KR101288748B1 - 광반응성 다당, 광가교 다당 생성물, 이들의 제조 방법 및이로부터 제조된 의료용 재료 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 공유 결합에 의해 글리시딜 에스테르에 결합된 다당을 포함하는 광반응성 다당, 이 광반응성 다당을 이용하여 제조한 광가교 다당 및 이 광가교 다당을 포함하는 의료용 제품에 관한 것이다.

Description

광반응성 다당, 광가교 다당 생성물, 이들의 제조 방법 및 이로부터 제조된 의료용 재료{PHOTOREACTIVE POLYSACCHARIDE, PHOTOCROSSLINKED POLYSACCHARIDE PRODUCTS, THE METHOD OF MAKING THEM AND MEDICAL MATERIALS THEREFROM}
본 발명은 광반응성 다당, 광반응성 다당을 광가교하여 제조한 광가교 다당 생성물 및 가교 화합물로부터 제조된 의료용 제품에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 광반응성 및 가교를 촉진하기 위해 카르복실기 및 불포화 탄소 이중 결합을 갖는 글리시딜 에스테르에 결합된 다당, 상기 다당에 광을 조사하여 제조한 광가교 다당 생성물 및 상기 광가교 다당을 포함하는 의료용 제품에 관한 것이다.
다당은 생체에서 유래되는 안전한 중합체이기 때문에, 다당의 개질 물질을 각종 의료용 재료에 적용하는 시도가 이루어져 왔다.
그러한 의료용 제품의 일례로서, 가교제로서 디글리시딜 에테르를 이용하여 황산콘드로이틴을 가교시켜 다당 겔을 제조하는 예가 문헌[Eur. J. Pharm. Sci., 2002 Mar; 15(2): 139-48]에 개시되어 있다. 이러한 유형의 방법에서는, 황산콘드로이틴과 가교제의 반응과 동시에 가교 반응이 일어난다. 반응 종료 후에 미반응의 가교제를 가교 겔로부터 제거하는 것이 곤란한 것으로 확인되었다. 이러한 결함은, 가교제의 제거가 불충분한 스폰지형 또는 겔형의 가교 다당을, 예를 들어 유착 방 지재로서 복강 내에 적용할 경우, 간에 장해가 발생한다는 것이 실험적으로 확인되었기 때문에 문제를 야기할 수 있다. 따라서, 가교제의 제거는 중요한 문제이다. 가교 다당이 스폰지형일 경우, 세정에 의한 제거가 비교적 용이하지만, 그것이 겔 또는 필름 형태일 경우 가교제가 내부로 혼입되기 때문에 제거는 매우 곤란해진다.
이러한 점에서, 광반응성인 다당을 합성하는 방법이 제안되었다. 구체적으로, 사전 단계로서, 광반응성 가교기(가교제)가 이미 화학적으로 결합되어 있는 화합물에 다당을 결합시키는 것이 제안되었다. 이렇게 하면, 조사시, 광반응성 가교기는 다당의 가교를 촉진하게 된다. 그러나, 조사 전에는, 그러한 "광반응성 다당"은 미반응 가교기 또는 가교제의 제거가 용이하도록 용액을 형성할 수 있다. 그러한 광가교 다당을 각종 의료용 제품으로서 이용하려는 시도가 이루어져 왔다.
예를 들어, 미국 특허 제5,462,976호 및 미국 특허 제5,763,504호는 천연 중합체인 글리코사미노글리칸에 신남산, 티민 또는 쿠마린 등의 가교제를 먼저 결합시켜 광반응성 글리코사미노글리칸 유도체를 제조하는 방법을 개시한다. 그 후 생성된 화합물은 정제함으로써 미반응의 가교제를 제거할 수 있다. 정제 후, 광반응성 다당은 자외광을 이용하여 광가교하여 광가교 글리코사미노글리칸을 수득한 후, 이것을 유착 방지재 및 약제 서방용 담체로서 사용할 수 있다.
