JP2000507236A - 成長因子複合体の抽出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 成長因子複合体を抽出するための本発明の方法は、天然の成長因子複合体含有物質に水を加え、ｐＨ値を酸の添加によって２．５〜３．２に調節し、生ずる沈殿を上澄み液から分離し、水溶液中の成長因子複合体を、水と混和性の有機溶剤の添加によって沈殿させ、液相から分離して乾燥させ、必要な場合には、得られる粉末を透析することを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】 成長因子複合体の抽出方法 発明の簡単な概要 成長因子複合体を抽出するための本発明の方法は、天然成長因子を含有する物 質に水を加え、酸を加えることによってｐＨ値を２．５〜３．２に調節し、生じ た沈殿を上澄み液から分離し、水溶液中の成長因子複合体を水と混和しうる有機 溶媒の添加によって沈殿させ、液体相から分離し、乾燥させ、得られた粉末を必 要な場合には透析することを特徴とする。 発明の背景 成長因子は特異的な生物学的性質を有するので、特に重要なポリペプチドであ る。それらの特別な性質のために、成長因子自体は、特に組合せとして、薬剤及 びコスメチックの有望なコンパウンド(compound)である。今まで、成長因子の抽 出は、主として単一種類の成長因子を生じる、非常に時間と費用とを要するプロ セスであった。 ＥＰ３１３，５１５の特許明細書によると、出発物質に１種類以上のクロマト グラフィー方法を施し、必要な場合には、さらなる精製工程を施す、乳成長因子 （ＭＧＦ）の単離方法が述べられている。この大規模な抽出方法によると、乳か ら単一種類の成長因子が得られるにすぎない。ＷＯ９５／２９９３３は乳からの 数種類の成長因子の製造を述べている。この労力を要する方法では、ミクロ濾過 を受けた低温殺菌(pasteurized)ホエーが出発物質として用いられる（詳細はオ ーストラリア特許明細書第６４５５８９号に述べられている）。次に、５０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）と平衡させたカチオン交換樹脂に、こ のタンパク質含有物質を供給する。同じ緩衝液による洗浄操作後に、タンパク質 を０．４Ｍ ＮａＣｌによって溶出し、水に対して透析濾過し(diafiltrated)、 限外濾過によって濃縮して、凍結乾燥する。さらなる精製工程が１０ｍｇラクト アルブミン／ｍｌを含有する画分を生じる(画分はそれぞれ１００μｌから成る) 。ＷＯ９５／２６９８４の特許明細書は牛乳からのカチオン交換クロマトグラフ ィ ーとその後の透析とによるインシュリン様成長因子の製造を述べている。ＪＰ６ ２７９３１２も、乳又はホエーを特定温度にまで加熱し、遠心分離し、上澄み液 を８ｋＤａ限外フィルターに通すことによるインシュリン様成長因子の製造を述 べている。 先行技術とは対照的に、本発明は簡単で費用がかからず、しかも高収率をあげ る方法を開示する：１ｋｇの商業的乳粉末から、活性な成長因子複合体を含有す る炭水化物３５０ｇ〜４２０ｇが単離される。この複合体は一本明細書で既述し たように一大部分がラクトースから成る。出発物質として牛乳を用いると、タン パク質の比率は８％〜１７％である。必要な場合には、ラクトースの大部分を透 析によって除去することができる。しかし、治療目的のためには、透析されてい ないラクトース含有物質が有利である、というのは、このやり方で生物学的に高 度に活性な因子の正確で、再現可能な投与量をかなり簡単に管理することができ るからである。 個々の乳成長因子の作用は最近１５年間に詳しく研究されている。特に、生物 学的に活性なポリペプチドが種々な細胞機能の例えば、調節、刺激又は阻害のよ うな生理学的機能を有することが判明している（Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．１ ９９１，３０１，２，１２４〜１３２）。Ｐｉｔｔｅｌｋｏｗ Ｍ．Ｒ．（Ａｄ ｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１９９１，７，５５〜８１）は 、幾つかの乳ペプチドが真皮構造のメインテナンスのために重要である細胞プロ セスの天然のメディエーターとして作用することを実証することができた。 成長因子の生物学的活性はマイグレーション試験及び／又は成長試験によって 評価することができる。マイグレーション試験はＢｕｅｒｋ Ｒ．Ｒ．（Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９７３，７０，２，３６９〜３７２）に従 っておこなわれる：細胞（例えば、Ｂａｌｂ／Ｃ−３Ｔ３−線維芽細胞）が集密 的単層まで成長した後に、１０ｍｍ幅の面積をかみそりの刃によって取り出す。 