EP0396597A1

EP0396597A1 - Verfahren zur herstellung eines therapeutisch aktiven, insbesondere zur wundheilung oder zur behandlung in der geriatrie verwendbaren wirkstoffes und ein einen solchen wirkstoff enthaltendes therapeutisches präparat

Info

Publication number: EP0396597A1
Application number: EP89901246A
Authority: EP
Inventors: Gerhard Hantich; Johanna Krenauer; Volker Eisenreich; Ernst Hesse
Original assignee: GEBRO BROSCHEK KG PHARMAZEUTISCHE FABRIK
Current assignee: GEBRO BROSCHEK KG PHARMAZEUTISCHE FABRIK
Priority date: 1988-01-13
Filing date: 1989-01-13
Publication date: 1990-11-14
Also published as: JPH03505200A; WO1989006538A1; ATA6188A; AT392003B

Description

Verfahren zur Herstellung eines therapeutisch aktiven, insbesondere zur Wundheilung oder zur Behandlung in der Geriatrie verwendbaren Wirkstoffes und ein einen solchen Wirkstoff enthaltendes therapeutisches Präparat

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines therapeutisch aktiven, insbesondere zur Wuπdheilung oder zur Be¬ handlung in der Geriatrie verwendbaren, Wirkstoffes, bei welchem defi- briniertes Blut von warmblütigen Säugetieren, insbesondere von jungen Rindern oder Kälbern, einer enzymatischen Hydrolyse mit Papain unterworfen, filtriert, das Permeat eingeengt und mit Alkohol, vorzugs¬ weise Äthanol, behandelt wird.

Seit vielen Jahren sind zahlreiche Verfahren bekannt, um aus Blut bzw. Blutfraktionen oder aus Organho ogenisateπ von Säugetieren oder Menschen Präparate mit wundheilenden, zellatmungsaktiveπ bzw. Stoffwechsel- und wachstumfördernden Eigenschaften zu extrahieren. Viel¬ fach war die genaue Zusammensetzung dieser Präparate weitgehend ungeklärt, doch hatte sich die Wirkund derselben zur Behandlung schlecht heilender Wunden, wie von Verbrennungen, Ulcus cruris u.dgl., oder zur Verbesserung der Cerebraldurchblutung als günstig erwiesen. Ein gemeinsames Merkmal der Herstellungsverfahren dieser

Präparate besteht meist darin, defibriniertes, häufig auch hämolysiertes Blut von in der Regel jungen Schlachttiereπ, vor allem Kälbern, jungen Rindern oder Pferden, auf übliche Weise von Zellsubstanzen, Mineralstoffen und/oder Eiweiß zu befreien und die Extrakte als ganzes oder Fraktionen derselben einzuengen und als Wirkstoffpräparate zu for¬ mulieren. Die Enteiweißung oder Deproteinisierung erfolgt bei den be¬ kannten Verfahren durch Erhitzen oder Zeπtrifugieren oder Filtrieren oder aber durch Einwirkung von Säuren oder Alkoholen und anschließende Zeπtrifugation und/oder Filtration der ausgefällten Proteine. Eine Deproteinisierung durch Erhitzen und anschließende Fil¬ tration mit Hilfe eines Membraπtrennverfahrens wird in der EP-A 95 170 beschrieben, wobei als Membrantreπnverfahren eine kontinuierliche mehr¬ stufige Ultrafiltratioπ unter Verwendung von Membranen mit einer Moleku¬ larausschlußgrenze von über etwa 8000 Dalton angewendet und die teil- weise Abtrennung der anorganischen Salze durch Elektrodialyse mit Mem¬ branen einer Durchlässigkeit bis zu etwa 300 Dalton durchgeführt wird. Die EP-A 140 134 beschreibt ein ähnliches Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven Extraktes aus Organen von Säugetieren und aus Zellkulturen, bei welchem das Ausgaπgsmaterial unter Aufschluß der Zellen zerkleinert, rasch auf eine Temperatur von 70 bis 90° erhitzt, abgekühlt, zentrifugiert, aus der erhaltenen Lösung durch Ultrafiltration die Substanzen mit einem Molekulargewicht von über 10.000 D entfernt und der verbleibenden Lösung durch Elektrodialyse die Salzioneπ entzogen werden. Als Beispiele für das Ausgangsmaterial für dieses*Verfahren werden Thymus, Milz, Leber und andere Organe, aber auch

10 das-Blut von Säugetieren, erwähnt.

Aus* der AT-PS 274 240 ist es bekannt, hämolysierte Blutkörperchen vom Blut junger Säugetiere, gegebenenfalls nach vollständiger Trocknung oder teilweiser Einengung auf höheren Trockeπmassegehalt, mittels

, _c . Idπeπaustauscherverfahren, Absorptioπschromatographie,

Hochspannuπgselektrophorese, Hochspaππuπgsdialyse, Gelfiltration, Düπnschichtchromatographie oder Gegeπstromverteilung in Fraktionen aufzutrennen, von denen diejenige mit einem UV-Maximum bei 245 bis 246 mμ zur Isolierung des Wirkstoffs herangezogen wird. Die wahlweise vor

„_n der Fraktionstrenπung vorgenommene Einengung oder Trocknung kann beispielsweise durch Ultrafiltration oder durch Sprühtrocknung erfolgen.

Schließlich ist es noch aus der EP-A 38 511 bekannt, daß es sich bei biologisch aktiven, zur Wundheiluπg verwendbaren Substanzen, die aus

Organen oder Körperflüssigkeiteπ von Säugetieren gewonnen werden, um

₂₅ r Glykosphiπgolipide folgender Formel handelt:

30 NH I •CH₃-(CH₂)_g-CH=CH-CH₂-C=0 worin R ein Oligosaccharid ist, welches 5 Zuckergruppeπ hat. Hiebei wird diese aktive Komponente durch Homogenisieren des Gewebes oder der Kör¬ perflüssigkeit des Säugers mit einer wässerigen o,2 %-igeπ NaCl-Lösung, ^•35 Zentι±_xιgieren oder Filtrieren dieses Homogeπisats, Ultrafiltratioπ des erhaltenen Filtrats, Einengen des Permeats, Binden des organischen Ma¬ terials aus dem konzentrierten Permeat an Aktivkohle, Desorptioπ, 1 Reinigung desselben durch mehrfaches Chromatographieren und Elution dieser organischen Stoffe gewonnen.

Parallel zu dieser Entwicklung gibt es eine Reihe von Verfahren, bei denen zur Herstellung des biologisch aktiven Wirkstoffs das defibri- 5 nierte und gegebenenfalls hämolysierte Blut vor jeder weiteren Behand¬ lung eπzy atisch hydrolysiert, d.h. einer Verdauung mit einem proteoly- tischen Enzym unterworfen wird. Proteinabbau-Produkte, die dann in die endgültigen Präparate eingehen, scheinen die Wirksamkeit der erhaltenen Produkte zu fördern und zu verbessern.

