 교환 조건을 예측하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이온 교환 크로마토그래피는 폴리펩티드를 포함하는 조성물 중 오염물을 검출하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 오염물은 전하 변이체이고; 예를 들어, 항체 또는 항체 단편의 염기성 전하 변이체 및/또는 산성 전하 변이체를 비롯한, 폴리펩티드의 염기성 전하 변이체 및/또는 산 전하 변이체이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드가 전하 평형에 있는 조건이 확인된다. 폴리펩티드의 알짜 전하 상태 (z) vs. pH를 그래프화하는 것은 이러한 평형을 입증한다. 곡선은 폴리펩티드의 아미노산 서열을 사용하여 제작된다. 0에 가장 가까운 기울기를 갖는 곡선의 영역이 전하 평형을 대표한다. 평형 시에 폴리펩티드의 알짜 전하 상태는 pH 변화로 인한 변화에 대해 저항하여, 곡선 상에서 그래프적으로 가장 평평한 영역으로 나타난다 (도 1). 폴리펩티드 전하 상태의 안정성은 검정 견실성에 기여한다. 폴리펩티드가 평형에 있는 조건은 pH에 대한 z 선 방정식의 이차 도함수 = 0으로 설정함으로써 구할 수 있다. 이것은 곡선의 변곡점이고, 여기서 곡선은 오목으로부터 볼록으로 또는 그 반대로 전이된다. 이 곡선 상에는 다중 변곡점 (IP)이 존재하지만 (도 1에는 나타내지 않음), 관심 변곡점은 기울기의 절대값이 더 이상 감소하지 않는 생물학적 영역 내에 있다. 이 IP는 pH와 관련된 전하 상태의 안정화로 인하여 놀랄만하게 견실한 방법을 생성한다.
폴리펩티드의 전하 평형은 IEC 해상도를 위한 이상적인 최적의 전하이며, 이는 표적 폴리펩티드와 비교하여 알짜 전하에서 약간의 차이를 갖는 오염물이 pH 값 범위에 걸쳐 검출될 수 있기 때문이다. 이는 폴리펩티드를 구성하는 아미노산의 구조 및 특성으로 인한 것이다. 6가지 아미노산을 사용하여 알짜-전하 상태 (z)를 계산하였으며 (표 1), 이는 이들이 단백질의 pH-의존성 특성을 규정하는데 중요한 역할을 수행하기 때문이다. (-log10Ka)로서 정의되고 상수 비 [A-] / [HA]에 기초하는 산 해리 상수 pKa를 사용하여 아미노산의 전하 상태를 계산하였다. 그러나, 그 결과는 실제 값이 아니라, 그 전하 상태의 확률, P였다.
<표 1> 선택된 아미노산의 산 해리 상수.
Figure pct00001
방정식 1
Figure pct00002
pH 6.5에서 히스티딘에 대해 방정식 1을 사용하는 예에 대하여, P = 10(6.5-6)/(10(6.5-6) + 1)
Figure pct00003
0.76이다. 이는, pH 6.5에서 10개의 히스티딘 잔기를 함유하는 폴리펩티드 중 각 히스티딘 잔기가 +0.24 전하 (1 -0.76)보다 오히려 비양성자화되는 76% 기회를 가질 것임을 나타낸다. 다시 말해서, pH 6.5에서 폴리펩티드 중 매 4개 히스티딘 잔기 중 대략 3개가 비양성자화될 것이다. 이는 pH 7.5에서 폴리펩티드에 대한 계산치와 비교될 수 있으며 (도 2B), 여기서 거의 모든 히스티딘 잔기가 탈양성자화된다. 가장 우세한 전하 상태의 빈도는 pH가 아미노산 측쇄의 pKa에 접근함에 따라 감소한다.
이 방정식을 결정적 아미노산에 적용하는 것은 평형에서의 작용이 최적의 해상도를 제공하는 이유를 입증한다. pH 범위에 걸쳐 6개의 전하-결정 아미노산의 확률을 가중시키면서, 가장 균질한 전하 상태를 해결할 수 있다 (도 3). 양성자화 종의 가능한 분포로 인한 상이한 전하 상태의 존재는 그 결과를 불명확하게 하고, 대상 폴리펩티드와 비교하여 알짜 전하 분포에서 약간의 변화가 있는 오염물을 검출하는 능력을 방해할 것이다. 일부 실시양태에서, 알짜 전하 분포 vs. pH의 3D 그래프를 플롯팅한다. 보다 높은 해상도가 달성되고, 여기서 전하 vs. pH vs. 빈도의 피크가 가장 예리하다 (도 5). 따라서, 견실성에 대한 pH 및 온도의 동일한 조건은 최적의 해상도를 생성한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 전하 분포의 빈도는 샤논 엔트로피를 통해 결정되고, 이는 무작위 변수에서 불확실성의 척도이다 (방정식 2). 폴리펩티드에 존재하는 6가지 아미노산 (리신, 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타메이트, 티로신 및 아르기닌)의 잔기 수 각각에 기초하여, 폴리펩티드의 주어진 pH에서의 샤논 엔트로피는 주어진 온도에서 pH의 함수로서 플롯팅된다 (도 4). 샤논 엔트로피가 낮을수록, 전하 분포가 더 균질해진다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피는 샤논 엔트로피가 대략 최소인 pH 및 온도에서 수행된다.
방정식 2
Figure pct00004
상기 식에서,
n = 결과의 가능성 (n=2, 양성자화 또는 비양성자화)
p = 결과 또는 사건의 확률 (xi) (방정식 1 참조)
b = # 시도 (하전된 아미노산 잔기의 #)
본 발명의 일부 실시양태에서, 최적의 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건은 통상의 크로마토그래피 절차가 다중 폴리펩티드 산물; 예를 들어 다중 항체 산물을 분석하는데 사용되도록 다수의 상이한 폴리펩티드에 따라 결정된다. 일부 실시양태에서, 다중 폴리펩티드 산물 (예를 들어, 다중 항체 산물)은 오염물, 예컨대 전하 변이체의 존재에 대해 본원에 기재된 방법에 의해 확인되는 통상의 크로마토그래피 절차를 사용하여 분석된다. 본 발명의 유의한 장점은 다수의 mAb를 비롯한 다수의 폴리펩티드에 대한 IP가 동일한 pH에서 발생한다는 것이며 (도 7), 이 지점에서는 전하의 개수만 단지 상이하다. 따라서, 이들 폴리펩티드에 대하여 모든 IEC에 대한 최적의 조건, 즉 폴리펩티드가 전하 평형에 있는 pH 및 온도는 동일할 것이다.
조건에서의 변화가 IP로부터의 이탈을 야기하지 않을 것임을 확실하게 하기 위해, 용어 dIP/dT 값이 사용된다. 단백질의 dIP/dT는 온도에서의 변화와 관련하여 알짜 전하 vs. pH의 곡선에서 폴리펩티드의 변곡점에서의 변화이다. 주어진 폴리펩티드에 대한 변곡점은 알짜 전하 vs. pH의 플롯이 결정되는 온도를 기준으로 하여 변동할 것이다. 그러나, 변곡점 pH가 온도 증가에 따라 감소하더라도 (예를 들어 도 8 및 9), 알짜 전하는 일정하게 남아있다. 따라서, 변곡점에 대한 크로마토그래피의 최적화는 또한 온도 변동에 대한 이온 교환 방법 견실성을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 다중 폴리펩티드 중 주어진 폴리펩티드에 대해 사용하기 위한 이온 교환 크로마토그래피의 유형을 결정하는 수단을 제공한다. 예를 들어, 변곡점에서의 알짜 전하가 양성인 경우에, 양이온 교환 크로마토그래피 물질이 사용된다. 양이온 교환 크로마토그래피 물질의 비제한적 예가 하기에 제공된다. 일부 실시양태에서, 통상의 양이온 교환 크로마토그래피 절차는 다수의 폴리펩티드 (예를 들어 항체)를 분석하는데 사용되고, 여기서 다수의 폴리펩티드는 공통의 변곡점에서 알짜 양전하를 갖는다. 변곡점에서의 알짜 전하가 음성인 경우에, 음이온 교환 크로마토그래피 물질이 사용된다. 음이온 교환 크로마토그래피 물질의 비제한적 예는 하기에 제공된다. 일부 실시양태에서, 통상의 음이온 교환 크로마토그래피 절차는 다수의 폴리펩티드 (예를 들어 항체)를 분석하는데 사용되고, 여기서 다수의 폴리펩티드는 공통의 변곡점에서 알짜 음전하를 갖는다.
B. 최적의 완충제 시스템의 결정
일부 실시양태에서, 본 발명은 크로마토그래피 절차에 사용하기 위한 최적의 완충제를 선택하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 온도에서의 변화에 대한 변곡점에서의 변화로서의 산 해리 상수 (pKa)에서 유사한 변화율을 갖는 완충제 시스템이 크로마토그래피 절차에 사용된다. 단백질의 dIP/dT와 대략 동등한, 온도에서의 변화에 대한 pKa에서의 변화 (즉 dpKa/dT)를 갖는 완충제의 선택은 온도에서의 임의의 변화가 단백질이 IP에서 유지되도록 하고 따라서 분석 크로마토그래피의 견실성에 기여하도록 할 것을 확실하게 한다. 일부 실시양태에서, (dIP/dT)폴리펩티드(들)
Figure pct00005
(dpKa/dT)완충제이다. 일부 실시양태에서, 완충제는 ACES 완충제 또는 HEPES 완충제이다. 완충제 ACES 또는 HEPES를 사용하는 예에 대하여, 변곡점에서 예시적인 mAb의 전하 상태는 30℃에 걸쳐 0.5 미만 변화한다 (도 11).
방정식 3 dIP/dT
Figure pct00006
dpKa/dT
일부 실시양태에서, 완충제는 변곡점 pH에서 유효 완충 용량을 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드(들)의 dIP/dT는 약 -0.02이다. 일부 실시양태에서, 온도에서의 변화는 약 20℃에서 약 50℃이다. 일부 실시양태에서, dIP/dT=dpKa/dT±1%, dIP/dT=dpKa/dT±2%, dIP/dT=dpKa/dT±3%, dIP/dT=dpKa/dT±4%, dIP/dT=dpKa/dT±5%, dIP/dT=dpKa/dT±6%, dIP/dT=dpKa/dT±7%, dIP/dT=dpKa/dT±8%, dIP/dT=dpKa/dT±9%, dIP/dT=dpKa/dT±10%, dIP/dT=dpKa/dT±20%, dIP/dT=dpKa/dT±30%, dIP/dT=dpKa/dT±40%, 또는 dIP/dT=dpKa/dT±50%이다. 일부 실시양태에서, 선택된 완충제 중 폴리펩티드(들)의 알짜 전하는 약 5℃, 10℃, 15℃, 20℃, 25℃ 또는 30℃ 초과에 걸쳐 1 미만 변화한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 오염물, 예컨대 전하 변이체를 검출하기 위한 고해상도 및 견실한 다중산물 폴리펩티드 IEC를 개발하는 방법을 제공한다. 조건은 모 폴리펩티드로부터 하전된 변이체의 분할을 개선하기 위해 폴리펩티드 (예를 들어 mAb)가 전하 평형에 있도록 설계된다. 전하 평형은 계산된 알짜 전하 상태 (z) vs. pH를 그래프화함으로써 다수의 폴리펩티드 산물 (예를 들어 mAb 산물)에 대해 결정된다. 폴리펩티드가 평형에 있는 조건은 pH에 대한 z 선 방정식의 이차 도함수 = 0으로 설정함으로써 구한다.
주어진 pH에서 폴리펩티드의 알짜 전하는 단백질의 pH-의존성 특성을 그의 측쇄에 의해 정의하는데 중요한 역할을 수행하는, mAb에 있는 6가지 아미노산의 함량을 기초로 하여 결정된다. 6가지 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 티로신, 리신 및 아르기닌이다. 6가지 아미노산의 산 해리 상수 (pKa, -log10Ka로서 정의됨)는 알짜-전하 상태 (z)를 계산하는데 사용된다 (표 1). 예를 들어, 6.02 미만의 pH 값에서, 히스티딘은 평균적으로 양성자화되어 양전하를 수반하는 반면, 6.02 초과의 pH 값에서는, 히스티딘은 평균적으로 비양성자화되어 전하를 수반하지 않는다. 주어진 pH에 대한 가장 풍부한 전하 상태의 확률을 6가지 아미노산 각각에 대해 결정하였고, 주어진 pH에서 mAb1의 전하의 가중된 확률은 항체에 존재하는 이들 6가지 아미노산 각각의 잔기 수를 기초로 하여 결정하였다. 전하 분포의 빈도는 또한 샤논 엔트로피를 통해 결정될 수 있고, 이는 무작위 변수에서 불확실성의 척도이다 (방정식 3). 폴리펩티드에 존재하는 이들 6가지 아미노산 각각의 잔기 수에 기초 하여, 폴리펩티드에 대한 주어진 pH에서의 샤논 엔트로피는 pH의 함수로서 플롯팅될 수 있다. 샤논 엔트로피가 낮아질수록, 전하 분포는 더 균질해진다. 이 데이터로부터, 폴리펩티드의 알짜 전하의 분포가 pH의 함수로서 플롯팅되고, 중성 pH에 가장 가까운 변곡점 (IP)이 결정된다. 이는 가장 균질한 전하 상태를 갖는 pH이고, IEC 분리에서 가장 예리한 피크를 생성할 것이다. 다중산물 IEC 프로토콜을 개발하기 위해, 다양한 pI를 갖는 다수의 표적 폴리펩티드 (예를 들어 표적 MAb)에 대한 변곡점이 결정된다. IP의 표적화는 IEC의 pH 견실성을 개선할 수 있다.
용어 dIP/dT는 온도에서의 변화에 대한 분자 IP에서의 변화를 나타낸다. 이들 결과로부터, 최적의 완충제는 온도 함수로서 완충제의 산 해리 상수에서의 변화가 dIP/dT에 근접하여 (즉, dIP/dT
Figure pct00007
dpKa/dT) 온도 효과를 최소화하고 검정 견실성을 개선하도록 하여 선택될 수 있다. 다수의 완충제에 대하여 온도 함수로서 pKa에서의 변화 (dpKa/dT)의 공개된 값은 하기와 같다: 포스페이트: -0.0028, HEPES: -0.014, ACES: -0.02, 트리스: -0.028, 비신(Bicine): -0.018, 트리신(Tricine): -0.021, TAPS: -0.02, 및 CHES: -0.018 (Benyon, RJ & Easterby, JS, Buffer Solutions The Basics, IRL Press, 1996).
일부 측면에서, 본 발명은, 각 항체 조성물에 대하여, a) 항체 및 1종 이상의 전하 변이체를 이온-교환 크로마토그래피 물질에 로딩 완충제를 약 1 mL/min의 유량으로 사용하여 결합시키며, 여기서 로딩 완충제는 약 40℃에서 약 pH 7.6에서 10 mM HEPES 완충제를 포함하는 것인 단계; b) 항체 및 전하 변이체 오염물을 이온-교환 크로마토그래피 물질로부터 용리 완충제의 구배를 사용하여 용리시키며, 여기서 용리 완충제는 약 pH 7.6에서 약 10 mM HEPES 완충제 및 NaCl을 포함하고, NaCl의 농도는 약 40분 내에 약 0 mM에서 약 80 mM로의 구배로 증가시키고, 항체 및 그의 전하 변이체는 구배에 의해 분리되는 것인 단계; 및 c) 항체 및 1종 이상의 전하 변이체를 검출하는 단계를 포함하는, 항체를 그의 전하 변이체로부터 효과적으로 분리하여 각각 항체 및 항체의 1종 이상의 전하 변이체를 포함하는 다수의 항체 조성물을 분석하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 다수의 항체 조성물은 다양한 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 항체 조성물은 다양한 pI를 갖는 항체를 포함한다.
C. 크로마토그래피
일부 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물, 예를 들어 폴리펩티드 변이체를 이온 교환 크로마토그래피 물질에 초기 이온 강도를 갖는 로딩 완충제를 사용하여 결합시키는 단계, 및 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 이온 교환 칼럼으로부터 용리 완충제를 사용하여 용리시키며, 여기서 용리 완충제의 이온 강도는 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물이 크로마토그래피 물질로부터 별개의 개별 물질로서 용리되도록 하는 이온 강도 구배에 의해 달라지는 것인 단계를 포함하는, 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물, 예를 들어 폴리펩티드 변이체를 포함하는 조성물을 분석하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 방법은 다양한 pI를 갖는 다중 폴리펩티드 (예를 들어 폴리펩티드 산물)에 적합하다. 예를 들면, 방법은 6.0 내지 9.5 범위의 pI를 갖는 다수의 다양한 항체 산물에 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 크로마토그래피 방법은 본원에 기재된 방법에 의해 확인된 최적의 완충제의 사용을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 물질이다. 일부 실시양태에서, 양이온 교환 물질은 본원에 기재된 바와 같이 폴리펩티드가 변곡점에 양으로 하전된 경우에 사용된다. 일부 실시양태에서, 양이온 교환 물질은 음으로 하전되고 고체 상 위를 지나가거나 또는 이를 통과하는 수용액 중에서 양이온과의 교환을 위한 유리 양이온을 갖는 고체 상이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 양이온 교환 물질은 막, 모노리스, 또는 수지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 양이온 교환 물질은 수지일 수 있다. 양이온 교환 물질은 카르복실산 관능기 또는 술폰산 관능기, 예컨대 술포네이트, 카르복실산, 카르복시메틸 술폰산, 술포이소부틸, 술포에틸, 카르복실, 술포프로필, 술포닐, 술폭시에틸 또는 오르토포스페이트를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 상기 일부 실시양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼이다. 일부 실시양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 7.0 내지 약 9.5 범위의 pI를 갖는, 다양한 폴리펩티드, 예를 들어 다양한 항체 또는 그의 단편에 사용된다. 일부 실시양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 본원에 기재된 방법에 의해 확인된 최적의 완충제를 사용하는 크로마토그래피 방법에 사용된다.