乳成長因子の添加によって、細胞マイグレーションは対照に比べて増加する。同 様にＢａｌｂ／Ｃ−３Ｔ３−線維芽細胞に対しておこなわれた成長試験は、乳成 長因子による線維芽細胞の処理時の細胞成長の増加を明らかにした。 先行技術では、単一因子又は２種類の成長因子の組合せの使用が述べられてい る。ＷＯ９５／２９９３３は、乳から製造されるＧＦＥ−２と略記される成長因 子を述べている。この成長因子は創傷治療のために並びに胃腸障害、疾患又は潰 瘍に対して用いられる。ＥＰ３６７４４７は例えば創傷、潰瘍、火傷の治療又は 放射線療法後の再上皮形成のためのような、上皮細胞の成長刺激のためのヒト細 胞トランスフォーミング成長因子の使用を述べている。ＦＲ２４７２３８５とＦ Ｒ２５３３４３８は種々な単離成長因子のコスメティック使用を述べている。Ｊ Ｐ６０４０８５８は脱毛症の予防と治療のためのヘアートニックに線維芽細胞成 長因子を用いている。ＥＰ３１３５１５は練り歯磨き、マウスウォッシュ、コス メティック及び栄養製剤への乳成長因子の使用を述べている。 本発明は、協調して作用することができる天然の成長因子セットを含む。ＥＰ ３１３５１５に開示されているように、種々な成長因子は組合わされたときに相 乗的に作用する。前記特許明細書では、良好な創傷治癒を達成するために、乳成 長因子が上皮成長因子（ＥＧＦ）又はトランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ −α）と組合わされる。本発明は、最終生成物が種々な成長因子の組合せを既に 含有するという利点を有する。 発明の詳細な説明 天然成長因子を含有する物質（以下では、“出発物質”と呼ぶ）は下記物質： 例えば、ヒト乳、牛乳、ヤギ乳、ヒツジ乳、ウマ乳等のような、哺乳動物からの 乳；対応するホエー；例えば、鶏卵、アヒル卵、ダチョウ卵等のような、鳥類の 卵；例えば、マス卵、チョウザメ卵等のような魚卵；例えば、ヒト血液、ウシ血 液、ヤギ血液、ヒツジ血液、ウマ血液等のような、哺乳動物からの血液；例えば 、ヒト尿、ウシ尿、ヤギ尿、ヒツジ尿、ウマ尿等のような、哺乳動物からの尿； 並びに蜂蜜及び植物種子であることができる。 好ましい出発物質はヒト乳、牛乳、鶏卵、マス卵及びウシ血液である。特に好 ましい出発物質は脱脂牛乳、又はチーズ製造から得られるそのホエー又は、例え ば噴霧乾燥によって得られる商業的に入手可能なホエー粉末である。 成長因子複合体を抽出するための本発明の方法は、出発物質として本明細書に 挙げた全ての例に対して適用することができ、一般に、成長に寄与する又はそれ 自体が成長する（例えば種子）全ての出発物質に用いることができる。一般的に いえば、本発明の方法は任意のペプチド含有出発物質又はタンパク質含有出発物 質に用いることができる。 固体出発物質に、水を加えて、それらを均質な溶液にしてから、さらに処理す る。脂肪含有出発物質は脱脂してから、例えばスキミング(skimming)によるよう な、慣用的な方法で処理する。 本発明による成長因子の抽出を本明細書の以下において、固体乾燥物質が未加 工乳におけるよりも濃縮されている脱脂乳からの成長因子複合体の抽出を例とし て説明する。高含量の固体乳乾燥物質を有する、このような出発物質は、天然乳 をスキミング後に緩和な条件下で水分の蒸発によって濃縮することによって、又 は脱脂乳から得られた乾燥乳に適当な量の水分を混合することによって製造され る。少なくとも１００ｇ／ｌの乾燥物質、特に脱脂牛乳からの乾燥乳を含有する 脱脂乳が好ましい出発物質である。 出発物質を含有する溶液のｐＨを２．５〜３．２に調節するために、例えばモ ノ−、ジー及びトリカルボン酸並びにそれらから誘導されるヒドロキシ酸のよう な、一般に非酸化性無機酸及び有機酸を用いることができる。適当な無機酸は塩 酸、硫酸及びリン酸である。適当な有機酸はギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、 蓚酸、マロン酸、コハク酸、グリコール酸、乳酸（α−ヒドロキシプロピオン酸 ）、β−ヒドロキシプロピオン酸、リンゴ酸、酒石酸、アスコルビン酸及びクエ ン酸である。酸は水溶液として最も良く用いられる。 好ましい酸はギ酸、酢酸、乳酸及びクエン酸である。８０％乳酸が特に好まし い。ｐＨ値の調節のために必要な酸量を室温において激しく撹拌しながら水溶液 として乳に加えることが好ましく、この添加は一般に発熱反応なしに進行する。 好ましくは、ｐＨ値を酸の添加によって２．５〜２．７に調節する。この後に、 混合物をさらに１５〜３０分間撹拌することが好ましい。 酸添加から生じた沈殿は、例えば目の詰んだワイヤーガーゼ又は漉し布又は遠 心分離によるような、濾過によって分離することが好ましい。沈殿から付着性(a dhering)成長因子含有水溶液を加圧によって除去することが好ましい。