DE102021212812A1

DE102021212812A1 - Entzündungshemmendes viskosupplementierendes Mittel enthaltend Hyaluronsäure

Info

Publication number: DE102021212812A1
Application number: DE102021212812.2A
Authority: DE
Inventors: Carsten Werner; Uwe Freudenberg; Lucas Schirmer; Beatrix Bauerfeind-Johnson; Jürgen Dietrich
Original assignee: Bauerfeind AG
Current assignee: Bauerfeind AG
Priority date: 2021-11-15
Filing date: 2021-11-15
Publication date: 2023-05-17
Also published as: CA3237552A1; WO2023084110A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft therapeutische Zusammensetzungen enthaltend Hydrogelpartikel, mindestens eine Hyaluronsäure-Komponente und mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Träger sowie Verfahren zur Herstellung von therapeutischen Zusammensetzungen und deren Verwendung zur Behandlung von Arthritis.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft therapeutische Zusammensetzungen enthaltend Hydrogelpartikel, mindestens eine Hyaluronsäure-Komponente und mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Träger sowie Verfahren zur Herstellung von therapeutischen Zusammensetzungen und deren Verwendung zur Behandlung von Arthritis.
Die häufigsten Erscheinungsformen der Arthritis sind Osteoarthritis und rheumatoide Arthritis. Osteoarthritis (auch als Arthrose bezeichnet) ist eine chronisch-degenerative Gelenkveränderungen mit Knorpelabbau, die mit Schmerzen und Funktionseinschränkungen einhergeht. Die im Gelenkspalt vorhandene Synovialflüssigkeit schützt den Gelenkknorpel vor mechanischer Beanspruchung. Veränderung oder Verlust der Synovialflüssigkeit kann zu Knorpelschädigung im Gelenk und Osteoarthritis (OA) führen. OA kann den Abbau der Gelenkoberfläche und der Synovialfüssigkeit verstärken (Berenbaum, Osteoarthritis and Cartilage, (2013), doi:10.1016/j.joca.2012.11.012). Die entzündlich verlaufende Gelenkserkrankung Rheumatoide Arthritis (chronische Polyarthritis, primär chronische Polyarthritis, RA) ist dagegen eine chronische Autoimmunerkrankung. Behandlungsoptionen sind derzeit die Injektion von Hyaluronsäure-Präparaten als Viskosupplementations-Therapie zur Verbesserung der mechanischen Eigenschaften der Synovialflüssigkeit und die systemische Verabreichung von nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAR) oder Cortisol. Die Injektion von Hyaluronsäure-Präparaten kann zur temporären Verbesserung der Beweglichkeit und Verminderung von Schmerzen führen, die Entzündung wird aber nicht kausativ behandelt. Anti-entzündliche Medikamente behandeln die Entzündung, verursachen aber Nebenwirkungen. Entzündungsprozesse im Gelenk sind mit der Infiltration von Immunzellen verbunden, die durch Chemokine wie IL-8 (CXCL8) und RANTES (CLL5) in der Synovialflüssigkeit stimuliert werden (Vergunst et al., (2005) Scandinavian Journal of Rheumatology, doi:10.1080/03009740500439159, Valcamonica et al., Clin. Exp., Rheumatol. (2014), Goldring & Berenbaum, Curr. Opin. Pharmacol. 22, 51-63 (2015), Pierzchala et al., Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). (2011) doi:10.1007/s00005-011-0115-4).
Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem ist es, die Nachteile bekannter Verfahren zur Therapie von Arthritis, insbesondere OA und RA, und von in diesen eingesetzten therapeutischen Zusammensetzungen zu überwinden. Insbesondere ist es das technische Problem der vorliegenden Erfindung, eine therapeutische Zusammensetzung bereitzustellen, welche zu einer verbesserten Behandlung von Arthritis führt, insbesondere symptomatisch und kausativ Arthritis zu therapieren vermag.
Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem insbesondere durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche sowie die Lehren der abhängigen Ansprüche und der vorliegenden Beschreibung.
Die Erfindung betrifft eine therapeutische Zusammensetzung enthaltend Hydrogelpartikel, mindestens eine Hyaluronsäure-Komponente und mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, insbesondere eine wässrige Flüssigkeit, wobei die Hydrogelpartikel mindestens eine polyionische Polymer-Komponente aufweisen, die mit mindestens einer ungeladenen Polymer-Komponente oder einer nicht-polymeren Vernetzer-Komponente kovalent unter Ausbildung eines Netzwerks verbunden ist, und wobei die mindestens eine polyionische Polymer-Komponente Sulfat- oder Sulfonatgruppen aufweist. Diese Sulfat- oder Sulfonatgruppen liegen im Hydrogel, insbesondere den Hydrogelpartikeln, als freie, also ungebundene Gruppen vor.
Die Erfindung betrifft daher eine, insbesondere entzündungshemmende, Zusammensetzung, insbesondere zur Verwendung als Biolubricant, das heißt als Schmiermittel für biologische Gewebe, insbesondere in vivo, welches mindestens drei Komponenten umfasst. Diese drei Komponenten sind mindestens eine, insbesondere eine, Hyaluronsäure-Komponente, Hydrogelpartikel sowie mindestens ein pharmazeutisch akzeptabler Träger. Die erfindungsgemäßen Hydrogelpartikel umfassen mindestens zwei Komponenten, nämlich mindestens eine, insbesondere eine, polyionische Polymer-Komponente, insbesondere eine polyanionische Polymer-Komponente, insbesondere Glykosaminoglykan (GAG)-Komponente und mindestens eine nicht-polymere Vernetzer-Komponente oder, optional und, mindestens eine, insbesondere eine, ungeladene Polymer-Komponente, insbesondere eine Polyethylenglykol (PEG)-Komponente.
Erfindungsgemäß ist in einer Ausführungsform die mindestens eine ungeladene Polymer-Komponente mit der mindestens einen polyionischen Polymer-Komponente kovalent verbunden, insbesondere unmittelbar oder mittels einer Vernetzer-Komponente. Die ungeladene Polymer-Komponente und die mit ihr kovalent verbundene polyionische Polymer-Komponente bilden somit zusammen, optional unter zusätzlicher Anwesenheit der nicht-polymeren Vernetzer-Komponente, unter Ausbildung eines Netzwerks die Hydrogelpartikel aus.
Erfindungsgemäß ist in einer weiteren Ausführungsform die mindestens eine nicht-polymere Vernetzer-Komponente mit der mindestens einen polyionischen Polymer-Komponente kovalent verbunden, insbesondere unmittelbar. Die mindestens eine nicht-polymere Vernetzer-Komponente und die mit ihr kovalent verbundene polyionische Polymer-Komponente bilden somit zusammen unter Ausbildung eines Netzwerks die Hydrogelpartikel aus.
Die Erfindung sieht daher insbesondere vor, dass die mindestens eine polyionische Polymer-Komponente unmittelbar kovalent oder über mindestens eine Vernetzer-Komponente mit der mindestens einen ungeladenen Polymerkomponente unter Ausbildung eines Netzwerks verbunden ist oder, in einer weiteren Ausführungsform, dass die mindestens eine polyionische Polymer-Komponente mit der mindestens einen Vernetzer-Komponente unter Ausbildung eines Netzwerks verbunden ist.
Die polyionische Polymer-Komponente weist erfindungsgemäß Sulfat- oder Sulfonatgruppen, insbesondere Sulfatgruppen, auf. Diese Sulfat- oder Sulfonatgruppen sind erfindungsgemäß nicht mit der ungeladenen Polymer-Komponente, insbesondere nicht mit der Polyethylenglykol-Komponente, oder der Hyaluronsäure-Komponente kovalent verbunden. Diese Sulfat- oder Sulfonatgruppen sind erfindungsgemäß nicht mit der nicht-polymeren Vernetzer-Komponente kovalent verbunden.
Ohne an die Theorie gebunden zu sein, liegen die Sulfat- oder Sulfonatgruppen im Hydrogel im Wesentlichen in deprotonierter Form vor. Diese deprotonierten Sulfat- oder Sulfonatgruppen können durch Gegenionen und/oder Proteine Ladungskompensationen erfahren oder Ladungswechselwirkungen ausbilden. Sulfat- oder Sulfonatgruppen können daher über nichtkovalente Wechselwirkungen, insbesondere Ladungswechselwirkungen, reversible Bindungen zu löslichen Molekülen ausbilden, insbesondere sobald sie in Kontakt mit Biofluiden stehen, die bevorzugt lösliche Moleküle aufweisen.
Das für die Herstellung der Hydrogelpartikel eingesetzte polyionische Polymer verfügt zusätzlich zu den Sulfat- oder Sulfonatgruppen bevorzugt über mindestens zwei weitere funktionelle Gruppen, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Thiolgruppe, Maleimidgruppe, Vinylsulfongruppe, Acrylatgruppe, Carboxylgruppe und Kombinationen davon, mit welchen das polyionische Polymer mit dem für die Herstellung der Hydrogelpartikel eingesetzten ungeladenen Polymer und/oder der nicht-polymeren Vernetzer-Komponente kovalent verbunden wird, so dass sich ein Hydrogel ausbildet, das mindestens eine polyionische Polymer-Komponente, die über mindestens eine ungeladene Polymer-Komponente oder mindestens eine nicht-polymere Vernetzer-Komponente über beide vernetzt ist und so ein Netzwerk ausbildet. Die mindestens zwei funktionellen Gruppen des polyionischen Polymers können gleich oder verschieden sein, insbesondere sind sie gleich.
Das zur Herstellung der Hydrogelpartikel eingesetzte ungeladene Polymer weist in bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung am jeweils freien Ende des Polymers eine funktionelle Gruppe, insbesondere Endgruppe, auf ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Thiolgruppe, Maleimidgruppe, Vinylsulfongruppe, Acrylatgruppe, Carboxylgruppe und Kombinationen davon. Das ungeladene Polymer ist somit funktionalisiert, insbesondere Endgruppen-funktionalisiert. Über diese reaktiven funktionellen Gruppen, insbesondere Endgruppen, wird das mindestens eine ungeladene Polymer bevorzugt mit dem mindestens einen polyionischen Polymer verbunden und bildet so das Netzwerk der Hydrogelpartikel. Die mindestens zwei funktionellen Gruppen des ungeladenen Polymers können gleich oder verschieden sein, insbesondere sind sie gleich.
Das ungeladene Polymer kann linear oder verzweigt sein, insbesondere mehrarmig, das heißt dieses besteht in bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aus mehreren verzweigten Ketten. Insbesondere ist das ungeladene Polymer sternförmig, das heißt mehrarmig mit einem Zentrum, von welchem aus vier, insbesondere gleichlange, Ketten aus entsprechenden Wiederholeinheiten abzweigen.
Das in bevorzugten Ausführungsformen zur Herstellung der Hydrogelpartikel eingesetzte nicht-polymere Vernetzer-Molekül weist in bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mindestens zwei funktionelle Gruppen, insbesondere Endgruppen, auf ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Thiolgruppe, Maleimidgruppe, Vinylsulfongruppe, Acrylatgruppe, Carboxylgruppe, hydroxylierte aromatische Gruppe und Kombinationen davon. Das nicht-polymere Vernetzer-Molekül ist somit funktionalisiert, insbesondere Endgruppen-funktionalisiert. Über diese reaktiven funktionellen Gruppen, insbesondere Endgruppen, wird das mindestens eine nicht-polymere Vernetzer-Molekül bevorzugt mit dem mindestens einen polyionischen Polymer verbunden und bildet so das Netzwerk der Hydrogelpartikel. Die mindestens zwei funktionellen Gruppen des nicht-polymeren Vernetzer-Moleküls können gleich oder verschieden sein, insbesondere sind sie gleich.
Die therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zeichnet sich insbesondere durch eine besonders vorteilhafte Verwendbarkeit zur Behandlung von Arthritis, insbesondere rheumatische Arthritis und Osteoarthritis, aus. Die erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung kann vorteilhafterweise insbesondere proinflammatorische Zytokine, insbesondere Chemokine wie Interleukin-8 (IL-8) aus der Synovialflüssigkeit binden und damit Chemokin-induzierte Immunzellmigration verhindern. Darüber hinaus weist sie eine besonders vorteilhafte Viskosupplementationswirkung, das heißt sie stellt eine Verringerung des Reibungswiderstandes in der Synovialflüssigkeit und damit die Gleitfähigkeit im Gelenk verbessernde Funktion, hier auch als Lubrikationswirkung bezeichnet, bereit, welche bevorzugt mindestens die gleiche ist, wie sie in bekannten in diesem Zusammenhang eingesetzten Zusammensetzungen wie Hyaluronsäure, zukommt, insbesondere jedoch besser ist. Die Lubrikationswirkung führt zu einer Schmerzlinderung beim Patienten und wirkt weiteren Gelenkschäden entgegen. Die Erfinder haben in überraschender Weise festgestellt, dass sich die vorliegende therapeutische viskosupplementierende Zusammensetzung insbesondere durch eine funktionale Kombination aus vorteilhafter Lubrikationswirkung und der Fähigkeit zur Bindung, also Sequestrierung, proinflammatorischer Chemokine und damit anti-entzündlicher Wirkung auszeichnet, wobei darüber hinaus eine besonders gute Injizierbarkeit der Zusammensetzung gegeben ist. Die bereitgestellte Kombination antiinflammatorischer und verbessert mechanischer Eigenschaften in Hinblick auf die Lubrikationswirkung und die gute Injizierbarkeit erlaubt in synergistischer Art und Weise eine besonders effektive intraartikuläre und damit gezielte Therapie von Arthritis.
Die erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung enthaltend Hydrogelpartikel, mindestens eine Hyaluronsäure-Komponente und mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Träger wird in erfindungsgemäß bevorzugter Ausführungsform hergestellt, indem mindestens ein ungeladenes Polymer mit mindestens einem polyionischen Polymer unmittelbar oder über mindestens eine Vernetzer-Komponente kovalent miteinander verbunden wird und dabei ein Hydrogel ausbilden, wobei dieses Hydrogel dementsprechend mindestens eine ungeladene Polymer-Komponente aufweist, die mit mindestens einer polyionischen Polymer-Komponente unter Ausbildung eines Netzwerks kovalent verbunden ist, und wobei dieses Hydrogel, insbesondere in Form von Hydrogelpartikeln, mit mindestens einer Hyaluronsäure-Komponente und mindestens einem pharmazeutisch akzeptablen Träger vermischt wird.
