JPS6396552A

JPS6396552A - 生体高分子の工業的分離法、その方法に使用する装置

Info

Publication number: JPS6396552A
Application number: JP61243353A
Authority: JP
Inventors: Kuniuchi Shirasawa; 白澤　邦内; Hiroto Sugano; 博人菅野; Shigeo Eto; 江藤　成夫; Hiroshi Saito; 浩斎藤
Original assignee: Soken Kagaku KK; Suntory Ltd
Current assignee: Soken Kagaku KK; Suntory Ltd
Priority date: 1986-10-14
Filing date: 1986-10-14
Publication date: 1988-04-27
Also published as: WO1990007711A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕この発明は、イオン交換型カラムクロマトグラフィによ
る工業的分離に関し、より詳細には、大量の生体高分子
含有混合物試料をカラムクロマトグラフィにより工業的
に分離する方法、その方法に使用する装置に関する。

〔従来の技術〕

近年、イオン交換型カラムクロマトグラフィによる生体
高分子の高度な分離精製が、化学、生物、農芸化学、お
よび医学等の多くの分野で頻繁に利用されてきている。

このイオン交換型カラムクロマトグラフィは、イオン交
換能を持つ充填剤を固定相として用いるクロマトグラフ
ィの一形式であり、イオン交換充填剤柱（カラム、ｃｏ
ｌｕｍｎ）の上端に試料混合物を付け、適当な電解質溶
液で展開すると、各成分イオンの充填剤に対する吸着性
の差異により、各成分の吸着帯が分離して降下する。

この展開剤である移動相が溶離液であり、展開操作、す
なわち溶離を続けると吸着性の弱い成分から溶出し、一
定分画（フラクション）ごとに分取することができる。

蛋白質などの生体高分子をイオン交換型カラムクロマト
グラフィで分離精製する場合、蛋白質の等電点の違いを
利用して、試料が注入されたカラムに、溶離液の塩濃度
および／またはＰＨを時間的に連続変化させて供給して
カラムの長さ方向に塩濃度および／またはＰＨの勾配を
形成して各蛋白質を溶出させる（グラジェント、濃度勾
配溶出）。従って、蛋白質などの生体高分子をイオン交
換型カラムクロマトグラフィで分離精製する場合、グラ
ジェントを行う必要がある。

また、生体高分子試料をカラムクロマトグラフィにより
工業的規模で分離する従来の装置としては、イオン交換
能を持つ充填剤が充填されたカラムと、流路を介してカ
ラムの上流側に設けられた少なくとも２種の移動相液槽
と、該カラムと該移動相液槽との間の流路に設けられた
試料注入用バルブと、試料注入時に試料注入用バルブに
連通ずる試料槽と、該カラムの下流側に設けられたフラ
クションコレクターと、該カラムと該フラクションコレ
クターとの間の流路に設けられた濃度および／またはＰ
Ｈの第１検知器並びに試料成分の第２検知器とからなる
分離装置であって、バイオプロセスで用いられているよ
うに、グラジェンターとしてあらかじめ濃度およびＰＨ
調整された移動相液槽を３〜５個用意しておき、所定時
間に達するとそれらの槽のバルブを順次切換えてグラジ
ェントを行うステップワイズ型のものがほとんどである
。

〔発明が解決しようとする問題点〕

蛋白質などの生体高分子をイオン交換型カラムクロマト
グラフィで分離精製する方法であって、高精度（土１％
以内）の濃度・ＰＨ勾配の直線性を有するものは工業規
模ではなかった。また、生体高分子試料をカラムクロマ
トグラフィの高精度グラジェントより分離する装置は、
従来、いずれも分析用に供するもので工業規模に使用で
きる大型の大容量の装置はなかった。しかしながら、最
近のバイオテクノロジーの目覚ましい進展によって高性
能であって信頼性の高い生体高分子分離精製法およびそ
の装置の開発が望まれている。

