HU215503B - Eljárás fényre keményedő glükóz-amino-glükán-származékok és keresztkötéses glükóz-amin-glükánok előállítására és alkalmazására - Google Patents

Abstract

A találmány szerinti eljárásban – fényre keményedő glükóz-aminő-glükán-származékők előállítására – egy glükóz-aminő-glükán hidrőxil-vagy karbőxilcsőpőrtjait észterezési vagy amidálási rea ciónak vetikalá egy fényreaktív vegyülettel, amely főtőreakcióban ciklőbűtángyűrűképzésére képes. A keresztkötéses glükóz-aminő-glükánők előállításábana fenti származékőkat fénnyel sűgárőzzák be, s így intermőlekűlárisés/vagy intramőlekűláris keresztkötéseket hőznak létre. Az eljárássőrán a származékból főrmázható gélt képeznek, majd a főrmázható gélalakú származékőt sűgárőzzák be fénnyel. Az alkalmazás sőrán a fényrekeményedő glükóz-aminő-glükán-származékőt sérülés helyére viszik felgyógyászati készítmény főrmájában, és így sejtek és/vagy szövetekadhézióját előzik meg. A készítmény mesterséges szerv felületén isalkalmazható, valamint gyógyszert is tartalmazhat szabályőzhatóhatóanyagleadású gyógyszerkészítmény alakjában. ŕ

Description

A találmány glükóz-amino-glükán-származékok - melyek glükóz-amino-glükánból (továbbiakban GAG) és hozzá kémiai kötéssel kapcsolódó fényreaktív vegyületből állnak - előállítására, valamint keresztkötéses glükóz-amino-glükánok - melyek háromdimenziós térhálós struktúrával rendelkeznek (ami az említett származékoknak a fényreaktív vegyülettel történő fotodimerizációja során alakul ki) - előállítására, továbbá az orvosi gyakorlatban történő alkalmazási eljárásokra vonatkozik.

A fényre keményedő gyanták, melyek hidrofób polimer rendszereket tartalmaznak (s fotodimerizációval keresztkötéseket képeznek) régóta használatosak, többek között a festészetben, nyomdászatban. A másik oldalról - néhány példa ismeretes, ahol hidrofil polimerek hajlamosak fény hatására keresztkötéseket képezni.

Aldehidek, epoxi-, divinil-szulfon-vegyületek és hasonlók felhasználásával kísérleteket végeztek GAG-ok (melyek tipikusan hidrofil polimerek) keresztkötés-képzésével abból a célból, hogy meghosszabbítsák a GAGok in vivő hatását vagy hogy gyógyászati anyagokat készítsenek porok alakjában, például szövetösszenövés megelőzésére.

Mivel a GAG-ok makromolekulák, a létrehozott keresztkötéses GAG-származékok molekulatömege még nagyobb, s ez a tény megnehezíti az el nem reagált anyagok és/vagy a katalizátorok eltávolítását a keresztkötéses GAG-származékokból. Ilyenformán élő testbe történő implantáció esetén az említett származékok gyakran okozhatnak ártalmas hatásokat, így nem alkalmazhatók a gyakorlatban.

Ezenkívül a keresztkötéses GAG-származékok gél vagy szilárd alakban fordulnak elő, éppen ezért a keresztkötések kialakítása után nehéz a megformázásuk, s ennélfogva nem alkalmasak gyakorlati alkalmazásra. Sőt, minthogy hordozóként szerepelnek a folyamatos vagy kontrollált gyógyszerkibocsátó készítményekben (JP-A-62-129226 japán közrebocsátást irat; megfelel az US 5,128,326 szabadalmi leírásnak), az aktív hatóanyagok hosszan tartó kibocsátása csak keresztkötéses GAG-származékok viszkózus tulajdonságának kihasználásával lenne elérhető, s ez a hátrány alkalmatlanná teszi őket a gyakorlati felhasználásra. Ilyenformán ezen módszerek és ezen keresztkötéses GAGszármazékok kevéssé képesek kontrollálni a drogkibocsátás mértékét.

Szintén ismeretes, hogy a mikroorganizmusokból illetve növényekből származó poliszacharidok (pl. a pullalan, amilóz mannán, melyek fotodimerizációra képes cinnamoilcsoportokkal rendelkeznek) hidroxilcsoportjainak észterezésével előállított fényérzékeny anyagok felhasználhatók adszorbensként, enzimhordozóként, kromatográfiás vivőanyagként, továbbá felhasználhatók PS-lemezek készítéséhez stb. (JP-B-56-14969 közzétételi irat, megfelel az US 3,960,685 szabadalmi leírásnak). Amellett, hogy sok probléma merült fel biztonságossá tételükkel, a fényérzékeny anyagok kevéssé tudják korlátozni a sejtadhéziót, nem megfelelőek az emberi biokompatibilitás terén, s így nem alkalmazhatók közvetlenül gyógyászati anyagokként, élő szervezetben, félmesterséges szervekben, nem használhatók sebkötözőként, hordozóként sebészeti készítményekben vagy más anyagokban az egyéb gyógyászati műveleteknél.

A fentieknek megfelelően a találmány tárgya eljárás olyan fényre keményedő GAG-származékok és ezekből származtatható keresztkötéses GAG-ok előállítására, melyek messzemenően biztonságosak és biokompatibilisek.

A találmány szerinti eljárással előállított fényre keményedő GAG-származékok a kívánt időben könnyen formálhatók, például oldószer felhasználásával történő öntéssel, mely módszer alkalmazásával az el nem reagált anyag (ami ártalmas hatások okozója) könnyen eltávolítható.

A találmány tárgya fényre keményedő glükózamino-glükán-származékot (a következőkben gyakran fényre keményedő GAG, a rövidség kedvéért) bocsát rendelkezésre, mely glükóz-amino-glükánból és a hozzá kapcsolódó fényreaktív vegyületből áll, továbbá keresztkötéses glükóz-amino-glükánt (a továbbiakban keresztkötéses GAG), mely úgy készül, hogy az említett fényre keményedő GAG-ot keresztkötés-képző reakciónak vetjük alá az említett fényreaktív vegyülettel. A fent említett fényre keményedő GAG, a GAG hidroxil- vagy karboxilcsoportjai és a fényreaktív vegyületek között észterképző reakcióval vagy - a GAG karboxilcsoportjait aktiválva - az aktivált karboxilcsoportok és a fényérzékeny vegyület közötti amidképző reakcióval vagy szintén a GAG karboxilcsoportjai és a fényreaktív vegyület közötti, de kondenzáló ágens jelenléte mellett végrehajtott amidképző reakcióval állítható elő.

A keresztkötéses GAG a fényre keményedő GAG fénnyel történő besugárzásával állítható elő, mivel fény hatására a fényreaktív vegyületfelek keresztkötéssel összekapcsolódnak. Az anyagok, melyek az említett keresztkötéses GAG-on alapulnak, alkalmasak az orvosi gyakorlati felhasználásban. A fényre keményedő GAG, melyből az említett keresztkötéses GAG származtatható, szintén alkalmas anyag a gyógyászati gyakorlat számára.

Az ábrák rövid leírása

Az 1. ábrán a kötött fahéjsav mennyiségi meghatározásához használt >H-NMR spektrum látható (lásd 1. példa).

A 2. ábrán UV/VIS-spektrum látható; 279 nm-nél jelöltük a keresztkötéses hialuronsav-film megvilágítása során tapasztalt abszorbancia-csökkenést (lásd 1. példa).

A 3. ábra grafikusan mutatja be az érintkezési szög függését a különböző keresztkötéses hialuronsav-filmek fahéj savgyökre vonatkoztatott szubsztitúciós fokától.

A 4. ábra különböző keresztkötéses hialuronsav-filmek esetében grafikusan mutatja be a duzzadási képesség függését a fahéj savgyökre vonatkoztatott szubsztitúciós foktól.

Az 5. ábrán sejtmorfológiát ábrázoló fényképek láthatók, melyek az endothel-sejtek összetapadása és a fahéjsavgyökre vonatkoztatott szubsztitúciós fok összefüggését illusztrálják keresztkötéses hialuronsav-filmek esetén.

HU 215 503 Β

A 6. ábra grafikusan mutatja be a kondroitin-szulfátfahéjsav-észter (CS-Cin-2) gélesedési mértékének (%) és a PBS-oldatban mért koncentrációjának összefüggését.

A 7. ábra grafikusan mutatja be a keresztkötéses kondroitin-szulfát gél gélesedési mértékének (%) és duzzadási képességének függését a PBS-ben oldott kondroitin-szulfát-fahéjsav-észter (CS-Cin-3) megvilágítási idejétől.

A 8. ábra grafikusan mutatja be a keresztkötéses kondroitin-szulfát gél gélesedési mértékének és duzzadási képességének függését a fahéj savgyökre vonatkoztatott szubsztitúció fokától.

A 9. ábra grafikusan mutatja be a duzzadási képesség függését a szubsztitúció fokától (DS) keresztkötéses kondroitin-szulfát filmeknél.

A 10. ábra grafikusan mutatja be az érintkezési szög függését a fahéj savgyökre vonatkoztatott szubsztitúció fokától a 8. példában nyert keresztkötéses kondroitinszulfát filmeknél.

All. ábra grafikusan mutatja be a létrejött timindimerek arányának függését az UV-sugárzás idejétől (hialuronsav-filmek előállítása HA-Thym-1 UV-fénynyel történő megvilágításával, 14. példa).

A 12. ábra grafikusan mutatja be az l-(2-karboxietil)-timin/HA mólarány és a DS közötti összefüggést a HA-Thym szintézisében (16. példa).

A 13. ábra grafikusan mutatja be az l-(2-karboxietil)-timin/CS mólarány és a DS közötti összefüggést a CS-Thym szintézisében (17. példa).

A 14. ábra grafikusan mutatja be a 270 nm-nél mért timinre jellemző abszorbancia változását és a megvilágítási idő közötti összefüggést vékony CS-Thym filmek besugárzása esetében (18. példa).

A 15. ábra grafikusan mutatja be a vékony CS-Thym film besugárzásakor a gélesedés mértéke (%) és a megvilágítási idő közötti összefüggést (18. példa).

A 16. ábra grafikusan mutatja be egy másik vékony CS-Thym film fénnyel történő besugárzásakor a gélesedés mértéke (%) és a megvilágítási idő közötti összefüggést (18. példa).

A 17. ábra grafikusan mutatja be a duzzadási képesség és a megvilágítási idő közötti összefüggést egy vékony HA-Thym film fénnyel történő besugárzásakor (18. példa).

A 18. ábra grafikusan mutatja be vékony HA-Thym filmekre a duzzadási képesség és a DS közötti összefüggést fénnyel történő besugárzás előtt illetve után (18. példa).

A 19. ábra a 20. példában előállított kondroitin-szulfát-(7-kumaril-oxi)-ecetsav-észter ¹H-NMR-spektrumát mutatja be.

A 20. ábra grafikusan mutatja be a kumarinsavklorid formája és a kondroitin-szulfát hidroxilcsoport (CS-OH) mólarányának és a szubsztitúció fokának összefüggését az észterben.

A 21. ábra vékony kondroitin-szulfát-(7-kumariloxi)-ecetsav-észter film fénnyel történő besugárzása esetében mutatkozó - kumarinra vonatkozó - abszorbancia-változások (320 nm-nél) és a besugárzási idő közötti összefüggést ábrázolja (21. példa).

A 22. ábra grafikusan mutatja be a duzzadási képesség és a besugárzási idő közötti összefüggést vékony kondroitin-szulfát-(7-kumaril-oxi)-ecetsavészter filmek fénnyel történő besugárzása esetén (21. példa).

A 23. ábra grafikusan ábrázolja a duzzadási képesség és a DS közötti összefüggést vékony kondroitinszulfát-(7-kumaril-oxi)-ecetsavészter fénnyel történő besugárzása esetén (21. példa).

A 24. ábra grafikusan mutatja be a gélesedés mértéke (%) és a besugárzási idő közötti összefüggést vékony kondroitin-szulfát-(7-kumaril-oxi)-ecetsavészter fénnyel történő besugárzása esetén (21. példa).

A 25. ábra grafikusan mutatja be a gélesedés mértéke és a kondroitin-szulfát-(7-kumaril-oxi)-ecetsavészter koncentrációja közötti összefüggést az említett észterből készült vékony film fénnyel történő besugárzása esetén (21. példa).

A 26. ábra a fény hatására keresztkötött HA-Thym filmből (DS = 0,7) történő gyógyszerkibocsátás mértékét ábrázolja az idő függvényében. A film 10 vagy 50 tömeg%-ban tartalmazza a gyógyszert - amint azt a 28. példában meghatároztuk - és a kibocsátás mértékét a 269 nm-nél mért abszorbancia változásával fejeztük ki.

A 27. ábra a fény hatására keresztkötött, 10 vagy 50 tömeg%-os gyógyszertartalmú (28. példa) HA-Thym filmből (DS = 2,2) történő gyógyszerkibocsátás mértékét ábrázolja az idő függvényében. A kibocsátás mértékét a 269 nm-nél mért abszorbancia változásával fejeztük ki.

A 28. ábra a fény hatására keresztkötött 10 vagy 50 tömeg%-os gyógyszertartalmú (28. példa) CS-Thym filmből (DS = 0,8) történő gyógyszerkibocsátás mértékét ábrázolja az idő függvényében. A kibocsátás mértékét a 269 nm-nél mért abszorbancia változásával fejeztük ki.

A 29. ábra a fény hatására keresztkötött 10 vagy 50 tömeg%-os gyógyszertartalmú (28. példa) CS-Thym filmből (DS = 1,3) történő gyógyszerkibocsátás mértékét ábrázolja az idő függvényében. A kibocsátás mértékét a 269 nm-nél mért abszorbancia változásával fejeztük ki.

A 30. ábra a fény hatására keresztkötött 10 vagy 50 tömeg% gyógyszertartalmú (28. példa) CS-Thym filmből (DS = 1,8) történő gyógyszerkibocsátás, mértékét a 269 nm-nél mért abszorbancia változásával fejeztük ki.

A találmány részletes leírása:

Az „anyagok gyógyászati felhasználásra” kifejezésen - esetünkben — a következőket értjük: anyagokat, melyekből a diagnosztizálás illetve a gyógykezelés során alkalmazható gyógyászati eszközök készíthetők; anyagokat, melyekből mesterséges szervek (mesterséges ér, szív, bőr stb.), sebkötözők, protézisek, nonadhezív anyagok vagy olyan eszközök készíthetők, melyek a kontrollált gyógyszerkibocsátásra alkalmasak; anyagokat, melyek mesterséges alapmembránokként használhatók, amelyek alkalmasak félmesterséges szervek kialakításához szükséges endothel- és epithelsejtek illetve simaizom-sejtek összetapadásához és multiplikációjához.

HU 215 503 Β

Az ebben a találmányban szereplő, fényre keményedő GAG - melynek inkább egyszerűsített szerkezete ábrázolandó, lásd alább [1 ]—[5] képletek - fényreakció útján adja a keresztkötéses GAG-ot. Az említett alábbi képletek mindegyikénél megadtuk a megfelelő reakció[A] gag-O-(CO-R') [1] gag-OH + R'-COOH -észterkötés - [1] [B] gag-CO-(NH-R') [2] gag-COOH + R‘-NH₂ - amidkötés - [2] [C] gag-CO-(O-R') [3] gag-COOH + R'-OPH - észterkötés - [3] [D] gag-O-R2a-Ri [4] fajtát. A „gag” jelölés a glükóz-amino-glükán egyszerűsített jelölése, R¹ egy fényreaktív csoportot jelöl (azaz legalább egy vinilcsoport), az R'-COOH, R'-NH₂ és R'-OH jelölések mindegyike fényreaktív vegyületet 5 jelent.

