JPH11502235A - ジクチオテール由来の抽出物、その調製方法および該抽出物を含む組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生物学分野、特に海洋由来の生物活性物質。ジクチオテール科の植物から抽出される特徴的な分析特性を有する新規な生物活性物質と、この新規物質の調製方法と、この物質を含む医薬品、化粧品および／または食品組成物。この生物活性物質は動物および人間の組織の細胞間マトリクスのグリコシル化要素の合成を良くするための医薬品／化粧品および食品組成物の製造で利用される。

Description

【発明の詳細な説明】 ジクチオテール由来の抽出物、その調製方法および 該抽出物を含む組成物 本発明は生物学分野、特に海洋由来の生物活性物質に関するものである。 本発明は、ジクチオテール(Dictyotales)科の植物から抽出される新規な生物 活性物質と、その抽出方法と、該抽出物を含む組成物とに関するものである。 本発明の組成物は、動物および人間の組織の細胞間マトリクス（細胞外間充織 ）（ＭＥＣ）のグリコシル化成分(elementsglycosyles)の合成を良くするために 使用できる。 ジクチオテール科という用語は、炭酸カルシウムを固定、濃縮、析出し、ある いは葉状体上にアラゴナイト（霰石）とよばれる炭酸カルシウム結晶を生成する ものを意味する。 植物という用語は乾燥状態、生の状態、粉砕状態あるいは自然の状態のものを 意味する。 本発明の生物活性物質が抽出される植物は、褐藻類、フコフィシー(Fucophyce ae)綱、ジクチオテール目、ジクチオタシー(Dictyotaceae)科のものである。ジ クチオテール科に属する属はわずかに数種類すなわちパディナ(Padina)、ゾナリ ア(Zonaria)またはジクチオタ(Dictyota)である。パディナ属には最もよく見ら れる種がまとめられている。例えば、地中海沿岸にはパボニカ(pavonica)、ボヤ ナ(boryana)(P.tenuis)、ブルゲセニ(boergeseniii)などの種が見られ、太平洋 沿岸には（すでに挙げたものは除いて）アルボレセンス(arborescens)、オスト ラリス(australis)、ボヤナ(boyana)、コーレンス(caulens)、コメルソニ(comme rsonii)、コンクレセンス(concrescens)、クラセ(crasse)、ドルビレイ(durvell ei)、エレガンス(elegans)、フェルナンデジアナ(fernandeziana)、フレスリ(fr eseri)、ジムノスポラ(gymnospora)などの種が見られ、同様に大西洋沿岸では、 グラブラ(glabra)、ヘテンシス(haitensis)、ディストロマティカ(distromatica )、ドゥビア(dubia)などの種が見られる。インド洋には特有の種が見られる。以 上の植物の特徴の１つは葉状体上にアラゴナイト型の炭酸カルシウム層を固定し 、葉状体表面に斜方晶系の炭酸カルシウム層を固定することである。この特徴は 植物と一諸に得られる粉末をＸ線回折試験することで見られる。Ｘ線の回折では これら植物の粉末は２θ：-3,393℃、-3,268°、-2,699°、-2,682°、-2,371° 、-2,336°（ダブレット）、-1,976°、-1,877°（ダブレット）に強いピークを 有する。これらの回折角度はアラゴナイトに特徴的なものである。 本発明の対象は、動物および人間の組織の細胞間マトリクスのグリコシル化成 分の合成を良くする新規な生物活性物質であるジクチオテール科の植物の抽出物 にある。 この新規な生物活性物質は４〜10個の炭素原子を有し且つ２つの二重結合を有 する直鎖または分岐鎖を有する多環構造によって特徴付けられる。 この新規物質は詳細な分析データによっても特徴付けられる。 本発明はさらに、ジクチオテール科の植物から抽出される生物活性成分の抽出 方法に関するものである。 その第１段階では、ジクチオテール科の植物を採種後に、薬学的特性を損なわ ないように、できれば遮光した状態で乾燥さ せる。強い光にあてて長時間乾燥すると、活性の低い不安定な物質が生じる。従 って、活性物質を得るのにより適した方法で乾燥するのが好ましい。 そのためには、粉砕された植物または自然のままの植物を熱を加えずに通気乾 燥させる。それによって暗い栗色の上に炭酸カルシウムが鮮明な白い縞模様が際 立って見える植物材料が得られる。 経済的にはより安価で同様に満足な結果を与えるもう一つの方法は、強力に植 物の水を切った後に真空乾燥させる方法である。粉砕した（またはしていない） 植物を凍結乾燥させることによって無水の生成物を得ることができ、有利である 。 上記２つの方法では濃い茶色がかった緑色の材料が得られ、この材料は非常に 脆く、容易に粉末化するため、溶媒を用いて生物活性成分を抽出する操作が容易 になる。 