MXPA04002387A - Factor inhibidor de afluencia de calcio y metodo de aislamiento del mismo. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un factor purificado aislado de leche humana. El factor es capaz de inhibir la actividad de afluencia de calcio en leucocitos polimorfonucleares. Tambien se proporciona un metodo para la purificacion del factor.

Description

FACTOR INHIBIDOR DE AFLUENCIA DE CALCIO Y MÉTODO DE AISLAMIENTO DEL MISMO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los leucocitos polimorfonucleares o granulocitos son una amplia clase de glóbulos blancos entre los que se incluyen neutrófilos, eosinófilos y basófilos, que se producen en la médula ósea y defienden al cuerpo contra organismos infecciosos o sustancias extrañas, y los neutrófilos son el componente celular predominante de la inflamación aguda. La migración de neutrófilos en el área afligida es característica de una respuesta inflamatoria. También se ha mostrado que los neutrófilos desempeñan una función en la enfermedad inflamato ia, y la activación neutrofilica "inadecuada" y la posterior supresión se propone explicar la función de los nuetrófilos en ciertas enfermedades. Por ejemplo, la activación, desactivación inadecuada y el probable daño antioxidativo se ha implicado como un mecanismo de defecto leucomotor neutrofilico en traumas. 'La activación neutrofilica inadecuada también se ha implicado en enfermedades venosas. Cuando los leucocitos polimorfonucleares ("PMN", por sus siglas en inglés) se estimulan con un agonista durante una respuesta inmunológica , los PMN exhiben un aumento transitorio en los niveles de calcio libre intracelular , que se puede atribuir a una liberación de calcio desde almacenamientos internos, tales como por ejemplo, aquellos dentro del retículo endoplásmico . Por ejemplo, después de la exposición a un quimioatrayente , secretagogo, o agonista de activación, los neutrófilos exhiben, un aumento en los niveles de calcio libre intracelular.

Este aumento en el calcio libre intracelular es importante para la posterior actividad de los PMN en la respuesta inmunológica. Modelos actuales indican que después de este aumento transitorio en los niveles de calcio libre intracelular, los neutrófilos posteriormente regresan a homeostasia y los niveles de calcio libre intracelular regresan a un estado normal mediante un proceso que implica la resecuestración de Ca++ de regreso al interior de los almacenes intracelulares , la afluencia de Ca++ desde el exterior de la célula, y la descarga de Ca++ al interior del medio externo. La leche humana ha mostrado tener actividad anti-inflamatoria tanto en seres humanos como en modelos animales (por ejemplo, en un modelo de colitis inducida químicamente y en un modelo de inflamación subcutánea del saco aéreo de rata) . Estudios anteriores han mostrado que muchas funciones pro-inflamatorias de neutrófilos se disminuyen por la exposición a calostro y/o leche humana. Por ejemplo, los componentes en la leche humana pueden aumentar la expresión de DCllb, disminuir la expresión de L-selectina y producir neutrófilos activados. Los niveles de calcio libre intracelular en neutrófilos se relacionan con la actividad neutrofílica, y el equilibrio de Ca++ intracelular es decisivo para múltiples funciones neutrofílicas normales. Los estudios han mostrado que la inhibición de la afluencia de Ca++ (ya sea mediante un bloqueador de canal de Ca++ o al suspender neutrófilos en un amortiguador libre de Ca++) puede disminuir muchas funciones neutrofílicas pro-inflamatorias después de una estimulación fisiológica, por ejemplo, la inhibición de la función neutrofílica humana mediante ácido tolfenámico implica la inhibición de la afluencia del Ca++. Se ha reportado que la N-acetilesfingosina ( C2 -ceramida ) inhibe la formación de supe'r-óxidos neutrofílicos y la afluencia de calcio. Se sabe que los fármacos que bloquean los canales de calcio tienen una influencia sobre la función microbicida de nuetrófilos humanos y se ha reportado que los bloqueadores de canal de calcio influyen en la actividad bactericida y fungicida poli-morfonuclear y de monocitos. La supresión selectiva de la función de los PMN se ha intentado por razones terapéuticas utilizando agentes citotóxicos capaces de suprimir la producción de PMN mediante médula ósea para tratar de disminuir al mínimo la inflamación inducida por lesiones a tejidos. Sin embargo, la supresión de médula no ha sido PMN-específica, y ha conducido a la producción suprimida de otros elementos sanguíneos con efectos secundarios auxiliares. El tratamiento con corticoides se ha utilizado para suprimir la función de los PMN aunque estos tratamientos también tienen varios efectos secundarios no deseados. Se ha reportado que la supresión de la función PMN in vivo se alcanzará experimentalmente a través del uso de anticuerpos monoclonales dirigidos contra las integrinas PMN. Este último trabajo sugiere que la supresión de la función PMN puede tener aplicación en la prevención/minimización de la extensión de infarto de miocardio y la mejoría de la lesión por isquemia/reperfusión . Se ha reportado anteriormente que la leche humana inhibe los P N al reducir los almacenamientos de calcio, al menos en parte, a través de la inhibición de la afluencia dé calcio extracelular hacia los PMN después de la estimulación de agonistas. También se ha reportado que la exposición a leche humana altera el equilibrio de Ca++ intracelular , provoca activación celular y suprime la función de los leucocitos polimorfonucleares . Un trabajo más reciente ha reportado que la capacidad de la leche humana para inhibir la afluencia de calcio extracelular hacia los PMN puede ser un efecto que tenga especificidad significativa. La exposición a leche humana ha reportado no tener ningún efecto inhibidor sobre la afluencia de calcio extracelular en células de músculo liso o estriado de conejo, sobre células mieloideas humanas inmaduras o células intestinales inmaduras de rata.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente solicitud se relaciona con un factor para inhibición de afluencia de calcio extracelular y un método para su purificación a partir de leche humana. La leche humana tiene amplias propiedades anti-inflamatorias , y se ha mostrado que la leche humana inhibe mediadores celulares de inflamación tales como por ejemplo, PMN o neutrófilos. La actividad de PMN y neutrófilos se ha correlacionado con niveles de calcio libre intracelular . La leche humana puede suprimir la función de PMN o neutrófilos al inhibir la afluencia de calcio al interior de las células a partir de fuentes externas, cuando los PMN o neutrófilos regresan a homeostasia después de haber sido estimulados con un agonista. Otros estudios han sugerido que la leche humana también puede modificar la resecuestración de Ca++ en almacenamientos intracelulares , y la afluencia de Ca++ en el medio externo. Debido a que el equilibrio de calcio intracelular parece ser decisivo para múltiples funciones PMN normales, la depleción de almacenamientos de calcio intracelular podrían proporcionar potencialmente una rama para alcanzar efectos anti-inflamatorios a través de la supresión amplia de la función PMN. La presente solicitud proporciona un factor purificado a partir de leche humana que sea capaz de inhibir la afluencia de calcio extracelular en PMN.