R^2a egy olyan köztes csoport, mely a gag-OH-dal 15 és a fényreaktív vegyület funkciós csoportjával reagálni képes vegyületből származik (pl. HOOC-R³-COOH, HOOC-R3-NH₂) [D-l] gag-OH + HOOC-R3-COOH - gag-O-CO-R³-COOH [D-l-a] gag-O-CO-R³-COOH + R' -OH- gag-O-CO-R³-CO-O-R' = [4a] [D-l-b] gag-O-CO-R³-COOH + R'-NH₂- gag-O-CO-R³-CO-NH-R' = [b] [D-2] gag-OH + HOOC-R³-NH2 - gag-O-CO-R³- NH2 [D-2-a] gag-O-CO-R³-NH₂ + R'-COOH- gag-O-CO-R³-NH-CO-R' = [4c] [E] gag-CO-R^2b-R* [5]

R^2b egy köztes csoport, amely a gag-COOH-val 25 gyület funkciós csoportjával reagálni képes vegyületből például HO-R³-COOH, HO-R³-OH, HO-R³-NH₂, származik.

H₂N-R³-NH₂, H₂N—R³—COOH és a fényreaktív ve[E-0] [E-O-a] H₂N-R³-NH2 + R'-COOH - H2N-R³-NH-CO-R> gag-COOH + H2N-R³-NH-CO-Ri [F-l] gag-CO-NH-R3-NH-CO-R' = [5-1] [E-O-b] RHN-R³-NH₂ + R'-COOH - RNH-R³-NH-CO-R' [F-2]

RNH-R³-NH-CO-Ri [F-2] - H2N-R³-NH-CO-R' gag-COOH + H2N-R³-NH-CO-R> [F-l] vagy [F-2] - gag-CO-NH-R³-NH-CO-R* = [5-1]

R egy védőcsoport [E-l] gag-COOH + HO-R³-COOH - gag-CO-O-R³-COOH [E-l-a] gag-CO-O-R³-COOH + R'-OH - gag-CO-O-R³-CO-O-R' = [5a] [E-l-b] gag-CO-O-R³-COOH + R²-NH₂ - gag-CO-O-R³-CO-NH-R' = [5b] [E-2] gag-COOH + HO-R³-OH - gag-CO-O-R³-OH [Ε-2-a] gag-CO-O-R³-OH + R'-COOH - gag-CO-O-R³-O-CO-R> = [5c] [E-3] gag-COOH + HO-R³-NH2 - gag-CO-O-R³-NH2 [Ε-3-a] gag-CO-O-R³-NH₂ + R'-COOH - gag-CO-O-R³-NH-CO-R' = [5d] [E—4] gag-COOH + H₂N-R³-OH - gag-CO-NH-R³-OH [Ε-4-a] gag-CO-NH-R³-OH + R'-COOH - gag-CO-NH-R³-O-CO-R' = [5e] [E-5] gag-COOH + H₂N-R³-NH2 - gag-CO-NH-R³-NH2 [Ε-5-a] gag-CO-NH-R³-NH₂ + R'-COOH - gag-CO-NH-R³-NH-CO-R' = [5f] [E-6] gag-COOH + H₂N-R³-COOH - gag-CO-NH-R³-COOH [Ε-6-a] gag-CO-NH-R³-COOH + R'-OH - gag-CO-NH-R³-CO-O-R' = [5g] [Ε-6-b] gag-CO-NH-R³-COOH + R'-NH₂ - gag-CO-NH-R³-CO-NH-R' = [5h]

R³: a követezők egyike lehet

R^3a: -(CH₂)_n- (n= 1-10);

R^3b: -(CH₂)_PCHY- (Y lehet COOH vagy NH₂; p = 1-10)

R^3c: -(CH₂)_m-C₆H₄-(CH₂)' (m = 1-10,1 = 1-10)

Míg a fenti példákban csak egy köztes csoportot használtunk, a köztes csoportok többsége ugyanúgy használható.

A [4b], [5b], [5h]-val jelölt termékek készítésekor a fent említett vegyület - [F-l] vagy [F-2] - használható R2-NH₂ helyett.

HU 215 503 Β

Általában R¹ - ami fényérzékeny csoport - bármelyik csoport lehet, amely alkalmas a ciklobutángyűrű kialakulásához vezető inter- és/vagy intramolekuláris fotodimerizációra.

Valamennyi fenti képletben a -COOH csoport valamely reaktív származék (például halogenid, savanhidrid, aktív észter) olyan formáját jelenti, mely reagálni képes hidroxil- vagy aminocsoportokkal. Ahol az általános R'-CO- alakok találhatók, mint az [1], [4c], [5c]-[5f] képletekben, ott a következő képletek egyszerűbb formájáról van szó.

[6] képlet ahol R⁴ és R⁵ lehet egyforma vagy különböző; jelenthetnek hidrogénatomot vagy nitro- vagy aminocsoportot;

[7] képlet, ahol R⁶ hidrogén- vagy halogénatom vagy kis szénatomszámú alkil-, kis szénatomszámú halogénezett alkilcsoport; R⁷ lehet hidrogén-, halogénatom vagy ciano-, karboxil-, (kis szénatomszámú alkoxi)-karbonil-, kis szénatomszámú alkil-, kis szénatomszámú halogénezett alkilcsoport; és R⁸ kis szénatomszámú alkiléncsoport.

[8] képlet, ahol R⁹, R'°, R¹¹ lehetnek egyformák vagy különbözőek, és mindegyik egymástól függetlenül lehet hidrogénatom, kis szénatomszámú alkiléncsoport; R'² kis szénatomszámú alkiléncsoport.

A fenti képletek [6]—[8] általában R^la-CO- (R¹⁰ fényreaktív csoport, formában szerepelnek, mint az Ria-CO-NH-R³-NH₂ [2] képletben, vagy R³-COformában az [5 -1] képletben és az R^3a vagy R^3b inkább R³ formában használatos. Amikor az R³ helyett R^3b szerepel, -COOH helyett Y-t írunk.

Az R*-O- jelölés (például a [3], [4a], [5a], [5g] stb. képletben) az alábbi részletesebb képleteknek felel meg.

[9] képlet, ahol R¹³: hidrogén- vagy halogénatom vagy kis szénatomszámú alkil- illetve kis szénatomszámú halogénezett alkilcsoport; R¹⁴: hidrogén- vagy halogénatom vagy ciano-, karboxil-, (kis szénatomszámú alkoxi)-karbonil-, kis szénatomszámú alkilvagy kis szénatomszámú halogénezett alkilcsoport, R¹⁵ kis szénatomszámú alkiléncsoport.

[10] képlet, ahol R'⁶ és R¹⁷ lehet egyforma vagy különböző, s mindkettő lehet hidrogénatom vagy nitrovagy aminocsoport.

A [1 l]-es képletű csoportokat tartalmazó vegyületek szintén lehetnek R³ alkotórészei.

A találmány szerinti eljárással előállított fényre keményedé GAG képes a fény által kiváltott intermolekuláris dimerizációra, melynek következtében a fényreaktív molekulákban található fényreaktív csoportok (melyek legalább egy vinilcsoportból állnak) párosával ciklobutángyűrűket alkotnak - az alábbi egyenletnek megfelelően, ([12]) - s a megfelelő, két- vagy háromdimenziós hálózatstruktúrával rendelkező s kívánt mértékben keresztkötött keresztkötéses GAG-ot adják. Az intermolekuláris dimerizáció a fényre történő kikeményítésben is alkalmazható. így a találmány szerint a biokompatibilis, fény hatására kellő mértékben keresztkötött GAG-ok tervezett felhasználásához megkívánt fizikai tulajdonságok (például mechanikai alaktartó sajátság, vízállóság, hidrofilitás, kenőtulajdonság, gyógyszerkibocsátási sebesség) és biológiai tulajdonságok (mint például sejttapadás, biodegradábilitás, fiziológiai aktivitás) kialakíthatók, mégpedig - többek között - a fényreaktív vegyületek és a GAG-ok helyes megválasztásával és ellenőrzésével (kémiai szerkezet, molekulatömeg stb.), illetve a fényreaktív vegyület összetételének megválasztásával és ellenőrzésével (például a fényreaktív vegyülettel történő szubsztitúció foka).

A „szubsztitúció foka” (DS = degree of substitution) kifejezés, melyet itt használtunk, úgy definiálható, mint a GAG ismétlődő diszacharid egységeihez kötött fényreaktív vegyület vagy csoport móljainak diszacharid egységenkénti száma (minden egység tartalmaz egy uronsavat és egy hexóz-amint). Ilyenformán például a hialuronsav esetében - mely négy hidroxilcsoportot tartalmaz diszacharid egységenként - amikor egy fényreaktív vegyület vagy csoport mind a négy hidroxilcsoporthoz kapcsolódva megváltoztatja az eredeti vegyületet, a DS 4-nek adódik. A diszacharid egységenként csak három hidroxilcsoportot tartalmazó kondroitin-szulfát esetében viszont, ha a fotoreaktív vegyület vagy csoport a hidroxilcsoportok mindegyikéhez kapcsolódik, a DS 3-nak adódik.

A többször említett „glükóz-amino-glükán” vagy „GAG” kifejezés a kólsav, hialuronsav (HA), kondroitin, kondroitin-szulfát (CS), teikuronsav, dermatánszulfát, heparin, heparán-szulfát, keratoszulfát, keratopoliszulfát és ezek származékainak (acil-származékok, poliszulfátok, deszulfonált származékok, deacilált származékok stb.) gyűjtőneve. A „kis szénatomszámú” kifejezés azt jelenti, hogy a kérdéses szénlánc, mely lehet egyenes vagy elágazó, 1-6 szénatomot tartalmaz. A halogénatom kifejezés a klór-, bróm- és jódatomokat jelenti, a „halogénezett” kifejezés pedig azt, hogy a molekula egy vagy több hidrogénatomja halogénnel szubsztituált.

A [6] képletnek [1], [4c], [5-1], [5c]-[5f] stb. képletekkel történő egyesítésekor R'CO- olyan gyök, amely szubsztituált vagy nem szubsztituált fahéjsavból illetve annak reaktív származékából származtatható. Ha szubsztituált fahéjsavgyökökről van szó, akkor megemlíthetők azok, melyek egy vagy két nitro- vagy aminocsoportot tartalmaznak a benzolgyűrű bármely szénatomján. Mindemellett a fahéjsavból származtatott R'CO— gyökök a gyakoribbak.

A [7] képletnek a [1], [4c], [5-1], [5c]-[5f] stb. képletekkel történő egyesítésnél az R'CO- olyan gyök, amely uracilszármazékból származtatható. Ezen uracilszármazék az 1-es helyen szubsztituensként karboxialkil-csoportot tartalmaz, vagy annak reaktív származékát (melyben hidrogén- vagy halogénatom vagy kis szénatomszámú alkilcsoport, halogénezett kis szénatomszámú alkilcsoport van az 5-ös helyzetben, R⁶tal jelölve), továbbá tartalmazhat hidrogén- vagy halogénatomot, cianocsoportot, karboxilcsoportot, (kis szénatomszámú alkoxi)-karboxil-csoportot, kis szénatomszámú alkil- vagy halogénezett alkilcsoportot a 6-os helyzetben, R⁷-tel jelölve, vagy tartalmaz (1-es helyzetben) olyan kis szénatomszámú alkiléncsoportot (R⁸), amely a GAG hidroxilcsoportjával észterkötést létesítő

HU 215 503 Β karboxi-alkil-csoportból származik. Általában az l-(2karboxi-etil)-timinből származtatható R’CO- a leginkább használatos.

A [8] képletnek az [1], [4c], [5-1], [5c]-[5f] stb. képletekkel történő egyesítésében R’-CO- például egy 7-es helyen karboxi-alkillal szubsztituált kumarinszármazékból képzett gyök, vagy annak olyan reaktív származéka, mely a kumaringyűrű 5, 6 és 8-as atomján - egymástól függetlenül - hidrogénatomot vagy kis szénatomszámú alkilcsoportot tartalmazhat (R⁹, R¹⁰, R¹¹) illetve a 7-es helyen (R¹²-vel jelölve) a GAG egy hidroxilcsoportjával észterkötést képező hidroxi-alkoxil-csoportból származó kis szénatomszámú csoportot tartalmaz. Egy általánosan használt R’-CO csoport a 7-kumaril-oxi-ecetsavból származtatható.

A [10]-es képlet [3], [4a], [5a], [5g] stb. képletekkel történő egyesítésében az R’-OH csoport egy, az 1-es helyen hidroxi-alkil szubsztituált uracilszármazék vagy annak olyan reaktív származéka, melyben a pirimidingyürű 5-ös atomján lehet hidrogén- vagy halogénatom, vagy kis szénatomszámú alkil vagy kis szénatomszámú halogénezett alkilcsoport (R¹³), a gyűrű 6-os helyén lehet - R¹⁴-gyel jelölve - hidrogén- vagy halogénatom, ciano-, karboxil-, kis szénatomszámú alkil-, (kis szénatomszámú alkoxij-karbonil- vagy kis szénatomszámú halogénezett alkilcsoport, vagy az 1-es helyen olyan kis szénatomszámú alkiléncsoport lehet, (R¹⁵), mely a GAG karboxilcsoportjával észterkötést létesítő hidroxi-alkilcsoportból származik.

A [ll]-es képletnek a [3], [4a], [5a], [5g] képletekkel történő egyesítésében R’O- lehet például szubsztituált vagy szubsztituálatlan fahéj-alkohol vagy az utóbbi aktív származéka. A szubsztituált fahéj-alkohol gyök tartalmazhat például egy vagy két nitro- vagy aminocsoportot a benzolgyűrű bármely atomján.

Kiindulási vegyületek: Glükóz-amino-glükánok

A GAG vegyületek eredete és molekulatömege nincs megszabva. A tervezett célnak megfelelően kiválasztott GAG-ok használhatók önmagukban vagy GAG-ok keverékeként, elegy formájában is. Míg általában a természetes eredetű GAG-ok használatosak, szükség szerint használhatók kémiai vagy enzimatikus úton, illetve félszintetikus módon előállított GAG vegyületek. A fentiekből a funkciós csoport átalakításából származó termékek szintén használhatók. A GAG önmagában is regálhat a fényreaktív vegyülettel, de általában alkálifémekkel (nátrium, kálium stb.), alkáliföldfémekkel (magnézium, kalcium stb.), tercier-aminokkal [tri(nbutil)-amin, trietilamin, piridin stb.] képzett só formájában használatos.

Ha a GAG-hoz kapcsolni kívánt fényreaktív vegyület nem vízoldékony, úgy a reakció véghezvitele érdekében a fényreaktív vegyületet GAG-ot tartalmazó szerves oldószerekhez adjuk.

A GAG-ot tartalmazó szerves oldat például a következőképpen állítható elő. A GAG nátriumsójának vizes oldatát kationcserélőn visszük keresztül, hogy karboxilvagy szulfátgyököket kapjunk, majd vízzel elegyedő szerves oldószert adunk hozzá (például dimetilformamid (DMF), dimetil-szuloxid (DMSO), hexametil-foszforamid (HMPA), piridin vagy hasonlók) és végül, hogy a GAG aminsóját kapjuk, tercieramint [például tri(n-butil)-amint] adunk az oldathoz. A vizet desztillációval távolítjuk el.

Ha a fényreaktív vegyület vízoldékony, a reakció úgy hajtható végre, hogy a fényreaktív vegyületet a GAG vizes oldatához (például nátriumsó) adjuk.

Fényreaktív vegyületek

A fényreaktív vegyületek, melyek olyan csoportokkal létesítenek kötést, mint a GAG-ok vagy ezekhez kötött köztes vegyületek -OH, -COOH, -NH₂ csoportjai, maguk is rendelkeznek -OH-, -COOH-, -NH₂-csoportokkal.