強力に乾燥させた植物の利点は保存性の良い（水分のない状態で）植物材料が 得られ、この植物材料から極性溶媒の存在に邪魔されることなく活性物質（安定 化されたもの、またはされていないもの）を抽出することができる点にある。さ らに、完全に乾燥された植物は粉末化が容易である。 生物活性物質を得る方法は、ジクチオテール科の植物を乾燥および／または凍 結乾燥し、粉砕し、その後、低級アルカノール（エタノール等）、脂肪族ケトン （アセトン等）、アルカン（ペンタン、ヘキサン、ヘプタン等）、シクロアルカ ン（シクロヘキサン等）、ハロゲンを含む溶媒（クロロホルム、ジクロロメタン ）、芳香族溶媒、エステル（ジエチル酢酸等）、エーテルおよび類似物で構成さ れる群から選択される有機溶媒を用いて植物材料を１回以上抽出することによっ て植物の有機抽出 物を調製し、溶媒を蒸発させて有機抽出物を乾燥させ、乾燥した有機抽出物を液 ／液抽出、高圧または低圧カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフ ィーを順次行う精製段階を一回以上行って精製し、ジクチオテール科の植物の活 性成分を得るものである。 有機溶媒は単独または組み合わせて使用することができる。一般には水と混和 する有機溶媒、さらに植物の葉状体から活性成分を抽出可能な任意の溶媒を使用 することができる。 活性生物物質は溶媒を除去した状態で得られるのが好ましいので、溶媒は揮発 性のものから選択される。実際には、生物活性物質を溶解する揮発性溶媒はセル ロールまたはその誘導体、コロイドシリカ、高分子量アルカン（例えばパラフィ ン）、両親媒性溶媒（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プロピレング リコール）あるいはグリセロールなどの支持体から蒸発させることができる。有 機溶媒としてはアセトンまたはエタノールを使用するのが好ましい。 使用する割合は、植物材料１g に対して溶媒５mlにするのが好ましく、植物材 料と有機溶媒との接触時間は４〜５日間にするのが好ましい。 浸漬時に溶媒に対する乾燥材料の比率を種々変えて行って良い結果が得られて いる。同じ量の乾燥材料に対する使用量は１〜50の間で変化する。同様に有機溶 媒と植物材料の接触時間も12時間〜５日間の間で変化する。 さらに、操作はより難しくなるが、アンモニア性媒質を用いた水性抽出でも満 足な結果が得られる。 生物活性物質の抽出では選択した溶媒に植物材料を浸漬する必要はなく、溶媒 を粉末上を連続的に通過させる（パーコレー ション）ことで行うことができる。流速を調節して所定の活性溶液を得られるま で抽出物を濃縮するだけでよい。 本発明では、乾燥および／または凍結乾燥させたジクチオテール科の植物を粉 砕し、材料１ｇあたり５mlのアセトンを用いて４〜５日間アセトンと接触させる ことによって１回以上の抽出を行う。 得られたアセトン抽出物からアセトンを蒸発させて抽出物を乾燥し、下記精製 段階で精製する。 精製の第１段階は液／液抽出で行う。残留物すなわち乾燥したアセトン抽出物 に再びメタノール／水混合物を加え、この溶液をヘキサンで抽出する。続いて、 水メタノール相を濃縮して水で稀釈し、さらにエーテルで抽出する。このように して得られるエーテル相に生物活性物質が含まれる。 精製の第２段階は低圧カラムを用いたクロマトグラフィーで行う。担体はセフ ァデックス（Sephadex LH20 登録商標）型のゲルを使用する。濃度勾配をつけた クロロホルム／メタノールを用いて溶出する。クロロホルム／メタノール比率が 97／3(v/v)の画分に生物活性物質が溶出する。クロロホルム／メタノール70/30 を用いてカラムをリンスすると、第２の残留活性画分が溶出する。 次の精製段階は半調製用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で行う。カ ラム寸法は 250 mm（長さ）×10mm（直径）である。使用する担体は：グラフト シリカＣ₁₈と、グラフトシリカジオールである。流速は８ml／分にする。 グラフトシリカジオールの担体を用い、溶出液がヘキサン／イソプロパノール 92/8の場合、活性画分は20〜25分と35〜40分で溶出する。グラフトシリカＣ₁₈を 担体として使用した場合、 アセトニトリル／水85/15 の溶出液では15〜17分に活性成分が溶出し、アセトニ トリル／水／酢酸85/15/0.05の溶出液では、活性成分は17〜20分と30〜40分に溶 出する。 以上の精製段階で黄緑色の生物活性物質が得られる。 ジクチオテール科の植物から抽出された生物活性成分の特性は各種の分析（Ｕ Ｖスペクトル、ＩＲスペクトル、ＮＭＲ、薄層クロマトグラフィー）で決定する 。 最終的に得られる活性画分のメタノール中でのＵＶスペクトルは 202nm（228n m に肩あり）、260〜270nm 、400〜460nmおよび630nm にある複数の吸収バンド で特徴付けられる。 