En el sentido en que se emplea en la presente, los términos "purificada" y "purificación" se refieren a composiciones (y métodos relacionados) en los cuales la cantidad relativa de un componente o componentes designados, tales como por ejemplo, un factor Cali, se ha aumentado al eliminar al menos una porción de una o más impurezas de la composición. Aunque estos términos se pueden referir a un proceso que produce una composición que incluye 90% en peso o más de los componentes deseados, los términos "purificado" y "purificación" no requieren implicar este alto grado de eliminación u otras sustancias de la composición. La importancia central del metabolismo de Ca++ para la función neutrofilica indujo a los solicitantes a examinar si la exposición a leche altera las respuestas de Ca++ a neutrófilos con una serie de agonistas y la forma en que se logren los efectos. La presente solicitud se basa en la consideración de que debe ser posible aislar un factor capaz de inhibir la afluencia de calcio extracelular en PMN (denominado en la presente como un "factor Cali") a partir de leche humana al utilizar un análisis que mide la afluencia de calcio en PMN después de la estimulación con un agonista (por ejemplo, formil-metionil-leucil-fenilalanina ( "/MLP" ) ) . La presente solicitud proporciona un método para producir un factor purificado a partir de leche humana que sea capaz de inhibir al menos parcialmente la afluencia de calcio extracelular en PMN (denominado en la presente como "actividad para la inhibición de afluencia de calcio"). De preferencia, el factor Cali se purifica sustancialmente , es decir, el factor Cali constituye al menos aproximadamente 50% en peso de los componentes que tienen un peso molecular evidente de 1 kDa o mayor que están presentes en una composición purificada. Cuando los PMN se tratan con el factor Cali purificado, se inhibe la afluencia de calcio externo en los PMN. Por lo tanto, en el momento de una estimulación adicional con un agonista y la liberación adicional de calcio proveniente de almacenamientos internos, los PMN experimentarán una depleción neta en contenido de calcio y, como tal, se suprimirán una o más funciones de los PMN. Una modalidad proporciona un método para purificar un factor Cali derivado de leche humana clarificada. La leche clarificada se ha despojado prácticamente de residuos celulares y glóbulos de grasa. Esto se puede llevar a cabo utilizando métodos estándar tales como por ejemplo, centrifugación y/o filtración. El factor Cali se puede purificar al aislar una fracción de bajo peso molecular de leche clarificada de tal forma que la fracción contenga componentes con un peso molecular evidente no menor a 1 kDa y no mayor a 10 kDa. Por ejemplo, la leche clarificada se puede procesar para eliminar los componentes que tengan un peso molecular evidente mayor a 10 kDa; y posteriormente se puede procesar para eliminar los componentes que tengan un peso molecular evidente menor a 1 kDa. En una modalidad preferida, la leche clarificada se puede procesar para que proporcione una fracción de bajo peso molecular que contenga componentes que tengan un peso molecular evidente no mayor a 3.5 kDa y no menor a 1 kDa. La fracción de bajo peso molecular se puede tratar posteriormente para eliminar componentes solubles lipidos para proporcionar una segunda fracción acuosa, que incluye un componente que exhibe una actividad para inhibición de afluencia de calcio. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, al extraer la primera fracción con un solvente orgánico (por ejemplo, una mezcla de cloroformo/metanol ) y mantener la fase acuo sa .