ECf Nach der US-PS 2 912 359 wird defibriniertes und hämolysiertes Blut mit proteolytischen Enzymen unter Erwärmen vorverdaut, nach dem Abkühlen zur Entsalzung dialysiert, angesäuert und der dabei erhaltene Nieder¬ schlag, der mit Lauge neutral gestellt wird, als Wirkstoff gewonnen.

Nach der DE-PS 1 076 888 wird defibriniertes Blut junger Schlacht-

1-5 tiere fermentativ abgebaut und/oder nach einer fraktionierten Deprote¬ inisierung mit aliphatischen Alkoholen oder Säuren zur Abtrennung der höhermolekularen Bestandteile einer Dialyse mit Wasser bzw. Alkoholen unterworfen. Das Dialysat wird, wenn nötig, von den organischen Lösungs¬ mitteln befreit und schonend eingeengt.

20⁾ In der DE-OS 2 349 186 wird vorgeschlagen, das nach der obigen DE-PS 1 076 888 erhaltene Präparat mit einem physiologisch verwendbaren Säure¬ additionssalz von Heptaminol-(6-Amino-2-methylheptan-2-ol) zu versetzen, um die Wirkung des Präparates zu potenzieren.

Es ist auch ein Verfahren der eingangs geschilderten Art bekannt

25 (,DE-0S 1 949 195) , bei welchem die enzymatische Verdauung bei einem pH--Wert von 5 bis 5,5 vorgenommen wird, worauf durch Erwärmung auf etwa 80°C und anschließende Filtration eine teilweise Deproteinisierung er¬ folgt. Da hiebei keine völlige Enteiweißung zu erreichen ist, wird noch eine zweite Enteiweißungsstufe verwendet, welche thermisch in

SO⁾ Anwesenheit von Papain geführt wird. Dieses Verfahren ist kompliziert und langwierig und schwierig durchzuführen. Im Endprodukt besteht eine relativ hohe Trübuπgsneigung, wenn die Präparate in flüssiger Form auf¬ bewahrt werden, die Ausbeuten sind in Bezug auf das eingesetzte Blut nicht allzu günstig und die Wirksamkeit des Wirkstoffes selbst scheint

S5 nicht überall in der gewünschten Weise gegeben.

Die Erfindung hat sich zur Aufgabe gestellt, diese Nachteile der bekannten Verfahren zu vermeiden, die Trübungsneiguπg zu beseitigen und die- Ausbeute und die Wirksamkeit des Wirkstoffes bei verbesserter Verfahreπsökonomie zu steigern. Erfindungsgemäß wird hiezu vorgeschlagen, daß die Papainhydrolyse an uπhämolysiertem Blut mit aktiviertem Papain bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,4 vorgenommen wird, daß anschließend die Reaktion durch Abkühlung gestoppt wird, daß zur Entproteinisierung und zur Entfernung des Papains bis 10.000 D ultrafiltriert wird und daß sodann das im Wesentlichen proteinfreie Permeat auf 1/25 bis 1/35, bezogen auf das eingesetzte Blut, eingeengt und' mit Alkohol versetzt mindestens 24 Stunden gekühlt stehengelassen und ^■schließlich klarfiltriert wird.

Im Gegensatz zum zuletzt beschriebenen bekannten Verfahren wird eine- enzymatische Hydrolyse an nicht hämolysiertem Blut durchgeführt und keine^' ärmebehandlung angewendet, solange noch Eiweiß in der Lösung ist. Vielmehr kommt es beim erfiπdungsgemäßen Verfahren zu einer Erwärmung lediglich bei der Einengung und gegebenenfalls noch bei einer Sterilisation des Endproduktes, wobei es jedoch in beiden Fällen zu keiner Veränderung des Produktes kommt. Während beim bekannten Verfahren durch πachgeschaltete Säulentreπnung auf aufwendige Weise eine weitere Befreiung von unerwünschten Substanzen durchgeführt wird, ist dies beim erfindungsgemäßen Verfahren nicht notwendig, was ein Grund für die unterschiedliche Wirksamkeit sein mag. Während beim bekannten Verfahren das Endprodukt ein Maximum der Molekulargewichtsverteilung im Bereich von etwa 350 bis 400 hat, liegt beim erfindungsgemäßeπ Verfahren das Molekulargewichtsmaximum wesentlich niedriger als 300. - Die Molekulargewichtsverteilung des Endproduktes des erfiπduπgsge- mäßerr Verfahrens weicht daher von jener bekannter Produkte wesentlich ab..Auch dies mag ein Grund für die unterschiedliche Wirksamkeit sein. Ein weiterer Grund hiefür dürfte aber auch darin liegen, daß beim er- findungεgemäßeπ Verfahren als Ausgangspunkt im wesentlichen unhämol^'ysiertes Blut verwendet wird, welches also die roten Blutkör¬ perchen noch unzerstört enthält. Eine geringfügige Hämolyse, welche etwa beim- Tieffrieren des Blutes eintritt, .ist auf das erfindungsgemäße Ver¬ fahren ohne Belang und hat keinen Einfluß auf das Endprodukt, wie Un¬ tersuchungen bewiesen haben. Die beim erfindungsgemäßen Verfahren ?> mittels der Ultrafiltration durchgeführte Eπteiweißung, bei welcher auch das Papain entfernt wird, da dessen Molekulargewicht größer ist als 20.000,entfernt auch das Hämoglobin (Molekulargewicht größer als 50000), 1" so daß zum Zeitpunkt des Alkoholzusatzes kein Eiweiß (Protein) mehr in der Lösung enthalten ist, da Eiweißmoleküle in der Regel ein Molekular¬ gewicht von über 12.000 haben. Es liegt daher die Vermutung nahe, daß beim erfinduπgsge äßen Verfahren die Alkoholfällung zur Entfernung hö- 5 herer Peptide dient, die beim bekannten Verfahren eine Trübung verur¬ sachen. Im Gegensatz hiezu bleibt beim erfindungsgemäßen Verfahren das erhaltene Produkt völlig trübuπgsfrei. Vorteilhaft ist auch die verein¬ fachte Verfahreπsführung, da ein Hämolyseschritt eingespart wird. Dies ist so zu verstehen, daß im Zuge der enzymatischeπ Hydrolyse mit Papain

I-CD eine Hämolyse erfolgt, so daß also die beiden Schritte der Hydrolyse und der Hämolyse in einem erfolgen. Ein späterer Wasserzusatz zur Erleich¬ terung der Ultrafiltration bzw. zur thermischen Abstoppuπg der Reaktion bewirkt keine wesentliche Hämolyse mehr.

Zudem wird ein Endprodukt erreicht, welches im Vergleich mit

•C5 bekannten Präparaten eine gesteigerte Wuπdheilungswirkuπg aufweist. Außerdem wird eine vergleichsweise verbesserte Sauerstoffutilisation er¬ reicht. Insbesondere werden die cerebrale Durchblutung und die periphere arterielle Durchblutung im Vergleich zu bekannten Präparaten gesteigert. Ferner liefert das erfindungsgemäße Verfahren überraschend hohe Aus-

ZLX beuten bezogen auf die eingesetzte Blutmenge und ist verfahrenstechnisch äußerst wirtschaftlich.

