DK167845B1 - Maelke-vaekstfaktor eller et salt deraf, fremgangsmaade til fremstilling deraf, kombinationer deraf med polypeptider samt farmaceutiske og kosmetiske praeparater med indehold deraf - Google Patents

Description

i DK 167845 B1

Den foreliggende opfindelse angår en mælke-vækstfaktor eller et salt deraf, en fremgangsmåde til fremstilling deraf, kombinationer af mælke-vækstfaktoren og et vil-5 kårligt polypeptid, som udøver en agonistisk virkning ved binding til EGF-receptorer, samt farmaceutiske og kosmetiske præparater med indhold af mælke-vækstfaktoren eller et salt deraf.

Mælke-vækstfaktoren ifølge den foreliggende opfindelse er 10 en polypeptidvækstfaktor fra mælk, som kan anvendes til at fremme og accelerere sårheling og vævsgendannelse, undertrykkelsen af immunrespons, cancerbehandling og stimulering af væksten hos mennesker eller pattedyr og af cellekulturer. Dette polypeptid betegnes i nærværende beskri-15 velse som "Milk Growth Factor" (MGF).

Vækstfaktorer kan defineres som polypeptider, der stimulerer cellevækst og celleformering ved meget lave koncentrationer gennem specifikke celleoverfladereceptorer med høj affinitet. Denne virkning fremkalder andre intracel-20 lulære signaler, som resulterer i næringsoptagelse, DNA-syntese og celledeling, og som til sidst fører til cellevækst. Der er fundet vækstfaktorer i forskellige legemsvæv og legemsvæsker, såvel hos det voksne individ som hos fostret, og de antages nu at afgives af størsteparten 25 eller måske alle celler i kulturer, jf. oversigtsartiklen af A.S. Goustin et al. (1986), Cancer Research, 4j5, 1015. Vækstfaktorer som sådan virker sædvanligvis ikke endocrint, men defunderer formentlig over korte afstande gennem intercellulære rum eller virker autocrint eller 30 paracrint.

Mælk er en sådan legemsvæske, som indeholder faktorer, der simulerer cellevækst i kultur. Det har vist, at forskellige celletyper, herunder epithelceller, normale og transformerede fibroblaster, glatte muskelceller og chondrocy-35 ter, formerer sig i blodserumfrit dyrkningsmedium tilsat

UK 10/540 B I

2 mælk, jf. M. Klagsbrun (1980), J. Cell Biol., 84, 808, K.S. Steimer og M. Klagsbrun (1981), J. Cell Biol., 88, 194, A. Sereni og R. Baserga (1981), Cell. Biol. Int.

5 rep., 5, 338. En sådan virkning er konstateret i mælk og colostrum, som er den mælk, der dannes i løbet af de første dage efter fødslen, fra mennesker (M Klagsbrun (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5057) og køer (K.S. Steimer et al. (1981), J. Cell Physiol., 109, 223).

10 I de seneste år har man isoleret en lang række faktorer fra mælk, som er blevet oprenset til et homogent produkt, i forsøg på at karakterisere deres struktur og biologiske funktion.

En af de tidligste og bedre karakteriserede vækstfaktorer 15 er "Epidermal Growth Factor" (EGF), som er et polypeptid med en molekylvægt på ca. 5 kd, og som har virkning på væksten og formeringsevnen hos forskellige celler og væv såvel in vitro som in vivo. Det har endvidere vist sig, at EGF er det væsentligste vækstfremmende middel i humanmælk 20 (G. Carpenter (1980), Science, 210, 198, og P.E. Petrides et al. (1985), FEBS Letters 187, 89), komælk (H. Yagi et al. (1986), Acta Scand. Paed. 75, 233) og musemælk (J.M. Beardmore og R.C. Richards (1983), J. Endocrinol. 96, 287). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

To faktorer med betegnelsen "Mammary Derived Growth 2

Factor" (MDGF) er også blevet isoleret fra mælk. Human 3 MDGF-I er et polypeptid, som er følsomt over for reduk 4 tionsmidler, og som har en molekylvægt på ca. 62 kd og et 5 isoelektrisk punkt (pi) på 4,8 (M. Bano et al. (1985), J.

6

Biol. Chem. 260, 5745). I picomolære koncentrationer 7 stimulerer det væksten af mammaceller og forstærker deres 8 co11agenproduktionsniveauer. MDGF-II er også følsomt over 9 for disulfidreduktionsmidler, men har en lavere molekyl 10 vægt på ca. 17 kd og et pi på 4,4 (J.A. Zwiebel et al.

11 (1986), Cancer Research, 46, 933). Ved anvendelse af elueringspuffere med høj ionstyrke kan MDGF-II skilles fra DK 167845 B1 3 human-EGF på en TSK-3000SW gelfiltreringssøjle, selv om det stadig konkurrerer med radioaktivt mærket 125j_egf vedrørende binding til EGF-receptoren på A431 human 5 epidermoide carcinoma-cellemembraner. MDGF-II stimulerer endvidere den forankringsuafhængige vækst af normale rottenyreceller (NRK) i blød agar, som er den fastliggende egenskab ved en "Transforming Growth Factor (TGF)", og det er sandsynligt, at MDGF-II hører til TGF-a-familien, da 10 molekyler af den større TGF-/?-type ikke binder til EGF-receptoren.

Det er endvidere beskrevet, at humanmælk og komælk indeholder forskellige sæt vækstfaktorer. Shing og Klagsbrun (1984, Endocrinol., 115, 273) har isoleret tre 15 arter vækstfaktorer fra human mælk, og de betegnes HMGF-I, HMGF-II og HMGF-III. HMGF-III synes at udgøre 75% af den totale vækstfaktoraktivitet i humanmælk udtrykt ved DNA-syntese. HMGF-III har en molekylvægt på ca. 6 kd, et pi på 4,4-4,7 og er ufølsomt over for behandling med 20 reaktionsmidler. Sammenligningsundersøgelser antyder, at dette molekyle formentlig er EGF. Under anvendelse af de samme adskillelsesprocesser har ovennævnte forskere også vist, at bovint colostrum ikke indeholder dette molekyle, skønt det indeholder en væsentlig vækstfaktorkomponent, 25 som har en molekylvægt på 30-35 kd, og som inaktiveres ved behandling med reduktionsmidler. Denne såkaldte "Bovine Colostrum Growth Factor" (BCGF) ligner i biokemisk henseende HMGF-II, som er en anden forbindelse, som dækker ca. 20% af den totale vækstfaktoraktivitet i humanmælk. 1 2 3 4 5 6 "Colony Stimulating Factor" (CSF), som stimulerer knogle 2 marvscelleformering in vitro, og som bevirker differen 3 tiering af "Colony Forming Granulocytic Macrophage" 4 progenitorceller (CFU-GM), er også blevet isoleret fra 5 humanmælk (S.K. Sinha og A.A. Yunis (1983), Biochem.

6

Biophys. Res. Comm. 114, 797). Denne faktor, som ikke findes i komælk eller kocollostrum, er heller ikke følsom

UIV I O / 0τ·0 D I

4 for indvirkningen af reduktionsmidler. Gelfiltreringsforsøg og forsøg med isoelektrisk fokusering har indiceret, at den biokemisk adskiller sig fra andre CSF'er og 5 har en molekylvægt på 240-250 kd og et pi på 4,4-4,9.

Der findes en række andre vækstfaktorer eller beslægtede faktorer, som skal omtales i forbindelse med den foreliggende opfindelse, og som er blevet udvundet fra andre kilder end mælk.

10 TGF-β-Molekyler afledt af humane blodplader, humant placenta og oksenyre, er beskrevet i international patentansøgning W084/01106 og EP offentliggørelsesskrift nr. 0.128.849. I EP-patentskrift nr. 0.169.016 og US-patent-skrift nr. 4.627.982 beskrives den delvise rensning af to 15 proteiner fra demineraliseret okseknogle (CIF-A og CIF-B), som er co-faktorer til fremkaldelse af bruskdannelse. CIF-B (TGF-/32) har vist sig at inhibere inflammatorisk cellefunktion in vivo (EP 213.776) og at have inhiberende virkning in vitro på formeringen af tumorceller (EP 20 271.211). Begge disse såkaldte "Cartilage Inducing

Factors" er virksomme, når de kombineres med EGF i TGF-/3-analysen. En af disse faktorer (CIF-A) har en N-terminal sekvens, som for de første 30 aminosyrers vedkommende er identisk med den N-terminale sekvens hos 25 TGF-/3 udvundet fra human placenta, men som er signifikant forskellig fra den N-terminale sekvens hos CIF-B (jf. også oversigtsartiklerne af M. Sporn (1986), Science, 233, 532, og J. Massagué, Cell 49, 437-438 (1987)).

CIF-B [S.M. Seyedin et al. (1987), J. Biol. Chem. 262; 30 1946, EP 169.016] ligner eller er måske identisk med to andre vækstfaktorer, som er blevet omtalt i den senere tid. S. Cheifets et al. (1987), Celle, 48: 409, har beskrevet en faktor, som er blevet isoleret fra blodplader fra svin, og som betegnes TGF-/32, da den har en anden 35 N-terminal aminosyresekvens end den oprindelige TGF-/3 fra DK 167845 B1 5 svin (som nu betegnes TGF-01 i den videnskabelige litteratur) isoleret fra den samme kilde. Senere har M. Wrann et al. (1987), EMBO J. 6: 1633, isoleret en faktor 5 fra humane glioblastomaceller, som er immunosuppressiv over for T-lymphocyter, og som betegnes G-TsF. CIF-B, TGF-02 og G-TsF har den samme aminosyresekvens ved N-terminalen op til aminosyre 19. CIF-B og TGF-02 har samme molekylvægt på ca, 26 kd, hvorimod G-TsF har en 10 molekylvægt på 12,5 kd. En human TGF type 02 (hTGF-02) med en molekylvægt på 24 kd bestående af to disulfidbundne tilsyneladende identiske polypeptidkæder er blevet isoleret fra den humane prostataadenocarcinomcellelinie tilsat tamoxifen, jf. H. Marquardt et al., J. Biol. Chem.

15 262, 12127-12131 (1987) og T. Ikeda et al., Biochem. 26, 2406-2410 (1987).

En vækstinhibitor BSC-1 GI, som kaldes polyergin, udvundet fra BSC-l-nyreceller fra grøn afrikansk abe, er blevet identificeret og oprenset af R.W. Holley et al., Proc.

20 Natl. Acad. Sci. USA, bind 75, side 1864-1866 (1978) og R.W. Holley et al., ibid, bind. 77, side 5989-5992 (1980).

R.F. Tucker et al.. Science, bind 226, 705-707 (1984) har vist, at dette stof har en biologisk virkning, som er næsten identisk med virkningen af TGF-01, og H.J. Ristow, 25 ibid, bind 83, side 5531-5533 (1986) har vist, at det er en kraftig inhibitor af thymocytisk formering. Ud fra cDNA'et fra et BSC-1 celle-cDNA-bibliotek har det for nylig vist sig, at aminosyresekvensen for BSC-1 GI er identisk med aminosyresekvensen for TGF-02 [S.J. Hanks et 30 al., Proc. Natl. Sci. USA, bind 85, side 79-82 (1988)].

Disse vækstfaktorer er hidtil ikke blevet påvist i mælk.

Selv om man allerede har isoleret, karakteriseret og klonet en række polypeptidvækstfaktorer, har der kun været foretaget få undersøgelser af disse materialers aktivitet 35 in vivo, hovedsagelig som følge af de relativt små mængder, som er til rådighed for sådanne forsøg. Et

UK IO/OH-3 D I

6 vigtigt indikationsområde for den potentielle anvendelse af den omhandlede vækstfaktor er fremskyndelsen af sårheling. Til trods for at der findes mange præparater 5 til behandling af sår, findes der stadig et stort antal patienter, især ældre patienter, hvis sår (herunder læsioner, brandsår, liggesår og sår som følge af sukkersyge) enten heler langsomt eller slet ikke vil hele. Sådanne patienter udgør en målgruppe, som det er umagen 10 værd at behandle med et farmaceutisk præparat, som fremmer og accelererer sårhelingsprocessen. Typer på mindre sår er sår i munden, især på gummerne, og endvidere sår fremkaldt f.eks. af barberblade i ansigtet eller på andre dele af kroppens overflade. Stimulering af væksten hos mennesker 15 eller pattedyr, f.eks. ved behandling af dværgvækst, og af cellekulturer in vitro er også mulige anvendelsesområder for den omhandlede vækstfaktor.

Det har overraskende vist sig, at den omhandlede vækstfaktor også har hæmmende virkninger på visse celletyper, 20 nemlig cellerne i immunsystemet samt cancerceller.

Det er indlysende, at der er et stort behov for behandling ved disse indikationer.

Det er formålet med opfindelsen at tilvejebringe en poly-peptidfaktor, som findes i mælk, og som betegnes "Milk 25 Growth Factor" eller "MGF", en fremgangsmåde til opkoncentrering, udvinding og rensning deraf, samt præparater, som indeholder faktoren, og som kan anvendes til at fremme celleformering, migrering og vævsgendannelse i mennesker og pattedyr samt til at undertrykke immunrespons og 30 formeringen af kræftceller og at stimulere vækst og formering af celler in vitro. Det er desuden formålet at tilvejebringe synergistiske blandinger, som indeholder vækstfaktoren og et aktiveringsmiddel.