Por ejemplo, un factor Cali purificado se puede producir a partir de leche humana clarificada mediante un método que incluye (i) dializar la leche humana clarificada a través de una membrana de corte de 10 kDa para recolectar un dializado como una primera fracción; (ii) dializar la primera fracción a través de una membrana de corte de 1 kDa para aislar un contenido como una segunda fracción; y (iii) extraer la segunda fracción con un solvente orgánico capaz de disolver los componentes solubles en lipidos (por ejemplo, mezcla de cloroformo/metanol) para producir una tercera fracción que es una solución acuosa que incluye un componente que exhibe una actividad para inhibición de afluencia de calcio. La presente solicitud también roporciona un factor Cali purificado derivado de leche humana. El factor Cali es capaz de inhibir la afluencia de calcio extracelular para los PMN . El factor Cali purificado típicamente se produce a partir de leche humana clarificada. El factor Cali típicamente tiene un peso molecular evidente no menor a aproximadamente 1 kDa y no mayor a aproximadamente 10 kDa. De manera más adecuada, se cree que el factor Cali típicamente tiene un peso molecular evidente no menor a aproximadamente 1 kDa y no mayor a aproximadamente 3.5 kDa. El factor Cali es soluble en solución acuosa y de preferencia se purifica de tal forma que esté prácticamente libre de material soluble en lipidos. Se ha encontrado que el factor es capaz de mantener su actividad para inhibición de afluencia de calcio extra-celular ("actividad Cali") después de ser calentado durante 10 minutos a 100°C. El factor Cali también es capaz de mantener su actividad Cali después de ser sometido a acidificación a un pH 2 durante 10 minutos a 60°C o a alcalinización a un pH 12 durante 10 minutos a 25°C. El factor Cali no produce una respuesta positiva en un análisis Lowry y es capaz de mantener su actividad Cali después de ser tratado con preteinasa K a 1 µg/ml durante 10 minutos a 37°C. En el sentido en el que se emplea en la presente, el término "resistente a" se refiere al factor que continúa para exhibir al menos algún grado de actividad inhibidora de afluencia de calcio después de ser sometido a las condiciones establecidas. El factor Cali también es estable al tratamiento por congelación y deshielo, es decir, el factor Cali exhibe una actividad inhibidora de afluencia de calcio después de ser sometido a un tratamiento de congelación y deshielo. La presente solicitud también proporciona un método para inhibir la afluencia de calcio en leucocitos polimorfonucleares que incluye administrar un factor Cali a los leucocitos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1, muestra una gráfica que representa la inhibición de la afluencia de C++ después de la estimulación con /MLP y la adición de Ca++ libre en el medio. La fracción de leche purificada que pasa a través de una membrana de corte de 10 kDa se denomina como "Filtrado". La fracción de "Filtrado" que se retiene por una membrana de corte de 1 kDa Dalton se denomina como "Concentrado" ("Conc") . La "Conc. Acuosa" (alternativamente denominada en la presente como "mkll") se produjo al extraer la fracción "Conc" con una mezcla de cloroformo/metanol y recolectar la fase acuosa. La Figura 2, muestra una gráfica que representa los resultados de un análisis con escopoletina después de la estimulación con /MLP. El "Filtrado", "Concentrado" ("Conc") y "Conc. Acuosa" son los mismos componentes de leche purificada a los que se hizo referencia en la descripción de la Figura 1. En este análisis, la pérdida de fluorescencia por escopoletina es un indicador de la . producción de H202 mediante PM . La Figura 3 muestra una gráfica que representa los efectos de la leche humana y el "concentrado" ("Conc") sobre las respuestas de agregación de PMN después de la estimulación con /MLP. "Conc." es el mismo componente de leche purificada al que se hizo referencia en la descripción de la Figura 1. La Figura 4 muestra una gráfica que representa los efectos del · "Filtrado" y "Concentrado" ("Conc.") sobre la locomoción de los PMN (ya sea sin estimular o después de la estimulación con /MLP o con suero activado). "Filtrado" y "Conc." son los mismos componentes de leche purificada a los que se hizo referencia en la descripción de la Figura 1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta solicitud se relaciona con el aislamiento y/o purificación de un factor proveniente de leche humana que sea capaz de inhibir la afluencia de calcio en PMN.