(1) Ha -COOH a funkciós csoport:

A fényreaktív vegyületek a GAG-hoz vagy köztes csoportokhoz észter formájában kötöttek (mint az [1], [4c], [5-1], [5c], [5d], [5e] és [5f] képletekben) és olyan vegyületeket foglalnak magukban, melyek az alábbi kémiai szerkezettel rendelkeznek: a [6], [7], [8] képletekkel jelzett csoportokhoz például hidroxilcsoport vagy halogén kapcsolódik; nevezetesen szubsztituált vagy nem szubsztituált fahéjsavak, 1-(karboxi-alkil)-uracilok és 7(karboxi-alkoxi)-kumarinok (7-kumaril-oxi-karbonsavak) és ezek reaktív származékai. Mint reaktív származékok, megemlíthetők savhalogenidek (pl. savklorid) és savanhidridek.

A fent említett 7-(kumaril-oxi)-karbonsavak savhalogenidjei kondenzációval állíthatók elő A kellőképpen szubsztituált 7-hidroxi-kumarint halogénezett karbonsav-észterrel reagáltatjuk (lúg jelenlétében), s a kondenzáció során keletkezett 7-(kumaril-oxi)-karbonsav-észtert hidrolizáljuk, így kapjuk a 7-(kumaril-oxi)-karbonsavat, vagy más módon úgy, hogy a megfelelő, optimálisan szubsztituált 7-(kumaril-oxi)-karbonsavat [8], mely egy vagy több szubsztituenst is tartalmazhat, reagáltatjuk tionil-halogeniddel (lásd, például JP-A-3-48674).

(2) Ha -NH₂ a funkciós csoport:

Az alább megadott [F-l], [F—2] fényreaktív vegyületek úgy nyerhetők, hogy a fentebb említett szubsztituált vagy szubsztituálatlan fahéjsavat, 1-(karboxi-alkil)uracilt vagy 7-(karboxi-alkoxil)-kumarint (7-kumariloxi-karbonsav) vagy ezek reaktív származékait az [X-l] vagy az [X-2] képletű vegyületekkel reagáltatjuk. [X-2] az [X-l]-ből úgy származik, hogy az egyik aminocsoportot védőcsoporttal látjuk el (például tercbutoxi-karbonil- vagy benzil-oxi-karbonil-csoport), mely később, szükség esetén eltávolítható.

H₂N-R³-NH₂ [X-l]

RNH-R³-NH₂ [X-2]

H₂N-R³-NH-CO-R’ [F-l]

RNH-R³-NH-CO-R₅ [F-2] (3) Ha -OH a funkciós csoport:

A [9]-es képlet szerinti reaktív származékok alkalmazhatók mint fényreaktív vegyületek. Például ciklikus éter-vegyületek használhatók a pirimidingyűrű 1-es és 2-es atomja között. Konkrét példák:

1,2-O-etano-uracil; 1,2-O-etano-timin; 1,2-O-etano5-klór-uracil; l,2-O-etano-5-(triklór-metil)-uracil; 1,2O-etano-6-(klór-metil)-uracil; 1,2-O-etano-6-cianouracil és l,2-O-etano-6-(triklór-metil)-uracil. Megem6

HU 215 503 Β líthetők még a szubsztituált vagy szubsztituálatlan fahéj-alkoholok ([10]-es képlet).

(4) A legalkalmasabb fényreaktív vegyületek:

Az alkalmazandó fényreaktív vegyület a felhasználási célnak megfelelően kiválasztható lenne a fenti vegyületek közül, mégis gyógyászati szempontból az olyan vegyületek részesíthetők előnyben, melyek azokból a vegyületekből származnak, amelyek a legkisebb valószínűséggel okoznak káros hatásokat - még akkor is, ha reagálatlan állapotban maradnak a keresztkötéses GAGokban (ilyenek például a fahéj sav, timin, kumarin).

A találmányban a fényre keményedő GAG-ok egy vagy több fényreaktív vegyületet tartalmazhatnak, melyek vagy kizárólag egy GAG-molekulához képesek kötődni, vagy a különféle GAG-ok többségéhez is. Meg kell jegyezni, hogy a találmányban szereplő keresztkötéses GAG-ok olyan termékek, melyek a fenti fényre keményedő GAG-okból fény hatására történő keresztkötés-képzéssel nyerhetők.

Reakciók (fényreaktív csoportok bemutatása):

(1) Észterképző reakció gag-OH-dal

A találmányban szereplő fényre keményedő GAG-ot a következőképpen kapjuk: A GAG megfelelő tercieramin sóját [például tri(n-butil)-amin só, trietil-amin só, pirimidinsó stb.] alkalmas oldószerben oldjuk (például DMF, piridin, DMSO, HMPA stb.) és a GAG hidroxilcsoportjait észterképző reakcióba visszük - bázikus katalizátor (például vízmentes piridin) jelenlétében szubsztituált vagy szubsztituálatlan fahéjsavval ([6]-os képlet) (0,5/5 mólarányban a GAG hidroxilcsoportjaival) vagy annak reaktív származékával (például sav-halogenidek) vagy - szintén bázikus katalizátor jelenlétében (például 2-klór-l-metil-piridin-jodid, piridin) -R>-COOH-val ([7], [8] képletek) vagy ennek reaktív származékával. A reakció történhet 0-100 °C tartományban (legkedvezőbb 70-90 °C) s néhány tíz perctől néhány tíz óráig terjedő ideig (leginkább 1-10 óra hosszat).

A szubsztitúció foka (DS) minden fényre keményedő GAG esetében a kívánalmaknak megfelelően szabályozható a reakció körülményeinek befolyásolásával. Például a DS növelhető a kiindulási GAG-hoz viszonyított R'COOH mólarány növelésével és/vagy a reakcióidő meghosszabbításával.

A reakció után a reakcióelegyhez nátrium-acetáttal telített etanolt, etanolt vagy metanolt kell adni, a keletkezett csapadékot leszűrni, etanollal vagy metanollal mosni, majd kis nyomáson szárítani, minek folytán a kívánt termék fehér por formájában nyerhető.

Az [5c] vagy [5e] képletű vegyületek előállítási reakciója lényegében a fenti módon hajtható végre.

Az így nyerhető fényre keményedő GAG-ok olyan változataira mutatunk néhány példát, melyekben minden diszacharid egység egy fotoreaktív vegyület egy molekulájával szubsztituált. A diszacharid egységek szerkezeti képletét tüntettük fel. Szerkezetileg eltérő egységek - melyek például a hozzájuk kötött fényreaktív csoportok számában és/vagy ezen kötések helyzetében különböznek - előfordulhatnak ugyanazon molekulán belül.

1., Fényre keményedő GAG (HA-Cin), mely hialuronsav és fahéjsav összekapcsolódásából származik [13].

2., Fényre keményedő GAG (HA-Thym), mely hialuronsav és l-(2-karboxi-etil)-timin összekapcsolódásából származik [14],

3., Fényre keményedő GAG, mely kondroitin-szulfát és 7-kumaril-oxi-ecetsav összekapcsolódásából származik [15], (2) Amidképző reakció gag-COOH-val (főként olyan esetben, mikor a fényreaktív vegyület köztes csoporthoz kötött, lásd [5-1] képlet).

(2-1): haR³ = R^3a

Ha az [X-l] vagy [X-2] vegyület alkilén-diamin (például etilén-diamin), úgy először olyan módosított GAGot kell előállítani, melynek karboxilcsoportjai aktiváltak. Ez a következőképpen történik: a GAG alkalmas tercier-amin sóját [például tri(n-butil)-amin só, trietil-amin só, pirimidinsó] megfelelő oldószerben (DMF, piridin, DMSO, HMPA stb.) feloldjuk - mint az előző (1) eljárásnál -, majd olyan mennyiségű hidroxivegyületet (például N-hidroxi-szukcinimid, N-hidroxi-ftálamid stb.) adunk hozzá, hogy a GAG karboxilcsoportjaihoz képest - mólszámot tekintve - némileg feleslegben legyen. Végül kondenzáló ágenst adunk a reakcióelegyhez [például diciklohexil-karbodiimid, l-etil-3-(dimetil-amino-propil)-karbodiimid]. Az egész reakciót 1-20 órán keresztül 0-50 °C hőmérsékleten végezzük, s eredményül az említett, karboxilcsoportjain aktivált, módosított GAG-ot kapjuk. Az így átalakított GAG-ot és az [F— 1] vagy [F-2] vegyület aminocsoportját amidképző reakcióba visszük 0-50 °C hőmérsékleten, 30 perctől 20 óráig terjedő időtartamban, s így kapjuk a fényre keményedő GAG-ot.

Fényre keményedő GAG-ok úgy is előállíthatók, hogy a GAG vizes oldatát használjuk, s az [F-l] vagy [F-2] vegyület aminocsoportját illetve a GAG karboxilcsoportját amidképző reakcióba visszük -0-50 °C hőmérsékleten, 1-20 órás időtartamban kondicionáló ágens [például vízoldékony karbodiimid: l-etil-3-(dimetil-amino-propil)-karbodiimid] jelenlétében.

(2-2) Ha R³ = R^3b (Y = COOH)

Abban az esetben, amikor [X-l] vagy [X-2] vegyület például bázisos aminosav (például L-lizin) a GAG vizes oldatban használatos, s a fényre keményedő GAG úgy állítható elő, hogy az [F-l] vagy [F-2] vegyület aminocsoportját és a GAG karboxilcsoportját amidképző reakcióba visszük (0-50 °C-on), kondenzáló ágens jelenlétében (például vízoldékony karbodiimid: l-etil-3-(dimetil-amin-propil)-karbodiimid).

A fényre keményedő GAG-ok úgy is előállíthatók, hogy a GAG megfelelő tercier-amin sóját reagáltatjuk hidroxivegyülettel (mint például N-hidroxi-szukcinimid) alkalmas oldószerben (például DMF), kondenzáló ágens (például diciklohexil-karbodiimid) jelenléte mellett - mint a (2-1) eljárásban - s az így nyert, karboxilcsoportjain aktivált GAG-ot amidképző reakcióba visszük az [F-l] vagy [F-2] vegyületek aminocsoportjaival. A [2], [4b], [5b] vagy [5h] reakciók lényegében a fenti eljárás szerint hajthatók végre.

HU 215 503 Β (3) Észterifikálás gag-COOH-val

Hasonlóan az (1) eljáráshoz, a GAG megfelelő tercieramin sóját [például tri(n-butil)-amin sóját, trietil-aminsóját, piridinsóját] feloldjuk alkalmas oldószerben (például DMF, piridin, DMSO, HMPA stb.) s a GAG karboxilcsoportjait észteresítjük egy uracilszármazék reaktív származékával [9] (például ciklikus étervegyülettel) vagy szubsztituált/szubsztituálatlan fahéj-alkohollal [10] (vagy annak reaktív változatával). E reakciót 0-100 °C hőmérsékleten, bázikus katalizátor jelenlétében (vízmentes piridin) végezzük.

A [4a], [5a] vagy [5g] reakciók lényegében a fenti eljárás szerint végezhetők.

A fényre keményedő GAG izolálása és tisztítása

A fenti reakciók után az előállított fényre keményedő GAG-ok bármely, GAG-oknál használt izolálási és tisztítási módszerrel izolálhatok és tisztíthatok, minden különösebb korlátozás nélkül.

így például a fényre keményedő GAG-ok, mégpedig a kívánt termékek olyan módszerekkel választhatók el a reagálatlan GAG-októl vagy fényreaktív vegyietektől, illetve olyan módszerekkel tisztíthatok, mint az anion-/kationcserélő kromatográfia, a kirázás, a dialízis vagy mint a szerves oldószerekben mutatott oldódáskülönbségeken alapuló eljárás (például alkoholos kicsapás).

Míg az ismert keresztkötéses glükóz-amino-glükánok gélek vagy szilárd anyagok formájában fordulnak elő (s így az elreagálatlan anyagok, katalizátorok, fertőző mikroorganizmusok, pirogének s más szennyezések nehezen távolíthatók el) a találmányban szereplő fényre keményedő GAG-ok oldhatók vízben és/vagy szerves oldószerben, s így könnyen tisztíthatok. Mivel a fent leírt módon megtisztított fényre keményedő GAG-ok fénysugárzás hatására - inter- vagy intramolekuláris dimerizációra képesek e fényreaktív csoportokkal, könnyen előállíthatok olyan keresztkötéses GAG-ok, melyek reagálatlan anyagokkal, katalizátorokkal, mikroorganizmusokkal, pirogénekkel stb. minimális mértékben szennyezettek.

A fényre keményedő GAG-ok fizikai tulajdonságai

A fent említett módokon szintetizált és tisztított, fényre keményedő GAG-ok fizikai tulajdonságai módosíthatók a kiindulási anyagként használt GAG-tól, annak molekulatömegétől, az alkalmazott fényreaktív vegyülettől, annak mennyiségétől, s más faktoroktól függően.

Ezen fizikai tulajdonságok olyan mértékben szabályozhatók, hogy a fényre keményedő GAG-ok alkalmassá váljanak a tervezett célra. Ezen vegyületek oldhatók vízben és/vagy szerves oldószerben, molekulatömegük általában 4000-2000000 között, leginkább 10 000-1000 000-ig, és a fényreaktív vegyületekkel történő szubsztitúció foka (DS) általában 0,1-4,0 értékek között, leginkább 0,1-3,0-ig terjed. Az oldékonyság a kívánalmaknak megfelelően szabályozható. Általában a DS emelkedése a vízoldékonyság csökkenését illetve a szerves oldószerben (például DMF) való oldékonyság növekedését eredményezi. Ha a fényreaktív csoport fahéjsavszármazék ([6]-os képlet) vagy 7-kumaril-oxikarbonsav ([8]-as képlet) vagy fahéj-alkohol-származék ([ll]-es képlet) az előállított fényre keményedő GAGok viszonylag hidrofóbok. Másrészt ha a fényreaktív csoport uracilszármazék (főleg ha timinszármazék ([7]es képlet vagy [10]-es)) az előállított fényre keményedő GAG-ok viszonylag hidrofilek. Attól függően, hogy a fényre keményedő vagy a keresztkötéses GAG-ot milyen célra kívánjuk alkalmazni, s hogy milyen GAG-ot és fényreaktív vegyületet használtunk fel az előállítás során, a DS módosítható. A sejtekhez nem tapadó keresztkötéses GAG-ok előállításához és ezek szövethez nem tapadó (nonadhezív) anyagként történő felhasználásához például a hialuronsav-fahéjsav-észter (HA-Cin) esetén a DS-nek 0,1-0,5 körül kell lennie; kondroitinszulfát-fahéjsav-észter (CS-Cin) esetén ez az érték 0,1-3,0 körül, hialuronsav és timinszármazék (HA-Thym) észtere esetén 0,2-1,0 illetve kondrotinszulfát és timinszármazék észtere (CS-Thym) esetén 0,2-1,0 körül optimális. Biológiai anyagnak (gyógyszer vagy hasonló) a keresztkötéses GAG háromdimenziós térhálójába történő beágyazásához - miáltal megvalósítható a hatóanyagok kontrollált kibocsátása - a DS 1,0 és 2,5 között kívánatos az összes, fent említett keresztkötéses GAG esetében.

Még pontosabban, ha a fényre keményedő GAG az [1] képlet egy fényre keményedő hialuronsav-származéka, a molekulatömeg többnyire 100000-1000000-ig terjed, és a fényreaktív vegyülettel történő szubsztitúciófoka (DS) 0,1-3,0 között van. Ha a fényre keményedő GAG az [l]-es képlet egy fényre keményedő kondroitin-szulfát származéka, a molekulatömeg többnyire 10000-60000, a DS 0,1-3,0.