Ein weiterer wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die Möglichkeit besteht, die klarfiltrierte Mischung auf die gewünschte Konzentration zu standardisieren, vorzugsweise durch

25ό Verdünnung.

Beim erfindungsgemäßeπ Verfahren wird vorzugsweise defibriniertes Blut von Schlachttieren, insbesondere von Kälbern oder jungen Rindern (Ms maximal 3 Jahre) als Ausgangsmaterial verwendet. Dieses Blut wird mit einer aktivierten Papainlösung vorverdaut. Hiebei wird zur Vorbe-

3Ö-- handlung handelsübliches Papain in destilliertem Wasser suspendiert und durch Zentrifugieren von etwaigen Feststoffen befreit. Handelsübliches Papain hat ein ungefähres Molekulargewicht von 25.000, es enthält aber auch niedermolekulare Substanzen mit einem Molekulargewicht bis unter 10..000. Um zu vermeiden, daß diese niedermolekularen Stoffe aus dem

3S Papaiπ in das eπdültige Wirkstoffkonzentrat gelangen, wird die wässerige Suspension ultrafiltriert. Das Konzentrat wird dann mit Cysteinlösung versetzt, wodurch das Papain aktiviert und als Inkubationslösung ver- wendet wird.

Das Blut, das gegebenenfalls in gefrorener Form aufbewahrt war und in diesem Fall vorher aufgetaut wird, wird im Inkubationskessel auf 35 - 42°C erwärmt, der pHWert mit 1 N HC1 auf 6,5 - 7,4 eingestellt und mit der Inkubatioπslösung vorzugsweise etwa 14 bis 18 h inkubiert. Das fertig inkubierte Blut wird mit frischem aqua dest.ad inject mit einer Temperatur von 0 - 10°C kalt versetzt, wodurch die enzy¬ matische Hydrolyse bzw. Vorverdauung unterbrochen und die Masse für die Ultrafiltration verdünnt wird. Vor der Ultrafiltratioπ wird zum Schutz des. Ultrafilters meist vorfiltriert, um Teilchen mit einer Größe von •- 50 μm abzutrennen.

Anschließend erfolgt die Ultrafiltration, während welcher in regelmäßigen Abständen Proben zur Überprüfung der Filterdichtheit mittels Trichloressigsäurefällung gezogen werden. Die Ergebnisse müssen negativ sein. Durch die Ultrafiltration wird praktisch das gesamte Eiweiß aus der Lösung entfernt. Dies konnte durch eine Mole¬ kulargewichtsbestimmung mittels einer SDS-Gelelektrophorese bestätigt werden. Zweckmäßig wird ab der Ultrafiltration unter aseptischen Bedingungen weitergearbeitet. Das erhaltene Permeat wird so rasch wie möglich im

Vakuumverdampfer bei 60 - 80°C auf 1/25 - 1/33 des ursprünglichen Blutvolumeπs eingeengt. Dabei kommt es wieder zu Ausfälluπgεn, die über ein Filter abfiltriert werden. Doch wird durch diese starke Einengung die Wahrscheinlichkeit von Nachfällungen weitgehend herabgesetzt. Das - filtrierte Konzentrat wird nun mit einer etwa 2 1/2-fachen Volumsmeπge vorgekühlten 96%-igen Äthanols versetzt und in der Kälte, vorzugsweise bei: Kühlraumtemperatur (4 - 6°C) , stehen gelassen. Anstelle von Äthanol kann auch Methanol, Propanol oder Butaπol verwendet werden. Nach einer Stehzeit von mindestens 24 h, vorzugsweise etwa 48 h, wird X klarfiltriert, was mit Hilfe eines Schwarzbandfilters erfolgen kann. Der zur Fällung zugesetzte Alkohol wird dann im Rotavapor abdestilliert. Dabei kommt es meist nochmals zu einer Ausfällung, die über Schwarzbaπd- und Glasfaservorfilter klarfiltriert wird.

Durch die starke Einengiπg vor der Alkoholfälluπg wird es möglich, nur mehr eine Trockeπgewichtseinstellung auf etwa 200 mg/ml durch Ver¬ dünnung mit der entsprechenden Menge frischen Wassers für Injektionszwecke durchzuführen. ^•*^■■• Das fertige Wirkstoffkoπzentrat wird über ein Sterilfilter und nochmals durch ein Ultrafilter filtriert und anschließend in sterile

Flaschen abgefüllt. Im Allgemeinen ist die Sterilfiltration im Hinblick auf eine Keimentfernung stets erforderlich, wenn der Alkohol abgezogen

5 . wird. Die Klarfiltration erfolgt zur Entfernung der Ausfälluπgen.

Durch die Ultrafiltration vor derÄikoholfälluπg^■ wird vermieden, daß unwirtschaftlich große Alkoholmengen eingesetzt werden. Die Manipulation kleinerer Mengen ist stets einfacher und daher billiger.

Durch die Alkoholfällung werden aus der Lösung höhere Peptide

L-0-^' abgetrennt, welche im Endprodukt durch Agglomeratbildung Ausfällungen bzw. Trübungen verursachen könnten. Es wird dabei ein Produkt erhalten, das im flüssigen Zustand äußerst stabil ist und keinerlei Nachfällungen im pharmazeutischen Endprodukt zeigt, auch wenn dieses bei höheren Temperaturen, z.B. etwa 120°C, autoklavisiert wird.

-C5 Die Einengung auf mindestens 1/25 - 1/33 des ursprünglichen Blutvolumeπs erfolgt, um das Produkt nach der Alkoholfällung nicht mehr weiter einengen zu müssen. Es wird daher nach der Alkoholfällung nur mehr der Alkohol abgedampft und die Masse auf das entsprechende Trockengewicht verdünnt.

2*© Obwohl eine Molekulargewichtsbestimmung mittels SDS-Gelelektrophorese für Moleküle mit einem Molekulargewicht von mehr als 10.000 negativ ausfällt, ist es vorteilhaft, zum Abschluß noch eine zweite Ultrafiltration durchzuführen, um ein verläßlich sauberes, steriles und pyrogenfreies Endprodukt zu erhalten. Verluste hinsichtlich

2^*5^*" der Ausbeute treten hiebei nicht auf.