微細な構 造の粘着性沈殿が得られる。酸処理によって得られた沈殿を上澄み液から完全に 分離するために、例えばリカーフィルター(liquor filter)又はプリーツフィル タ ー(pleated filter)によって水溶液をもう一度濾過することがさらに好ましい。 酸による沈殿の分離によって得られる成長因子含有水溶液は重要な中間生成物で あり、本発明の対象(subject)でもある。 沈殿の分離後に得られる水溶液に加えれる、水と混和性の可能な有機溶剤は、 例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール又はイソプロパノールのよ うな低級アルカノール、並びに例えばアセトン、メチルエチルケトン及びジエチ ルケトンのような低級ケトンでありうる。好ましい水と混和性の有機溶剤はイソ プロパノールとアセトンである。アセトンが特に好ましい。 成長因子複合体を分離するために水と混和性の有機溶剤を添加する前に、成長 因子含有水溶液を０℃〜１０℃、好ましくは３℃〜５℃の温度に冷却する。成長 因子複合体を沈殿させるために、水と混和性の有機溶剤を一般に撹拌しながら水 溶液に加える、有機溶剤と水溶液とは２：１から１０：１までの量比で用いられ る。水と混和性の有機溶剤の、水溶液に対する量比は好ましくは４：１から６： １までである。沈殿した成長因子複合体は濾過又は遠心分離によって分離するこ とができる。これを好ましくは分離に用いた溶剤によって洗浄し、室温において 又はやや高い温度において真空下で乾燥させる。 続いて、必要な場合には、得られた粉末をさらに濃縮するためにイオンを含ま ない流水に対して透析する、隔膜の透過度は３．６ｋＤａ未満の分子量を有する 分子のみが通過するように選択する。得られた生成物を乾燥後に脂溶性溶剤によ って抽出するならば、その生物学的活性が増強することが判明している。この抽 出は通常の装置によってそれ自体公知の方法で連続的にも不連続的にもおこなう ことができる。連続抽出は例えばソックスレー装置によっておこなうことができ る。不連続抽出は好ましくは、本発明の方法によって得られた生成物を乾燥後に 溶剤中に懸濁させることによっておこなう。懸濁液を数分間、例えば５〜２０分 間撹拌し、生成物を分離して、乾燥させる。可能な脂溶性溶剤は好ましくは、例 えば塩化メチレン、クロロホルム及び四塩化炭素のような低沸点ハロゲン化脂肪 族炭化水素である。好ましい溶剤は塩化メチレンである。 牛乳から本発明の方法によって製造した成長因子複合体は白色の結晶質粉末で ある。この粉末に含まれる活性ポリペプチド、いわゆる成長因子は文献（Ｍ．Ｒ ． Ｐｉｔｔｅｌｋｏｗ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１９ ９１，７，５５）から公知である。最も良く知られ、最も良く研究されている乳 成長因子はトランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミ ング成長因子β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成 長因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）及び上皮成長因子（Ｅ ＧＦ）である。 前述した出発物質の全ては、成長因子複合体を抽出するための本発明の方法に 使用可能である。しかし、得られる成長因子複合体は出発物質に依存して活性ポ リペプチドの組成において異なる。本発明の異なる成長因子に対応して、表１で は質量スペクトルを、表２では保持時間を、図１と２ではＳＤＳ ｐａｇｅゲル 電気泳動図を示す。 表１ 成長因子複合体：質量スペクトル（ダルトンでの分子量）表２ 成長因子複合体：ＨＰＬＣ保持時間（分） カラム： Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ１８ 検出の波長： ２７５ｎｍ 移動相： クエン酸０．１Ｍとアセトニトリルによる勾配 サンプル： ０．１Ｍクエン酸（１％ナトリウム）中に溶解 本発明による成長因子複合体は主としてラクトースから成り、約２％〜１５％ のタンパク質を含有する。タンパク質部分は透析によって強く増加する可能性が ある。タンパク質含量をＭ．Ｍ．Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法［Ａｎａｌｙｔｉｃａ ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７６，７２，２４８〜２５４］によって測 定する： ・ 牛乳粉末からのＧＦＣ： ５．０重量％のタンパク質 ・ 透析した牛乳粉末からのＧＦＣ：２１．０重量％のタンパク質 ・ 牛乳ホエーからのＧＦＣ： ５．