Gyógyászati anyagként történő felhasználásukhoz a fényre keményedő és a keresztkötéses GAG-ok különböző formában alkalmasak. így ezen vegyületek változatos formában használhatók, úgymint oldatok, gélek, szilárd anyagok stb. A találmány gyógyászati anyagai, melyek az említett fényre keményedő és keresztkötéses GAG-okon alapulnak, a kívánalmaknak megfelelően tartalmazhatnak különböző oldószereket (például víz, pufferek, PB, DMF, DMSO), hordozókat (például géz, kötött vagy szőtt anyagok, vatták vagy gyapotszerű anyagok, szálak vagy fonalak, hártyák, porózus szivacs, gumi, műanyagok, mesterséges szervek, élő testszövetfelszínek, élő testen lévő vágások vagy sebek), biológiai anyagokat (kollagén, zselatin, heparin, kondroitinszulfát, hialuronsav, dermatán-szulfát stb.), gyógyszeranyagokat stb.

A fényre keményedő GAG-ok formázása (formába öntése stb.)

A gyógyászati felhasználásra kerülő fényre keményedő GAG-ok különböző alakúra formázhatok (filmszerű, cső alakú, szemcsés) vagy felhasználhatók, hozzákapcsolhatók a fent hordozóként leírt más anyagokhoz vagy azokkal beburkolhatok illetve azokba beágyazhatok. Ilyen esetekben a fényre keményedő GAG-ok a következőképpen formázhatok. A fényreakciót megelőzően feloldjuk őket vízben (lehetőleg tisztított vízben), pufferben (például foszfátpuffer, karbonátpuffer) vagy szerves oldószerben - a gyógyászatilag szükséges minőségnek megfelelően -, majd az oldatot sima lemezre

HU 215 503 Β vagy felületre kenjük vagy formába öntjük [mely lemezek és tartályok anyaga lehet üveg, kvarc, poli(vinil-klorid), polisztirén, poliuretán vagy hasonlók], s végül szellőztetéssel vagy hasonló módszerrel szárítjuk. A kapott anyagvastagság 1 pm-1 mm.

A keresztkötéses GAG-ok előállítása (fényreakció)

A keresztkötéses GAG-ok a fenti módon megformázott fényre keményedő GAG-ok vagy azok oldatának olyan fénnyel történő besugárzásával állíthatók elő, mely sugárzás a keresztkötések kialakulását indukálja, miáltal megvalósul a fotodimerizáció. Az alkalmazandó hullámhossz vagy a hullámhossztartomány attól függően változtatható, hogy a fényreaktív csoport milyen természetű, de általában 260-400 nm-ig terjed. Speciálisan nagy nyomású higanylámpák (450 W) használhatók a besugárzáshoz úgy, hogy a 260-270 nm-nél kisebb hullámhosszúságú sugarakat kiszűrjük. Bár a szükséges besugárzási idő olyan faktoroktól függ, mint a hullámhossztartomány, hőmérséklet, fényforrástól való távolság, a reakció megvalósításához általában 30 percen belüli besugárzási idő szükséges. A gélesedés (fényre keményedés) mértéke a fényreakció ideje alatt a fényre keményedő GAG-koncentráció esetleges változtatásával szabályozható. Általában a koncentráció 1-30 tömeg% között, leginkább 2-20 tömeg%-ig terjed.

A fényre keményedő GAG fényreakciójával képződő dimer szerkezetre a következőkben mutatunk konkrét példákat.

1., Ha a fényreaktív vegyület fahéj sav [16]

2., Ha a fényreaktív vegyület l-(2-karboxi-etil)-timin [Π]

3., Ha a fényreaktív vegyület 7-kumaril-oxi-ecetsav [18] A keresztkötéses GAG-ok fizikai tulajdonságai

A találmány fenti módokon előállított keresztkötéses GAG-jainak fizikai tulajdonságait olyan faktorok befolyásolhatják, mint a GAG vagy a fényreaktív vegyület természete, a fényre keményedő GAG koncentrációja, a fényreaktív vegyülettel (csoporttal) történő szubsztitúció foka (DS), a keresztkötöttség mértéke és a fényreakció ideje. Általában jellemző rájuk a duzzadóképesség, mely a következőképpen fejezhető ki: (duzzadt állapotban mért tömeg - száraztömeg) / száraztömeg. Ez különböző értéket mutat (0,1-200), s ennek megfelelő mennyiségben tartalmazhatnak illetve vehetnek fel vizet.

A duzzadóképesség értéke csökken a fényreaktív vegyülettel történő szubsztitúció fokának (DS) illetve a keresztkötöttség mértékének növekedésével arányosan.

Szintén jellemző rájuk a vízzel történő érintkezés szöge (10°-100°). Az érintkezési szög a keresztkötéses GAG felszínének hidrofobitás/hidrofilitás arányát fejezi ki. A fényreaktív csoport keresztkötöttségének (dimerizációjának) növekvő értéke az érintkezési szög értékének növekedését okozza, azaz a hidrofobitás növekedését.

A keresztkötöttség mértéke - mely azt mutatja meg, hogy az említett fényreaktív csoport milyen arányban vesz részt a dimerizációban - növelhető a DS növelésével, s befolyásolható az említett fényreakció szabályozásával is.

A fentiekből következik, hogy a keresztkötéses GAG-ok biológiai fúnkciói a keresztkötöttség mértékének változtatásával szabályozhatók. Például az olyan sejtek, mint az endothel-sejtek, hajlamosak olyan keresztkötéses GAG-okhoz tapadni, melyeknek keresztkötöttségi mértéke magas, jóllehet ezen tapadási tulajdonság változó lehet a GAG-ok és a fényreaktív vegyületek természetétől függően. A fent említett tapadási hajlam megfigyelhető hialuronsav esetében, mely nem tartalmaz szulfátcsoportot (lásd „példák” részben bemutatott fényképeket), míg szulfátcsoportot tartalmazó GAG-ok (például kondroitin-szulfát) esetében ez a hajlam csekély. Fentiekre való tekintettel a sejthez tapadás elősegítésére vagy megszüntetésére több, különböző GAG kombinált használata alkalmazható.

Fenti tulajdonságok felhasználhatók arra, hogy a funkcióknak megfelelően megkülönböztessük a mesterséges vérerek érbelhártyáját illetve külső felszínét (adventitia), mégpedig úgy, hogy az egymástól - a sejthez tapadási hajlamukban - különböző keresztkötéses GAG-okat használjuk fel az érbelhártya illetve az adventitia burkolóanyagaként. így például az érbelhártya sejthez nem tapadóvá tehető - megelőzendő a trombózist míg az adventitia sejthez tapadóvá tehető, hogy a fibroblasztok képesek legyenek hozzátapadni, miáltal az ér impermeábilis lesz a vérre.

Gyógyászati anyagokként való felhasználások

A találmány szerinti fényre keményedő illetve keresztkötéses GAG-ok felhasználhatók gyógyászati anyagokként, beleértve nemcsak a fent említett mesterséges vérerek érbelhártyájának illetve adventitiájának kialakításához használatos anyagokat, hanem azokat is, melyek mesterséges bőr, szövetekhez nem tapadó hártyák vagy anyagok, sebgyógyulást elősegítő anyagok, félmesterséges szervek, mesterséges sejtközötti állományok, alapmembránok stb. készítéséhez használhatók. Sőt, gyógyszerbeágyazás is lehetséges, ha a fényérzékeny GAG-oldatot fiziológiailag aktív anyaggal keverjük össze (például heparin, dermatán-szulfát, heparánszulfát, rákellenes ágens, gyulladásgátló szer, citokin, hormonok, növekedési faktor vagy enzimek, mint például szövet plazminogén-aktivátor, szuperoxid-dizmutáz vagy urokináz stb. s az oldatot vagy a már tárgyalt módon megformázott változatát fényreakcióba visszük, s így kialakítjuk a keresztkötéseket. így a fényre keményedő és a keresztkötéses GAG-ok egyaránt használhatók hordozókként, melyek segítségével megvalósítható a beléjük ágyazott gyógyszerek kontrollált kibocsátása.

Néhány jellemző felhasználási lehetőséget az alábbiakban részletezünk.

Nem tapadó (nonadhezív) anyagok

A találmány keresztkötéses GAG-jai felhasználhatók nem tapadó anyagokként, melyek megakadályozzák a műtéti sebek nem kívánt összenövését (összetapadását) és elősegítik a gyógyulást. Például keresztkötéses GAGhártya használható a hasfal vagy a hasüregi szervek (például máj) befedésére - miáltal a hasüregi sérülés megvédhető -, s így megakadályozható a nem kívánt összetapadás, illetve elősegíthető a gyógyulás. Az említett

HU 215 503 Β hártyák a seb gyógyulási idejének megfelelően leépíthetők illetve felszívódtathatók.

A fényre keményedő GAG-ok oldat formájában is felhasználhatók a fenti célok megvalósítására, mégpedig úgy, hogy az oldatot a sebbe fecskendezve befedjük annak felületét, majd fénysugárzással in vivő alakítjuk ki a keresztkötéses hártyákat vagy membránokat. Ez a technika különösen endoszkópiás operációknál alkalmazható az összetapadás megakadályozására és/vagy defektusok, hiányok kitöltésére.

Nem tapadó anyagokként történő felhasználásukhoz a keresztkötéses GAG-oknak (beleértve az in vivő keresztkötött GAG-okat is) megfelelő szakítószilárdságúnak - elkerülendő a hártyák szakadását - és sejthez nem tapadónak kell lenniük, továbbá a sebgyógyulással arányos mértékben kell biológiailag lebontódniuk. A biológiailag lebomló anyagoknak teljesen nontoxikusnak kell lenniük, különösen ha élő szervezetben szívódnak fel. A fenti funkciók szabályozhatók a fényre keményedő GAG szelektálásával (szelekció GAG-fajtára, fényreaktív vegyületre, DS-re) illetve a besugárzási feltételek megválasztásával (például a fényforrástól való távolság, fényforrás fajtája, fényintenzitás, anyagvastagság stb.).

Kontrollált gyógyszerkibocsátás

A találmány keresztkötéses GAG-jai felhasználhatók olyan anyagokként (hordozók), melyeknek háromdimenziós térhálójába gyógyszereket ágyazhatunk, miáltal megvalósítható a kontrollált gyógyszerkibocsátás. így a beágyazott gyógyszer olyan sebességgel bocsátható ki, amely megfelel a gyógyszer természetének illetve a felhasználási módnak (kívánt ideig fenntartva az alkalmazási helyen a szükséges gyógyszerkoncentrációt).

A kontrollált gyógyszerkibocsátás mértéke szabályozható a fényre keményedő GAG megfelelő kiválasztásával (GAG-fajták, fényreaktív csoportok kiválasztása) illetve a besugárzási körülmények megfelelő alkalmazásával (például besugárzási idő, fényforrástól való távolság, fényforrás teljesítménye). Bár a kibocsátás mértéke általában csökken a gyógyszer molekulatömegének és az elektrosztatikus vonzerő (a gyógyszer és a keresztkötéses GAG között) emelkedésével, a kibocsátás kívánt mértékűre állítható oly módon, hogy a fényre keményedő GAG-ot a gyógyszerrel együtt választjuk ki, tekintettel kémiai szerkezetükre (molekulatömeg, elektromostöltés-jelleg - hidrofilitás, hidrofobitás mértéke - stb.).

Ilyen szempontból a gyógyszerek mérsékelt körülmények között történő immobilizálása olyan állapotban stabilizálja őket, melyben a gyógyszer lebomlása, aktivitásának elvesztése gátolt.

A kontrollált gyógyszerkibocsátásra használható anyagok vagy készítmények - melyek mindegyike keresztkötéses GAG-ból és a beágyazott gyógyszerből áll - bármely kívánt formában kialakíthatók (a gyógyszer természetének illetve a felhasználási módnak megfelelően). így kialakíthatók például filmek, hártyák, zselék, gélek, krémek, szuszpenziók, mikrokapszulák, tabletták, granulátumok stb. formájában. A fényre keményedő GAG-ok úgy is alkalmassá tehetők a felhasználásra, hogy a fényre keményedő GAG-ot és gyógyszert tartalmazó készítménybe valamilyen vázanyagot [például géz, kötszer, kötött vagy szőtt vagy másfajta (textil) anyag, papír, gyapot, film, porózus szivacs] ágyazunk (vagy az említett készítményt kenjük rá a vázanyagra), s végül besugárzással alakítjuk ki a keresztkötéses GAG-ot. Sőt a fényre keményedő GAG és a gyógyszert tartalmazó készítmény felhasználható mesterséges szervek felületének vagy belsejének (például mesterséges vérerek, szív) kialakításához, majd keresztkötés-képző reakcióba vihető.

Ezen találmány keresztkötéses GAG-jaiba úgy ágyazhatok gyógyszerek, hogy utóbbiakat vizes vagy szerves oldószeres (például DMF) oldatban oldjuk vagy szuszpendáljuk - mely oldatok 1-30 tömeg%-os arányban tartalmazzák a megfelelő fényre keményedő GAGot, 0,001-50 tömeg%-os gyógyszertartalom mellett -, majd a megfelelő adalékanyagok hozzáadása után a kapott készítményt formázzuk, szárítjuk, s végül fénysugárzásnak tesszük ki. A keresztkötés-képzés után a megformázott anyagok felhasználhatók közvetlenül vagy kontrollált gyógyszerkibocsátásra alkalmas anyagok alapanyagaiként, szilárd, félkemény illetve szuszpenzió formában.

A találmány kontrollált gyógyszerkibocsátásra alkalmas anyagai felhasználhatók sebészeti készítményekként. Ebben az esetben a gyógyszert tartalmazó keresztkötéses GAG-ok feldolgozhatok közvetlenül illetve hagyományos, sebészetileg alkalmas adalékanyagokkal együtt (például tartósítószerek, stabilizáló anyagok, helyi érzéstelenítők, diszpergáló ágensek, megformázhatóságot befolyásoló anyagok, szolubilizáló ágensek stb.) a kívánt dózisokat tartalmazó formákká. Például az átlagos részecskeméret kialakítása után (0,5-40 pm) a gyógyszertartalmú keresztkötéses GAG-ok felhasználhatók vizes szuszpenziók készítéséhez diszpergáló ágensekkel [például Tween 80, HCO 60 (Nippon Chemicals), karboxi-metil-cellulóz, Na-alginát stb.], tartósítószerekkel (például metil-parabén, propil-parabén, benzil-alkohol, klór-butanol stb.), izotonizáló (ozmózis nyomást kiegyenlítő) ágensekkel (például NaCl, glicerin, szorbitol, glükóz) és más, szükség szerinti adalékokkal. Növényi olajban (olívaolaj, szezámolaj, földimogyoróolaj, gyapotmagolaj, kukoricaolaj) vagy propilén-glikolban diszpergálva olajemulziók készítéséhez is használhatók. A gyógyszert tartalmazó keresztkötéses GAGok felhasználhatók préselt tabletták vagy porok, granulátumok készítéséhez közvetlenül vagy kötőanyagokkal (például keményítő, gumiarábikum, karboxi-metil-cellulóz, poli(vinil-pirrolidin), hidroxi-propil-cellulóz stb.), csúszást segítő anyagokkal [például talkum, magnézium-sztearát, polietilén-glikol 6000 stb.] és/vagy hasonlókkal összekeverve is. Ha a porokat, granulátumokat kapszulákba töltjük, gyógyszertartalmú kapszulákhoz jutunk. Sőt a gyógyszertartalmú keresztkötéses GAG-ok közvetlenül filmekké alakítva vagy más vázanyagokkal rögzítve perkután (bőrön keresztül) felszívódó készítmények nyerhetők, továbbá szemészeti készítmények (például szaruhártya sebgyógyulását elősegítő szer), élő testbe ágyazható illetve testüregbe helyezhető készítmények

HU 215 503 Β (például végbélkúpok). Ezek használhatók többek között sebkötözőként, gyógyszerkibocsátó tapaszokként (például ragasztószalag), fogamzásgátlókként.