En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "leche humana clarificada" se refiere a leche humana que prácticamente se ha despojado de residuos celulares y glóbulos de grasa, por ejemplo, mediante centrifugación y/o filtración. En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "inflamación" se refiere a un respuesta protectora localizada producida por una lesión y/o destrucción de tejidos que sirve para destruir, diluir o separar con paredes un agente perjudicial y un tejido dañado y se caracteriza en la forma aguda por las secuencias clásicas de dolor, calor, enrojecimiento, hinchazón y pérdida de función. La inflamación histológicamente implica una serie compleja de eventos, entre los que se incluyen dilatación de las arteriolas, capilares y vénula con permeabilidad aumentada y flujo sanguíneo, exudación de fluidos entre los que se incluyen proteínas plasmáticas, y migración de leucocitos en el interior del foco inflamatorio. En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "leucocitos polimorfonucleares" (o "P N") se refiere a una clase representativa de glóbulos blancos, denominados alternativamente granulocitos , que comprende neutrófilos, eosinófilos y basófilos . En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "HBSSw" se refiere a Solución Salina Equilibrada de Hanks, complementada con MgCl2 10 mM y CaCl2 10 mM. En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "HBSSw/o" se refiere a Solución Salina Equilibrada de Hanks, sin gCl2 10 mM y CaCl2 10 mM. En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "/MLP" se refiere a un péptido de la secuencia, formil-metionil-leucil-feni1alaniña . En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "afluencia de calcio" se refiere al desplazamiento de calcio del medio externo en una célula. En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "calcio libre" se refiere a calcio intracelular que está presente en el citosol y no retenido dentro de las vesículas intracelulares tal como por ejemplo, el retículo endoplásmico . Un método adecuado para aislar y purificar el factor proveniente de leche humana clarificada comprende los siguientes pasos: 1. Dializar la leche humana clarificada a través de una membrana para diálisis de 10 kDa y recolectar el dializado ("filtrado") como una primera fracción, por ejemplo, vía diálisis durante la noche de la leche humana clarificada contra solución salina amortiguada con fosfato ("PSB") a través de una membrana para diálisis de 10 kDa; 2. Dializar la primera fracción a través de una membrana par diálisis de 1 kDa y recolectar el ("concentrado") como una segunda fracción, por ejemplo, vía diálisis /concentración por absorción de la primera fracción a través de una membrana de corte de 1 kDa. 3. Extraer la segunda fracción con un solvente orgánico (tal como por ejemplo, una mezcla de cloroformo y metanol) y recolectar la fase acuosa resultante ("concentrado acuoso"). La presencia y cantidad relativa del factor Cali en una fracción dada se puede determinar al realizar un análisis para afluencia de calcio. La concentración de calcio libre en células ("Ca++ libre") se puede medir al utilizar una solución de ensayo fura 2 (Molecular Probes, Eugene, OR) . P N, tal como por ejemplo neutrófilos, se pueden aislar como se describe en Boyum, A. , "Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood," Scand. J. Clin. Invest., 97:77-89 (1968) . Los PMN o neutrófilos, 5x10s PMN en HBSSw/o, se pueden marcar con fura-2 mediante la exposición a fura-2AM, 2 µ? (la forma de metiléster de fura 2) durante 45 minutos a 37°C, C02 al 5%, en oscuridad total. Después del marcado, las células se pueden lavar dos veces al aglomerar las células, y al resuspender las células en un volumen de 15 mi de HBSSw/o. La concentración de células luego se volvió a ajustar a lOxloVml en HBSSw (con Ca++ 10 mM y Mg++ 10 mM) , y la emisión de la solución de ensayo fura 2 dentro de las células se puede examinar en un espectrofluorómetro LS50B (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) a longitudes de onda de excitación de 340 nm y 380 nm, y a una longitud de onda de emisión de 510 nm. Cuando la solución de ensayo de fura 2 se une al Ca++ libre intracelular , emite una luz de intensidad mayor cuando se excita a 340 nm distinto de 380 nm. Esta emisión diferencial cuando la solución de ensayo se une a Ca++ libre intracelular permite al investigador calcular la cantidad de Ca++ libre al utilizar la ecuación: Conc. de Ca++ libre = Kd ( (R-Rmin) / (Rmax - R) ) Q En donde R es la proporción de la fluorescencia de 340/380-nm bajo condiciones de prueba particulares, Rmax es la proporción de fluorescencia de 340/380-nm de las células tratadas con Tritón X-100 al 0.1%, ¾in es la proporción de la fluorescencia 340/380-nm de las células tratadas con Tritón X-100 al 0.1% y EGTA 20 mM, " Q" es la proporción de fluorescencias de 380-nm bajo condiciones libres de C++/saturadas con C++, y Ka es la constante de disociación para Ca++ que se une a fura 2 {Ka = 145 nM con base en las curvas de calibración) . Después de la estimulación con agonistas, tal como por ejemplo, el tratamiento de los P N con /MLP 1 µ?, los valores calculados de Ca++ libre se pueden utilizar para producir una curva de Ca++ libre contra el tiempo, y el área bajo esta curva es indicativa de la respuesta de Ca++ libre al agonista . La "actividad Cali" en una fracción determinada se puede medir al (1) tratar los PMN con la fracción purificada proveniente de leche humana; (2) estimular los PMN con un agonista tal como por ejemplo, /MLP; (3) agregar CaCl2 10 mM al medio celular aproximadamente 30 segundos después de la estimulación con /MLP; y (4) medir el aumento, o falta del mismo, de Ca libre intracelular contra el tiempo según se compara con células no tratadas después de la adición del CaCl2 10 mM externo. La actividad Cali se define como la actividad que reduce el área bajo la curva del Ca++ libre intracelular contra el tiempo con relación a las células no tratadas después de la adición de CaCl2 10 mM al medio externo. Después de la estimulación con un agonista, los PMN exhiben un aumento transitorio en la concentración de Ca++ libre intracelular, que luego disminuye gradualmente (Figura 1). Después de la adición" de Ca++ externo, la concentración de Ca++ libre intracelular nuevamente aumenta, excepto en donde la fracción contiene un componente que exhibe actividad Cali ( Figura 1 ) .