この発明は上述の背景に基づいてなされたものであり、
その目的とするところは高精度グラジェントより工業的
規模で蛋白質などの生体高分子を分離する方法並びにそ
の装置を提供することである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、生体高分子試料をカラムクロマトグラフ
ィの高精度グラジェントより分離する方法および装置に
ついて種々の試作・研究した結果、移動相液を調製する
ための前駆液を広い流量可変域で各々流量制御しながら
、好ましくは、マイクロコンピュータによる自動制御し
ながら連続混合すればこの目的達成に有効であることを
見出し、この発明を完成するに至った。

すなわち、この発明のカラムクロマトグラフィによる生
体高分子の工業的分離法は、大量の生体高分子含有混合
物試料を、イオン交換能を持つ充填剤が充填されたカラ
ム上流側に装入し、少なくとも２種の移動相用前駆液を
５０：１〜１ｏｏｏ：１の流量可変域で各々に流量制御
しながら連続混合して濃度および／またはＰＨが時間的
に連続変化する移動相液体を調製し、次いで得られた該
移動相液体を送液して該混合物の成分を該カラム中で展
開し、カラム下流側から流出したフラクションを分取し
て混合物の各成分を分離することを特徴とするものであ
る。

また、この発明の分離法に使用する装置によれば、大量
の生体高分子含有混合物試料をカラムクロマトグラフィ
により分離する工業的分離装置であって、イオン交換能
を持つ充填剤が充填されたカラムと、流路を介してカラ
ムの上流側に設けられた少なくとも２種の移動相用前駆
液槽と、該カラムと該前駆液槽との間の流路に設けられ
た試料注入用バルブと、試料注入時に試料注入用バルブ
に連通ずる試料槽と、該カラムの下流側に設けられたフ
ラクションコレクタ一槽と、該カラムと該フラクション
コレクタ一槽との間の流路に設けられた濃度および／ま
たはＰＨの第１検知器並びに試料成分の第２検知器と、
該カラムと該前駆液槽との間の流路に設けられたカラム
交換用バルブと、カラム再生時にカラム交換用バルブと
連通ずるカラム再生液槽と、該前駆液槽の各々の下流側
に設けられかつ各前駆液を５０：１〜１０００；１の流
量−■変域で流量制御できる送液装置と、前記の各送液
装置から送液された各前駆液を連続混合して該カラムに
送液する混合器とからなることを特徴とするものである
。

以下、この発明の分離法およびその装置を、この発明に
よる分離装置の一態様を第１図に示すフローシートを参
照しながら、より詳細に説明する。

この態様の装置は、大量の生体高分子含有混合物試料を
カラムクロマトグラフィにより分離する工業的分離装置
であって、イオン交換能を持つ充填剤が充填されたカラ
ム１ａおよび１ｂと、流路２を介してカラム１ａおよび
１ｂの上流側に設けられた２種の移動相用前駆液槽３ａ
および３ｂと、該カラム１ａおよび１ｂと該前駆液槽３
ａおよび３ｂとの間の流路２に設けられた試料注入用バ
ルブ４と、試料注入時に試料注入用バルブ４に連通ずる
試料槽５と、該カラム１ａおよび１ｂの下流側に設けら
れたフラクションコレクター６と、該カラム１ａおよび
１ｂと該フラクションコレクター６との間の流路７に設
けられた濃度およびＰＨの第１検知器８および９並びに
試料成分の第２検知器１０と、該カラム１ａおよび１ｂ
と該前駆液槽３ａおよび３ｂとの間の流路２に設けられ
たカラム交換用バルブ１１と、カラム再生時にカラム交
換用バルブ１１を介して再生すべきカラムと連通するカ
ラム再生液槽１２　ａ−、１２ｂｌｌ　２　ｃおよび１
２ｄと、該前駆液槽３ａおよび３ｂの各々の下流側に設
けられかつ各前駆液を５０：１〜１０００　：　１の流
量可変域で流量制御できる送液装置１３ａおよび１３ｂ
と、前記の各送液装置１３ａおよび１３ｂから送液され
た各前駆液を連続混合して該カラムに送液する混合器１
４とから主になるものである。さらにこの態様では、試
料注入用バルブ４と試料槽５との間の流路１５に試料の
送液装置１６が、また、カラム交換用バルブ１１と再生
液槽１２ａ、１２ｂおよび１２ｃとの間の流路１７に再
生液の送液装置が設けられ、グラジェント中のカラムを
フラクションコレクター６に連通させカラム再生中のカ
ラムをドレイン１９に連通させる切換えパル２０がカラ
ム１ａおよび１ｂの下流側に設けられ、ドレイン１９と
切換えバルブ２０との間の流路に濃度およびＰＨの第１
検知器２１および２２並びに試料成分の第２検知器２３
が設けられる。