또한, 미국 특허 제6,025,444호 및 미국 특허 제6,107,410호에는 광가교 전에, 신남산이, 아미노산 또는 그 유도체, 펩티드, 아미노 알콜 및 디아민으로부터 선택되는 스페이서 화합물을 통해 히알루론산에 먼저 결합되는, 광반응성 히알루론산 유도체로부터 유래된 광가교 생성물을 개시한다.
미국 특허 제6,031,017호는 조직 유착 방지 작용을 유발하는 특수한 물성을 갖는 가교 하이드로겔을 개시한다. 상기 하이드로겔은 광반응성 히알루론산 유도체의 자외선 조사에 의해 얻어진다. 상기 유도체에서, 광반응성 가교기는 히알루론산의 작용기에 화학적으로 결합된다.
의료용 재료로서 사용되는 것으로 제안된 광가교 다당의 다른 예로는 다음과 같은 것이 있다: WO 02/060971은 의료용 재료로서 사용될 수 있는 광가교 다당 스폰지를 개시하며, 미국 특허 제6,602,859호에는 의료용 재료 또는 제품으로서의 사용이 제안된 광가교 히알루론산이 기재되어 있다. 상기 광가교 히알루론산은 친수성이 향상되고 수용액으로서의 여과성이 개선된 것으로 제안되는 광반응성 히알루론산으로부터 제조된다. 일본 특개소 56-147802호는 의료용 중합체의 중간체로서의 유용성이 높은 헤파린 유도체를 개시한다. 상기 유도체는 헤파린과 글리시딜 아크릴레이트 또는 글리시딜 메타크릴레이트를 반응시킴으로써 제조한다. 또한, 미국 특허 제6,586,493호에는 비히알루론산 다당에 결합된 글리시딜 아크릴레이트 또는 글리시딜 메타크릴레이트와 히알루론산의 혼합물의 가교 생성물이 기재되어 있다.
가교 다당에 기초한 의료용 제품, 특히 유착 방지재로서 사용하기 위한 의료용 제품에 대한 전술한 고려 사항 이외에도, 상기 제품은 충분한 장벽 효과 및 적절한 분해성을 가질 것이 고려되어야 한다. 그러나, 종래의 광가교 다당을 유착 방지재로서 이용하는 경우 반복되는 딜레마에 봉착하였다. 구체적으로, 장벽능을 높이고자 하면 제품의 생체내 잔류성이 바람직하지 않게 길어지는 반면, 적절한 분해성을 부여하고자 하면 충분한 장벽 효과가 얻어지지 않는다. 예를 들어, 장벽 효과 가 높은 종래의 광가교 다당 겔로 제조된 스폰지 또는 시트를 유착 방지재로서 이용할 경우, 대사 지연으로 인하여 겔이 생체내에 너무 오래 잔류하기 때문에 바람직하지 않은 부작용이 발생할 수 있다. 따라서, 바람직한 또는 제어 가능한 생체내 분해성을 보유함에도 충분한 강도 및 장벽 효과를 보유하는 의료용 제품, 특히 유착 방지재의 개발이 요구되고 있다.
본 발명자는, 장벽 효과가 높고 적절한 분해성을 갖는 광가교 다당을 발견하기 위해 예의 연구를 진행시킨 결과, 의료용 제품으로서 사용될 경우, 충분한 장벽 효과를 지니고 조기 분해성이 우수한 광가교 다당을 개발하게 되었다. 이와 같은 바람직한 특성은 특정한 가교제가 결합된 다당을 광가교함으로써 얻어진다는 것을 발견하였다.