Purificación del Factor El presente método para producir un factor Cali purificado proveniente de leche humana se ejemplifica haciendo referencia a la siguiente descripción. Esta descripción pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención que se ha establecido en la presente. Se recolectaron muestras de leche humana madura provenientes de madres con más de cuatro días después del nacimiento del niño al vaciar el pecho mediante expresión manual o mediante bomba eléctrica para mama. Después de la recolección, cada muestra se almacenó a temperaturas de refrigerador y se transportó a laboratorio en el intervalo de tres horas. Al llegar al laboratorio, las muestras lácteas se sometieron a centrifugación (380 X g, 10 min, 4°C) , y el sobrenadante sin células que contenía la crema y la fase acuosa se recolectó, se combinó, y se almacenó a -70°C hasta el momento de utilizarse. Antes del uso experimental, las muestras de leche humana se descongelaron y se sometieron a centrifugación (14,000 x g, 25 min, temperatura ambiente) utilizando una micro-centrifugadora sobre una mesa para proporcionar nuevamente una fase acuosa (leche humana clarificada) . La leche humana clarificada luego se dializó contra PBS a través de ya sea una membrana de corte de 10 kDa o una membrana de corte de 3.5 kDa. El dializado ("Filtrado") se recolectó y se concentró al dializar una segunda vez contra PBS a través de una membrana de corte 1 kDa y la recolección del ("Concentrado") . El concentrado, luego se puede extraer con una mezcla de cloroformo/metanol , y la fracción acuosa se recolectó ("concentrado acuoso") . Después déla extracción, estas fracciones acuosas (¾Conc. Acuosa") mantienen la actividad (véase la Figura 1). El factor purificado resultante esencialmente no tiene contenido proteinico (según se puede detectar via un análisis Lowry) y su actividad Cali es resistente a la proteinasa K. La exposición al solvente orgánico durante el paso de extracción no parece tener ningún efecto sustancial sobre la actividad Cali del factor, por ejemplo, sin el componente de la Conc. Acuosa que tiene la actividad Cali parece perder actividad a través de la desnaturalización que resulta de la exposición al solvente orgánico. Según se demuestra por los resultados del análisis con escopoletina mostrados en la Figura 2, los PMN expuestos al "Filtrado" producen peróxido de hidrógeno ("H202") después de la estimulación con /MLP según resulta evidente por la pérdida de fluorescencia con escopoletina. Por contraste, la exposición de los PMN estimulados por /MLP a ya sea el "Concentrado" ("Conc") o la "Conc. Acuosa" no dieron por resultado en una pérdida de fluorescencia por escopoletina, lo que indica una falta de la producción sustancial de H202 por los PMN expuestos- a estas fracciones.

Caracterización del factor El factor Cali purificado tiene un peso molecular evidente de ya sea 1-10 kDa (es decir, el factor no se retuvo por una membrana de diálisis de 10 kDa, aunque se retuvo por una membrana de 1 kDa) o 1-3.5 kDa (es decir, el factor no se retuvo por una membrana de diálisis de 3.5 kDa, pero se retuvo con una membrana de 1 kDa) dependiendo de la membrana empleada en el primer paso de diálisis. El factor se dividió a la fase acuosa en el momento de la extracción con un solvente orgánico tal como por ejemplo, una mezcla de cloroformo/metanol . El factor no se unió totalmente a las resinas catiónicas o aniónicas, por ejemplo, el factor Cali presente no se unió a heparina separosa o resina Dowex. El factor Cali inhibe la afluencia de calcio en los PMN, después de que los PMN se han estimulado con un agonista, según se mide por una reducción en el área bajo la curva de la concentración de Ca++ libre intracelular contra el tiempo para células tratadas con relación a células sin tratar (véase por ejemplo, la Figura 1) . Como resulta evidente por los resultados mostrados en las Figuras 3 y 4, respectivamente, el factor Cali también es capaz de inhibir la agregación de los PMN expuestos a /MLP y la locomoción de los PMN estimulados con ya sea /MLP o suero activado. Mientras que la leche humana sin fraccionar se ha reportado que disminuye la adherencia de los PMN a las superficies de las placas para cultivos de tejidos, el factor Cali presente no tuvo ningún efecto sobre la adherencia de PMN (resultado no mostrado) . Los siguientes procedimientos mostrados enseguida se pueden emplear para (a) determinar la concentración de calcio intracelular en ?MN; (b) determinar el efecto de las fracciones lácteas sobre el receptor superficial que se derraman por los PMN; (c) examinar el efecto de las fracciones lácteas sobre la conformación de los PMN expuestos a /MLP; (d) examinar el efecto de las fracciones lácteas sobre la adherencia de PMN a las cavidades de las placas para cultivo de tejidos, y (e) determinar el efecto de las fracciones lácteas sobre la agregación de los PMN expuestos a /MLP.