この発明における分離対象は、イオン交換クロマトグラ
フィのグラジェントによって分離することのできる生体
高分子であり、そのようなものとしてインターフェロン
、インタロイキン、ティッシュプラスミノーゲン、アク
チュベータ（ＴＰＡ）　、コロニン刺憑因子（ＣＳＥ）
、免疫ヒトグロブリンなどの蛋白質、その他各種酵素な
どがある。

この方法および装置で用いられる充填剤はイオン交換能
を持つ充填剤からなり、そのような充填剤として、例え
ば、強酸性陽イオン交換型（ＳＰ）、弱酸性陽イオン交
換型（ＣＭ）　、強塩基性陰イオン交換型（ＱＡＥ）　
、弱塩基性陰イオン交換型（ＤＥＡＥ）がある。充填剤
の粒径は、工業的規模で実施されることを考慮した、例
えば、５μを超える、好ましくは、数十〜数百μである
。

この発明で用いられるカラムは、大量の試料を処理でき
る大容量の中低圧クロマトカラムが好ましく、例えば１
１７χ〜１００２χのカラムである。このカラムは第１
図のように複数本であってもよく、その場合、直列およ
び並列にして用い、一方で試料のグラジェントを行い他
方でカラムの再生を行うことができる。

この発明の分離法において移動相液は、少なくとも２種
の移動相用前駆液を混合して得られ、通常、水溶液であ
るが、存機溶媒を添加してもよい。

この移動相液の種類はイオン交換能を持つ充填剤の種類
、試料の性質などに応じて適宜選択され、例えば、陽イ
オン交換型には陰イオン性緩衝液、陰イオン交換型には
陽イオン性緩衝液が用いられる。生体高分子のイオン交
換クロマトグラフィに用いることのできる緩衝液として
、例えば、トリス塩酸、トリスリン酸、リン酸バッファ
などがある。イオン交換クロマトグラフィでは、イオン
強度（濃度）およびＰＨに保持値、溶出時間などに微妙
に変化し、この発明において、少なくとも２種の移動相
用前駆液を５０：１〜１０００　：　１の流量可変域で
各々に流量制御しながら連続混合して濃度および／また
はＰＨが時間的に連続変化する移動相液体を調製する。

この調整は、第１図の態様では、前駆液槽３ａおよび３
ｂの各々の下流側に設けられかつ各前駆液を５０：１〜
１０００　：１の流量可変域で流量制御できる送液装置
１３ａおよび１３ｂと、前記の各送液装置１３ａおよび
１３ｂから送液された各前駆液を連続混合して該カラム
に送液する混合器１４とで行われる。この送液装置の好
ましい態様として、広範囲の流量域ｃ１ｉｖ′ｌχ／分
〜１１７，７分）を有し、無脈流、高圧の定量性を持つ
ダイヤフラム型のポンプがある。