발명의 개시
본 발명의 일 양태에 따르면, 겔, 스폰지, 필름 및 겔 특성과 스폰지 특성을 둘 다 갖는 복합재 등의 광가교 다당 재료로 이루어지며 향상된 특성을 갖는 개선된 의료용 재료 또는 제품이 제공된다. 특히, 상기 의료용 재료 또는 제품은 유착 방지성; 강도; 순도 및 생체내 분해성이 향상되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 광가교 다당의 제조를 위한 광반응성 다당 및 상기 광가교 다당을 포함하는 의료용 재료가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 다당이, 신남산 등의 광반응성 화합물과의 반응에 의해 자체 형성되어, 생성된 글리시딜 에스테르(예, 신남산글리시딜)가 카르복실기 및 불포화 탄소 이중 결합을 포함하게 되는 글리시딜 에스테르에 결합 된다. 본 발명의 이러한 양태에 따르면, 광반응성 다당은 하기 화학식 (1) 또는 (2)로 표시되는 글리시딜 에스테르에 공유 결합된 다당을 포함한다:
Figure 112007028455016-pct00001
Figure 112007028455016-pct00002
상기 식 중,
Figure 112007028455016-pct00003
및
Figure 112007028455016-pct00004
는 각각 확인되는 카르복실기(들) 및 불포화 탄소 이중 결합을 갖는 광반응성 화합물의 잔기를 나타내며, 다당이 헤파린인 경우,
Figure 112007028455016-pct00005
는 아크릴로일기도 아니고 메타크릴로일기도 아니다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 광반응성 다당은 에스테르 결합에 의해 공유 결합된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 광반응성 화합물은 신남산, 히드록시신남산, 아크릴산, 메타크릴산, 푸릴아크릴산, 티오펜아크릴산, 신나밀리덴아세트산 및 소르브산으로 구성되는 군에서 선택되는 일염기 카르복실산, 또는 말레산 및 푸마르산으로 구성되는 군에서 선택되는 이염기 카르복실산이다.
본 발명의 바람직한 일 실시형태에 따르면, 광반응성 다당의 광반응성 화합물은 신남산이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 다당은 글리코사미노글리칸, 폴리(우론산), 폴리(아미노당), 글루칸, 만난, 프럭탄, 갈락탄, 펙틴질, 식물 고무, 한천, 폴피란, 카라기난, 푸코이단 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 유도체로 구성되는 군에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 따르면, 다당은 히알루론산, 콘드로이틴, 황산콘드로이틴, 황산더마탄, 헤파린, 황산헤파란 및 황산케라탄으로 구성되는 군에서 선택되는 글리코사미노글리칸이다. 폴리(우론산)은 알긴산이고; 글루칸 유도체는 카르복시메틸 셀룰로스이며; 폴리(아미노당) 또는 그 유도체는 키틴 및 키토산으로 구성되는 군에서 선택된다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 다당은 히알루론산이며, 광반응성 화합물은 신남산이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 광반응성 화합물은 신남산, 히드록시신남산, 말레산, 푸마르산, 아크릴산, 메타크릴산, 푸릴아크릴산, 티오펜아크릴산, 신나밀리덴아세트산 및 소르브산으로 구성되는 군에서 선택되는 카르복실산이며; 다당은 히알루론산, 콘드로이틴, 황산콘드로이틴, 황산더마탄, 황산헤파란, 황산케라탄, 키틴, 키토산, 알긴산 및 카르복시메틸 셀룰로스로 구성되는 군에서 선택된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 광반응성 화합물은 신남산, 히드록시신남산, 말레산, 푸마르산, 푸릴아크릴산, 티오펜아크릴산, 신나밀리덴아세트산 및 소르브산으로 구성되는 군에서 선택되는 카르복실산이며; 다당은 헤파린, 키틴, 키토산, 알긴산 및 카르복시메틸 셀룰로스로 구성되는 군에서 선택되는 