Purificación y preparación de los PMN Los PMN se purificaron a partir de sangre tratada con heparina obtenida de donadores voluntarios adultos utilizando un método de sedimentación con Hypaque-ficoll/dextrano . Las preparaciones celulares resultantes (típicamente > PMN al 95%) se ajustaron a 107 células/ml en Solución Salina Equilibrada de Hanks con Ca++ y Mg++ (HBSSw) y se utilizaron en los experimentos según se describe .

Suero y preparación de control plasmático: Se prepararon especímenes séricos a partir de 6 muestras de sangre fresca que se dejaron coagular durante 30 minutos a temperatura ambiente, se bordearon, se mantuvieron en hielo durante 30-60 minutos para permitir el retroceso de los coágulos, se sedimentaron (500 x g, 10 minutos, 4°C) y el suero se retiró y se congeló a -20°C hasta que se utilizó. Las muestras plasmáticas se prepararon a partir de 6 diferentes muestras sanguíneas tratadas con heparina mediante sedimentación (500 x g, 10 minutos, 4°C), la filtración de los plasmas ricos de plaquetas resultantes a través de filtros de 0.4.µ para eliminar las plaquetas contaminantes, y luego se almacenaron a -20°C hasta el momento de utilizarse .

Mediciones de Ca intracelular en los PMN; Los PMN purificados se transfirieron a Solución Salina Equilibrada de Hanks sin Ca++ ni Mg++ (HBSSw/o), ajustados a 5xl06 células/ml, y se combinaron con 2 µ? de fura2-AM (Molecular Probes, Inc, Eugene, OR) durante 45 minutos a 37 °C, CO2 al 5% como se describió anteriormente (8) . Después del marcado con fura2, las células se lavaron dos veces (15 mi de HBSSw/o), se ajustaron a 107/ml en HBSSw, y se colocaron en un espectrofluorómetro LS-50B (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) con longitudes de onda de excitación de 340 y 380 nm y una longitud de onda de emisión de 510 nm . Después de la estabilización de las lecturas de fluorescencia, se agregó leche al 0-9% a las células y se registró su respuesta. Posteriormente, se agregó 1 µ? de /MLP y los cambios resultantes en la emisión de fluorescencia se registraron continuamente. Para los experimentos que examinan las exposiciones de leche al 10%, 50% y 100%, las células marcadas con ¦ fura2 se resuspendieron en leche diluida adecuadamente, se mantuvieron a 37 °C durante 10 minutos, se lavaron dos veces, se volvieron a ajustar a 107/ml en HBSSw y se colocaron en el espectrofluorómetro . Después del equilibrio a un valor inicial estable, se agregó 1 µ? de /MLP a las células y se registró su emisión de fluorescencia continuamente durante el tiempo. Las concentraciones de Ca++ libre intracelular se calcularon como se describió anteriormente, con Rmax y Rm±n para cada condición experimental con base en la fluorescencia observada después de la lisis de las células con Tritón X-100 al 0.1% para calcular Rmax y la quelación de Ca++ con E GTA 20 mM para calcular Rmin · El aumento repentino y la calda menor de la concentración de Ca++ libre intracelular (el Ca++ transitorio) que se presentó después de las exposiciones a péptido de formilo o leche se cuantificó al medir la diferencia entre el nivel de valor inicial del Ca++ libre intracelular y la altura máxima alcanzada después de la adición de /MLP. En experimentos para examinar los efectos de múltiples adiciones de leche sobre almacenamientos de Ca++ intracelular movilizado por /MLP se siguieron 0-4 adiciones secuenciales de leche al 3% a la cubeta fluorométrica mediante una adición de /MLP, la altura del Ca++ transitorio inducido por /MLP se midió como anteriormente y se expresó como un porcentaje del control (sin adición de leche anterior) altura transitoria inducida por /MLP.