Den foreliggende opfindelse angår en "Milk Growth Factor" DK 167845 B1 7 (MGF) i beriget eller opkoncentreret og ren form og salte deraf, og vækstfaktoren ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at den kan udvindes fra mælk eller mælkeprodukter, 5 har en molekylvægt på ca. 25 kd bestemt ved SDS-PAGE samt et ioelektrisk punkt pi mellem 9,0 og 10,5.

Det i forbindelse med den foreliggende opfindelse anvendte udtryk "Milk Growth Factor" (MGF) omfatter en hvilken som helst beriget eller opkoncentreret eller renset, herunder 10 delvis renset form af denne faktor. Opkoncentreringen kan svare til en koncentrationsforøgelse fra ca. 10^ til over 107, og faktoren kan have en renhed på op til 100%. MGF’en indeholder stort set ingen andre vækstfaktorer, som kan findes i mælk, og har en lavere eller højere molekylvægt 15 og et andet pi end andre vækstfaktorer, såsom EGF eller HMGF III (6 kf), MDGFI (62 kd), MDGF II (17 kd), BCGF (30-35 kd) eller CSF (240-250 kd).

Mælke-vækstfaktoren ifølge den foreliggende opfindelse er især MGF fra komælk i stort set ren form med følgende 20 aminosyresammensætning.

UIV ΙΟ/ΟΜ-Ο D I

8

Aminosyre Aminosyrer/mol a) b) ASP + ASN 21,10 20 5 GLU + GLN 24,68 24 SER 19,00 18 THR 10,02 10 GLY 10,62 10 ALA 14,64 14 10 ARG 9,50 10 PRO 12,92 12 VAL 10,68 10 MET 0,16 2 ILE 11,04 10 15 LEU 22,40 22 TRP ikke bestemt PHE 7,78 8 CYS 11,16 12 LYS 16,14 16 20 HIS 5,84 6 TYR 13,38 14 [a): antal mol aminosyre pr. mol peptid, b): afrundet til antal aminosyrerester pr. mol peptid ] og følgende N-terminale aminosyresekvens 1 5 10 is

Ala-Leu-Asp-Ala-Ala-Tyr-Cys-Phe-Arg-Asn-Val-Gln-Asp-Asn-Cys-Cys-X17- 25 19 -X18-Pro, hvori χ!7 Dg χ18 er ubestemte aminosyrer, og salte deraf.

DK 167845 Bl 9

Molekylvægten er bestemt ved hjælp af natriumoxiddodecyl-sulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge U.K. Laemmli, (1970) 5 Nature, 227, 680. Det isoelektriske punkt er bestemt ved hjælp af fremgangsmåden beskrevet af R.R. Bilrk (1980) i "Control Mechanisms in Animal Cells", side 245-257, Raven Press, New York. Dette polypeptids kationiske natur skyldes tilstedeværelsen af basiske aminosyregrupper, 10 såsom arginin, lysin og histidin. MGF er et varmestabilt, syrestabilt polypeptid, som er følsomt over for reduktionsmidler, såsom mercaptoethanol, dithiothreitol og deres salte. Behandling af MGF med sådanne midler indicerer, at molekylet er sammensat af to underenheder, 15 som ligner hinanden eller er identiske, som hver har en størrelse på ca. 12,5 kd, og som formentlig holdes sammen af en eller flere cysteindisulfidbindinger, der spaltes ved behandling med de ovenfor omtalte midler.

Iagttagelsen af, at MGF ikke synes at være artsspecifik 20 med hensyn til dens fremmende virkning på cellemigration og celleformering, understøtter den antagelse, at molekylet bevares i vid udstrækning hos de forskellige pattedyrarter og antages derfor at være homolog i væsentlig grad med andre molekyler i denne familie. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 I denne sammenhæng omfatter udtrykket "homolog i væsentlig 2 grad" anvendt på et polypeptid de molekyler, som enten de 3 er dannet nativt, syntetisk eller ved rekombination, 4 uanset art eller oprindelse, har samme aminosyresekvens 5 som MGF, og polypeptider med i det væsentlige homolog, men 6 forskellig aminosyresekvens, hvor forskellene ikke påvir 7 ker krydsningsartsaktivitet på uheldig måde. I overens 8 stemmelse hermed kan polypeptidet ifølge opfindelsen, MGF, 9 der oprindeligt er isoleret fra komælk, godt være udvundet 10 af mælk, som stammer fra andre pattedyr, eller være dannet 11 ved rekombinant DNA-teknologi. Komælk er en foretrukken naturlig kilde for MGF, da komælk er let tilgængelig i

UIV 10/040 D I

10 store mængder, hvorved der ikke lægges begrænsninger på den mængde faktor, som kan fremstilles under anvendelse af de beskrevne rensningsmetoder.

5 Til analytisk brug tørres prøver af homogen MGF (50-100 pmol), og de hydrolyseres i lukkede, evakuerede rør ved 150°C i to timer i 100 μΐ konstant kogende 6 N saltsyre indeholdende 0,1% flydende phenol. Halvcystein og methionin bestemmes ved oxidation med permyresyre 10 efterfulgt af sur hydrolyse. Analyser af o-phthalaldehyd-derivater af aminosyrerne gennemføres på en modificeret aminosyreanalysator forsynet med et fluorimeter og en computerintegrator.

Antallet af aminosyrerester pr. mol MGF er baseret på en 15 tilsyneladende molekylvægt på 25.000 Dalton.

Til aminoterminalsekvensanalyse reduceres ca. 500 picomol (Mr 25.000) MGF, og der S-carboxymethyleres med dithio-threitol og iod-[ ]eddikesyre i nærværelse af 6 M guanidin-HCl i 1 M Tris-HCl-puffer, pH 8,4. Overskud af 20 reagenser adskilles fra carboxymethyleret protein ved hjælp af HPLC på en 5 μ 50 x 4,6 mm søjle elueret med en gradient på 0-90% acetonitril, 1% pr. minut, i 0,1% TFA.

Det samlede udbytte er 96%, baseret på en skønnet proteinmængde bestemt ved aminosyreanalyse under anven-25 delse af fluorescindetektion.

Automatiseret Edman-nedbrydnng gennemføres på ca. 500 pmol (Mr 12,500) af det S-carboxymethylerede protein med et gasfasesekvenseringsapparatur. PHT-Aminosyrer identificeres under anvendelse af et HPLC-system. Begyndelsesudbyt-30 tet er ca. 30% og gentagelsesudbyttet ca. 90%. Resultaterne indicerer, at sekvensen af i det mindste de første 19 N-terminale aminosyre i hver af de to underenheder af MGF er identiske og bekræfter iagttagelserne af et enkelt proteinbånd af den reducerede form af MGF ved hjælp af DK 167845 B1 11 SDS-PAGE.

Analyse af bovint MGF ved hjælp af SDS-PAGE antyder, at nogle af disulfidbindingerne er bindinger mellem kæder.

5 På grund af dens basiske grupper kan den nye vækstfaktor danne syreadditionssalte med uorganiske eller organiske syrer. Til rensningsformål foretrækkes vand- og/eller alkoholuopløselige salte, såsom tetraphenylboratet, Ca-,

Al-, Zn-salte og lignende.

10 Til farmaceutiske formål anvendes farmaceutisk acceptable salte, såsom vandopløselige metal- eller ammoniumsalte, især alkalimetal- eller jordalkalimetalsalte, f.eks. natriumsaltet, kaliumsaltet, magnesiumsaltet eller calciumsaltet, eller ammoniumsalte med ammoniak eller en 15 egnet organisk amin. Der foretrækkes syreadditionssalte med en uorganisk syre, f.eks. hydrogenchloridsyre, svovlsyre eller phosphorsyre, eller med en organisk syre, især en organisk carboxylsyre eller sulfonsyre, f.eks. en lavalkancarboxylsyre eller -dicarboxylsyre, f.eks.

20 myresyre, eddikesyre, citronsyre, trifluoreddikesyre og lignende syrer.

MGF'en ifølge opfindelsen er endvidere defineret ved hjælp af dens biologiske egenskaber.

De vækstfremmende virkninger ved MGF i dens forskellige 25 renhedsgrader bestemmes i overensstemmelse med analysemetoden beskrevet af R.R. Btirk (1973), Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 70: 369, hvormed man måler antallet af normale Balb/C 3T3-fibroblastceller (eller stammer afledt deraf), som migrerer ind i en såkaldt "såret" monolagskultur af 30 cellerne i nærværelse af et MGF-holdigt serumfrit medium, sammenlignet med antallet af celler, som migrerer i fravær af MGF eller andre kendte polypeptidvækstfaktorer.

12

Dosisresponsforsøg under anvendelse af denne analysemetode har vist, at koncentrationer af helt renset MGF på så små som 40 ± 35 picogram pr. ml kulturmedium er tilstrækkelige 5 til at fremkalde 50% af det maksimale migreringsrespons. Denne MGF-koncentration fremkalder også 50% af det maksimale migreringsrespons ved denne analysemetode, når der som indikatorcelletype anvendes en human hudepithel-cellelinie (NCTC 2544).

10 MGF er endvidere karakteriseret ved dens stimulerende virkning på cellulær DNA-syntese og celledeling, som viser sig i monolagskulturerne, når de iagttages under et lysmikroskop. Denne virkning måles ved en af følgende to fremgangsmåder: 15 a) Optælling af antallet af cellekerner i et vilkårligt givet synsfelt i kulturer af cellerne dyrket i nærværelse af serumfrit MGF-holdigt medium, sammelignet med antallet af optalte cellekerner i et vilkårligt synsfelt i kulturer dyrket i fravær af MGF eller andre 20 kendte polypeptidvækstfaktorer.

b) Måling af størrelsen af optagelsen af radioaktivt mærket [ 3h ]-thymidin i kulturer af cellerne dyrket i nærværelse af MGF-holdigt serumfrit medium sammenlignet med størrelsen af optagelsen af [ ]-thymidin i kul-25 turer dyrket i fravær af MGF eller andre kendte polypeptidvækstf aktorer .

Den vækstfremmende virkning ved MGF er kun en egenskab ved den dimere form af molekylet på 25 kd. Denne aktivitet kan genfindes i supernatanteluaterne fra gelskiver indeholden-30 de dimeren efter SDS-PAGE og eluering natten over i 50 millimolær myresyre under en nitrogenatmosfære. Der kan ikke genfindes nogen aktivitet i eluater fra gelskiverne, som indeholder 12,5 kd monomerf ormen. Den vækstfremmende virkning ved MGF er også tydelig ved afprøvning i celle- DK 167845 B1 13 kulturer fra andre pattedyr og af en anden type end Balb/c 3T3-fibroblasttypen, hvilket tyder på, at det vækstfremmende respons på MGF udvundet af komælk ikke er 5 artsspecifik af natur.

MGF er desuden karakteriseret ved, at det virker synergistisk i nærværelse af EGF. Denne synergisme er påvist ved hjælp af en analysemetode til in vitro-induktionen af "Anchorage Independant Growth of Normal Rat 10 Kidney (NRK) Cells" i blød agar (A.B. Roberts et al.

(1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 5339). Denne analysemetode kaldes sommetider "Transforming Growth Factor type Beta" (TGF/3)-analysen, da TGF-/3 (til forskel fra TGF-α) ikke konkurrerer med EGF med hensyn til binding 15 til membranreceptor steder, men kræver besættelse af de andre "activating agent"-receptorsteder til induktionen af cellekolonier. I denne forbindelse er forekomsten i mælk af proteiner med en sådan synergistisk virkning med EGF ved denne analysemetode ikke blevet beskrevet. MGF alene 20 er ikke tilstrækkelig til at fremkalde dannelsen af store kolonier af NRK-celler i blød agar, men vil kun være i stand hertil i nærværelse af murin-EGF. I nærværelse af EGF i en koncentration (5 ng/ml), som alene ikke er tilstrækkelig til at fremkalde en tydelig virkning ved 25 denne analysemetode, inducerer MGF stor kolonidannelse ved tilsætning i et koncentrationsinterval på fra 0,1 til 500 ng/ml.

Selv om picomolære koncentrationer af MGF er tilstrækkelig til at fremme migreringen og formeringen af normale Balb/C 30 3T3-fibroblastceller in vitro, indtræder et synergistisk respons i nærværelse af murin-EGF. Ved analysemetoden beskrevet af R.R. Btirk (1973), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70: 369, har man påvist, at det maksimale migreringsre-spons på MGF (over et koncentrations interval på fra 10 til 35 100 pg/ml) i nærværelse af 3,16 mg/ml murin-EGF er op til 30 gange større end i fravær af EGF.

14

Opfindelsen angår også en kombination, især en synergistisk kombination, af MGF og et vilket som helst polypeptid, som udøver en agonistisk virkning ved binding 5 til EGF-receptor. Foruden EGF selv er et polypeptid f.eks. TGF-α. En sådan kombination er særlig nyttig til behandling af dybere sår, f.eks. som fremkaldt ved større ulykker eller kirurgiske indgreb. Der foretrækkes en ækvimolær kombination af MGF og EGF.

10 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstillingen af mælke-vækstfaktor (MGF) eller et salt deraf er ejendommelig ved, at MGF udvindes fra mælk eller et hvilket som helst mælkeprodukt, som indeholder MGF, og, om nødvendigt, omdannes dannet fri MGF til et salt eller et dannet salt 15 omdannes til den fri MGF.