다당이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 광가교 다당은 상기에 요약된 광반응성 다당을 광가교하여 제조한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 겔형의 광가교 다당은 상기 광반응성 다당의 용액에 광을 조사하여 제조한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 스폰지형의 광가교 다당은 상기에 요약된 광반응성 다당의 용액을 동결 또는 동결 건조시키고, 얻어진 동결 용액 또는 동결 건조물에 광을 조사하여 제조한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 겔형 생성물의 특성과 스폰지형 생성물의 특성을 둘 다 갖는 광가교 다당은
(a) 광반응성 다당의 용액에 광을 조사하여 겔형 생성물을 얻고;
상기 겔형 생성물을 동결시키고;
동결 상태를 유지한 채로 상기 동결된 겔형 생성물에 광을 조사하여 제조하거나; 또는
(b) 광반응성 다당의 용액에 광을 조사하여 겔형 생성물을 얻고;
상기 겔형 생성물을 동결 건조시키고;
상기 동결 건조된 겔형 생성물에 광을 조사하여 제조한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 필름형의 광가교 다당은 상기 광반응성 다당의 용액을 건조시켜 그 필름을 얻고, 이 필름에 광을 조사하여 제조한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 광가교 다당은
상기 광반응성 다당의 용액에 광을 조사하여 겔형 생성물을 얻는 단계;
상기 겔형 생성물을 동결시키는 단계;
동결 상태를 유지한 채로 상기 동결된 겔형 생성물에 광을 조사하여, 겔형 생성물의 특성과 스폰지형 생성물의 특성을 둘 다 갖는 조성물을 얻는 단계;
상기 조성물을 건조시키는 단계; 및
그와 같이 건조된 조성물에 광을 조사하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 유착 방지재; 약제 서방용 기재; 및 세포 배양 기재를 비롯한 광가교 다당을 이용하는 의료용 재료 및 제품이 제조된다.
도 1은 참고예 1에 있어서의 신남산글리시딜의 기체 크로마토그래피에 의한 측정 결과를 도시한다. 도면 중, 횡좌표는 시간(min)을 의미한다.
도 2는 실시예 5에 있어서의 광가교 다당의 복합재 시트와 광가교 다당의 스폰지에 관한 분해성의 조사 결과를 도시한다.
이하, 상세한 실시형태 및 방법에 의해 본 발명을 상세하게 설명한다. 이와 같은 상세한 설명은 단지 명세서에 개시되고 청구범위에서 청구된 발명의 예에 관한 것으로서, 본 명세서에 첨부된 청구범위에서 구체적으로 기재되고 명확히 청구된 본 발명의 범위를 어떠한 식으로든 한정하려는 것은 아니다.
광반응성 다당의 조성
본 발명의 광반응성 다당에서, 상기 화학식 (1) 또는 (2)로 표시되는 글리시딜 에스테르는 공유 결합에 의해 다당에 결합된다. 이 "광반응성 다당"을 구성하는 다당으로는 글리코사미노글리칸, 폴리(우론산), 폴리(아미노당), 글루칸, 만난, 프럭탄, 갈락탄, 펙틴질, 식물 고무, 한천, 폴피란, 카라기난, 푸코이단 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 유도체를 들 수 있다. 이들 중에서도, 본 발명에 있어서는 글리코사미노글리칸 또는 그의 염 또는 유도체가 특히 바람직하다.
글리코사미노글리칸(이하, 때때로 "GAG"라 칭하기도 함)으로는, 아미노당과 우론산(또는 갈락토스)을 포함하는 기본 골격을 갖는 다당이다. GAG의 예로는 히알루론산, 콘드로이틴, 황산콘드로이틴, 황산더마탄, 황산케라탄, 헤파린 및 황산헤파란을 들 수 있다. 히알루론산, 황산콘드로이틴, 헤파린, 황산헤파란 및 황산케라탄이 바람직하며, 히알루론산이 더욱 바람직하다. 약학적으로 허용 가능한 염의 예로는 나트륨염 및 칼륨염 등의 알칼리 금속염; 칼슘염 등의 알칼리토류 금속염; 암모늄염 등의 무기 염기와의 염; 또한, 피리딘염, 디에탄올아민염, 시클로헥실아민염 및 아미노산염 등의 유기 염기와의 염을 들 수 있다. 나트륨염이 특히 바람직하다.