Die erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung enthaltend Hydrogelpartikel, mindestens eine Hyaluronsäure-Komponente und mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Träger wird in erfindungsgemäß bevorzugter Ausführungsform hergestellt, indem mindestens ein nicht-polymeres Vernetzer-Molekül mit mindestens einem polyionischen Polymer unmittelbar kovalent miteinander verbunden wird und dabei ein Hydrogel ausbilden, wobei dieses Hydrogel dementsprechend mindestens eine nicht-polymere Vernetzer-Komponente aufweist, die mit mindestens einer polyionischen Polymer-Komponente unter Ausbildung eines Netzwerks kovalent verbunden ist, und wobei dieses Hydrogel, insbesondere in Form von Hydrogelpartikeln, mit mindestens einer Hyaluronsäure-Komponente und mindestens einem pharmazeutisch akzeptablen Träger vermischt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das mindestens eine ungeladene Polymer ein durchschnittliches Molekulargewicht von 5.000 bis 25.000, insbesondere 10.000 bis 19.000 Da auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Wiederholeinheit der mindestens einen ungeladenen Polymer-Komponente ein durchschnittliches Molekulargewicht von 30 bis 55, insbesondere von 40 bis 50 Da auf.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die mindestens eine ungeladene Polymer-Komponente eine lineare ungeladene Polymer-Komponente.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die mindestens eine ungeladene Polymer-Komponente eine verzweigte, insbesondere mehrarmige, ungeladene Polymer-Komponente.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die mindestens eine mehrarmige ungeladene Polymer-Komponente eine vierarmige oder achtarmige ungeladene Polymer-Komponente.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die mindestens eine ungeladene Polymer-Komponente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenglykol (PEG)-Komponente, Poly(2-oxazolin) (POX)-Komponente, Polyvinylpyrrolidon (PVP)-Komponente, Polyvinylalkohol (PVA)-Komponente, Polyacrylamid (PAM)-Komponente und Kombinationen davon.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die mindestens eine mehrarmige ungeladene Polymer-Komponente eine PEG-Komponente.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die mindestens eine ungeladene Polymer-Komponente eine Polyethylenglykol-Komponente, insbesondere eine lineare oder mehrarmige Polyethylenglykol-Komponente.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die mindestens eine mehrarmige ungeladene Polymer-Komponente eine vierarmige Polyethylenglykol-Komponente.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die mindestens eine mehrarmige ungeladene Polymer-Komponente eine achtarmige Polyethylenglykol-Komponente.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die mindestens eine mehrarmige ungeladene Polymer-Komponente Stern-PEG, ebenso bekannt als starPEG.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das für die Herstellung der erfindungsgemäßen Hydrogelpartikel eingesetzte ungeladene Polymer am jeweils freien Ende der Polymerkette eine funktionelle Gruppe, insbesondere Endgruppe, auf ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Thiolgruppe, Maleimidgruppe, Vinylsulfongruppe, Acrylatgruppe, Carboxylgruppe und Kombinationen davon. Das ungeladene Polymer ist somit insbesondere Endgruppen-funktionalisiert. Die mindestens zwei funktionellen Gruppen des ungeladenen Polymers können gleich oder verschieden sein, insbesondere sind sie gleich.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist das für die Herstellung der erfindungsgemäßen Hydrogelpartikel eingesetzte ungeladene Polymer mindestens zwei Aminogruppen, insbesondere endständige Aminogruppen auf.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist das für die Herstellung der erfindungsgemäßen Hydrogelpartikel eingesetzte ungeladene Polymer mindestens zwei Carboxylgruppen, insbesondere endständige Carboxylgruppen auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die polyionische Polymer-Komponente eine polyanionische Polymer-Komponente, insbesondere eine Glykosaminoglykan-Komponente.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das für die Herstellung der erfindungsgemäßen Hydrogelpartikel eingesetzte Glykosaminoglykan ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Chondroitinsulfat, Dextransulfat, Dermatansulfat, Glukosaminsulfat, Heparin, selektiv desulfatierte Heparine, Heparansulfat und Hyaluronansulfat. Insbesondere ist das Glykosaminoglykan Heparin, Heparansulfat oder Dextransulfat, insbesondere Heparin.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die für die Herstellung der erfindungsgemäßen Hydrogelpartikel eingesetzte polyionische Polymer-Komponente Poly(4-Styrensulfonsäure-co-Maleinsäure).
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt das durchschnittliche Molekulargewicht des polyionischen Polymers 3 bis 20, insbesondere 4 bis 14 kDa.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegen pro polyionischem Polymermolekül 65 bis 80, insbesondere 65 bis 75 Sulfat- oder Sulfonatgruppen vor.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Wiederholeinheit der mindestens einen polyionischen Polymer-Komponente ein durchschnittliches Molekulargewicht von 400 bis 550, insbesondere von 420 bis 470 Da auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegen pro Wiederholeinheit der mindestens einen polyionischen Polymer-Komponente 1,5 bis 4,5, insbesondere 2,0 bis 3,0 Sulfat- oder Sulfonatgruppen vor.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das für die Herstellung der erfindungsgemäßen Hydrogelpartikel eingesetzte nicht-polymere Vernetzer-Molekül in bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mindestens zwei zur Ausbildung jeweils einer kovalenten Bindung zu der polyionischen Polymer-Komponente geeignete funktionelle Gruppen auf, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Thiolgruppe, Maleimidgruppe, Vinylsulfongruppe, Acrylatgruppe, Carboxylgruppe, hydroxylierte aromatische Gruppe und Kombinationen davon.
Das im Hydrogel die nicht-polymere Vernetzer-Komponente darstellende nicht-polymere Vernetzer-Molekül ist somit funktionalisiert, insbesondere Endgruppen-funktionalisiert. Über diese reaktiven funktionellen Gruppen wird das mindestens eine nicht-polymere Vernetzer-Molekül bevorzugt mit dem mindestens einen polyionischen Polymer verbunden und bildet so das Netzwerk der Hydrogelpartikel. Die mindestens zwei funktionellen Gruppen des nicht-polymeren Vernetzer-Moleküls Polymers können gleich oder verschieden sein, insbesondere sind sie gleich.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Vernetzer-Molekül ein nicht-polymeres bifunktionelles Vernetzer-Molekül.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Vernetzer-Molekül mindestens zwei Aminogruppen auf. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Vernetzer-Molekül mit mindestens zwei Aminogruppen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethylendiamin, Propylendiamin (1,3-Diaminopropan), Butan-1,4-diamin, Pentan-1,5-diamin (Cadaverine), Hexamethylen-1,6-Diamin und Kombinationen dieser.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Vernetzer-Molekül mindestens zwei Carboxylgruppen auf. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Vernetzer-Molekül mit mindestens zwei Carboxylgruppen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure und Kombinationen dieser.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Vernetzer-Molekül ein Molekül mit mindestens zwei verschiedenen funktionellen Gruppen, insbesondere mindestens zwei funktionelle Gruppen, welche in der Lage sind, die polyionische Polymer-Komponente und die ungeladene Polymer-Komponente zu vernetzen, insbesondere N-(2-Aminoethyl)maleimid.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die mindestens eine nicht-polymere Vernetzer-Komponente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethylendiamin, Propylendiamin (1,3-Diaminopropan), Butan-1,4-diamin, Pentan-1,5-diamin (Cadaverine), Hexamethylen-1,6-Diamin Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure, N-(2-Aminoethyl)maleimid und Kombinationen dieser.
In besonders bevorzugter Ausführungsform ist das Vernetzer-Molekül insbesondere eine enzymatisch spaltbare Sequenz, insbesondere ein Matrix-Metalloproteasen (MMPs)-responsives Element, beispielsweise PQGIWGQ, IPVSLRSG oder VPMSMRGG, Cathepsin-responsives Element, wie VPMSMRGG, Elastase-responsives Element, beispielsweise AAPV oder APEEIMDRQ, Blutgerinnungsenzym-responsives Element, beispielsweise Thrombinresponsives GGF-Pipecolinsäure-RYSWGCG oder GG-Cyclohexylalanin-ARSWGCG, FXaresponsives Element, beispielsweise GGIEGRMGGWCG, Kalikrein-responsives Elemente, beispielsweise CGGGPFRIGGWCG oder Bakterienproteasen-responsives Element, beispielsweise Aureolysin-responsives ADVFEA oder AAEAA, Elastase-responsives Element, wie AAPV oder die Protease IV-responsive Sequenz MKATKLVLGAVILGSTLLAG, insbesondere mit einer der Sequenzen GPQGIAGQ, GPQGIWGQ oder GCGGPQGIWGQGGCG Bei den Sequenzen GPQGIAGQ und GPQGIWGQ handelt es sich um künstlich erzeugte Sequenzen, welche durch eine Vielzahl von Matrix-Metalloproteasen (MMPs), insbesondere MMP1, 3, 7, 9, spaltbar sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die enzymatisch spaltbaren Sequenzen jeweils am C- und N-terminalen Ende von einem Cystein flankiert, insbesondere von der Sequenz GCG oder GCGG. Über das jeweilige Cystein wird das polyionische Polymer und das ungeladene Polymer oder mindestens zwei polyionische Polymere vernetzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die für die Herstellung der erfindungsgemäßen Hydrogelpartikel eingesetzte polyionische Polymer-Komponente mit einer nicht-polymeren Vernetzer-Komponente, insbesondere Peptid, kovalent verknüpft.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die für die Herstellung der erfindungsgemäßen Hydrogelpartikel bevorzugt eingesetzten ungeladene Polymer-Komponente und die polyionische Polymer-Komponente mittels einer nicht-polymeren Vernetzer-Komponente, insbesondere Peptides, kovalent miteinander verknüpft.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die nicht-polymere Vernetzer-Komponente und die polyionische Polymer-Komponente über mindestens eine Amidbindung kovalent miteinander verbunden.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die ungeladene Polymer-Komponente und die polyionische Polymer-Komponente mittels einer nicht-polymeren Vernetzer-Komponente über mindestens eine Amidbindung kovalent miteinander verbunden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die für die Herstellung der erfindungsgemäßen Hydrogelpartikel eingesetzten ungeladene Polymer-Komponente und die polyionische Polymer-Komponente unmittelbar miteinander kovalent verbunden, insbesondere mittels einer Amidbindung, Thiol-Amin-Bindung, Disulfidbindung oder bioorthogonaler Thioetherbindung erhältlich durch Thiol-Maleimid-, Thiol-Vinylsulfon- oder Thiol-Acrylat-Reaktion.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die für die Herstellung der erfindungsgemäßen Hydrogelpartikel eingesetzten ungeladene Polymer-Komponente, insbesondere Aminogruppen aufweisende ungeladene Polymer-Komponente, und die polyionische Polymer-Komponente, insbesondere Carboxylgruppen aufweisende polyionische Polymer-Komponente, unmittelbar miteinander mittels einer Amidbindung kovalent miteinander verbunden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Amidbindung mittels 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid/N-hydroxysulfosuccinimid (EDC/sNHS))-Aktivierung an den Carboxylgruppen der polyionischen Polymer-Komponente ermöglicht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die für die Herstellung der erfindungsgemäßen Hydrogelpartikel eingesetzten nicht-polymere Vernetzer-Komponente, und die polyionische Polymer-Komponente unmittelbar miteinander kovalent verbunden, insbesondere mittels einer Amidbindung, Thiol-Amin-Bindung, Disulfidbindung oder bioorthogonaler Thioetherbindung erhältlich durch Thiol-Maleimid-, Thiol-Vinylsulfon- oder Thiol-Acrylat-Reaktion.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die für die Herstellung der erfindungsgemäßen Hydrogelpartikel eingesetzten nicht-polymere Vernetzer-Komponente, insbesondere Aminogruppen aufweisende nicht-polymere Vernetzer-Komponente, und die polyionische Polymer-Komponente, insbesondere Carboxylgruppen aufweisende polyionische Polymer-Komponente, unmittelbar miteinander mittels einer Amidbindung kovalent miteinander verbunden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Amidbindung mittels 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid/N-hydroxysulfosuccinimid (EDC/sNHS)-Aktivierung an den Carboxylgruppen der polyionischen Polymer-Komponente ermöglicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Hydrogelpartikel mindestens zwei, insbesondere zwei, verschiedene nicht-polymere Vernetzer-Komponenten auf. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die Hydrogelpartikel eine nicht-polymere Vernetzer-Komponente, welche mindestens zwei Carboxylgruppen aufweist, insbesondere mit jeweils einer Carboxylgruppe Endgruppen-funktionalisiert ist, und eine nicht-polymere Vernetzer-Komponente, welche mindestens zwei Aminogruppen aufweist, insbesondere mit jeweils einer Aminogruppe Endgruppen-funktionalisiert ist, auf. Bevorzugt kann die mindestens zwei Carboxylgruppen aufweisende nicht-polymere Vernetzer-Komponente über mindestens eine Amidbindung mit der vorzugsweise Aminogruppen aufweisenden nicht-polymeren Vernetzer-Komponente und die mindestens zwei Aminogruppen aufweisende nicht-polymere Vernetzer-Komponente über mindestens eine Amidbindung mit der vorzugsweise Carboxylgruppen aufweisenden polyionischen Polymer-Komponente, insbesondere Heparin, verbunden werden, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform die Amidbindung mittels 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid/N-hydroxysulfosuccinimid (EDC/sNHS)-Aktivierung an den Carboxylgruppen des nicht-polymeren Vernetzer-Moleküls und der polyionischen Polymer-Komponente ermöglicht wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Hydrogelpartikel mindestens zwei, insbesondere zwei, verschiedene ungeladene Polymer-Komponenten auf. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die Hydrogelpartikel eine ungeladene Polymer-Komponente, welche mindestens zwei Carboxylgruppen aufweist, insbesondere mit jeweils einer Carboxylgruppe Endgruppen-funktionalisiert ist, und eine ungeladene Polymer-Komponente, welche mindestens zwei Aminogruppen aufweist, insbesondere mit jeweils einer Aminogruppe Endgruppen-funktionalisiert ist, auf. Bevorzugt kann die mindestens zwei Carboxylgruppen aufweisende ungeladene Polymer-Komponente über mindestens eine Amidbindung mit der vorzugsweise Aminogruppen aufweisenden ungeladenen Polymer-Komponente und die mindestens zwei Aminogruppen aufweisende ungeladene Polymer-Komponente über mindestens eine Amidbindung mit der vorzugsweise Carboxylgruppen aufweisenden polyionischen Polymer-Komponente, insbesondere Heparin, verbunden werden, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform die Amidbindung mittels 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid/N-hydroxysulfosuccinimid (EDC/sNHS)-Aktivierung an den Carboxylgruppen der ungeladenen Polymer-Komponente und der polyionischen Polymer-Komponente ermöglicht wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Hydrogelpartikel eine ungeladene Polymer-Komponente auf. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die Hydrogelpartikel eine ungeladene Polymer-Komponente, welche mindestens zwei Aminogruppen aufweist, insbesondere mit jeweils einer Aminogruppe Endgruppen-funktionalisiert ist, auf. Bevorzugt kann die mindestens zwei Aminogruppen aufweisende ungeladene Polymer-Komponente über mindestens eine Amidbindung mit der vorzugsweise Carboxylgruppen aufweisenden polyionischen Polymer-Komponente, insbesondere Heparin, verbunden werden, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform die Amidbindung mittels 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid/N-hydroxysulfosuccinimid (EDC/sNHS)-Aktivierung an den Carboxylgruppen der polyionischen Polymer-Komponente ermöglicht wird.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das ungeladene Polymer, welches insbesondere mit jeweils einer Carboxylgruppe Endgruppen-funktionalisiert ist, ein mehrarmiges, insbesondere achtarmiges, PEG.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das ungeladene Polymer, welches insbesondere mit jeweils einer Aminogruppe Endgruppen-funktionalisiert ist, ein mehrarmiges, insbesondere vierarmiges, PEG.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegen die Hydrogelpartikel in der therapeutischen Zusammensetzung in einem gequollenen Zustand vor, insbesondere in wässriger Lösung, insbesondere Wasser, oder gepufferter wässriger Lösung, insbesondere PBS, gequollener Form vor.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die Hydrogelpartikel auf das 0,75 bis 2,5-fache der Größe der Hydrogelpartikel direkt nach der Hydrogelbildung aufquellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der Gehalt der Hydrogelpartikel in gequollenem Zustand in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung 5 bis 60 Vol.-%, insbesondere 9 bis 55 Vol.-%, insbesondere 10 bis 50 Vol.-% (jeweils bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung)).