양이온 교환 물질의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 무스탕(Mustang) S, 사토바인드(Sartobind) S, SO3 모노리스(Monolith), S 세라믹 하이퍼D(Ceramic HyperD), 포로스(Poros) XS, 포로스 HS50, 포로스 HS20, SPSFF, SP-세파로스 XL (SPXL), CM 세파로스 패스트 플로우(Sepharose Fast Flow), 캅토(Capto) S, 프락토겔(Fractogel) Se 하이캡(HiCap), 프락토겔(Fractogel) SO3 또는 프락토겔 COO를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 양이온 교환 물질은 포로스 HS50이다. 일부 실시양태에서, 포로스 HS 수지는 포로스 HS 50 μm 또는 포로스 HS 20 μm 입자일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼의 예는 ProPac WCX-10, ProPac WCX-10HT, MabPac SCX-10 5μm 및 MabPac SCX-10 10μm를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 물질이다. 일부 실시양태에서, 음이온 교환 물질은 본원에 기재된 바와 같이 폴리펩티드가 변곡점에서 음으로 하전된 경우에 사용된다. 일부 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 양으로 하전되고 고체 상 위를 지나가거나 또는 이를 통과하는 수용액 중에서 음이온과의 교환을 위한 유리 음이온을 갖는 고체 상이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 음이온 교환 물질은 막, 모노리스, 또는 수지일 수 있다. 한 실시양태에서, 음이온 교환 물질은 수지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 음이온 교환 물질은 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민 또는 4급 암모늄 이온 관능기, 폴리아민 관능기, 또는 디에틸아미노에틸 관능기를 포함할 수 있다. 상기 일부 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼이다. 일부 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 7 미만의 pI를 갖는 폴리펩티드, 예를 들어 항체 또는 그의 단편에 사용된다. 일부 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 약 4.5 내지 약 7.0 범위의 pI를 갖는, 다양한 폴리펩티드, 예를 들어 다양한 항체 또는 그의 단편에 사용된다. 일부 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 본원에 기재된 방법에 의해 확인된 최적의 완충제를 사용하는 크로마토그래피 방법에 사용된다.
음이온 교환 물질의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 포로스 HQ 50, 포로스 PI 50, 포로스 D, 머스탱 Q, Q 세파로스 FF 및 DEAE 세파로스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼의 예는 디오넥스(Dionex) 프로팩 10 SAX 및 토소(Tosoh) GSK겔 Q STAT 7 μM WAX를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 하기 관능성 중 하나 이상일 수 있는 관능기를 포함하는 혼합 모드 물질이다: 음이온 교환, 양이온 교환, 수소 결합 및 소수성 상호작용. 일부 실시양태에서, 혼합 모드 물질은 음이온 교환 및 소수성 상호작용을 가능하게 하는 관능기를 포함한다. 혼합 모드 물질은 리간드로서 N-벤질-N-메틸 에탄올 아민, 4-메르캅토-에틸-피리딘, 헥실아민 또는 페닐프로필아민을 함유하거나 가교 폴리알릴아민을 함유할 수 있다. 혼합 모드 물질의 예는 캅토 어드히어 수지, QMA 수지, 캅토 MMC 수지, MEP 하이퍼셀 수지, HEA 하이퍼셀 수지, PPA 하이퍼셀 수지 또는 크로마소르브 막 또는 사토바인드 STIC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 혼합 모드 물질은 캅토 어드히어 수지이다. 상기 일부 실시양태에서, 혼합 모드 물질은 혼합 모드 크로마토그래피 칼럼이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 이온 교환 물질은 종래의 크로마토그래피 물질 또는 전달성 크로마토그래피 물질을 활용할 수 있다. 통상적인 크로마토그래피 물질은 예를 들어 살포성 물질 (예를 들어, 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 수지) 및 확산성 물질 (예를 들어, 가교 아가로스 수지)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 수지는 포로스(Poros) 수지일 수 있다. 일부 실시양태에서, 가교 아가로스 수지는 술포프로필-세파로스 패스트 플로우 ("SPSFF") 수지일 수 있다. 전달성 크로마토그래피 물질은 막 (예를 들어, 폴리에테르술폰) 또는 모노리스 물질 (예를 들어 가교 중합체)일 수 있다. 폴리에테르술폰 막은 무스탕일 수 있다. 가교 중합체 모노리스 물질은 가교 폴리(글리시딜 메타크릴레이트-코-에틸렌 디메타크릴레이트)일 수 있다.
본 발명의 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 칼럼; 예를 들어 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼 또는 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼에 존재한다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 칼럼은 액체 크로마토그래피를 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 칼럼은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 칼럼은 HPLC 크로마토그래피 칼럼; 예를 들어, 양이온 교환 HPLC 칼럼 또는 음이온 교환 HPLC 칼럼이다.
본 발명의 다중산물 크로마토그래피 방법에 사용될 수 있는 예시적인 HPLC 절차는 하기와 같지만; 본 발명의 방법이 이러한 절차에 한정되는 것으로 해석되지 않는다. 샘플을 오토샘플러에 첨가하고 냉장시킨다 (5 ± 3℃). 칼럼을 칼럼 구획에 위치시키고, 온도 제어 기구를 사용하여 구획 온도를 분석 동안에 설정값으로부터 좁은 범위 (± 1℃) 내에서 유지할 수 있다. 칼럼 용리액을 280 nm에서 모니터링한다.
샘플을 이동상을 사용하여 대략 1-2 mg/mL의 표적 폴리펩티드 농도로 희석시킨다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 1:100 (w/w)의 비로 첨가되는 카르복시펩티다제 B (CpB)로 소화시키고, 37℃에서 20분 동안 인큐베이션한다. 샘플을 분석할 때까지 5℃에서 저장할 수 있다.
기구는 저압 4원 구배용리 펌프, 온도 제어 능력을 갖는 급속 분리 오토샘플러, 열적 제어 칼럼 구획 및 다이오드 어레이 UV 검출기를 포함할 수 있다. 검출기의 유출구에, PCM-3000 pH 및 전도도 모니터가 연결되어 pH 및 전도도 데이터를 실시간으로 수집할 수 있다. 예를 들어 버전 6.8의 써모 사이언티픽 디오넥스 크로멜레온(Thermo Scientific Dionex Chromeleon) 소프트웨어를 사용하여, 기구 제어, 데이터 수집, 및 데이터 분석을 수행할 수 있다.
샘플은 탈이온수를 사용하여 2 mg/mL로 희석하고, 오토-샘플러에서 5±3℃에서 유지할 수 있다. MabPac SCX-10, 4 x 250 mm 칼럼을 온도가 37±1℃에서 설정된 칼럼 구획에 넣는다. 각 크로마토그래피 진행을 위해, 10 μL의 단백질 (20 μg)을 주입한다. 완충제 A는 37℃에서 5 mM ACES pH 7.5이다. 완충제 B는 완충제 A 중 180 mM NaCl이다. 구배는 완충제 B를 완충제 A 내로 혼합함으로써 100분 내 1 mM/min으로 0-100 mM NaCl이다. 유량은 0.8 mL/min이다. 단백질은 280 nm에서 흡광도에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, 완충제 A는 40℃에서 10 mM HEPES 완충제 pH 7.6이고, 완충제 B는 100 mM NaCl이다.
본원에 사용된 용리는 산물, 예를 들어 폴리펩티드, 및 또는 오염물의, 크로마토그래피 물질로부터의 제거이다. 용리 완충제는 관심 폴리펩티드 또는 다른 산물을 크로마토그래피 물질로부터 용리하는데 사용되는 완충제이다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제는 크로마토그래피의 이동상의 일부이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 및 오염물을 포함하는 조성물은 이동상의 일부로서 크로마토그래피 물질에 적용된다. 그 후에, 이동상은 폴리펩티드로서의 오염물로부터 폴리펩티드의 분리를 가능하도록 변경되고, 오염물은 크로마토그래피 물질로부터 용리된다. 대부분의 경우에, 용리 완충제는 로딩 완충제와는 상이한 물리적 특성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제의 이온 강도는 로딩 완충제와 비교하여 용리의 과정 경과에 따라 증가된다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피는 다중-산물 크로마토그래피 절차이다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제는 본원에 기재된 방법에 의해 확인된 최적의 완충제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 이온 강도 구배는 염 구배이다. 일부 실시양태에서, 염 구배는 약 0 mM의 염 내지 약 200 mM의 염의 구배이다. 일부 실시양태에서, 염 구배는 약 0 mM 내지 약 100 mM, 0 mM 내지 약 60 mM, 0 mM 내지 약 50 mM, 0 mM 내지 약 40 mM, 0 mM 내지 약 30 mM, 0 mM 내지 약 20 mM, 0 mM 내지 약 10 mM, 10 mM 내지 약 200 mM, 10 mM 내지 약 100 mM, 10 mM 내지 약 50 mM, 10 mM 내지 약 40 mM, 10 mM 내지 약 30 mM, 10 mM 내지 약 20 mM, 20 mM 내지 약 200 mM, 20 mM 내지 약 100 mM, 20 mM 내지 약 50 mM, 20 mM 내지 약 30 mM, 30 mM 내지 약 200 mM, 30 mM 내지 약 100 mM, 및 30 mM 내지 약 50 mM 중 어느 하나이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 이동상, 예를 들어 용리 완충제의 이온 강도는 이동상의 전도도에 의해 측정된다. 전도도는 2개의 전극 사이의 전류를 통하게 하는 수용액의 능력을 지칭한다. 용액 내에서는 이온 수송에 의해 전류가 흐른다. 따라서, 수용액 중에 존재하는 이온량을 증가시키면, 용액은 보다 큰 전도도를 갖게 될 것이다. 전도도의 기본 측정 단위는 지멘(Siemen) (또는 mho), mho (mS/cm)이며, 전도도 측정기, 예컨대 다양한 모델의 오리온(Orion) 전도도 측정기를 사용하여 측정할 수 있다. 전해질 전도도란 전류를 운반할 수 있는 용액 중의 이온의 능력이기 때문에 용액의 이온 농도를 변화시킴으로써 용액의 전도도를 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 바람직한 전도도를 얻기 위해 용액 중 완충제의 농도 및/또는 염 (예를 들어, 염화나트륨, 아세트산나트륨, 또는 염화칼륨)의 농도를 변화시킬 수 있다. 바람직하게는, 다양한 완충제의 염 농도를 변형시켜 바람직한 전도도를 달성한다.
일부 실시양태에서, 크로마토그래피의 이동상은 약 0.0 mS/cm, 0.5 mS/cm, 1.0 mS/cm, 1.5 mS/cm, 2.0 mS/cm, 2.5 mS/cm, 3.0 mS/cm, 3.5 mS/cm, 4.0 mS/cm, 4.5 mS/cm, 5.0 mS/cm, 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 7.0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8.0 mS/cm, 8.5 mS/cm, 9.0 mS/cm, 9.5 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 17.0 mS/cm, 18.0 mS/cm, 19.0 mS/cm, 또는 20.0 mS/cm 중 어느 하나를 초과하는 초기 전도도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 이동상의 전도도는 크로마토그래피 과정 동안에, 예를 들어 이온 강도 구배에 의해 증가한다. 일부 실시양태에서, 용리가 완료되었을 때 이동상의 전도도는 약 1.0 mS/cm, 1.5 mS/cm, 2.0 mS/cm, 2.5 mS/cm, 3.0 mS/cm, 3.5 mS/cm, 4.0 mS/cm, 4.5 mS/cm, 5.0 mS/cm, 5.5 mS/cm, 6.0 mS/cm, 6.5 mS/cm, 7.0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8.0 mS/cm, 8.5 mS/cm, 9.0 mS/cm, 9.5 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 17.0 mS/cm, 18.0 mS/cm, 19.0 mS/cm, 또는 20.0 mS/cm 중 어느 하나를 초과한다. 일부 실시양태에서, 이동상의 전도도는 선형 구배에 의해 증가한다. 일부 실시양태에서, 이동상의 전도도는 하나 이상의 단계를 포함하는 단계형 구배에 의해 증가한다.
본원에 기재된 임의의 방법, 예를 들어 다중-산물 크로마토그래피 절차 또는 본원에 기재된 방법에 의해 확인된 최적의 완충제를 포함하는 크로마토그래피 절차의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 조성물은 약 1 μg, 2 μg, 3 μg, 4 μg, 5 μg, 6 μg, 7 μg, 8 μg, 9 μg, 10 μg, 15 μg, 20 μg, 25 μg 또는 50 μg 중 어느 하나를 초과하는 양으로 크로마토그래피 물질 상에 로딩된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 0.5 mg/mL, 1.0 mg/mL, 1.5 mg/mL, 2.0 mg/mL, 2.5 mg/mL, 및 5.0 mg/mL 중 어느 하나를 초과하는 농도로 크로마토그래피 물질에 로딩된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 크로마토그래피 물질에 로딩하기 전에 희석되며; 예를 들어, 1:1, 1:2, 1:5, 1:10 또는 1:10을 초과하여 희석된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 크로마토그래피의 이동상으로 희석된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 로딩 완충제로 희석된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 유량은 0.5 mL/min, 0.6 mL/min, 0.7 mL/min, 0.8 mL/min, 0.9 mL/min, 1.0 mL/min, 1.1 mL/min, 1.2 mL/min, 1.3 mL/min, 1.4 mL/min, 1.5 mL/min, 1.75 mL/min 및 2.0 mL/min 중 대략 임의의 것 초과이다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 칼럼에 존재한다. 일부 실시양태에서, 칼럼은 HPLC 칼럼이다. 일부 실시양태에서, 칼럼은 하기 치수 중 어느 하나를 갖는다: 4 x 50 mm, 4 x 100 mm, 4 x 150 mm, 4 x 200 mm, 4 x 250 mm 또는 2 x 250 mm.
D. 전하 변이체의 검출
일부 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드의 조성물 중 폴리펩티드 및 1종 이상의 변이체를 포함하는 조성물에서 폴리펩티드 (예를 들어 항체)의 변이체를 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 변이체는 상기 기재된 바와 같이 최적화된 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건을 사용하여 분석된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 변이체는 완충제가 상기 기재된 바와 같이 최적화된 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분석된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 변이체는 분리 조건 및 완충제가 상기 기재된 바와 같이 최적화된 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분석된다. 일부 실시양태에서, 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건 및/또는 완충제는 예를 들어, 1종 이상의 표적 폴리펩티드 (예를 들어 1종 이상의 항체)에 대한 공통의 dIP/dT 값을 확인함으로써 다수의 폴리펩티드에 대하여 최적화된다. 상기 방법은 폴리펩티드 및 1종 이상의 변이체를 이온 교환 크로마토그래피 물질에 초기 이온 강도를 갖는 로딩 완충제를 사용하여 결합시키는 단계, 및 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 이온 교환 칼럼으로부터 용리 완충제를 사용하여 용리시키며, 여기서 용리 완충제의 이온 강도는 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물이 크로마토그래피 물질로부터 별개의 개별 물질로서 용리되도록 하는 이온 강도 구배에 의해 달라지는 것인 단계를 포함한다. 그 후에, 크로마토그래피의 용리액을 모 폴리펩티드 및 변이체의 존재에 대하여 분석한다. 폴리펩티드의 변이체는 폴리펩티드의 산성 변이체 및 모 폴리펩티드의 염기성 변이체를 포함할 수 있다. 산성 변이체, 즉 모 폴리펩티드의 pI보다 낮은 pI를 갖는 변이체의 예는 하나 이상의 글루타민 및/또는 아스파라긴 잔기가 탈아미드화된 폴리펩티드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 염기성 폴리펩티드 변이체, 즉 모 폴리펩티드의 pI보다 높은 pI를 갖는 변이체의 예는 아스파르트산 잔기가 숙신이미드 잔기로 변형된 변이체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 6.0 내지 약 9.5 범위의 pI를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 6.0 내지 약 9.5 범위의 pI를 갖는 항체이다.
E. 조성물 중 폴리펩티드의 순도의 결정
일부 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드를 포함하는 조성물 중 폴리펩티드의 순도를 결정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 폴리펩티드의 순도는 상기 기재된 바와 같이 최적화된 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건을 사용하여 분석된다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 폴리펩티드의 순도는 완충제가 상기 기재된 바와 같이 최적화된 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분석된다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 폴리펩티드의 순도는 분리 조건 및 완충제가 상기 기재된 바와 같이 최적화된 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분석된다. 일부 실시양태에서, 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건 및/또는 완충제는 예를 들어, 1종 이상의 표적 폴리펩티드 (예를 들어 1종 이상의 항체)에 대한 공통의 dIP/dT 값을 확인함으로써 다수의 폴리펩티드에 대하여 최적화된다. 상기 방법은 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 이온 교환 크로마토그래피 물질에 초기 이온 강도를 갖는 로딩 완충제를 사용하여 결합시키는 단계, 및 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 이온-교환 칼럼으로부터 용리 완충제를 사용하여 용리시키며, 여기서 용리 완충제의 이온 강도는 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물이 크로마토그래피 물질로부터 별개의 개별 물질로서 용리되도록 하는 이온 강도 구배에 의해 달라지는 것인 단계를 포함한다. 폴리펩티드의 순도는 크로마토그래피 물질로부터 용리되는 오염물, 예를 들어 전하 변이체의 총량에 대한, 크로마토그래피 물질로부터 용리되는 폴리펩티드의 양의 비를 결정함으로써 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 6.0 내지 약 9.5 범위의 pI를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 약 6.0 내지 약 9.5 범위의 pI를 갖는 항체이다.