Es hat sich herausgestellt, daß es ohne Zwischenschaltung einer Äl oholfällung bei längerer Lagerung des Wirkstoffes oder der verdünnten Ämpullenlösung zu Trübungen und Ausfällungeπ durch Peptid-Agglomerationen kommt, deren Bildung durch Schütteln der Lösung

SCI^* bei 50°C oder durch Lagerung der Lösung im Kühlschrank bei 5°C auf weni¬ ge Tage verkürzt werden kann. Wird die Ultrafiltration erst nach der Älkoholfällung vorgenommen, so kann trotz der oben erwähnten Aufkonzentrierung der positive Effekt auf die Haltbarkeit ohne Trübung des Wirkstoffes nicht mehr festgestellt werden. Eine weitere Möglichkeit

S^*******^* zur Feststellung der Ausfällungstendenz besteht in der Autoklavieruπg des Fertigproduktes bei 121°C. Hier kommt es ohne Durchführung der Äl¬ koholfällung zur Trübung nach einigen Tagen bis Wochen. ^■**• Ein weiterer Vorteil des Verfahrens liegt darin, daß durch die entsprechende Vorbehandlung mit Papain und die VcraTteiweißung mittels Ul- trafiltratioπ überraschenderweise ein Produkt erhalten wird, das im

Vergleich zu den im Handel befindlichen Präparaten wesentlich höhere

5 Ausbeuten an aktiver Substanz bei gleichen Blutmengen ergibt.

Wie bereits erwähnt, weicht die Molekulargewichtsverteiluπg beim in erfiπduπgsgemäßer Weise hergestellten Produkt wesentlich von je¬ ner in bekannter Weise hergestellter Produkte ab. Dies wurde durch Ver¬ gleichsversuche festgestellt, wobei als Vergleichsprodukte folgende Pro- Q- dukte verwendet wurden:

Vergleichsprodukt I: Ein im Handel erhältliches, eiweiß- und pyro- genfreies Produkt, das aus dem Blut schlacht¬ reifer Kälber gewonnen wird. Vergleichsprodukt II: Ein anderes, im Handel befindliches Produkt, 15 hergestellt im wesentlichen nach dem Verfahren gemäß der DE-PS 1076888. Vergleichsprodukt III:Ein Produkt hergestellt nach dem Verfahren nach der DE-OS 1949 195. Methode: Zσ Säule: TSK 2000 SW, 0,75 x 60 cm.

Vorsäule: Merck Hiber 100 Diol, 0,4 x 25 cm Probenvolumen: 20 ul

Pumpe: LKB 2150 HPLC-Pumpe mit Rheodyne Injektor Fluß: 0,5ml/min 255 Pbratome er: LKB 2138 Uvicord S, 280 nm Schreiber: Servogor S, 30 cm/h Mblekulargewichtsstaπdard:

Substanz Molekulargewicht Retentioπszeit (min)

Tyrosin 181,19 49,6

Sft∑ Insulin Chain a 2,660 41,8

Ovalbumiπ 45.000 33,5

Die Ergebnisse sind in Fig.l im Vergleich zu den Meßergebnis¬ sen des erfiπdungsgemäßeπ Produktes (IV) dargestellt. Die Diagramme zeigen hiebei die volle Absorption AFS (absorptioπ füll scale) in Abhän- 35: g gkeit von der Retentioπszeit RT.

Die Vergleichsprodukte I und II zeigen jeweils nur ein einzi¬ ges Hauptmaximum bei einer Retentioπszeit von 47,8 bzw. 48,2 min. Dies entspricht einem ungefähren Molekulargewicht von 350 - 400. Das Ver- 1* gleichsprodukt I weist je eine Schulter bei einer Reteπtionszeit von

49,3 min und 56,1 min (entspricht-_*✓ MG 200 bzw. MG <100) auf, das Ver¬ gleichsprodukt II hingegen nur eine Schulter bei RT 56,2 (~MG<100) . Die gesamten beim Versuch detektierbareπ Substanzen zeigen sich in einem Be- 5 reich von MG<100 bis MG-v 2.500. Das Vergleichsprodukt III zeigt hingegen zwei Hauptmaxima, eines bei RT = 48,4 min (MG~300), das zweite bei RT = 52,4 min (MG<150) , und weiters im niederen MG-Bereich (<100) drei Schultern.

Das erfindungsgemäße Präparat (IV) unterscheidet sich UCC wesentlich von den bisher genannten Substanzen. Es weist drei deutliche Maxi a auf, wobei das erste Maximum in einem niedrigeren Molekύϊ^rgewichtsbereich als bei den vorher genannten Präparaten liegt, nämlich ungefähr bei MG 200. Dies wird wahrscheinlich durch die zusätz¬ liche Äthaπolfällung erreicht. Die beiden anderen Maxima befinden sich 115 bei MG <150 bzw. MG<100. Außerdem zeigt das erfinduπgsgemäße Präparat im niedermolekularen Bereich keine Schultern, hingegen zwei im höhermoleku¬ laren Bereich bei MG 500 bzw. MG 300.

Die in den Kurven für die Vergleichspräparate I und II links der Maxima aufscheinenden Mebenmaxima sind durch die Konservierungsmit- 20) tel bedingt und gehören somit nicht zum jeweiligen Präparat.

Die genauen Meßergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 zuammengefaßt:

Tabelle 1: £.. Maxima 255 Reteπtionszeit ungefähres Molekulargewicht

(min)

SEGO Vergleic-hspräparat m 48,4 52,4 300 150 e f indungsgemäßes Präparat IV 49,6 52,0 56,2 200 150 100 2. Schulter

Reteπtioπszeit ungefähres Molekulargewicht (min)

Vergleichspräparat I Vergleidτspräparat II Visrgleichspräparat m erfinduπgsgemäßes Präparat IV ^: 3.blekula__gewicht der gesamten beim Versuch detektierbaren Substanzen

Reteπtionszeit ungefähres Molekulargewicht

(min)

Vergleichspräparat I 43,0 - 58,5 2500- <100 Vergleidispräparat H 40,4- 59,2 2700 - <100

Vergleichspräparat in 39,8 - 67,2 3000 - <100 eα±indungsgemäßes Präparat IV 39,5 - 63,5 3000 - <100

Das erfindungsgemäß hergestellte Produkt wurde ferner in verschiedenen Test- und Untersuchungsreihen auf seine Wirksamkeit in therapeutischer Hinsicht geprüft. Die genauen Versuchsbedingungen werden später angegeben.

Bei der Untersuchung der Wirkung des Präparats auf die Inkorporation von ³H-Thymidin in DNA von menschlichen Fibroblasten und Leberzelleπ zeigte sich, daß das Präparat im Verhältnis zu bekannten Produkten eine wesentlich stärkere (5 bis lOfache) Wirkung auf das Wachstum sowohl von Fibroblasten als auch von Leberzelleπ hat. Hiefür wurde die regenerierende Wirkung des erfinduπgsgemäß hergestellten Präparates auf menschliche Vorhaut-Fibroblasteπ untersucht, die durch Entzug von fötalem Kälberserum geschädigt waren. Als Ergebnis zeigte sich, daß das erfiπduπgsgemäße Präparat unter Steigerung der DNA-Synthese eindeutig regenerierend auf geschädigte menschliche Fibroblastenzellen wirkt und daß dabei die Konzentrationsbereiche ebenso wie der Hemmbereich ähnlich wie bei bekannten Produkten sind. Für diese Untersuchungen wurden menschliche Vorhaut-Fibroblasten in der 8. 5^'- bis 10. Passage mit variablen Mengen an dem erfindungsgemäßen Produkt bzw.. dem bekannten Vergleichspräparat I versetzt und der ³H-Thymidiπ-Eiπbau in DNA gemessen. Um die Zellen zu stressen, wurden sie-nach Ausplotten zunächst auf 1/2 bis 2/3 Koπfluenz anwachsen gelassen und dann in künstlichem Medium ohne Zusatz von fötalem Kälber- S- seruπτ. einem essentiellen Mediumbestaπdteil, für 6 bis 9 Stunden inku¬ biert. Dann wurde das Medium gewechselt gegen ein solches, welches nur geringe Mengen fötales Kälberserum enthielt sowie steigende Mengen an erfiπdungsgemäßem Präparat sowie ³H markiertes Thymidin bzw. an dem Ver¬ gleichspräparat I. 5- Dieser Ansatz wurde 12 bis 24 Stunden inkubiert und die Radioakti¬ vität in der DNA-Fraktion nach entsprechendem Aufarbeiten der Zellen bestimmt.