A gyógyszertartalmú keresztkötéses GAG-okat tartalmazó készítményekben alkalmazható gyógyszerek nem korlátozódnak speciális fajtákra, másrészről azonban olyan gyógyszereknek kell lenniük, melyek alkalmasak effektív vérbeni koncentráció vagy effektív helyi koncentráció megvalósítására, feltéve, hogy megfelelő mértékben visszatarthatok a keresztkötéses GAGok térhálójában illetve kontrollált módon bocsáthatók ki abból.

A következőkben jellemző példákat említünk.

1. Lázcsillapító - érzéstelenítő (fájdalomcsillapító) - gyulladásgátló szerek, mint indometacin, mefensav, acemetacin, alklofenak, ibuprofen, tiaramid-hidroklorid, fenbufen, mepirizol, szalicilsav stb.;

2. Rosszindulatú daganat elleni szerek, mint például methotrexat, fluoro-uracil, mitomycin C, aktinomycin C, daunorubicin-hidroklorid stb.;

3. Fekélyt gyógyító szerek, például alumínium-aceglutamid, L-glutamin, p-(transz)-4-aminometil-ciklohexán-karboxil)-fenil-propionsav-hidroklorid, cetraxáthidroklorid, szulfimid, gefamát, cimetidin stb.;

4. Enzimkészítmények, például kimotripszin, sztreptokináz, lizozim-klorid, bromelain, urokináz, szövet plazminogén-aktivátor stb.;

5. Vérnyomáscsökkentő szerek, például clonidinhidroklorid, bumitrolol-hidroklorid, prazosin-hidroklorid, captopril, betanidin-szulfát, metoprolol-tartarát, metildopa stb.;

6. Urogenitális sszervekhez használatos szerek, például flavoxát-hidroklorid stb.;

7. Véralvadásgátló szerek, mint például heparin, heparán-szulfát, trombomodulin, dikumarol, warfarin stb.

8. Érelmeszesedést gátló szerek, például clofibrát, simfibrát, elasztáz, nicomol stb.;

9. Keringési szervekben használható szerek, például nicardipin-hidroklorid, nimodipin-hidroklorid, citokróm C, tokoferol-nikotinát stb.;

10. Szteroidok, például hidrokortizon, prednisolon, dexametason, betametason stb.;

11. Sebgyógyulást elősegítő szerek, például növekedési faktorok, kollagén stb. (lásd JP-A-67-222425).

Megemlíthetők még a fiziológiailag aktív polipeptidek, hormonok, tuberkulusztátok, vérzéscsillapítók, antidiabetikus szerek, értágító szerek, szívritmusszabályozó szerek, szíverősítők, allergia elleni szerek, antidepreszszív szerek, epilepszia elleni szerek, izomlazítók, köhögéscsillapítók, köptetőszerek, antibiotikumok és hasonlók.

Ezen találmány kontrollált gyógyszerkibocsátó anyagai mesterséges szervek (mesterséges vérerek, szív) alkotóelemeiként (például felületek) is felhasználhatók. Ilyen esetben különösen alkalmasak vérrel érintkező felületek alkotóelemeiként való felhasználásra, mert itt a keresztkötéses GAG-okba ágyazhatok véralvadásgátló szerek (heparin, heparán-szulfát, trombomodulin), fibrinolízis-aktivátor (pl. szövet plazminogén-aktivátor, urokináz) és/vagy trombocitagátló szerek, melyek kontrollált kibocsátása megvalósítható, s ezáltal a felület trombózisgátlóvá válik.

Mesterséges extracelluláris sejtközi állományok és mesterséges alapmembránok

A találmány fényre keményedő GAG-jai sejthez tapadó fehérjékkel (kollagén, zselatin vagy fibronektin) alkotott keverékként vagy ezen fehéijékhez kémiai kötéssel kapcsolódva átalakíthatok keresztkötéses GAGokká, melyek a sejtek (endothel-, epithelsejtek, simaizomsejtek) tapadását és növekedését lehetővé tevő (lásd JP-A-1-124465, 61-128974 és 62-270162) extracelluláris sejt közötti állományként vagy mesterséges alapmembránként használhatók fel. Ezek félmesterséges (hibrid-mesterséges) szervekként (mesterséges vérér, mesterséges bőr stb.) használhatók.

A következő példák a találmány további szemléltetését teszik lehetővé, de ez semmi esetre sem jelenti azt, hogy a találmány alkalmazási köre csak az alábbiakra vonatkozik.

A példákban néhány sajátságos fizikai jellemzőt és egy biológiai funkciót az alább részletezett módon, illetve az alább leírt műszerekkel mértünk illetve számítottunk.

Ή-NMR-spektrumot JOEL JNM-JX 270 FT NMR-spektrométerrel mértük, míg az UV/VIS-spektrumot JASCO Ubest-30 UV/VIS-spektrométerrel.

A szubsztitúció fokát (DS) - minden fényreaktív vegyületre - az Ή-NMR- vagy az UV-adatok alapján számítottuk. Kis molekulatömegű modellek (GAGbomlástermékek) UV-abszorbciójának a hozzájuk kapcsolódó fényreaktív vegyülettel történő összehasonlításával szintén meghatároztuk.

Az összes keresztkötéses GAG-származék esetében a duzzadási kapacitást (képességet) az alábbiak szerint határoztuk meg:

Duzzadóképesség = [m(duzzadt) - m(száraz)] / m(száraz), ahol m(száraz) a fénysugárzással előállított keresztkötéses GAG-film száraz állapotban mért tömege; m(duzzadt) pedig a film tömege 24 órás, tisztított vízben történt áztatás után.

Az érintkezési szöget, az előrehajló, hátrahajló érintkezési szögeket folyadékcsepp-módszerrel, kontakt goniométer használatával (Kyowa contact angie meter CA-D, Kyowe Kaimén Kagaku K. K.) mértük. Amikor az „érintkezési szög” kifejezést önmagában használjuk, az általában „előrehajló érintkezési szög”et jelent.

Endothelsejtek tapadási kísérleteit a következőképpen végeztük. A fényre keményedő GAG-ot öntéssel hártyává formáltuk, és a filmet (hártyát) polisztirénből (TCPS) készült szövettenyésztő tál alján rögzítettük. Ezt szarvasmarha aortából származó endothelsejtekkel oltottuk be, steril körülmények mellett. Dulbecco-féle módosított Eagle táptalajt (DMEM) használtunk, melyet 10-15% borjúmagzat-szérummal (FCS) egészítettük ki. A sejtek tapadását vagy nemtapadását - 24 órás, 37 °C-on történő inkubáció utáni - fáziskontraszt mikroszkóppal vizsgáltuk. A sejtnövekedés vizsgálatához 1-2 nap múlva számított sejtnövekedési rátát használtunk.

HU 215 503 Β

1. példa: Hialuronsavas fahéj sav-észter előállítása és ebből keresztkötéses hialuronsav előállítása fényreakcióval (1) Hialuronsavas fahéjsav-észter előállítása ml vízmentes piridint adunk hialuronsav (molekulatömeg 880000) tri(n-butil)-amin sójának dimetilformamidos (DMF) oldatához (150 mg/35 ml), majd 26,64 mg cinnamoil-kloridot adunk hozzá élénk kevergetés mellett, szobahőmérsékleten. Az észteresítést 75 °C-on 2 óra hosszat folytatjuk, majd nátriumacetáttal telített etanolt adunk a reakcióelegyhez, s a kapott csapadékot összegyűjtjük, és etanollal alaposan átmossuk (az reagálatlan cinnamoil-klorid eltávolítása végett), s így a hialuronsav fahéj sav-észterét kapjuk.

Tétel: HA-Cin-3

Hozam: 95,6 mg

Kötött fahéjsav: 11,0 m% ('H-NMR-spektrum alapján)

DS: 0,5

A fenti termék 'H-NMR-spektruma az 1. ábrán látható. Sajátosan jellemző elnyelések:

6-8 ppm: a fahéjsav benzolgyűrűjének illetve a fahéjsav kettős kötése protonjainak tulajdonítható ppm: a hialuronsav N-acetil-csoportjainak metilprotonjainak tulajdonítható

Fenti protonok számának arányát kiszámítottuk, és a kötött fahéjsav mennyiségének illetve a DS meghatározásához használtuk.

(2) Kikeményített (keresztkötéses) hialuronsav-film 5 előállítása

A HA-Cin-3-vegyület DMF-os oldatának 30 mgját sima üveglapra (24 χ 24 mm) helyeztük, és 40 °C-os steril levegővel szárítottuk. A kialakult filmet 450 W-on nagynyomású higanylámpával sugároztuk be egy pyrex10 borítású vizes szűrő közbeiktatásával, hogy a 270 nmnél kisebb hullámhosszú fényt kiszűrjük. így kikeményített (keresztkötéses) hialuronsav-filmet kaptunk.

A 279 nm-nél lévő abszorpciós csúcs megvilágítás hatására csökkent. A megvilágítást akkor szakítottuk meg, mikor a százalékos csökkenés állandó lett (megvilágítási idő: 30 perc).

Tétel (vegyület): HA-Cin-3-2

2. példa

A hialuronsavas fahéj savésztereket ugyanolyan eljárással és ugyanolyan anyagok felhasználásával állítottuk elő, mint az 1. példában, azzal a különbséggel, hogy a hialuronsav/fahéjsav tömegarányt változtattuk, amint az az 1. táblázatban látható (a hialuronsav tömege mindig

150 mg volt). Továbbá a kikeményített hialuronsav-filmet szintén az 1. példának megfelelően állítottuk elő.

1. táblázat

Hialuronsav-fahéjsav-észter	Keresztkötéses hialuronsav
Tétel	Hozam	Kötött fahéjsav	DS	Tétel
HA-Cin-1	92,3 mg	2,0 m%	0,10	HA-Cin-1-2
HA-Cin-2	97,3 mg	6,5 m%	0,35	HA-Cin-2-2
HA-Cin-4	111,4 mg	14,0 m%	0,87	HA-Cin-4-2
HA-Cin-5	117,0 mg	22,5 m%	1,28	HA-Cin-5-2
HA-Cin-6	139,2 mg	36,0 m%	2,43	HA-Cin-6-2
HA-Cin-7	149,7 mg	46,0 m%	3,65	HA-Cin-7-2

3. példa: A kikeményített (keresztkötéses) hialuronsav-fílmek érintkezési szögei

Az 1. és 2. példában kapott valamennyi kikeményített hialuronsav-film előrehajló, hátrahajló érintkezési szögét lemértük. Az eredmények a 3. ábrán láthatók. Mindkét érintkezési szög egyértelműen nő a fahéjsavgyök szubsztitúciójának fokával (DS) (annak növekedésével). Az érintkezési szög növekedése a filmfelület hidrofobitásának növekedését tükrözi.

4. példa: A kikeményített hialuronsav-filmek duzzadást képességének kifejezése

Az 1. és 2. példákban kapott valamennyi kikeményített hialuronsav-film duzzadást képességét megmértük (20 órás, tisztított vízben történő duzzadást idővel). Az eredmények a 4. ábrán láthatók.

Amint az megfigyelhető, a duzzadóképesség csökken a fahéjsavgyök szubsztitúciófokának (DS) növekedésével.

A duzzadást képesség csökkenése a film hidrofobitásának növekedését tükrözi.

5. példa: Endothelsejtek tapadása a kikeményített hialuronsav-filmhez

Az endothelsejtek tapadását vagy rögzülését az 1. és 2. példában kapott kikeményített hialuronsav-filmekhez [HA-Cin-3-2 (DS = 0,5); 4-2 (DS = 0,87),

5-2 (DS = 1,28) és 6-2 (DS = 2,43)] 24 órás inkubáció után vizsgáltuk. Az eredmények az 5. ábrán láthatók (fényképek). Látható, hogy az endothelsejtek tapadási hajlama növekedhet a DS (fahéjsavgyök) növekedésével.

A HA-Cin-3-2-film (DS = 0,5) elégséges mértékben mutat nonadhezív (sejtekhez nem tapadó) jelleget, ezért ezt alapvető kívánalomnak tekintjük szövetekhez nem tapadó anyagok esetében.

A kapott adat arra is alkalmas, hogy alapvető feltétel60 ként szolgáljon olyan mesterséges sejt közötti állomá12

HU 215 503 Β nyok és mesterséges alapmembránok készítésére vonatkozóan, melyek a találmány keresztkötéses GAG-jaiból illetve sejthez tapadó fehéijékből (kollagén, zselatin, fibronektin) készülnek, és lehetővé teszik, hogy endothel sejtek, epithelsejtek, simaizom-sejtek stb. tapadjanak hozzájuk és növekedjenek rajtuk, miáltal hibrid típusú félmesterséges szervek nyerhetők (például mesterséges vérerek, bőr stb.).

6. példa: Kondroitin-szulfát-fahéjsav-észter előállítása és keresztkötéses kondroitin-szulfát előállítása fényreakcióval (fényre keményedés) (1) Kondroitin-szulfát-fahéj savészter előállítása

Kondroitin-szulfát-tri(n-butil)-amin sónak DMF-os oldatához (247 mg/15 ml) 30 ml vízmentes piridint adtunk. A reakcióelegyhez 19,78 mg cinnamoil-kloridot adtunk (szobahőmérsékleten, élénk kevergetés mellett). A reakciót 75 °C-on 2 óra hosszat végeztük, végül Na-acetáttal telített etanolt adtunk a reakcióelegyhez, s a kapott csapadékot összegyűjtöttük, alaposan átmostuk etanollal, majd alacsony nyomáson szárítottuk.

Tétel: CS-Cin-1

Hozam: 152 mg

Kötött fahéj sav: 7,52 m%

DS: 0,33 (2) A keresztkötéses kondroitin-szulfát-film előállítása

Az előző (1) lépésben előállított CS-Cin-1 -terméket 15 tömeg%-os koncentrációban foszfátpufferben oldottuk, majd az 1. példában használt higany lámpával meg10 világítva végeztük a gélesítést.

Tétel: CS-Cin-1-2

7. példa

A kondroitin-szulfát-fahéjsavésztereket ugyanolyan 15 eljárással és ugyanolyan anyagok felhasználásával állítottuk elő, mint a 6. példában, azzal a különbséggel, hogy a kondroitin-szulfát és fahéj sav tömegarányát változtattuk (lásd 2. táblázat). A kondroitin-szulfát tömege mindig 247 mg volt. A keresztkötéses kondroitin-szul20 fát-filmet szintén az 1. példának megfelelően állítottuk elő.

2. táblázat

Kondroitin-szulfát-fahéjsavészter	Keresztkötött kondroitin-szulfát
Tétel	Hozam	Fahéjsav	DS	Tétel
CS-Cin-2	165,7 mg	11,59 m%	0,51	CS-Cin-2-2
CS-Cin-3	170,0 mg	14,0 m%	0,65	CS-Cin-3-2
CS-Cin-4	195,4 mg	25,8 m%	1,37	CS-Cin-4-2
CS-Cin-5	233,8 mg	38,6 m%	2,43	CS-Cin-5-2

A CS-Cin-2-vegyületet különböző koncentrációkban, foszfátpufferes sóoldatban (PBS) oldottuk, s az így kapott oldatokat 30 percig világítottuk meg, majd megvizsgáltuk a gélesedés mértékét. Az eredmények a 6. ábrán láthatók. Amint az a 6. ábrán látható, a gélesedés mértéke nő a koncentráció növekedésével. A gélesedés mértékét (%) a következőképpen számítottuk:

Gélesedési százalék (%) = 100 x (A-X)/(A-B), ahol A= a megvilágítás előtti abszorbancia (OD275 nm)

B= az abszorbancia konstans értékének eléréséhez szükséges megvilágítás után kapott abszorbancia (OD275 nm)

X= az abszorbancia (OD275 nm), 30 perces megvilágítás után

A CS-Cin-3-vegyület (DS = 0,65) 15%-os PBS oldatát fénnyel besugároztuk, és a gélesedés mértékét az idő függvényében követtük. így minden besugárzási periódus után a kialakult gélt 24 óráig ioncserélt vízben áztattuk, majd - a felületi nedvesség eltávolítása után - lemértük. A gél tisztítása után a duzzadási képességet kiszámoltuk. A gélesedés mértékét szintén meghatároztuk. Az így kapott eredményeket a 7. ábrán szemléltettük.