Den omhandlede vækstfaktor udvindes ved anvendelse af konventionelle fremgangsmåder fra en vilkårlig kilde til frisk mælk eller mælkeprodukt, som indeholder faktoren. Foretrukne MGF-kilder er især mælk eller mælkeprodukter, 20 især fra oksefamilien, f.eks. køer, geder, får og lignende. En anden kilde er kommercielt tilgængeligt mælkepulver, såsom tørret skummetmælkspulver.

Nærmere beskrevet udvindes vækstfaktoren ved at underkaste mælkekilden forskellige kromatograferingsbehandlinger, 25 især kationbytterkromatografi, hydrofob vekselvirknings-kromatografi, størrelsesudelukkelseskromatografi, poly-acrylamidgelelektroforese og/eller, om nødvendigt, andre rensningsprocesser. Det er fordelagtigt at sætte en proteaseinhibitor, såsom phenylmethansulfonylfluorid til 30 den MGF-holdige kilde.

Fremgangsmåden til isolering af MGF fra frisk komælk omfatter trin med f.eks. kationbytterkromatografi, hydrofob vekselvirkningskromatografi og størrelsesudelukkelseskromatografi under anvendelse af en kombination af DK 167845 B1 15 såvel lavtryks- som højtryksteknik. Prøveportioner, som opsamles fra de enkelte efterfølgende separationstrin, og som udviser biologisk virkning ved den ovenfor omtalte 5 cellemigreringsanalyse på Balb/C 3T3-celler, hældes sammen og føres til det næste separationstrin. Prøvemateriale fra hver af de sammenbiandinge fraktioner underkastes en dosisresponsanalyse (under anvendelse af den samme bioanalysemetode på cellerne), hvorved det bliver muligt 10 at skønne over det rumfang materiale, som er nødvendigt for at fremkalde 50% af det maksimale migreringsrespons. Dette rumfang defineres her som "en enhed" og ud fra denne værdi sammen med værdierne for rumfang af materialet i hver enkelt aktiv pool, kan man beregne 15 rensningsudbytterne, de udvundne mængder og den specifikke aktivitet i hvert trin af processen. Homogenitet af den rene MGF fra det afsluttende rensningstrin kan påvises ved hjælp af 1) konstant specifik aktivitet 20 2) migrering som et enkelt bånd på ca. 25-25 kd ved SDS-

PAGE

3) konstant aminosyresammensætning 4) konstant aminosyresekvensanalyse.

Udvindingen af MGF gennemføres især ved, at man behandler 25 fortyndet mælk indeholdende vækstfaktoren eller en vandig suspension af mælkepulveret med en kationbytterharpiks, vasker harpiksen med den påsatte faktor med et puffersystem af natriumdihydrogenphosphat (10 mm) pH 7,0, eluerer faktoren fra harpiksen med et puffersystem 30 bestående af kaliumdihydrogenphosphat (20 mm) i 40% ethanol, pH 7,6, underkaster faktoren, især i form af et syreadditionssalt deraf, hydrofob vekselvirkningskromatografi, størrelsesudelukkelseskromatografi og polyacryl-amidgelelektroforese og, om ønsket, yderligere 35 rensningstrin og, om ønsket, omdanner den opnåede vækstfaktor i form af basen til et salt eller omdanner den opnåede vækstfaktor i form af et salt til den fri base

UIV ΙΟ/ΟΗ-Ο D I

16 eller til et andet salt.

Inden kromatograferingen kan man fjerne frit og andre upolære materialer fra mælken eller mælkepulveret, f.eks.

5 ved ekstraktion med et upolært organisk opløsningsmiddel, såsom methylenchlorid, eller i tilfælde af et mælkepulver med acetone. Mælk fortyndes i destilleret vand i et forhold mellem mælk og vand på fra ca. 1:3 til 1:10, fortrinsvis ca. 1:4, på rumfangsbasis.

10 Mælkepulveret suspenderes i destilleret vand i et forhold mellem pulver og vand på fra ca. 1:5 til 1:20, fortrinsvis ca. 1:10, på vægtbasis.

Til kationbytterkromatograferingen kan anvendes en hvilken som helst egnet kationbytterharpiks, f.eks. harpikserne af 15 "Bio Rad AG 50W"®-rækken, harpikser af "Amberlite IR"®-rækken, "Zeocarb 22S”, harpikser af "Diaion SK"-rækken og harpikser af "Dowex AG 50W"-rækken. Ionbyttere i form af ombyttelige modgrupper bundet til faste matrixbærere (i form af skiver eller patroner) kan også anvendes, f.eks.

20 kationbyttere af "Zetaprep 3P"-rækken.

En foretrukken kationbytterharpiks er "Dowex AG 50W X2" 50-100 mesh. Harpiksen kan vaskes inden anvendelsen med acetone, ethanol og/eller vand. Efter påsætning af en kation, f.eks. en alkalimetalkation, såsom natrium eller 25 kalium, ved behandling med det tilsvarende metalhydroxid, f.eks. et alkalimetalhydroxid, vaskes harpiksen neutral, hvorpå den ækvilibreres til pH-værdien 7,0 med en egnet puffer med lav ionstyrke, fortrinsvis en natriumdihydro-genphosphatpuffer (10 mM). Den friske eller rekonstitue-30 rede mælk indstilles på samme pH-værdi med det samme alkalimetalhydroxid, hvorefter den bringes i kontakt med harpiksen. Den belastede harpiks vaskes med den samme puffer med pH 7,0, indtil vaskevæsken ikke indeholder polypeptid, dvs. indtil grundlinien for den optiske tæthed DK 167845 B1 17 ved 280 er nået. Den ønskede vækstfaktor elueres i en vandig alkalimetalsaltpufferopløsning med høj ionstyrke, især med kaliumacetat (700 mM) i nærværelse af 40%'s 5 ethanol ved pH-værdien 7,6. Fraktionerne, som udviser den ønskede aktivitet, hældes sammen og, om ønsket koncentreres ved inddampning. Der opnås ca. 10% af begynde ls es aktiviteten med en 1000 gange så stor forøgelse af specifik aktivitet.

10 De sammenblandede fraktioner underkastes hydrofob vekselvirkningskromatografi på en harpiks bestående af en uladet matrix, som bærer interaktive hydrofobe grupper. Der kan anvendes en vilkårlig egnet harpiks, f.eks. phenylsepha-rose eller octylsepharose. En foretrukket hydrofob 15 vekselvirkningsharpiks er phenylsepharose CL-4B.

Inden anvendelsen regenereres phenylsepharosen ved vaskning med en alkohol, f.eks. n-butanol og ethanol, og derpå med vand. De sammenhældte fraktioner fra kromatogra-feringen på "Dowex"-søjlen anbringes på phenylsepharose-20 søjlen ved direkte omrøring af søjlen natten over i de sammenhældte fraktioner. Harpiksen sættes derefter på søjlen, som vaskes med 0,6 M ammoniumacetat, pH 5,0, efterfulgt af en tringradient med en stigende mængde ethanol, f.eks. fra 28 til 40% i det samme opløsnings-25 middel, pH 5,0, som er tilstrækkelig til at eluere den ønskede aktivitet.

De aktive fraktioner fra trinnet med phenylsepharose-hydrofob vekselvirkningskromatografi hældes sammen, hvorpå der lyofiliseres og genopløses i en lille mængde puffero-30 pløsning md høj styrke, f.eks. 2 M ammoniumacetat, pH 5,5, eller de sættes direkte til en hydrofob vekselvirkningskromatografisøj le med butyl-polyol, som danner den første aktive komponent i et high performance-væskekromatografi-system (HPLC). Søjlen vaskes med den samme puffer efter-35 fulgt af en lineær gradient med en stigende mængde 18 ethanol, f.eks. 20-25%, som er tilstrækkeligt til at eluere den ønskede aktivitet.

De aktive fraktioner fra det hydrofobe vækselvirknings-5 kromatografitrin med butyl-polyol hældes sammen, blandes med et stort, fortrinsvis ligeså stort rumfang af den samme opløsningspuffer, nemlig 2 M ammoniumacetat, pH 5,5, og sættes på en hydrofob vekselvirkningskromatografisøjle med octyl-polyol, som danner den anden aktive komponent i 10 et HPLC-system. Søjlen vaskes med den samme puffer efterfulgt af en lineær gradient med en stigende mængde ethanol, f.eks. 40-45%, som er tilstrækkelig til at eluere den ønskede aktivitet. De aktive fraktioner fra det hydrofobe octyl-polyol-trin hældes sammen, hvorpå der lyo-15 filiseres og genopløses i et lille rumfang, fortrinsvis 100 μΐ, af en pufferopløsning bestående af 7 dele 60%'s ethanol til 3 dele 2 M ammoniumacetat pH 5,5, og der foretages størrelsesudelukkelseskromatografi på en TSK G2000 SW-søjle, som danner den tredje aktive komponent i 20 et HPLC-system. Elueringsprocessen gennemføres under isocratiske elueringsbetingelser under anvendelse af den samme pufferopløsning, og fraktionerne indeholdende aktiviteten hældes sammen, lyofiliseres og opbevares ved 20°C indtil yderligere anvendelse.

25 Den opnåede vækstfaktor migrerer som et enkelt bånd med en molekylvægt på ca. 25-26 kd ifølge SDS-PAGE og kan have en renhed på fra ca. 95% op til 100%.

Om nødvendigt kan der gennemføres yderligere rensning af vækstfaktoren ved hjælp af en eller flere af den ovenfor 30 omtalte kromatografiske metoder eller andre metoder, som anvendes ved polypeptidrensning, såsom modstrømsfordeling, elektrofokusering, kromatofokusering, dialyse, salt- og opløsningsmiddelfældning, adsorption med andre geler, celluloseionbytterkromatografi, elektroforesekromatografi 35 på porøse glasperler, kromatografi på immobiliseret DK 167845 B1 19 zinkchelat HPLC og lignende.

En opnået fri MGF, dvs. i form af et indre salt, kan behandles med en syre eller en base til dannelse af det 5 ønskede salt, eller et dannet salt kan omdannes til den fri base eller til et andet salt under anvendelse af kendte fremgangsmåder, især ved hjælp af ionbytter-harpikser påsat den ønskede anion og lignende.

Tilstedeværelsen af vækstfaktoren i de forskellige frak-10 tioner under dens rensning kan kontrolleres ved at måle den optiske tæthed ved 280 nm og især ved at foretage bestemmelse af de forskellige egenskaber, hvorved den er karakteriseret. En foretrukken fremgangsmåde er bestemmelsen af fraktionernes cellemigreringsstimuleringsegen-15 skaber i overensstemmelse med migreringsanalysemetoden af R.R. Btirk (1973), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70: 370. 2 x 10^ 3T3-B-celler (et derivat af Balb/C 3T3-celler klon A31) podedes i 2,5 ml Dulbeccos modificeret Eagle's medium indeholdende 10% kalveserum i 35 mm plastpetriskåle 20 (Nunc). Efter 3 dage ved 37°C dannes et sår i det sammenflydende cellemonolag ved at trykke et sterilt barberblad ned til bunden af skålen for at skære cellepladen og markere en "startlinie".

Barberbladet bevæges forsigtigt til siden til fjernelse af 25 noget af denne plade. Det flydende medium og cellerester fjernes ved sugning og erstattes med 2,5 ml Eagle's medium uden serum efterfulgt af en passende mængde af fraktionen indeholdende vækstfaktoren, som skal testes. Efter 22 timer ved 37°C fikseres cellerne, som farves med 30 Leishmann's opløsning. Migreringsaktivitet defineres som det antal celler, som krydser 1 mm af "startlinien" dannet vd hjælp af barberbladet.

Det farmaceutiske præparat ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det indeholder en effektiv mængde mælke- vækstfaktor ifølge opfindelsen eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf i dosisenhedsform.

20

Ulv 10/04-0 O I

Sådanne materialer foreligger i form af infusionsopløsnin-5 ger eller præparater til parenteral indgift, f.eks. intra-muskulær eller intravenøs indgift, oral eller især til lokal, f.eks. topisk indgift. Opløsningerne er fortrinsvis isotoniske vandige opløsninger eller suspensioner, som kan fremstilles inden anvendelsen, f.eks. ud fra lyofiliserede 10 præparater, som indeholder den aktive bestanddel alene eller sammen med et farmaceutisk acceptabelt bærestof. Opløsninger til parenteral anvendelse er sædvanligvis vandige opløsninger. De fremstilles på sædvanlig måde og kan foruden den aktive bestanddel indeholde fysiologisk 15 saltopløsning, et stabiliseringsmiddel, såsom human serumalbumin, aminosyrer, såsom arginin eller glycin, og et kulhydrat, f.eks. glucose, mannose, dextran eller hydroxyethylstivelse. pH-Værdien kan være indstillet med en puffer, f.eks. et phosphat, et substinat eller en 20 aminosyre, til en værdi på fra ca. 4,5 til 7. Sædvanligvis fyldes hætteglas med opløsningen, som lyofiliseres med henblik på langvarig opbevaring.

Mundskylleopløsninger fremstilles også på sædvanlig måde.