Fig.2 der beiliegenden Zeichnung zeigt die Ergebnisse in Diagramm- form, wobei mit vollen Linien die Meßkurve für ein erfiπduπgsgemäßes Produkt dargestellt ist, mit strichlierteπ Linien jene für das bekannte Vergleichspräparat I. Auf der Abszisse ist hiebei die Präparatzugahe ^• in Mikroliter angegeben, auf der Ordinate die radioaktive Zählungsmeπge. 5 Bei der Bestimmung der regenerierenden Wirkung auf menschliche Hepatoma-Zellen, die ebenfalls durch Entzug von fötalem Kälberserum geschädigt worden waren, zeigte sich ebenfalls eine ausgesprochen günstige Wirkung unter Steigerung der DNA-Synthese. Die Untersuchungs¬ methodik entsprach jener bei der zuvor beschriebenen Fibroblastenun-

ICC tersuchung, jedoch wurde die Steigerung lediglich gegenüber uπbehandelteπ Kontrollen gemessen. Fig.3 zeigt die Meßergebnisse für das erfindungsgemäße Präparat.

Die Untersuchung der Steigerung der Zellatmung von Leberzellen, welche nach der Homogenisatioπ eine relativ geringe bzw. relativ hohe

15 Eigenatmuπg aufweisen, zeigte, daß das neue Präparat eine stärkere Aktivierung hervorzurufen vermag als das bekannte Vergleichspräparat. Im Bereich maximaler Atmungssteigeruπg wirken beide Präparate in vergleichbarem Ausmaß. Die Messung erfolgte hiebei mittels der bekannten Warburgmethode (beschrieben in der GB-PS 824 375) . In der folgenden Ta-

20⁾ belle sind die Meßergebnisse für drei Ansätze von verschiedenen Leber- ho ogeπaten angegeben, wobei ein Vergleich sowohl mit dem bekannten Ver¬ gleichspräparat I durchgeführt wurde, als auch gegenüber Messungen ohne^' Präparatzugabe.

Tabelle 2:

25

SEGD höhen (z.B. Teiluπgsaktivität geschädigter Fibroblasten oder Zunahme des zellulären, mitochondrialen Sauerstoffsverbrauchs). Diese zellaktivie- reπden Effekte können z.B. im Rahmen der Wundheilung als erwünscht ange- S5 sehen werden. Unerwünscht hingegen wäre die Aktivierung von neoplasti¬ schen Zellen. Untersuchungen zeigten, daß im Gegensatz zum bekannten Vergleichspräparat I das erfindungsgemäße Präparat den Sauerstoffver- 1 - brauch von Tumorzellen (Mäuse-Aszitestumorzellen) nicht aktiviert. Dies wurde im folgenden Experiment überprüft, bei welchem die Sauerstoffakti- vität von Mäuse-Aszitestumorzellen nach Zugabe des erfindungsgemäßen Präparates bzw. des Vergleichspräparates I untersucht wurde: 5 Messung des SauerstoffVerbrauchs: mittels "Clark"-Elektrode Suspen¬ sionspuffer: Na₂HP0₄0.04 Mol/1, NaCl 0,08 Mol/1, gCl₂ 0.005 Mol/1, pH 7,4 (3 ml pro Kammer)^* Aszitestumorzellen: nach H0RNYKIEWICS und SATKE- EICHLER (Arzneimittelforschuπg 6, 1956) 0,1 bzw. 0,05 ml pro Kammer; erfinduπgsgemäßes Präparat: Iπjektioπslösung, Q._ 40 mg;Trockengewicht/ml (0,2 ml/Kammer)

Vergleichspräparat I: Ampullen, Haπdelspräparat (0,2 ml/Kammer)

In Fig.4 sind die Ergebnisse für das erfindungsgemäße Präparat (IV) sowie für das Vergleichspräparat (I) graphisch dargestellt. Für das er- finduπgsgemäße Präparat IV wurde hiebei ein Mittelwert aus sechs Be- 55 Stimmungen ermittelt, für das Vergleichspräparat I ein Mittelwert aus vier Bestimmungen. Es zeigt sich, daß im Gegensatz zum Vergleichspräpa¬ rat I das erfindungsgemäße Präparat (IV) die Sauerstoffaktivität (zellu¬ läre Atmung)voπ Mäuse-.Aszitestumorzellen nicht nur nicht steigert, son¬ dern sogar eine Verringerung der Säuerstoffaktivität bewirkt. 0 Besonders überraschend ist, daß sich beim Einsatz der erfindungs¬ gemäß hergestellten Präparate in der Geriatrie an Patienten mit cerebralvaskulärer Insuffizienz bei einer Behandlung über vier Wochen eine deutliche Besserung bei der Flimmerfrequenzanalyse zeigt, weiters bei einem durch einen Bewertuπgsscore ermittelten psychischen

255 Gesamteiπdruck und beim geriatrischeπ Bewertungsschema nach Gottfries und:Gö LCries. Es eignet sich das neue Präparat also auch ausgezeichnet zurrsymptomatischen Behandlung von psychopathologischeπ Begleiterschei¬ nungen-der cerebralvaskulären Insuffizienz.

Weiters wurden Untersuchungen nach der WARBURG-Methode vorgenommen,

30 ) um zu erfahren, inwieweit das erfindungsgemäß hergestellte Präparat tat¬ sächlich eine Steigerung des 0-,-Stoffwechsels hervorruft. Es wurde dabei das erfindungsgemäß hergestellte Präparat mit zwei handelsüblichen Pro¬ dukten (Vergleichspräparat I und II) verglichen. Bei allen drei Präpa¬ raten trat eine ausgeprägte Atmungssteigerung im Rattenleberhomogeπisat

35. auf , wobei in Abhängigkeit von der Menge und/oder dem Zustand der akti¬ ven-Zellbestandteile die Ergebnisre beim einen bekannten Präparat und deπr erfindungsgemäß hergestellten Präparat ähnlich bis für das erfin- 1 dungsgemaß hergestellte Präparat deutlich besser, beim anderen bekannten Präparat jedoch um bis zu 20 % herabgesetzt waren.