F. 조성물 중 폴리펩티드의 안정성 결정
일부 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드를 포함하는 조성물 중 폴리펩티드의 안정성을 측정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 폴리펩티드의 안정성은 분리 조건이 상기 기재된 바와 같이 최적화된 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 폴리펩티드의 안정성은 완충제가 상기 기재된 바와 같이 최적화된 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 폴리펩티드의 안정성은 분리 조건 및 완충제가 상기 기재된 바와 같이 최적화된 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건 및/또는 완충제는 예를 들어, 1종 이상의 표적 폴리펩티드 (예를 들어 1종 이상의 항체)의 공통의 dIP/dT 값을 확인함으로써 다수의 폴리펩티드에 대하여 최적화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 샘플을 시간에 걸쳐 분석한다. 일부 실시양태에서, 조성물을 분석 전에 다양한 시간으로 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 조성물을 분석 전에 약 0℃, 20℃, 37℃ 또는 40℃ 중 어느 하나를 초과하여 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 조성물을 분석 전에 1일, 2일, 3일, 5일, 1주, 2주, 3주, 4주, 6주, 2개월, 3개월, 6개월, 1년 중 하나 이상 동안 인큐베이션한다. 그 후에, 조성물은 조성물 중 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 이온 교환 크로마토그래피 물질에 초기 이온 강도를 갖는 로딩 완충제를 사용하여 결합시키고, 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 이온 교환 칼럼으로부터 용리 완충제를 사용하여 용리시키며, 여기서 용리 완충제의 이온 강도는 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물이 크로마토그래피 물질로부터 별개의 개별 물질로서 용리되도록 하는 이온 강도 구배에 따라 달라지게 하여 분석된다. 폴리펩티드 대 오염물의 비에서의 변화는 조성물 중 폴리펩티드의 안정성을 나타낸다. 예를 들어, 폴리펩티드 대 오염물의 비가 시간 경과에 따라 변화하지 않는 경우에, 폴리펩티드는 안정한 것으로 간주될 수 있고, 반면에 조성물 중 폴리펩티드의 양이 감소함과 동시에 오염물의 급속한 축적은 조성물 중 폴리펩티드가 덜 안정하다는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 폴리펩티드의 안정성은 분리 조건이 상기 기재된 바와 같이 최적화된 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분석된다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 폴리펩티드의 안정성은 완충제가 상기 기재된 바와 같이 최적화된 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분석된다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 폴리펩티드의 안정성은 분리 조건 및 완충제가 상기 기재된 바와 같이 최적화된 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분석된다. 일부 실시양태에서, 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건 및/또는 완충제는 예를 들어, 1종 이상의 표적 폴리펩티드 (예를 들어 1종 이상의 항체)의 공통의 dIP/dT 값을 확인함으로써 다수의 폴리펩티드에 대하여 최적화된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 6.0 내지 약 9.5 범위의 pI를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 6.0 내지 약 9.5 범위의 pI를 갖는 항체이다. 폴리펩티드의 예는 항체 및 항체 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
G. 폴리펩티드의 정제
일부 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 조성물로부터 폴리펩티드, 예컨대 항체를 정제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 기재된 바와 같이 크로마토그래피 분리 조건을 최적화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 완충제가 상기 기재된 바와 같이 최적화된 크로마토그래피를 사용하여 정제된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 분리 조건 및 완충제가 상기 기재된 바와 같이 최적화된 크로마토그래피를 사용하여 젱제된다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 분리 조건 및/또는 완충제는 예를 들어, 1종 이상의 표적 폴리펩티드 (예를 들어 1종 이상의 항체)의 공통의 dIP/dT 값을 확인함으로써 다수의 폴리펩티드에 대하여 최적화된다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피는 이온 교환 크로마토그래피; 예를 들어 양이온 교환 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피이다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피는 혼합 모드 크로마토그래피이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 폴리펩티드 및 오염물을 이온 교환 크로마토그래피 물질 또는 혼합 모드 크로마토그래피 물질에 크로마토그래피 온도에서 폴리펩티드의 변곡점에서의 pH를 갖는 로딩 완충제를 사용하여 결합시키는 것을 포함한다. 로딩 완충제는 초기 이온 강도를 갖는다. 그 후에, 폴리펩티드는 이온-교환 크로마토그래피 매질 또는 혼합 모드 크로마토그래피 매질로부터 용리 완충제를 사용하여 용리시키며, 여기서 용리 완충제의 이온 강도는 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물이 크로마토그래피 물질로부터 별개의 개별 물질로서 용리되도록 하는 이온 강도 구배에 따라 달라진다. 분획은 크로마토그래피의 용리기 동안 수집되고, 오염물이 전혀 없거나 최소로 갖는 폴리펩티드를 함유하는 분획은 추가의 가공 또는 제약 제제를 위해 모아진다. 폴리펩티드의 예는 항체 및 항체 분획을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
III. 폴리펩티드
폴리펩티드가 임의의 이온 교환 크로마토그래피 방법에 사용하기 위해 제공되며, 여기서 분리 조건은 본원에 기재된 바와 같이 최적화된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 조성물은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분석된다. 이러한 방법은 조성물 내의 폴리펩티드의 전하 변이체를 확인하는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 6.0 내지 약 9.5 범위의 pI를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 6.0 내지 약 9.5 범위의 pI를 갖는 항체이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 전하 vs. pH 곡선에서의 변곡점 (IP)이 본 발명의 방법에 의해 제공된다. 일부 실시양태에서, 온도에서의 변화에 대한 IP에서의 변화 (dIP/dT)가 본 발명의 방법에 의해 제공된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 치료 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 이뮤노어드헤신이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 5,000 달톤, 10,000 달톤, 15,000 달톤, 25,000 달톤, 50,000 달톤, 75,000 달톤, 100,000 달톤, 125,000 달톤, 또는 150,000 달톤 초과의 분자량을 갖는다. 폴리펩티드는 약 50,000 달톤 내지 200,000 달톤 또는 100,000 달톤 내지 200,000 달톤의 분자량을 가질 수 있다. 대안적으로, 본원에 사용하기 위한 폴리펩티드는 약 120,000 달톤 또는 약 25,000 달톤의 분자량을 가질 수 있다.
pI는 등전점이고, 특정한 분자 또는 표면이 알짜 전기적 전하를 전혀 수반하지 않는 pH이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 조성물 중 폴리펩티드, 예를 들어 항체의 pI가 약 6.0 내지 약 9.5 범위인 폴리펩티드를 포함하는 다수의 조성물에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 9.5 초과; 예를 들어, 약 9.5 내지 약 12의 pI를 갖는다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 예를 들어 항체의 pI는 약 7 미만; 예를 들어, 약 4 내지 약 7일 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법의 실시양태에서, 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 조성물 중 1종 이상의 오염물은 폴리펩티드 전하 변이체이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 전하 변이체는 천연 상태로부터 변형되어 폴리펩티드의 전하가 달라진 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 전하 변이체는 모 폴리펩티드보다 더 산성이고; 즉, 모 폴리펩티드보다 낮은 pI를 갖는다. 다른 실시양태에서, 전하 변이체는 모 폴리펩티드보다 더 염기성이고; 즉, 모 폴리펩티드보다 높은 pI를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 전하 변이체는 조작된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 전하 변이체는 자연 과정; 예를 들어, 산화, 탈아미드화, 리신 잔기의 C-말단 프로세싱, N-말단 피로글루타메이트 형성 및 비효소적 당화의 결과이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 전하 변이체는 단백질에 부착된 글리칸이, 예를 들어 시알산 또는 그의 유도체의 첨가에 의해 변형되어 당단백질의 전하가 모 당단백질과 비교하여 달라진 당단백질이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 전하 변이체는 항체 전하 변이체이다.
본원에 기재된 방법을 사용하여 분석되는 폴리펩티드는 일반적으로 재조합 기술을 사용하여 생산된다. 재조합 단백질의 생산 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 5,534,615 및 4,816,567 (구체적으로 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 관심 단백질은 CHO 세포에서 생산된다 (예를 들어, WO 94/11026 참조). 일부 실시양태에서, 관심 폴리펩티드는 이. 콜라이 세포에서 생산된다. 예를 들어, 번역 개시 영역 (TIR) 및 발현 및 분비를 최적화하기 위한 신호 서열을 기재하고 있는, 미국 특허 번호 5,648,237; 미국 특허 번호 5,789,199 및 미국 특허 번호 5,840,523을 참조한다. 또한, 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현이 기재되어 있는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254]을 참조한다. 재조합 기술을 이용하는 경우, 폴리펩티드는 세포내에서 또는 주변세포질 공간 내에서 생산될 수 있거나, 또는 배지로 직접 분비될 수 있다.
배양 배지로부터 또는 숙주 세포 용해물로부터 폴리펩티드를 회수할 수 있다. 폴리펩티드의 발현에 사용되는 세포는 다양한 물리적 또는 화학적 수단, 예컨대 동결-해동 주기, 음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제에 의해 파괴할 수 있다. 폴리펩티드가 세포내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서 입자형 잔해인 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]은 이. 콜라이의 주변세포질 공간으로 분비된 폴리펩티드를 단리하기 위한 절차를 기재하고 있다. 간략하게, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 파편을 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 폴리펩티드가 배지로 분비되는 경우, 일반적으로는 우선 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 상업적으로 입수가능한 폴리펩티드 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 농축시킨다. 단백질분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF를 임의의 이전 단계에 포함시킬 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제를 포함시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 조성물 중 폴리펩티드는 본 발명의 방법에 의해 분석 전에 정제되거나 부분적으로 정제된다. 예를 들어, 상기 방법의 폴리펩티드는 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피로부터의 용리액 중에 존재한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 단백질 A 크로마토그래피로부터의 용리액에 있다.
본 발명의 방법에 의해 분석가능한 폴리펩티드의 예는 이뮤노글로불린, 이뮤노어드헤신, 항체, 효소, 호르몬, 융합 단백질, Fc-함유 단백질, 면역접합체, 시토카인 및 인터류킨을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. (A) 항체
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 폴리펩티드 및 폴리펩티드를 포함하는 제제를 분석하는 임의의 방법에 사용하기 위한 폴리펩티드는 항체이다.
항체에 대한 분자 표적은 CD 단백질 및 그의 리간드, 예컨대 비제한적으로: (i) CD3, CD4, CD8, CD19, CD11a, CD20, CD22, CD34, CD40, CD79α (CD79a) 및 CD79β (CD79b); (ii) ErbB 수용체 패밀리의 구성원, 예컨대 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; (iii) 세포 부착 분자, 예컨대 LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 αv/β3 인테그린 (그의 알파 또는 베타 서브유닛 포함) (예를 들어, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); (iv) 성장 인자, 예컨대 VEGF; IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C, BR3, c-met, 조직 인자, β7 등; 및 (v) 세포 표면 및 막횡단 종양-연관 항원 (TAA), 예컨대 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 것들을 포함한다.
다른 예시적인 항체는 비제한적으로 항-에스트로겐 수용체 항체, 항-프로게스테론 수용체 항체, 항-p53 항체, 항-HER-2/neu 항체, 항-EGFR 항체, 항-카텝신 D 항체, 항-Bcl-2 항체, 항-E-카드헤린 항체, 항-CA125 항체, 항-CA15-3 항체, 항-CA19-9 항체, 항-c-erbB-2 항체, 항-P-당단백질 항체, 항-CEA 항체, 항-망막모세포종 단백질 항체, 항-ras 종양단백질 항체, 항-루이스 X 항체, 항-Ki-67 항체, 항-PCNA 항체, 항-CD3 항체, 항-CD4 항체, 항-CD5 항체, 항-CD7 항체, 항-CD8 항체, 항-CD9/p24 항체, 항-CD10 항체, 항-CD11a 항체, 항-CD11c 항체, 항-CD13 항체, 항-CD14 항체, 항-CD15 항체, 항-CD19 항체, 항-CD20 항체, 항-CD22 항체, 항-CD23 항체, 항-CD30 항체, 항-CD31 항체, 항-CD33 항체, 항-CD34 항체, 항-CD35 항체, 항-CD38 항체, 항-CD41 항체, 항-LCA/CD45 항체, 항-CD45RO 항체, 항-CD45RA 항체, 항-CD39 항체, 항-CD100 항체, 항-CD95/Fas 항체, 항-CD99 항체, 항-CD106 항체, 항-유비퀴틴 항체, 항-CD71 항체, 항-c-myc 항체, 항-시토케라틴 항체, 항-비멘틴 항체, 항-HPV 단백질 항체, 항-카파 경쇄 항체, 항-람다 경쇄 항체, 항-멜라노솜 항체, 항-전립선 특이적 항원 항체, 항-S-100 항체, 항-타우 항원 항체, 항-피브린 항체, 항-케라틴 항체 및 항-Tn-항원 항체로부터 선택된 것을 포함한다.
(i) 모노클로날 항체
일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체는 실질적 동종 항체의 집단으로부터 획득되며, 즉, 개별 항체를 포함하는 집단은, 모노클로날 항체의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체 (이러한 변이체는 일반저으로 미미한 양으로 존재함)를 제외하고는, 동일한 에피토프와 일치하고/거나 이에 결합한다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 개별 또는 폴리클로날 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특징을 나타낸다.
예를 들어, 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 번호 4,816,567)에 의해 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터는 면역화에 사용된 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 도출하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 면역화된다. 대안적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 이어서, 적합한 융제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]).
이와 같이 제조된 하이브리도마 세포를, 바람직하게는 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에 시딩하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우에, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 (HAT 배지), 이러한 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
일부 실시양태에서, 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생산을 지지하고, 배지 예컨대 HAT 배지에 민감한 세포이다. 이들 중에서, 일부 실시양태에서, 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell 분포 Center; 미국 캘리포니아주 샌 디에고)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; 미국 메릴랜드주 록빌)으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포로부터 유래된 것이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주 역시 인간 모노클로날 항체 생산에 대해 기재되어 있다 (문헌 [Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))]).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 항원에 대해 지정된 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정한다. 일부 실시양태에서, 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전법 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사성면역검정 (RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정한다.
모노클로날 항체의 결합 친화도는, 예를 들어 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980)]의 스캐차드(Scatchard) 분석에 의해 결정할 수 있다.
바람직한 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론을 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]). 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장할 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 예를 들어 폴리펩티드 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 이뮤노글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 절차 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 사용)를 사용하여 용이하게 단리 및 서열분석된다. 일부 실시양태에서, 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 공급원으로서 기능한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 이후에 이를 달리 항체 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서의 모노클로날 항체의 합성을 달성한다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아 내 재조합 발현에 대한 종설 논문은 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 (1993) 및 Plueckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)]을 포함한다.
추가 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]은 파지 라이브러리를 사용하는 뮤린 및 인간 항체의 단리를 각각 기재하고 있다. 후속적인 공개문헌은 쇄 셔플링에 의한 고친화도 (nM 범위) 인간 항체의 생산 (Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)), 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993))을 기재하고 있다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실용적 대안이다.
DNA는 또한, 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환하거나 (미국 특허 번호 4,816,567; 문헌 [Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)]), 또는 이뮤노글로불린 코딩 서열을 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부와 공유 연결함으로써 변형될 수 있다.
전형적으로, 이러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인에 대해 치환되거나, 또는 이들은 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인에 대해 치환되어, 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG 모노클로날 항체이다.
(ii) 인간화 항체
일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 비-인간 항체를 인간화하는 방법은 관련 기술분야에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 그 내로 도입되는 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기라 지칭되고, 전형적으로는 "유입" 가변 도메인으로부터의 것이다. 인간화는 본질적으로 상응하는 인간 항체의 서열을 초가변 영역 서열로 치환하는 것에 의하는 윈터(Winter) 및 동료들의 방법 (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988))에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는, 실질적으로 무손상 인간 가변 도메인 이외에서 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체이다 (미국 특허 번호 4,816,567). 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체의 제조에 사용될 인간 가변 도메인 경쇄 및 중쇄 둘 다의 선택은 항원성 감소에 매우 중요하다. 소위 "최적-적합" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지의 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 영역 (FR)으로서 받아들여진다 (Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al. J. Mol. Biol. 196:901 (1987)). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정한 프레임워크를 이용한다. 동일한 프레임워크를 여러 상이한 인간화 항체에 사용할 수 있다 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)).
또한, 항체가 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것이 중요하다. 이를 달성하기 위해서, 방법의 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 산물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고, 통상의 기술자에게 친숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태적 구조를 설명하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이들 디스플레이들의 검사로 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능화에 있어서 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉, 항원에 결합하는 후보 이뮤노글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 목적하는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 수용자 및 유입 서열로부터 FR 잔기들을 선택하고 조합시킬 수 있다. 일반적으로, 항원 결합에 대한 영향에는 초가변 영역 잔기가 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.
(iii) 인간 항체
일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 인간화에 대한 대안으로서 인간 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 면역화시, 내인성 이뮤노글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체의 생산이 완전히 억제된다고 기재된 바 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이러한 배선 돌연변이체 마우스에게 전달하면, 항원 챌린지 시에 인간 항체가 생산될 것이다. 예를 들어 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993)]; 및 미국 특허 번호 5,591,669; 5,589,369; 및 5,545,807을 참조한다.
대안적으로, 파지 디스플레이 기술 (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990))은 비면역화된 공여자로부터의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내 생산하는데 사용될 수 있다. 이 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 사상 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 부차적 코트 폴리펩티드 유전자 내로 프래임-내 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로서 디스플레이된다. 사상 입자가 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특징을 기준으로 하는 선택은 또한 이러한 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자의 선택을 유발한다. 따라서, 파지는 B 세포 특징의 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있고; 이의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]을 참조한다. V-유전자 절편의 여러 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)]은 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 다양한 어레이의 항-옥사졸론 항체를 단리하였다. 비면역화 인간 공여자로부터의 V 유전자 레퍼토리가 구축될 수 있고, 다양한 어레이의 항원 (자가-항원 포함)에 대한 항체는 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), 또는 Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 의해 기재된 기술에 따라 본질적으로 단리될 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,565,332 및 5,573,905를 참조한다.
인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수도 있다 (미국 특허 5,567,610 및 5,229,275 참조).
(iv) 항체 단편
일부 실시양태에서, 항체는 항체 단편이다. 항체 단편의 생산을 위해 다양한 기술이 개발되어 왔다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해적 소화를 통해 유래되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) 및 Brennan et al., Science 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 현재 이러한 단편들은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 항체 단편이 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 또 다른 접근법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술들이 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 미국 특허 번호 5,587,458을 참조한다. 항체 단편은 또한 예를 들어 미국 특허 5,641,870에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 단편이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 항원 결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv, Fv 및 디아바디로 이루어진 군으로부터 선택된다.