A besugárzási idő növekedésével a gélesedés mértéke nő, míg a duzzadási képesség csökken.

A CS-Cin-1— CS-Cin-5-vegyületeket szintén megvizsgáltuk PBS-ben mutatott gélesedésük illetve a kapott gélek duzzadási képességének tekintetében. A gélesedés mértéke illetve a duzzadási képesség és a fahéj savgyök szubsztitúciófoka (kondroitin-szulfát-tartalmú diszacharid egységre vonatkoztatott mólarány) közötti összefüggést a 8. ábrán mutatjuk be.

A fahéj savgyök szubsztitúciófokának emelkedése a 50 gélesedés mértékének emelkedését, illetve a duzzadási képesség gyors csökkenését eredményezi.

8. példa: A kikeményített kondroitin-szulfátfilmek duzzadási képességének értékelése

A 6. és 7. példákban szintetizált kondroitin-szulfátfahéjsavésztereket fényre keményedő filmekké alakítottuk, majd 30 perces fénybesugárzással (a keresztkötések kialakítása érdekében) kikeményedett kondroitinszulfát-filmeket kaptunk. Ezen filmek duzzadási képes60 ségét mértük. Az eredmények a 9. ábrán láthatók.

HU 215 503 Β

Ezen eredmények azt mutatják, hogy a kikeményített kondroitin-szulfát-filmek duzzadóképessége nem csökken olyan gyors mértékben a fahéjsavgyök szubsztitúciófokának (DS) növekedésével, mint a kikeményített hialuronsav-filmek esetében. Ez feltételezhetően annak a ténynek tulajdonítható, hogy a kikeményített kondroitin-szulfát-filmek szulfátcsoportokkal rendelkeznek, és hidrofilitásuk nagyobb, mint a kikeményített hialuronsav-filmeké.

9. példa

A 8. példában kapott kikeményített kondroitinszulfát-filmek érintkezési szögeit megmértük és a fahéjsav-gyök szubsztitúciófokának függvényében ábrázoltuk. Az eredmények a 10. ábrán láthatók. A grafikus ábrázolás megmutatja, hogy a keresztkötéses kondroitin-szulfátok kisebb érintkezési szögeket mutatnak, mint a keresztkötéses hialuronsavak. Ez valószínűleg szintén a hidrofilitásban mutatkozó különbségnek tudható be.

10. példa: Endothelsejtek tapadása kikeményített kondroitin-szulfát-fílmekhez

Endothelsejteknek a 8. példában előállított kikeményített kondroitin-szulfát-fílmekhez történő tapadását az 5. példának megfelelően vizsgáltuk. A kikeményített hialuronsav-fílmekkel ellentétben - a fahéjsav szubsztitúciófokától függetlenül - nem tapasztaltunk összetapadást.

11. példa: Fahéj savszármazék kötése hialuronsav karboxilcsoportjaihoz; keresztkötésképzés (1) Cinnamoil-etilén-diamin-amid szintézise

1,666 g cinnamoil-kloridot 100 ml kloroformban oldottunk, majd 6 g etilén-díamint (kloroformban) csepegtettünk az oldathoz 0 °C-on. 20 órás, 40 °C-on történő keverés után a reakcióelegyet telített nátrium-hidrokarbonát-oldattal mostuk, majd alaposan átmostuk vízzel. A szerves fázist alacsony nyomáson bekoncentráltuk, majd a csapadékot átkristályosítottuk etanollal és megkaptuk a kívánt terméket (1,58 g; a továbbiakban ,A” vegyület).

(2) Na-Cinnamoil-L-lizin szintézise

Na-(t-butoxi-karbonil)-L-lizint (2,58 g) 50 ml dimetilformamidban oldottunk, s 30 ml vízmentes piridint adtunk hozzá. Az elegyhez cinnamoil-klorid kloroformos oldatát (1,665 g/20 ml) adtuk, s a reakciót 40 °C-on végeztük. A reakcióelegyet alacsony nyomáson, száraz állapotig töményítettük, majd a maradékot 33 ml, 3,6 N HCl/dioxánban oldottuk, s 4 órás állás után az oldatot alacsony nyomáson koncentrálva megkaptuk a kívánt vegyületet (2,43 g, a továbbiakban „B”-vegyület).

(3) A cinnamoil-etilén-diamin-amid kötése hialuronsavhoz ml vízben 150 mg Na-hialuronátot (molekulatömeg 1 200000) oldottunk, majd 42,75 mg „A”-vegyületet és 71,9 mg l-etil-3-(3-/dimetil-amino/-propil)karbodiimid-hidrokloridot adtunk hozzá. A reakciót szobahőmérsékleten 20 óra hosszat folytattuk. A reakcióelegyhez 1 M vizes nátrium-hidrokarbonátot adtunk, majd szobahőmérsékleten 1 óráig állni hagytuk, s Na-acetáttal telített etanolt adtunk hozzá. A kapott fehér csapadékot összegyűjtöttük és alaposan mostuk etanollal.

Tétel: HA-CinA-1

Hozam: 176,2 mg

Kötött „A”-vegyület: 16,58 m%

DS: 0,5 (4) Να-cinnamoil-L-lizin kötése hialuronsavhoz

A hialuronsav tri(n-butil)-amin sójának (molekulatömeg: 880 000) dimetil-formamidos oldatához (150 mg/35 ml) 1,224 g N-hidroxi-szukcinimidet és 55 mg diciklohexil-karbodiimidet adtunk, s reakciót először 0 °C-on 1 óra hosszat végeztünk, majd szobahőmérsékleten 10 óra hosszat (hogy aktiváljuk a hialuronsav karboxilcsoportjait). A reakcióelegyhez étert adtunk, s a csapadékot összegyűjtöttük, éterrel mostuk, majd alacsony nyomáson szárítottuk, s végül megkaptuk a megfelelően aktivált hialuronsav-észtert.

Ezen aktivált hialuronsavat dimetil-formamidban oldottuk. Az oldathoz „Β’’-vegyület dimetil-formamidos oldatát (44 mg/50 ml) adtuk, s a reakciót szobahőmérsékleten 20 óra hosszat végeztük. A reakcióelegyhez Na-acetáttal telített etanolt adtunk, s a keletkezett csapadékot leszűrtük, majd etanolos mosással tisztítottuk.

Tétel: HA-CinB-1

Hozam: 122,1 mg

Kötött „B”-vegyület: 25,92 m%

DS: 0,5 (5) Kikeményített hialuronsav-filmek előállítása

A HA-CinA-1- és HA-CinB-1- vegyületek 30-30 mgját az 1. példához hasonlóan filmmé alakítottuk, s fénysugárzással kialakítottuk a keresztkötéseket. Az így külön-külön - előállított HA-CinA—1—2 és HA-CinB-1-2 hialuronsav-filmek 1,2 illetve 1,4 g (H₂O/g (gél) duzzadásiképesség-értéket mutattak.

12. példa

Hialuronsav-[l-(2-karboxi-etil)-timin]-észter szintetizálása (1). Hialuronsav (molekulatömeg: 1 000000, továbbiakban HA 100) dimetil-formamidos (DMF) oldatához (mely 0,317 g 2-klór-l-metilpirimidínium-jodidot tartalmaz) 0,245 g [l-(2-karboxietil)-timint] és 0,461 g trietil-amint adtunk, s a reakciót 90 °C-on 4 óra hosszat végeztük. A DMF-ot alacsony nyomáson eltávolítottuk, feleslegben lévő etanolt adtunk a reakcióelegyhez és a csapadékot összegyűjtöttük, etanollal mostuk s alacsony nyomáson szárítottuk. A kapott fehér csapadék a hialuronsav-[l-(2-karboxietil)-timin]-észter.

Tétel: HA-Thym-1

Hozam: 160,0 mg

Kötött timin: 9,1 m%

DS: 0,46 (A DS-t az 'H-NMR-spektrummal meghatározott timin metilprotonok és hialuronsav acetilprotonok számának aránya alapján számítottuk.)

HU 215 503 Β

13. példa: lönbséggel, hogy néhány tényezőt a 3. táblázatnak megHialuronsav-[ 1 -(2-karboxi-etil)-timin]-észter felelően változtattunk meg.

szintetizálása (2)

Több hialuronsav-[l-(2-karboxi-etil)-timin] észtert állítottunk elő a 12. példában leírt módszerrel, azzal a kü- 5

3. táblázat

Reakció- körülmények	Fizikai jellemzők
Tétel	Timin/HA OH mólarány	Hőmérséklet (°C)	Idő (óra)	DS	Oldhatóság (mg/ml) víz	DMF
HA-Thym-2	0,5/1,0	90	3	0,05	1	20
HA-Thym-3	1,0/1,0	75	2	0,125	10	80
HA-Thym-4	2,0/1,0	75	2	0,14	10	80
HA-Thym-5	0,67/1,0	90	4	0,17	50	80
HA-Thym-6	1,0/1,0	90	3	0,26	20	80
HA-Thym-7	1,0/1,0	90	6	0,35	20	80
HA-Thym-8	0,67/1,0	100	4	0,37	50	80
HA-Thym-9	3,0/1,0	90	3	2,40	0	100

14. példa: Keresztkötéses hialuronsav előállítása hialuronsav-[ 1 -(2-karboxi-etil)-timin] fényreakciójával

Az 1. példában leírt eljárásnak megfelelően HA-Thym-l-vegyületből (DS = 0,46) filmet készítettünk, majd Xenon-lámpa segítségével ultraibolya (UVj fénnyel sugároztuk be. A timin dimerek kialakulásának folyamatát a megvilágítási idő függvényében ábrázoltuk all. ábrán.

15. példa: Kikeményített hialuronsav-filmek előállítása hialuronsav-[l -(2-karboxi-etil)-timin]észter fényreakciójával (2)

A 13. példában előállított HA-Thym-3, 4, 6, 7, 8, 9 -vegyületekből (DS = 0,125; 0,14; 0,26; 0,35; 0,37 és 2,40 a sorrendnek megfelelően) az 1. példában leírt módszerrel filmeket formáztunk, és a filmeket UVfénnyel világítottuk meg (Xenon-lámpával). Az így nyert kikeményedett hialuronsav-filmeket az előbbi sorrendben HA-Thym-3-2; 4-2; 6-2; 7-2; 8-2; 9-2ként jelöltük. Ezen filmek gélesedési mértékét és duzzadás! képességét az alábbi, 4. táblázatban foglaltuk össze.

4. táblázat

Tétel	Gélesedés mértéke (%)	Duzzadást képesség
HA-Thym-3-2	75,39	34,76
HA-Thym-4-2	74,5	45,00
HA-Thym-6-2	88,9	32,63
HA-Thym-7-2	94,0	40,17
HA-Thym-8-2	99,4	32,17
HA-Thym-9-2	98,0	0,56

16. példa:

Hialuronsav-[l-(2-karboxi-etil)-timin]-észterek szintetizálása (3)

Hialuronsav DMF-os oldatát (1,0 mM), előzetes mole30 kulaszűrőn történt szárítás után alaposan víztelenítettük 4 órás szellőztetéssel. l-(2-karboxi-etil)-timin DMF-os oldatát (a hialuronsav hidroxilcsoportjaihoz képest különböző mólarányokkal (lásd 12. ábra), 2-klór-l-metilpiridínium-jodid DMF-os oldatát (1,2 mM) és trimetil35 amin DMF-os oldatát (1,2 mM) szobahőmérsékleten 30 percig kevertük, majd ezt az oldatot cseppenként a fenti, trietil-aminnal (1,2 mM) kiegészített hialuronsavoldathoz adtuk. A kapott elegyet 90 °C-on 3, 5 vagy 8 órán keresztül kevertük. A reakcióelegyet alacsony nyomáson koncentráltuk, s a maradékhoz metanolt adtunk. A kapott csapadékot leszűrtük, metanollal mostuk, majd szárítottuk. Ezen eljárással DS-értékekben különböző hialuronsav-[l-(2-karboxi-etil)-timin] -észtereket kaptunk (HA-Thym; DS = 0,2; 0,4; 0,6; 0,7; 0,9; 1,3;

1,8; 2,2).

A 12. ábrán az l-(2-karboxi-etil)-timin mólarányai és a DS közötti összefüggésre mutatunk példát.

17. példa:

Kondroitin-szulfát-[ 1 -(2-karboxi-etil)-timin]-észterek előállítása

A 16. példában leírt eljárást követtük, azzal a különbséggel, hogy kondroitin-szulfátot (molekulatömeg: 60000) használtunk. A kondroitin-szulfát hidroxil55 csoportjaihoz l-(2-karboxi-etil)-timin mólarányt variáltuk, és az észterezést 3, 5, 9 órán keresztül végeztük. A reakcióelegyekhez - a termék kicsapása érdekében - metanolt vagy dietil-étert adtunk. Ha dietilétert használtunk, a csapadékot alaposan mostuk me60 tanollal. Ilyen módon kondroitin-szulfát-[l-(2-karboxi15

HU 215 503 Β etil)-timin] észtereket nyertünk, melyek a DS-ben különböztek (CS-Thym; DS = 0,09; 0,4; 0,8; 0,9; 1,3; 1,7; 1,8; 2,2).

A 13. ábrán az l-(2-karboxi-etil)-timin alkalmazott mólarányai és a DS közötti kapcsolatra mutatunk példát.

A DS-oldékonyság (vízben vagy DMF-ben) kapcsolatát az 5. táblázatban mutatjuk be.

5. táblázat

DS	Oldhatóság
VÍZ	DMF
0,4	oldódik	oldódik
0,9	oldódik	oldódik
1,3	részben oldódik	oldódik
1,7	nem oldódik	oldódik

18. példa: Kikeményített hialuronsav és kondroitinszulfát-filmek előállítása timinszármazék felhasználásával

Fenti fdmeket a 16. vagy 17. példában nyert GAG-ok [1 -(2-karboxi-etil)-timin]-észtereinek felhasználásával állítottuk elő

Minden hialuronsav- [ 1 -(2-karboxi-etil)-timin]-észtert (HA-Thym; DS = 0,2; 0,4; 0,6; 0,7; 0,9; 1,3; 1,8; 2,2) és kondroitin-szulfát-[l-(2-karboxi-etil)-timin]észtert (CS-Thym DS = 0,09; 0,4; 0,8; 0,9; 1,3; 1,7; 1,8; 2,2) DMF-ben oldva 5 tömeg%-os oldatokat készítettünk, s az oldatok 200 pl-ét 14 mm átmérőjű sima üveglapra helyeztük, majd 35 °C-os steril levegővel szárítottuk. A kapott filmet 400 W-os nagynyomású higanylámpával sugároztuk pyrex-vízszűrőn keresztül, s így kaptuk a keresztkötéses GAG-filmet.

A megszárított, vékony kondroitin-szulfát-[l-(2karboxi-etil)-timin]-észter (CS-Thym)-filmek (DS = 0,09; vastagság = 2-3 pm) fenti módon történő megvilágítása során a besugárzási idő és az abszorpció megváltoztatása között a 14. ábrán látható összefüggést találtuk. A besugárzási idő és a gélesedés mértéke (%) közötti összefüggést a 15. ábrán ábrázoltuk. A gyakorlati felhasználásra alkalmas vastagságú (10-12 pm) CS-Thym filmeket (DS = 0,09) szintén a leírt módon sugároztuk be; a gélesedés mértéke (%) és a besugárzási idő közötti összefüggést a 16. ábrán láthatjuk.