更に好ましくは、接液部が非金属でありサニタリー性を
有していることである。各送液装置が５０：１〜１００
０　：　１という広い流量可変域を持つので、濃度勾配
の直線性、すなわち、グラジェントの精度が±１％以内
の高精度に改善され、等電点の近い蛋白質の分離に極め
て有効である。次いで、この発明において用いられる混
合器は送液装置（ポンプ）から送液された各前駆液を連
続混合してカラムに送液する。この様な連続混合する混
合器として、例えばスタテックミキサーがある。通常の
ミキサーは固定容量のため、吐出流量にあわせて各容量
のミキサーを準備しなくてはならず、流量に対しミキサ
ーの内容積が大き過ぎると遅れが生じ、その逆ではミキ
サー内での滞留時間が短くなって混合が不十分となるが
、スタテックミキサーなどの連続混合のミキサーによっ
て混合がスムーズになり、滞留による遅れもない。

この発明において用いられる第１検知器は移動相液の塩
および／またはＰＨのレベルを検知しその度合いを信号
として送出する。そのようなものとして電気伝導度計、
ＰＦｉ計などかある。他方、第２検知器は試料成分、特
に生体高分子の存在の程度を検知し、その度合いを信号
として送出する。

そのようなものとして紫外吸光光度計（ＵＶ）、示差屈
折計（Ｒ１）、蛍光光度計（Ｆ　Ｐ）などがある。

イオン交換クロマトグラフィによる生体高分子の分離を
繰返し行う場合、グラジェント実行後にカラムの再使用
のための操作を行う。この操作として、カラムの再生、
バッファ化、洗浄、殺菌の各工程がある。その様な試薬
としてアルコールなどの有機溶剤、水酸化ナトリウム、
塩酸、トリス塩酸、塩化ナトリウムなどの塩などがある
。

次いで、第１図の装置の操作・動作を説明する。

分離操作の準備として、カラム１ａを洗浄し、再生して
バッファ化すると共に、試料槽５に生体高分子含有混合
物試料を装填し、また、移動相前駆液槽３ａおよび３ｂ
に濃度および／または組成の異なる緩衝溶液を各々充填
する。先ず、バルブ４および１１の状態を、試料槽５と
カラム１ａとが連通ずるようにし、ポンプ１６を作動さ
せて試料槽５から試料をカラム１ａの上端に流路２およ
び１５を介して装入する。次いで、バルブ４を変えて移
動相前駆液槽３ａおよび３ｂとカラム１ａとが連通ずる
ようにする。ポンプ１３ａおよび１３ｂを作動させ、流
量制御しながら各移動用前駆液を混合器内で十分かつ滞
留なく混合する。混合器から得られた移動相液は、流路
２およびバルブ４および１１を介してカラム１ａに送液
される。

ポンプ１３ａおよび１３ｂで流量が制御されるので、移
動相液は、濃度および／またはＰＨが時間的に連続変化
する。従って、カラム中で試料は、グラジェントに掛け
られることになる。カラム１ａから溶出した試料成分と
移動相液は、バルブ２０と流路７を介して電気伝導度計
（ＣＤ）８、ＰＨ計９、およびＵＶ計１０で移動相液の
濃度およびＰＨ１試料成分が測定される。この測定結果
から濃度／ＰＨの勾配、目的成分の有無を判断すること
ができる。目的成分が溶出したとき、目的成分を含むフ
ラクションをフラクションコレクター６に分取する。不
要なフラクションはドレイン１９に排出される。

この装置ではカラム１ａと平行してカラム１ｂが設けら
れている。従って、カラム１ｂを再使用のために、カラ
ムの再生などの工程に付すことができる。例えば、カラ
ム再生液槽１２ａに殺菌用メタノールを、カラム再生液
槽１２ｂに精製水を、カラム再生液槽１２ｃに不純物除
去用水酸化ナトリウム液を、カラム再生液槽１２ｄにバ
ッファ用の塩化ナトリウム液を貯蔵し、カラム再生、バ
ッファ化、洗浄、殺菌の各工程に応じてポンプ１８によ
りカラム１ｂに送液する。ドレイン１９の上流の電気伝
導度計（ＣＤ）２１、ＰＨ計２２、およびＵＶ計２３で
カラム再生、バッファ化、洗浄の各工程をモニターする
。カラム１ａでのグラジェントを終了し、再生する必要
があり、同時にカラム１ｂで引き続いてグラジェントを
行う場合、バルブ１１および２０の状態を変えて実行す
ることができる。