(v) 이중특이적 항체
일부 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 적어도 2종의 상이한 에피토프에 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로, 이중특이적 항체 결합 아암은 세포 방어 메카니즘을 세포에 집중시키도록 백혈구 상의 촉발 분자, 예컨대 T-세포 수용체 분자 (예를 들어, CD2 또는 CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR), 예컨대 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)에 결합하는 아암과 조합될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 통상적인 생산은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공발현을 기반으로 하며, 여기서 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)]). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 편성으로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10종의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하고, 이중 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 이루어지는 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 산물 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829, 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
다른 접근법에 따르면, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인이 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 일부 실시양태에서, 융합은 적어도 힌지의 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인에 의한다. 일부 실시양태에서, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합체 중 적어도 하나에 존재한다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체 및 원하는 경우에 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 개별 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동-형질감염시킨다. 이는, 구축에 사용된 3종의 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않은 비가 최적의 수율을 제공하는 경우의 실시양태에서, 상기 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비를 조정하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비의 적어도 2종의 폴리펩티드 쇄의 발현으로 높은 수율이 달성되는 경우에, 또는 비가 특정한 유의성을 갖지 않는 경우에, 2종 또는 모든 3종의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 1개의 발현 벡터에 삽입할 수 있다.
이러한 접근법의 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암 내에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른쪽 아암 내의 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 한쪽 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 분리 방식을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원치 않는 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터의 바람직한 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 한다는 것이 발견되었다. 이러한 접근법이 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성하는 것에 관한 추가의 상세사항에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)]을 참조한다.
미국 특허 번호 5,731,168에 기재된 또 다른 접근법에 따라, 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수된 이종이량체의 백분율을 최대화하도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 소형 아미노산 측쇄는 보다 대형 측쇄 (예를 들어 티로신 또는 트립토판)으로 대체된다. 대형 측쇄(들)에 대한 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동"은 대형 아미노산 측쇄를 보다 소형의 것 (예를 들어 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 제2 항체 분자의 계면에 생성된다. 이는 다른 원치않는 최종-산물, 예컨대 동종이량체보다 이종이량체의 수율을 증가시키기 위한 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교된 또는 "이종접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체들 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 것은 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체들은, 예를 들어 원치않는 세포에 대한 면역계 세포의 표적화 (미국 특허 번호 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089)를 위해 제안되었다. 임의의 편리한 가교 방법을 사용하여 이종접합체 항체를 제조할 수 있다. 적합한 가교제는 관련 기술분야에서 널리 공지되어 있으며, 다수의 가교 기술과 함께 미국 특허 번호 4,676,980에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성시키는 기술이 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 사용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science 229:81 (1985)]은 무손상 항체를 단백질 분해로 절단하여 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 기재한다. 이들 단편을 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재 하에 환원시켜, 이웃자리 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 그 후 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 그 후 Fab'-TNB 유도체 중 하나를 메르캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 작용제로서 사용될 수 있다.
재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기재되었다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체가 생산되었다. (Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합에 의해 연결되었다. 항체 동종이량체가 힌지 영역에서 환원되어 단량체가 형성된 후, 다시 산화되어 항체 이종이량체가 형성되었다. 이러한 방법은 항체 동종이량체의 생산에 또한 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 대안적인 메카니즘을 제공한다. 이 단편은 동일한 쇄 상의 2개의 도메인이 쌍을 이루게 하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인이 또 다른 단편의 상보적인 VL 및 VH 도메인과 쌍을 이루게 되어, 2개의 항원-결합 부위가 형성된다. 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)]을 참조한다.
2가 초과의 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)].
(v) 다가 항체
일부 실시양태에서, 항체는 다가 항체이다. 다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 신속하게 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본원에 제공된 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다가 항체 (IgM 부류 이외의 것)일 수 있고 (예를 들어, 4가 항체), 이는 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 용이하게 생산될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 이러한 시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역의 아미노-말단의 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본원에서의 바람직한 다가 항체는 3 내지 약 8개, 그러나 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 다가 항체는 적어도 1개의 폴리펩티드 쇄 (바람직하게는 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하고, 여기서의 상기 폴리펩티드 쇄(들)는 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어 폴리펩티드 쇄(들)는 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc (여기서 VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 1개의 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1임)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 다음을 포함할 수 있다: VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄. 본원에서의 다가 항체는 바람직하게는 적어도 2개 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 더 포함한다. 본원에서의 다가 항체는 예를 들어 약 2 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 더 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 다중특이적 항체이다. 이러한 다중특이적 항체는 VHVL 유닛이 폴리에피토프 특이성을 갖는, 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체, 각각의 VHVL 유닛이 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체, 각각의 단일 가변 도메인이 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 단일 가변 도메인을 갖는 항체, 전장 항체, 항체 단편, 예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디, 트리아바디, 삼관능성 항체, 공유 또는 비-공유 연결된 항체 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 폴리에피토프 특이성; 예를 들어 동일한 또는 상이한 표적(들) 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체는 단일특이적이고; 예를 들어 항체는 오직 1개의 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에 따르면, 다중특이적 항체는 각 에피토프에 5 μM 내지 0.001 pM, 3 μM 내지 0.001 pM, 1 μM 내지 0.001 pM, 0.5 μM 내지 0.001 pM, 또는 0.1 μM 내지 0.001 pM의 친화도로 결합하는 IgG 항체이다.
(vi) 기타 항체 변형
본원에 제공되는 항체를 예를 들어 항체의 항원-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)이 증진되도록 이펙터 기능과 관련하여 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 항체의 Fc 영역에 1개 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역 내에 도입하여, 이 영역 내에서의 쇄간 디술피드 결합 형성을 허용할 수 있다. 이로써 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다. 문헌 [Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, B. J., Immunol. 148:2918-2922 (1992)]을 참조한다. 항종양 활성이 증진된 동종이량체 항체는 문헌 [Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같이 이종이관능성 가교제를 사용하여 제조할 수 있다. 대안적으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체가 조작될 수 있고, 이에 의해 증진된 보체 매개 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있다. 문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)]을 참조한다.
항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 아미노산 변경은 US 2006/0067930에 기재된 바와 같이 항체에서 만들어질 수 있고, 이는 본원에 그 전문이 참조로 포함된다.
(B) 폴리펩티드 변이체 및 변형
본원에 기재된 폴리펩티드 (항체 포함)의 아미노산 서열 변형(들)이 본원에 기재된 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)를 정제하는 방법에 사용될 수 있다.
(i) 변이체 폴리펩티드
"폴리펩티드 변이체"는 폴리펩티드의 전장 천연 서열, 신호 펩티드가 없는 폴리펩티드 서열, 신호 펩티드가 있거나 없는 폴리펩티드의 세포외 도메인과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 본원에 정의된 바와 같은 폴리펩티드, 바람직하게는 활성 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 폴리펩티드 변이체는 예를 들어 1개 이상의 아미노산 잔기가 전장 천연 아미노산 서열의 N 또는 C-말단에서 부가되거나 결실된 폴리펩티드를 포함한다. 통상적으로, TAT 폴리펩티드 변이체는 전장 천연 서열 폴리펩티드 서열, 신호 펩티드가 없는 폴리펩티드 서열, 신호 펩티드가 있거나 없는 폴리펩티드의 세포외 도메인에 대해 적어도 약 80%의 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 임의로, 변이체 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드 서열과 비교하여 1개 이하의 보존적 아미노산 치환, 대안적으로 천연 폴리펩티드 서열과 비교하여 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이하의 보존적 아미노산 치환을 가질 것이다.
변이체 폴리펩티드는 N-말단 또는 C-말단에서 말단절단될 수 있거나, 또는 예를 들어 전장 천연 폴리펩티드와 비교하여 내부 잔기가 결여될 수 있다. 특정 변이체 폴리펩티드는 바람직한 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결여될 수 있다. 말단절단, 결실 및 삽입을 갖는 이들 변이체 폴리펩티드는 임의의 다수의 통상의 기술에 의해 제조될 수 있다. 바람직한 변이체 폴리펩티드는 화학적으로 합성될 수 있다. 또 다른 적합한 기술은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의한, 바람직한 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 단편의 단리 및 증폭을 포함한다. 핵산 단편의 바람직한 말단을 정의하는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머에서 사용된다. 바람직하게는, 변이체 폴리펩티드는 본원에 개시된 천연 폴리펩티드와 적어도 하나의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 공유한다.
아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩티드가 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.
예를 들어, 폴리펩티드의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 항체 핵산 내에 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형은 예를 들어 폴리펩티드의 아미노산 서열 내 잔기로부터의 결실 및/또는 이들로의 삽입 및/또는 이들의 치환을 포함한다. 최종 구축물이 바람직한 특징을 갖는다는 조건 하에 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어져 최종 구축물에 도달된다. 아미노산 변화는 또한, 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)의 번역후 프로세싱을 변경시킬 수 있는데, 예컨대 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시킬 수 있다. 어느 아미노산 잔기가 바람직한 활성에 불리한 영향을 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는지를 결정할 때의 지침은 폴리펩티드의 서열을 공지의 상동성 폴리펩티드 분자의 서열과 비교하고, 높은 상동성 영역에서 이루어진 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 찾아볼 수 있다.
돌연변이유발에 대해 바람직한 위치인 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)의 특정 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기 군이 확인되고 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 Arg, Asp, His, Lys 및 Glu), 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체되어 아미노산과 항원과의 상호작용에 영향을 미친다. 이어서, 치환에 대해 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치가, 치환 부위에 또는 치환 부위에 대해 추가의 또는 다른 변이체를 도입함으로써 정밀화된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되며, 돌연변이 그 자체의 성질을 미리 결정할 필요는 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서의 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 표적 코돈 또는 영역에서 수행하고, 발현된 항체 변이체를 목적 활성에 대해 스크리닝한다.
또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이러한 변이체는 항체 분자 중 적어도 1개의 아미노산 잔기가 상이한 잔기에 의해 대체된다. 치환 돌연변이유발을 위한 최대 관심 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경이 또한 예상된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"의 표제 하에 하기 표 2에 나타낸다. 이러한 치환이 생물학적 활성에서의 변화를 유발하는 경우에, 표 2에 "예시적인 치환"으로 명명된 또는 추가로 아미노산 부류에 관하여 하기 기재된 바와 같은 보다 실질적 변화가 도입될 수 있고, 산물을 스크리닝할 수 있다.
<표 2>
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폴리펩티드의 생물학적 특성에 있어서의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어 시트 또는 나선형 입체형태로서, 치환 영역 내의 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 부피를 유지하는 것에 대한 효과가 현저하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 아미노산은 그의 측쇄 특성의 유사성에 따라 하기 군으로 나누어질 수 있다 (문헌 [A. L. Lehninger, Biochemistry second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)]에서):
(1) 비-극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 비하전된 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H)
대안적으로, 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 하기 군으로 나뉠 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
또한, 항체의 적절한 입체형태 유지에 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기가 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 개선시키고 비정상적인 가교를 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)이 폴리펩티드에 부가되어 그의 안정성이 개선될 수 있다 (특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).
특히 바람직한 유형의 치환 변이체는 모 항체 (예를 들어, 인간화 항체)의 1종 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가적인 개발용으로 선택된 생성된 변이체(들)는 이들이 생성되는 모 항체에 비해 생물학적 특성이 개선될 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성하는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 사용한 친화도 성숙이다. 간략하게, 몇몇 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6-7개 부위)가 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노 치환이 생성되도록 돌연변이된다. 이렇게 생성된 항체 변이체는 각각의 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 산물에 대한 융합물로서 사상 파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이된다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 본원에 개시된 바와 같이 그의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 식별하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 식별할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 표적 사이의 접촉점을 확인하기 위해서는 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기가 본원에서 상술된 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 변이체들의 패널을 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 1종 이상의 관련 검정에서 탁월한 특성을 갖는 항체를 추가적인 개발을 위해 선택할 수 있다.
폴리펩티드의 아미노산 변이체의 또 다른 유형은 항체의 원래의 글리코실화 패턴을 변경시킨다. 폴리펩티드는 비-아미노산 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 글리코실화될 수 있다. 이러한 글리코실화는 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 폴리펩티드가 발현되는 동안 자연적으로 발생할 수 있거나, 인간 개입에서 비롯되는 의도적 변형일 수 있다. 변경은 폴리펩티드에서 발견되는 1개 이상의 탄수화물 모이어티를 결실시키는 것 및/또는 폴리펩티드에 존재하지 않는 1개 이상의 글리코실화 부위를 부가하는 것을 의미한다.
폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 나타낸다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (식 중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 측쇄에의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 이러한 트리펩티드 서열 중 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나가 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신 또한 사용될 수 있다.
폴리펩티드에 글리코실화 부위를 부가하는 것은 항체가 1종 이상의 상기 기술된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 변경은 또한 원래의 항체의 서열에 대한 1개 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
폴리펩티드 상에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로, 또는 글리코실화를 위한 표적으로서 작용하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이성 치환에 의해 달성될 수 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 사용함으로써 달성될 수 있다.
다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실 기의 인산화, 리신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노 기의 메틸화, N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복실 기의 아미드화를 포함한다.
(ii) 키메라 폴리펩티드
본원에 기재된 폴리펩티드는 또 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키메라 분자는 항-태그 항체가 그에 대해 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 폴리펩티드의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복실-말단에 위치한다. 이러한 에피토프-태그가 부착된 형태의 폴리펩티드의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 제공함으로써 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 또 다른 유형의 친화성 매트릭스를 사용한 친화도 정제에 의해 폴리펩티드를 용이하게 정제할 수 있다.
대안적 실시양태에서, 키메라 분자는 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린의 특정한 영역과 폴리펩티드의 융합체를 포함할 수 있다. 키메라 분자의 2가의 형태는 "이뮤노어드헤신"으로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "이뮤노어드헤신"은 이종 폴리펩티드의 결합 특이성을 이뮤노글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 조합시킨 항체-유사 분자를 지정한다. 구조적으로, 이뮤노어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 다른 (즉, "이종") 목적하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열 및 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 이뮤노어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 전형적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 이뮤노어드헤신 내의 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG-1, IgG-2, IgG-3 또는 IgG-4 하위유형, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다.
Ig 융합체는 바람직하게는 Ig 분자 내의 적어도 하나의 가변 영역 대신에 가용성 (막횡단 도메인이 결실된 또는 불활성화된) 형태의 폴리펩티드를 치환한 것을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 이뮤노글로불린 융합체는 힌지, CH2 및 CH3, 또는 IgG1 분자의 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다.
(iii) 폴리펩티드 접합체
폴리펩티드 제제에 사용하기 위한 폴리펩티드는 세포독성제, 예컨대 화학요법제, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합될 수 있다.
이러한 접합체의 생성에 유용한 화학요법제가 사용될 수 있다. 또한, 사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의) 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 다양한 방사성핵종은 방사성접합된 폴리펩티드의 생산에 이용가능하다. 예는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re를 포함한다. 폴리펩티드 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질-커플링 작용제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 만들어진다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 폴리펩티드에 대한 방사성뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다.
폴리펩티드 및 1개 이상의 소형 분자 독소, 예컨대 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 트리코텐 및 CC1065, 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체의 접합체가 또한 본원에 예상된다.
메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 메이테누스 세라타(Maytenus serrata)로부터 처음 단리되었다. 이후에, 특정 미생물이 또한 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생산하는 것으로 발견되었다. 합성 메이탄시놀 및 그의 유도체 및 유사체가 또한 고려된다. 폴리펩티드-메이탄시노이드 접합체를 제조하는 것으로 관련 기술분야에 공지된 다수의 연결 기가 존재하며, 예컨대 예를 들어 미국 특허 번호 5,208,020에 개시된 것이 포함된다. 이러한 연결 기는 상기-확인된 특허에 재시된 바와 같은, 디술피드 기, 티오에테르 기, 산 불안정성 기, 광불안정성 기, 펩티다제 불안정성 기 또는 에스테라제 불안정성 기를 포함하며, 디술피드 및 티오에테르 기가 바람직하다.
링커는 연결 유형에 따라 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연결은 통상의 커플링 기술을 이용한 히드록실 기와의 반응에 의해 형성될 수 있다. 반응은 히드록실 기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실 기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실 기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
또 다른 관심 접합체는 1종 이상의 칼리케아미신 분자에 접합된 폴리펩티드를 포함한다. 칼리케아미신 패밀리의 항생제는 피코몰 미만의 농도에서 이중-가닥 DNA 절단부를 생산할 수 있다. 칼리케아미신 패밀리의 접합체의 제조에 대해, 예를 들어 미국 특허 번호 5,712,374를 참조한다. 사용할 수 있는 칼리케아미신의 구조 유사체는 γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θ1 I를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항체가 접합될 수 있는 또 다른 항종양 약물은 항폴레이트제인 QFA이다. 칼리케아미신 및 QFA는 둘 다 세포내 작용 부위를 갖고, 원형질 막을 용이하게 통과하지 않는다. 따라서, 폴리펩티드 (예를 들어, 항체) 매개된 내재화를 통한 이들 작용제의 세포 흡수는 이들의 세포독성 효과를 크게 증진시킨다.
본원에 기재된 폴리펩티드에 접합될 수 있는 다른 항종양제는 BCNU, 스트렙토조신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 집합적으로 LL-E33288 복합체로 공지된 작용제의 패밀리 뿐만 아니라 에스페라미신을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드와 뉴클레오티드분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예컨대 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이의 접합체일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)를 종양 예비표적화에 활용하기 위해 "수용체" (상기 스트렙타비딘)에 접합시킬 수 있고, 여기서 폴리펩티드 수용체 접합체는 환자에게 투여한 후에, 제거제를 사용하여 결합되지 않은 접합체를 순환계로부터 제거하고, 이어서 세포독성제 (예를 들어, 방사성뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 전구약물 (예를 들어, 펩티딜 화학요법제)을 활성 항암 약물로 전환시키는 전구약물-활성화 효소에 접합될 수 있다. 면역접합체의 효소 성분은 전구약물을 그의 보다 활성인, 세포독성 형태로 전환시키는 방식으로 전구약물에 대하여 작용할 수 있는 임의의 효소를 포함한다.