De indeholder den aktive bestanddel opløst f.eks. i vand 25 eller vandig ethanol, f.eks. på ca. 30-60% og kan indeholde sædvanlige additiver, såsom polyethylenglycol, glycerol og en etherisk olie, f.eks. pebermynteolie, for at forbedre smagen. De farmaceutiske præparater til topisk anvendelse omfatter pulvere, cremer, herunder tandpastaer, 30 tyggegummi, lotioner, tinkturer og lignende, som ligeledes fremstilles på sædvanlig måde. Pulvere består sædvanligvis af talkum og den aktive bestanddel og eventuelt andre additiver, såsom stabiliseringsmidler og duftstoffer. Cremer og salver er af den konventionelle type og kan 35 indeholde et stearat, f.eks. sorbitan- eller polyoxy-ethylensorbitanmonostearat, et oleat, såsom sorbitantri- DK 167845 B1 21 oleat, en alkohol, såsom cetylalkohol, eller propylenglycol, en paraffin eller mikrokry stal linsk voks, såsom lanolin, et pulver, såsom magnesiumsulfat, eller til 5 en tandpasta et almindeligt rensepulver, konserveringsmidler og lignende. Faste dosisformer til buccal eller pharyngeal indgift kan være tabletter, pastiller eller bolcher, som fremstilles under anvendelse af gængse farmaceutiske hjælpestoffer, f.eks. a) fortyndingsmidler 10 pastilgrundlag, såsom saccharose, dextrose, lactose, mannitol eller sorbitol, b) bindemidler, såsom stivelsespasta, gelatine, polyvinylpyrrolidon eller hydroxy-propylmethylcellulose, c) smøremidler, såsom magnesiumeller calciumstearat, stearinsyre, talkum eller hydroge-15 nerede vegetabilske olier og, om ønsket, d) farvestoffer, smagsstoffer, sødestoffer osv. Eventuelt kan pastiller fremstillet med et grundlag af gelatine og glycerol eller en blanding af acacia og sukker anvendes til langsom opløsning i munden.

20 Faste dosisformer til oral indgift beregnet til at sluge kan være tabletter eller gelatinekapsler. Det aktive stof formuleres med passende gængse farmaceutiske hjælpestoffer og additiver, f.eks. til tabletter a) fortyndingsmidler, såsom lactose, stivelse, cellulose, sorbitol, 25 calciumphosphat eller calciumsulfat, b) bindemidler, såsom stivelsespasta, gelatine, polyvinylpyrrolidon, hydroxypropylmethylcellulose eller andre egnede celluloseethere, c) disintegreringsmidler, såsom stivelse, natriumstivelseglycolat, natriumcarboxymethylcellulose 30 eller crospovidone, d) smøremidler og glidemidler, såsom magnesium- eller calciumstearater, stearinsyre, talkum, kolloidt siliciumdioxid, hydrogenerede vegetabilske olier og, om ønsket e) overfladeaktive stoffer, såsom natriumlaurylsulfat, farvestoffer osv. Tabletkerner kan 35 være forsynet med et egnet overtræk, som eventuelt kan være resistent over for mavesaft. De ydre overtræk kan være sukkerbaseret eller bestå af tynde film baseret på

UIV I U / 0^0 D I

22 celluloseethere eller acrylharpikser. Sukkerovertræk kan påføres under anvendelse af koncentrerede sukkersirupper og overtrækssuspensioner indeholdende almindelige 5 overtræksbestanddele, såsom talkum, polyvinylpyrrolidon, polyethylenglycoler og farvestoffer eller pigmenter. Filmovertræk påføres fortrinsvis som vandige opløsningsmidler eller suspensioner og kan indeholde filmdannende midler, såsom hydroxypropylmethylcellulose, blødgørings-10 midler, såsom polyethylenglycol, antiklæbestoffer, såsom talkum, farvestoffer og opaliserende stoffer, såsom titan-dioxid og jernoxider. Enteriske overtræk opnås med lakopløsninger af polymerer, som er uopløselige i mavesaft, men opløselige i tarmvæsken, f.eks. celluloseacetat, phthalat-15 eller methacrylsyrecopolymerer i organiske opløsningsmidler.

Kapsler fremstilles enten ud fra præfabrikerede hårde gelatineskaller, der fyldes med lægemiddelformuleringen, eller under anvendelse af bløde gelatineskaller dannet og 20 forseglet under fyldningsprocessen ud fra en blanding af gelatine og et blødgøringsmiddel, såsom glycerol eller sorbitol. De hårde gelatinekapsler kan indeholder pulverblandinger formuleret med fortyndingsmidler, smøremidler og glidemidler som anført for tabletter under 25 a) og d) eller kan være granulater med bestanddele, der ligner de bestanddele, som anvendes til kompression til tabletter og anført ovenfor under a)-d). De hårde gelatinekapsler kan eventuelt indeholde væsker, pastaer eller faste masser, hvori det aktive stof er opløst eller 30 dispergeret i egnede væsker eller halvfaste grundlag, såsom polyethylenglycol, fede olier eller polyoxyethylere-de glyceridderivater, om nødvendigt med fortykningsmidler, såsom voksarter eller kolloidt siliciumdioxid, og/eller overfladeaktive stoffer såsom polysorbater. I bløde 35 kapsler er den aktive bestanddel fortrinsvis opløst eller suspenderet i egnede væsker, såsom fede olier, paraffiner eller polyethylenglycoler. Det aktive stof kan også være DK 167845 B1 23 inkorporeret i små pellets til dannelse af en multiple-enhedsdosisform til oral indgift, fordelingen af det aktive stof på pellets kan opnås ved påsprøjtning af en 5 opløsning eller suspension på overfladen af fremstillede pellets eller ved at danne pellets ud fra en blanding indeholdende det aktive stof og passende fortyndingsmidler. Til overfladeapplikation kan pellets være kommercielt tilgængelige nonpareil sukkerkugler, som 10 indeholder sukker og stivelse, eller de kan være fremstillet ved ekstrudering og spheronisering under anvendelse af hjælpestoffer, såsom mikrokrystallinsk cellulose og lactosevådmasse med vand. Sidstnævnte fremgangsmåde kan anvendes til inkorporering af det aktive 15 sof i pellets. Pellets kan være overtrukket med beskyttelseslak eller afgivelsesregulerende lak under anvendelse af polymerer, såsom ethylcellulose, polymethacrylat-harpikser, celluloseacetatphthalat osv., som påføres i form af opløsninger i organiske opløsningsmidler eller som 20 vandige dispersioner. Pellets kan fyldes i hårde gelatinekapsler eller komprimeres til tabletter sammen med passende tabletteringshjælpestoffer.

Midlerne indeholder konventionelle tilsætningsstoffer, f.eks. konserveringsmidler, stabiliseringsmidler, fugte-25 midler og/eller emulgeringsmidler, opløseliggørende midler, salte til regulering af det osmotiske tryk og/eller puffere. De farmaceutiske præparater, der om ønsket kan indeholde andre farmakologisk værdifulde stoffer, fremstilles på kendt måde, f.eks. ved hjælp af 30 konventionelle blandings-, opløsnings-, lyofiliserings-og/eller seriliseringsfremgangsmåder, og de indeholder fra ca. 1 ng til 100 /ig/g, især fra ca. 10 ng til 10 μg/g præparat, i tilfælde af lyofilisater op til 100% af den aktive bestanddel. 1

Det farmaceutiske præparat ifølge opfindelsen kan fremstilles ved, at MGF ifølge opfindelsen eller et salt

UIV I o / 0*tu D I

24 forarbejdes på sædvanlig måde, f.eks. blandes med et farmaceutisk acceptabelt bærestof.

Det farmaceutiske præparat ifølge opfindelsen kan være en 5 tandpasta, som indeholder en effektiv mængde MGF eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf. Tandpastaen er særlig nyttig til forebyggelse og/eller behandling af sår på gummerne, f.eks. periodontitis eller gingivitis.

Det farmaceutiske præparat ifølge opfindelsen kan endvide-10 re være et mundskyllevand indeholdende en effektiv mængde MGF eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf. Mund-skyllevandet er nyttigt til forebyggelse og/eller behandling af sår i munden og svælget, f.eks. sådanne, som optræder under periodontitis, gingivitis eller inflammation 15 af svælget.

Det kosmetiske præparat ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det indeholder en effektiv mængde MGF ifølge opfindelsen eller et kosmetisk acceptabelt salt deraf. Det kosmetiske præparat kan ligne det topisk 20 farmaceutiske præparat og kan desuden indeholde duftstoffer. Sådanne præparater omfatter konventionelle barbersæber, barberskum, barbercremer og barberlotioner.

MGF har dualistisk karakter, idet den på den ene side stimulerer formeringen af en type legemsceller, nemlig 25 fibroblaster og andre mesenchymceller og på den anden side inhiberer formeringen af en anden type legemsceller, nemlig tumorceller og celler i immunsystemet.

Den nye vækstfaktor, eventuelt i form af et salt, især et ugiftigt farmaceutisk syreadditionssalt, eventuelt i form 30 af et farmaceutisk præparat anvendes i en effektiv mængde.

Ved udtrykket "effektiv mængde" skal forstås en mængde, som fremkalder en signifikant helingsvirkning eller DK 167845 B1 25 kosmetisk virkning, f.eks. en mængde, som stimulerer de ønskede celler til vækst, og som ikke er toksisk over for cellerne. Denne mængde kan eksempelvis bestemmes ved in 5 vitro-vækstforsøg. Som følge af den dualistiske karakter af MGF er en "effektiv mængde" tillige en sådan mængde, som i signifikant grad inhiberer væksten og formeringen af tumorceller og celler i immunsystemet. I tilfælde af anvendelse i human- eller veterinærmedicinen skal mængden 10 reguleres under hensyntagen til det pågældende væv, som skal behandles, applikationsmåden, sygdommens sværhedsgrad samt alderen og den almene tilstand hos det menneske eller dyr, som skal behandles. Sædvanligvis vil doser til voksne mennesker ligge i området fra ca. 0,1 til 1000 μg såvel i 15 tilfælde af vækststimulerende virkning som inhiberende virkning. Allergiske reaktioner kan undgås ved at anvende vækstfaktoren fra den specifikke art, som skal behandles, dvs. anvende vækstfaktoren fra humanmælk til behandling af mennesker, fra komælk til behandling af kvæg osv.

20 De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen, hvis aktive bestanddele er MGF eller MGF i kombination med et egnet aktiveringsmiddel, fortrinsvis EGF, kan anvendes klinisk ved behandlingen af dyr, især pattedyr, og specielt mennesker, og i tilfælde af sårheling, især hos 25 ældre mennesker. Dette fremgår af resultaterne opnået i de efterfølgende biologiske tests I-VII.

Midlerne ifølge opfindelsen fremmer cellemigrering og celleformering. Da der i sårhelingsprocessen indgår såvel cellemigrering som celleformering er disse in vitro-re-30 sultater direkte relevante ved in vivo-sårhelingsproces-sen.

En vigtig egenskab ved komponenterne i midlerne ifølge opfindelsen er at artspecifikke kombinationer ikke er nødvendige for deres virkning hverken in vitro eller in 35 vivo, dvs. MGF fra en art, f.eks. bovin-MGF, kan aktiveres

LSIN. io/o*ty D I

26 ved hjælp af et aktiveringsmiddel fra en anden art, f.eks. murin-EGF. Endvidere kan de celler, hvis migrering og/eller vækst skal fremmes, enten in vitro eller in vivo, 5 også være fra en anden art end det er tilfældet med komponenterne i midlet eller af andre typer, såsom fibroblast eller epithel (selv om det antages, at fremskyndelsen af væksten af disse to celletyper vil have den største medicinske betydning). Synergien af MGF med 10 EGF tyder på, at hud er et passende mål. Som forebyggelse eller behandling af liggesår er et foretrukket mål, da de ofte optræder hos hospitalspatienter især på geriatriske afdelinger og patienter i kørestol. Hos ældre mennesker er sårhelingsprocessen langsommere, og hos denne gruppe 15 patienter er der en større tendens til forekomst af sår (ikke kun liggesår og sår som følge af diabetes, men læsioner, brandsår og lignende), som enten heler langsomt eller slet ikke heler.

To applikationstyper for midlerne ifølge opfindelsen er 20 anvendelige i både veterinærmedicinen og især humanme dicinen.

Den første og foretrukne applikation er topisk applikation til at fremme helingen af overfladesår, især hos ældre mennesker, hvor sårhelingsprocesserne er væsentligt 25 langsommere end hos yngre mennesker. Der er ingen begrænsninger med hensyn til den type sår, som kan behandles, og disse typer omfatter (men er ikke begrænset til): overfladesår, herunder liggesår, sår som følge af diabetes, dental-, oral-, varicose- og hæmofilioverflade-30 sår, brandsår, især af anden og tredje grad, kirurgiske indgreb, herunder dentalkirurgiske indgreb og kosmetiske kirurgiske indgreb, sår i forbindelse med uheld eller ulykker, herunder snit, gennemtrængninger, flænger og andre læsioner, og sår fremkaldt ved terapi, herunder sår 35 fremkaldt ved røntgenterapi. Ved topisk applikation kan præparaterne være kombineret med andre bestanddele, såsom DK 167845 B1 27 hjælpestoffer, bærestoffer, opløseliggørende midler og en hvilken som helst anden kendt eller endnu hidtil ukendt sekundær vækstfaktor. Der er ingen begrænsninger med 5 hensyn til disse bestanddeles natur, hvorset fra at de skal være farmaceutisk og fysiologisk acceptable til administration og ikke må nedbryde aktiviteten eller gøre præparatets aktive bestanddele skadeligt giftige. Når præparaterne ifølge opfindelsen påføres på overfladesår, 10 brandsår, kirurgiske sår eller sår fremkaldt af ulykker, har præparaterne fortrinsvis form af et pulver, en gel, en salve eller en skyllevæske, eller de kan være imprægneret i transdermale puder, plastre og bandager, fortrinsvis i flydende eller halvflydenmde form, eller de kan være 15 inkorporeret i en tandpasta eller en gummi eller en harpiks til at tygge.