次いで、マイクロコンピュータを応用した分離装置の態
様を示す。

この態様のフローシートを第２図に示す。この態様では
、第１図の分離装置にマイクロコンピュータ制御系が更
に付加されている。すなわち、流量制御信号によりポン
プ１３ａおよび１３ｂの出力を制御する流量制御手段２
００と、第１検知器からの検知信号および／または設定
値に応じて該流量制御信号を流量制御手段２００に送出
するグラジェント制御手段２１０と、第２検知器の検知
信号から溶出液中の成分ピークを評価して分取信号を送
出するピーク判定手段２３０と、該分取信号に応じて流
れをフラクションコレクター６に切替える分取バルブ２
４と、再生制御信号に応じてカラム再生液槽のバルブ２
５およびポンプ１８を制御するカラム再使用制御手段２
４０と、検知器２１〜２３からの検知信号を評価してカ
ラム再使用各工程終了を判断し該再生制御信号を送出す
るカラム再使用制御手段２５０と、該流量制御信号と該
分取信号と該再生制御信号とに応じて試料注入工程、グ
ラジェント工程およびカラム再使用工程に各々切替える
か判定し切替信号を送出する工程切替判定手段２７０と
、該切替信号に応じてバルブ４．１１および２０を切替
えポンプ１６の出力を制御する切替制御手段２６０とを
備えている。

この態様の分離装置のグラジェントを制御するためのフ
ローチャート例を第３図に示す。

この制御手順に従えば、分離装置のグラジェントか始動
できる状態が確認される。次いで、グラジェント制御の
設定値が人力される。この設定値には、ポンプ１３ａお
よび１３ｂの流量、その運転時間などがある。装置は設
定値入力後に始動する。切替信号によりポンプ１６が作
動しカラム１ａにロードする。更に切替信号によりバル
ブ４が切替わり、流量制御手段２００によりポンプ１３
ａおよび１３ｂが始動し、移動相液をカラムにロードす
る。カラムから溶出液が出て、第２検知器で検知される
。この検知信号から溶出液中の成分ピークを評価され、
ピーク判定手段から分取信号が分取バルブに送出され、
分取バルブの切替えによって所望のフラクションがフラ
クションコレクター１９に分取される。ピークの判定は
、例えばレベルモードで、またはピークモードで、もし
くはその組合わせで行うこともできる。フローシートで
示したようにグラジェントの途中で勾配を変える、また
、濃度を途中一度ホールドするように運転条件を変える
こともできる。

なお、カラムの再生、バッファ化、洗浄等の工程も同様
に制御され、また、それらへの工程切替え制御も同様で
ある。

〔発明の効果〕

この発明のによってつぎの効果を得ることができる。

流量可変領域が広いので、それだけグラジェントの精度
が上がり、カラムの分離性能も向上する。

この発明の態様としてカラム再生中の溶出液の流路にも
塩／ＰＨ１試料成分の検知器を設け、マイクロコンピュ
ータで監視・制御するので、グラジェント実行中の分離
状態だけでなく、カラムの再生なども自動的に行うこと
ができ、長時間に渡るクロマト分離精製を自動的に繰返
し行うことができる。

生体高分子の分離は生理活性の面から無菌低温室（約４
℃）で行うことが多いが、マイクロコンピュータで監視
・制御するので、遠隔操作ができ、無菌低温室への出入
りを少なくし、作業能率を高める。

この発明の別の態様として異常圧、液切れなどのセンサ
を更に設けることにより、安全に分離を行うことができ
る。

この発明の好ましい態様として複数のカラムを用い一方
でグラジェント、他方でカラムの再生などの操作を行う
ことができ、更に自動制御できるので、分離精製の時間
を大幅に短縮することができる。