글리코사미노글리칸의 유도체로는 의도적으로 GAG에 하나 이상의 황산기를 결합시킨 황산화 유도체, GAG로부터 황산기를 부분적으로 또는 완전히 제거한 탈황산화 유도체, GAG를 산화/환원 반응에 적용한 산화/환원 유도체 및 GAG의 산화/환원 유도체를 탈황산화시킨 산화/환원 탈황산화 유도체를 들 수 있다.
황산화 유도체의 예로는 황산화 히알루론산 및 콘드로이틴 폴리황산을 들 수 있다.
탈황산화 유도체의 예로는
헤파린을 구성하는 글루코사민 잔기의 6번 위치의 히드록실기에서 황산기가 제거된 6-탈황산화 헤파린(미국 특허 제6,492,502호 참조);
헥사우론산 잔기의 2번 위치의 히드록실기에서 황산기가 제거되거나 헤파린을 구성하는 글루코사민 잔기의 2번 위치의 아미노기에서 황산기가 제거된 2-탈황산화 헤파린(일본 특허 공개 제2003-113090호 참조); 및
완전 탈황산화 헤파린을 들 수 있다.
산화/환원-탈황산화 유도체의 예로는 헥사우론산의 2번 및 3번 위치의 탄소 원자 사이의 결합이 부분적으로 절단되고 비절단된 헥사우론산의 일부가 2번 위치에서 황산기를 갖지 않는 과요오드산 산화/환원-탈황산화 헤파린(미국 특허 제6,498,246호 참조) 등이 있다.
상기 예들 중에서, 탈황산화 유도체 및 산화/환원-탈황산화 유도체가 바람직하며, 탈황산화 유도체가 특히 바람직하다.
다른 한편으로는, 글리코사미노글리칸 이외의 다당(그 밖의 다당으로서 언급할 수도 있음)으로는 폴리(우론산), 폴리(아미노당), 글루칸, 만난, 프럭탄, 갈락탄, 펙틴질, 식물 고무, 한천, 폴피란, 카라기난, 푸코이단 및 이들의 염 또는 유도체를 들 수 있다. 폴리(우론산)으로는 알긴산을 들 수 있다. 폴리(아미노당) 및 그 탈아세틸화 유도체로서는 키틴 및 키토산을 들 수 있다. 글루칸 및 그 유도체의 예로는 아밀로스, 아밀로펙틴, 글리코겐, 셀룰로스, 히드록시메틸 셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스를 들 수 있다. 그 밖의 다당의 염으로는 글리코사미노글리칸의 염으로서 상기에 열거된 것들을 들 수 있다. 그 밖의 다당의 유도체로는 전술한 카르복시메틸 유도체, 히드록시메틸 유도체 및 탈아세틸화 유도체를 들 수 있다. 전술한 그 밖의 다당 및 이들의 유도체 중, 키틴, 키토산, 알긴산 및 카르복시메틸 셀룰로스가 특히 바람직하다.
본 발명의 광반응성 다당에 사용되는 전술한 다당의 분자량(중량 평균 분자량)은 다음과 같다. 히알루론산 이외의 다당의 경우, 분자량은 통상 2,000∼3,000,000, 바람직하게는 3,000∼2,700,000, 더욱 바람직하게는 4,000∼2,500,000이다. 히알루론산의 경우, 분자량은 통상 20,000∼3,000,000, 바람직하게는 100,000∼2,000,000, 더욱 바람직하게는 200,000∼1,200,000이다.