Den anden applikation er en systemisk applikation til heling af indre sår enten som følge af kirurgiske indgreb eller på grund af beskadigelse af vævene i de indre 20 organer, hvor kirurgi enten ikke er mulig eller ikke er påkrævet. Heller ikke i disse tilfælde er der nogen begrænsninger med hensyn til typen af væv eller sår, som kan behandles, og disse indbefatter (men er ikke begrænset til) dybe kirurgiske indgreb til de indre organer og væv, 25 knogle og brusk (efter brud), mavesår, sår på tolvfingertarmen og andre tarmsår. Når præparaterne ifølge opfindelsen anvendes systemisk kan de være formulerede som væsker, piller, tabletter, pastiller til interal indgift eller i flydende form til parenteral injektion. Til behandling af 30 interne sår efter kirurgi kan de foreligge i form af en skyllevæske, fortrinsvis i kombination med en fysiologisk acceptabel saltopløsning. Også her kan de aktive bestanddele i præparaterne være kombineret med andre bestanddele, såsom hjælpestoffer, bærestoffer, 35 opløseliggørende midler og en vilkårlig anden kendt eller endnu ukendt sekundær vækstfaktor. Der er ingen begrænsninger md hensyn til disse bestanddeles natur, 28 bortset fra at de skal være farmaceutisk og fysiologisk acceptable til indgift og ikke må nedbryde aktiviteten eller gøre de aktive bestanddele i disse præparater 5 skadeligt giftige.

Til sårheling er mængden af den aktive bestanddel, som skal anvendes, ikke særlig kritisk. Sædvanligvis har en dagsdosis på fra ca. 0,1 til 10 /ig MGF pr. cm2 sår allerede en udtalt helende virkning. Til intern anvendelse bør 10 der anvendes en større mængde afhængigt af indgifts- måden på grund af fortyndingen af MGF i kropsvæskerne. Sikkerheden i forbindelse med større mængder opnås på grund af det faktum, at MGF forekommer i mælk.

Det har overraskende vist sig, at MGF ifølge den fore-15 liggende opfindelse også har bredspektrede immunosuppressive virkninger, hvilket fremgår af de biologiske tests IV og V.

Den immunosuppressive virkning af den omhandlede MGF kan anvendes ved organtransplantationoperationer eller også 20 til at forebygge og behandle autoimmunsygdomme, såsom inf1ammationer.

Endvidere har MGF ifølge opfindelsen antitumorvirkninger, f.eks. mod melanomaceller, hvilket kan påvises ved hjælp af de antiproliferative virkninger mod melanomacellelinie 25 A 375 (test VI) og humane brystcancerceller (test VII).

Mængden af det påkrævede aktiveringsmiddel afhænger af mængden af MGF, som forekommer i de pågældende midler ifølge opfindelsen, selv om forsøg tyder på, at omtrentlig ækvimolære mængder foretrækkes. Nøj agtige mængder af de 30 aktive bestanddele sammen med eventuelle yderligere bestanddele i midlerne ifølge opfindelsen afhænger af den specifikke aktivitet af MGF'en og/eller aktiveringsmidlet, sygdommen, som skal behandles, f.eks. også af størrelsen, DK 167845 B1 30 ningen af MGF under de forskellige kromatografitrin. For hver fraktion registreres absorbansen ved måling af den optiske tæthed (O.D.) ved 280 nm og migreringsaktiviteten 5 ved testen ifølge R.R. Bilrk (1973) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 70, 369.

Fig. 1 viser resultaterne af kationbytterkromatografe-ringen ifølge eksempel la), fig. 2 viser resultaterne af den hydrofobe vekselvirk-10 ningskromatografi I ifølge eksempel lb), fig. 3 viser resultaterne af den hydrofobe vekselvirkningskromatografi II ifølge eksempel lc), fig. 4 viser resultaterne af den hydrofobe vekselvirkningskromatografi III ifølge eksempel Id) og 15 fig. 5 viser resultaterne af størrelsesudelukkelses-kromatograferingen ifølge eksempel le).

Opfindelsen illustreres nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

Eksempel 1 20 Isolering af vækstfaktor fra frisk komælk a) Kationbytterkromatografi "Dowex AG 50W X2"® 50-100 mesh harpiks (30 1, H+-form) anbringes i en kromatografisøjle af passende størrelse og vaskes først med 2-3 lag rumfang 1 M natriumhydroxid-25 opløsning i 50% ethanol efterfulgt af 3-6 lag rumfang destilleret vand. Harpiksen ækvilibreres derefter i Na+-formen med 2-3 lag rumfang 0,01 M natriumdihydrogen-phosphat, pH 7,0. 250-400 1 frisk mælk fortyndes med 4 rumfang destilleret vand efter tilsætning af 40 ml 30 0,1 M phenylmethansulfonylf luorid (PMSF), som er en proteaseinhibitor, til den rå mælk. Den fortyndede mælkeopløsning pumpes derefter langsomt gennem søjlelaget ved DK 167845 Bl 29 naturen og beliggenheden af såret. Til topisk applikation på overfladesår, herunder melanoma, bør MGF forekomme i en mængde på mindst 1 ng op til 1 mg pr. ml. Da de aktive 5 bestanddele ifølge opfindelsen udøver deres virkning ved binding til receptorsteder og derefter udnyttes af cellerne, hvis vækst og migrering stimuleres, foretrækkes kontinuerlig eller periodisk genpåføring af midlerne eller præparaterne.

10 Selv om mælks hovedrolle klart er ernæringen af den nyfødte, kan MGF også have virkninger, ikke blot på lokalvæv, men kan fremme væksten af hele individet på en måde analogt med humant væksthormon (HGH). I denne henseende kan det påregnes, at præparaterne ifølge 15 opfindelsen også kan anvendes som foderadditiv ved opdræt af unge dyr, f.eks. kalve, lam, føl, pattegrise og kyllinger.

Et yderligere aspekt af opfindelsen er anvendelse af MGF til væksten af dyrkede celler, som har vanskeligheder ved 20 at vokse under normale dyrkningsbetingelser, f.eks. den SV40-virustransformerede embryoniske humane fibroblast-cellelinie WI-38 VA13. Endvidere kan MGF anvendes til dyrkning af visse celler i proteinfattige eller stort set proteinfrie medier, hvilket tillader besparelser med 25 hensyn til serum anvendt i cellekulturen. Som testen ifølge R.R. Btirk indicerer, stimulerer således picomolære koncentrationer på ca. 1 til 1000 pM af faktoren migrering af vækst af Balb/c 3T3 celler i serumfrit medium.

Opfindelsen angår derfor tillige et celledyrkningsmedium, 30 som er ejendommeligt ved, at det indeholder en vækstfremmende stimulerende mængde MGF ifølge opfindelsen eller et salt deraf.

Opfindelsen forklares nærmere i det følgende under henvisning til tegningen, idet fig. 1-5 viser forløbet af rens- DK 167845 B1 31 4°C til absorption af de passende ladede mælkeproteiner på harpiksen.

Efter påsætning vaskes harpiksen med 1 1/2 lag rumfang 5 0,01 M natriumdihydrogenphosphat, pH 7,0. Derefter elueres søjlen med 2 1/2 lag rumfang 0,02 M kaliumdihydrogen-phosphat og 0,7 M kaliumacetat i 40% ethanol ved pH 7,6, indtil O.D. 280 nm vender tilbage til grundlinien. Hver fraktion indstilles straks på pH-værdien 4,5-5,5 med eddi-10 kesyre. Kaliumacetatet eluerer en lille top med absorbans ved 280 nm og som indeholder meget af den ønskede aktivitet. Fig. 1 repræsenterer absorbansen ved 280 nm over elueringsfasen sammen med migreringsaktiviteten for de opsamlede fraktioner. Det aktive fraktioner (nr. 8-17) 15 hældes sammen, koncentreres 2-3 gange ved rotations-inddampning og opbevares ved 4°C indtil videre behandling.

b) Hydrofob vekselvirkningskromatografi I

Phenylsepharose CL 4B fra Pharmacia regenereres ved 20 vaskning med 1 søjlerumfang n-butanol, 1 rumfang ethanol og ca. 10 rumfang destilleret vand. Blandingen af de aktive fraktioner fra afsnit a) (samlet rumfang sædvanligvis 40-50 1, som kan reduceres ved rotationsinddamp-ning ved formindsket tryk) indstilles på pH-værdien 5,0 25 med 1 M ammoniumhydroxid i en beholder af en passende størrelse. Til beholderen sættes ca. 750 ml phenyl-sepharose CL 4B harpiks præpareret som beskrevet ovenfor, og indholdet omrøres forsigtigt natten over ved 4°C. Omrøringen afbrydes, blandingen henstår til bundfældning af 30 harpiksen, og supernatantmaterialet dekanteres omhyggeligt og kasseres. Harpiksen overføres til en stor sinterglas-tragt og vaskes omhyggeligt med pufferopløsning bestående af 0,6 H ammoniumacetat, indtil afgangsvæsken ikke længere er uklar. Harpiksen overføres derefter til en kromatogra-35 feringssøjle af en passende størrelse, og harpiksen vaskes 32

derpå med yderligere 2 rumfang 0,6 M ammonium- acetat, pH

5,0, efterfulgt af trin ved 28% og 40% ethanol i 0,2 M ammoniumacetat, pH 5,0, hvilket er tilstrækkeligt til at 5 eluere den ønskede aktivitet. 28%-trinnet kan udelades for at nedsætte rumfanget. Fig. 2 viser absorbansen·ved 280 nm over elueringsfasen sammen med migreringsaktiviteten for de opsamlede fraktioner. De aktive fraktioner (nr. 113-180) hældes sammen og opbevares ved 4°C, indtil de 10 skal anvendes.

c) Hydrofob vekselvirkningskromatograi II (HPLC)

Blandingen af de aktive fraktioner fra afsnit b) (samlet rumfang sædvanligvis 2-2,5 1) lyofiliseres til tørhed og genopløses i et lille rumfang, sædvanligvis 50 ml, af en 15 blanding bestående af 7 dele 60% ethanol til 3 dele 2 M ammoniumacetat pH 5,0, eller koncentreres 3-10 gange ved vakuuminddampning. Der tilsættes yderligere 1-2 rumfang af en puffer bestående af 2 M ammoniumacetat, pH 5,5, og opløsningen pumpes til en butylpolyol Si500 (10 /an 20 porestørrelse) hydrofob vekselvirkningskromatograferings-søjle ved stuetemperatur med en strømningshastighed på 1 ml pr. minut. Søjlen vaskes derpå med den samme pufferopløsning, hvorefter der elueres under anvendelse af en lineær gradient med et stigende indhold af ethanol, i 25 dette tilfælde 21-24% over den udfladede del af gradienten, som er tilstrækkelig til at eluere den ønskede aktivitet. Fig. 3 viser absorbansen ved 280 nm over elueringsfasen sammen med migreringsaktiviteten i de opsamlede fraktioner. De aktive fraktioner (nr. 31-40) 30 hældes sammen og opbevares ved -20°C i en lukket beholder for at undgå fordampning, indtil materialet skal anvendes.

d) Hydrofob vekselvirkningskromatografi III (HPLC)

Blandingen af de aktive fraktioner fra afsnit c) (samlet rumfang sædvanligvis 20-40 ml) blandes med et lige så DK 167845 B1 33 stort rumfang af en puffer bestående af 2 M ammoniumacetat, pH 5,5, og opløsningen pumpes til en octylpolyol Si500 (10 /un porestørrelse) hydrofob vekselvirknings- 5 kromatograferingssøjle ved stuetemperatur med en strømningshastighed på 1 ml pr. minut. Søjlen vaskes derpå med den samme puffer, hvorpå der foretages eluering under anvendelse af en lineær gradient med en stigende mængde ethanol, i dette eksempel 40-42% over den udfladede del af 10 gradienten, hvilket er tilstrækkeligt til at eluere den ønskede aktivitet. Til sidst strippes søjlen ved gentagelser af 0-100% lineær ethanolgradient. Fig. 4 viser absorbansen ved 280 nm over elueringsfasen sammen med migreringsaktiviteten i de opsamlede fraktioner. De aktive 15 fraktioner (nr. 39-42) hældes sammen og opbevares ved -20°C, indtil materialet skal anvendes.

e) Størrelsesudelukkelseskromatografi (HPLC)

Blandingen af de aktive fraktioner fra afsnit d) (samlet rumfang sædvanligvis 2-10 ml) lyofiliseres til tørhed, og 20 materialet genopløses i 100 /il af en pufferopløsning bestående af 7 dele 60% ethanol til 3 dele 2 M ammoniumacetat, pH 5,5. Det genopløste materiale injiceres derpå til en TSK G2000 størrelsesudelukkelsessøjle, og der gennemføres en isocratisk eluering under anvendelse af den 25 samme pufferopløsning ved stuetemperatur ved en strømningshastighed på 0,2 milliliter pr. minut. Fig. 5 viser absorbansen ved 280 nm over hele den isocratiske elue-ringsfase sammen med migreringsaktiviteten af de opsamlede fraktioner. De aktive fraktioner (nr. 86-91) lyofi-30 liseres og opbevares separat ved -20°C, indtil de skal anvendes.