精製段階終了後、化学試薬を用いて薄層クロマトグラフィー（ＣＣＭ）を行う （使用する検出試薬はスルフリックアニスアルデヒド、スルフリックバニリン、 ホフホモリブデート、エタノール硫酸）。検出後、複数のスポットが確認される 。先端保持時間は以下の通り：Ｒｆ値は0.15、0.90および0.95であり、これは同 様の条件で行った調製用ＣＣＭすなわちグラフトシリカジオールを用いてヘキサ ン／イソプロパノール85／15で溶出させたＣＣＭプレートで得られる生物活性領 域に相当する。 質量分析スペクトル、ＩＲスペクトルおよびプロトンＮＭＲまたはＣ¹³ＮＭＲ スペクトルでも同様にジクチオテール科の植物から抽出された本発明の新規な生 物活性物質の構造に関する情報が補完された。 Ｃ¹³ＮＭＲスペクトル分析の結果、４〜10個の炭素原子を有し且つ２つの二重 結合を含む直鎖または分岐鎖を有する多環構造に結合した状態で存在することが 示された。 本発明のジクチオテール科の植物から抽出される生物活性物質は、乾燥させた 植物材料１ｇを５mlのエタノールを用いて12 時間浸漬または浸出することによっても得られる。 エタノールは細胞に受入れられ易い溶媒であり、しかも、細胞が浸漬されてい る栄養分の豊富な水性溶液に対して完全に混和性である。その後、下記の精製段 階を行う。 通常のシリカカラムを用いた高圧クロマトグラフィーに通し、高圧クロマトグ ラフィー用装置に20μｌの生物活性画分を添加し、ヘプタン／エーテル（90／10 ）混合物を用いて流速２mm／分で溶出させる。ジクチオテール科の植物から抽出 された活性は全て6.9 分〜8.5 分の間に溶出した画分中に見られる。同様に高速 液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で操作することもできる。ＨＰＬＣカラム にグラフトシリカＣ₁₈を充填し、溶出液はメタノール／水（80／20）とし、流速 は４ml／分にする。抽出された物質の活性は全て保持時間16〜18分で溶出する画 分中に濃縮される。 光の拡散を利用した検出器を用いたクロマトグラムから、減圧下で操作すれば （従って、移動相の蒸発によって活性画分が随伴されることはないという条件で ）、この保持時間に植物の活性画分を構成するかなりの量の物質が確認される。 従って、ジクチオテール科の植物から抽出される新規生物活性物質は、アセト ンを用いて抽出を行った場合、精製段階の下記分析データで特徴付けられる： a) グラフトシリカジオールを担体としてヘキサン／イソプロパノール(92/8)溶 出液を用いて行った半調製用高速液体クロマトグラフィーにおける保持時間が20 〜25分および35〜40分である。 b) グラフトシリカＣ₁₈を担体としてアセトニトリル／水(85/15）溶出液を用い て行った半調製用高速液体クロマトグラ フィーにおける保持時間が15〜17分である。 c) グラフトシリカＣ₁₈を担体としてアセトニトリル／水／酢酸(85/15/0.05)溶 出液を用いて行った半調製用高速液体クロマトグラフィーにおける保持時間が17 〜20および30〜40分である。 エタノールで抽出を行った場合の精製段階における分析データは以下のとおり である： a) ノルマルシリカのカラムを用いてヘプタン／エーテル(90/10)を溶出液とし て行った高圧クロマトグラフィーにおける保持時間が6.9 〜8.5 分である。 b) グラフトシリカＣ₁₈カラムを備えた高速液体クロマトグラフィーでメタノー ル／水(80/20)を溶出液として用いた場合の保持時間が16〜18分である。 本発明の生物活性物質は、アセトンで抽出を行った場合、精製段階の後で以下 の分析データで特徴付けられる： a) メタノール中におけるＵＶスペクトルが202 nm（228nm に肩あり）、260nm 〜270nm 、400〜460nm および630nm に複数の吸収バンドを示す。 b) 化学的検出（スルフリックアニスアルデヒド、スルフリックバニリン、ホス ホモリブデート、エタノール硫酸）後、薄層クロマトグラフィー（ＣＣＭ）で示 される先端の保持時間は0.15、0.90、および0.95である。 有機溶媒を用いて抽出される物質は取扱いが難しいことが多い（揮発、水和、 爆発の危険等）ので、固体支持体、例えばセルロース等の吸収性有機ポリマー、 吸収性または吸着性の無機物または無機組成物（コロイドシリカ）、不活性物質 、例えばパラフィン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プロピレン グリコール、ポリビニルピロリドン等に固定するのが望ましい。ほとんど酸素を 含まない不活性支持体は全て適している。 固定された物質の特性は、ジクチオテール科植物の抽出条件、固定用材料、安 定化条件および抽出溶媒の固定材料によって大きく変化する。従って、粘稠度は 可変であり、色は純粋な緑色から栗色まで様々である。 