０重量％のタンパク質 ・ ヒト乳からのＧＦＣ： １４．５重量％のタンパク質 ・ 透析したヒト乳からのＧＦＣ： ７６．０重量％のタンパク質 ・ 鶏卵からのＧＦＣ： １０．５重量％のタンパク質 ・ 魚卵からのＧＦＣ： ２．５重量％のタンパク質 生理的に良好に許容される補助剤とキャリヤー材料とを用いて適当に製剤化し た後に、本発明による成長因子複合体は例えば下記のような、多くの可能な医学 的及びコスメティック用途を有する： ・ 創傷、火傷、血腫、湿疹、潰瘍等の治癒を促進しながらの治療のため、 ・ 例えば、抜歯等の後の歯周炎のような口腔粘膜の治癒を促進しながらの治療 のため、 ・ 例えば、鼻の乾燥粘膜、手術後の出血傾向等のような、鼻粘膜の治癒を促進 しながらの治療のため、 ・ 例えば、瘢痕の改善、蜂巣炎、老人性皮膚等のような、皮膚構造の改善のた め、 ・ 例えば、脱毛症の治療と予防のため、 ・ 例えば、皮膚癌、肺癌、胃癌等のような、癌の治療のため、 ・ 胃腸の障害、疾患及び潰瘍の治療のため、 ・ 骨粗しょう症の治療と予防のため、 ・ 例えば、幼児栄養、非経口栄養等のような、食品補充物として、 ・ 筋肉量の発達のため、及び ・ 哺乳動物における乳産出量を高めるための獣医学薬剤中に。 本発明の成長因子複合体は、上記適応に用いられる、あらゆる慣習的生薬形(g alenic form)に有効成分として加工されることができる。組成物中の有効成分（ 成長因子複合体）の含量は０．００１〜９９％、好ましくは０．０１％〜５０％ 、特に好ましくは０．１％〜１０％であることができる。局所使用には０．５％ の含量、経口使用には７５％の含量が事実上特に好ましい。 局所治療に用いられる、あらゆる組成物に成長因子複合体を加工することがで きる。このような組成物は例えば、軟膏、クリーム、ゲル、ペースト並びにまた 練り歯磨き、エマルジョン、溶液、マウスウオッシュ、スプレーのような皮膚及 び粘膜用の局所用途、又はバス添加剤、プラスター、及び軟膏若しくはペースト を含有するガーゼとしてである。 成長因子複合体は例えば注入及び注射のための溶液として非経口薬剤に加工さ れることもできる。 経口組成物は、例えば、胃液中で崩壊する錠剤又は糖衣錠であるか、又は他の 固体製剤、いわゆる浸透圧ポンプ系、成長因子複合体の遅延放出を保証する単層 状若しくは多層状固体製剤、成長因子複合体を即時放出若しくは遅延放出するた めのカプセル中のペレット若しくは圧縮ペレット、特殊な方法を用いてシールさ れた軟質ゼラチンカプセル若しくは硬質ゼラチンカプセル中の溶液、例えば沸騰 錠、沸騰顆粒、溶解錠若しくは溶解顆粒のような水若しくは他の飲料中に可溶性 の製剤、又は濃縮物として若しくは水若しくは他の飲料中で希釈して服用するた めの例えば滴剤若しくはシロップのような液体製剤である。 本発明はさらに、これらの製剤の製造方法であって、治療有効量の成長因子複 合体を生理的に不活性な賦形剤と共に生薬投与形(galenic form of administrat ion)にすることを特徴とする上記方法を包含する。 薬剤製剤の製造のために、溶解、凍結乾燥、混合及び懸濁プロセスのような、 慣用的な方法が用いられる。 局所製剤の製造のためには、成長因子複合体の水溶液が適当である。これらの 水溶液は親水性軟膏基剤に、例えばマクロゴール又はポリエチレングリコール軟 膏に、疎水性脂質成分、水及び界面活性剤を含有するクリームに、例えばゼラチ ン及びセルロースエーテルのような親水性高分子化合物を有するゲルに、高度に 濃縮された懸濁液軟膏からのペーストに、並びに油、アラビアゴム及び水を用い たエマルジョンに加工される。局所組成物の製造は慣用的な方法によっておこな われる。 非経口投与のためには、水溶液が最も適するが、例えば注射用の油性懸濁液（ 適当な親油性溶剤又はビヒクルは例えばゴマ油のような植物油、例えばエチルオ レエート及びトリグリセリドのような脂肪酸エステルである）；例えばナトリウ ムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール及び／又はデキストランのような 、粘度を高める化合物と、必要な場合には、安定剤とを含有する、注射用の水性 懸濁液のような、有効成分の懸濁液も適する。 経口用の組成物は、成長因子複合体を固体キャリヤー材料と一緒にすることに よって得ることができ、得られた混合物を必要な場合には顆粒化し、望ましい又 は必要な場合には、適当な補助コンパウンドの添加後に、錠剤又は糖衣錠コアに 加工される。