유용한 효소의 예는 포스페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리성 포스파타제; 술페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 아릴술파타제; 비-독성 5-플루오로시토신을 항암 약물인 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제, 예컨대 세라티아 프로테아제, 써모리신, 서브틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신 (예컨대, 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환기를 함유하는 전구약물을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화된 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 탄수화물-절단 효소, 예컨대 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 아민 질소에서 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 아미다제, 예컨대 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 효소적 활성을 갖는 항체 (또한, 관련 기술분야에 "아브자임"으로 공지됨)를 사용하여 전구약물을 유리 활성 약물로 전환시킬 수 있다.
(iv) 기타
폴리펩티드의 공유 변형의 또 다른 유형은 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중 하나에 대한 폴리펩티드의 연결을 포함한다. 폴리펩티드는 또한, 예를 들어, 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐 (예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐), 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐), 또는 마크로에멀젼에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Gennaro, A.R., Ed., (1990)]에 개시되어 있다.
IV. 제제 및 방법에 사용하기 위한 폴리펩티드 수득
본원에 기재된 분석 방법에서 사용되는 폴리펩티드는 재조합 방법을 포함하여, 관련 기술분야에서 널리 공지된 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 하기 섹션은 이러한 방법에 대한 지침을 제공한다.
(A) 폴리뉴클레오티드
"폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다.
폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드 mRNA를 보유하고 이를 검출가능한 수준에서 발현시키는 것으로 여겨지는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 편리하게는 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 폴리펩티드-코딩 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 또는 공지의 합성 절차 (예를 들어, 자동화 핵산 합성)에 의해 얻을 수 있다.
예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 전체 이뮤노글로불린 분자 쇄, 예컨대 경쇄 또는 중쇄를 코딩할 수 있다. 완전한 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 뿐만 아니라 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함하고, 이는 전형적으로 3개의 불변 도메인: CH1, CH2 및 CH3; 및 "힌지" 영역을 포함할 것이다. 일부 상황에서, 불변 영역의 존재는 바람직할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있는 다른 폴리펩티드는 항원-결합 항체 단편, 예컨대 단일 도메인 항체 ("dAb"), Fv, scFv, Fab' 및 F(ab')2 및 "미니바디"를 포함한다. 미니바디는 (전형적으로) CH1 및 CK 또는 CL 도메인을 절제한 2가 항체 단편이다. 미니바디는 통상적인 항체보다 작기 때문에 이들은 임상/진단 용도에서 보다 우수한 조직 침투를 달성하여야 하지만, 2가이므로 이들은 1가 항체 단편, 예컨대 dAb보다 높은 결합 친화도를 유지하여야 한다. 따라서, 문맥상 달리 표시되지 않는다면, 본원에 사용된 용어 "항체"는 전체 항체 분자 뿐만 아니라 상기 논의된 유형의 항원-결합 항체 단편을 포함한다. 바람직하게는 코딩된 폴리펩티드에 존재하는 각각의 프레임워크 영역은 상응하는 인간 수용자 프레임워크와 관련하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 것이다. 따라서, 예를 들어 프레임워크 영역은 수용자 프레임워크 영역과 관련하여 총 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
VI. 예시적 실시양태
1. a) 2종 이상의 조성물 중 폴리펩티드의 아미노산 조성을 기초로 하여, 선택된 온도에서의 알짜 전하 대 pH 곡선을 플롯팅하는 단계, 및 b) 단계 a)의 플롯의 이차 도함수를 결정함으로써 중성 또는 거의 중성 pH에서의 알짜 전하 대 pH 곡선의 변곡점을 결정하는 단계를 포함하며; 여기서 최적의 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건은 1종 이상의 조성물 중 폴리펩티드에 대한 대략 공통의 변곡점에서의 pH인, 각각 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 다수의 조성물을 분석하기 위한 최적의 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건을 확인하는 방법.
2. 실시양태 1에 있어서, 변곡점에서의 알짜 전하가 양성인 경우에, 양이온 교환 물질을 이온 교환 크로마토그래피에 사용하는 것인 방법.
3. 실시양태 2에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질이 술폰화 크로마토그래피 물질 또는 카르복실화 크로마토그래피 물질인 방법.
4. 실시양태 1에 있어서, 변곡점에서의 알짜 전하가 음성인 경우에, 음이온 교환 물질을 크로마토그래피에 사용하는 것인 방법.
5. 실시양태 4에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질이 4급 아민 크로마토그래피 물질 또는 3급 아민 크로마토그래피 물질인 방법.
6. 실시양태 1에 있어서, 혼합 모드 크로마토그래피 물질을 크로마토그래피에 사용하는 것인 방법.
7. 실시양태 6에 있어서, 혼합 모드 이온 교환 물질이, 순차적으로 패킹된 술폰화 크로마토그래피 물질 또는 카르복실화 크로마토그래피 물질 및 4급 아민 크로마토그래피 물질 또는 3급 아민 크로마토그래피 물질의 혼합물인 방법.
8. 실시양태 1-7 중 어느 하나에 있어서, c) 2종 이상의 조성물 중 폴리펩티드에 대하여 온도에서의 변화에 대한 알짜 전하 대 pH 곡선의 변곡점 pH에서의 변화 (dIP/dT)를 결정하는 단계, d) 온도에서의 변화에 대한 완충제의 산 해리 상수에서의 변화 (dpKa/dT)가 폴리펩티드의 dIP/dT와 본질적으로 동일한, 크로마토그래피에 사용하기 위한 완충제를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
9. 실시양태 8에 있어서, 완충제가 변곡점 pH에서 유효 완충 용량을 제공하는 것인 방법.
10. 실시양태 1-9 중 어느 하나에 있어서, 1종 이상의 조성물 중 폴리펩티드의 dIP/dT가 약 -0.02 pH 단위인 방법.
11. 실시양태 1-10 중 어느 하나에 있어서, 온도에서의 변화가 약 20℃에서 약 70℃인 방법.
12. 실시양태 1-11 중 어느 하나에 있어서, 온도에서의 변화가 약 20℃에서 약 50℃인 방법.
13. 실시양태 8-12 중 어느 하나에 있어서, dpKa/dT = dIP/dT ± 50%인 방법.
14. 실시양태 8-13 중 어느 하나에 있어서, 단계 d)에서 선택된 완충제 중 폴리펩티드의 알짜 전하가 30℃에 걸쳐 0.5 미만 변화하는 것인 방법.
15. 실시양태 8-14 중 어느 하나에 있어서, 단계 d)에서 선택된 완충제를 약 5 mM 내지 약 250 mM 범위의 농도로 크로마토그래피에 사용하는 것인 방법.
16. 실시양태 1-15 중 어느 하나에 있어서, 완충제 조성물이 염을 추가로 포함하는 것인 방법.
17. 실시양태 16에 있어서, 염이 NaCl, KCl, (NH4)2SO4 또는 Na2SO4인 방법.
18. 실시양태 16 또는 17에 있어서, 염의 농도가 약 1 mM 내지 약 1M의 범위인 방법.
19. 실시양태 1-18 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 항체 또는 이뮤노어드헤신 또는 그의 단편인 방법.
20. 실시양태 1-19 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 모노클로날 항체 또는 그의 단편인 방법.
21. 실시양태 19 또는 20에 있어서, 항체가 인간 항체인 방법.
22. 실시양태 19 또는 20에 있어서, 항체가 인간화 항체인 방법.
23. 실시양태 19 또는 20에 있어서, 항체가 키메라 항체인 방법.
24. 실시양태 19-23 중 어느 하나에 있어서, 항체가 항체 단편인 방법.
25. 실시양태 1-14 중 어느 하나에 있어서, 오염물이 폴리펩티드의 변이체인 방법.
26. 실시양태 1-25 중 어느 하나에 있어서, 오염물이 폴리펩티드의 분해 산물인 방법.
27. 실시양태 1-26 중 어느 하나에 있어서, 오염물이 폴리펩티드의 전하 변이체인 방법.
28. a) 폴리펩티드의 아미노산 조성을 기초로 하여, 선택된 온도에서의 알짜 전하 대 pH 곡선을 플롯팅하는 단계, 및 b) 단계 a)의 플롯의 이차 도함수를 결정함으로써 중성 또는 거의 중성 pH에서의 알짜 전하 대 pH 곡선의 변곡점을 결정하는 단계를 포함하며; 여기서 최적의 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건은 폴리펩티드에 대한 대략 변곡점에서의 pH인, 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 조성물을 분석하기 위한 최적의 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건을 확인하는 방법.
29. 실시양태 28에 있어서, 변곡점에서의 알짜 전하가 양성인 경우에, 양이온 교환 물질을 이온 교환 크로마토그래피에 사용하는 것인 방법.
30. 실시양태 29에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질이 술폰화 크로마토그래피 물질 또는 카르복실화 크로마토그래피 물질인 방법.
31. 실시양태 28에 있어서, 변곡점에서의 알짜 전하가 음성인 경우에, 음이온 교환 물질을 크로마토그래피에 사용하는 것인 방법.
32. 실시양태 31에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질이 4급 아민 크로마토그래피 물질 또는 3급 아민 크로마토그래피 물질인 방법.
33. 실시양태 28에 있어서, 혼합 모드 크로마토그래피 물질을 크로마토그래피에 사용하는 것인 방법.
34. 실시양태 33에 있어서, 혼합 모드 이온 교환 물질이, 순차적으로 패킹된 술폰화 크로마토그래피 물질 또는 카르복실화 크로마토그래피 물질 및 4급 아민 크로마토그래피 물질 또는 3급 아민 크로마토그래피 물질의 혼합물인 방법.
35. 실시양태 28-34 중 어느 하나에 있어서, c) 폴리펩티드에 대하여 온도에서의 변화에 대한 알짜 전하 대 pH 곡선의 변곡점 pH에서의 변화 (dIP/dT)를 결정하는 단계, d) 온도에서의 변화에 대한 완충제의 산 해리 상수에서의 변화 (dpKa/dT)가 폴리펩티드의 dIP/dT와 본질적으로 동일한, 크로마토그래피에 사용하기 위한 완충제를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
36. 실시양태 35에 있어서, 완충제가 변곡점 pH에서 유효 완충 용량을 제공하는 것인 방법.
37. 실시양태 28-36 중 어느 하나에 있어서, 1종 이상의 조성물 중 폴리펩티드의 dIP/dT가 약 -0.02 pH 단위인 방법.
38. 실시양태 28-37 중 어느 하나에 있어서, 온도에서의 변화가 약 20℃에서 약 70℃인 방법.
39. 실시양태 28-38 중 어느 하나에 있어서, 온도에서의 변화가 약 20℃에서 약 50℃인 방법.
40. 실시양태 28-39 중 어느 하나에 있어서, dIP/dT = dpKa/dT ± 50%인 방법.
41. 실시양태 28-40 중 어느 하나에 있어서, 단계 d)에서 선택된 완충제 중 폴리펩티드의 알짜 전하가 30℃에 걸쳐 0.5 미만 변화하는 것인 방법.
42. 실시양태 28-41 중 어느 하나에 있어서, 단계 d)에서 선택된 완충제를 약 5 mM 내지 약 50 mM 범위의 농도로 크로마토그래피에 사용하는 것인 방법.
43. 실시양태 28-42 중 어느 하나에 있어서, 완충제 조성물이 염을 추가로 포함하는 것인 방법.
44. 실시양태 43에 있어서, 염이 NaCl, KCl, (NH4)2SO4 또는 Na2SO4인 방법.
45. 실시양태 43 또는 44에 있어서, 염의 농도가 약 10 mM 내지 약 1M의 범위인 방법.
46. 실시양태 28-45 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 항체 또는 이뮤노어드헤신 또는 그의 단편인 방법.
47. 실시양태 28-46 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 모노클로날 항체 또는 그의 단편인 방법.
48. 실시양태 46 또는 47에 있어서, 항체가 인간 항체인 방법.
49. 실시양태 46 또는 47에 있어서, 항체가 인간화 항체인 방법.
50. 실시양태 46 또는 47에 있어서, 항체가 키메라 항체인 방법.
51. 실시양태 38-50 중 어느 하나에 있어서, 항체가 항체 단편인 방법.
52. 실시양태 28-51 중 어느 하나에 있어서, 오염물이 폴리펩티드의 변이체인 방법.
53. 실시양태 28-52 중 어느 하나에 있어서, 오염물이 폴리펩티드의 분해 산물인 방법.
54. 실시양태 28-53 중 어느 하나에 있어서, 오염물이 폴리펩티드의 전하 변이체인 방법.
55. a) 각각 실시양태 1의 방법에 따른 표적 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 다수의 조성물에 대한 최적의 pH 및 온도 이온 교환 분리 조건을 결정하는 단계; b) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 조성물로부터 이온-교환 크로마토그래피 물질에 로딩 완충제를 사용하여 결합시키며, 여기서 로딩 완충제는 실시양태 8-15 중 어느 하나의 방법에 의해 확인된 완충제를 포함하는 것인 단계; c) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 이온-교환 크로마토그래피 물질로부터 용리 완충제의 구배를 사용하여 용리시키며, 여기서 용리 완충제는 완충제 및 염을 포함하고, 염의 농도는 시간 경과에 따라 구배로 증가하고, 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물은 구배에 의해 분리되는 것인 단계; 및 d) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 검출하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 오염물로부터 효과적으로 분리하여 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 조성물을 분석하는 방법.
56. a) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 이온-교환 크로마토그래피 물질에 로딩 완충제를 사용하여 결합시키며, 여기서 로딩 완충제는 완충제를 포함하고, 크로마토그래피의 pH 및 온도는 다수의 표적 폴리펩티드에 대하여 i) 선택된 온도에서의 알짜 전하 대 pH 곡선을 플롯팅하며, 여기서 곡선은 2종 이상의 표적 폴리펩티드 중 폴리펩티드의 아미노산 조성을 기초로 하는 것, 및 ii) 단계 i)의 플롯의 이차 도함수를 결정함으로써 알짜 전하 대 pH 곡선의 변곡점을 결정하는 것에 의해 최적화되며; 여기서 최적의 이온 교환 크로마토그래피 조건은 2종 이상의 표적 폴리펩티드에 대한 공통의 변곡점에서의 pH인 단계; b) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 이온-교환 크로마토그래피 물질로부터 용리 완충제의 구배를 사용하여 용리시키며, 여기서 용리 완충제는 완충제 및 염을 포함하고, 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물은 구배에 의해 분리되는 것인 단계; 및 c) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 검출하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 오염물로부터 효과적으로 분리하여 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 조성물을 분석하는 방법.
57. 실시양태 56에 있어서, 선택된 온도가 주위 온도인 방법.
58. 실시양태 56 또는 57에 있어서, 완충제가 a) 2종 이상의 표적 폴리펩티드에 대하여 온도에서의 변화에 대한 알짜 전하 대 pH 곡선의 변곡점 pH에서의 변화 (dIP/dT)를 결정하는 단계, b) 온도에서의 변화에 대한 완충제의 산 해리 상수에서의 변화 (dpKa/dT)가 공통의 변곡점을 갖는 1종 이상의 표적 폴리펩티드의 dIP/dT와 본질적으로 동일한 완충제를 선택하는 단계에 의해 확인되는 것인 방법.
59. 실시양태 58에 있어서, 완충제가 변곡점 pH에서 유효 완충 용량을 제공하는 것인 방법.
60. a) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 이온-교환 크로마토그래피 물질에 로딩 완충제를 사용하여 결합시키며, 여기서 로딩 완충제는 완충제를 포함하고, 크로마토그래피의 pH 및 온도는 다수의 표적 폴리펩티드에 대하여 최적화된 것인 단계; b) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 이온-교환 크로마토그래피 물질로부터 용리 완충제의 구배를 사용하여 용리시키며, 여기서 용리 완충제는 완충제 및 염을 포함하고, 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물은 구배에 의해 분리되는 것인 단계; 및 c) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 검출하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 오염물로부터 효과적으로 분리하여 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 조성물을 분석하는 방법.
61. 실시양태 60에 있어서, 완충제가 N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산 (ACES) 또는 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES)인 방법.
62. 실시양태 55-61 중 어느 하나에 있어서, 완충제의 농도가 약 5 mM 내지 약 20 mM의 범위인 방법.
63. 실시양태 55-62 중 어느 하나에 있어서, 완충제의 pH가 약 20℃ 내지 약 70℃의 온도 범위에서 약 6.5 내지 약 8.5의 범위인 방법.
64. 실시양태 55-63 중 어느 하나에 있어서, 완충제의 pH가 약 20℃ 내지 약 50℃의 온도 범위에서 약 6.5 내지 약 8.5의 범위인 방법.
65. 실시양태 55-64 중 어느 하나에 있어서, 변곡점에서 완충제 및 폴리펩티드의 pH가 약 22℃에서 약 7.8, 약 37℃에서 약 7.5, 또는 약 50℃에서 약 7.2인 방법.
66. 실시양태 55-65 중 어느 하나에 있어서, 염 구배가 선형 구배인 방법.
67. 실시양태 55-66 중 어느 하나에 있어서, 염 구배가 단계형 구배인 방법.
68. 실시양태 55-67 중 어느 하나에 있어서, 염 구배가 NaCl 구배, KCl 구배, (NH4)2SO4 구배 또는 Na2SO4 구배인 방법.
69. 실시양태 55-68 중 어느 하나에 있어서, 구배에서의 염 농도가 약 0 mM에서 약 1M로 증가하는 것인 방법.
70. 실시양태 69에 있어서, 염 농도가 약 100분 내에 약 0 mM에서 약 100 mM로 증가하는 것인 방법.
71. 실시양태 69에 있어서, 염 농도가 약 40분 내에 약 0 mM에서 약 80 mM로 증가하는 것인 방법.