本発明はさらに、無機または有機材料に吸着後、溶媒を除去した生物活性物質 に関するものである。 ジクチオテール科の植物から抽出される本発明の生物活性物質は非常に有効な 薬学的特性を示すので、治療、美容、食品、人間および動物の栄養学、移植学お よび整形外科（骨または関節に関する外科）で利用される。 この物質は医薬、美容および／または食品組成物あるいはインプラントとして 使用される。 ジクチオテール科の植物より抽出された本発明の生物活性物質は動物および人 間の組織の細胞間マトリクスのグリコシル化成分の合成を改変し、この物質はヒ アルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン 硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸等のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）類の合成、 アグレカン、デコリン、ビグリカン、ベルシカン、フィブロモジュリン、フィブ ログリカン、シンデカン、ベタグリカン、グリピカン等のプロテオグリカン類の 合成を刺激する。 従って、本発明の生物活性物質は動物や人間の組織の細胞間マトリクス（ＭＥ Ｃ）のグリコシル化成分の合成を改変し、特に動物および人間の組織の細胞間マ トリクス（ＭＥＣ）のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）およびプロテオグリカン の合成を刺激する組成物の製造で使用される。 本発明物質は皮膚におけるグリコサミノグリカンおよびプロテオグリカンのグ リコシル化合成を良くするために美容または皮膚科学での組成物の製造で使用さ れる。 本発明物質は、結合組織または間充組織細胞の蛋白質合成および配糖体合成を 刺激する。本発明物質は上皮組織に直接作用することによって結合または間充組 織細胞の活性を間接的に改変するための局所用組成物の製造で使用される。ジク チオテール科の植物から抽出される物質は、ＭＥＣのグリコサミノグリカンのゴ ルジ体および膜の合成およびＭＥＣのプロテオグリカンのゴルジ体の合成を刺激 する。 さらに、この物質は例えばコラーゲン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸 、ヒアルロン酸の合成を良くする。 この物質はＭＥＣのグリコサミノグリカンのゴルジ体および膜の合成およびＭ ＥＣのプロテオグリカンのゴルジ体の合成を刺激するための組成物の製造で使用 できる。 本発明の物質は皮膚細胞（繊維芽細胞、角質細胞）、骨細胞（骨芽細胞、軟骨 細胞）および骨以外の関節組織の細胞（滑膜細胞）に対して活性である。 人間では、ジクチオテール科の植物から抽出された生物活性物質を摂取するこ とによって、乾燥状態の植物と全く同様に、間充組織、特に肌（真皮および表皮 ）、骨（軟骨、篩骨、柱骨(os trabeculaire)、軟骨層）の組織のＭＥＣのグリ コシル化成分の合成が良くなる。 従って、ジクチオテール科の植物から抽出された物質は皮膚、骨および軟骨の 組織損傷（病変）の予防および／または治療のための医薬品組成物の製造で使用 できる。 一般に、この物質は、動物および人間の細胞間マトリクスの グリコシル化成分に関する疾患の予防および／または治療用組成物の製造で使用 される。 本出願人の研究の結果、この活性はエステラジオールおよびビタミンＤ₃（1-2 5(OH)₂D₃）、ビタミンＣなどの賦活作用のある多くの物質によって誘導される活 性とは異なることを確認した。本発明の植物に含まれる活性物質は、インターロ イキン（例えばIL-1）等の有害物質の存在下でもその活性を発現し、従って、生 物活性なこの物質は回復活性(active reparatrice)を有する。 この生物活性物質はさらに、細胞に対して間接的な活性を有する。すなわち、 植物から抽出された活性物質が第１の細胞群に到達し、この細胞群から標的細胞 に向かってサイトカイニン、成長因子またはホルモンなどのメッセンジャーが分 泌されることによって、活性物質はメッセンジャーを介して標的細胞に作用する 。 ジクチオテール科の植物から抽出された物質の活性は、環形動物、ホヤ類（原 索動物の総称）、節足動物門、軟体動物類、二枚貝（貝殻を有するもの）、輔皮 動物門、鳥類および哺乳類等の各種の門に属する動物種に由来する細胞に対して 発現が認められる。 ジクチオテール科の植物から抽出される生物活性物質はさらに、節足動物（エ ビやカニ類）や貝類の養殖、並びに卵の殻の品質を向上させるための食品組成物 を製造する目的で使用される。 ジクチオテール科の植物から抽出される物質はさらに、整形外科（骨に関する 外科）でも非常に有利であり、この物質は、組織移植の際に骨芽細胞の表現型を 保存し、骨や関節表面を再 生させるために関節の近くに生体材料と供に挿入することができる。 