A megszárított hialuronsav-[l-(2-karboxi-etil)-timin]-észter (HA-Thym)-filmeket (DS = 0,9; vastagság = 10-12 pm) ugyancsak a fenti módon sugároztuk be, s a 17. ábrán bemutatott duzzadási képesség/megvilágítási idő összefüggést kaptuk. A DS-ben különböző HA-Thym filmeket megmértük duzzadóképességük tekintetében a besugárzás előtt illetve után (3 óra múlva), s az adatokat DS függvényében ábrázoltuk. A kapott görbét a 18. ábrán mutatjuk be.

Az ebben a példában előállított, DS-ben különböző HA-Thym és CS-Thym alapú, fényre keményedéit filmek érintkezésiszög- és duzzadóképesség-adatait a 6. táblázatban adjuk meg.

6. táblázat

Fényre keményedő GAG	Érintkezési szög (fok) + SD	Duzzadási képesség
HA-Thym (0,6)	-	32 + 7
HA-Thym (0,9)	-	13 + 4
HA-Thym (1,3)	-	7
HA-Thym (1,8)	54 + 3	0
CS-Thym (0,9)	-	40 + 13
CS-Thym (1,3)	-	22 + 5
CS-Thym (1,8)	-
CS-Thym (2,2)	70 + 2	3

19. példa: Endothelsejtek tapadása keresztkötéses hialuronsav-filmhez

A 18. példa szerinti timinszármazékokkal készült, DS-ben különböző, keresztkötéses hialuronsavfilmeken endothelsejteket neveltünk, s a sejthez tapadás mértékét 6 órával a sejtkultúra elkészítése után értékeltük.

Az endothelsejtek tapadását, kiteijedését (szétszóródását) és növekedését jóformán soha nem észleltük egyik keresztkötéses, DS-ben különböző hialuronsavfilm esetében sem. Másrészről normális rögzülést, kiterjedést (szétszóródást), növekedést tapasztaltunk a kontroll TCPS üregeiben.

20. példa:

Kondroitin-szulfát-(7-kumaril-oxi-ecetsav)-észter szintetizálása

A kondroitin-szulfát tri(n-butil)-amin sójának DMF-os oldatát (10,25 mg/ml) előzetesen molekulaszűrőn szárítottuk, s az oldat 70 ml-ét vákuumban szárítottuk, keverés közben, háromnyakú lombikban, szobahőmérsékleten. Miután a levegőt nitrogéngázzal helyettesítettük, az elegyhez 15 ml desztillált piridint adtunk. Ehhez egy mól egyenérték - a kondroitin-szulfát hidroxilcsoportjaira vonatkoztatva - 7-kumaril-oxi-acetilklorid (a kumarin sav-klorid formája) DMF-os oldatát adtuk (1,19 g 5 ml DMF-ben). A reakcióelegyet 80 °C-on 3 órán keresztül refluxáltuk nitrogénatmoszférában. Ezután az elegyet besűrítettük, s cseppenként dietil-étert adtunk hozzá. A kapott csapadékot kiválasztottuk (ülepítettük), ioncserélt vízben oldottuk, és áramló vízben 3 napig dializáltuk. A dializátumot liofílizáltuk, hogy a kondroitin-szulfát-(7kumaril-oxi-ecetsav)-észtert fehér, szilárd formában kapjuk.

Hozam: 965,1 mg

DS 0,021

Duzzadóképesség: 2,8 g H₂O/g száraz gél •H-NMR-spektrum: lásd 19. ábra

A fenti eljárást megismételtük azzal a különbséggel, hogy a kumarin sav-klorid formája és a kondroitin-szulfát hidroxilcsoportjainak mólarányát variáltuk, és a DS-t a mólarány függvényében ábrázoltuk. Az eredmény a 20. ábrán látható.

HU 215 503 Β

21. példa: Fényre keményedéit kondroitin-szulfátfilm előállítása kondroitin-szulfát-(7-kumaril-oxiecet-sav)-észterből

A 20. példában szintetizált kondroitin-szulfát-(7kumaril-oxi-ecetsav)-észtert az 1. példának megfelelően száraz filmmé alakítottuk, a filmet UV-fénnyel (320 nm) sugároztuk, s így fényre keményedett kondroitin-szulfátfílmet kaptunk.

A besugárzási idő és a kumarin abszorpciós spektrumának változásai közötti összefüggést a 21. ábrán láthatjuk. A kapott film duzzadóképességét (g H₂O/g száraz gél) meghatároztuk, és ábrázoltuk a besugárzási idő és a DS függvényében. Az eredmények a 22. illetve a 23. ábrán láthatók. A gélesedés mértékét (%) is meghatároztuk, s ábrázoltuk a besugárzási idő illetve a kondroitin-szulfát-(7-kumaril-oxi-ecetsav)-észter koncentrációjának függvényében. Az eredmények a 24. illetve 25. ábrán láthatók.

22. példa: Keresztkötéses hialuronsav/kondroitinszulfát-filmek

Az 1. példában kapott HA-Cin-3-vegyületet (DS = 0,5) DM 20 tömeg%-os vizes oldatában oldottuk (m/m% = 5). Ezután CS-Cin-4 (DS = 1,37)-vegyületet szintén 5 tömeg%-os koncentrációban oldottuk a fenti elegyben, miáltal hialuronsav-fahéjsavészter és kondroitin-szulfát-fahéjsavészter kevert oldatához jutottunk. Ezen oldat felhasználásával - a film kialakítását és a besugárzást az 1. példában leírt eljárás szerint végezve - keresztkötéses hialuronsav/kondroitin-szulfát-filmet állítottunk elő.

Hasonlóan, HA-Cin-3- és CS-Cin-4- vegyületeket 2:1 vagy 1:2 tömegarányban tartalmazó kevert oldatokat készítettünk, s meghatároztuk mindegyik készítmény „nem tapadó” (nonadhezív) tulajdonságát (melyet a későbbiekben részletezünk).

23. példa: Heparin-fahéjsavészter szintézise és keresztkötéses heparinfilm előállítása (1) Heparin-fahéjsavészter előállítása

Heparin tri(n-butil)-amin-sójának dimetil-formamidos (DMF) oldatához (500 mg/125 ml) 20 ml piridint adtunk, s az elegyet alacsony nyomáson víztelenítettük. Ezután szobahőmérsékleten, erőteljes keverés mellett 69,35 mg cinnamoil-kloridot adagoltunk. A reakciót 75 °C-on 2 órán keresztül végeztük, majd a reakcióelegyet 40 °C-on, alacsony nyomáson 30 ml-re koncentráltuk. A maradékhoz étert adtunk, majd alacsony nyomáson szárítottuk. A csapadékot 5 ml DMF-ban feloldottuk, és további 40 ml PBS hozzáadásával jól elkevertük. Az oldatot dializáló membránon keresztül dializáltuk, hogy tökéletesen eltávolítsuk a kismolekulájú vegyületeket, majd a liofilizálás után a kívánt észter 440 mg-ját kaptuk.

Tétel: Hep-Cin-1

A kötött fahéjsav mennyiségét /H-NMR-spektrummal meghatározva), a DS-t és az oldékonyságot a 7, táblázatban mutatjuk be.

7. táblázat

Tétel	Kötött fahéjsav (tömeg%)	DS	Oldhatóság
DMF	VÍZ
Hep-Cin-1	12,4	0,5	o	Δ
Hep-Cin-2	21,7	1,1	o	*
Hep-Cin-3	31,7	1,8	o	*
Hep-Cin-4	40,2	2,5	o	*

°: jól oldódó

Δ: nem jól oldódó, de gélszerű *: nem oldódó (2) Keresztkötéses heparinfilm előállítása

DMF-ben 30 mg Hep-Cin- 1-vegyületet oldottunk, és az oldatot 24x24 mm-es üveglapra helyeztük, majd 40 °C-on steril levegővel szárítottuk. A kapott filmet 450 W-os higanylámpával világítottuk meg (pyrex borítású vízszűrőn keresztül), s így keresztkötéses heparinfilmet állítottunk elő.

Tétel: Hep-Cin-1-2

Az érintkezési szöget (előrehajló, hátrahajló) és a duzzadási képességet a 8. táblázatban adtuk meg.

8. táblázat

Tétel	Érintkezési szög (°)	Duzzadási képesség
előrehajló szög	hátrahajló szög
Hep-Cin-1-2	89,3	54,8	0,13
Hep-Cin-2-2	76,2	41,5	0,02
Hep-Cin-3-2	90,3	56,5	0,05

HU 215 503 Β (3) A fenti anyagokat és eljárást alkalmazva, az észtereket (Hep-Cin-2; Hep-Cin-3; Hep-Cin-4) úgy állítottuk elő, hogy a heparin/cinnamoil-klorid-arányt variáltuk (a heparin mennyisége mindig 500 mg volt). Az analízis eredményeit szintén a 7. táblázatban adtuk meg. Ezekből keresztkötéses heparinfilmeket (Hep-Cin-2-2; Hep-Cin-3-2) is a leírt eljárás szerint készítettünk, ezen filmek fizikai jellemzőit a 8. táblázatban közöltük.

24. példa

Hialuronsav tri(n-butil-amin)-sójának (1,5 g felel meg az -OH csoportok 10 mmóljához) víztelen DMF-es oldatát (200 ml) argon alatt tartottuk és 0 °C-ra hűtöttük. 4-(dimetil-amino)-piridint (0,305 g; 2,5 mmol), fahéjsavanhidridet (2,78 g; 10 mmol), tri(n-butil)-amint (4,76 ml; 10 mmol) adtunk az oldathoz egymás után, s a reakciót 24 óráig végeztük, szobahőmérsékleten. 0 °C-ra történő hűtés után nátrium-hidrokarbonát 5 tömeg%-os vizes oldatát (100 ml) fokozatosan adtuk a reakcióelegyhez, és az oldatot szobahőmérsékleten 48 óra hosszat kevertük. A felesleges nátrium-hidrokarbonátot úgy távolítottük el, hogy folyamatosan 1M HCl-oldatot adagoltunk pH = 4 eléréséig és 1M NaOH-ot 7-es pH eléréséig. Ezután keverés közben hideg etanolt adtunk. Ülepítés után a csapadékot feloldottuk vízben, és a kicsapási eljárást megismételtük etanollal. A csapadékot lecentrifugáltuk, feloldottuk vízben, és DOWEX 50 (H®) kationcserélő gyantaoszlopon engedtük át (4 °C-on).

A savat 1M NaOH-dal semlegesítettük, majd liofilizáltuk.

25. példa: A fényre keményedő hialuronsav-fdmek „nem tapadó” tulajdonsága

Az 1. példában szereplő HA-Cin-3-2-vegyület előállítási módjának megfelelően készített, fényre keményedéit hialuronsav-fahéjsavészter-filmet (DS = 0,5; vastagság : 30 pm; 20 x 20 mm felület) használtuk nem tapadó (nonadhezív) anyagként, és a következő kísérletet végeztük.

Elaltatott patkány hasát felnyitottuk, a hashártyát mechanikusan megsebeztük, hogy szabad izomréteghez jussunk. Ezt a helyet a fenti, nem tapadó anyaggal befedtük. Az implantátumot 1 és 2 hét múlva távolítottuk el, és a filmhez való szövettapadás mértékét (hematoxilin-eozin festés után) fénymikroszkóppal illetve elektronmikroszkóppal vizsgáltuk. Kontrollként olyan patkányt használtunk, amelynél a sebzett helyet nem fedtük be.

A kísérletben, a találmány nem tapadó anyagait használva, fibrinkicsapódást illetve sejttapadást, 1 illetve 2 hét múltán (az összes minta esetében) alig tapasztaltunk. A két hét múltán tapasztaltak egyértelműen bebizonyítják, hogy a film biológiai lebontása ekkorra megkezdődött.

Másrészről a kontroli-kísérletben, a sebzés után fibrinkicsapódást, gyulladt sejtek, fibroblasztok terjedését tapasztaltuk, és egy hét múltán a kollagén készítmények, illetve a bélcsatoma közvetlenül hozzátapadt a sebzett felszínhez.

A fenti kísérletet megismételtük úgy, hogy a 22. példában előállított HA—Cin-3/CS-Cin-4-filmet használtuk. A fenti homogén HA-Cin-3-filmhez (HA-Cin-3-2) képest a biodegradabilitás (biológiai lebonthatóság) fokozott volt, így a film biológiai lebontása (mely a sejtek filmbe történő inváziójával történt) az implantáció után egy héten belül megkezdődött, és a lebomlás előrehaladása 2 hét múltán nyilvánvaló volt.

26. példa: A fényre keményedett kondroitin-szulfátfilm nem tapadó hatása

A 7. példában előállított kondroitin-szulfát-fahéj savésztert (CS-Cin-3; DS = 0,65) foszfátpufferben oldottuk (20 tömeg%-os töménységig), s a nem tapadó anyag oldatát kaptuk.

A 25. példának megfelelően szervsebzést végeztünk a kísérleti állaton, és a sebzett felszínt a fenti nem tapadó anyaggal vontuk be. Ezután az anyagot 15 percig UV-fénnyel sugároztuk, ezáltal in vitro gélesítettük. Szövettani vizsgálatok kimutatták, hogy a gélréteg a hasi peritoneális szövetfelszínnel közvetlenül kapcsolódva alakult ki. A 25. példában leírt módon végzett ellenőrző vizsgálatok - hasonlóan a 25. példában tapasztaltakhoz - semmilyen adhéziót nem mutattak ki.

példa: A fényre keményedett (keresztkötéses) hialuronsav-film és a fényre keményedett (keresztkötéses) kondroitin-szulfát-film nonadhezív hatása

Nonadhezív hatóanyagként az 1. és 2. példa szerint előállított fényre keményedett hialuronsav-fahéjsavészter (HA-Cin)-filmeket (DS = 0,1; 0,5), és a 18. példa szerint előállított fényre keményedett hialuronsav-(timin-származék)-észter (HA-Thym; DS = 0,2; 0,6; 0,9; 1,8) filmeket illetve fényre keményedett kondroitinszulfát-timin-származék-észter (CS-Thym; DS = 0,4; 0,9) filmeket használtunk, s a következő kísérleteket végeztük. Minden fényre keményedett filmet (14 mm átmérő; 15-20 pm vastagság) 70 tömeg%-os etanolba merítve 30 percig sterilizáltuk, majd 1 óra hosszat steril vízben áztattuk. Az alacsony DS-értékű mintákat a vízben történt áztatás után megszárítottuk, hogy eltávolítsuk az etanolt, s mielőtt állatkísérlethez használtuk volna, 10 percig steril vízben áztattuk. A vizet adszorbeáló film hidrogéllé duzzadt.

Wistar albínó patkányt (hím, 300 g) éterrel elaltattunk, s ezt az operáció során éter-oxigén keverékkel tartottuk fent. Minden mintához egy patkányt használtunk. A patkány hasának középvonalán hosszanti metszést végeztünk, hogy feltárjuk a májat. A feltárt máj felszínét mechanikusan megsebeztük, s így 1 cm²-es peritoneális sebhelyet okoztunk. Ezt a fenti, duzzadt, fényre keményedett filmmel fedtük be. Azon filmeket, amelyeket nem tudtunk biztonságosan rögzíteni a sebhelyen, a film 4 sarkára poliuretán ragasztót helyezve rögzítettük. A hasfalat nylonszállal varrtuk össze. Az implantáció után 1 és 2 héttel a patkányt megöltük s a varratot felnyitottuk. A májat fedő film makroszkopikusan eltűnt, s a fedett részt a környező szövetekkel együtt kivágva fénymikroszkópos szövettani vizsgálatnak vetettük alá. Az eredmények a 9. táblázatban találhatók.