Análisis para derramamiento del receptor superficial: Los PMN purificados (107) se resuspendieron en 0.5 mi de alícuotas de diluciones de leche/HBSSw y se mantuvieron a 37°C durante 10 minutos. Los controles lácteos comprendieron alícuotas idénticas de leche diluida (sin células agregadas) y los controles plasmáticos fueron diluciones plasmáticas ± células agregadas. Después de la incubación, las células se sedimentaron (5 minutos, 14,000 x g, temperatura ambiente), y estos sobrenadantes y sus diluciones lácteas de control correspondientes se retiraron y se congelaron a -70°C hasta el momento de la prueba. Para la cuantificación del derrame del receptor, las muestras (con y sin células) se examinaron por su contenido de sTNFRI y sTNFRII mediante EASIA (Medgenix Inc, Fleures, Bélgica), y los contenidos de sIL-lRII mediante ELISA (R & D Systems, Minneapolis, MN) . Las diferencias del contenido del receptor de citosina soluble entre muestras con y sin células agregadas se tomaron como las cantidades del receptor de citosina derramado durante la exposición a leche, factor purificado, o plasma. Los experimentos se pueden conducir utilizando 2 diferentes muestras con cada preparación de PMN o una preparación de PMN diferente con cada muestra.

Análisis para cambio de forma: Los PMN purificados se ajustaron a 2xl07 células /mi y se expusieron a HBSSw, 1 µ? de /MLP, leche, fracciones lácteas, o diluciones séricas, y se mantuvieron a 37°C durante 5 minutos. Después de la incubación, las células se fijaron (formalina al 10% v/v, 25°C, 30 minutos), se sedimentaron, se retiraron de la formalina y se resuspendieron en HBSSw frió a 107 células/ml. Cinco 4 µ? de suspensión celular se combinaron 1:1 con cristal violeta al 0.1% en agua, se colocaron bajo un portaobjetos y se examinaron utilizando un microscopio invertido Olympus BH2. Las imágenes microscópicas de células se capturaron digi-talmente (400x, Connectix Color QuickCam, Connectix, San Mateo, CA) , se guardaron como archivos a escala de grises y se importaron en un software para análisis de imágenes (SigmaScan Pro, Jandel Scientific, San Rafael, CA) par medir las longitudes axiales mayores y menores (en pixeles) de todas las células capturadas en la imagen digital. A partir de estas mediciones, se calculó la proporción de eje mayor: eje menor calculada para cada célula (para células redondas, eje mayor: eje menor = 1) . Se recolectó y se midió un mínimo de 25 imágenes (54-120 células individuales) a partir de cada condición experimental, los datos se recolectaron, y la proporción axial media se tomó como la medida de la forma celular para cada muestra examinada. Estos valores medios para las mismas diluciones de cada muestra se promediaron, y los valores resultantes se tomaron como la medición de la forma celular en las condiciones de dilución de muestra respectivas.

Análisis para adherencia de PM : los PMN purificados (5xl05/ml en HBSS ) en alícuotas de 1 mi se combinaron con leche o una fracción láctea para alcanzar concentraciones de muestra final de 0% hasta 50% en 2 mi. Volúmenes de medio mililitro de esta suspensión celular se colocaron en cavidades por duplicado sobre placas para cultivo de tejidos de 24 cavidades y se agregaron 20 mg/ml (final) en miristato acetato de forbol (PMA) a una de las cavidades por duplicado. Las placas de cultivo se mantuvieron a 37 °C, C02 al 5%, durante 15 minutos, luego cada cavidad se lavó suavemente x2 con HBSSw para retirar las células no adherentes, se drenaron, y se agregaron 0.5 mi de amortiguador de ???? (bromuro de hexadeciltrimetil amonio al 0.5% en fosfato de potasio 50 mM, pH 6.0) a cada cavidad (25°C, 15 minutos) para solubilizar las células adherentes. Después de la incubación, el amortiguador de HTAB se retiró y se congelo a -70°C hasta el momento del análisis para la actividad de peroxidasa. Para calibrar el análisis, se sedimentó una alícuota de 2.5xl06 PMN, el aglomerado celular solubilizado en amortiguador de HTAB, y se tomó la actividad de peroxidasa de esta muestra para representar la actividad presente en 2.5xl06 células. Para las determinaciones de la actividad de peroxidasa, se descongelaron . los sobrenadantes del amortiguador de HTAB, se combinó 0.1 mi con 2.9 mi del amortiguador para análisis (0.167 mg de O-dianisodina HCl/ml y H202 al 0.0005% en amortiguador de fosfato de potasio 50 mM, pH 6.0) y el desarrollo de color café se siguió a OD460 utilizando un espectrofotómetro lambda-6 (Perkin Elmer Cetus, Norwalk CT) . Las lecturas de la intensidad de color se registraron cada 10 segundos durante 90 segundos, y el AOD460 sobre los 60 segundos finales se tomó como la medida de la actividad de peroxidasa en la muestra. El AOD460 observado para cada muestra experimental se dividió en entre el AOD46o - observado con 2.5xlOe células que representan el estándar para convertir los datos al porcentaje de las células que se adhieren al plástico en cada condición.