従って、この物質はさらに、関節疾患の予防および／または治療用組成物の製 造で使用される。 本発明の物質はさらに、細胞間マトリクスのグリコシル化成分の関与する局部 的疾患の予防および／または治療のための局所施用組成物の製造で使用される。 生物活性物質はさらに、細胞間マトリクス変性症に関連する疾患の予防および ／または治療と、軟骨組織の再生または食品の補完用組成物の製造で使用できる 。 本発明はさらに、動物および人間の組織の細胞間マトリクスのグリコシル化要 素の合成を良くする医薬、美容および／または食品組成物であって、活性成分と してジクチオテール科の植物から抽出される生物活性成分を、目的の用途に適し た不活性で無毒性の賦形剤またはベヒクルと組み合わせた状態または混合した状 態で含み、必要に応じて相補的活性成分を含むことを特徴とする組成物に関する ものである。 本発明の医薬、美容および／または食品組成物は、経口、非経口、経皮的、局 所的または直腸経由で投与できる。従って、この組成物は糖衣錠または無糖衣錠 、カプセル、ゼラチンカプセル、ピル（丸剤）、タブレット、（オブラートに包 んだ）薬包、シロップ、経口摂取用または外用粉末、術後の瘢痕形成、火傷、外 傷用の補助組成物、座薬、アンプル注射溶液または懸濁液、クリーム、ジェルま たはポマード、浸透性極性溶媒に入った経皮投与用溶液の状態で提供される。 皮膚投与用で全身性の効果を示す組成物は特にユニークである。すなわち、こ の条件では角質細胞（皮膚の表皮）に塗布し たジクチオテール科植物由来の生物活性物質が軟骨細胞、滑液細胞、骨芽細胞、 さらにおそらくは他の間充組織細胞に作用して因子(facteur)の分泌を刺激する 。 本発明の他の対象は、活性成分としてジオクチオテール科の植物から抽出され る生物活性物質を、不活性で無毒且つ所望用途に適した賦形剤またはベヒクルと 組み合わせ、あるいは混合した状態で含み、必要に応じて相補的な効果を有する 他の活性成分を含むことを特徴とするインプラントにある。 以下、本発明の実施例を説明するが、本発明が下記実施例に限定されるもので はない。実施例１ ジクチオテール科植物の抽出物の活性の研究 1) 活性の研究 得られる効果が植物の特殊な生物活性物質に起因することを示すために、高速 液体クロマトグラフィーまたは高圧クロマトグラフィー分析時に単離可能な全て の画分に対して活性の研究を行った。 この植物の活性を研究するために２つの半定量的評価方法を用いた。 細胞または組織の培養物から細胞間マトリックス成分を特殊抗体によって固定 された細胞を免疫標識することによって検出するか、細胞の破壊後、特殊抗体に よって物質の検出および識別を用いたゲルクロマトグラフィーまたは電気泳動（ 電界クロマトグラフィー）で検出する。 上記２つの方法では、特殊抗体は蛍光分子と連結した第２抗体あるいは基質の 発色団を発現させるような活性を有する酵素 と結合した第２抗体によって検出される。 相対的定量化は画像分析（免疫蛍光法）または着色基質（ウェスタンブロット 法）の使用時は単純な分光光度分析で行うことができる。画像分析が必要な時は 、検光子BICOM 200 を用いて複数の細胞培養物について得られた複数のネガから 結果を定量化する。いずれの場合でも、値は対照に対する相対値および／または 合成蛋白質の総量に対する相対値（半定量的評価）で示される。半定量的評価に よって結果同士を比較することができる。しかし、抗体の親和性が（抗体は特異 的であるにもかかわらず）２つの抗原−抗体結合について同じではないために、 他の細胞の化合物の合成とは比較することはできない。 外科的処置の際に採取された組織の断片から単離した細胞のマトリックス合成 を研究した。培養物は第１単層培養物に作り、結果を３次元細胞培養物によって 確認した。組織断片の培養物、皮膚、関節、骨は同様な結果であった。 2) 結果 結果は知覚した信号値に対応する数で示される。 表中の文字“ＳＢＡ”はジクチオテール科植物から抽出された生物活性物質を 表している。 1) 第１単層培養物でヒトの線維芽細胞によって合成されたデルマタン硫酸： 2) 第１単層培養物中でヒトの線維芽細胞によって合成されたヒアルロン酸 3) 第１単層培養物中でヒトの軟骨細胞によって合成されたコンドロイチン硫酸 ： 4) 第１単層培養物中でヒトの軟骨細胞によって合成されたヒアルロン酸： 3) 活性の制御 この制御は文献に従って３次元培養物に行った。ここでは、アルギン酸のゲル を用いた。 1) ３次元培養物中でヒトの軟骨細胞によって合成されたコンドロイチン硫酸： 4) ３次元培養物中でヒトの軟骨細胞によって合成されたヒアルロン酸： 全く同じ結果が各種哺乳類の骨から採取した骨芽細胞の内容物を用いて得られ た。 この結果を確認するために、ジクチオテール科の植物から抽 出された生物活性物質を多数の傷付いた軟骨の組織培養物に加えた。