Es zeigte sich, daß beim nach dem erfindungsgemäßeπ Verfahren hergestellten Präparat im Vergleich zum erstgenannten bekannten Präparat

5 die 4-fache und im Vergleich zum zweitgenannten bekannten Präparat die

1,4-fache Ausbeute an Wirkstoff bei gleicher M.enge eingesetzten Blutes erhalten werden konnte.

Schließlich wurde eine Messung des cerebralen Blutflusses bzw. der periphereπ arteriellen Durchblutung (an der Oberschenkelarterie) bei -Q- Pavianen, die einem künstlichen Sauerstoffmangel ausgesetzt wurden, durchgeführt. Eine solche Messung stellt ein anerkanntes Modell zur Eva¬ luierung von Medikamenten dar, welche die Gehirπdurchblutung bzw. die arterielle Durchblutung (besonders in den Beinen) , beeinflussen (Meyer J.S., Ishikawa S., Lee T.K., J. Neurosurg. 21, 524 (1964)). *5 Bei einer vergleichenden Untersuchung zeigt sich, daß das erfin- duπgsgemäße Präparat (IV) (4 ml/kg Körpergewicht intravenös als Iπjek- tionslösung) gegenüber dem bekannten Vergleichspräparat I (4 ml/kg Körpergewicht intravenös als Injektionslösung) sowohl die cerebrale als auch die periphere Durchblutung beim Pavian deutlich stärker fördert. 0^' Die Meßergebnisse sind für die cerebrale Durchblutung in Fig.5 dargestellt, für die periphere arterielle Durchblutung in Fig.6.

Andere Herz-Kreislauf-Parameter (Blutdruck, Herzfrequenz, Gefäß- widerstaπd) änderten sich nicht oder nur geringfügig, sodaß das erfin¬ dungsgemäß hergestellte Präparat eine spezifische pharmakologische Wir- kung auf die erwähnten Durchblutungsbereiche ausübt.

Das erfindungsgemäß hergestellte Konzentrat kann zur Verwendung in der Therapie nach an sich bekannten Methoden zu Injektioπslösuπgen, Tab¬ letten, Dragees, Wundsalben oder -gelen verarbeitet werden. Erfiπdungs- gemäße therapeutische Präparate, die insbesondere Wuπdheilmittel oder ® geriatrische Präparate sein können, enthalten ein Konzentrat, gegebenen¬ falls nach dessen Trocknung, das nach dem zuvor beschriebenen Verfahren hergestellt wurde.

Im folgenden werden genauere Herstellungsangaben und die Beschrei¬ bung der Untersuchungsverfahreπ und ihrer Ergebnisse für das erfiπdungs- 5 gemäß hergestellte Präparat angegeben.

Papaiπvorbehandlung und -aktivierung: Eine Vorbehandlung des Pa- pains ist zweckmäßig, um unlösliche Substanzen abzutrennen und um -zu* 1. zu vermeiden, daß niedermolekulare Substanzen (MG — 10.000) aus dem Pa¬ paiπ in das Wirkstoffkonzentrat gelangen.

200 g Papayotin (Fa. Extrakt-Chemie/Aktivität: 80 E/mg) werden in 11 a.d. suspendiert und anschließend zentrifugiert (Zentrifuge: Sorvell 5 RC-3, Rotor: HG-4L: 3.000 rpm. 20 min).

Vorfiltration für Ultrafiltration (die Lösung soll frei von Teil¬ chen > 10 μm sein) über: Schwarzbaπdfilter oder Rundfilter 595, Glas¬ faservorfilter (Fa. Sartorius) , 8 μm Membranfilter (Fa. Sartorius) Ultrafiltratioπ: Gerät Pellicon Kassettensystem Fa. M-llipαre N>EG: 10.000 0- Probevolumeπ nach Zentrifugation und Vorfiltration - ^* 0,77 1 Koπzentratvolumen: 0,38 1 Durchflußrate: 60 ml/min

Das Konzentrat wird mit Cysteinlösung (3 g Cystein in o,62 1 a.d.) auf^' 11 verdünnt = aktivierte Papaiπlösuπg (= Inkubationslösung) 5- Zur erfindungsge äßeπ Herstellung der neuen Wirkstoffe wird nun folgendermaßen vorgegangen: Rohstoffe.

100 1 durch Rühren defibriniertes Blut von Kälbern oder jungen Rin¬ dern (bis ax. 3 Jahre alt) 0 11 aktivierte Papainlösung HCL 1 N Äthanol 96 % aqua dest. ad. injectionem Inkubation: Das aufgetaute Blut wird im Inkubationskessel auf 37°C 5- erwärmt, der pH-Wert mit 1 N HC1 auf 7,0 eingestellt. Anschließend wird die::Ihkubationslösung zugegeben und man läßt 14 bis 18 h inkubieren. Das fertig inkubierte Blut wird mit frischem a.d. 1:1 verdünnt und für die anschließende Ultrafiltratioπ vorfiltriert.

Vorfiltratioπ: Teilchengröße — 50 μm;Gerät: Seitz Platteπfilteran- 0: läge für 7 Filterschichteπ Seitz Supra 300.

Ultrafiltration: Gerät: Millipore Ultrafilter, Filterfläche: 4,6 m² , NMG

10.000

Ausgangsvolumeπ :-~2001;Durchflußrate: ~0,71/min.

Das Konzentrat wird bei -^ 60 1 mit 30 1 a.d.verdünnt und man fil- 5- triert: nochmals bis auf -*->--20 - 25 1 Retentat. Gesamtfiltrationsvolumen: 205^~ - 2101. Nach 30, 100 und 2001 Permeat werden jeweils Proben zur Überprüfung der Filterdichtheit mittels TCA-Fällung (muß negativ sein!) gezogen. 1 Einengung im Verdampfer: Das Ultrafiltrat wird so rasch als möglich im Verdampfer bei 60 - 80°C auf 3 - 4 1 Endvolumen unter Vakuum aufkon-

1 1 zentriert (Aufkoπzentrierung auf 25 ~ 33 ^des ursprünglichen

Blutvolumens). Dabei kommt es zu starken Ausfälluπgeπ, die über ein

5^" Schwarzbaπdfilter abfiltriert werden. Man konzentriert so hoch, um die

Wahrscheinlichkeit von Nachfällungen zu verringern.

Äthanolfällung: Das filtrierte Konzentrat wird nun in die 2,5-fache

Menge (10 1) vorgekühlten Äthanol 96 Vol.-% eingerührt und in der Kälte

(Kühlraumtemperatur: 4 - 6°C) stehenlassen. Nach einer Stehzeit von 48

1*0^' Stunden wird klarfiltriert.

Verwendete Filter: Schwarzbandfilter, Glasfaservorfilter (Fa. Sartorius) Der zur Fällung zugesetzte Äthanol wird im Rotavapor abdestilliert. Da¬ bei kommt es meist nochmals zu einer Ausfälluπg. In diesem Falle wird die Klarfiltration über Schwarzband- und Glasfaservorfilter wiederholt.