適当なキャリヤー材料は好ましくは糖（例えば、ラクトース、サッ カロース、マンニトール又はソルビトール）と、セルロース製剤及び／又はリン 酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム又はリン酸水素カルシウム）とのよ うな充填剤コンパウンド(filling compound)であり、例えばトウモロコシ、小麦 、米若しくはジャガイモからの澱粉ペースト、又はゼラチン、トラガントガム、 メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキ シメチルセルロース及び／又はポリビニルピロリドンのような結合剤、及び／又 は必要な場合には、例えば上記澱粉形、さらにカルボキシメチル澱粉、クロスメ ッシュ状(crossmeshed)ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はその塩（ 例えば、アルギン酸ナトリウム）のようなブラスティング剤(blasting agent)も 適当である。補助剤は好ましくは流動調節剤と潤滑剤、例えばケイ酸、タルク、 ステアリン酸又はその塩（例えば、ステアリン酸マグネシウム若しくはステアリ ン酸カルシウム）及び／又はポリエチレングリコールである。 糖衣錠コアには、任意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリ エチレングリコール及び／又は二酸化チタンを含有する濃縮糖溶液、又は適当な 有機溶媒若しくは溶媒混合物中のワニス溶液、又は胃液に耐性な被膜を製造する ために適当な、例えばアセチルセルロースフタレート若しくはヒドロキシプロピ ルメチルセルロースフタレートのようなセルロース製剤の溶液を用いて、任意に 胃液に耐性な、適当な被膜を与える。 経口用のさらに有用な組成物は、二部式硬質ゼラチンカプセル並びに、例えば グリセリン又はソルビトールのような軟化剤(tenderizer)を含有する軟質密閉ゼ ラチンカプセルである。硬質カプセルは例えばラクトースのような充填剤コンパ ウンドと、例えば澱粉のような結合剤及び／又は例えばタルク若しくはステアリ ン酸マグネシウムのような潤滑剤と、任意に安定剤とを加えることによって顆粒 状の成長因子複合体を含有することができる。軟質カプセルでは、成長因子複合 体を好ましくは、例えば油脂(fatty oil)、パラフィン油又は液体ポリエチレン グリコールのような適当な液体中に溶解又は懸濁させる。 本発明を下記実施例によって説明する： 実施例１：乾燥牛乳−ＧＦＣの抽出 脱脂乾燥牛乳 １５０ｇ 脱イオン水 ７００ｇ 乳酸（８０％） １２０ｇ アセトン ３，５６０ｇ 脱イオン水 ３００ｇ アセトン １５０ｇ １．７００ｇの脱イオン水を含有するビーカーに撹拌しながら（Ｈｅｉｄｏｌ ｐｈスターラー，約２００ｒｐｍ）１５０ｇの脱脂乾燥乳を徐々に（５分間以内 ）加えた。懸濁液をさらに２０分間撹拌する。 ２．１２０ｇの乳酸を徐々に（５分間以内）加え、懸濁液をさらに１５分間撹 拌する。 ３．ビーカーの内容物を遠心機に移し、６，０００ｒｐｍにおいて２０分間遠 心分離する。 ４．上澄み水溶液を注ぎ出す。遠心機中の固体ペレットを、約３００ｇの脱イ オン水を加えることによって、ペーストに加工し、再び遠心分離する。 ５．上澄み水溶液を一緒にして、リカーフィルターに通して濾過する。成長因 子含有水溶液は淡黄色であり、オパール様光沢を有する。 ６．エーレンマイヤーフラスコ中の９００ｇの水溶液に、３，５６０ｇのアセ トンを徐々に（５分間以内）撹拌しながら（Ｈｅｉｄｏｌｐｈスターラー，２０ ０ｒｐｍ）加えて、懸濁液をさらに５分間撹拌する。生じる沈殿を室温において 一晩沈降させる。 ７．翌日、沈殿をガラスシンター吸引フィルターＧ４上で吸引して、５０ｇの アセトンによって３回洗浄し、好ましくは窒素ガス下の真空乾燥室において４０ ℃で乾燥させる。 収量：約５８ｇの乾燥牛乳−ＧＦＣ。 実施例２：母乳−ＧＦＣの抽出 ヒト乳 ６００ｍｌ 乳酸（８０％） ９０ｍｌ アセトン １，５００ｍｌ １．６００ｍｌのヒト乳を６，０００ｒｐｍにおいて２０分間遠心分離する。 上部脂肪層を除去し、残留溶液を真空下で３００ｍｌにまで蒸発させる。 ２．９０ｍｌの乳酸を徐々に（５分間以内）加えて、溶液をさらに１５分間撹 拌する。実施例１、３〜７項の操作に従う。 収量：約４０ｇの母乳−ＧＦＣ。 実施例３：鶏卵−ＧＦＣの抽出 卵黄 ６ 脱イオン水 ２００ｍｌ 乳酸（８０％） １００ｍｌ アセトン １，５００ｍｌ １．６個の卵黄を真空下で乾燥するまで蒸発させ（約４４ｇ乾燥物質）、２０ ０ｍｌの脱イオン水中に懸濁させる。 ２．１００ｍｌの乳酸を懸濁液に徐々に（５分間以内）加える。非常に微細な 濾過不能な沈殿が形成される。 ３．懸濁液を透析管（カットオフ：３，０００ＭＷ）内で水に対して２日間透 析する。 ４．透析管からの３００ｍｌの水溶液をエーレンマイヤーフラスコ中で１，５ ００ｍｌのアセトンを撹拌しながら（Ｈｅｉｄｏｌｐｈスターラー，２００ｒｐ ｍ）加える（徐々に添加、即ち、５分間以内）ことによって沈殿させる。混合物 をさらに５分間撹拌する。