傷ついた軟 骨はコンドロイチン硫酸およびヒアルロン酸型のグリコースアミノグリカンの貯 蔵時に合成不良であるということが確認されている。ジクチオテール科の植物か ら抽出された生物活性物質で処理した傷付いた軟骨は、活性物質で処理していな い健康な媒体より優れた合成率を示した。 4) 生物活性物質の薬学作用 ジクチオテール科の植物から抽出される生物活性物質の薬物学的作用を下記a) 、b)によって客観化した： a) 回復作用：細胞間マトリクスの有害な抑止剤の存在下での物質の回復作用。 b) 間接作用：成長因子またはホルモンであるcytokine等のメッセンジャーを介 する物質の間接作用。 今日では関節現象の大部分は関節表面の退化が原因であるということで文献の 意見は一致している。 a) 回復作用 物質の回復作用は病理学的過程に関与する生物学的介入による有害作用に対す る反応性で見られる。主要な生理学的介入剤はインターロイキン(interleukine １(IL-1)である。 従って、IL-1 の存在下で培養された間充織細胞によって生成されたグリコー スアミノグリカンに対するジクチオテール科植物から抽出される生物活性物質の 活性を評価する。 1．IL-1 の存在下での培養結果 1) 単層培養物中でヒトの線維芽細胞によって合成されたヒアルロン酸： 2) 単層培養物中でヒトの線維芽細胞によって合成されたデルマタン硫酸または コンドロイチン硫酸： 3) 単層培養物中でヒトの骨芽細胞によって合成されたヒアルロン酸： 4) 単層培養物中でヒトの骨芽細胞によって合成されたコンドロイチン硫酸： 5) ３次元培養物中でヒトの軟骨細胞によって合成されたヒアルロン酸： 6) ３次元培養物中でヒトの軟骨細胞によって合成されたコンドロイチン硫酸： 別の型の細胞および抽出物の培養物を用いた場合にも同じ種類の結果を得た。 外植を用いた半定量的評価では断面図を考慮しなければならないので難しい。 b) 間接作用 本出願人は、驚くべきことに、ジクチオテール科の植物から抽出される生物活 性物質（ＳＢＡ）を用いて培養した細胞は他の細胞の信号を伝達でき、その信号 は生物活性物質と接触する時に知覚されるということを見出した。従って、この 生物活性物質は第２メッセンジャーの分泌を刺激できる。このメッセンジャーは 別の型の細胞に作用し、プロテオグリカンの合成を刺激する。 この現象を証明するために下記の方法で試験を行った： ケラチノサイト（ヒトの表皮細胞）の培養中に、生物活性物質を添加する。数 時間培養後、細胞を数回洗浄し、生物活性物質（ＳＢＡ）の残部を留去する。次 いで、胎児の子牛および動物の血清を用いない新しい媒体（例えばK.E.M.または Mac Coy）を添加する。新たな培養後、媒体を採取する。こうして得られた条件 化された媒体を凍結乾燥する。凍結乾燥したものを再び取り、次いで、中で第２ 培養が行われる特殊な媒体(例えば、線維芽細胞にはDMEM、骨芽細胞にはMac Coy )で1/4 または1/10に希釈する。ケラチノサイトから生じた条件化された媒体に よって処理された細胞の培養物は、培養物が生物活性物質によって直接処理され た培養物自体である場合と同じ比率で、プロテグリカンの合成率を向上させる。 しかし、ケラチノサイトによって条件化された媒体の存在下で培養し、生物活性 物質では培養していない培養物はその合成が改良しない。 さらに、条件化された媒体への反応は希釈前に凍結乾燥したものをアルコール で取るか、水性媒体か取るかによって変化する。 ある種の経験的条件では、骨芽細胞はケラチノサイトによって条件化された媒 体をアルコールで取った時に良く反応する。同じ処理であるのに、線維芽細胞と 骨芽細胞との間では、凍結乾燥したものを直接媒体によって取った時により良い 反応があった。このことから細胞から浸出したメッセンジャーと、同じ集団に同 じ信号を与えるメッセンジャーは異なるものであると考えられる。この試験から 、皮膚のケラチノサイト上または上皮組織上での活性成分を含む組成物を使用す ることによって皮膚下の組織のプロテオグリカンの合成を改良できると考えられ る。実施例２ 組成物 1) 例としては、下記抽出物（生物活性物質を含む）の１種を調製することがで きる： または 生物活性物質（ＳＢＡ）を含む抽出物の担体への固定： 有機溶液はセルロース誘導体の担体から蒸発させる。 または、 有機溶液は液体または固体のＰＥＧ中で蒸留する。有機溶液／担体の比率は大 きく変化でき、求められる効果（質量効果、遅延配合物、in situ 作用、一般系 の作用等）に関連する。 2) 組成物の一般的利用 生物活性物質をエタノールで抽出し、不活性担体に固定したものを含むカプセ ルおよび錠剤の配合物は、非常に単純であることが分かっている。そのためには 、エタノールで抽出された生物活性物質を微結晶セルロースと、タルク等の潤滑 剤と、グリセロールベヘン酸塩等の圧縮補助剤と混合する。 