HU 215 503 Β

9. táblázat

Keresztkötéses film	DS	Implantáció után eltelt idő	Ragasztó	Makroszkopikus Mikroszkopikus
megfigyelés
Össze- tapadás	biodegra- dabilitás	filmsza- kadás
HA-Cin	0,1	1 hét	-	-	+	-
HA-Cin	0,5	1 hét	+	-	-	+
HA-Thym	0,2	1 hét	-	-	+	-
HA-Thym	0,6	1 hét	-	-	+	-
HA-Thym	0,6	2 hét	-	-
HA-Thym	0,9	1 hét	-	-	+	-
HA-Thym	0,9	2 hét	-	-	+	-
HA-Thym	1,8	1 hét	+	-
CS-Thym	0,4	1 hét	-	-	+	-
CS-Thym	0,9	1 hét	-	-	+	-

-: nem használtunk (ragasztó), illetve nem tapasztalható +: használtunk, illetve tapasztalható + +: kiváló

Pl. a fényre keményedett Ha-Cin (DS = 0,l)-film esetén az implantáció után 1 héttel végzett szövettani vizsgálat a film felszínén semmilyen sejttapadást nem mutatott ki, a film biodegradációja (lebontása) megkezdődött, s a szövet elburjánzását (gyógyulását) tapasztaltuk. A fényre keményedett HA-Thym (DS = 0,2) film esetén lapos sejteket (mint a peritoneális sejtek) figyeltünk meg a legfelső rétegben s azt tapasztaltuk, hogy egy kis, középső rész kivételével a biodegradáció előrehaladott volt.

Fedetlen sebet használtunk kontrollnak, s egyszeri vizsgálatot végeztünk 1 hét múltán. A sebzett májfelszín és a hasfal között olyan összetapadást tapasztaltunk, amelyet vágás nélküli operációval (szike fokával vagy kézzel) nem lehetett megszüntetni.

28. példa: Kontrollált drogkibocsátás, hordozóként fényre keményedett hialuronsav és fényre keményedett kondroitin-szulfát-filmek felhasználásával (1) Az indometacin kontrollált kibocsátása

A 16. példában előállított különböző DS-értékű HA-Thym vegyületeket 5 tömeg%-os koncentráció eléréséig DMF-ben oldottuk, s ezen oldat 200 pl-ében 1 pg indometacint oldottunk. A kapott oldatot 15 ml átmérőjű sima üveglapra helyeztük, 35 °C-on steril levegővel szárítottuk. Az így kapott filmet a 18. példának megfelelően besugároztuk, s indometacin tartalmú keresztkötéses hialuronsav-filmhez jutottunk. A gyógyszertartalom 10 tömeg% volt. Hasonló módon, keresztkötéses hialuronsav-filmeket állítottunk elő 30, 50 és tömeg%-os gyógyszertartalommal. A különböző DS-értékű CS-Thym vegyületeket (melyeket a 17. példában állítottunk elő) felhasználva - szintén a fenti eljárással - 10, 30, 50%-os gyógyszertartalmú keresztkötéses kondroitin-szulfát-filmeket készítettünk.

A gyógyszerkibocsátást ellenőrző teszteket - minden kapott filmre — a következőképpen végeztük. A filmet 20 °C-os vízben vagy 37 °C-os foszfátpuffer sóoldatban áztattuk keverés közben. A folyadékfázisból meghatározott időnként mintát vettünk, és 269 nm-en mértük az UV abszorpciós spektrumát.

A 10. táblázat a 30 tömeg%-os gyógyszertartalmú, fényre keményedett hialuronsav-filmek (DS = 0,7; 1,3; 1,8) vizes oldat-tesztjének eredményeit és a DS illetve a duzzadási képesség közötti kapcsolatot mutatja be. Az oldástesztet illetőleg a film gyógyszertartalma 20%ának kibocsátásához szükséges időt tüntettük fel.

10. táblázat

DS	Duzzadási képesség	20%-os kibocsátási idő perc
0,7	8	25
1,3	5	120
1,8	0,2	360

A 10. táblázatból világosan látható az a tendencia, hogy minél nagyobb a DS (ezáltal nagyobb a keresztkötöttség mértéke, így keményebb a film), annál kisebb a duzzadási képesség illetve a gyógyszerkibocsátás aránya. Az eredmény azt sugallja, hogy a vízabszorbeáló képesség a gyógyszerkibocsátás-arány szempontjából fontos tényező. Az 1,3 és 1,8 DS-értékű filmeket tekintve, a gyógyszerkibocsátás aránya növekvő gyógyszer60 tartalom mellett csökkent.

HU 215 503 Β

A fényre keményedéit hialuronsav-filmeket (DS = 0,7; 2,2) és a fényre keményedett kondroitin-szulfát-filmeket (DS = 0,8; 1,3; 1,8) a PBS-ben megfigyelt gyógyszerkibocsátásuk alapján hasonlítottuk össze. Valamennyi film 10 és 50%-os gyógyszertartalmú formáját használtuk. Az eredmények a 26-30. ábrákon láthatók. Ezekből a grafikonokból jól látható, hogy a gyógyszerek kontrollált kibocsátása olyan filmekkel valósítható meg, melyek DS-értéke nem kisebb, mint egy meghatározott alsó küszöbérték (CS-Thym vegyületre ezDS = 1,3).

(2) Heparin kontrollált kibocsátása

DMF 20 tömeg%-os vizes oldatában a következő vegyületeket oldottuk: a 7. példában nyert kondroitin-szulfát-fahéjsavésztert (CS-Cin-4, DS = 1,37; CS-Cin-5, DS = 2,43) 20 tömeg%-os koncentrációban; az 1. és 2. példában nyert hialuronsav-fahéjsav-észtert (HA-Cin-3, DS = 0,50; HA-Cin-5, DS = 1,28; HA-Cin-6, DS = 2,43) 10 tömeg%-os koncentrációban. Ezen oldatok mindegyikének 10 ml-éhez 100 mg heparint adtunk, az oldatokat 10 cm χ 10 cm-es üveglapokra vittük, s egy órán át szobahőmérsékleten szárítottuk. A képződött filmeket 30 percig 450 W-os nagynyomású higanylámpával világítottuk meg. A kapott filmek vastagsága 100 pm körül volt.

Valamennyi filmet az üveglapról levéve 100 ml vizet tartalmazó lombikba merítettük, és 60-as másodpercenkénti fordulattal kevertük. Az időegység alatt kibocsátott heparin mennyiségét a karbazol-kénsav módszerrel határoztuk meg. Az eredmények azt mutatják, hogy az összes film alkalmas volt a heparin kontrollált kibocsátására.

Olyan kísérleteket is végeztünk, melyekben a fenti kontrollált heparinkibocsátó filmeket egy kémcső belső falán alakítottuk ki, majd - a JP-A-4-31432 japán közrebocsátási iratnak megfelelően - citráttal kezelt vért adtunk hozzájuk, s meghatároztuk az alvadási időt. Mindegyik minta antitrombotikus aktivitást mutatott.

(3) Növekedésihormon-faktor kontrollált kibocsátása

DMF 20 tömeg%-os vizes oldatában hialuronsavfahéjsavésztert (HA-Cin-3; DS = 0,50) 10 tömegszázalékban, és 1 mg növekedésihormon-faktort (GRF, humán; molekulatömeg: 5039,8) kevertünk a fenti oldat 1 ml-éhez. Ezzel az eleggyel 3 cm χ 3 cm-es üveglapot vontunk be, s egy órán át szobahőmérsékleten szárítottuk. A kapott filmet 30 percig 450 W-os higanylámpával világítottuk meg. A film vastagsága 110 pm volt.

A filmet az üveglapról levéve 10 ml vizet tartalmazó lombikba merítettük, s 60-as percenkénti fordulattal kevertük. Az időegység alatt kibocsátott GRF mennyiségét nagy érzékenységű folyadékkromatográfiás módszerrel határoztuk meg, és kiszámítottuk az összes kibocsátott GRF mennyiséget. Azt találtuk, hogy a GRF kontrollált kibocsátása sikeresen hajtható végre.

29. példa: Érrendszer protézis Kis átmérőjű (3 mm belső átmérő), mesterséges vérér belső felszínét az 1. példában nyert HA-Cin3 oldatával vontuk be (rotációs technikával), majd szárítás után kis átmérőjű optikai szál segítségével UV-fénnyel sugároztuk be, s így szilárd hialuronsavval belsőleg bevont érprotézist kaptunk.

A találmány messzemenően biztonságos és biokompatíbilis kiindulási anyagok (a részletesen leírt fényreaktív vegyületek és a glükóz-amino-glükánok) megfelelő kiválsztásával és ezek egymáshoz kapcsolásával könnyen tisztítható, fényre keményedő GAG-okat bocsát rendelkezésre.

A találmány továbbá olyan gyógyászati anyagokat biztosít, melyek a fényre keményedő GAG-ok fénnyel történő besugárzásával állíthatók elő. Ezen anyagok két- vagy háromdimenziós hálózatstruktúrával rendelkeznek, s messzemenően biztonságosak, biokompatíbilisek, biológiailag lebonthatók, felszívhatok. A GAG molekulatömegének, a fényreaktív vegyület DS-értékének és más faktorok alkalmas megválasztásával a találmány alapján olyan GAG-alapú anyagok állíthatók elő, melyek gyógyászati felhasználáshoz megkövetelt fizikai tulajdonságokkal rendelkeznek. A találmány nagyon széles körben alkalmazható a gyógyászat különböző területein.

Claims (15)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás egy fényre keményedő glükóz-aminoglükán-származék előállítására, azzal jellemezve, hogy legalább egy glükóz-amino-glükán hidroxil- vagy karboxilcsoportjait - amilyen a kolominsav, hialuronsav, kondroitin, kondroitin-szulfát, teikuronsav, dermatán-szulfát, heparin, heparán-szulfát, keratoszulfát, keratopoliszulfát és ezek származékai - észterezési reakciónak vetjük alá egy fényreaktív vegyülettel, amely egy, fotoreakcióban ciklobutángyűrű képzésére képes fényreaktív csoportot - legalább egy szén-szén kettős kötéssel - tartalmaz. (Elsőbbsége: 1992. 02. 05.)
2. 2. Eljárás egy fényre keményedő glükóz-aminoglükán-származék előállítására, azzal jellemezve, hogy legalább egy glükóz-amino-glükán karboxilcsoportjait - amilyen a kolominsav, hialuronsav, kondroitin, kondroitin-szulfát, teikuronsav, dermatán-szulfát, heparin, heparán-szulfát, keratoszulfát, keratopoliszulfát és ezek származékai - aktiváljuk és a kapott aktív karboxilcsoportokat amidálási reakciónak vetjük alá egy fényreaktív vegyülettel, amely egy, fotoreakcióban ciklobutángyűrű képzésére képes fényreaktív csoportot legalább egy szén-szén kettős kötéssel - tartalmaz. (Elsőbbsége: 1992.02.05.)
3. 3. Eljárás egy fényre keményedő glükóz-aminoglükán-származék előállítására, azzal jellemezve, hogy legalább egy glükóz-amino-glükán karboxilcsoportjait amilyen a kolominsav, hialuronsav, kondroitin, kondroitin-szulfát, teikuronsav, dermatán-szulfát, heparin, heparán-szulfát, keratoszulfát, keratopoliszulfát és ezek származékai - kondenzálószer jelenlétében amidálási reakciónak vetjük alá egy fényreaktív vegyülettel, amely egy, fotoreakcióban ciklobutángyűrű képzésére képes fényreaktív csoportot - legalább egy szén-szén kettős kötéssel - tartalmaz. (Elsőbbsége: 1992. 02.05.)

   HU 215 503 Β
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás fényre keményedő glükóz-amino-glükán-származék előállítására, azzal jellemezve, hogy fényreaktív vegyületként legalább egy - adott esetben helyettesített fahéj savat vagy reakcióképes származékát, 1-helyzetben karboxi-alkil-csoporttal helyettesített uracilszármazékot vagy reakcióképes származékát és/vagy 7-helyzetben karboxi-alkil-csoporttal helyettesített kumarinszármazékot vagy reakcióképes származékát alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1992. 02. 05.)
5. 5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás fényre keményedő glükóz-amino-glükán-származék előállítására, azzal jellemezve, hogy fényreaktív vegyületként egy, a (11) képletcsoport egy tagját mint fotoreaktív csoportot tartalmazó vegyületet alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1992.02.05.)
6. 6. Eljárás fényre keményített keresztkötéses glükóz-amino-glükán előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-3. igénypontok bármelyike szerint előállított fényre keményedő glükóz-amino-glükán-származékot fénnyel sugározzuk be és így a fényreaktív vegyületben intermolekuláris és/vagy intramolekuláris keresztkötéseket hozunk létre. (Elsőbbsége: 1992. 02. 05.)
7. 7. Eljárás fényre keményített keresztkötéses glükózamino-glükán előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-3. igénypontok bármelyike szerint előállított fényreaktív glükóz-amino-glükán-származékot oldószerben oldjuk és a kapott oldatot fénnyel sugározzuk be, így a fényreaktív vegyületben intermolekuláris és/vagy intramolekuláris keresztkötéseket hozunk létre. (Elsőbbsége: 1992.02.05.)
8. 8. Eljárás fényre keményített keresztkötéses glükózamino-glükán előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-3. igénypontok bármelyike szerint előállított fényreaktív glükóz-amino-glükán-származékot oldószerben oldjuk, az oldószert eltávolítjuk és a származékból formázható gélt képezünk, majd a formázható gél alakú származékot fénnyel sugározzuk be és így a fényreaktív vegyületben intermolekuláris és/vagy intramolekuláris keresztkötéseket hozunk létre. (Elsőbbsége: 1992.02.05.)
9. 9. Eljárás sejt és/vagy szövet adhéziójának megelőzésére, azzal jellemezve, hogy az 1 -3. igénypontok bármelyike szerint előállított fényre keményedő glükózamino-glükán-származékot a sérülés helyére visszük fel. (Elsőbbsége: 1992.07.08.)
10. 10. Eljárás sejt és/vagy szövet adhéziójának megelőzésére, azzal jellemezve, hogy az 1-3. igénypontok bármelyike szerint előállított fényre keményedő glükóz-amino-glükán-származékot a sérülés helyére visszük fel és fénnyel sugározzuk be, ily módon a fényre keményített glükóz-amino-glükánból filmet képzünk. (Elsőbbsége: 1992.07.08)
11. 11. Eljárás sejt és/vagy szövet adhéziójának megelőzésére, azzal jellemezve, hogy a 6-8. igénypontok bármelyike szerint előállított fényre keményített glükóz-amino-glükánt a sérülés helyére visszük fel. (Elsőbbsége: 1992.07.08.)
12. 12. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására sejt és/vagy szövet adhéziójának megelőzésére, azzal jellemezve, hogy hogy az 1-3. igénypontok bármelyike szerint előállított fényre keményedő glükóz-amino-glükánszármazékhoz oldószerként gyógyászatilag elfogadható minőségű vizet, pufferoldatot vagy szerves oldószert adunk. (Elsőbbsége: 1992.07.08.)
13. 13. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására sejt és/vagy szövet adhéziójának megelőzésére, azzal jellemezve, hogy a 6-8. igénypontok bármelyike szerint előállított fényre keményített, keresztkötéses glükózamino-glükánhoz oldószerként gyógyászatilag elfogadható minőségű vizet, pufferoldatot vagy szerves oldószert adunk. (Elsőbbsége: 1992. 07. 08.)
14. 14. Eljárás szabályozott hatóanyag-leadású gyógyszerkészítmény előállítására sejt és/vagy szövet adhéziójának megelőzésére, azzal jellemezve, hogy a 6-8. igénypontok bármelyike szerint előállított fényre keményített keresztkötéses glükóz-amino-glükánhoz egy gyógyszert adagolunk. (Elsőbbsége: 1992. 12. 21.)
15. 15. Eljárás mesterséges szerv előállítására, azzal jellemezve, hogy a 6-8. igénypontok bármelyike szerint előállított fényre keményített keresztkötéses glükózamino-glükánból egy réteget képezünk egy mesterséges szerv felületén. (Elsőbbsége: 1992. 12. 21.)