본 발명의 다당은 천연물 유래이거나 화학적으로 합성된 것이거나 유전공학 기법에 의해 효모 등의 미생물에서 생산한 것이라도 좋다. 일반적으로 GAG는 생물의 부분 소재(예를 들어, 계관, 탯줄, 연골, 피부, 소장, 혈관 등)로부터 추출함으로써 제조하는 것이 가능하고, 이것들이 바람직한 예이다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 (1) 또는 (2)로 표시되는 글리시딜 에스테르의
Figure 112007028455016-pct00006
또는
Figure 112007028455016-pct00007
를 형성하는 분자 내에 카르복실기 및 불포화 탄소 이중 결합을 갖는 광반응성 화합물은, 하기 화학식 (3)으로 표시되는 아크릴산, 그 유도체 및 메타크릴산이다:
Figure 112007028455016-pct00008
상기 식 중, R3은 수소, 페닐, 히드록시페닐, 카르복실, 푸릴, 티에닐, 스티릴, 또는 1-프로페닐을 나타내고, R4는 수소 또는 메틸을 나타내며, R4가 메틸인 경우, R3은 수소이다.
광반응성 화합물의 예로는 신남산, 히드록시신남산, 아크릴산, 메타크릴산, 푸릴아크릴산, 티오펜아크릴산, 신나밀리덴아세트산 및 소르브산 등의 일염기 카르복실산과, 말레산 및 푸마르산 등의 이염기 카르복실산을 들 수 있다. 이들 중에서도 바람직한 것은, 신남산 또는 티오펜아크릴산 등의 1개의 불포화기를 갖는 카르복실산과, 신나밀리덴아세트산 또는 소르브산 등의 2개의 불포화기를 갖는 카르복실산이다. 생체에 대한 안전성의 측면에서 신남산이 가장 바람직하다.
카르복실기 및 불포화 탄소 이중 결합을 갖는 광반응성 화합물의 글리시딜 에스테르는, 상기 광반응성 화합물과 에피할로히드린, 바람직하게는 에피클로로히드린을 반응시킴으로써 얻어진다. 광반응성 화합물이 말레산 또는 푸마르산 등의 이염기 카르복실산인 경우, 글리시딜 에스테르로서 모노에스테르 또는 디에스테르가 얻어지지만, 디에스테르가 바람직하다.
본 발명의 광반응성 다당은, 상기 광반응성 글리시딜 에스테르를 상기 다당에 도입하여 제조된다. 상기 글리시딜 에스테르의 에폭시기는 개환되어 다당의 카르복실기, 히드록실기 또는 아미노기에 공유 결합을 통해 결합된다. 광반응성 다당은 바람직하게는 카르복실기 함유 다당의 카르복실기에 광반응성 화합물의 글리시딜 에스테르가 에스테르 결합을 통해 결합된 것, 예컨대 히알루론산, 콘드로이틴, 황산콘드로이틴, 황산더마탄, 황산헤파란, 헤파린, 알긴산 및 카르복시메틸 셀룰로스이다.
본 발명의 바람직한 광반응성 다당은, 상기 글리시딜 에스테르의 광반응성 화합물이 신남산, 히드록시신남산, 말레산, 푸마르산, 아크릴산, 메타크릴산, 푸릴아크릴산, 티오펜아크릴산, 신나밀리덴아세트산 및 소르브산으로 구성되는 군에서 선택되는 카르복실산이며, 다당이 히알루론산, 콘드로이틴, 황산콘드로이틴, 황산더마탄, 황산헤파란, 황산케라탄, 키틴, 키토산, 알긴산 및 카르복시메틸 셀룰로스로 구성되는 군에서 선택되는 다당인 것이다.
다른 바람직한 광반응성 다당은, 상기 글리시딜 에스테르의 광반응성 화합물이 신남산, 히드록시신남산, 말레산, 푸마르산, 푸릴아크릴산, 티오펜아크릴산, 신나밀리덴아세트산 및 소르브산으로 구성되는 군에서 선택되는 카르복실산이며, 다당이 헤파린, 키틴, 키토산, 알긴산 및 카르복시메틸 셀룰로스로 구성되는 군에서 선택되는 다당인 광반응성 다당을 포함한다.