エタノールで抽出された生物活性物質の吸着剤を利用し、ポリエチレングリコ ール4000または6000に固定し、次いでコロイド型シリカ、登録商標Aerosil また は登録商標Sippernal で希釈してカプセルを製造する。 経皮（transcutanee）法は従来の方法で配合し、貯蔵容器は 用いても用いなくてもよく、従来型の登録商標Transcutolの付形剤を用いる。 注入可能な方法は溶液または懸濁液に注入するのに適した液体で溶液状に精製 された生物活性物質を用いることができる。配合物の実施例 a) カプセル：ジクチオテール科の植物から抽出された生物活性物質（ＳＢＡ） を主成分とする。 カプセルの充填は従来の方法で行う。 b) 錠剤 ジクチオテール科の植物から抽出された生物活性物質（ＳＢＡ）を主 成分とする。 調剤に好ましい組成物は経口投与、例えば錠剤、糖衣錠、カプセル(gelule)、 カプセル(capsule)の形である。これらは活性成分として少なくとも１つのジク チオテール科の植物から抽出された生物活性物質または不活性担体に活性物質を 吸着する吸着剤を含み、無毒で、適合性の調剤である希釈剤または不活 性付形剤とを組み合わせるか、または混合する。場合によっては、１種または複 数の補足的な作用を有する活性成分を含む。 食餌利用ではジクチオテール科の植物から抽出された生物活性物質を小麦粉等 の栄養食支持体、またはセルロースまたはセルロース中に豊富な調合物等の不活 性支持体に希釈する。 この組成物は特に甲殻類、例えば子エビの飼育に求められる。実施例：こえび この配合物は、養魚池の180 000 匹のこえびに1.5 kgの量で１回投与され、解 化生存率を30％向上することができ、成熟したこえびの重量は10％±２％増量し た。 従って、生物活性物質は動物の平均重量を向上させ、および／または成熟期間 を短くする。 よく卵を産む雌鳥に対する同じ体験で、割れた卵の数が第２周期の産卵では２ ％減少したことが示された。 3) 組成物の局所的利用 移植片（ペレット：皮膚下に入れた小さな錠剤）の利用は既 に一般的である。代用ホルモン治療で広く利用され、治療を延長することができ る。ジクチオテール科の植物から抽出された生物活性物質を与える活性成分を含 浸した生物材料、例えば合成ポリマー（ポリ乳酸、ポリアクリル酸）、無機物： ヒドロキシルアパタイトリン酸カルシウム、生物材料：真珠層、珊瑚等の外科的 方法で配置ができ、細胞間マトリックスのプロテオグリカンの合成の再開につい て興味深い結果が得られた。 4) 適当な組成物の皮膚用または化粧用の一般的な利用 皮膚用および化粧用で利用するためには、クリームまたはジェルを使用するの が好ましい。この分野での組成物の利用は、非常に便利で効果的である。この配 合物は水中油または油中水型のエマルジョンを使用するが、これに限定されるも のではない。このエマルジョンは化粧分野での特定利用では乳液、デイクリーム またはナイトクリームとよばれ、皮膚学利用では、軟膏、ジェル、ジェル−クリ ーム混合配合物とよばれる。 例として、エマルジョン配合物を挙げることができる。この配合物は少なくと も３つの成分：水、脂肪体、エマルジョンまたは界面活性剤を全て有している。 もちろん、他の物質、例えば、着色剤、組織化剤、活性成分（組み合わせてもよ い）、保存剤、ｐＨ安定化剤、酸化剤は、最終配合物に介入することができる。 軟膏は親油性付形剤しか統合しない配合物である。ジェルはジアフェンアスペク トを有する組成物である。ジアフェンアスペクトでは水または時に親油性成分（ またはシリコン）はコロイド状態であるか、コロイド懸濁液中にある。 生物活性物質（ＳＢＡ）の濃度は広範囲、エマルジョン質量の0.01％〜20％、 0.01％は限界量で変えることができる。生物 活性物質（リポソーム、ナノ球体、ナノカプセル）は、活性を向上できるので、 封入した形で使用することも可能である。20％の活性成分を用いる場合は、配合 物を大幅に改質する必要があり、活性はおそらく高平状態である。 配合物の最新形状はジェルとも呼ばれる。多数のジェルがカルボマーと呼ばれ るアクリル酸の誘導体ポリマーを介して配合されている。他の型の分子はジェル をセルロースおよびその誘導体、コロイドシリカ、ウロン酸のポリマー、マンナ ン、ガラクトマンナン、キサンタンゴム等にすることができる。実施例 ：予備乾燥したエタノールで抽出された生物活性物質を含む水中油クリー ム 調剤用、化粧用の適当な利用での他の配合物、例えば、スポ ンジ、局所に有効なシール、粉末、小さな棒（スティックおよび口紅）にするこ とができるということは明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＡＵ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，Ｅ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＫ，ＴＲ，ＵＳ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．