T5 Durch die starke Einengung vor der Äthanolfällung ist nun nur mehr eine Trockeπgewichtseinstellung auf 200 mg/ml durch Verdünnung mit der ent¬ sprechenden Menge frischen Wasser für Injektionszwecke notwendig.

Das fertige Wirkstoffkonzentrat wird über ein Sterilfilter (0,2 μm Membranfilter, Fa. Sartorius) und nochmals durch ein Ultrafilter (NMGG:

2D_ 10.000) filtriert und anschließend in sterile Flaschen abgefüllt. Dieses Wirkstoffkonzentrat ist Ausgangsbasis für die Herstellung von Ampullen, Infusionslösungen, Tabletten, Dragees, Kapseln, Salben, Gels usw. Bevor¬ zugte galenische Formen sind Pulver oder Granulate, die in Hart- oder Weichgelatinekapseln abgefüllt sind.

25 Beispiel 1:

10 1 Rinderblut werden am Schlachthof durch Rühren defibriniert. Die Fibrinflocken werden durch^' ein Sieb abfiltriert. Das Blut wird in kleinen Portionen (4 - 5 1) eingefroren und erst kurz vor der Verarbeitung wieder aufgetaut. Zur Inkubation wird der pH-Wert mit HC1

•333⁾ auf 7,0 eingestellt, mit 20 g vorbehandeltem aktiviertem Papain versetzt und 15 Stunden bei 37°C unter Rühren stehengelassen. Die Vorbehandlung des Papains dient der Reinigung von handelsüblichem Papain .(∑r.B.Papayotin, Fa. Extrakt-Chemie, 80.000 E/g) . 20 g handelsübliches Papaiπ werden in 200 ml a.d. suspendiert und anschließend wird zentrifu¬ giert. Der Überstand wird für die anschließende Ultrafiltratioπ vorfil¬ triert. Die Lösung soll frei von Teilchen > 10 μm sein. Bei der Ultra¬ filtration wird bis auf 50 ml Konzentrat filtriert und anschließend zur 1 Aktivierung des Papaiπs mit Cysteiπlösung (300 mg Cysteiπ in 151 ml a.d.) verdünnt auf insgesamt 200 ml. Das Ultrafiltrat wird verworfen. Das inkubierte Blut wird in 10 1 vorgekühltes destilliertes Wasser ge¬ rührt. Das verdünnte Blut wird für die Ultratiltration über eine Plat- 5 teπfilteranlage für 7 Filterschichten vorfiltriert und anschließend durch ein Ultrafilter mit einer Molekulargewichtsgrenze von 10.000 Dalton filtriert und sofort auf 360 ml eingeengt. Die durch das Aufkoπzentrieren ausgefallenen Substanzen werden durch Filtration über ein Schwarzbaπdfilter abgetrennt. Das eiweißfreie Filtrat wird in 900 ml 10. vαrgekühltem Äthanol 96% eingerührt und im Kühlschrank bei 7°C stehengelassen. Die Überprüfung auf Eiweißfreiheit erfolgt im Schnelltest mit Trichloressigsäure. Nach mindestens 48 Stunden Stehzeit werden die Ausfällungen abfiltriert und der Alkohol im Rotavapor abgezogen. 15 Das so erhaltene Produkt wird mit sterilem, pyrogeπfreiem Wasser auf einen Trockeπsubstaπzgehalt von 200 mg/ml verdünnt und aseptisch in sterile Flaschen abgefüllt. Aπalyseπdateπ: pH-Wert 6,1

20 Dichte (g/ml.) 1,0760

Chlorid*^' 2,56

Natrium* 1,94

Kalium* 0,16

Ausbeute* 10,9

25 Osmolalität (mosm/kg) 3.110

Aktivität (Warburg)** + 32,1 %

SDS -Elektrophorese: frei von Substanzen mit MG > 10.000

* g aus 1 kg Blut

** Differenz gegen Referenzstandard so:

Beispiel 2 50 1 Kälberblut werden am Schlachthof durch Rühren defibriπiert. Die Fibriπflocken werden durch ein Sieb abfiltriert. Das Blut wird sofort wie in Beispiel 1 aufgearbeitet. -.-.- Aπalyseπdateπ: pH-Wert 6,0

Dichte (g/ml) 1,0840 1 Chlorid * 2,28

Natrium* 1,60

Kalium* 0,14

Ausbeute* 8,3

5 Osmolalität (mosm/kg) 3.725

Aktivität (Warburg)** 35,8 %

SDS Elektrophorese: frei von Substanzen mit MG > 10.000 * g aus 1 kg Blut

**Differenz gegen Referenzstandard ID. Beispiel 3:

1011 Rinderblut werden am Schlachthof durch Rühren defibriniert. Die Fibrinflocken werden durch ein Sieb abfiltriert. Anschließend wird mit HC1 der pH-Wert auf 7,1 eingestellt, mit 20 g gemäß Beispiel 1 vor¬ behandeltem aktivierten Papain 14 Stunden bei 37°C inkubiert und das iπ- E5- kubierte Blut mit dest. Wasser 1:1 verdünnt. Zur Abtrennung aller Teilchen > 10 μm wird durch ein Plattenfilter vorfiltriert und anschließend erfolgt. eine Ultrafiltration bei einer Abscheidegrenze von 10.000 Dalton. Das eiweißfreie Ultrafiltrat (überprüft mittels Fällung mit Trichloressigsäure) wird im Rotatioπsverdampfer auf ca. 350 ml ZΩ. eingeengt, mit 900 ml Äthanol versetzt und 48 Stunden im Kühlschrank ge¬ lagert. Die ausgefallenen Substanzen werden durch Filtration abgetrennt und der Alkohol wird im Vakuumverdampfer abdestilliert. Dieses Konzentrat wird auf 400 ml verdünnt sterilfiltriert und aseptisch in Ampullen abgefüllt. 25 Analysendaten: pH-~Wert 6,1

Dichte (g/ml) 1,0912

Chlorid* 1,68

Natrium * 1,19

333⁾ Kalium* 0,11

Ausbeute 6,0

Osmolalität (mosm/kg) 3.635

Aktivität (Warburg)** 28,3 %

SDS-Elektrophorese: frei von Substanzen mit MG > 10.000 35 * g aus 1 kg Blut

** Differenz gegen Referenzstandard 18

1 Beispiel 4:

10' 1 defibriniertes frisches Rinderblut wird mit HC1 auf pH 6,5 einge¬ stellt, mit 20 g gemäß Beispiel 1 vorbehandeltem aktivierten Papain bei Raumtemperatur 18 Stunden inkubiert und anschließend unverdünnt ultra- 5 filtriert. Das eiweißfreie Ultrafiltrat wird im Vakuum erdampfer auf 300 ml auf onzentriert, mit 0,75 1 Äthanol versetzt und anschließend 24 Stunden im Kühlschrank gelagert. Der Niederschlag wird durch Zeπtrifugation oder Filtration abgetrennt und der Alkohol im Rotavapor abgedampft. Das Konzentrat wird mit sterilem, pyrogenfreiem Wasser auf 0^' 200 mg Trockensubstanz/ml eingestellt und in sterile Flaschen abgefüllt. Beispiel 5: Das gemäß Beispiel 1 bis 4 hergestellte Konzentrat wird mit Aqua ad inject. auf 40 mg/ml verdünnt, der pH-Wert nochmals überprüft bzw. auf 6,9^" eingestellt und nochmals zur Entpyrogeπisierung mit einem Ultra- 5 filter mit einer Abscheidegrenze bei MG 10.000 filtriert. Diese Injek¬ tionslösung wird unter aseptischen Bedingungen in 2 ml, 5 ml bzw. 10 ml Ampullen abgefüllt.