沈殿を室温において一晩沈降させる。 ５．翌日、沈殿をガラスシンター吸引フィルターＧ４上で吸引し、５０ｍｌの アセトンによって３回洗浄し、真空乾燥室において４０℃で乾燥させる。 収量：約４ｇの鶏卵−ＧＦＣ。 実施例４：魚卵−ＧＦＣの抽出 マス卵 １００ｇ 脱イオン水 ５００ｍｌ 乳酸（８０％） ８０ｍｌ アセトン ２，５００ｍｌ １．１００ｇのマス卵を５００ｍｌの脱イオン水中でミキサーを用いて崩壊さ せる。 ２．８０ｍｌの乳酸を徐々に（５分間以内）加え、懸濁液をさらに１５分間撹 拌する。 ３．生じる沈殿を遠心機に移し、６，０００ｒｐｍにおいて２０分間遠心分離 する。上澄みの成長因子含有水溶液（約５００ｍｌ）を注ぎ出す。 ４．５００ｍｌの水溶液をエーレンマイヤーフラスコ中で２，５００ｍｌのア セトンを撹拌しながら(Ｈｅｉｄｏｌｐｈスターラー，２００ｒｐｍ)加える(徐 々に添加、即ち、５分間以内)ことによって沈殿させる。混合物をさらに５分間 撹拌する。沈殿を室温において一晩沈降させる。 ５．翌日、沈殿をガラスシンター吸引フィルターＧ４上で吸引し、５０ｍｌの アセトンによって３回洗浄し、真空乾燥室において４０℃で乾燥させる。 収量：約１．５ｇの魚卵−ＧＦＣ。 実施例５：ヒト血液−ＧＦＣの抽出 ヒト血液 １５０ｍｌ 脱イオン水 ２２５ｍｌ 乳酸（８０％） ４５ｍｌ アセトン １，６００ｍｌ １．１５０ｍｌのヒト血液を２２５ｍｌの脱イオン水によって希釈する。 ２．４５ｍｌの乳酸を撹拌しながら（Ｈｅｉｄｏｌｐｈスターラー，約２００ ｒｐｍ）徐々に（５分間以内）加え、懸濁液をさらに１５分間撹拌する。 ３．生じる沈殿を遠心機に移し、６，０００ｒｐｍにおいて２０分間遠心分離 する。上澄みの成長因子含有水溶液（約３２０ｍｌ）を注ぎ出す。 ４．３２０ｍｌの水溶液をエーレンマイヤーフラスコ中で１，６００ｍｌのア セトンを撹拌しながら(Ｈｅｉｄｏｌｐｈスターラー，２００ｒｐｍ)加える(徐 々に添加、即ち、５分間以内)ことによって沈殿させる。混合物をさらに５分間 撹拌する。沈殿を室温において一晩沈降させる。 ５．翌日、沈殿をガラスシンター吸引フィルターＧ４上で吸引し、５０ｍｌの アセトンによって３回洗浄し、真空乾燥室において４０℃で乾燥させる。 収量：約２２ｇのヒト血液−ＧＦＣ。 実施例６：牛乳ホエー−ＧＦＣの抽出 牛乳からの乾燥ホエー １００ｇ 脱イオン水 ５００ｍｌ 乳酸 １００ｍｌ アセトン 約３，５００ｍｌ １．１００ｇの乾燥ホエーを５００ｍｌの脱イオン水中で撹拌しながら（Ｈｅ ｉｄｏｌｐｈスターラー，２００ｒｐｍ）分解させる。 ２．１００ｍｌの乳酸を加え、懸濁液を約１時間撹拌する。 ３．生じる沈殿を遠心機に移し、５，５００ｒｐｍにおいて２０分間遠心分離 する。上澄みの成長因子含有水溶液（約５７０ｍｌ）を注ぎ出す。 ４．水溶液を２部分に分割し、各１，５００ｍｌのアセトンを加えることによ って、撹拌しながら（Ｈｅｉｄｏｌｐｈスターラー，２００ｒｐｍ）沈殿させる 。沈殿を室温において一晩沈降させる。 ５．翌日、沈殿をガラスシンター吸引フィルターＧ４上で吸引し、５０ｍｌの アセトンによって３回洗浄し、真空乾燥室において４０℃で乾燥させる。 収量：約７３．４ｇの牛乳ホエー−ＧＦＣ。 実施例７：ＧＦＣ−創傷ゲル(wound gel)０．５％ １００ｇの創傷ゲルは下記成分を含有する： ｃａｒｂｏｐｏｌ ９８０ＮＦ ０．５０ｇ 脱イオン水 ９２．８４ｇ 水中１Ｍ トリス（ヒドロキシメチル） −アミノメタン ６．１６ｇ 成長因子複合体（ＧＦＣ） ０．５０ｇ ６０ｇの脱イオン水を２００ｇビーカー中で中等度の速度において撹拌する。 ０．５ｇのｃａｒｂｏｐｏｌ ９８０ＮＦを撹拌しながら徐々に加え、さらに１ ０分間撹拌し、１５分間膨潤させ、５ｇのトリス（ヒドロキシメチル）−アミノ メタンを試験管中に計量して入れ、０．５ｇのＧＦＣを加えて、良好に懸濁させ る。ＧＦＣ溶液をゲル量(gel -mass)に加え、スパチュラで混合する。ｐＨ値を １Ｍトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタンによって撹拌しながら６〜７に 調節する。さらに撹拌しながら、ゲル量を脱イオン水によって１００ｇに希釈し て、さらに約５分間撹拌する。 実施例８：ＧＦＣ−練り歯磨き０．５％ １００ｇの練り歯磨きは下記成分を含有する： 成長因子複合体（ＧＦＣ） ０．５０ｇ 炭酸カルシウム ３７．００ｇ ａｅｒｏｓｉｌ２００ １．００ｇ グリセリン ２５．００ｇ パラフィン ０．５０ｇ ペパーミント油 １．００ｇ フッ化Ｎａ ０．７６ｇ サッカリン ０．０１ｇ 脱イオン水 ２７．２８ｇ カルボキシメチルセルロース ０．８０ｇ ラウリル硫酸Ｎａ ２．００ｇ 脱イオン水 ４．１５ｇ ＧＦＣと、炭酸カルシウムと、ａｅｒｏｃｉｌ２００とを乳鉢中で乳棒によっ て超微粉砕する。