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Hydrogelpartikel, insbesondere im gequollenen Zustand, ein Speichermodul von höchstens 22,0 kPa, insbesondere höchstens 20,0 kPa, insbesondere höchstens 15,0 kPa, insbesondere höchstens 10,0 kPa, auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Hydrogelpartikel, insbesondere im gequollenen Zustand, ein Speichermodul von 0,1 bis 22,0 kPa, insbesondere 0,1 bis 20,0 kPa, insbesondere kleiner 0,1 bis 15,0 kPa, insbesondere kleiner 0,1 bis 10,0 kPa, auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Hydrogelpartikel, insbesondere im gequollenen Zustand, eine mittlere Größe von höchstens 200 µm, insbesondere höchstens 80 µm, auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Hydrogelpartikel, insbesondere im gequollenen Zustand, einen mittleren Durchmesser (Größe) von 10 bis 200 µm, insbesondere 5 bis 150 µm, insbesondere 10 bis 80 µm auf. Bevorzugt wird der mittlere Durchmesser der Hydrogelpartikel mittels Fluoreszenzmikroskopie bestimmt, bevorzugt mit einem Farbstoff, welcher eine reaktive Gruppe, insbesondere eine Amin-Gruppe, aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Hydrogelpartikel, insbesondere im gequollenen Zustand, eine sphärische Form auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Hydrogelpartikel, insbesondere im gequollenen Zustand, eine Größenverteilung mit einer Abweichung von weniger als 15 %, insbesondere weniger als 10 %, der mittleren Größe auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Hydrogelpartikel, insbesondere im gequollenen Zustand, eine Sulfat- oder Sulfonatgruppen-Konzentration von mindestens 0,1 mmol/l, insbesondere mindestens 10 mmol/l, insbesondere mindestens 100 mmol/l, insbesondere 0,1 bis 800 mmol/l, insbesondere 10 bis 800 mmol/l, insbesondere 20 bis 500 mmol/l, insbesondere 20 bis 200 mmol/l, insbesondere 50 bis 200 mmol/l, im Volumen der Hydrogelpartikel auf.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die Hydrogelpartikel Sulfatgruppen auf. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die Hydrogelpartikel, insbesondere im gequollenen Zustand, Sulfatgruppen in einer Konzentration von mindestens 0,1 mmol/l, insbesondere mindestens 10 mmol/l, insbesondere mindestens 100 mmol/l, insbesondere 0,1 bis 800 mmol/l, insbesondere 10 bis 800 mmol/l, insbesondere 20 bis 500 mmol/l, insbesondere 20 bis 200 mmol/l, insbesondere 50 bis 200 mmol/l, im Volumen der im gequollenen Zustand vorliegenden Hydrogelpartikel auf.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die Hydrogelpartikel Sulfonatgruppen auf. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die Hydrogelpartikel, insbesondere im gequollenen Zustand, Sulfonatgruppen in einer Konzentration von mindestens 0,1 mmol/l, insbesondere mindestens 10 mmol/l, insbesondere mindestens 100 mmol/l, insbesondere 0,1 bis 800 mmol/l, insbesondere 10 bis 800 mmol/l, insbesondere 20 bis 500 mmol/l, insbesondere 20 bis 200 mmol/l, insbesondere 50 bis 200 mmol/l, im Volumen der im gequollenen Zustand vorliegenden Hydrogelpartikel auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Hydrogelpartikel eine mittlere Maschenweite von mindestens 5 nm, insbesondere mindestens 5,7 nm, auf. Die minimale mittlere Maschenweite stellt sicher, dass alle relevanten Signalmoleküle mit einem Durchmesser von 3 bis 5 nm schnell und sterisch ungehindert die Hydrogelpartikel penetrieren können und die Fähigkeit der Signalmoleküle durch die Partikel zu diffundieren im Wesentlichen von den Ladungseigenschaften der Partikel und der daraus resultierenden Wechselwirkung mit den Signalmolekülen abhängt.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Hydrogelpartikel eine mittlere Maschenweite von 5 bis 30 nm, insbesondere 5,7 bis 30 nm, auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Zusammensetzung einen Gehalt von 0,1 bis 3,0 Gew.-%, insbesondere 0,4 bis 2,0 Gew.-%, insbesondere 0,5 bis 2,0 Gew.- %, insbesondere 0,5 bis 1,8 Gew.-% Hyaluronsäure-Komponente (jeweils bezogen auf die Gesamtmasse der Zusammensetzung) auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Zusammensetzung einen Gehalt von 5 bis 20 Vol.-%, insbesondere 10 bis 20 Vol.-%, insbesondere 10 bis 18 Vol.-% Hyaluronsäure-Komponente (jeweils bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung) auf, insbesondere einer 5 Gew.-%igen Hyaluronsäurelösung (bezogen auf die Gesamtmasse der Hyaluronsäurelösung).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Hyaluronsäure-Komponente Hyaluronsäure und/oder ein Salz davon, insbesondere ist die Hyaluronsäure-Komponente das Natriumsalz der Hyaluronsäure.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Hyaluronsäure-Komponente Hyaluronsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von 4 bis 100 000 kDa, insbesondere 500 bis 100 000 kDa, insbesondere 1 000 bis 7 000 kDa, insbesondere 1 000 bis 5 000 kDa.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Zusammensetzung einen Gehalt von 30 bis 90 Vol.-%, insbesondere 30 bis 85 Vol.-%, insbesondere 40 bis 80 Vol.-% pharmazeutisch akzeptablem Träger (jeweils bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung) auf.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der mindestens eine pharmazeutisch akzeptable Träger eine wässrige Flüssigkeit, insbesondere Wasser oder eine wässrige gepufferte Lösung, insbesondere phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist der mindestens eine pharmazeutisch akzeptable Träger, insbesondere die wässrige Flüssigkeit, einen pH-Wert von 6,5 bis 8,0, insbesondere 6,8 bis 7,6, insbesondere 7,0 bis 7,5, insbesondere 7,4 auf.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die therapeutische Zusammensetzung zusätzlich mindestens ein Additiv, insbesondere marines Kollagen, Sorbit, Mannit, thrombozytenreiches Plasma (Platelet-rich Plasma, PRP), Polyphenole, S-Allylcystein, Pentosan-Polyphosphat-Na, und/oder extrazelluläre Vesikel, enthaltend Curcuminoide, auf, insbesondere Sorbit.
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der Feststoffgehalt der erfindungsgemäßen Zusammensetzung 10 bis 25 Gew.-%, insbesondere 10 bis 17 Gew.-%, insbesondere 12 bis 15 Gew.-% (jeweils bezogen auf die Gesamtmasse der Zusammensetzung).
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Zusammensetzung eine Viskosität von 10 bis 100, insbesondere 20 bis 90, insbesondere 30 bis 80 Pa/s auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Zusammensetzung eine injizierbare therapeutische Zusammensetzung.
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Injektionskraft zur Injektion der erfindungsgemäßen Zusammensetzung bei einer Injektionsgeschwindigkeit von 0,05 ml/s durch eine 25 G-Nadel höchstens 10 N, insbesondere 2,5 bis 3,5 N, insbesondere 2,7 bis 3,5 N. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegen die Hydrogelpartikel bei der Messung der Injektionskraft im gequollenen Zustand vor.
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der Reibungskoeffizient der erfindungsgemäßen Zusammensetzung höchstens 0,2, insbesondere 0,085 bis 0,095, jeweils bei 10 Umdrehungen/s .
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Zusammensetzung befähigt, die Konzentration an mindestens einem freien Zytokin, insbesondere Chemokin, insbesondere IL-8, in einer Umgebungslösung, insbesondere einer Synovialflüssigkeit zu senken. In bevorzugter Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Zusammensetzung die Fähigkeit auf, in einer Zytokin-haltigen Modell-Synovialflüssigkeit die Konzentration an mindestens einem freien Zytokin um 70 bis 80 %zu senken.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das freie Zytokin, insbesondere Chemokin, ein proinflammatorisches Zytokin, insbesondere Chemokin.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das freie Zytokin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, RANTES und Kombinationen davon, insbesondere IL-8.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch therapeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in einem therapeutischen Verfahren zur Behandlung von Arthritis, insbesondere Osteoarthritis oder rheumatoide Arthritis, insbesondere Osteoarthritis, insbesondere zur Applikation, insbesondere Injektion, insbesondere intraartikulären Injektion, in ein Gelenk eines menschlichen oder tierischen Patienten.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der in der vorliegenden therapeutischen Zusammensetzung eingesetzten Hydrogelpartikel in einem therapeutischen Verfahren zur Behandlung von Arthritis, insbesondere Osteoarthritis oder rheumatoide Arthritis, insbesondere zusammen mit mindestens einer Hyaluronsäure-Komponente und mindestens einem pharmazeutisch akzeptablen Träger sowie gegebenenfalls mindestens einem Additiv.
Die Erfindung betrifft insbesondere therapeutische Verfahren zur Behandlung von Arthritis, insbesondere Osteoarthritis oder rheumatoide Arthritis, insbesondere Osteoarthritis, unter Verwendung einer therapeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Therapie von Arthritis, insbesondere Osteoarthritis oder rheumatoide Arthritis, insbesondere Osteoarthritis, wobei einem menschlichen oder tierischen Patienten eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in einer wirksamen Menge appliziert, insbesondere injiziert, insbesondere in ein Gelenk, also intraartikulär, injiziert wird.
Die Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Therapie von Arthritis, insbesondere Osteoarthritis oder rheumatoide Arthritis, insbesondere Osteoarthritis, unter Verwendung einer therapeutischen Zusammensetzung, insbesondere enthaltend Hydrogelpartikel, mindestens eine Hyaluronsäure-Komponente und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, wobei die Hydrogelpartikel mindestens eine Polyethylenglykol-Komponente aufweisen, die mit mindestens einer polyionischen Polymer-Komponente kovalent verbunden ist, und wobei die mindestens eine polyionische Polymer-Komponente Sulfat- oder Sulfonatgruppen aufweist und wobei einem menschlichen oder tierischen Patienten eine wirksame Menge der erfindungsgemäßen Zusammensetzung appliziert, insbesondere intraartikulär injiziert wird.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeichnet sich die therapeutische Zusammensetzung und das therapeutische Verfahren zur Behandlung von Arthritis dadurch aus, dass die Therapie von Arthritis durch die erfindungsgemäß bereitgestellte Lubrikationswirkung, die erfindungsgemäß bereitgestellte Zytokin-reduzierende Wirkung, insbesondere anti-entzündliche Wirkung, oder beides erreicht wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch therapeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in einem therapeutischen Verfahren zur Behandlung von Kreuzschmerzen, insbesondere zur Applikation, insbesondere Injektion eines menschlichen oder tierischen Patienten.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der in der vorliegenden therapeutischen Zusammensetzung eingesetzten Hydrogelpartikel in einem therapeutischen Verfahren zur Behandlung von Kreuzschmerzen, insbesondere zusammen mit mindestens einer Hyaluronsäure-Komponente und mindestens einem pharmazeutisch akzeptablen Träger sowie gegebenenfalls mindestens einem Additiv.
Die Erfindung betrifft insbesondere therapeutische Verfahren zur Behandlung von Kreuzschmerzen unter Verwendung einer therapeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Therapie von Kreuzschmerzen, wobei einem menschlichen oder tierischen Patienten eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in einer wirksamen Menge appliziert, insbesondere injiziert, wird.
Die Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Therapie von Kreuzschmerzen unter Verwendung einer therapeutischen Zusammensetzung, insbesondere enthaltend Hydrogelpartikel, mindestens eine Hyaluronsäure-Komponente und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, wobei die Hydrogelpartikel mindestens eine Polyethylenglykol-Komponente aufweisen, die mit mindestens einer polyionischen Polymer-Komponente kovalent verbunden ist, und wobei die mindestens eine polyionische Polymer-Komponente Sulfat- oder Sulfonatgruppen aufweist und wobei einem menschlichen oder tierischen Patienten eine wirksame Menge der erfindungsgemäßen Zusammensetzung appliziert, insbesondere injiziert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung, insbesondere der vorliegenden Erfindung, umfassend die folgenden Verfahrensschritte:

a) Bereitstellen von mindestens einem ungeladenen Polymer, insbesondere einem funktionalisierten ungeladenen Polymer, oder/und mindestens einem nicht-polymeren funktionalisierten Vernetzer-Molekül, und mindestens einem Sulfat- oder Sulfonatgruppen aufweisenden polyionischen Polymer, mindestens einer Hyaluronsäure-Komponente und mindestens einem pharmazeutisch akzeptablen Träger sowie optional weiterer Komponenten,
b) Vernetzen des ungeladenen Polymers oder/und nicht-polymeren Vernetzer-Moleküls mit dem polyionischen Polymer unter Ausbildung eines Netzwerks zum Erhalt eines Hydrogels, insbesondere von Hydrogelpartikeln, aus mindestens einer polyionischen Polymer-Komponente, die mit mindestens einer ungeladenen Polymer-Komponente oder/und einer nicht-polymeren Vernetzer-Komponente kovalent verbunden ist,
c) Mischen des Hydrogels, insbesondere der Hydrogelpartikel, mit der mindestens einen Hyaluronsäure-Komponente und dem mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, und
d) Erhalt der therapeutischen Zusammensetzung.

In bevorzugter Ausführungsform weist das, bevorzugt funktionalisierte, ungeladene Polymer mindestens zwei funktionelle Gruppen, insbesondere Endgruppe, auf ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Thiolgruppe, Maleimidgruppe, Vinylsulfongruppe, Acrylatgruppe, Carboxylgruppe und Kombinationen davon, wobei die mindestens zwei Gruppen gleich oder verschieden sein können.
In bevorzugter Ausführungsform weist das, bevorzugt funktionalisierte, nicht-polymere Vernetzer-Molekül mindestens zwei funktionelle Gruppen, insbesondere Endgruppe, auf ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Thiolgruppe, Maleimidgruppe, Vinylsulfongruppe, Acrylatgruppe, Carboxylgruppe, hydroxylierte aromatische Gruppe und Kombinationen davon, wobei die mindestens zwei Gruppen gleich oder verschieden sein können.
In bevorzugter Ausführungsform weist das polyionische Polymer zusätzlich zu den mindestens einen Sulfat- oder Sulfonatgruppen mindestens zwei weitere funktionelle Gruppen auf, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Thiolgruppe, Maleimidgruppe, Vinylsulfongruppe, Acrylatgruppe, Carboxylgruppe und Kombinationen davon, wobei die mindestens zwei Gruppen gleich oder verschieden sein können.
Die bevorzugt in dem erfindungsgemäß eingesetzten mindestens einen polyionischen Polymer und dem mindestens einen ungeladenen Polymer und/oder nicht-polymeren Vernetzer-Molekül vorgesehenen, jeweils mindestens zwei funktionellen Gruppen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Thiolgruppe, Maleimidgruppe, Vinylsulfongruppe, Acrylatgruppe, Carboxylgruppe und Kombinationen davon werden jeweils für das polyionische Polymer und das ungeladene Polymer und/oder nicht-polymere Vernetzer-Molekül so ausgewählt, dass die funktionellen Gruppen der Reaktionspartner miteinander eine kovalente Bindung zwischen dem polyionischen Polymer und dem mindestens einen ungeladenen Polymer oder zwischen dem mindestens einen polyionischen Polymer und dem mindestens einen nicht-polymeren Vernetzer-Molekül unter Ausbildung eines Netzwerks ausbilden können.
Die ungeladenen Polymere sind bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenglykole (PEG), Poly(2-oxazoline) (POX), Polyvinylpyrrolidone (PVP), Polyvinylalkohole (PVA) und/oder Polyacrylamide (PAM), welche in bevorzugter Ausführungsform mindestens zwei oder mehr mit den bevorzugten Carboxylgruppen als funktionelle Gruppe aufweisenden polyionischen Polymeren vernetzbare funktionelle Gruppen, insbesondere Aminogruppen aufweisen.
Die nicht-polymeren Vernetzer-Moleküle sind bevorzugt bifunktionelle Vernetzer-Moleküle, welche in bevorzugter Ausführungsform mindestens zwei oder mehr mit den bevorzugten Carboxylgruppen als funktionelle Gruppe aufweisenden polyionischen Polymeren vernetzbare funktionelle Gruppen, insbesondere Aminogruppen aufweisen.
In besonders bevorzugter Ausführungsform werden in Verfahrensschritt b) die Carboxylgruppen von diese aufweisenden Polymeren oder nicht-polymeren Vernetzer-Molekülen 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid/N-hydroxysulfosuccinimid (EDC/sNHS) aktiviert.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das ungeladene Polymer PEG und das polyionische Polymer Glykosaminoglykan. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt das molare Verhältnis des Polyethylenglykol und des Glykosaminoglykan bei der Vernetzung in Verfahrensschritt b) 0,75 bis 3,0 (PEG /GAG), insbesondere 0,75, insbesondere 1,5, insbesondere 2,25, insbesondere 3,0.
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt das molare Verhältnis des Polyethylenglykol und des Glykosaminoglykan bei der Vernetzung in Verfahrensschritt b) 0,75 bis 3,0 (PEG /GAG), insbesondere 0,75 bei einem Feststoffgehalt von 12,0 bis 15,0 % (m/V), insbesondere 13,3 % (m/V), insbesondere 1,5 bei einem Feststoffgehalt von 12,0 bis 15,0 % (m/V), insbesondere 13,3 % (m/V), insbesondere 2,25 bei einem Feststoffgehalt von 12,0 bis 15,0 % (m/V), insbesondere 13,3 % (m/V), insbesondere 3,0 bei einem Feststoffgehalt von 12,0 bis 15,0 % (m/V), insbesondere 13,3 % (m/V), jeweils bezogen auf das Gesamtvolumen der Mischung umfassend Polyethylenglykol und Glykosaminoglykan.
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration an polyionischem Polymer in Verfahrensschritt b) 0,5 bis 6,0 mmol/l (bezogen auf die Mischung aus mindestens einem ungeladenen Polymer und mindestens einem polyionischen Polymer).
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration an ungeladenem Polymer in Verfahrensschritt b) 5,0 bis 12,0 mmol/l (bezogen auf die Mischung aus mindestens einem ungeladenen Polymer und mindestens einem polyionischen Polymer).
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration an nicht-polymeren Vernetzer-Molekül in Verfahrensschritt b) 5,0 bis 24,0 mmol/l (bezogen auf die Mischung aus mindestens einem nicht-polymeren Vernetzer-Molekül und mindestens einem polyionischen Polymer).
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Hydrogelpartikel in Verfahrensschritt b) durch mechanische Zerkleinerung, insbesondere Fragmentierung, Mahlen, Schreddern, Hochdruckverfahren, insbesondere Ultraschallbehandlung und anschließende Filtrierung, insbesondere Filtrierung mit einer Filtervorrichtung mit einem Porendurchmesser von höchstens 200 µm, aus dem in Verfahrensschritt b) erhaltenen Hydrogel erhalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Hydrogelpartikel in Verfahrensschritt b) durch mechanische Zerkleinerung, insbesondere Fragmentierung, Mahlen, Schreddern, Hochdruckverfahren, insbesondere Ultraschallbehandlung und anschließende Filtrierung, insbesondere Filtrierung mit einer Filtervorrichtung mit einem Porendurchmesser von höchstens 200 µm, aus dem in Verfahrensschritt b) erhaltenen Hydrogel, oder durch Cryogelierung und anschließende Lyophilisierung der erhaltenen Hydrogelpartikel oder durch mikrofluidische Co-Flow-Gelierungsverfahren hergestellt werden.
In einer besonders Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die in Verfahrensschritt b) hergestellten Hydrogelpartikel so hergestellt, dass sie nach mechanischer Zerkleinerung aus dem in Verfahrensschritt b) erhaltenen Hydrogel, insbesondere Fragmentierung, Mahlen, Schreddern, Hochdruckverfahren, insbesondere Ultraschallbehandlung und anschließender Filtrierung oder nach Cryogelierung oder nach mikrofluidischer Co-flow Gelierungsverfahren partikuläre Struktur haben, insbesondere in Form von Partikeln vorliegen, insbesondere mit einer Partikelgröße mit einem mittleren Durchmesser von höchstens 200 µm im gequollenen Zustand.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden das Hydrogel, die Hyaluronsäure-Komponente und der mindestens eine pharmazeutisch akzeptable Träger in Verfahrensschritt c) unter Rühren, insbesondere bei einer Rührgeschwindigkeit von 500 U/min, gemischt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden das Hydrogel, die Hyaluronsäure-Komponente und der pharmazeutisch akzeptable Träger in Verfahrensschritt c) für 1 bis 20 min, insbesondere 8 bis 12, insbesondere 10 Minuten gemischt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Hydrogel, insbesondere die Hydrogelpartikel, vor dem Mischen in Verfahrensschritt c) gequollen, insbesondere in PBS.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Hydrogel, insbesondere die Hydrogelpartikel, vor dem Mischen in Verfahrensschritt c) aufkonzentriert, insbesondere durch Zentrifugation, insbesondere durch Zentrifugation für 5 min bei 3000G, wobei bevorzugt nach der Zentrifugation mindestens ein Teil des Überstandes abgenommen wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung, wobei in Verfahrensschritt b) aus dem in Verfahrensschritt b) erhaltenen Hydrogel die Hydrogelpartikel durch folgende Verfahrensschritte gebildet werden:

b1) Fragmentierung des Hydrogels, insbesondere durch Ultraschallbehandlung mit einem Ultraschall-Homogenisator, zum Erhalt von Hydrogelfragmenten und
b2) Filtrierung der Hydrogelfragmente zum Erhalt von Hydrogelpartikeln.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Hydrogel vor der Fragmentierung gemäß Verfahrensschritt b1) gequollen, insbesondere vollständig, insbesondere in PBS.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird in Verfahrensschritt b1) die Fragmentierung des Hydrogels durch Mahlen, Schreddern, Hochdruckbehandlung oder Ultraschallbehandlung, insbesondere Ultraschallbehandlung, durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der Feststoffgehalt des Hydrogels, erhalten in Verfahrensschritt b1) 9 bis 13 Gew.-% (bezogen auf die Gesamtmasse des Hydrogels).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Fragmentierung in Verfahrensschritt b1) 1 bis 15 Minuten durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Filtrierung gemäß Verfahrensschritt b2) mittels eines Filters mit einem Porendurchmesser in einem Bereich von 5 bis 200, 10 bis 200, insbesondere 10 bis 80, insbesondere 50 bis 200, insbesondere 110 bis 200, insbesondere 200 µm durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung, wobei in Verfahrensschritt b) das Hydrogel, insbesondere die Hydrogelpartikel, durch folgende Verfahrensschritte gebildet werden:

b1') Herstellen einer Emulsion enthaltend das mindestens eine polyionische Polymer sowie das mindestens eine ungeladene Polymer und/oder nicht-polymere Vernetzer-Molekül,
b2') Abkühlen der Emulsion enthaltend das mindestens eine polyionische Polymer sowie das mindestens eine ungeladene Polymer und/oder nicht-polymere Vernetzer-Molekül zum Erhalt von cryogelierten Hydrogelpartikeln,
b3') Lyophilisierung der Hydrogelpartikel,
b4') Aufreinigung der lyophilisierten Hydrogelpartikel,

In einer bevorzugten Ausführungsform wird in Verfahrensschritt b1') eine Emulsion enthaltend das mindestens eine ungeladene Polymer und das mindestens eine polyionische Polymer in Toluol hergestellt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Verfahrensparameter und die der Cryogelierung in Verfahrensschritten b1') bis b3') so eingestellt, dass die erhaltenen Hydrogelpartikel partikuläre Form aufweisen, insbesondere als Partikel vorliegen, insbesondere mit einer mittleren Partikelgröße (mittlerer Durchmesser) im gequollenen Zustand von höchstens 200 µm.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung, wobei Hydrogelpartikel in Verfahrensschritt b) durch folgende zusätzliche Verfahrensschritte gebildet werden:

b1") Mischen des mindestens einen polyionischen Polymers sowie des mindestens einen ungeladenen Polymers und/oder nicht-polymeren Vernetzer-Moleküls,
b2") Bildung von Hydrogelpartikeln mittels einer mikrofluidischen Vorrichtung, insbesondere einem Mikrofluidikchip,
b3") Aufreinigung der Hydrogelpartikel, wobei das mindestens eine polyionische Polymer sowie des mindestens eine ungeladene Polymer und/oder nicht-polymere Vernetzer-Molekül zum Erhalt des Hydrogels während Verfahrensschritt b2") vernetzt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist die mikrofluidische Vorrichtung eine Kreuzungsanordnung auf, wobei die Mischung aus polyionischem Polymer und ungeladenem Polymer oder/und nicht-polymere Vernetzer-Molekül durch einen ersten Kreuzungseingang und den diesem gegenüberliegenden ersten Kreuzungsausgang fließt und eine organische Phase über einen zweiten Kreuzungseingang und den diesem gegenüberliegenden zweiten Kreuzungsausgang fließt, wobei die Fließrichtungen der Mischung aus polyionischem Polymer und ungeladenem Polymer oder/und nicht-polymeren Vernetzer-Molekül und organischer Phase senkrecht zueinander verlaufen. Gemäß dieser Ausführungsform weist die mikrofluidische Vorrichtung bevorzugt einen Durchmesser des Kreuzungseingangs von 5 bis 50 µm auf.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Verfahrensparameter und die mikrofluidische Vorrichtung so eingestellt, dass die erhaltenen Hydrogelpartikel partikuläre Form aufweisen, insbesondere als Partikel vorliegen, insbesondere mit einer mittleren Partikelgröße (mittlerer Durchmesser) im gequollenen Zustand von höchstens 200 µm.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist die Mischung aus geladenem und polyionischem Polymer eine Flussgeschwindigkeit von 5 bis 25, insbesondere 10 bis 20 µl/min auf. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist die organische Phase eine Flussgeschwindigkeit von 5 bis 25, insbesondere 10 bis 20 µl/min auf. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die organische Phase 3-Ethoxy-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-dodecafluor-2-(trifluormethyl)-hexan (auch bekannt als Novec™ 7500 von 3M) und/oder ein Perfluoriertenpolyether-Polyethylenglykol-Perfluoriertenpolyether-Triblock-copolymer (PFPE-PEG-PFPE), insbesondere ein Triblock-copolymer aus Krytox™ 157 FSH (DuPont) - Jeffamine™ ED 600 Amine (Huntsman)- Krytox™ 157 FSH (DuPont) erhältlich nach der Synthesevorschrift publiziert in Lab Chip, 2008, 8, 1632-1639, insbesondere 1,8 % (m/V).
In einer bevorzugten Ausführungsform werden in Verfahrensschritt b1") das mindestens eine polyionische Polymer sowie das mindestens eine ungeladen Polymer und/oder nicht-polymere Vernetzer-Molekül bei 2 bis 10 °C, insbesondere 2 bis 8 °C, insbesondere 2 bis 6°C gemischt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die in Verfahrensschritt b2") gebildeten Hydrogelpartikel in einem weiteren Verfahrensschritt b2a'') vor der Aufreinigung in Verfahrensschritt b3") gelagert, insbesondere für bis zu 14 Stunden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Hydrogelpartikel in Verfahrensschritt b3") zuerst mittels einer Mischung umfassend 1H,1H,2H,2H-perfluoro-1-octanol und 3-Ethoxy-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-dodecafluor-2-(trifluormethyl)-hexan, insbesondere einer Mischung umfassend ein Volumenverhältnis von 1:1 von 1H,1H,2H,2H-perfluoro-1-octanol und 3-Ethoxy-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-dodecafluor-2-(trifluormethyl)-hexan, abgetrennt und anschließend mehrmals mit PBS gewaschen.
Die Erfindung betrifft auch therapeutische Zusammensetzungen herstellbar, insbesondere hergestellt, durch ein erfindungsgemäßes Verfahren, optional enthaltend mindestens ein Additiv, insbesondere marines Kollagen, Sorbit, Mannit, thrombozytenreiches Plasma (Platelet-rich Plasma, PRP), Polyphenole, S-Allylcystein, Pentosan-Polyphosphat-Na, und/oder extrazelluläre Vesikel enthaltend Curcuminoide.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „Hydrogel“ ein Gel aus wasserunlöslichen Polymer-Komponenten verstanden, welches Wasser binden kann und wobei die Moleküle, die das Gel aufbauen, chemisch durch kovalente Bindungen zu einem Netzwerk verknüpft sind. Durch im Netzwerk vorliegende hydrophile Polymer-Komponenten quillt das Hydrogel in Wasser unter beträchtlicher Volumenzunahme auf, ohne aber seinen stofflichen Zusammenhalt und Integrität zu verlieren.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „Hydrogelpartikel“ eine physische Erscheinungsform eines des Materials „Hydrogel“ verstanden, insbesondere ein Hydrogel in Teilchenform.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „Netzwerk“ ein Polymernetzwerk verstanden, insbesondere dreidimensional miteinander verknüpfte Polymerketten. Die Polymerketten sind über Vernetzungspunkte miteinander verknüpft und bevorzugt als permanentes Netzwerk ausgeführt, wobei die Polymerketten über chemische Vernetzungspunkte in Form von kovalenten Bindungen miteinander verbunden sind.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter der „Konzentration an Sulfat- oder Sulfonatgruppen der Hydrogelpartikel“ die Anzahl an freien Sulfat- oder Sulfonatgruppen, ausgedrückt in Mol je Volumen, verstanden, welche in dem durch die Gesamtheit der Hydrogelpartikel ausgebildeten Volumen vorliegt. Diese Konzentration wird vorzugsweise mit der Einheit mmol/l angegeben. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Konzentration an Sulfat- oder Sulfonatgruppen durch Multiplikation der Konzentration der polyionischen Polymer-Komponente im Hydrogelpartikel im gequollenen Zustand mit der Anzahl an Wiederholeinheiten und der Anzahl an Sulfat- oder Sulfonatgruppen je Wiederholeinheit berechnet.
Sofern im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung der Begriff „P1“ verwendet wird, wird darunter vorzugsweise die Konzentration an Sulfat- oder Sulfonatgruppen, insbesondere die Ladungseigenschaften, welche vorzugsweise aus der Konzentration der Sulfat- oder Sulfonatgruppen resultiert, oder insbesondere die globale Ladungsdichte, welche vorzugsweise aus der Konzentration der Sulfat- oder Sulfonatgruppen resultiert, verstanden, insbesondere in der Einheit mmol/l.
Die Konzentration der polyionischen Polymer-Komponente im Hydrogelpartikel im gequollenen Zustand wird dadurch berechnet, dass die Konzentration des polyionischen Polymers, welches bei der Vernetzung eingesetzt wird, durch den Quellungsgrad geteilt wird.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „Stern-PEG“ oder „starPEG“ ein Polyethylenglykolmolekül verstanden, welches ein Zentrum mit daran kovalent gebundenen vier, insbesondere gleichlangen, Ketten umfasst.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Biofluid“ eine Flüssigkeit verstanden, welche in einem lebenden biologischen System vorhanden ist oder aus diesem stammt. Ein Biofluid kann zum Beispiel eine Körperflüssigkeit eines Menschen oder Tieres sein.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „nicht polymeren Vernetzer-Komponente“ ein enzymatisch spaltbares Peptid oder kurzes Molekül, welche mindestens zwei zur Vernetzung fähigen Gruppen aufweisen, verstanden, wobei das kurze Molekül ein Molekül ist, welches selbst nicht zur Polymerisation geeignet ist oder ein Monomer oder ein Oligomer mit 2 bis 10 Wiederholeinheiten, insbesondere 3 bis 4 Wiederholeinheiten.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter dem Begriff „Hydrogelpartikel in gequollenem Zustand“ oder „in gequollenem Zustand vorliegende Hydrogelpartikel“ Hydrogelpartikel verstanden, die in bevorzugt physiologischer Kochsalzlösung (PBS) vorliegen und die in dieser Lösung die maximal aufnehmbare Flüssigkeitsmenge aufgenommen haben, also gequollen vorliegen. Die Hydrogelpartikel haben daher im gequollenen Zustand ihre maximale Volumenausdehnung erreicht, bei welcher sie die maximal aufnehmbare Flüssigkeitsmenge aufgenommen haben. Demgemäß wird hierunter ein Zustand der Partikel verstanden, in welchem die Partikel in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, insbesondere PBS, ihr Volumen im Verhältnis zu dem Volumen vergrößert haben, welches direkt nach der Herstellung vorliegt. Die Volumenquellung wird bevorzugt berechnet aus der Volumenänderung des unmittelbar nach Ausbildung des Netzwerks vorliegenden Volumen des Hydrogels im Vergleich zu dem Volumen des gequollenen Hydrogels, das nach Einbringung in PBS und dem darin erfolgenden Quellungsvorgang erhalten wird. Der gequollene Zustand ist gekennzeichnet durch das Erreichen des Gleichgewichtsquellungsgrads der Hydrogelpartikel in der Lösung, das heißt bevorzugt PBS, wobei PBS die gleiche Ionenstärke wie das Biofluid im Knorpel, insbesondere Gewebsflüssigkeit, insbesondere Synovialflüssigkeit, insbesondere eine Modell-Synovialflüssigkeit, aufweist. Thermodynamisch sind in diesem Zustand die expansiven Kräfte (osmotische/elektrostatische Kräfte- und Kräfte aufgrund des ausgeschlossenen Volumens der Polymerketten) und die elastischen Rückstellkräfte (aufgrund der kovalent verbundenen Netzwerkketten) ausgeglichen (siehe auch Freudenberg et al., DOI: 10.1002/adfm.201101868). Demzufolge verändern die Hydrogelpartikel in der gleichen Lösung den Zustand hinsichtlich des Quellungsgrades nicht mehr, wenn diese den gequollenen Zustand erreicht haben. Der gequollene Zustand kann bevorzugt dadurch hergestellt werden, dass die Hydrogelpartikel solange in einer Lösung, insbesondere PBS, inkubiert werden, bis sich ihr Quellungsgrad nicht mehr ändert, bevorzugt für 1 h, insbesondere 4 h, insbesondere 12 h, insbesondere 24 h.
Die Quellung wird erfindungsgemäß bevorzugt dadurch gemessen, dass 67 µl unpolymerisierte Hydrogelmischung mit der gleichen chemischen Zusammensetzung wie die zu erzeugenden Hydrogelpartikel zwischen zwei mit Sigmacote (Sigma-Aldrich, Deutschland) behandelte 9 mm-Glasträger (Menzel-Gläser, Deutschland) für 16 h bei Raumtemperatur auspolymerisiert und anschließend die resultierenden Hydrogelscheiben von den Glasträgern entfernt wurden. Der Durchmesser der Hydrogelscheiben nach der Polymerisation wurde mittels eines Scanners des Typs FLA-3100 (Fujitsu, Japan) optisch bestimmt (Durchmesser des Hydrogels direkt nach der Vernetzung/Hydrogelbildung). Im Anschluss wurden die Hydrogelscheiben in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 0,9 % NaCl gepuffert auf pH 7,4 (Sigma-Aldrich, Deutschland), für 24 h gequollen (physiologische Bedingungen) und erneut mittels des Scanners des Typs FLA-3100 (Fujitsu, Japan) bestimmt (Durchmesser im gequollenen Zustand). Die Quellung der Hydrogele (Quellungsgrad) wurde aus den bestimmten Durchmessern nachfolgender Gleichung bestimmt: Quellungsgrad = (Durchmesser des gequollenen Hydrogels)³ / (Durchmesser des Hydrogels direkt nach der Vernetzung/Hydrogelbildung)³.
Alternativ kann der Quellungsgrad, das heißt insbesondere der mittlere Durchmesser der Hydrogelpartikel im gequollenen Zustand im Vergleich zu der Größe der Hydrogelpartikel direkt nach der Hydrogelbildung, mittels Fluoreszenzmikroskopie bestimmt werden. Hierzu werden die Hydrogelpartikel direkt nach der Hydrogelbildung und Hydrogelpartikel nach der Quellung mit einem Fluoreszenzfarbstoff, bevorzugt Atto-488-NH₂ (1% bezogen auf die Anzahl an Aminogruppen im Hydrogel), gelabelt. Mittels eines Fluoreszenzmikroskops werden die Partikelgrößen über Bildauswertesoftware erfasst und vermessen.
Der mittels Hydrogelscheiben bestimmte Quellungsgrad (x-fache der Größe zwischen gequollenen Zustand und Zustand der Hydrogelpartikel direkt nach der Hydrogelbildung) stimmt bei gleicher Zusammensetzung der Hydrogelscheiben und Hydrogelpartikel mit dem Quellungsgrad der Hydrogelpartikel überein, welcher mittels Fluoreszenzmikroskopie bestimmt wurde.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter der „mittleren Maschenweite“ der mittlere Abstand zwischen zwei Netzknotenpunkten verstanden (siehe Polymer Physics, Michael Rubinstein and Ralph H. Colby, 2006, Oxford University Press, Oxford). Der Abstand stimmt in gewisser Näherung mit dem sterisch bedingten Widerstand der Netzwerke für Transportprozesse von Molekülen durch das Netzwerk überein, da Moleküle die eine größere Dimension als die Maschenweite haben von einer Penetration des Netzwerks aufgrund sterischer Gründe ausgeschlossen sind. Die Maschenweite berücksichtigt ein ideales Netzwerk ohne jegliche Defektstrukturen. Die mittlere Maschenweite der Hydrogele kann auf Basis der Gummielastizitäts-Theorie und der Annahmen eines idealen Netzwerks ohne Defekte vom experimentell, insbesondere mittels oszillatorischer Rheometrie, bestimmten Speichermodul der Hydrogelpartikel im gequollenen Zustand mit Hilfe folgender Formel abgeleitet werden (Polymer Physics, Michael Rubinstein and Ralph H. Colby, 2006, Oxford University Press, Oxford): $ξ = {(\frac{G' N_{A}}{R T})}^{- 1_{/ 3}}$
wobei G' das gemessene Speichermodul in Pa, N_A die Avogadro-Konstante (6,023 × 10^-23 mol^-1), R die universelle Gaskonstante (8,314472 m³ Pa K^-1 mol^-1) und T die absolute Temperatur (in Kelvin; bevorzugt wird bei 295 K gemessen) ist.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem „Reibungskoeffizient“ eine das Verhältnis von Reibungskraft zu Anpresskraft angegebene Messgröße verstanden. Diese kann insbesondere in einer Tribometriezelle, insbesondere einem Anton Paar MCR 301-Rheometer, insbesondere in einem oszillierenden Rheometer bei einer Geschwindigkeit von 10 Umdrehungen pro Sekunde mit einer Kalk-Natron-Glaskugel (12,7 mm Durchmesser), welche mit einer Normalkraft von 10 N auf eine Silikonschicht drückt, gemessen werden.
Die zu untersuchende Flüssigkeit/Zusammensetzung (insbesondere 1 ml) wird dabei in die Tribometriezelle gegeben und bildet einen Schmierfilm zwischen Glaskugel und Silikonschicht und vermindert somit die Gleitreibung im Vergleich zu einer Messung mit reinem Wasser. In dem Verfahren wird der Reibungskoeffizient mittels der Gerätesoftware bei einer Normalkraft von 10 N und einer Drehzahl von 10 Umdrehungen pro Sekunde bestimmt. Bevorzugt wird ein Rheometer MCR 301 von Anton Paar mit einer Tribometriezelle des Typs T-PTD 200 der gleichen Firma benutzt.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter dem Begriff „Zytokine“ Proteine verstanden, die das Wachstum und/oder die Differenzierung von Zellen regulieren. Einige Zytokine sind Wachstumsfaktoren, andere spielen eine wichtige Rolle für immunologische Reaktionen und bei Entzündungsprozessen und werden auch als Mediatoren bezeichnet. Erfindungsgemäß bevorzugt werden unter Zytokinen insbesondere Interferone, Interleukine, Kolonie-stimulierende Faktoren, Tumornekrosefaktoren und „Chemokine“, also kleine Signalmoleküle, verstanden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter der „Senkung der Konzentration an Zytokinen, insbesondere Chemokinen“, verstanden, dass in einer Synovialflüssigkeit, insbesondere einer Modell-Synovialflüssigkeit, die Konzentration an freien Zytokinen, insbesondere Chemokinen, reduziert wird. Dies geschieht im Wesentlichen, ohne an die Theorie gebunden zu sein, durch Bindung des Zytokins, insbesondere Chemokins, an die Hydrogelpartikel der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, insbesondere durch Sequestrierung.
Die Senkung wird vorzugsweise gemessen, indem eine vorbestimmte Menge an Zytokin, insbesondere Chemokin, in eine Synovialflüssigkeit, insbesondere eine Modell-Synovialflüssigkeit, bestimmten Volumens gegeben wird und wobei in dieser Synovialflüssigkeit, insbesondere der Modell-Synovial-Flüssigkeit, ein zu prüfendes Material, insbesondere die vorliegende therapeutische Zusammensetzung, insbesondere die Hydrogelpartikel, vorliegen.
Bevorzugt werden für die Messung der Senkung 50 µl der zu untersuchenden therapeutischen Zusammensetzung in 0,5 ml Reaktionsgefäße, insbesondere Protein LoBind^® Reaktionsgefäßen (Eppendorf Tubes, Germany), - die Zusammensetzung befindet sich auf dem Boden des Reaktionsgefäßes - mit 250 µl einer Protein- oder Proteingemischlösung für 24 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Protein- oder Proteingemischlösung wird hergestellt durch lösen eines oder mehrerer Proteine (Zytokine, Chemokine oder andere Signalmoleküle) in PBS mit 1 % Rinderalbumin und 0,05 % (m/v) Proclin™ 300 (Sigma-Aldrich), um eine Aktivkonzentration von jeweils 10 ng/ml der Proteine zu erreichen. Als Referenz wird die gleiche Protein- oder Proteingemischlösung ohne Gegenwart der 50 µl der therapeutischen Zusammensetzung in 0,5 ml Reaktionsgefäßen, insbesondere Protein LoBind^® Reaktionsgefäßen, ebenfalls für 24 h bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss wird aus den Reaktionsgefäßen, insbesondere Protein LoBind^® Reaktionsgefäßen, jeweils eine Probe der Lösung (Überstand ohne Zusammensetzung) entnommen und die Proteinkonzentrationen mittels ProcartaPlex™ (Thermo Fisher, Deutschland) in Kombination mit den entsprechenden ProcarteaPlex™ Simplex Kits auf einen Gerät des Typs Bioplex 200 (Biorad, Deutschland) vermessen.
Die Senkung der Konzentration an Zytokinen, insbesondere Chemokinen, wird aus den ermittelten Konzentrationen der Lösung, welche mit der zu untersuchenden therapeutischen Zusammensetzung und ohne diese Zusammensetzung inkubiert wurde, nach folgender Gleichung bestimmt: Senkung in % = (1 - Konzentration in Lösung mit Zusammensetzung/Konzentration in Lösung ohne Zusammensetzung) × 100.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „Modell-Synovialflüssigkeit“ eine Flüssigkeit verstanden, die mindestens ein Zytokin, insbesondere Chemokin, in einer Konzentration von 10 ng/ml gelöst in einer Lösung aus 1 mg/ml Rinderalbumin in PBS aufweist.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter der „Injektionskraft“ die Kraft verstanden, die nötig ist, um eine Zusammensetzung durch eine 25-Gauge-Nadel, also eine Nadel mit einem Außendurchmesser nach EN ISO 9626 von 0,5 mm, mit einer Geschwindigkeit von 0,05 ml/s zu drücken. In bevorzugter Ausführungsform wird die Injektionskraft gemäß der Vorgehensweise und Messvorschrift gemäß des Beispiels C) bestimmt.
Die Injektionskraft wird bevorzugt bestimmt, indem 0,5 ml der Zusammensetzung in eine 1 ml Spritze gefüllt und die notwendige Kraft zur Extrusion durch eine 25 G Spritzennadel in einer ZwickRoell Universaltestmaschine mit einer 50 N Messzelle bei 10 ml/s gemessen werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem „Speichermodul“ der Hydrogelpartikel der elastische Anteil des komplexen Schubmoduls verstanden. Der elastische Anteil ist proportional zu dem Anteil der Deformationsenergie, der im Material gespeichert wird und nach Entlastung wieder aus dem Material gewonnen werden kann. Diese Energie wird bevorzugt an in ihren chemisch/physikalisch identischen Hydrogelscheiben bestimmt mittels oszillatorischer Rheometrie in einer Platte/Platte-Anordnung durch frequenzabhängige Messung des Schermoduls. Die erfindungsgemäß angegebenen Speichermodule sind die Speichermodule von in physiologischer Kochsalzlösung (PBS) gequollenen Hydrogelpartikeln. In bevorzugter Ausführungsform wird das Speichermodul gemäß der Vorgehensweise und Messvorschrift gemäß des Beispiels B) bestimmt.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „Vernetzen“ die Ausbildung kovalenter Verbindungen zwischen polyionischer Polymer-Komponente mit mindestens einer ungeladenen Polymer-Komponente oder einer nicht-polymeren Vernetzer-Komponente verstanden, wobei hierzu vorzugsweise die Komponenten miteinander vermischt werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „mindestens eine“ eine Mengenangabe verstanden, die eine Anzahl von 1 oder 2 oder 3 oder 4 oder 5 oder 6 oder 7 oder 8 oder 9 oder 10 und so weiter ausdrückt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann die Bezeichnung „mindestens eine“ genau die Anzahl 1 darstellen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Begrifflichkeit „mindestens eine“ auch 2 oder 3 oder 4 oder 5 oder 6 oder 7 bedeuten.
Sofern im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung quantitative Angaben, insbesondere Prozentangaben, von Komponenten eines Produktes oder einer Zusammensetzung angegeben sind, addieren diese, sofern nicht explizit anders angegeben oder fachmännisch ersichtlich, zusammen mit den anderen explizit angegeben oder fachmännisch ersichtlichen weiteren Komponenten der Zusammensetzung oder des Produktes auf 100 % der Zusammensetzung und/oder des Produktes auf.
Sofern im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein „Vorhandensein“, ein „Enthalten“, ein „Aufweisen“ oder ein „Gehalt“ einer Komponente ausdrücklich erwähnt oder impliziert wird bedeutet dies, dass die jeweilige Komponente vorhanden ist, insbesondere in messbarer Menge vorhanden ist.
Sofern im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein „Vorhandensein“, ein „Enthalten“ oder ein „Aufweisen“ einer Komponente in einer Menge von 0 [Einheit], insbesondere mg/kg, µg/kg oder Gew.-%, ausdrücklich erwähnt oder impliziert wird, bedeutet dies, dass die jeweiligen Komponenten nicht in messbarer Menge vorhanden, insbesondere nicht vorhanden ist.
Die Zahl der angegebenen Nachkommastellen entspricht der Präzision der jeweils angewandten Messmethode.
Unter dem Begriff „und/oder“ wird in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verstanden, dass alle Mitglieder einer Gruppe, welche durch den Begriff „und/oder“ verbunden sind, sowohl alternativ zueinander als auch jeweils untereinander kumulativ in einer beliebigen Kombination offenbart sind. Dies bedeutet für den Ausdruck „A, B und/oder C“, dass folgender Offenbarungsgehalt darunter zu verstehen ist: a) A oder B oder C oder b) (A und B), oder c) (A und C), oder d) (B und C), oder e) (A und B und C).
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter den Begriffen „umfassend“ und „aufweisend“ verstanden, dass zusätzlich zu den von diesen Begriffen explizit erfassten Elementen noch weitere, nicht explizit genannte Elemente hinzutreten können. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter diesen Begriffen auch verstanden, dass allein die explizit genannten Elemente erfasst werden und keine weiteren Elemente vorliegen. In dieser besonderen Ausführungsform ist die Bedeutung der Begriffe „umfassend“ und „aufweisend“ gleichbedeutend mit dem Begriff „bestehend aus“. Darüber hinaus erfassen die Begriffe „umfassend“ und „aufweisend“ auch Zusammensetzungen, die neben den explizit genannten Elementen auch weitere nicht genannte Elemente enthalten, die jedoch von funktioneller und qualitativ untergeordneter Natur sind. In dieser Ausführungsform sind die Begriffe „umfassend“ und „aufweisend“ gleichbedeutend mit dem Begriff „im Wesentlichen bestehend aus“. Der Begriff „bestehend aus“ bedeutet, dass allein die explizit genannten Elemente vorliegen und die Anwesenheit weiterer Elemente ausgeschlossen ist.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die Gegenstände der Unteransprüche und weiteren unabhängigen Ansprüche.
Die Erfindung wird anhand des folgenden Beispiels und der dazugehörigen Figuren näher erläutert.
Die Figuren zeigen:

1 schematisch den Aufbau einer erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzung und
2 fotografische Darstellungen unterschiedlicher erfindungsgemäß eingesetzter Hydrogelpartikel.

Das Sequenzprotokoll zeigt:

SEQ ID No. 1 Matrix-Metalloproteasen (MMPs)-responsive Sequenz PQGIWGQ,
SEQ ID No. 2 Matrix-Metalloproteasen (MMPs)-responsive Sequenz IPVSLRSG,
SEQ ID No. 3 Matrix-Metalloproteasen (MMPs)-responsive Sequenz VPMSMRGG,
SEQ ID No. 4 Elastase-responsive Sequenz AAPV,
SEQ ID No. 5 Elastase-responsive Sequenz APEEIMDRQ,
SEQ ID No. 6 Thrombin-responsive Sequenz GGF-Pipecolinsäure-RYSWGCG,
SEQ ID No. 7 Thrombin-responsive Sequenz GG-Cyclohexylalanin- ARSWGCG,
SEQ ID No. 8 FXa-responsive Sequenz GGIEGRMGGWCG,
SEQ ID No. 9 Kalikrein-responsive Sequenz CGGGPFRIGGWCG,
SEQ ID No. 10 Aureolysin- responsive Sequenz ADVFEA,
SEQ ID No. 11 Aureolysin- responsive Sequenz AAEAA,
SEQ ID No. 12 Protease IV-responsive Sequenz MKATKLVLGAVILGSTLLAG,
SEQ ID No. 13 Matrix-Metalloproteasen (MMPs)-responsive Sequenz GPQGIAGQ,
SEQ ID No. 14 Matrix-Metalloproteasen (MMPs)-responsive Sequenz GPQGIWGQ,
SEQ ID No. 15 Matrix-Metalloproteasen (MMPs)-responsive Sequenz GCGGPQGIWGQGGCG.

BEISPIEL
Eine zur intraartikulären Injektion geeignete erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung weist neben einer Hyaluronsäure-Komponente Hydrogelpartikel und mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Träger auf, deren Herstellung und Einsatz im Folgenden beschrieben wird. Der grundsätzliche Aufbau dieser therapeutischen Zusammensetzung ist in 1 dargestellt, welche die beiden therapeutisch wirksamen Elemente, nämlich die Hyaluronsäure-Komponente und das die Hydrogelpartikel bildende Stern-PEG-/Glykosaminoglykan (Heparin)-Netzwerk aufzeigt.
A) Hyaluronsäure-Komponente
Es wurde eine Hyaluronsäure (Natriumsalz) der Firma Contipro, Molekulargewicht > 1,9 Mio. Da genutzt. Die Reinheit entspricht Pharmaqualität und einer Zertifizierung gemäß ISO 13485 (Medizinprodukt). Die Konzentrationen in der Zusammensetzung sind in Abschnitt C) benannt.
Ein besonders vorteilhafter Bereich der Molmasse der Hyaluronsäure liegt im Bereich von 500 kDa bis 100 Mio Da.
B) Herstellung der Hydrogelpartikel
B1: Beschreibung der Hydrogel-Eigenschaften
Das erfindungsgemäße Hydrogel besteht aus geladenen Bausteinen, also der polyionischen Polymer-Komponente wie Glykosaminoglykan, insbesondere Heparin (Baustein A) und ungeladenen Bausteinen, also nicht-polymeren Vernetzer-Komponente und/oder der ungeladenen Polymer-Komponente, beispielsweise ungeladene Polymere in Form von Multiarm-Polyethylenglykolen (PEG) in aminterminierter (Baustein B) und/oder carboxyterminierter (Baustein C) Form, siehe Tabelle 2. Dabei sind die geladenen und ungeladenen Bausteine kovalent vernetzt zu einem Polymernetzwerk, welches bevorzugt erhältlich ist durch die Aktivierung der Carboxylgruppen des geladenen Bausteins mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)/N-Hydroxysulfosuccinimid (S-NHS) und entweder einer direkte Vernetzung mit dem Aminogruppen enthaltenden ungeladenen Baustein oder über Vernetzer-Moleküle (Linker) mit mindestens zwei Aminogruppen jeweils unter Amidbildung. Zur Variation der Ladungseigenschaften (insbesondere des Parameters P1, der globalen Ladungsdichte) kann weiterhin als dritter Baustein des Hydrogelnetzwerkes ein zweiter ungeladener Baustein mit Carboxylgruppen (zum Beispiel Baustein C, 8-ArmPEG, carboxyterminiert)) verwendet werden, welcher ebenso wie der geladene Baustein über EDC/S-NHS an den Carboxylgruppen aktiviert wird. Das Netzwerk wird dann über Vernetzung zwischen Baustein A und Baustein C einerseits und Baustein B (aminterminiert) andererseits gebildet.
Die Strukturen erfindungsgemäß bevorzugter Hydrogele sind durch die molaren Konzentrationen der Bausteine A bis C in der Hydrogel-Mischung bei der Vernetzung (siehe Tabelle 1) definiert. Diese Konzentrationen beschreiben die Konzentration der netzwerkbildenden Bausteine unmittelbar nach der Vermischung im Reaktionszustand. Aus diesen Konzentrationen können die molaren Verhältnisse der Hydrogel-Bausteine bei der Vernetzung errechnet werden (siehe Tabelle 1). Die Netzwerkbildung findet über einen Zeitraum von 12 Stunden statt, wobei das nach diesem Zeitraum ausgebildete Hydrogel dem Hydrogel-Zustand nach der Vernetzung, insbesondere nach Verfahrensschritt b), entspricht.
Zur Herstellung der Hydrogele eines Typs 1-9 werden hierfür die Komponenten A-C für 5 min durch Behandlung im Ultraschall gelöst (die Ausgangskonzentrationen werden dabei so gewählt, dass sich nach Vermischung der 1 bis 3 Volumenteile (für Komponente A bis C) in der finalen Reaktionsmischung die Konzentration der Bausteine A bis C entsprechend den Angaben in Tabelle 1 ergibt. Die Aktivierungsreagenzien EDC/sNHS werden stöchiometrisch im Verhältnis der in der Reaktionsmischung vorhandenen Aminogruppen (4-fache molare Konzentration des Bausteins B aufgrund der Molekülarchitektur mit dem 4-Arm-PEG) wie folgt in Reinstwasser gelöst, sodass 2 mol EDC pro mol Aminogruppe und 1 mol sNHS im Verhältnis zu 1 mol Aminogruppen in der finalen Reaktionsmischung resultieren. Daraufhin werden die Aktivierungsreagenzien mit den Carboxylgruppen tragenden Komponenten A und C vereinigt und für 10 min bei Raumtemperatur aktiviert. Im Anschluss erfolgt die Zugabe der Komponente B zur Mischung aus A+C +Aktivierungsreagenzien, um die kovalente Netzwerkbildung des Materials zu initiieren.
Für die folgenden Berechnungen wird davon ausgegangen, dass alle Netzwerkbausteine quantitativ in das Hydrogel eingebaut werden und beim nachfolgenden Gleichgewichts-Quellungsschritt in PBS im Hydrogel verbleiben. Die Volumenquellung wird berechnet aus der Volumenänderung der Prüfkörper nach Netzwerkbildung und der nachfolgenden Quellung in PBS.
Die Quellung wurde dadurch gemessen, dass 67 µl unpolymerisierte Hydrogelmischung mit der gleichen chemischen Zusammensetzung wie die zu erzeugenden Hydrogelpartikel zwischen zwei mit Sigmacote (Sigma-Aldrich, Deutschland) behandelte 9 mm-Glasträger (Menzel-Gläser, Deutschland) für 16 h bei Raumtemperatur auspolymerisiert und anschließend die resultierenden Hydrogelscheiben von den Glasträgern entfernt wurden. Der Durchmesser der Hydrogelscheiben nach der Polymerisation wurde mittels eines Scanners des Typs FLA-3100 (Fujitsu, Japan) optisch bestimmt (Durchmesser des Hydrogels direkt nach der Vernetzung/Hydrogelbildung). Im Anschluss wurden die Hydrogelscheiben in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 0,9 % NaCl gepuffert auf pH 7,4 (Sigma-Aldrich, Deutschland), für 24 h gequollen (physiologische Bedingungen) und erneut mittels des Scanners des Typs FLA-3100 (Fujitsu, Japan) bestimmt (Durchmesser im gequollenen Zustand). Die Quellung der Hydrogele wurde aus den bestimmten Durchmessern nachfolgender Gleichung bestimmt: Quellung = (Durchmesser des gequollenen Hydrogels)³ / (Durchmesser des Hydrogels direkt nach der Vernetzung/Hydrogelbildung)³.
Ausschließlich die in PBS gequollenen Hydrogele werden für die weitere Charakterisierung (Rheometrie zur Bestimmung des Speichermoduls, Sequestrierung von IL-8 und weiteren inflammatorischen Proteinen) und die Anfertigung von Mischungen verwendet. Aus diesem Grund können die Ladungseigenschaften der Hydrogele (die Sulfat-/Sulfonatkonzentration P1) aus den Reaktionsmischungen unter Nutzung der Konzentration der geladenen Bausteine in der Reaktionsmischung und dem Volumenquellungsgrad berechnet werden (siehe Tabelle 1, Spalte H). Die Berechnung erfolgte aus der molaren Konzentration der Hydrogelbausteine bei der Hydrogelbildung (siehe Tabelle 1, Spalte A) unter Berücksichtigung der Volumenquellung unter Annahme des vollständigen Einbaus der polymeren Hydrogelbausteine.
Hierfür wurde zuerst die Konzentration der polyionischen Polymer-Komponente im gequollenen Hydrogel (Tabelle 1, Spalte G) aus der Konzentration des polyionischen Polymers, welches für die Hydrogelbildung eingesetzt wird (Tabelle 1 Spalte A), geteilt durch den Quellungsgrad berechnet (Tabelle 1, Spalte E). Die Konzentration der Sulfat- oder Sulfonatgruppen im gequollenen Hydrogel (Parameter P1, Spalte H, Tabelle 1) wurde aus der Konzentration der polyionischen Polymer-Komponente (dem geladenen Baustein) im gequollenen Hydrogel (Tabelle 1, Spalte G) multipliziert mit der Anzahl der Sulfat/Sulfonatgruppen je Polymermolekül (Tabelle 2) berechnet.
Die Hydrogelmaterialien zeichnen sich durch die Mischungsverhältnisse entsprechend der Tabelle 1 aus (wobei die Ausbildung eines elastischen Hydrogels als bedeutsames Kriterium dient, das heißt nach der Quellung in PBS ein elastisches Hydrogel resultiert, welches sich nicht auflöst und bevorzugt durch einen Bereich für das mit der Elastizität/Steifigkeit des Netzwerkes direkt korrelierte Speichermodul (bestimmt durch Rheometrie) von 0,1 bis 22 kPa gekennzeichnet ist. Das Speichermodul der Hydrogelpartikel wurde mittels oszillatorischer Rheometrie (in Kilo-Pascal) mittels eines Scherrheometers des Typs Ares der Firma TA Instruments United Kingdom, bestimmt. Dazu wurden vollständig gequollene Hydrogelscheiben (gequollen 24 h in PBS) ausgestanzt auf einen Durchmesser von 8 mm in einer 9 mm Platte-Platte Messanordnung mit steigender Frequenz von 1-100 rad/s bei Raumtemperatur bei geringer Deformation (2%) gemessen und der Mittelwert über den gesamten Frequenzbereich bestimmt (1 Messwert an einer Probe). Die berichteten Werte sind die Mittelwerte von vier unabhängigen voneinander hergestellten Hydrogelscheiben und werden +/- der Standardabweichung (SD) angegeben.
Neben dem Speichermodul dient als zweiter wichtiger Parameter die Ladungsdichte im Hydrogel, ausgedrückt über die Konzentration der anionisch geladenen Sulfat-/Sulfonatgruppen im gequollenen Hydrogel (siehe Parameter P1 in Tabelle 1, Spalte H, Berechnung siehe oben).