72. 실시양태 55-71 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 항체 또는 이뮤노어드헤신 또는 그의 단편인 방법.
73. 실시양태 55-72 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 모노클로날 항체 또는 그의 단편인 방법.
74. 실시양태 72 또는 73에 있어서, 항체가 인간 항체인 방법.
75. 실시양태 72 또는 73에 있어서, 항체가 인간화 항체인 방법.
76. 실시양태 72 또는 73에 있어서, 항체가 키메라 항체인 방법.
77. 실시양태 72-76 중 어느 하나에 있어서, 항체가 항체 단편인 방법.
78. 실시양태 55-77 중 어느 하나에 있어서, 오염물이 폴리펩티드의 변이체인 방법.
79. 실시양태 55-78 중 어느 하나에 있어서, 오염물이 폴리펩티드의 분해 산물인 방법.
80. 실시양태 55-79 중 어느 하나에 있어서, 오염물이 폴리펩티드의 전하 변이체인 방법.
81. 실시양태 55-80 중 어느 하나에 있어서, 크로마토그래피 물질이 양이온 교환 크로마토그래피 물질인 방법.
82. 실시양태 81에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질이 술폰화 크로마토그래피 물질 또는 카르복실화 크로마토그래피 물질인 방법.
83. 각 폴리펩티드 조성물에 대하여, a) 폴리펩티드 및 1종 이상의 전하 변이체를 이온-교환 크로마토그래피 물질에 로딩 완충제를 약 1 mL/min의 유량으로 사용하여 결합시키며, 여기서 용리 완충제는 약 40℃에서 약 pH 7.6에서 10 mM HEPES 완충제를 포함하는 것인 단계; b) 폴리펩티드 및 전하 변이체 오염물을 이온-교환 크로마토그래피 물질로부터 용리 완충제의 구배를 사용하여 용리시키며, 여기서 용리 완충제는 약 pH 7.6에서 약 10 mM HEPES 완충제 및 NaCl을 포함하고, NaCl의 농도는 약 40분 내에 약 0 mM에서 약 80 mM로의 구배로 증가시키고, 폴리펩티드 및 그의 전하 변이체는 구배에 의해 분리되는 것인 단계; 및 c) 폴리펩티드 및 1종 이상의 전하 변이체를 검출하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 그의 전하 변이체로부터 효과적으로 분리하여 각각 폴리펩티드 및 폴리펩티드의 1종 이상의 전하 변이체를 포함하는 다수의 폴리펩티드 조성물을 분석하는 방법.
84. 실시양태 83에 있어서, 다수의 폴리펩티드 조성물이 다양한 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
85. 실시양태 83 또는 84에 있어서, 다수의 폴리펩티드 조성물이 다양한 pI를 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
86. 실시양태 83-85 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드 조성물이 항체 조성물인 방법.
본 명세서에 개시된 모든 특성은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특성은 동일하거나, 동등하거나, 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특성으로 대체될 수 있다. 따라서, 분명하게 달리 언급되지 않는 한, 개시된 각각의 특성은 단지 일련의 포괄적인 동등하거나 또는 유사한 특성의 예이다.
본 발명의 추가 상세내용은 하기의 비제한적 실시예에 의해 예시된다. 본 명세서 내의 모든 참고문헌의 개시내용은 본원에 명백히 참조로 포함된다.
실시예
하기 실시예는 순수하게 본 발명을 예시하기 위한 것이고, 따라서 본 발명을 임의의 방식으로 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 하기 실시예 및 상세한 설명은 예로서 비제한적 방식으로 제공된다.
실시예를 위한 물질 및 방법
달리 언급하지 않는 한, 하기의 물질 및 방법을 실시예를 위해 사용하였다.
물질
모든 mAb는 안정한 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary) (CHO) 세포주 또는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포를 사용하여 제조하였다.
MabPac SCS-10 및 Propac WCX-10 칼럼은 써모피셔(ThermoFisher)로부터 구입하였다. 안티보딕스(AntiBodix) 칼럼은 세팍스(Sepax)로부터 구입하였다. YMC 칼럼은 YMC로부터 구입하였다. 트리스마 (트리스)는 말린크로트 베이커 인크.(Mallinckrodt Baker Inc.) 또는 시그마(Sigma) (미주리주 세인트 루이스)로부터 입수하였고, HEPES, ACES, 트리즈마 염기 및 CAPS는 시그마로부터 입수하였다. 염화나트륨, 수산화나트륨 (10 N) 및 염산 (12 N)은 말린크로트 베이커 인크.(Mallinckrodt Baker Inc.)로부터 입수하였다. 인산 (85%)은 EMD 밀리포어로부터 입수하였다.
HPLC 설정
양이온 교환 크로마토그래피 실험은 주로 워터스(Waters) 2796 바이오얼라이언스(BioAlliance) 액체 크로마토그래피 기구, 애질런트(Agilient) 1200SL HPLC 시스템 또는 얼티메이트(UltiMate) 3000 4원 급속 분리 LC (써모 사이언티픽 디오넥스(Thermo Scientific Dionex))에서 수행하였다. 기구는 저압 4원 구배용리 펌프 또는 2원 펌프, 온도 제어 능력을 갖는 오토샘플러, 정밀한 온도 제어를 위한 열적 칼럼 구획, 및 이중-파장 다이오드 어레이 UV 검출기를 포함하였다. 기구 제어, 데이터 획득 및 데이터 분석은 디오넥스 크로멜레온 소프트웨어, 버전 6.8을 사용하여 수행하였다.
실시예 1: 다중-산물 분석용 이온 교환 크로마토그래피의 최적화.
오염물, 예컨대 전하 변이체를 검출하기 위한 고해상도 및 견실한 다중산물 IEC를 개발하기 위해, 조건은 mAb가 전하 평형에 있도록 설계되었다. 전하 평형은 알짜 전하 상태 (z) vs. pH를 그래프화함으로써 다수의 mAb 산물에 대해 결정되었다. mAb가 평형에 있는 조건은 pH에 대한 z 선 방정식의 이차 도함수 = 0으로 설정함으로써 구하였다.
주어진 pH에서 mAb의 알짜 전하는 단백질의 pH-의존성 특성을 그의 측쇄에 의해 정의하는데 중요한 역할을 수행하는, mAb에 있는 6가지 아미노산의 함량에 기초하여 결정되었다. 6가지 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 티로신, 리신 및 아르기닌이다. 6가지 아미노산의 산 해리 상수 (pKa, -log10Ka로서 정의됨)를 사용하여 알짜-전하 상태 (z)를 계산하였다. MAb1은 10개의 히스티딘 잔기를 갖는다. 도 2는 히스티딘의 양성자화를 pH의 함수로서 보여준다. 예를 들어, 히스티딘 pKa 6.02 미만의 pH 값에서, 히스티딘은 양성자화되어 양전하를 수반한다 (도 2A). 6.02 초과의 pH 값에서는, 히스티딘은 탈양성자화되어 전하를 수반하지 않는다. 방정식 1을 사용하여, 특정한 pH에서 히스티딘에 대한 특정한 전하 상태의 확률을 결정하였다. 도 2B는 pH 6.5 및 pH 7.5에서 mAb1에서의 탈양성자화 히스티딘의 가능한 분포를 보여준다. pH 6.5에서 mAb1은 8개 탈양성자화 히스티딘 잔기의 중앙값을 갖지만, pH 7.5에서는 거의 모든 히스티딘 잔기가 탈양성자화되었다. 도 2C는 각각 2개의 히스티딘 잔기를 갖는 4개의 폴리펩티드 분자를 사용하는 예를 보여준다. pKa (pH 6.02)에서, 50%의 His 잔기가 양성자화되고, 50%가 탈양성자화된다. 이들 4개 분자 상에 있는 히스티딘 잔기의 전하 상태 조합은 pKa에서 이항 분포이며: 하나는 양성자화 히스티딘 둘 다를 갖고; 둘은 1개의 양성자화 및 또 다른 탈양성자화 히스티딘을 갖고; 하나는 탈양성자화 히스티딘 둘 다를 갖는다.
주어진 pH에 대한 가장 풍부한 전하 상태의 확률은 6가지 아미노산 각각에 대해 결정되었고, 주어진 pH에서 mAb1의 전하의 가중된 확률은 항체에 존재하는 이들 6가지 아미노산 각각의 잔기 수를 기초로 하여 결정되었다 (도 3). 전하 분포의 빈도는 또한 샤논 엔트로피를 통해 결정될 수 있고, 이는 무작위 변수에서의 불확실성의 척도이다 (방정식 3). mAb1에 존재하는 이들 6가지 아미노산 각각의 잔기 수 (표 3)를 기초로 하여, mAb1에 대한 주어진 pH에서의 샤논 엔트로피는 도 4에 플롯팅된다. 샤논 엔트로피가 낮아질수록, 전하 분포는 더 균질해진다.
<표 3>. mAb1 중의 선택된 아미노산 잔기 수
Figure pct00009
이 데이터로부터, mAb1의 알짜 전하의 분포는 pH의 함수로서 플롯팅하고 (도 5), 변곡점은 37℃에서 pH 7.5인 것으로 결정되었다 (도 6, 이는 도 5의 상면도임). 이는 도 5에서 가장 크고 가장 예리한 피크로 보여지는, 가장 균질한 전하 상태를 갖는 pH임을 유념한다. 가장 균질한 전하 상태는 또한 IEC 분리에서 가장 예리한 피크를 생성할 것이다.
싱기 기재된 방법을 사용하여, 7.6 내지 9.4 범위의 pI를 갖는 다수의 mAb에 대한 변곡점을 결정하였다 (도 7). 놀랍게도, 거의 모든 mAb에 대한 변곡점은 37℃에서 pH 7.5로 동일하였다. IP를 표적화하는 것은 IEC의 pH 견실성을 개선할 수 있다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 알짜 전하는 모든 항체에 대해 pH 7 내지 pH 8에서 거의 변화하지 않는다.
mAb에 대한 변곡점은 22℃, 37℃ 및 50℃에서 결정하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 변곡점은 온도에 의존적이지만, 시험된 모든 항체에 대한 변곡점은 주어진 온도에서 유사하였다.
mAb2에 대한 변곡점은 22℃ 내지 50℃ 범위의 온도에 대해 결정하였다. 도 9에 보여지는 바와 같이, 변곡점 pH가 온도에서의 증가에 따라 감소하지만, 알짜 전하는 일정하게 남아있다. 따라서, 변곡점에 대한 크로마토그래피의 최적화는 또한 온도 변동에 대한 IEX 방법 견실성을 제공한다. 용어 dIP/dT는 온도에서의 변화에 대한 분자 IP에서의 변화를 나타낸다. 이들 결과로부터, 최적의 완충제는 온도 함수로서의 완충제의 산 해리 상수에서의 변화가 dIP/dT에 접근하여 (즉, dIP/dT
Figure pct00010
dpKa/dT) 온도 효과를 최소화하고 검정 견실성을 개선하도록 하여 선택될 수 있다.
변곡점 pH 및 온도 사이의 관계를 플롯팅하고, 선형 회귀의 기울기인 dIP/dT 값을 다양한 pI 값을 갖는 다수의 mAb에 대해 계산하였다 (도 10 및 표 4). 이들 6종의 mAb에 대한 dIP/dT 값은 본질적으로 동힐한 것으로 밝혀졌다 (-0.0177 내지 -0.0183). 이와 같이, 약 -0.018의 dpKa/dT 값을 갖는 완충제는 도 10에 제시된 모든 mAb의 IEC 분석에 대해 최적이고, 따라서 다중-산물 IEC에 대해 최적일 것이다.
<표 4> 변곡점 (pH)
Figure pct00011
다수의 완충제에 대하여 온도의 함수로서의 pKa의 변화 (dpKa/dT)의 공개된 값은 다음과 같다:
포스페이트: -0.0028
HEPES: -0.014
ACES: -0.02
트리스: -0.028
비신: -0.018
트리신: -0.021
TAPS: -0.02
CHES: -0.018
문헌 [Benyon, RJ & Easterby, JS, Buffer Solutions The Basics, IRL Press, 1996]을 참조한다.
도 11은 포스페이트 완충제, HEPES 완충제, ACES 완충제 및 트리스 완충제 중 mAb2의 변곡점에서의 알짜 전하의 그래프를 온도의 함수로서 보여준다. ACES 완충제 또는 HEPES 완충제 중 mAb2의 알짜 전하의 그래프는 30℃ 범위에 걸쳐 거의 평평하게 0.5 미만 변화하였다. 다른 한편으로는, 트리스 및 포스페이트에 대한 그래프는 평평하지 않았으며, 이는 온도에서의 변화에 비해 알짜 전하에서의 변화가 더 크다는 것을 보여준다. ACES 또는 HEPES가 다중-산물 IEC 분석을 위한 최적의 완충제인 것으로 결정되었다.
실시예 2. 다중-산물 IEC 프로토콜의 개발.
다중-산물 IEC 프로토콜을 다수의 mAb에 대해 결정된 dIP/dT 값과 ACES 및 HEPES에 대한 dpKa/dT 값의 관계, 및 변곡점의 관점에서 개발하였다. 19종의 mAb를 시험하였다. mAb 샘플을 완충제 A를 사용하여 1 mg/mL로 희석하고, 오토-샘플러 내 5±3℃에서 유지하였다. MabPac SCX-10, 4 x 250 mm 칼럼을 37±1℃에 설정된 온도를 갖는 칼럼 구획에 위치시켰다. 각 크로마토그래피 진행을 위해, 10 μL의 단백질 (20 μg)을 주입하였다. 완충제 A는 37℃에서 5 mM ACES pH 7.5였다. 완충제 B는 완충제 A 중 180 mM NaCl이었다. 구배는 완충제 B를 완충제 A 내로 혼합함으로써 100분 내에 1 mM/min으로 0-100 mM NaCl이었다. 유량은 0.8 mL/min이었다. 단백질을 280 nm에서의 흡광도에 의해 검출하였다. 도 12에 보여지는 바와 같이, 다중-산물 IEC는 광범위한 mAb 산물에 대해 우수한 해상도를 제공하였다.
실시예 3. 다중-산물 IEC의 pH 견실성
다중-산물 IEC의 pH 견실성은, 구배가 1.5 mM NaCl/min인 것을 제외하고는 실시예 2에 기재된 방법을 사용하여, 3가지 상이한 pH 값, pH 7.3, pH 7.5 및 pH 7.7에서 검사하였다. mAb4를 이 연구를 위한 비제한적 예시적 항체로서 사용하였다.
도 13에 보여지는 바와 같이, 항체 주요 피크 및 그의 전하 변이체 사이의 우수한 해상도가 시험된 모든 pH 값에서 보여졌다. 피크 면적의 정량화는 pH에 관련한 분석에서 어떠한 유의한 변화도 드러나지 않았다 (표 5).
<표 5> 다중-산물 IEC의 pH 견실성
Figure pct00012
a 방정식 4에 의해 정의된 해상도.
방정식 4
Figure pct00013
상기 식에서, R은 해상도이고,
tr1 및 tr2는 2개의 바로 인접한 피크의 체류 시간이고,
w1 및 w2는 바로 인접한 피크의 피크 폭이다.
실시예 4. 온도 견실성
다중-산물 IEC의 온도 견실성을 구배가 1.5 mM NaCl/min인 것을 제외하고는 실시예 2에 기재된 방법을 사용하여 3가지 상이한 온도 32℃, 37℃ 및 42℃에서 검사하였다. mAb2, mAb6 및 mAb 10을 이 연구를 위한 비제한적 예시적 항체로서 사용하였다.
도 14에 보여지는 바와 같이, 항체 및 그의 전하 변이체 사이의 우수한 해상도가 각 항체에 대해 시험된 모든 온도에서 보여졌다. 거의 동일한 크로마토그램이 각 항체에 대한 각 온도에 따라 보여졌다.
제2 실험에서, mAb 19, 7 및 8을 10 mM HEPES 완충제에서 온도 견실성에 대해 시험하였다. 도 15에 보여진 바와 같이, 항체 및 그의 전하 변이체 사이에 우수한 해상도가 각 항체에 대해 시험된 모든 온도에서 보여졌다. 피크 면적의 정량화는 온도에 관한 분석에서 어떠한 유의한 변화도 드러나지 않았다.
<표 6> 다중-산물 IEC의 온도 견실성
Figure pct00014
실시예 5. 다중-산물 IEC와 산물-특이적 IEC와의 비교.
다중-산물 IEC를 mAb8, mAb25 및 mAb26에 대해 개발된 산물-특이적 IEC 방법과 비교하였다. mAb8, mAb28 및 mAb26의 IEC를 1.5mM NaCl/min으로의 구배를 제외하고는 실시예 2에 기재된 다중-산물 IEC 방법을 사용하여 수행하였다 [제넨텍(Genentech)-확인 요망]. 산물 특이적 방법을 위한 완충제 및 온도는 다양하였다. mAb8의 경우에, 이는 30℃에서 20 mM MES pH 6.5이고; mAb25의 경우에, 이는 42℃에서 20 mM HEPES pH 7.6이고; mAb26의 경우에, 이는 40℃에서 20 mM ACES pH 7.1이다. 도 16에 보여질 수 있는 바와 같이, 다중-산물 IEC (좌측 패널)는 산물-특이적 IEC 방법 (우측 패널)과 유사하게 또는 그보다 더 우수한 해상도로 수행되었다.
실시예 6. 다양한 칼럼에 의한 다중-산물 IEC의 사용
다중-산물 IEC를 크로마토그래피 칼럼 선별을 위해 사용하였다. mAb8을 구배가 1.5 mM NaCl/min인 것을 제외하고는 실시예 2에 기재된 방법을 사용하여 4가지 상이한 양이온 교환 칼럼에서 시험하였다. 시험된 칼럼은 ProPac WCX-10, 4 x 250, 10 μm; YMC, 4.6 x 100, 5 μm; 안티보딕스 NP5, 4.6 x 250, 5 μm; 및 MabPac SCX-10, 4 x 250, 10 μm (실시예 2에 사용됨)이었다. 도 17에 보여질 수 있는 바와 같이, 모든 4가지 칼럼은 적절한 해상도를 생성하였다. 산 피크 및 염기성 피크와, 주요 피크 사이의 피크 면적의 정량화 및 해상도는 표 7에 나타낸다.