グリセリンと、パラフィンと、ペパーミント油とを加え、乳棒 でペースト化する。脱イオン水と、フッ化Ｎａと、サッカリンとをビーカー中で ５分間撹拌してから、ペースト化炭酸カルシウム混合物に加える。ラウリル硫酸 Ｎａをビーカーに加えて、残りの水を加える。約３０℃に加熱して、撹拌しなが ら懸濁させ、得られた懸濁液をペースト化炭酸カルシウム混合物に加える。ペー ストを手によって充分に撹拌して、三ローラーミル(3-roller-mill)にグレード ３で通し；この量を再び撹拌する。得られたペーストのｐＨ値は１０である。感 覚器官刺激的理由から必要である場合には、ｐＨ値をクエン酸によって中性又は やや酸性値に調節することができる。 実施例９：注射用の２％ＧＦＣ溶液 １リットルの注射溶液の組成： 成長因子複合体 ２０．０ｇ アスコルビン酸 ４５．０ｇ 注射用水 ９３５．０ｇ ９３５．０ｇの注射用水をエーレンマイヤーフラスコ中に計量して入れる。４ ５ｇのアスコルビン酸を加えて、（フラスコを閉じた状態で）９００ｒｐｍにお ける約１０分間以内の撹拌で溶解させる。２０ｇのＧＦＣを加えて、ＧＦＣが殆 ど溶解するまで、溶液を約１時間撹拌する。溶液を滅菌フィルターに通して滅菌 褐色ガラスボトル中に直接濾過する。 実施例１０：注射用の１００ｇのＧＦＣ粉末 各１００ｍｇのＧＦＣを含有する２００ボトル用の組成： 成長因子複合体 ２０．０ｇ 各５ｍｌを含有する２００溶液アンプル(solvent ampule)用の組成： アスコルビン酸 ４５．０ｇ 注射用水 ９３５．０ｇ １００ｍｇのＧＦＣを滅菌フラスコ中に計量して入れる。９３５．０ｇの注射 用水をエーレンマイヤーフラスコ中に計量して入れる。４５ｇのアスコルビン酸 を水に加えて、（フラスコを閉じた状態で）９００ｒｐｍにおける約１０分間以 内の撹拌で溶解させる。溶液を滅菌フィルターに通して滅菌褐色ガラスフラスコ 中に直接濾過する。５ｍｌの溶液を各溶液アンプルに移す。使用前に、溶液アン プルの内容物を滅菌ＧＦＣ含有フラスコ中に注射針によって注入して、フラスコ を注意深く振動しながらＧＦＣを溶解させる。 実施例１１：５００ｍｇのＧＦＣ錠剤 １０００錠は下記成分を含有する： 成長因子複合体 ５００．０ｇ 微細結晶質セルロース ８６．０ｇ Ｎａ−カルボキシメチル澱粉 ５０．６ｇ ｐｏｖｉｄｏｎ Ｋ３０ ３０．０ｇ ケイ酸、超微粉砕化、合成 ３．２ｇ ひまし油、硬化 ５．２ｇ イソプロパノール 湿らせるため ＧＦＣと、セルロースと、Ｎａ−カルボキシメチル澱粉とを計量し、ふるい分 けし（メッシュ幅７１０μｍ）、混合する。混合物を乳鉢中で乳棒によって超微 粉砕し、約１８０ｇのイソプロパノールによって湿らせる。湿った混合物を乾燥 室において５０℃で３時間乾燥させ、ふるい分けする（メッシュ幅７１０μｍ） 。ケイ酸とひまし油とを顆粒に加えて、混合物を閉じた容器内で充分に混合する 。錠剤プレス（Ｋｏｒｓｃｈ ＥＫＯ）で１３ｍｍ直径のスタンプによって錠剤 を圧縮成形して、６７５ｍｇの重量（５００ｍｇのＧＦＣに対応）を有する錠剤 を得た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/14 Ａ６１Ｋ 31/00 ６１７Ｈ 17/00 ６１７ 19/10 ６１９Ｅ 21/00 ６２１ 35/00 ６３５ Ａ６１Ｋ 38/22 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＡ，ＢＧ，Ｂ Ｒ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ ，ＪＰ，ＫＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，Ｕ Ａ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 デッター・ホフマン スイス連邦共和国 ラインナッハ4153，サ ーウィラーストラーセ，87

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．天然の成長因子含有物質からの成長因子複合体の抽出方法であって、 （ａ）出発物質に水を加える工程と、 （ｂ）ｐＨ値を酸の添加によって２．５〜３．２に調節する工程と、 （ｃ）生ずる沈殿を上澄み液から分離する工程と、 （ｄ）水と混和性の有機溶剤を成長因子含有水溶液に加える工程と、 （ｅ）生ずる沈殿を分離して、乾燥させる工程と、 （ｆ）必要な場合には、得られる生成物を透析する工程と を特徴とする上記方法。 ２．天然の成長因子含有物質が哺乳動物からの乳と対応するホエー、鳥卵、 魚卵、哺乳動物からの血液、哺乳動物からの尿、並びに蜂蜜及び植物の種子であ りうることを特徴とする、請求項１記載の方法。 ３．天然の成長因子含有物質がヒト乳、牛乳、ホエー、鶏卵、マス卵、ウシ 血液、ヒト尿及び蜂蜜でありうることを特徴とする、請求項１記載の方法。 ４．脱脂牛乳を出発物質として用いることを特徴とする、請求項１記載の方 法。 ５．脱脂乳を出発物質として用い、この場合に固体乾燥物質が未加工乳にお けるよりも濃厚であることを特徴とする、請求項１又は４に記載の方法。 ６．脱脂天然乳を出発物質として用い、この場合に固体乾燥物質が緩和な条 件下での水の蒸発によって濃縮されていることを特徴とする、請求項５記載の方 法。 ７.乾燥乳を出発物質として用いることを特徴とする、請求項５記載の方法 。 ８．ホエーを出発物質として用いることを特徴とする、請求項１又は２に記載の 方法。 ９．牛乳からのホエーを出発物質として用いることを特徴とする、請求項１ 又は２に記載の方法。 １０．牛乳からの乾燥ホエーを出発物質として用いることを特徴とする、請 求項１又は２に記載の方法。 １１．ｐＨを２．５〜３．２に調節するために、非酸化性無機酸又はモノ− 、ジー及びトリカルボン酸、又はこのようなモノ−、ジー及びトリカルボン酸か ら誘導されるヒドロキシカルボン酸を用いることを特徴とする、請求項１記載の 方法。 １２．塩酸、硫酸、リン酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、蓚酸、マロ ン酸、コハク酸、グリコール酸、乳酸、β−ヒドロキシプロピオン酸、リンゴ酸 、酒石酸、アスコルビン酸又はクエン酸を用いることを特徴とする、請求項１又 は１１に記載の方法。 １３．ギ酸、酢酸、乳酸及びクエン酸を用いることを特徴とする、請求項１ 又は１１に記載の方法。 １４．乳酸を用いることを特徴とする、請求項１又は１１に記載の方法。 １５．低級アルカノール又は低級ジアルキルケトンを水と混和性の有機溶剤 として用いて、成長因子複合体を分離することを特徴とする、請求項１記載の方 法。 １６．水と混和性の有機溶剤として、メタノール、エタノール、ｎ−プロパ ノール、イソプロパノール、アセトン又はジエチルケトンを用いることを特徴と する、請求項１又は１５に記載の方法。 １７．水と混和性の有機溶剤として、イソプロパノール又はアセトンを用い ることを特徴とする、請求項１又は１５に記載の方法。 １８．水と混和性の有機溶剤として、アセトンを用いることを特徴とする、 請求項１又は１５に記載の方法。 １９．水と混和性の有機溶剤と、成長因子含有水溶液とを２：１から１０： １までの量比で混合することを特徴とする、請求項１記載の方法。 ２０．水と混和性の有機溶剤の量が、成長因子含有水溶液の数倍、好ましく は４〜６倍であること特徴とする、請求項１又は１９記載の方法。 ２１．乾燥後に得られる成長因子複合体を脂溶性溶剤によって抽出すること 特徴とする、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。 ２２．抽出を塩化メチレン、クロロホルム又は四塩化炭素によっておこなう ことを特徴とする、請求項２１記載の方法。 ２３．抽出を塩化メチレンによっておこなうことを特徴とする、請求項２１ 記載の方法。 ２４．下記工程： （ａ）成長因子含有物質に水を加える工程と、 （ｂ）ｐＨ値を酸の添加によって２．５〜３．２に調節する工程と、 （ｃ）生ずる沈殿を上澄み液から分離する工程と、 （ｄ）水と混和性の有機溶剤を成長因子含有水溶液に加える工程と、 （ｅ）生ずる沈殿を分離して、乾燥させる工程と、 （ｆ）必要な場合には、得られる生成物を透析する工程と によって得られる成長因子複合体。 ２５．請求項２４記載の成長因子複合体が生理的に充分に許容される補助剤 及びキャリヤー材料中に有効成分として含有されていることを特徴とする組成物 。 ２６．０．５〜２．０％の成長因子複合体を含有する、請求項２５記載の創傷ゲ ル。 ２７．０．５〜２．０％の成長因子複合体を含有する、請求項２５記載の練 り歯磨き。 ２８．０．５〜２．０％の成長因子複合体を含有する、請求項２５記載の注 射溶液。 ２９．疾患を治療するための請求項２４記載の成長因子複合体の使用。 ３０．創傷、血腫、歯周炎、脱毛症、種々な形態の癌及び胃腸障害の治療の ため、脱毛症と骨粗しょう症の予防のため、皮膚構造の改善のため、筋肉量の発 達のため、及び哺乳動物における乳産出量を高めるための請求項２４記載の成長 因子複合体の使用。 ３１．創傷、血腫、歯周炎、脱毛症、種々な形態の癌及び胃腸障害の治療の ため、脱毛症と骨粗しょう症の予防のため、皮膚構造の改善のため、筋肉量の発 達のため、及び哺乳動物における乳産出量を高めるための方法であって、請求項 ２４記載の成長因子複合体を施用することを特徴とする方法。 ３２．下記工程： （ａ）成長因予含有物質に水を加える工程と、 （ｂ）ｐＨ値を酸の添加によって２．５〜３．２に調節する工程と、 （ｃ）生ずる沈殿を上澄み液から分離する工程と によって得られる成長因子含有水溶液。