Hierfür wird eine Parametervariation von P1 von 0,1 mmol/l bis 800 mmol/l vorgesehen, besonders vorteilhafte Bereiche betragen 20 bis 500 mmol/l, insbesondere 50 bis 200mmol/l. Tabelle 1: Bildungsvorschrift und chemisch-physikalische Beshcreigung der Hydrogele, Typen 1 bis 9

Name	Hydrogelmischung bei der Netzwerkbildung, ungequollen				Hydrogelnetzwerk nach Gleichgewichtsquellung in physiologischer Salzlösung (PBS)
Name	Konzentration an polyionischer Polymer-Komponente in mmol/l	Konzentration an ungeladener Polymer-Komponente in mmol/l		Verhältnis der Komponenten	Quellung in %		Konzentration der polyionischen Polymer-Komponente in mmol/l	Konzentration an Sulfat-/Sulfonatgruppen (P1) in mmol/l	Speichermodul in kPa
					Mittelwert	SD			Mittelwert	SD
	A	B	C	D	E	F	G	H	I	J
Typ 1	5,56	5,56	0,00	1	5,16	0,04	1,08	75,4	2,97	0,36
Typ 2	3,92	7,84	0,00	2	2,66	0,05	1,47	103,1	3,60	0,20
Typ 3	3,03	9,09	0,00	3	2,23	0,04	1,36	95,0	4,95	0,24
Typ 4	1,50	5,56	4,06	1	2,01	0,02	0,75	52,2	0,46	0,01
Typ 5	1,50	7,84	2,42	2	1,55	0,02	0,97	67,6	1,30	0,09
Typ 6	1,50	9,09	1,53	3	1,47	0,01	1,02	71,4	6,60	0,17
Typ 7	0,50	7,84	5,06	1	2,06	0,05	0,24	17,0	1,95	0,10
Typ 8	0,50	7,84	3,42	2	1,73	0,04	0,29	20,2	3,06	0,04
Typ 9	0,50	9,09	2,53	3	1,72	0,11	0,29	20,4	9,88	0,34

Tabelle 2: Chemisch-physikalische Eigenschaften der polymeren Hydrogel-Bausteine (Komponenten); MWP: Molmasse des Polymers, MWWE: Molmasse der Wiederholeinheit (WE)

Polymer	Hydrogel-Baustein	MWP in g/mol	MWWE in g/mol	Anzahl der Sulfate je WE	Anzahl der Sulfate je Polymermolekül
Heparin	A	14.000	540	2,7	70
4-Arm PEG, aminterminiert	B	10.000	44	0	0
8-Arm PEG, carboxylterminiert	C	10.000	44	0	0

B 2) Herstellung von Hydrogelpartikeln
Die Hydrogelnetzwerke entsprechend der Bildungsvorschrift nach B1) können bevorzugt durch drei verschiedene Verfahren zu Hydrogelpartikeln in dem bevorzugten Größenbereich verarbeitet werden. Zielparameter sind dabei die in der finalen Partikelsuspension vorherrschende mittlere Partikelgröße (mittlerer Durchmesser) mit einem Durchmesser von höchstens 200 µm und der Volumenanteil der Partikel, wobei eine Aufkonzentration der Partikelsuspension durch Zentrifugation vorteilhaft ist.
Die Herstellung der Partikel kann durch Verfahren B2.1) aus nach dem Verfahren nach B1) hergestellten Volumengelmaterialien durch geeignete mechanische Zerkleinerung, zum Beispiel Mahlen, Schreddern, Hochdruck oder Ultraschallbehandlung der Hydrogele erreicht werden. Hierfür wird vorteilhaft die Ultraschallzerkleinerung eingesetzt, bei der nach Verfahren B1) vollständig in PBS gequollene Hydrogele als Gelkörper in einem fünffachen Volumen an PBS für 10 min bei voller Leistung in einem Bandelin-Sonoplus-Ultraschallhomogenisator (Germany) behandelt werden. Anschließend kann die Partikelmischung durch einen Filter mit einer mittleren Porengröße von 200 µm filtriert werden, um noch vorhandene größere Fragmente abzutrennen. Andere Porengrößen von Filtern sind möglich. 2A zeigt derartige durch mechanische Zerkleinerung aus Hydrogelen erhaltene Hydrogelpartikel.
Die Partikelgröße (mittlerer Durchmesser) von höchstens 200 µm ist bedeutsam, um eine Injizierbarkeit der Zusammensetzung (siehe C)) zu gewährleisten, ein besonders vorteilhafter Bereich wird durch den Bereich von 80 bis 10 µm realisiert.
Die Herstellung der Partikel kann alternativ durch Verfahren B2.2 mittels geeigneter mikrofluidischer Verfahren, insbesondere Co-Flowverfahren, wie folgt erfolgen: Hierfür werden die Lösungen der Komponenten A+C+EDC/sNHS und der Komponente B (Konzentrationen und Mischung entsprechend der Bildungsvorschrift von B 1) bei 4°C vorgemischt und im Anschluss durch einen die Größenkriterien (Durchmesser) vorgebenden Mikrofluidikchip mit Kreuzungsanordnung (eine wässriger Phaseneingang für die gekühlte Gelmischung und ein Eingang für die organische Phase) bei einer Flussgeschwindigkeit von 10-20 µl/min (der wässrigen Gelphase) in eine organische Phase aus 3M™ Novec™ 7500 Engineered Fluid (3-Ethoxy-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6- dodecafluor-2-(trifluormethyl)-hexan) und 1% PFPE-PEG-PFPE-Tensid (Krytox™ 157 FSH (DuPont) - Jeffamine™ ED 600 Amine (Huntsman)- Krytox™ 157 FSH (DuPont) erhältlich nach der Synthesevorschrift publiziert in Lab Chip, 2008, 8, 1632-1639) mit einer Flussgeschwindigkeit von 10-20 µl/min zu Tröpfchen dispergiert. Die Geometrie des Mikrofluidikchips sowie die Verhältnisse der Fließgeschwindigkeit der beiden Phasen bestimmen die finale Partikelgröße. Die gebildeten Tropfen reagieren innerhalb der Flussstrecke und durch anschließende Verweilzeit in einem Sammelbehälter über einen Zeitraum von 1-12 Stunden aus und werden im Anschluss durch Zugabe von einem Volumenanteil von 1:1 zwischen 1H,1H,2H,2H-perfluoro-1-octanol und Novec™ 7500 Phase abgetrennt und durch mehrmaliges Waschen im Anschluss in PBS gereinigt und vollkommen gequollen.
Durch dieses Verfahren bilden sich sphärische Partikel mit engen Größenverteilung im Bereich von Abweichungen < 10% des mittleren Partikeldurchmessers. Eine Filtration oder weitere Nachbearbeitung ist nicht notwendig. 2C zeigt derartige mittels einer mikrofluidischen Vorrichtung erhaltene Hydrogelpartikel.
Die Partikelgröße (mittlerer Durchmesser) von höchstens 200 µm ist bedeutsam, um eine Injizierbarkeit der Zusammensetzung (siehe C)) zu gewährleisten, ein besonders vorteilhafter Bereich bildet der Bereich von 80 bis 10 µm.
2B zeigt mittels Cryogelierung und anschließende Lyophilisierung erhaltene Hydrogelpartikel (Verfahren B2.3).
In allen Verfahrensvarianten, insbesondere bei beiden Verfahren B2.1 und B2.2, kann der Volumenanteil der Hydrogelpartikel in der Suspension durch Zentrifugation der Partikelsuspension für 5 min bei 3000G aufkonzentriert und der Überstand abgezogen werden. Die aufkonzentrierte Partikelsuspension wird anschließend durch geeignete Pipetten (bspw. Direktverdrängungspipetten) aufgenommen und zur Herstellung der Mischungen nach Abschnitt C) verwendet.
C) Herstellung der therapeutischen Zusammensetzung aus Hyaluronsäure und sequestrierenden Hydrogelpartikeln
Die therapeutische Zusammensetzung zur Anwendung bei Arthritis, insbesondere Osteoarthritis, besteht aus einer Mischung aus Hydrogelpartikeln, pharmazeutisch akzeptablem Träger und Hyaluronsäuren. 1 zeigt schematisch eine injizierbare therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung hergestellt aus einer Hyaluronsäure-Trägermatrix und Stern-PEG-Glykosamin glykan (GAG) Hydrogelpartikeln.
Die Zusammensetzung (bezeichnet als F1-F7, siehe Tabelle 3) wird durch Vermischung von variablen Volumenanteilen der drei Komponenten 1) Hyaluronsäure, 2) Hydrogelpartikel-Suspension und 3) PBS hergestellt (siehe Tabelle 3). Dabei wird für die Komponente Hyaluronsäure eine Lösung mit 5(g/g) % Hyaluronsäure in PBS genutzt (hergestellt durch Lösung und Homogenisierung durch Rühren der pulverförmigen Hyaluronsäure in PBS). Die Komponente 2 (Hydrogelpartikel-Suspension) werden entsprechend der Hydrogel-Bildungsvorschriften nach B1 (Typen 1-8, siehe Tabelle 1) und einem Herstellungsprozess nach B2 (vorzugsweise B2.1) vorgegeben. Die Komponente 3) PBS kann optional Sorbit oder andere antioxidative Substanzen aufweisen. Die Vermischung der Komponenten 1) bis 3) erfolgt nach den Volumenanteilen, welche in Tabelle 3 vorgegeben sind durch geeignete Homogenisierung (zum Beispiel durch Rühren über 10 min bei einer Rührgeschwindigkeit von 500 U/min).
Besonders vorteilhafte mechanischen Eigenschaften der Zusammensetzung sind eine leichte Injizierbarkeit (charakterisiert durch eine niedrige Injektionskraft) und gleichzeitig eine vorteilhafte hohe Lubrikationswirkung (charakterisiert durch einen niedrigen Reibungskoeffizienten).
Zur Bestimmung der Injizierbarkeit wurde die Injektionskraft wie folgt vermessen: 0.5 ml der therapeutischen Zusammensetzung wurde in eine 1 ml Spritze gefüllt und die notwendige Kraft zur Extrusion durch eine 25G Spritzennadel in einer ZwickRoell Universaltestmaschine mit einer 50 N Messzelle bei 10 ml/s gemessen. Die Lubrikationswirkung wurde in einem Tribometrie-Testaufbau mit einer Kalk-Natron-Glas-Kugel (12,7 mm Durchmesser) auf einer Silikonschicht in einem Anton Paar MCR 301 Rheometer mit einer T-PTD 200 Messzelle bei einer Geschwindigkeit von 10 Umdrehungen pro Sekunde und einer angewandten Normalkraft von 10 N gemessen.
Exemplarisch wurden für die Zusammensetzungen F2, F4 und F6 eine Injektionskraft von 3,1 ± 0,4 N gemessen, die etwas geringer als die Injektionskraft für die 1 %-ige Hyaluronsäure allein (die Trägermatrix) mit 3,7 ± 0,8 N und nicht zu weit entfernt von der Injektionskraft von reinem Wasser mit 2,4 ± 0,4 N liegt. Für die Reibungskoeffizienten wurden ebenso für die Zusammensetzungen F2, F4 und F6 ein Reibungskoeffizient im Bereich von 0,091 ± 0,004 bestimmt, welcher vergleichbar zum Reibungskoeffizienten für die 1%-ige Hyaluronsäure allein mit 0,154 ± 0,002 und signifikant geringer als der Reibungskoeffizient von Wasser mit 0,644 ± 0,157 ist.
Erzielt wurde eine Injektionskraft von < 10 N (Versuchsdurchführung siehe oben) und eine Lubrikationswirkung beschreibbar durch einen Reibungskoeffizienten < 0.2.
Die Zusammensetzung weist zudem als bedeutsame Eigenschaft das Potential zur Sequestrierung mindestens eines der pro-inflammatorisch wirkenden Chemokine IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1a, MIP-1ß und/oder RANTES auf. Die Zusammensetzung ist dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens einen (oder alle) der Faktoren aus der Gruppe der pro-inflammatorisch wirkenden Chemokine zu einem gewissen Prozentsatz aus einer anwendungsrelevanten Lösung bindet.
Zur Charakterisierung der Bindung dieser Chemokine wird eine artifizielle Synovialflüssigkeit durch Mischung rekombinanter Chemokine im Konzentrationsbereich von ca. 10 ng/ml der jeweiligen Chemokine in einer 0,1% igen Albuminlösung (BSA) in PBS hergestellt. Die Zusammensetzung (jeweils 0,5 ml) wird dann mit einem Volumen von 0,5 ml artifizieller Synovialflüssigkeit für 24 Stunden bei Raumtemperatur in Kontakt gebracht und anschließend der Überstand abgezogen und mittels Multiplex-Immunoassay (Luminex) die Verarmung an Chemokinen im Überstand im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolllösung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt und zeigen eine abgestufte Verarmung in Abhängigkeit des Geltyps (Typ 2, Typ 5 oder Typ 8) und der Formulierung (F1-F7).
Nach exakter Bestimmung der Parameter P1 für alle Geltypen wurde eine weitere Korrelation der Sequestrierung mit der Hydrogelkomposition und der Zusammensetzung der Mischung vorgenommen. Die Formulierung F3 weist eine besonders vorteilhafte starke Sequestrierung der Chemokine IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1a, MIP-1ß und RANTES mit >64% bei einer gleichzeitig vorteilhaften niedrigen Injektionskraft von 0,03 N und einem vorteilhaften niedrigen Reibungskoeffizienten von 0,053 auf (Tabellen 3 und 4).