MGF forekommer i de aktive fraktioner fra afsnit e) i en form, som er op til og omfatter 100% rent stof, og har en molekylvægt på ca. 25000. Dette anslås ud fra sølvfarvet 35 SDS-PAGE geler (indeholdende 15% acrylamid) med en

L/iv ΙΟ/0^0 D I

34 tykkelse på 1,5 mm, som scannes ved 530 nm mod a-chymo-trypsinogenstandarder på et Shimadzu CS-930 dobbeltbølge-længdescanningsdensitometer. Sølvfarvning gennemføres i 5 overensstemmelse med R.R. Biirk et al., Methods in Enzymology, 91, 247-254 (1983).

Under fladlagsbetingelser med isoelektrisk fokusering udvindes aktiviteten fra fraktioner ved pH 9,0-10,5.

Eksempel 2 10 Isolering af MGF fra andre friske mælkekilder

En passende mængde frisk mælk fra en anden pattedyrkilde, f.eks. mennesker, får eller geder, fortyndes først som beskrevet i trin la). Der gennemføres kationbytter-kromatografi, hydrofobisk vekselvirkningskromatografi og 15 størrelsesudelukkelseskromatografi på samme måde som beskrevet i eksemplerne la) til le), hvorved der opnås en vækstfaktor for mælk eller en mælkevækstfaktor (MGF).

Eksempel 3

Isolering af MGF fra tørret skummetkomælkspulver 20 Kommercielt tilgængeligt tørret skummetkomælkspulver (25-50 kg) vaskes ved suspension i 50-100 1 acetone under omrøring i 1 time ved 20°C og tørring af det vaskede pulver natten over ved stuetemperatur i et stort vakuumkammer. Mindre end 100 g tørt materiale går tabt i 25 acetonen, som kasseres. Det acetonevaskede pulver kan opbevares ved stuetemperatur, indtil det skal anvendes.

Det acetonevaskede mælkepulver (25-50 kg) sættes til 250-500 1 destilleret vand ved 4°C, som omrøres forsigtigt for at undgå skumning i 1 time, hvorefter blandingen 30 indstilles på en pH-værdi fra ca. 6,7 til 7,0 med 1 N natriumhydroxidopløsning. Yderligere fortynding af det DK 167845 B1 35 vaskede og rekonstituerede mælkepulver, kationbytter-kromatografi, hydrofob vekselvirkningskromatografi og størrelsesudelukkelseskromatografi gennemføres på samme 5 måde som beskrevet i eksemplerne la) til le), hvorved man får en vækstfaktor fra komælk.

Eksempel 4

Creme (O/V-typen)

Bestanddele: % 10 Sorbitanmonostearat 2,0

Polyoxyethylensorbitanmonostearat 3,0

Cetylalkohol 5,0

Let flydende paraffin 8,0

Isopropylmyristat 2,0 15 Aktivt stof, MGF 1,0·10“5

Propylenglycol 2,0

Glycerol 2,0

Deioniseret vand 76,0

Konserveringsmidler og 20 andre stabiliseringsstoffer q.s.

Den vandige fase opvarmes til 55-60°C, det aktive stof opløses deri, og den smeltede lipidfase dispergeres deri ved kraftig omrøring. Blandingen afkøles til stuetemperatur og homogeniseres.

25 På tilsvarende måde fremstilles en creme indeholdende henholdsvis 0,4, 4 eller 20 /*g/ml.

Af denne creme anvendes 100 μΐ/cm2 sår.

UIV It>/»**£> bl 36

Eksempel 5

Salve (V/O-typen)

Bestanddele: % 5 Sorbitantrioleat 5,0

Voks, mikrokrystallinsk 3,0

Lys flydende paraffin 9,0

Isopropylmyristat 10,0

Lanolinalkoholer 3,0 10 Aktivt stof, MGF 1,0*10"^

Propylenglycol 2,0

Glycerol 2,0

Magnesiumsulfat, vandholdig 0,7

Deioniseret vand 65,3 15 Konserveringsmidier q.s.

Det aktive stof opløses i den vandige fase under forsigtig opvarmning, og opløsningen dispergeres i den smeltede lipidfase. Blandingen afkøles til stuetemperatur og homogeniseres.

20 På tilsvarende måde fremstilles en salve indeholdende henholdsvis 0,4, 4 og 20 /ig/ml. Af denne salve påføres 100 /tl/cm2 sår.

Eksempel 6

Mundskyllevand 25 Bestanddele: %

Aktivt stof, MGF 1,0*10“3

Polyethylenglycol(7)-glycerolcocoat 4,0 Deionisret vand 13,0

Glycerol 86% 18,0 30 Pebermynteolie 10,0

Ethanol 55,0 DK 167845 B1 37

Det aktive stof opløses i deioniseret vand. PEG(7)-glycerylcocoat og glycerol sættes til opløsningen og opløses deri. Pebermynteolie opløses i ethanol, og de to 5 opløsninger blandes under omrøring.

Opløsningen skal fortyndes i forholdet 1:10 inden anvendelse.

Eksempel 7

Parenteral opløsning 10 Bestanddele:

Aktivt stof, MGF 1 mg/ml ± Humant serumalbumin 1 mg/ml

Arginin eller glycin 20 mg/ml ± Kulhydrat 5-20 mg/ml 15 pH-værdi 7

Kulhydraterne er glucose, mannose, dextran, hydroxyethyl-stivelse eller en blanding deraf.

pH-Værdien indstilles med phosphat, succinat, aminosyrer eller en blanding deraf.

20 Der fremstilles hætteglas med 0,5 mg MGF/0,5 ml, som lyofiliseres.

UIV I Ο/ΟΗΌ D I

38

Eksempel 8

Tandpasta

Aktivt stof 1,0·1.0"5 g 5 Methylcellulose 0,8 g

Calciumcarbonat 30,0 g

Kolloidt siliciumdioxid 3,0 g

Lys flydende paraffin 2,0 g

Glycerol 20,0 g 10 Sødemiddel

Smagsstof

Konserveringsmi dier

Deioniseret vand til 100,0 g

Pulverne fugtes med blandingen af det aktive stof og 15 methylcellulose i en del af det deioniserede vand, paraffin og glycerol. Additiverne sættes til opløsningen. Efter tilsætning af den resterende mængde vand homogeniseres pastaen.

De efterfølgende biologiske forsøg viser, at materialerne 20 ifølge opfindelsen er virksomme in vivo, og at MGF kan anvendes på tværs af arter (cross-species).

Sårheling i 10 måneder gamle rotter, test I:

In vivo aktiviteten af bovin MGF bestemmes ved hjælp af en fremgangsmåde baseret på metoderne beskrevet af Zimmerli 25 et al., (1982) J.Infect.Dis. 146: 487 og M.B. Sporn et al., (1983) Science 219: 1329.

Tomme stive rør af polymethylacrylat eller polytetrafluor-ethylen (længde 32 mm, indre og ydre diameter henholdsvis 10 og 12 mm), som hver er perforeret med ca. 250 huller 30 (diameter 1 mm) med regelmæssig afstand og forseglet i hver ende med en hætte af identisk materiale, gassterili- DK 167845 B1 39 seres og indsættes subkutant ved hjælp af kirurgisk indgreb på symmetrisk måde i rygsiden på helt anæsteti-serede Wistar-rotter (ca. 10 måneder gamle). Én gas-5 steriliseret vævskurv implanteres i hver side, og snittet lukkes med metalklemmer, som fjernes 5 dage efter foretagelsen af snittet. Efter det kirurgiske indgreb bliver kamrene indkapslet med fibrøst bindevæv, selv om der er en relativ mangel på celler i selve kamrene. Denne 10 model tilvejebringer derfor et sterilt, afgrænset og indelukket rum (i det implanterede kammer), hvor et sårhelingsrespons kan bedømmes kvantitativt. Rotterne anvendes til forsøget 2 uger efter implanteringen af vævskurvene efter fuldstændig heling af snittet. På dette 15 tidspunkt foretages daglige injektioner af MGF (0,1 mm, i steril histidinpufret saltopløsning (HBS)/0,5% "Klucel"® bærepuffer) foretages direkte i kammeret i venstre side (kammer A). De daglige doser er enten 1000, 100 eller 10 ng MGF pr. kammer. Den specifikke aktivitet af MGF er 20 ca. 107 enheder pr. mg bestemt ved dosisresponsanalysen under anvendelse af Balb/C 3T3 fibroblastere.

Til aktivering af MGF-aktiviteten sættes en lille mængde (20 ng) murint EGF til alle MGF injektionerne, medmindre andet er anført. Kontralaterale kamre på højre side 25 (kammer B) anvendes som placebokontroller, og der injiceres enten bærepuffer alene eller bærepuffer indeholdende noget bovint serumalbumin (BSA), således at den samlede proteinmængde er ækvivalent med den mængde MGF, som injiceres i kammeret i venstre side. Injektio-30 nerne foretages én gang dagligt i 5 dage, og alle injicerede materialer er sterile, endotoksinfri og pyrogenfri. Alle rotterne anbringes hver for sig i bure under forsøgets forløb. Rotterne aflives 6 timer efter den sidste række injektioner, og alle kamrene fjernes fra 35 dyrene under aseptiske betingelser. Fibrøst materiale i kamrene vejes "vådt", og det totale proteinindhold i den serøse kammervæske måles under anvendelse af fremgangs- DK 167845 B1 40 måden ifølge Lowry et al., J.Bio.Chem. 193, 265 (1951). Kammerindholdets sterilitet kontrolleres ved inkubering af prøver på hj erne/hj erteinf usionsplader i 72 timer ved 5 37°C. Der foretages statistisk analyse af de opnåede data ved sammenligning af matchede par af kamrene (A i forhold til B).

Det fremgår af tabel 1, at daglige MGF-injektioner i 5 dage i væsentlig grad forøger (op til 3 gange) akkumulerin-10 gen af totalt fibrøst materiale på dosisafhængig måde i kamre i venstre side sammenlignet med de kontralaterale kontrolkamre i højre side, som kun gives placebobehandlinger (forsøg 1-3).

Selv om den virker som et aktiveringsmiddel har EGF ingen 15 signifikant virkning alene på mængden af det samlede fibrøse materiale i de pågældende kamre (forsøg 4). MGF bevirker tillige en signifikant forøgelse af mængden af totalt serøs væskeprotein i kamrene i den venstre side sammenlignet med de kontralaterale kamre i den højre side, 20 som kun får placebobehandlinger (forsøg 1-3). Også her har EGF kun ringe virkning alene på indholdet af totalt serøs væskeprotein i de pågældende kamre (forsøg 4).

DK 167845 Bl 41 m ri m *

Pi o o ni co o o o z o *· ·* »o © o c! •H PQ r* o o\ co d) ^—- η p & M < θ' π r- SE Q) +1+1 +1 +i •-i E Ό ri ni Ό

Pi r k * r r (D to cm n> r>* d (D ,2 ί*ι <N CM ri n

'S, S

cn p ffi <J r·» in vo r-.

g CO r r r r ·©. M cm en *n CT\ Η M fl) +i +i +i +i (B 0) E u m m σι +> co E ·* *r "> ·» η ro «σ *n vr o tn ·Η & co ro cm ni Φ in in d n O O *

S (¾ O O O M

S, S O O O z tn ® ·. » ·.

IH O O O

M +] m 'H W

Ί3 η g <d , M

c β H < <D m co co cm _ co Ό cd g *» “ ~ »

3 EH-HMg O O O O

H (0 O 9-1 03 (o +i +' +i +i

β -C (1) E n* ro ri O

2 Η P +! S ·» - ·* *» ra SOfdcStn ni m cm n ° O 4H g X 0

cm σ\ id O

M v .

(U rn ο cm \a oo co

-P g CO ri CM CM

-P Si +i +i +i +i O oi ve o O oo Μ φ g *·«-* — HE o\ n co m

Cd ft md m «cr ni Η H ri ri π n i 9-t ti a) o) Φ Ό -P 00 rQ & - =-1 η π

&H SliTcOr-T

g +J η Γ0 CO CO

CO P +' +' +' +l Η ·0· Q) o CO O <-* jo ro vo -a- n-

n H c3 UB CO O' CM

<$ CO CM «—< 2 _i r* frt q in tn m m

Il R

< < < m co co co ^ CQ « « . 2 g H1 g> « B1 1 00

•S S3 - o o +J

H W ri η n fi 1 3

ft H

_c Ib (K Fk h P h h H

lil <r ooooooo -H

φ «. swswsww 2

Si tn

ft 00 ω ω ω ω eo ω -H

g 3. C G C G C C CO

e o o o o o S * cm O ni o ni o d) ^ ri+n+ri+m

W

q ri CM CO vf *Jc fa DK ΊΒ7845 ΒΊ 42

Ved afslutningen af forsøg 1-3 konstateres det konstant ved biopsi efter aflivningen, at de MGF-behandlede kamre i venstre side var fastere fæstnet til det omgivende binde-5 væv i kropsvæggen end de respektive matchede kontrolkamre, og at tykkelsen af det fibrøse materiale umiddelbart omkring de MGF-behandlede kamre er udtalt større end omkring de tilsvarende matchede kontrolkamre. Denne iagttagelse tyder på, at virkningerne af MGF også giver 10 sig udslag i området umiddelbart omkring de pågældende kamre. Der iagttages ingen synlige forskelle i tykkelsen af fibrøst materiale omkring kamrene i eksempel 4. De kontralaterale kamre udviser også dosisafhængige små forøgelser i forhold til kontrollen, hvilket kan forklares 15 ved overføring gennem kredsløbet af MGF til dette kammer.