Beispiel 6: Das laut Beispiel 1 bis 4 hergestellte Konzentrat wird mit Aqua ad 0 inject. auf einen Trockenstoffgehalt von 50 - 70 mg/ml eingestellt und lyophilisiert. Tabletten werden hergestellt, indem 500.0 glyophilisier . Konzentrat 1.987,5 g Methylcellulose 12,5 g Mg-Stearat 25. vermischt und zu 250 mg Tabletten verpreßt werden. Da das lyophilisierte Konzentrat extrem hygroskopisch ist, muß die Tablettierung unter trocke¬ ner: Raumluft (<20 % relative Feuchte) erfolgen. Die Kerne werden mit einem speichelresisteπten, weißen Film überzogen, indem für 750 g Kerne 30U g Sprühlösuπg bestehend aus: 30: 12,0 g Eudragit E 100

1,5 g POlyäthylenglykol 6.000 91,8 g Opaspray white, K 1-7000 (50 % Festetϊ_faπte_ ,Fa.θDlαrcoπ) 97,5 g Isopropanol 97,5 g Methylenchlorid 35-: aufgesprüht werden.

Beispiel 7: 1,25 1 des laut Beispiel 1 bis 4 hercjestellteπ Konzentrats werden auf 1 kg Granulat bestehend aus 98 % Methylcellulose und 2 % Gelatine, sehr lang- •k sam aufgesprüht. Das so erhaltene Granulat wird bei 60°C in einem Trockeπschrank mit Umluft für mindestens 18 Stunden nachgetrocknet. Nach Erreichen einer Restfeuchte von max. 0,5 % wird das Granulat mit o,5 % Mg-Stearat vermischt und zu 250 mg Tabletten verpreßt. & Die Tabletten werden analog Beispiel 6 überzogen. Beispiel 8: Für die Herstellung eines Wundgels mit einem Trockenstoffgehalt des nach Beispiel 1 bis 4 hergestellten Wirkstoffkonzeπtrats von 8 mg/g Gel werden 1-0 1. 75,0 g Methylcellulose 4.000 cps

2. 210,o g Propylenglykol

3. 90,0 g Polyäthylenglykol

4. 120,0 ml Wirkstoffkonzentrat

5. 4,5 g p-OH Benzoesäuremethylester E5 6. 0,9 g p-OH Benzoesäurepropylester

7. 2.496,6 g Aqua dest. derart zu einem Gel verarbeitet, daß von 1., 2. und 3. eine Dispersion hergestellt wird und diese in 1.800 ml heiße wässerige Phase (worin 5. und 6. gelöst sind) eingearbeitet wird. Mit dem restlichen H-,0 wird das . 2^Q> Wirkstoffkonzentrat verdünnt, sterilfiltriert und dem Gel bei 50°C Ab¬ kühltemperatur hinzugerührt.

25

EEffi

SS

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e :

1. Verfahren zur Herstellung eines therapeutisch aktiven, insbeson¬ dere zur Wundheiluπg oder zur Behandlung in der Geriatrie verwendbaren Wirkstoffes, bei welchem defibriniertes Blut von warmblütigen Säuge- tieren, insbesondere von jungen Rindern oder Kälbern, einer eπzymati- schen Hydrolyse mit Papain unterworfen, filtriert, das Permeat eingeengt und mit Alkohol, vorzugsweise Äthanol, behandelt wird, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die Papainhydrolyse an unhämolysiertem Blut mit aktivier¬ tem Papaiπ bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,4 vorgenommen wird, daß an- schließend die Reaktion durch Abkühlung gestoppt wird, daß zur Eπtproteiπisierung und zur Entfernung des Papains bis 10.000 D ultrafil¬ triert wird und daß sodanh das im Wesentlichen proteinfreie Permeat auf 1/25^{^} bis 1/35, bezogen auf das eingesetzte Blut, eingeengt, mit Alkohol versetzt mindestens 24 Stunden gekühlt stehengelassen und schließlich klarfiltriert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die klar¬ filtrierte Mischung auf eine vorbestimmte Konzentration, z.B. 200 mg/ml, mit destilliertem Wasser verdünnt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß aus der klarfiltrierten Mischung der Alkohol entfernt wird, vorzugsweise durch Abdampfung.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeich¬ net,, daß die Abstoppung der Reaktion durch Verdünnung mit kaltem destillierten Wasser vorgenommen wird, vorzugsweise mit einer Temperatur von 0 bis 5°C.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Ver¬ dünnung im Ausmaß von etwa 1:1 vorgenommen wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeich¬ net, daß vor der Ultrafiltratioπ eine Vorfiltration zur Abscheidung von Teilchen mit einer Größe von mehr als 50μm vorgenommen wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeich¬ net, daß die Einengung des Permeates in einem Vakuumverdampfer bei einer Temperatur von 60 bis 80°C durchgeführt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeich- - net, daß vor dem Alkoholzusatz nochmals eine Filtration erfolgt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkoholzusatz im Ausmaß von etwa 65 bis 80 Vol.-%, vorzugsweise etwa 70 Vol.-% der entstehenden Mischung erfolgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung bei einer Temperatur von 4 bis 6°C stehengelassen wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß für die Papainhydrolyse das Papain durch Ultrafiltration von Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 10.000 befreit und mit Cystein aktiviert wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekeπn- ^*0 zeichnet, daß die Papainhydrolyse bei einem pH-Wert von etwa 7 und einer

Temperatur von etwa 37°C während 14 bis 18 Stunden erfolgt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die Stehzeit nach der Älkoholfällung 24 bis 55 Stunden, vorzugsweise etwa 48 Stunden beträgt. *5

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die klarfiltrierte Mischung nach Verdünnung nochmals ste¬ rilfiltriert und bzw. oder ultrafiltriert wird.

15. Wirkstoff, insbesondere für die Wundheilung oder zur Behandlung der Geriatrie, hergestellt mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 0 bis 14.

16. Verfahren zur Herstellung therapeutischer Präparate, insbeson¬ dere zur Wundheilung oder für die Geriatrie, dadurch gekennzeichnet, daß man nach einem der Ansprüche 1 bis 14 hergestellte Konzentrate zu Injek¬ tionslösungen, Tabletten, Dragees oder Wundsalben oder -gelen verar- 5 beitet.

17. Therapeutisches Präparat, insbesondere Wundheilmittel oder ge- riatrische Präparate, enthaltend ein nach einem der Ansprüche 1 bis 14 hergestelltes Konzentrat.

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