Erzielt wurde eine starke Sequestrierung von pro-inflammatorischen Chemokinen aus artifizieller Synovialflüssigkeit durch die erfindungsgemäße Zusammensetzung von deutlich mehr als 50%. Tabelle 5 zeigt in Übersichtsform wesentliche Eigenschaften der erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzung. Tabelle 3: Chemokinbindung verschiedener therapeutischer Zusammensetzungen

Zusammensetzung	Typ der Hydrogelpartikel	Volumenanteil in der finalen Zusammensetzung			Finale Massenkonzentration der Hyaluronsäure in der Zusammensetzung	Chemokin-Bindung
Zusammensetzung	Typ der Hydrogelpartikel	5% Hyaluronsäurelösung	Hydrogel-partikel (nach B2.1)	PBS		IL-8	IP-10	MCP-1	MIP-1alpha	MIP-1beta	RANTES
F1	Typ 2	10%	10%	80%	1%	40,87%	82,83%	65,38%	31,91%	28,76%	88,73%
F2	Typ 2	10%	20%	70%	1%	68,97%	92,13%	82,05%	45,71%	44,76%	94,57%
F3	Typ 2	10%	50%	40%	1%	82,74%	94,24%	88,39%	64,31%	66,13%	96,55%
F4	Typ 5	10%	20%	70%	1%	52,98%	63,75%	65,69%	29,69%	51,43%	75,16%
F5	Typ 8	10%	10%	80%	1%	23,55%	41,94%	40,47%	21,38%	26,51%	77,60%
F6	Typ 8	10%	20%	70%	1%	35,31%	69,31%	55,90%	26,44%	35,69%	83,16%
F7	Typ 8	10%	50%	40%	1%	44,45%	50,31%	50,13%	23,76%	40,49%	79,81%

Tabelle 4: Injektionskraft und Reibungskoeffizient

Zusammensetzungen	Typ der Hydrogelpartikel	Injektionskraft in N	Reibungskoeffizient bei 10 Umdrehungen pro Sekunde
F1	Typ 2	0,032	0,088
F2	Typ 2	0,028	0,059
F3	Typ 2	0,030	0,053
F4	Typ 5	0,031	0,032
F5	Typ 8	0,030	0,075
F6	Typ 8	0,032	0,053
F7	Typ 8	0,032	0,046

Tabelle 5: Übersicht einiger Eigenschaften der erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzung:

	Wirkung	Quantifizierung
1	Bindung inflammatorischer Chemokine	Bindung >50% der Chemokine (entsprechend der Testanordnung Abschnitt C)
2	Injizierbarkeit durch 25 Gauge-Nadel	Injektionskraft < 10 N (gemessen mit einer Spritze mit einem Kanülendurchmesser von 25 Gauge mittels einer Universaltestmaschine; siehe Abschnitt C)
3	Hohe Lubrikationswirkung	Reibungskoeffizienten < 0.2 (Tribometriezelle gemessen mittels eines Rheometers, siehe Abschnitt C)

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Clin. Exp., Rheumatol. (2014), Goldring & Berenbaum, Curr. Opin. Pharmacol. 22, 51-63 (2015) [0002]

Claims

Therapeutische Zusammensetzung enthaltend Hydrogelpartikel, mindestens eine Hyaluronsäure-Komponente und mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, insbesondere eine wässrige Flüssigkeit, wobei die Hydrogelpartikel mindestens eine polyionische Polymer-Komponente aufweisen, die mit mindestens einer ungeladenen Polymer-Komponente oder einer nicht-polymeren Vernetzer-Komponente kovalent unter Ausbildung einer Netzwerks verbunden ist, und wobei die mindestens eine polyionische Polymer-Komponente Sulfat- oder Sulfonatgruppen aufweist.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine ungeladene Polymer-Komponente ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenglykol (PEG)-Komponente, Poly(2-oxazolin) (POX)-Komponente, Polyvinylpyrrolidon (PVP)-Komponente, Polyvinylalkohol (PVA)-Komponente, Polyacrylamid (PAM)-Komponente und Kombinationen davon.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die mindestens eine ungeladene Polymer-Komponente eine Polyethylenglykol-Komponente ist, insbesondere eine lineare oder mehrarmige, insbesondere vierarmige, Polyethylenglykol-Komponente.
Therapeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mindestens eine polyionische Polymer-Komponente eine Glykosaminoglykan-Komponente ist.
Therapeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mindestens eine nicht-polymere Vernetzer-Komponente ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ethylendiamin, Propylendiamin (1,3-Diaminopropan), Butan-1,4-diamin, Pentan-1,5-diamin (Cadaverine), Hexamethylen-1,6-Diamin Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure, N-(2-Aminoethyl)maleimid und Kombinationen dieser.
Therapeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Hydrogelpartikel ein Speichermodul von höchstens 22 kPa, insbesondere 0,1 bis 22 kPa, aufweisen (jeweils gemessen an in physiologischer Kochsalzlösung (PBS) gequollenen Hydrogelpartikeln).
Therapeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Hydrogelpartikel einen mittleren Durchmesser von höchstens 200 µm, insbesondere höchstens 80 µm, aufweisen (jeweils gemessen an in physiologischer Kochsalzlösung (PBS) gequollenen Hydrogelpartikeln).
Therapeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Hydrogelpartikel eine Sulfat- oder Sulfonatgruppen-Konzentration von mindestens 0,1 mmol/l, insbesondere mindestens 10 mmol/l, insbesondere mindestens 100 mmol/l, insbesondere 0,1 bis 800 mmol/l, insbesondere 10 bis 800 mmol/l, insbesondere 20 bis 500 mmol/l, insbesondere 20 bis 200 mmol/l, insbesondere 50 bis 200 mmol/l,, aufweisen (jeweils gemessen im Volumen von in physiologischer Kochsalzlösung (PBS) gequollenen Hydrogelpartikeln).
Therapeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Gehalt der Hyaluronsäure-Komponente 0,5 bis 2,0 Gew.-%, insbesondere 1,0 bis 2,0 Gew.-%, (jeweils bezogen auf Gesamtmasse der Zusammensetzung) beträgt.
Therapeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die therapeutische Zusammensetzung eine injizierbare therapeutische Zusammensetzung ist, insbesondere eine injizierbare therapeutische Zusammensetzung, deren Injektionskraft bei einer Injektionsgeschwindigkeit von 0,05 ml/s durch eine 25 Gauge-Injektionskanüle, höchstens 10 N, insbesondere 2,7 bis 3,5 N beträgt.
Therapeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Reibungskoeffizient der Zusammensetzung höchstens 0,2, insbesondere 0,085 bis 0,095, jeweils bei 10 Umdrehungen pro Sekunde beträgt.
Therapeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die therapeutische Zusammensetzung befähigt ist, die Konzentration an mindestens einem freien Zytokin, insbesondere Chemokin, insbesondere IL-8, in einem Biofluid, insbesondere in einer Synovialflüssigkeit, insbesondere in einer Modell-Synovialflüssigkeit zu senken, insbesondere um mehr als 50 %, insbesondere um 70 bis 80 %.
Therapeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die ungeladene Polymer-Komponente und die polyionische Polymer-Komponente mittels mindestens einer Vernetzer-Komponente, insbesondere Peptides, oder unmittelbar miteinander kovalent verbunden sind, insbesondere mittels einer Amidbindung, Thiol-Amin-Bindung, Disulfidbindung oder bioorthogonaler Thioetherbindung erhältlich durch Thiol-Maleimid-, Thiol-Vinylsulfon- oder Thiol-Acrylat-Reaktion.
Therapeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zusammensetzung einen Feststoffgehalt von 4 bis 25, insbesondere 5 bis 20 Gew.-% (jeweils bezogen auf die Gesamtmasse der Zusammensetzung) aufweist.
Therapeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zusammensetzung zusätzlich mindestens ein Additiv, insbesondere marines Kollagen, Sorbit, Mannit, thrombozytenreiches Plasma (Platelet-rich Plasma, PRP), Polyphenole, S-Allylcystein, Pentosan-Polyphosphat-Na, und/oder extrazelluläre Vesikel enthaltend Curcuminoide, umfasst.
Therapeutische Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Arthritis, insbesondere Osteoarthritis oder rheumatoide Arthritis, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, insbesondere zur intraartikulären Injektion in ein Gelenk eines menschlichen oder tierischen Patienten.
Verfahren zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung, insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 16, umfassend die folgenden Verfahrensschritte: a) Bereitstellen von mindestens einem ungeladenen Polymer, insbesondere einem funktionalisierten ungeladenen Polymer, oder/und mindestens einem nicht-polymeren funktionalisiertem Vernetzer-Molekül, und mindestens einem Sulfat- oder Sulfonatgruppen aufweisenden polyionischen Polymer, mindestens einer Hyaluronsäure-Komponente und mindestens einem pharmazeutisch akzeptablen Träger sowie optional weiterer Komponenten, b) Vernetzen des ungeladenen Polymers oder nicht-polymeren Vernetzer-Moleküls mit dem polyionischen Polymer unter Ausbildung eines Netzwerks zum Erhalt eines Hydrogels, insbesondere von Hydrogelpartikeln, aus mindestens einer polyionischen Polymer-Komponente, die mit mindestens einer ungeladenen Polymer-Komponente oder/und einer nicht-polymeren Vernetzer-Komponente kovalent verbunden ist, c) Mischen des Hydrogels, insbesondere der Hydrogelpartikel, mit der mindestens einen Hyaluronsäure-Komponente und dem mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, und d) Erhalt der therapeutischen Zusammensetzung.
Verfahren zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei das ungeladene Polymer, insbesondere das funktionalisierte ungeladene Polymer, oder/und das mindestens eine nicht-polymere funktionalisierte Vernetzer-Molekül mindestens zwei zur Ausbildung jeweils einer kovalenten Bindung zu der polyionischen Polymer-Komponente geeignete funktionelle Gruppen aufweist, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Thiolgruppe, Maleimidgruppe, Vinylsulfongruppe, Acrylatgruppe, Carboxylgruppe und Kombinationen davon.
Verfahren zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 17 oder 18, wobei das mindestens eine Sulfat- oder Sulfonatgruppe aufweisende polyionische Polymer mindestens zwei funktionelle Gruppen aufweist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Thiolgruppe, Maleimidgruppe, Vinylsulfongruppe, Acrylatgruppe, Carboxylgruppe und Kombinationen davon.
Verfahren zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei die Hydrogelpartikel in Verfahrensschritt b) durch folgende zusätzliche Verfahrensschritte gebildet werden: b1) Fragmentierung des Hydrogels, insbesondere durch Ultraschallbehandlung mit einem Ultraschall-Homogenisator, zum Erhalt von Hydrogelfragmenten und b2) Filtrierung der Hydrogelfragmente zum Erhalt von Hydrogelpartikeln.
Verfahren zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 17 bis 19, wobei die Hydrogelpartikel in Verfahrensschritt b) durch folgende zusätzliche Verfahrensschritte gebildet werden: b1') Herstellen einer Emulsion enthaltend das mindestens eine polyionische Polymer und das mindestens eine ungeladene Polymer oder/und das mindestens eine nicht-polymere Vernetzer-Molekül und, b2') Abkühlen der Emulsion enthaltend das mindestens eine polyionische Polymer und das mindestens eine ungeladene Polymer oder/und das mindestens eine nicht-polymere Vernetzer-Molekül zum Erhalt von cryogelierten Hydrogelpartikeln, b3') Lyophilisierung der Hydrogelpartikel, b4') Aufreinigung der lyophilisierten Hydrogelpartikel, wobei das mindestens eine polyionische Polymer und das mindestens eine ungeladene Polymer und/oder das mindestens eine nicht-polymere Vernetzer-Molekül zum Erhalt des Hydrogels während der Verfahrensschritte b1') bis b3') vernetzt werden.
Verfahren zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 17 bis 19, wobei die Hydrogelpartikel in Verfahrensschritt b) durch folgende zusätzliche Verfahrensschritte gebildet werden: b1'') Mischen des mindestens einen polyionischen Polymers mit dem mindestens einen ungeladenen Polymers oder/und dem mindestens einen nicht-polymeren Vernetzer-Molekül und, b2'') Bildung einer Emulsion mittels einer mikrofluidischen Vorrichtung und anschließender Vernetzung zu Hydrogelpartikeln, und b3'') Aufreinigung der Hydrogelpartikel, wobei das mindestens eine polyionische Polymer und das mindestens eine ungeladene Polymer oder/und das mindestens eine nicht-polymere Vernetzer-Molekül zum Erhalt des Hydrogels während des Verfahrensschritts b2") vernetzt werden.
Therapeutische Zusammensetzung herstellbar, insbesondere hergestellt, durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 22.