Histologiske præparater viser udstrækningen af den forøgede vævstykkelse og kardannelse omkring de MGF-behandlede kamre i venstre side i forsøg 1-3 og tillige forekomsten af fibroblastformering i indholdet af 20 det fibrøse granulationsvæv inden i hvert kammer. En steril gennemsivning af inflammatoriske celler findes i den serøse væske i både behandlede kamre og kontrolkamre, skønt differentialtællinger viser en lille overvægt af polymorfkernede leukocyter i kontrolkamre i højre side 25 under overvægt af makrofagpopulationer i kamre i venstre side, som har modtaget MGF i forsøg 1-3. Indholdene af alle 40 kamre i forsøg 1-4 viser sig at være sterile efter inkubering af prøver af indholdet fra hvert kammer på hjernehjerteinfusion i 72 timer ved 37°C.

30 Sårheling i mus, som er mere end 480 dage gamle, test II:

Det har længe været iagttaget, men først for nylig testet, at sårhelingsprocessen svækkes med stigende alder (G.L. Grove (1982) Arch.Dermatol.Res. 272: 381), hvilket i sig selv er et væsentligt problem inden for geriatrien.

DK 167845 B1 43

Derfor foretages undersøgelser af virkningerne af bovint MGF på et sårhelingsrespons under anvendelse af sårdannelse i en del af tykkelsen (ved hjælp af andengradsforbræn-5 ding) i en delvis deficient eller svækket sårhelingssituation, nemlig hos gamle dyr, under anvendelse af en forsøgsmetode som beskrevet af G.S. Schultz et al, (1987) Science 235: 350.

Enkelte midtdermale forbrændingsskader foretages på den 10 dorsale del af brystkassen hos anæstetiserede gamle (480-600 dage) C57/BL6 mus, hvis rygsider forinden er barberet og behandlet med et kommercielt hårfjernings-middel, med en enkel anbringelse i 10 sekunder af et messingstempel (lxl cm, 8 g), som er blevet ækvilibreret 15 ved 80eC i et vandbad. Den dannede blære fjernes kirurgisk, og brandsårene behandles dagligt i 5 dage ved topisk applikation af 25 μΐ steril bærepuffer indeholdende forskellige mængder MGF (500 ng, 100 ng eller 10 ng, specifik aktivitet for MGF er ca. 10? enheder pr. mg 20 bestemt ved hjælp af dosisresponsanalysen under anvendelse af Balb/C 3T3 fibroblastere) i nærværelse af en konstant lille mængde (20 ng) murint EGF, eller de efterlades ubehandlede. Alle materialer til den topiske behandling er sterile, endotoksinfri og pyrogenfri, og alle musene 25 opbevares hver for sig i bure under forsøgenes gennemførsel .

Efter 5 dages behandling med MGF anæstetiseres musene, blærerne (hvis de forekommer) fjernes kirurgisk fra brandsårene, og sårene fotograferes. Omridset af områder 30 af brandsår, som har regenereret epitel, overføres til transparente plastfilm med ensartet tykkelse ("Scotch"® overhead projector film), og procentdelen af de oprindelige forbrændte områder, som er helet, måles ved plani-metri. I tabel 2 er anført gennemsnitsværdier og område-35 værdier for gruppebedømmelserne. Resultaterne sammenlignes også med epitelregenereringsprocessen i unge (56-84 DK 167845 B1 44 dage gamle) C57/BL6 mus med identiske midtdermale forbrændinger, men som ikke behandles under forsøget. Alle musene anbringes hver for sig i bure, og forsøgsgrupper 5 består af 5 mus pr. gruppe.

Tabel 2 (mus, over 480 dage gamle) % af oprindeligt

Ibrsøg Dyr Behandling Gp. forbrændt område, son findes på dag 6 1 gammel 500ng MGF A 45 + 9

+20ng EGF

2 gairmel 100ng MGF B 51 + 7

+20ng EGF

3 gammel 10ng MGF C 54 ± 5

+20ng EGF

4 gammel 20ng EGF D 78 ± 5 5 gammel Bærer E 91- ± 5 6 gammel N.T. F 90 ± 6 7 ung N.T. G 36+7 * ikke testet

Tabel 2 angiver resultaterne af de planimetriske analyser og viser, at topisk applikation af MGF dagligt i 5 dage i en egnet bærepuffer og i nærværelse af en lille mængde 10 murint EGF stimulerer og fremmer regenereringen af epitelvæv hos gamle mus på dosisafhængig måde (forsøg 1-3) sammenlignet med EGF alene, bærer alene eller ubehandlede sår (forsøg 4-6). Unge mus kan øjensynlig gendanne epitel på deres sår uden nogen som helst topisk påføring af MGF 15 (forsøg 7).

DK 167845 B1 45

Histologiske analyser af de eksperimentelt fremkaldte sår i denne forsøgsrække viser, at de strækker sig (og formentlig indbefatter) basallaget (det germinative lag) 5 af epidermis. Sådanne sår heler i første række ved en fremgangsmåde, hvori der indgår deling og migrering af celler i såvel det vertikale som det laterale plan, og på en sådan måde, at der ikke kun sker gendannelse af epitel væv og lukning af såret, men hvor der senere dannes 10 en fortykkelse eller hyperkeratose af det regenererede epidermis. Histologiske analyser viser endvidere graden af forøgelsen (eller accelerationen) af denne reepitalise-ringsproces i dyr, som er behandlet med MGF (forsøg 1-3) og et relativt fravær af nyt epitel i hvilken som helst af 15 kontrolgrupperne (forsøg 4-6). Unge dyr udviser også en udtalt reepitalisering af deres sår (forsøg 7).

Resultaterne af et lignende forsøg med 100 ng MGF, en blanding af 100 ng MGF og 100 ng EGF, 100 ng EGF alene, bærer alene, ubehandlede gamle mus og ubehandlede unge mus 20 er anført i nedenstående tabel 3.

Tabel 3

Gruppe Behandling Procentdel af oprindeligt forbrændingsonrade på dag 6 1 ganunel 100ng MGF 46 ± 9 2 gammel 100ng MGF 41+5

+100ng EGF

3 gaitmel 100ng EGF 76 + 9 4 garanel bærer alene 78 + 5 5 gammel ubehandlet 81 ± 9 6 ung ubehandlet 34 ± 5

Tabel 3 viser epitelregenereringen af brandsår med deltykkelse hos grupper af gamle C57BL/6J mus, som er behandlet dagligt i 5 dage med en viskos bærepuffer inde-

Ulv Ib/b^tD b I

46 holdende MGF i nærværelse eller fravær af EGF. Hver gruppe består af 5 dyr. De anførte værdier er gennemsnitsværdier og spredningen for 3 individuelle bedømmelser af 5 hvert sår.

Sårheling hos gamle svin, test III:

To sunde gamle store hvide søer (alder 7-8 år, vægt 250-300 kg) sammen med to sunde unge hungrise (alder 2-3 måneder, vægt 25-30 kg) af samme race udvælges og 10 fastholdes hver for sig i snævre opbevaringskasser under forsøgets varighed for at undgå, at dyrene slikker deres sår eller ligger på dem. Da grise sædvanligvis aflives, inden de når deres normale levealder (søer holdes sjældent længere linder betingelser for husdyrhold til en alder på 15 mere end 4 år), er gennemsnitslevealderen for såvel arten som racen, når de holdes som laboratoriedyr, ukendt, selv om det vides, at gamle søer kan føde kuld i en alder af 10 år og nå en alder af 15-20 år. Grise er valgt som egnede modeller for sår med deltykkelse hos mennesker på 20 grund af lighederne i hudstruktur, morfologi og hastigheden for celleproduktion.

Alle dyrene barberes og behandles med en kommerciel hårfjernelsescreme, inden de såres.

Grisene er i fuld kirurgisk anæstesi inden påføringen af 25 en række sår. Som sedativ anvendes azaperon ("STRESNYL"®, Janssen, Beerse, Belgien, 1 mg/kg), der gives intravenøst til hver gris gennem den centrale ørevene, hvorefter der 20 minutter senere indgives metomidat-hydrochlorid ("HYPNODIL"®, Janssen, Beerse, Belgien, 4 mg/kg) på samme 30 måde.

Et messingstempel (3x3 cm, 78 g) ækvilibreres til 90°C i et vandbad, anbringes i fast kontakt med den afhårede rygoverflade af huden i nøjagtig 10 sekunder til dannelse DK 167845 B1 47 af flere brandsår med deltykkelse på hvert dyr, og den dannede blære fjernes.

Brandsårene med deltykkelse på dorsalsiden af brystkassen 5 af gamle svin behandles dagligt i 9 dage med 225 μΐ bærepuffer indeholdende enten MGF (4,5 /tg, 0,9 μg eller 0,45 μg), EGF (4,5 μg, 0,9 μg eller 0,45 μg) eller lige store blandinger af begge faktorer (4,5 μg MGF + 4,5 μg EGF, 0,9 ftg MGF + 0,9 μg EGF, 0,45 μg MGF + 0,45 μg EGF).

10 Disse doser vælges således, at svinene modtager den samme mængde materiale pr. cm^ såroverfladeareal som musene i et foregående forsøg. Kontrolbrandsår på hvert dyr gives enten bærestof alene eller gives ingen behandling. Som en yderligere kontrol påføres to unge grise enkelte sår med 15 deltykkelse, og disse grise gives heller ingen behandling under forsøgsperioden. Graden af gendannelse af epitelvæv for hvert brandsår bedømmes på forsøgets 10. dag ved hjælp af planimetri og ved hjælp af histologisk undersøgelse på en lille mængde biopsimateriale.

20 Resultaterne af den planimetriske analyse er vist i tabel 4. Den normale reepitalisering af ubehandlede sår er tydeligt bedre hos unge grise (behandling 12) end hos gamle (behandling 11) over forsøgsperioden på 10 dage. Som i de tidligere forsøg forbedrer en daglig topisk applika-25 tion af MGF, enten i nærværelse eller fravær af EGF, tydeligt helingsprocessen i det gamle dyr (behandling 1-6) i en sådan grad, at niveauerne for reepiteliseringen igen svarer til niveuaerne hos unge dyr med ubehandlede sår (behandling 12). Daglig applikation af bærepuffer 30 (behandling 10) eller EGF i en koncentrationsområde på 100-500 ng/cm^ brandsårsareal (behandling 7-9) har ingen virkning på reepiteliseringsprocessen hos gamle svin.

Lysmikroskopi af biopsimateriale bekræfter resultaterne af den planimetriske analyse og viser en tynd epidermis 35 bestående af så lidt som to tydelige lag epitelceller i

Ulv Ib/b4b b I

48 den intakte zone, som omgiver hvert sår, og tillige forøgelsen af reepiteliseringsprocessen i sår, som er behandlet med MGF (enten i nærværelse eller fravær af 5 EGF). Selv om der ikke er noget tydeligt tegn på nogen form for metaplasi i det nydannede epitelvæv, er en let men tydelig hyperkeratosis synlig hos alle grupper mus ved randen af hvert sår. En anden generel iagttagelse er, at sårene behandlet med MGF (enten i nærværelse eller fravær 10 af EGF) synes at indeholde mere granulationsvæv, for det meste lige under den nydannede epidermis, end det er tilfældet med sår, som ikke er blevet behandlet eller som kun er blevet behandlet med EGF alene eller bærestof alene. Generelt gøres lignende iagttagelser i den 15 begrænsede mængde biopsimateriale, som er tilgængeligt fra griseforsøget, selv om det strukturelle udseende af den intakte epidermis, som omgiver sårene hos gamle dyr, mere ligner det velafgrænsede flerlagsarrangement, som er karakteristisk for det yngre dyr.

20 Tabel 4 (gamle svin)

Viser epitelregenerering af brandsår med deltykkelse hos 2 gamle hvide søer, som behandles dagligt i 9 dage med en viskos bærepuffer indeholdende MGF i nærværelse eller fravær af EGF. De angivne værdier er gennemsnitsværdier og 25 spredningen for 3 individuelle bedømmelser af hvert sår.

49

Dyr Forsøg Behandling Procentdel af oprindeligt + antal brandsårsareal efter 10 dage

Dyr 1 Dyr 2 ganinel 1. 4,5 μg MGF 7 ± 4 10 + 2 gaiimal 2. 0,9 με MGF 10 ± 2 12 + 4 gaimiel 3. 0,45 με MGF 15 ± 6 15+5 gammel 4. 4,5 με MGF+ q + 2 18 + 4

4,5 με EGF

ganmel 5. 0,9 με MGF+ i« + 2 20 + 2

0,9 με EGF

gammel 6. 0,45 με MGF+ π ± 4 21 ± 5

0,45 με EGF

gammel 7. 4,5 με EGF 26 ± 4 29 ± 2 gammel 8. 0,9 με EGF 28 + 3 36 + 3 ganmel 9. 0,45 με EGF 29 + 2 37 +4 gammel 10. barer alene 31 + 6 37 + 5 gammel 11. ubehandlet 42 ± 6 40 + 6 ung 12. ubehandlet 8 ± 2 7 + 3

Resultaterne af test I til III viser, at MGF signifikant kan fremskynde og forøge sårhelingen, ved primær og sekundær sårheling, in vivo, hvorimod placebobehandlinger 5 eller aktiveringsmiddel alene i begge eksemplerne ikke fremkalder et sådant respons.