<표 7> mAb8에 대한 칼럼 스크리닝
Figure pct00015
실시예 7. 확장성
다양한 크기의 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼의 사용은 다중-산물 IEC에 사용하기 위해 평가받았다. 감소된 칼럼 길이는 실행 시간을 보다 단축할 것이다. mAb8은 실시예 2에 기재된 다중-산물 IEC 방법을 사용하여 3가지 다양한 크기의 ProPac WCX-10 칼럼 상에서 크로마토그래피하였다. 칼럼의 크기가 다양하기 때문에, 크로마토그래피 진행은 다양한 시간 기간 동안 이루어졌다. 칼럼 크기 및 각 실행 시간은 다음과 같았다: 63분 동안 4 x 250 mm, 19분 동안 4 x 100 mm, 및 15분 동안 4 x 50 mm. 결과는 도 18에 제시하였다. 비록, 보다 짧은 칼럼을 사용하는 경우에 일부 해상도가 손실되기도 하지만, 일관적 정량적 결과를 갖는 적절한 분리는 고처리량 적용을 위해 보다 짧은 칼럼에 의해 획득된다. 피크 면적의 정량화는 일관적이고, 표 8에 나타내었다.
<표 8> 다중-산물 IEC의 확장성
Figure pct00016
실시예 8: 검정의 견실성
시험 절차의 확인은 적합하게 견실한 방법을 요구한다. 포괄적으로 견실성을 평가하기 위한 실험 설계 (DoE) 접근법은 상호작용 효과를 비롯한 검정 조건에서 부수적 변형의 효과를 평가한다. 각 실험의 특정한 다변량 조건은 상호작용 잠재력을 갖는 인자를 조합하여 선택되었다. 계속적으로 변경될 수 없지만, 효과를 갖는 것으로 공지된 인자, 즉 칼럼 (예를 들어, 로트간 변동성, 수명) 및 기기 (예를 들어, 두 모델 유형)는 한 번에 하나의 인자(one-factor-at-a-time) 방법으로 검사되었다. 효과는 표적 조건에서의 반응 변동성을 요인 설계에 따라 변경된 조건에서 반응의 변동성에 대해 비교함으로써 결정되었다.
실험 설계
다음은 플랫폼 방법 대조군 접근법에 대한 재조합 모노클로날 항체 단백질의 전하 이종성을 모니터하기 위해 사용된 이온 교환 조건을 기재하고 있다. 이 연구의 목적은 6가지 인자 플래케트-버만(Plackett-Burman) 실험 설계를 사용하여 검정 견실성을 연구하는 것이었다 (표 9 및 10). 검사된 인자는 용매 pH, 최종 염 농도, 칼럼 온도, 유량, 주입 부피 및 완충제 몰랄농도였다. 이 연구를 위한 반응 변수는 관련 백분율 주요 피크, 산성 및 염기성 변이체를 포함하였다. 요인 조건에서 12회 및 표적 조건에서 9회, 총 21회 실행이 수행되었다.
<표 9>
Figure pct00017
<표 10>
Figure pct00018
<표 11> 견실성 요약표
Figure pct00019
통계적 분석
표적 반응 값의 샘플은 모든 변수 인자가 표적 조건에 있는 경우에 발생하는 변동성을 나타낸다. 요인 반응 값의 샘플은 다중 인자가 조합으로 변경되는 경우에 발생하는 변동성을 나타낸다.
<표 12>
Figure pct00020
평균, 표준 편차 (SD) 및 상대 표준 편차 (RSD)를 모든 표적 및 DoE 요인 반응 값에 대해 계산하였다. 미미한 차이가 표적 조건 및 요인 조건 이소형의 SD 및 RSD 사이에 보이지만, 이들은 전례없이 낮다. 결과를 도 19-21에 나타내었다.
전형적으로 IEC 확인을 위해 허용가능한 %RSD 제한은 다음과 같다: 주요 피크에 대해 < 5%, 산성 및 염기성 변이체에 대해 < 10%.
모든 요인 조건은 표적 조건 결과로부터 계산된 95/99 허용오차 간격 내에 있는 % 주요 피크 및 % 염기성에 대한 결과를 생성한다.
두 요인 조건 #10 (- + - - + -) 및 #12 (- + - + + +)는 표적 조건 결과로부터 계산된 낮은 95/99 TI 요건 미만의 % 산성 변이체 값을 생성하였다. 모든 기타 요인 조건은 간격 내의 값을 생성하였다.
표적 조건 95/99 TI 밖의 값을 생성하는 조건은 DoE 연구 내 검정 및 제한된 비제어 변동성 (기기 & 칼럼) 면에서 높은 수준의 정밀도의 결과이다.
IEC를 위한 보통의 95/99 TI는 주요 피크, 산성 및 염기성 변이체에 대해 3-5% 범위 내에 있을 수 있다.
물질 및 방법
단백질 또는 항체 약물 물질의 전하 변이체를 정량화하기 위해, 임상 제품용 약물 제품 또는 독성학 물질을 플랫폼 방법 대조군 (PMC) 접근법에 사용하였다. 플랫폼 방법 대조군 접근은 이 다중-산물 양이온 교환 크로마토그래피 방법에서 시스템 적합성의 결정을 위한 방법 대조군으로서 대표적인 항체를 사용하였다. 이 다중-산물 시험 절차는 양성 알짜 전하 (대략 pI > 7.2)를 갖는 단백질 분자에 적용가능하다.
장비 및 물질
1.1 HPLC 시스템: 조정가능한 UV (TUV)를 갖춘 워터스 UPLC H-클래스 바이오; 워터스 2487 검출기를 갖춘 워터스 얼라이언스(Waters Alliance) 2695, 및 워터스 2489 UV/Vis 검출기 또는 등가물을 갖춘 워터스 얼라이언스 e2695.
1.2 280 nm에서 모니터링할 수 있는 인-라인 UV 검출기.
1.3 HPLC는 설정점 ± 2℃에서 온도를 유지할 수 있는 칼럼 구획을 함유해야 한다.
1.4 피크 면적의 적분을 가능하게 하는 전자 적분기 또는 컴퓨터 시스템.
1.5 2-8℃로의 냉각을 가능하게 하는 오토샘플러.
1.6 칼럼: 써모피셔(ThermoFisher) MabPacR SCX-10, 10μm, 4 250 mm (써모, 제품 번호 074625).
1.7 온도 보상되는 pH 계측기.
1.8 37 ± 2℃에서 가열을 가능하게 하는 수조.
1.9 수조 내로 부분 침지되어 사용되는 것으로 명시된 1℃ 분할을 갖춘 보정된 온도계.
시약
주: 레시피는 시약의 공칭 수량에 대한 것이고, 검정 요건에 따라 비례적으로 조정될 수 있다.
2.1 HPLC 분석에 적합한 정제수 (수퍼-Q 또는 등가물)
2.2 용매 A: 5mM HEPES 완충제, pH 7.5 ±0.1
HEPES 유리 산, 시약 등급 (FW 238.3, 코닝 셀그로(Corning CellGro); 제품 번호 61-034-RO ), 1.87 g
HEPES 나트륨 염, 시약 등급 (FW 260.3, 시그마알드리치(SigmaAldrich); 제품 번호 H3784), 1.87 g
정제수 3 L까지의 충분량
열거된 화학물질을 대략 2900 mL의 정제수가 채워진 눈금 실린더에서 합하였다. 용해될 때까지 교반하였다. 정제수를 3 L까지 충분량 첨가하고, pH를 측정하였다. pH가 주위 온도에서 7.5 ± 0.1임을 확인하였다. pH가 명시된 범위를 벗어나는 경우에, 폐기하고 제조를 반복하였다. 0.2- μm 막을 통해 여과하였다.
2.3 용매 B: 용매 A 중 100mM 염화나트륨
염화나트륨 (FW 58.44 J. T. 베이커(J. T. Baker) Cat. no. 3624-01 또는 등가물), 5.844 g
용매 A (단계 2.2) 1 L까지 충분량
염화나트륨을 대략 450 mL의 용매 A가 채워진 눈금 실린더에서 합하고, 용해될 때까지 교반하였다. 용매 A를 1 L까지 충분량 첨가하고, 0.2- m 막을 통해 여과하였다.
2.4 용매 C: 용매 A 중 1M 염화나트륨
염화나트륨 (FW 58.44 J. T. 베이커 Cat. no. 3624-01), 29.22 g
용매 A (단계 2.2) 500 mL까지 충분량
염화나트륨을 대략 450 mL의 용매 A가 채워진 눈금 실린더에서 합하고, 용해될 때까지 교반하였다. 용매 A를 500 mL까지 충분량 첨가하고, 0.2-μm 막을 통해 여과하였다.
2.5 칼럼 저장 용액: 용매 B 중 0.05% 아지드화나트륨, pH 7.5 ± 0.1
주의: 아지드화나트륨은 고도로 독성이고 돌연변이원성이다. 분진 호흡을 피하고, 피부와의 접촉을 피하였다 (이는 피부를 통해서도 용이하게 흡수됨).
아지드화나트륨 (FW 65.01,EM 사이언스(EM Science) 0066884R 또는 등가물), 2.25 g; 용매 B (단계 2.2), 500 mL까지 충분량
아지드화나트륨을 대략 450 mL의 용매 B이 채워진 눈금 실린더에서 합하고, 용해될 때까지 교반하였다. 용매 B를 용액 500 mL까지 충분량 첨가하고, 0.22-μm 막을 통해 여과하였다.
2.6 칼럼 및 시스템 세정 용액: 0.1N 수산화나트륨 (JT 베이커 5636-02), 하기 단계에 따라 제조하였다.
1N NaOH 100μL
정제수 900 μL
열거된 화학물질을 합하고, 잘 혼합하였다.
2.7 샘플 및 참조 표준물 제제 완충제
2.8 10% 폴리소르베이트 20 원액 (w/v)
폴리소르베이트 20 (폴리소르베이트™ 20, 시그마 Cat. P7949 또는 등가물) 10 g, 정제수 100 mL까지 충분량
폴리소르베이트 20을 칭량된 눈금 실린더 내로 칭량하였다. 실린더의 목과 계면활성제와의 접촉을 피하였다. 정제수를 조심스럽게 100mL까지 충분량 첨가하고, 버블 형성을 피하였다. 자기 교반 막대를 실린더 내로 서서히 내렸다. 모든 계면활성제가 용해될 때까지 용액을 15-20분 동안 교반하였다.
2.9 방법 대조군 제제 완충제
MAb8 제제 완충제: 20 mM 히스티딘 HCl, 120 mM 수크로스, 0.02% 폴리소르베이트 20, pH 6.0 ± 0.3
L-히스티딘 HCl, 1수화물 (FW 209.6) 2.31 g
L-히스티딘, 유리 염기 (FW 155.2) 1.40 g
수크로스 (FW 342.3) 41.08 g
폴리소르베이트 20 0.20 g
또는 10% 폴리소르베이트 20 (w/v) 원액 2.0 mL
정제수 1.0 L까지 충분량
열거된 화학물질을 대략 800 mL의 정제수와 합하고, 용해될 때까지 교반하였다. pH가 6.0 ± 0.3임을 확인하였다. pH가 명시된 범위를 벗어난 경우에, 폐기하고 제조를 반복하였다. 용액에 정제수를 1.0 L까지 충분량 첨가하였다. 0.45-μm 막을 통해 여과하였다.
2.10 5 mg/mL 카르복시펩티다제 B (DFP 처리됨) (로슈(Roche) 103233) 또는 등가물, 대략적인 활성 150 U/mg
2.11 1 mg/mL CpB
5 mg/mL 카르복시펩티다제 B (DFP 처리됨) 20 μL
정제수 80 μL
5 mg/mL 카르복시펩티다제 B를 정제수 내로 정확하게 첨가하였다. 구입한 카르복시펩티다제 B의 5 mg/mL 이외의 농도에 대하여, 부피에 대한 조정은 최종 농도 1 mg/mL가 확실하도록 수행될 수 있다. 새로 제조하였다.
방법 대조군, 샘플, 참조 및 제제 완충제 블랭크 제조
3.1 방법 대조군 (MAb8), 공칭 농도: 50 mg/mL
방법 대조군을 용매 A (단계 2.2)로 최종 농도 대략 2.0 mg/mL까지 희석하였다 (예를 들어, 50 mg/mL 방법 대조군에 대하여, 40 μL 샘플 및 960 μL 용매 A를 합함).
3.2 방법 대조군 블랭크
방법 대조군 제제 완충제를 용매 A로 단계 3.1에서와 동일한 희석 반응식을 사용하여 희석하였다.
3.3 샘플 및 참조 표준물 제조
샘플(들) 및 참조 표준물을 용매 A로 2 mg/mL까지 희석하였다.
3.4 샘플 및 참조 표준물 블랭크 제조
3.4.1 산물을 위한 제제 완충제를 단계 3.4와 동일한 희석 반응식을 사용하여 희석하였다.
3.5 데이터 시트 상에 희석률 기록하였다.
3.6 CpB 소화를 사용한 샘플 제조는 CpB 소화 요건에 대한 산물 특이적 정보 및 지침을 지칭한다.
3.6.1 1 mg/mL CpB (단계 2.12)를 희석된 방법 대조군, 샘플(들), 참조 표준물 및 제제 완충제 블랭크에 첨가하여 1% (w/w)를 만들었다 (예를 들어, 20 L의 1 mg/mL CpB를 1000 L의 2.0 mg/mL 샘플에 첨가함).
3.6.2 서서히 와류시키고, CpB 처리된 방법 대조군, 샘플(들), 참조 표준물 및 제제 완충제 블랭크를 20 ± 2분 동안 37 ± 2℃에서 인큐베이션하였다.
3.6.3 데이터 시트 상에 제제를 기록하였다.
3.7 희석된 방법 대조군, 참조 표준물, 샘플(들) 및 제제 완충제 블랭크를 분석을 위해 적절한 바이알 내로 옮겼다.
3.8 HPLC 분석은 샘플 제조 48시간 내에 완결되어야 한다. 샘플(들)은 분석 이전에 2-8℃에서 저장되어야 한다.
크로마토그래피 조건
4.1 워터스 HPLC 기기 둘 다에 대해 공통인 크로마토그래피 조건:
4.1.1 유량: 1.5 mL/min
4.1.2 오토샘플러 온도: 5 ± 3℃
4.1.3 칼럼 온도: 40 ± 2℃
4.1.4 UV 검출 파장: 280 nm
4.1.5 주입 부피: 25 L (~50 g)
4.2 워터스 액퀴티 H-클래스 UPLC 및 다중 파장 또는 다이오드 어레이 검출기에 대한 기기 설정
4.2.1 제로 오프 셋 아날로그 출력: 5%
4.2.2 감쇠 아날로그 출력: 500 mAU
4.2.3 세척 설정: 바늘 세척액 (10% IPA)과 함께 주입
주입-전 10s
주입-후 20s
4.2.4 연신 및 분배 속도: 100μL/min
4.2.5 가속화 2.0 mL / min / 0.02분 (100mL/min/min)
4.2.6 검출기 설정
4.2.6.1 샘플링 비율: 1 pt/sec
4.2.6.2 필터: 함밍(Hamming)
4.2.6.3 시간 상수 1.0
4.2.6.4 비 최소 최소 비 0.00 최대 비 2.00
4.2.6.5 오토 제로 채널 A: (시간 0 및 시간 50)
4.2.6.6 감수성: 2.000 AUFS
4.3 워터스 2487 검출기를 갖춘 워터스 얼라이언스 (e)2695 HPLC에 대한 기기 설정
4.3.1 일회 박출량: 100 μL
4.3.2 바늘 세척 시간: 연장 (10% IPA)
4.3.3 용매 탈기: "온" 모드 설정
4.3.4 가속화 10.0 mL / min / 0.1분 (100mL/min/min)
4.3.5 연신 및 분배 속도: 느림 (50μL/min)
4.3.6 검출기 설정
4.3.6.1 샘플링 비율: 1 pt/sec
4.3.6.2 필터: 함밍
4.3.6.3 시간 상수 1.0
4.3.6.4 비 최소 0.1000
4.3.6.5 오토 제로 시간 0 및 시간 50에서 채널 A
4.3.6.6 감수성: 2.000 AU
4.4 구배:
<표 13>
Figure pct00021
기기 조건화
5.1 HPLC의 사용을 위해 적절한 프로토콜을 따른다.
5.2 10% IPA을 갖는 바늘 세척액 라인을 포함하는 ~20mL의 적절한 용매로 라인을 프라이밍하였다.
칼럼 세정 및 조건화
6.1 시스템 및 칼럼 세척을 다음의 등용매 프로그램을 사용하여 수행하였다. 100μL의 0.1N NaOH를 주입하였다.
<표 14>
Figure pct00022
6.2 단계 6.1을 적어도 5회 반복하였다.
6.3 단계 6.1에서의 등용매 프로그램을 사용하여, 100uL의 용매 A를 단일 주입하였다.
6.4 칼럼을 단계 4.4에서의 구배 프로그램의 초기 조건 (100% 용매 A를 1.5mL/min으로)으로 ~20분 동안 또는 안정한 기준선이 관찰될 때까지 평형화하였다.
주입 프로토콜
7.1 조건화: 일관된 크로마토그램이 최소 2회 주입 동안 관찰될 때까지, CpB 소화 없이 방법 대조군을 주입하였다. 산성 영역, 주요 피크 및 염기성 영역의 해상도는 전형적 크로마토그램에 대한 육안 검사에 의해 일관적이어야 한다.