また、この発明の好ましい態様として初期の分離条件を
途中で変更できるコンピュータ制御とすることができる
ので、分離精製の失敗を少なくし貴重な試料のロスを極
力防ぐことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の分離装置例のフローシートを、第２
図はこの発明の別の分離装置例のフローシートを、第３
図はフローチャートを示す。１・・・カラム、２・・・流路、３・・・移動相用前駆
液槽、４・・・試料注入用バルブ、５・・・試料槽、６
・・・フラクションコレクター、７・・・流路、８・・
・ＣＤ計、９・・・ＰＨ計、１０・・・ＵＶ計、１１・
・・カラム交換用バルブ、１２・・・カラム再生液槽、
１３・・・送液装置、１４・・・混合器、１５・・・流
路、１６・・・ポンプ、１７・・・流路、１８・・・ポ
ンプ、１９・・・ドレイン、２０・・・切替えバルブ、
２１・・・ＣＤ計、２２・・・ＰＨ計、２３・・・ＵＶ
計。

Claims

【特許請求の範囲】１、大量の生体高分子含有混合物試料を、イオン交換能
を持つ充填剤が充填されたカラム上流側に装入し、少な
くとも２種の移動相用前駆液を５０：１〜１０００：１
の流量可変域で各々に流量制御しながら連続混合して濃
度および／またはＰＨが時間的に連続変化する移動相液
体を調製し、次いで得られた該移動相液体を送液して該
混合物の成分を該カラム中で展開し、カラム下流側から
溶出したフラクションを分取して混合物の各成分を分離
することを特徴とするカラムクロマトグラフィによる生
体高分子の工業的分離法。２、大量の生体高分子含有混合物試料をカラムクロマト
グラフィにより分離する工業的分離装置であつて、イオ
ン交換能を持つ充填剤が充填されたカラムと、流路を介
してカラムの上流側に設けられた少なくとも２種の移動
相用前駆液槽と、該カラムと該前駆液槽との間の流路に
設けられた試料注入用バルブと、試料注入時に該試料注
入用バルブに連通する試料槽と、該カラムの下流側に設
けられたフラクションコレクターと、該カラムと該フラ
クションコレクターとの間の流路に設けられた濃度およ
び／またはＰＨの第１検知器並びに試料成分の第２検知
器と、該カラムと該前駆液槽との間の流路に設けられた
カラム交換用バルブと、該カラム再生時にカラム交換用
バルブと連通するカラム再生液槽と、該前駆液槽の各々
の下流側に設けられかつ各前駆液を５０：１〜１０００
：１の流量可変域で流量制御できる送液装置と、前記の
各送液装置から送液された各前駆液を連続混合して該カ
ラムに送液する混合器とからなる工業的分離装置。３、流量制御信号により該送液装置の出力を制御する流
量制御手段と、第１検知器からの検知信号および／また
は設定値に応じて該流量制御信号を該流量制御手段に送
出するグラジエント制御手段と、第２検知器の検知信号
から溶出液中の成分ピークを評価して分取信号を送出す
るピーク判定手段と、該分取信号に応じて流れを該フラ
クションコレクターに切替える分取バルブと、再生制御
信号に応じて該カラム再生液槽のバルブおよびポンプを
制御するカラム再使用制御手段と、検知器からの検知信
号を評価してカラム再使用各工程終了を判断し該再生制
御信号を送出するカラム再使用制御手段と、該流量制御
信号と該分取信号と該再生制御信号とに応じて試料注入
工程、グラジエント工程およびカラム再生工程に各々切
替えるか判定し切替信号を送出する工程切替判定手段と
、該切替信号に応じてバルブを切替えポンプの出力を制
御する切替制御手段とを更に備えている特許請求の範囲
第２項記載の工業的分離装置。