Análisis para agregación de PMN: Los PMN purificados recientemente (2xl07/ml en HBSSw) se combinaron 1:1 con leche o una fracción láctea para alcanzar las concentraciones de muestra final deseadas y se colocaron en un instrumento para estudiar in vitro agregados de plaquetas sanguínea Chrono-Log modelo 560 a 37°C con agitación continua a 500 rpm. De un experimento al siguiente, se invirtió el orden en el que se examinaron diferentes concentraciones de muestra para evitar artefactos sistemáticos debidos al enve ecimiento celular durante cada experimento. Durante el equilibrio de la temperatura, los limites superior e inferior de transmisión ligera se ajustaron a 8xl06 y 10x10a células/ml respectivamente, y se agregó /MLP (1, µ? final) a la suspensión celular para inducir la agregación. La transmisión ligera de células de agregación se registró durante 3 minutos después de la adición de /MLP, y las copias de las curvas de , agregación de la copia impresa se convirtieron a imágenes digitales utilizando un explorador de cama plana. Las imágenes resultantes se analizaron (SigmaScan Pro, Jandel Scientific, San Rafael, CA) para cuantificar el área de 3 minutos bajo la curva de agregación (en pixel2) como la medición de las respuestas de agregación en cada condición. Los experimentos control gue examinan los efectos del suero al 1%, 4%, 10%, 25% y 50% sobre las respuestas de agregación con PMN a 1 µ? /MLP mostraron que ninguna de estas concentraciones séricas tuvo ningún efecto supresor sobre la agregación de PMN. La invención se ha descrito haciendo referencia a diversas modalidades y técnicas especificas e ilustrativas. Sin embargo, se debe entender que se pueden realizar muchas variaciones y modificaciones mientras que permanezcan dentro del espíritu y alcance de la invención.

Claims (18)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. ün método para purificar un factor derivado de leche humana clarificado caracterizado porque comprende: (i) aislar una primera fracción proveniente de leche humana clarificada, en donde la primera fracción contiene componentes con un peso molecular evidente no menor a aproximadamente 1 kDa y no mayor a aproximadamente 10 kDa; (ii) retirar los componentes solubles en lipidos de la primer fracción para proporcionar una segunda fracción que incluya un componente que exhiba actividad para la inhibición de afluencia de calcio.
2. 2. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque la actividad para la inhibición de la afluencia de calcio se purifica además a partir de la segunda fracción al aislar el factor con base en hidrofobicidad .
3. 3. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque el retiro de componentes solubles en lipidos comprende extraer la primera fracción con un solvente orgánico y mantener la fase acuosa .
4. 4. Un factor purificado derivado de leche humana producido mediante el método según la reivindicación 1.
5. 5. ün método para purificar un factor derivado de leche humana caracterizado porque comprende : (i) dializar leche humana clarificada a través de una membrana de corte de 10 kDa para proporcionar un dializado como una primera fracción; (ii) dializar la primera fracción a través de una membrana de corte de 1 kDa para aislar un contenido como una segunda fracción; (iii) extraer la segunda fracción con un solvente capaz de disolver los componentes solubles en lipidos para proporcionar una tercera fracción que incluye un componente que exhibe una actividad para inhibición de afluencia de calcio.
6. 6. El método según la reivindicación 5, caracterizado porque la actividad para la inhibición de afluencia de calcio se purifica además a partir de la tercera fracción al aislar el factor con base en la hidrofobicidad .
7. 7. Un factor purificado derivado de leche humana producido mediante el método según la reivindicación 5.
8. 8. Un factor purificado derivado de leche humana : caracterizado porque el factor tiene un peso molecular evidente no menor a aproximadamente 1 kDa y no mayor a aproximadamente 10 kDa; el factor es soluble en solución acuosa y está prácticamente libre de material soluble en lipidos; y el factor exhibe una actividad para inhibición de afluencia de calcio.
9. 9. El factor según la reivindicación 8, caracterizado porque el factor es resistente al tratamiento con calor durante 10 minutos a 100°C.
10. 10. El factor según la reivindicación 8, caracterizado porque el factor es resistente a la acidificación a pH 2 durante 10 minutos a 60°C.
11. 11. El factor según la reivindicación 8, caracterizado porque el factor es resistente a alcalinización a pH 12 durante 10 minutos a 25°C.
12. 12. El factor según la reivindicación 8, caracterizado porque el factor es resistente a tratamiento con proteinasa K a 1 g/ml durante 10 minutos a 37°C.
13. 13. El factor según, la reivindicación 8, caracterizado porque el factor es estable al tratamiento de congelación/deshielo.
14. 14. El factor según la reivindicación 8, caracterizado porque el factor no produce una respuesta positiva en un análisis Lowry.
15. 15. El factor según la reivindicación 8, caracterizado porque el factor tiene un peso molecular evidente no mayor a aproximadamente 3.5 kDa .
16. 16. Un método para inhibir la afluencia de calcio en leucocitos polimorfonucleares caracterizado porque comprende administrar un factor purificado mediante el método según la reivindicación 1.
17. 17. Un método para inhibir la afluencia de calcio en leucocitos polimorfonucleares caracterizado porque comprende administrar un factor purificado mediante el método según la reivindicación 5.
18. 18. Un método para inhibir la afluencia de calcio en leucocitos polimorfonucleares caracterizado por administrar un factor purificado según la reivindicación 8.