7.2 CpB 소화 없는 플랫폼 방법 대조군 (단일 주사)
7.3 방법 대조군을 위한 제제 완충제 블랭크
7.4 참조 표준물* (단일 주사)
7.5 샘플(들)* (이벌 주사)
7.6 참조 표준물* (단일 주사)
7.7 참조 표준물(들)*을 위한 제제 완충제 블랭크(들) (단일 주사)
7.8 CpB 소화 없는 플랫폼 방법 대조군 (단일 주사)
* 산물이 타당한 경우에 CpB 존재 또는 부재.
주: 1) 제제 완충제가 참조 표준물 및 샘플에 따라 달라지는 경우에, 참조 표준물 및 샘플에 대해 개별 블랭크를 주입한다.
2) 방법 대조군 중간에 15회 초과의 주입 (참조 표준물 및 각각의 산물 제제 완충제 블랭크 포함)이 필요한 경우에, 매 15회 주입을 방법 대조군 주입과 함께 브라켓하였다. 시험 데이터 시트의 시스템 적합성 섹션에, 보고되는 샘플(들)을 브라켓한 방법 대조군 주입만을 보고하였다.
3) 참조 표준물은 샘플로 고려되고, 시험 세션의 시스템 적합성을 평가하는데 사용되지는 않았다.
칼럼 정지 및 저장
칼럼을 적어도 30 mL의 칼럼 저장 용액 (단계 2.4)으로 플러슁함으로써 칼럼을 저장하였다.
시스템 적합성
주: 방법 대조군에 대해, 방법 대조군 프로파일을 방법 대조군 제제 완충제 블랭크와 중첩시킴으로써, 적분 종점을 결정하였다. 블랭크를 방법 대조군 프로파일과 비교함으로써, 중첩 프로파일을 확장하고, 적분의 종점을 확인하였다.
9.1 단백질에 기인한 모든 피크를 적분하였다. 방법 대조군 제제 완충제 블랭크 크로마토그램에 존재하는 임의의 피크는 블랭크에서의 상응하는 피크가 PMC에서의 피크의 < 1%가 아니면 포함시키지 않았다.
9.2 브라켓팅 방법 대조군 주입의 크로마토그램 프로파일의, 서로 간의 및 전형적 크로마토그래피 프로파일과의 일관성을 시각적으로 확인하였다. 전형적 크로마토그램에는 모든 명명된 피크가 존재해야 한다.
주: 명명된 피크의 프로파일은 칼럼 및 기기 변동성으로 인해 실시예 프로파일로부터의 피크 형상에서 약간 상이할 수 있다.
9.3 각각 브라켓팅 방법 대조군 주입에 대한 퍼센트 주요 피크, 산성 영역 및 염기성 영역을 계산하였다.
9.4 시스템 적합성 범위
<표 15> CpB 비처리된 방법 대조군에 대한 허용가능한 시스템 적합성 범위
Figure pct00023
9.5 시스템 적합성 데이터 시트에 결과를 기록하였다.
데이터 분석
10.1 프로파일을 시각적으로 비교하여 샘플 및 참조 표준물 크로마토그램 둘 다에서의 피크를 확인하였다.
10.2 단백질에 기인한 모든 피크를 적분하였다. 산물 제제 완충제 블랭크 크로마토그램에 존재하는 임의의 피크는 블랭크에서의 상응하는 피크가 PMC에서의 피크의 < 1%가 아니면 포함시키지 않았다.
주: 적분 종점을 결정하기 위해, 샘플(들) 및 참조 표준물 프로파일을 산물 제제 완충제 블랭크와 중첩시켰다. 산물 제제 완충제 블랭크를 샘플(들) 및 참조 표준물 프로파일과 비교함으로써, 중복 프로파일을 확장하고, 적분의 종점을 확인하였다.
10.3 각각의 샘플(들) 및 참조 표준물 주입물을 분석하여 주요 피크, 산성 영역 및 염기성 영역의 퍼센트 피크 면적을 계산하였다.

Claims (86)

  1. a) 2종 이상의 조성물 중 폴리펩티드의 아미노산 조성을 기초로 하여, 선택된 온도에서의 알짜 전하 대 pH 곡선을 플롯팅하는 단계, 및
    b) 단계 a)의 플롯의 이차 도함수를 결정함으로써 중성 또는 거의 중성 pH에서의 알짜 전하 대 pH 곡선의 변곡점을 결정하는 단계
    를 포함하며; 여기서 최적의 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건은 1종 이상의 조성물 중 폴리펩티드(들)에 대한 대략 공통의 변곡점에서의 pH인,
    각각 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 다수의 조성물을 분석하기 위한 최적의 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건을 확인하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 변곡점에서의 알짜 전하가 양성인 경우에, 양이온 교환 물질을 이온 교환 크로마토그래피에 사용하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질이 술폰화 크로마토그래피 물질 또는 카르복실화 크로마토그래피 물질인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 변곡점에서의 알짜 전하가 음성인 경우에, 음이온 교환 물질을 크로마토그래피에 사용하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질이 4급 아민 크로마토그래피 물질 또는 3급 아민 크로마토그래피 물질인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 혼합 모드 크로마토그래피 물질을 크로마토그래피에 사용하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 혼합 모드 이온 교환 물질이, 순차적으로 패킹된 술폰화 크로마토그래피 물질 또는 카르복실화 크로마토그래피 물질 및 4급 아민 크로마토그래피 물질 또는 3급 아민 크로마토그래피 물질의 혼합물인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    c) 2종 이상의 조성물 중 폴리펩티드에 대하여 온도에서의 변화에 대한 알짜 전하 대 pH 곡선의 변곡점 pH에서의 변화 (dIP/dT)를 결정하는 단계,
    d) 온도에서의 변화에 대한 완충제의 산 해리 상수에서의 변화 (dpKa/dT)가 폴리펩티드의 dIP/dT와 본질적으로 동일한, 크로마토그래피에 사용하기 위한 완충제를 선택하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 완충제가 변곡점 pH에서 유효 완충 용량을 제공하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 조성물 중 폴리펩티드의 dIP/dT가 약 -0.02 pH 단위인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 온도에서의 변화가 약 20℃에서 약 70℃인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 온도에서의 변화가 약 20℃에서 약 50℃인 방법.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, dpKa/dT = dIP/dT ± 50%인 방법.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d)에서 선택된 완충제 중 폴리펩티드의 알짜 전하가 30℃에 걸쳐 0.5 미만 변화하는 것인 방법.
  15. 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d)에서 선택된 완충제를 약 5 mM 내지 약 250 mM 범위의 농도로 크로마토그래피에 사용하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제 조성물이 염을 추가로 포함하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 염이 NaCl, KCl, (NH4)2SO4 또는 Na2SO4인 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 염의 농도가 약 1 mM 내지 약 1M의 범위인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 항체 또는 이뮤노어드헤신 또는 그의 단편인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 모노클로날 항체 또는 그의 단편인 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 항체가 인간 항체인 방법.
  22. 제19항 또는 제20항에 있어서, 항체가 인간화 항체인 방법.
  23. 제19항 또는 제20항에 있어서, 항체가 키메라 항체인 방법.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 항체 단편인 방법.
  25. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 오염물이 폴리펩티드의 변이체인 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 오염물이 폴리펩티드의 분해 산물인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 오염물이 폴리펩티드의 전하 변이체인 방법.
  28. a) 폴리펩티드의 아미노산 조성을 기초로 하여, 선택된 온도에서의 알짜 전하 대 pH 곡선을 플롯팅하는 단계, 및
    b) 단계 a)의 플롯의 이차 도함수를 결정함으로써 중성 또는 거의 중성 pH에서의 알짜 전하 대 pH 곡선의 변곡점을 결정하는 단계
    를 포함하며; 여기서 최적의 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건은 폴리펩티드에 대한 대략 변곡점에서의 pH인,
    폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 조성물을 분석하기 위한 최적의 이온 교환 크로마토그래피 분리 조건을 확인하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 변곡점에서의 알짜 전하가 양성인 경우에, 양이온 교환 물질을 이온 교환 크로마토그래피에 사용하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질이 술폰화 크로마토그래피 물질 또는 카르복실화 크로마토그래피 물질인 방법.
  31. 제28항에 있어서, 변곡점에서의 알짜 전하가 음성인 경우에, 음이온 교환 물질을 크로마토그래피에 사용하는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질이 4급 아민 크로마토그래피 물질 또는 3급 아민 크로마토그래피 물질인 방법.
  33. 제28항에 있어서, 혼합 모드 크로마토그래피 물질을 크로마토그래피에 사용하는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 혼합 모드 이온 교환 물질이, 순차적으로 패킹된 술폰화 크로마토그래피 물질 또는 카르복실화 크로마토그래피 물질 및 4급 아민 크로마토그래피 물질 또는 3급 아민 크로마토그래피 물질의 혼합물인 방법.
  35. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    c) 폴리펩티드에 대하여 온도에서의 변화에 대한 알짜 전하 대 pH 곡선의 변곡점 pH에서의 변화 (dIP/dT)를 결정하는 단계,
    d) 온도에서의 변화에 대한 완충제의 산 해리 상수에서의 변화 (dpKa/dT)가 폴리펩티드의 dIP/dT와 본질적으로 동일한, 크로마토그래피에 사용하기 위한 완충제를 선택하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 완충제가 변곡점 pH에서 유효 완충 용량을 제공하는 것인 방법.
  37. 제28항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 조성물 중 폴리펩티드의 dIP/dT가 약 -0.02 pH 단위인 방법.
  38. 제28항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 온도에서의 변화가 약 20℃에서 약 70℃인 방법.
  39. 제28항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 온도에서의 변화가 약 20℃에서 약 50℃인 방법.
  40. 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, dIP/dT = dpKa/dT ± 50%인 방법.
  41. 제28항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d)에서 선택된 완충제 중 폴리펩티드의 알짜 전하가 30℃에 걸쳐 0.5 미만 변화하는 것인 방법.
  42. 제28항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d)에서 선택된 완충제를 약 5 mM 내지 약 50 mM 범위의 농도로 크로마토그래피에 사용하는 것인 방법.
  43. 제28항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제 조성물이 염을 추가로 포함하는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 염이 NaCl, KCl, (NH4)2SO4 또는 Na2SO4인 방법.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 염의 농도가 약 10 mM 내지 약 1M의 범위인 방법.
  46. 제28항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 항체 또는 이뮤노어드헤신 또는 그의 단편인 방법.
  47. 제28항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 모노클로날 항체 또는 그의 단편인 방법.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 항체가 인간 항체인 방법.
  49. 제46항 또는 제47항에 있어서, 항체가 인간화 항체인 방법.
  50. 제46항 또는 제47항에 있어서, 항체가 키메라 항체인 방법.
  51. 제38항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 항체 단편인 방법.
  52. 제28항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 오염물이 폴리펩티드의 변이체인 방법.
  53. 제28항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 오염물이 폴리펩티드의 분해 산물인 방법.
  54. 제28항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 오염물이 폴리펩티드의 전하 변이체인 방법.
  55. a) 각각 제1항의 방법에 따른 표적 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 다수의 조성물에 대한 최적의 pH 및 온도 이온 교환 분리 조건을 결정하는 단계;
    b) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 조성물로부터 이온-교환 크로마토그래피 물질에 로딩 완충제를 사용하여 결합시키며, 여기서 로딩 완충제는 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법에 의해 확인된 완충제를 포함하는 것인 단계;
    c) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 이온-교환 크로마토그래피 물질로부터 용리 완충제의 구배를 사용하여 용리시키며, 여기서 용리 완충제는 완충제 및 염을 포함하고, 염의 농도는 시간 경과에 따라 구배로 증가하고, 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물은 구배에 의해 분리되는 것인 단계; 및
    d) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 검출하는 단계
    를 포함하는, 폴리펩티드를 오염물로부터 효과적으로 분리하여 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 조성물을 분석하는 방법.
  56. a) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 이온-교환 크로마토그래피 물질에 로딩 완충제를 사용하여 결합시키며, 여기서 로딩 완충제는 완충제를 포함하고, 크로마토그래피의 pH 및 온도는 다수의 표적 폴리펩티드에 대하여
    i) 선택된 온도에서의 알짜 전하 대 pH 곡선을 플롯팅하며, 여기서 곡선은 2종 이상의 표적 폴리펩티드 중 폴리펩티드의 아미노산 조성을 기초로 하는 것, 및
    ii) 단계 i)의 플롯의 이차 도함수를 결정함으로써 알짜 전하 대 pH 곡선의 변곡점을 결정하는 것
    에 의해 최적화되며;
    여기서 최적의 이온 교환 크로마토그래피 조건은 2종 이상의 표적 폴리펩티드에 대한 공통의 변곡점에서의 pH인 단계;
    b) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 이온-교환 크로마토그래피 물질로부터 용리 완충제의 구배를 사용하여 용리시키며, 여기서 용리 완충제는 완충제 및 염을 포함하고, 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물은 구배에 의해 분리되는 것인 단계; 및
    c) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 검출하는 단계
    를 포함하는, 폴리펩티드를 오염물로부터 효과적으로 분리하여 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 조성물을 분석하는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 선택된 온도가 주위 온도인 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 완충제가
    a) 2종 이상의 표적 폴리펩티드에 대하여 온도에서의 변화에 대한 알짜 전하 대 pH 곡선의 변곡점 pH에서의 변화 (dIP/dT)를 결정하는 단계,
    b) 온도에서의 변화에 대한 완충제의 산 해리 상수에서의 변화 (dpKa/dT)가 공통의 변곡점을 갖는 1종 이상의 표적 폴리펩티드의 dIP/dT와 본질적으로 동일한 완충제를 선택하는 단계
    에 의해 확인되는 것인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 완충제가 변곡점 pH에서 유효 완충 용량을 제공하는 것인 방법.
  60. a) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 이온-교환 크로마토그래피 물질에 로딩 완충제를 사용하여 결합시키며, 여기서 로딩 완충제는 완충제를 포함하고, 크로마토그래피의 pH 및 온도는 다수의 표적 폴리펩티드에 대하여 최적화된 것인 단계;
    b) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 이온-교환 크로마토그래피 물질로부터 용리 완충제의 구배를 사용하여 용리시키며, 여기서 용리 완충제는 완충제 및 염을 포함하고, 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물은 구배에 의해 분리되는 것인 단계; 및
    c) 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 검출하는 단계
    를 포함하는, 폴리펩티드를 오염물로부터 효과적으로 분리하여 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염물을 포함하는 조성물을 분석하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 완충제가 N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산 (ACES) 또는 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES)인 방법.
  62. 제55항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제의 농도가 약 5 mM 내지 약 20 mM의 범위인 방법.
  63. 제55항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제의 pH가 약 20℃ 내지 약 70℃의 온도 범위에서 약 6.5 내지 약 8.5의 범위인 방법.
  64. 제55항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제의 pH가 약 20℃ 내지 약 50℃의 온도 범위에서 약 6.5 내지 약 8.5의 범위인 방법.
  65. 제55항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 변곡점에서 완충제 및 폴리펩티드의 pH가 약 22℃에서 약 7.8, 약 37℃에서 약 7.5, 또는 약 50℃에서 약 7.2인 방법.
  66. 제55항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 염 구배가 선형 구배인 방법.
  67. 제55항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 염 구배가 단계형 구배인 방법.
  68. 제55항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 염 구배가 NaCl 구배, KCl 구배, (NH4)2SO4 구배 또는 Na2SO4 구배인 방법.
  69. 제55항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 구배에서의 염 농도가 약 0 mM에서 약 1M로 증가하는 것인 방법.
  70. 제69항에 있어서, 염 농도가 약 100분 내에 약 0 mM에서 약 100 mM로 증가하는 것인 방법.
  71. 제69항에 있어서, 염 농도가 약 40분 내에 약 0 mM에서 약 80 mM로 증가하는 것인 방법.
  72. 제55항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 항체 또는 이뮤노어드헤신 또는 그의 단편인 방법.
  73. 제55항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 모노클로날 항체 또는 그의 단편인 방법.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 항체가 인간 항체인 방법.
  75. 제72항 또는 제73항에 있어서, 항체가 인간화 항체인 방법.
  76. 제72항 또는 제73항에 있어서, 항체가 키메라 항체인 방법.
  77. 제72항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 항체 단편인 방법.
  78. 제55항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 오염물이 폴리펩티드의 변이체인 방법.
  79. 제55항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 오염물이 폴리펩티드의 분해 산물인 방법.
  80. 제55항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 오염물이 폴리펩티드의 전하 변이체인 방법.
  81. 제55항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 물질이 양이온 교환 크로마토그래피 물질인 방법.
  82. 제81항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질이 술폰화 크로마토그래피 물질 또는 카르복실화 크로마토그래피 물질인 방법.
  83. 각 폴리펩티드 조성물에 대하여,
    a) 폴리펩티드 및 1종 이상의 전하 변이체를 이온-교환 크로마토그래피 물질에 로딩 완충제를 약 1 mL/min의 유량으로 사용하여 결합시키며, 여기서 로딩 완충제는 약 40℃에서 약 pH 7.6에서 10 mM HEPES 완충제를 포함하는 것인 단계;
    b) 폴리펩티드 및 전하 변이체 오염물을 이온-교환 크로마토그래피 물질로부터 용리 완충제의 구배를 사용하여 용리시키며, 여기서 용리 완충제는 약 pH 7.6에서 약 10 mM HEPES 완충제 및 NaCl을 포함하고, NaCl의 농도는 약 40분 내에 약 0 mM에서 약 80 mM로의 구배로 증가시키고, 폴리펩티드 및 그의 전하 변이체는 구배에 의해 분리되는 것인 단계; 및
    c) 폴리펩티드 및 1종 이상의 전하 변이체를 검출하는 단계
    를 포함하는, 폴리펩티드를 그의 전하 변이체로부터 효과적으로 분리하여 각각 폴리펩티드 및 폴리펩티드의 1종 이상의 전하 변이체를 포함하는 다수의 폴리펩티드 조성물을 분석하는 방법.
  84. 제83항에 있어서, 다수의 폴리펩티드 조성물이 상이한 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
  85. 제83항 또는 제84항에 있어서, 다수의 폴리펩티드 조성물이 다양한 pI를 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
  86. 제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 조성물이 항체 조성물인 방법.
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