Cellulær immunrespons, test IV:

Enkeltblandet leukocytreaktion (MLR): Lymfocyter fra to forskellige musestammer (CBA og Balb/c) sammenblandes in 10 vitro i TC 96 pladehuller (2xl05 celler fra hver stamme pr. hul, CBA lymfocyter er såkaldte "respondere", og bestrålede Balb/c lymfocyter er såkaldte "stimulatorer"), og formeringsresponset målet efter 72 timers forløb ved hjælp af ^H-thymidininkorporering.

DK 167845 Bl 50

Resultat: ca. 1000 pg/ml MGF fremkalder 50% inhibering af formeringen.

Klonet T-celleanalyse (mus): En langtids T-cellemuseklon 5 specifik for et opløseligt antigen (arsenat-tyrosin) inkuberes in vitro i TC 96 pladehuller (10^ celler pr. hul) med peritoneale musemakrofager (2x10^ celler pr. hul), som forinden er blevet impulsbehandlet (pulsed) med antigen. T-celleproliferering og produktion af 10 interferon-γ måles efter 72 timers forløb.

Resultat: ca. 500 pg/ml MGF fremkalder 50% inhibering af såvel proliferering og IFN-y-afgivelse.

Murin lymfocytanalyse: Upræparerede murine lymfocyter stimuleres in vitro i TC 96 pladehuller (10^ celler pr.

15 hul) med lipopolysaccharid (LPS, 2,5 μg pr. hul), og det proliferative respons måles efter 72 timer ved hjælp af ^H-thymidininkorporering.

Resultat: ca. 1000 pg/ml MGF bevirker 50% inhibering af prolifereringen ved denne analyse.

20 Human T-lymfocytanalyse: Ubehandlede humane T-lymfocyter stimuleres in vitro i TC 96 pladehuller (10^ celler pr. hul) med enten a) phytohaemagglutinin A (PHA, 0,5%), b) anti-T3-antistof plus phorbolester (PDBu, 1 ng/ml) eller c) ionomycin (0,25 jig/ml) plus PDBu (10 ng/ml). Prolifera-25 tive respons måles efter 72 timers forløb ved %-thymidin-inkorporering.

Resultat: a) ca. 10 pg/ml MGF bevirker 50% inhibering af proliferering b) ca. 2 pg/ml MGF bevirker 50% inhibering af 30 proliferering c) ca. 10 pg/ml MGF bevirker 50% inhibering af proliferering.

DK 167845 B1 51

Antigenspecifik human T-lymfocytanalyse: Frisk isolerede humane T-lymfocyter stimuleres in vitro i TC 96 pladehuller (1()5 celler pr. hul) med et specifikt antigen, 5 stivkrampetoxoid, og det proliferative respons måles ved hjælp af ^H-thymidininkorporering.

Resultat: ca. 50 pg/ml MGF bevirker 50% inhibering af proliferering.

Klonet T-celleanalyse (Human): En langtids human T-celle-10 klon (T4+/T8-), som er specifik for et opløseligt antigen, rensede proteinderivater fra mycobakterier (PPD), inkuberes in vitro i TC 96 pladehuller (2x10^ celler pr. hul) med enten a) isologe humane monocyter (10^ celler pr. hul), som 15 forinden er blevet impulsbehandlet med antigen eller b) med isologe celler fra en Epstein Barr Virus (EBV) -transformeret B-cellelinie (8x10^ celler pr. hul).

Proliferative respons måles efter 72 timers forløb ved hjælp af ^H-thymidininkorporering.

20 Resultat: a) ca. 500 pg/ml MGF bevirker 50% inhibering af proli ferering b) ca. 20 ng/ml MGF bevirker 50% inhibering af proliferering.

11-2 drevet proliferering af human ConA lymfoblaster: 25 Humane concanavalin A (ConA) lymfoblaster inkuberes in vitro i TC 96 pladehuller (10^ celler pr. hul) i nærværelse af rekombinant interleukin 2 (rIl-2, 3 eller 9 ng/ml) og det proliferative respons måles efter 96 timers forløb ved hjælp af ^H-thymidininkorporering.

30 Resultat: ca. 0,1 pg/ml MGF bevirker 50% inhibering af prolifereringen.

DK 167845 Bl 52 11-4 drevet proliferering af humane T-lymfocyter: Ubehandlede humane T-lymfocyter (>95% T3+) inkuberes in vitro i TC 96 pladehuller (10^ celler pr. hul) i nærværel-5 se af PDBu (10 ng/ml) plus rekombinant interleukin 4 (rIl-4, 10 ng/ml), og det proliferative respons måles efter 72 timers forløb ved hjælp af 3H_-fchymidin-inkorporering.

Resultat: ca. 500 pg/ml MGF bevirker 50% inhibering af 10 prolifereringen.

Humoral immunrespons, test V:

Mus forbehandles in vivo med et hapten-bærerkonjugat (dinitrophenyl-hønsegammaglobulin, DNP-CGG, 200 μς pr. mus). To måneder senere behandles miltceller in vitro i TC 15 96 pladehuller (3x10^ celler pr. hul) med DNP-CGG

(10-100 ng pr. hul), og antallet af antihapten (DNP)-antistofdannende celler bestemmes efter 4 dage ved hjælp af en Jerne plaquetest.

Resultat: ca. 50 pg/ml MGF bevirker 50% inhibering af 20 antistof B-celler.

ca. 1000 pg/ml MGF bevirker endvidere 50% inhibering af proliferering.

Tumorcellelysering, test VI: MAF-analyse: Sammenhængende humane monocyter i TC 96 25 plader stimuleres i 24 timer med forskellige koncentrationer af MGF. Efter skylning af monocyterne en enkelt gang tilsættes melanoma A375 målceller. Kontroller indbefatter makrofager og tumorceller alene, en blanding af ikke-stimulerede makrofager med målceller, Klucel-30 opløsningsmidlet (se test I) og MAF-standarder.

DK 167845 B1 53

Efter 72 timers inkubering skylles cellemonolagene én gang, hvorpå de fikseres og farves med krystalviolet i 15 minutter. Ikke-bundet farvestof fjernes ved kraftig 5 skylning. De tilbageblevne farvede celler lyseres med eddikesyre, og OD måles ved 590 nm med et Multiskan-8 kanalfotometer udstyret med en Olivetti M24 PC til beregning af aktiviteten af forsøgsforbindelserne. De opnåede data udtrykkes som ED3Q-værdier.

10 Resultater: MGF-behandling stimulerer monocyterne til tumorcytolytisk aktivitet. EDøg-værdien findes ved koncentrationen 0,17 ± 0,14 ng/ml (n = 4 forsøg).

Klucel-kontrollerne er ikke virksomme.

Cytotoksicitet for proliferering af Melanoma A375 celler: 15 MGF fortyndes i C-RPMI medium + 5% FCS i TC 96 plader. Som kontroller anvendes medium alene og Klucel. (100 ng MGF opløses i 50 μΐ Klucel og fortyndes derpå med C-RPMI medium + 5% FCS). 1,2 x 10^ A375 målceller sættes til hvert hul. Efter inkubering i 72 timer ved 37°C i 5% CO2 20 farves A375 tumorcellemonolagene, og den cytotoksiske virkning beregnes på samme måde som beskrevet for MAF-analysen.

Resultater: MGF er cytotoksisk over for prolifererende melanoma A375 tumorceller. ED3Q-værdien findes ved 25 koncentrationen 0,18 ± 0,12 ng/ml (n = 4 forsøg).

Disse forsøg viser, at MGF-koncentrationerne, som stimulerer monocyter til tumorcytolyse og den direkte tumorcytotoksiske virkning ligger meget tæt (0,17 ± 0,14 i forhold til 0,18 ± 0,12).

DK 167845 Bl 54 Vækstinhibering af østradiol-afhængig og østradiol-uafhængig humane brystcancercellelinier, test VII:

To humane brystcarcinomacellelinier med østradiol-5 receptorer, MCF-7 og ZR-75-1, og én human brystearcinoma-cellelinie uden målelige østradiolreceptorer, MDA-MB-231, podes hver for sig på TC96 plader ved en tæthed på 3-6x103 celler pr. hul og stimuleres med forskellige koncentrationer af MGF i Klucel-opløsningsmiddel (se test I).

10 Kontroller indbefatter carcinomaceller alene og carcinoma-celler dyrket i nærværelse af Klucel-opløsningsmiddel alene. Efter 8-10 dages inkubering under fastlagte serumfri betingelser skylles de sammenhængende cellemonolag, hvorpå de fikseres og farves med krystalviolet i 15 15 minutter. Alt ikke-bundet farvestof udvaskes fuldstæn digt, og da den bundne farve er begrænset til kernen, giver denne teknik en kolorimetrisk analyse for måling af cellevækst og proliferering. O.D. måles ved 590 nm med et Multi-skan 8 kanalsfotometer udstyret med en Olivetti M24 20 PC til beregning af aktiviteten af forsøgsforbindelserne på carcinomacellevækst i forsøgsperioden.

Resultater: Behandling med MGF i et koncentrationsområde fra 10-9 til 10-13 m inhiberer væksten af såvel østradiol-afhængige cellelinier MCF-7 og ZR-75-1 som den 25 østradiol-uafhængige cellelinie MDA-MB-231 sammenlignet med ubehandlede kontrolceller. Klucel-opløsningsmiddel har ingen virkning på nogen af cellelinierne i denne analyse.

Claims (15)

1. Mælke-vækstfaktor (MGF) i fra 10^ til over 10? gange beriget form, som kan udvindes fra mælk eller 5 mælkeprodukter, har en molekylvægt på ca. 25 kd bestemt ved SDS-PAGE og et isoelektrisk punkt på mellem pi 9,0 og 10,5, eller et salt deraf.

2. Mælke-vækstfaktor ifølge krav 1, som i alt væsentligt er fri for andre vækstfaktorer, der findes i 10 mælk, og som har en lavere eller højere molekylvægt end disse og et andet pi, eller et salt deraf.

3. Mælke-vækstfaktor ifølge krav 1 på i alt væsentligt ren form.

4. Mælke-vækstfaktor ifølge krav 1, som kan udvin-15 des fra komælk i praktisk taget ren form med følgende aminosyresammensætning: DK 167845 Bl 56 Aminosyre Aminosyrer/mol a) b) ASP + ASN 21,10 20

5. Mælke-vækstfaktor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den foreligger i form af acetatet.

5 GLU + GLN 24,68 24 SER 19,00 18 THR 10,02 10 GLY 10,62 10 ALA 14,64 14

6. Kombination af MGF ifølge krav 1 og et vilkår-5 ligt polypeptid, som udøver en agonistisk virkning ved binding til EGF-receptorer.

7. Synergistisk kombination ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den indeholder en mælke-vækstfaktor og EGF i omtrentlig ækvimolære mængder.

8. Fremgangsmåde til fremstilling af mælke-vækst faktor (MGF) eller et salt deraf, kendetegnet ved, at MGF udvindes fra mælk eller et hvilket som helst mælkeprodukt, som indeholder MGF, og, om nødvendigt, omdannes dannet fri MGF til et salt eller et dannet salt til den fri MGF.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at MGF udvindes fra frisk komælk.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at MGF udvindes fra tørret skummetkomælkspulver.

10 ARG 9,50 10 PRO 12,92 12 VAL 10,68 10 MET 0,16 2 ILE 11,04 10

15 LEU 22,40 22 TRP ikke bestemt PHE 7,78 8 CYS 11,16 12 LYS 16,14 16

20 HIS 5,84 6 TYR 13,38 14 [a): mol aminosyre pr. mol peptid, b): afrundet til aminosyrerester pr. mol peptid ] og følgende N-terminale aminosyresekvens 1 5 10 15 Ala-Leu-Asp-Ala-Ala-Tyr-Cys-Phe-Arg-Asn-Val-Gln-Asp-Asn-Cys-Cys-X17- 25 -X18-Pro, hvori χ17 Qg χΐ8 er ut,estemte aminosyrer, eller et salt deraf. DK 167845 B1 57

11. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det 20 indeholder en effektiv mængde mælke-vækstfaktor ifølge krav 1 eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf på dosisenhedsform.

12. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder en effektiv mængde af en kombination af MGF og 25 et vilkårligt polypeptid, som udøver en agonistisk virkning ved binding til EGF-receptorer.

13. Farmaceutisk præparat ifølge krav 11, kende tegnet ved, at det er en tandpasta eller et mundskyllevand. 58 UK Tb/84b ΒΊ

14. Kosmetisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder en effektiv mængde mælke-vækstfaktor ifølge krav 1 eller et salt deraf.

15. Celledyrkningsmedium, kendetegnet ved, at det indeholder en vækstfremmende stimulerende mængde MGF ifølge krav 1 eller et salt deraf.