動物および人間の組織の細胞間マトリクスのグリコシル化成分の合成を良く するジクチオテール科の植物から抽出された生物活性物質。 ２．４〜10個の炭素原子を有し且つ２つの二重結合を有する直鎖または分岐鎖を 有する多環式構造である請求項１に記載の生物活性物質。 ３．下記a)〜e)の分析データを示す請求項１または２に記載の生物活性物質： a) グラフトシリカジオールを担体としてヘキサン／イソプロパノール(92/8)溶 出液を用いて行った半調製用高速液体クロマトグラフィーにおける保持時間が20 〜25分および35〜40分であり、 b) グラフトシリカＣ₁₈を担体としてアセトニトリル／水(85/15)溶出液を用い て行った半調製用高速液体クロマトグラフィーにおける保持時間が15〜17分であ り、 c) グラフトシリカＣ₁₈を担体としてアセトニトリル／水／酢酸(85/15/0.05)溶 出液を用いて行った半調製用高速液体クロマトグラフィーにおける保持時間が17 〜20分および30〜40分であり、 d) ノルマルシリカのカラムを用いてヘプタン／エーテル(90/10)を溶出液とし て行った高圧クロマトグラフィーにおける保持時間が6.9 〜8.5 分であり、 e) グラフトシリカＣ₁₈カラムを備えた高速液体クロマトグラ フィーでメタノール／水(80/20)を溶出液として用いた場合の保持時間が16〜18 分である。 ４．下記a)およびb)を特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の生物活性 物質： a) メタノール中におけるＵＶスペクトルが 202 nm(228nm に肩を有する）、 2 60〜270nm 、 400〜460nm および630nmに複数の吸収バンドを有し、 b) 化学的検出（スルフリックアニスアルデヒド、スルフリックバニリン、ホス ホモリブデート、エタノール硫酸）後、薄層クロマトグラフィー（ＣＣＭ）で示 される先端の保持時間が0.15、0.90および0.95である。 ５．不活性な無機あるいは有機材料に吸着後、溶媒を除去して得られる請求項１ 〜４のいずれか一項に記載の生物活性物質。 ６．ジクチオテール科の植物を乾燥および／または凍結乾燥し、粉砕した後、低 級アルカノール、脂肪族ケトン、アルカン、シクロアルカン、ハロゲンを含む溶 媒、芳香族溶媒、エステル、エーテルおよび類似物で構成される群の中から選択 される有機溶媒を用いて植物材料を１回以上抽出することによって植物の有機抽 出物を調製し、溶媒を蒸発して有機抽出物を乾燥し、乾燥した有機抽出物を液／ 液抽出、高圧または低圧カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィ ーを順次行う一つ以上の精製段階で精製してジクチオテール科の植物の活性成分 を得ることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の生物活性物質の調 製方法。 ７．有機溶媒としてエタノールまたはアセトンを使用する請求項６に記載の方法 。 ８．植物材料と有機溶媒とを植物材料１ｇに対して溶媒５mlの割合で使用し、植 物材料と有機溶媒との接触時間を12時間〜５日間にする請求項６または７に記載 の方法。 ９．動物および人間の組織の細胞間マトリクスのグリコシル化成分の合成を良く する医薬、美容および／または食品組成物であって、活性成分として請求項１〜 ５のいずれか一項に記載の生物活性成分を、目的用途に適した不活性で無毒性の 賦形剤またはベヒクルと組み合わせるか、混合した状態で含み、必要に応じて相 補的活性を有する活性成分をさらに含むことを特徴とする医薬、美容および／ま たは食品用組成物。 10．不活性な賦形剤またはベヒクルが経口、非経口、経皮、局所または直腸投与 用に適したものである請求項９に記載の組成物。 11．動物および人間の組織の細胞間マトリクスのグリコシル化成分の合成を良く する組成物の製造での請求項１〜５のいずれか一項に記載の生物活性物質の利用 。 12．動物および人間の細胞間マトリクスのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）およ びプロテオグリカンの合成を刺激する組成物の製造での請求項１〜５のいずれか 一項に記載の生物活性物質の利用。 13．細胞間マトリクスのグリコサミノグリカンのゴルジ体および膜における合成 と、細胞間マトリクスのプロテオグリカンのゴルジ体における合成を刺激するた めの組成物の製造での請求項１〜５のいずれか一項に記載の生物活性物質の利用 。 14．動物および人間の細胞間マトリクスのグリコシル化成分の関与する疾患の予 防および／または治療用組成物の製造での請求項１〜５のいずれか一項に記載の 生物活性物質の利用。