상기 광반응성 다당 중에서 가장 바람직한 것은, 상기 글리시딜 에스테르의 광반응성 화합물이 신남산이며 다당이 히알루론산인 광반응성 다당이다.
광반응성 다당의 합성
본 발명의 광반응성 다당은 하기 방법으로 제조할 수 있다.
역침전법을 다음과 같이 이용할 수 있다.
카르복실기를 갖는 다당의 0.1∼15 중량% 수용액에, 물과 혼화할 수 있고 광반응성 글리시딜 에스테르와 반응하지 않는 유기 용매를, 상기 수용액 중 물과의 혼합 비율이 0∼50%가 되도록 첨가한다. 여기에, 광반응성 글리시딜 에스테르를 0.1∼10 중량%의 농도가 되도록 첨가하고, 그 후 40∼80℃에서 0.5∼240 시간 동안 교반한다. 계속해서, 여기에, 이용한 다당 중량의 0.5∼5 배의 양으로 염화나트륨을 첨가한다. 이 혼합물을 반응액 양의 2∼5 배의 양의 에탄올에 부어, 침전물을 분리한다. 이 침전물을 필터를 사용하여 여과하고, 에탄올로 충분히 세정하고 건조시켜 광반응성 다당을 얻는다.
또한, 순침전법을 다음과 같이 이용할 수 있다.
카르복실기를 갖는 다당의 0.1∼15 중량% 수용액에, 물과 혼화할 수 있고 광반응성 글리시딜 에스테르와 반응하지 않는 유기 용매를, 상기 수용액 중 물과의 혼합 비율이 0∼50%가 되도록 첨가한다. 여기에, 광반응성 글리시딜 에스테르를 0.1∼10 중량%의 농도가 되도록 첨가하고, 그 후 40∼80℃에서 0.5∼240 시간 동안 교반한다. 계속해서, 여기에, 이용한 다당 중량의 0.5∼5 배의 양으로 염화나트륨을 첨가한다. 그 후, 여기에 반응액의 양의 0.5∼5 배의 양의 에탄올을 부어, 침전물을 분리한다. 이 침전물을 필터를 사용하여 여과하고, 에탄올로 충분히 세정하고 건조시켜 광반응성 다당을 얻는다.
본 발명에 따른 광반응성 다당을 제공하기 위해 다당에 도입하여야 하는 상기 글리시딜 에스테르의 양, 즉, 광반응성 기(불포화 탄소 이중 결합)의 치환도는, 광가교 다당의 원하는 가교율을 고려하여 결정한다. 그러나 치환도는 다당 및 광반응성 글리시딜 에스테르를 구성하는 광반응성 화합물의 종류에 따라 달라진다. 예를 들어, 다당의 분자량 및 그 다당에 포함된 카르복실기, 히드록실기 또는 아미노기 등의 반응기의 종류 및 수와, 광반응성 화합물의 불포화 기를 고려하여 선택한다. 광반응성 다당에의 광반응성 기의 치환량 또는 치환도는, 후술하는 "실시예"에 기재된 바와 같이, 다당의 구성 단위, 예를 들어, 글리코사미노글리칸을 구성하는 반복 이당 단위에 도입되는 광반응성 기의 수를 백분율로 나타낸 값이다. 광반응성 기의 치환도는 다당의 종류에 따라 달라지지만, 통상 약 1∼20%이며, 바람직하게는 약 1∼15%이다.
다당의 가교
본 발명의 광가교 다당은, 상기 광반응성 다당에 광을 조사하여 가교한 생성물이다. 광반응성 기가 서로 결합하여 시클로부탄형 고리가 형성된다. 특히, 각각의 광반응성 다당 분자로부터의 탄소-탄소 이중 결합이 서로 결합한다. 이러한 결합은 망상 구조를 제공한다.
광반응성 다당에 대한 광의 조사는, 광반응성 기가 광이량체화 반응을 효율적으로 일으키는 정도의 조건 하에 이루어지는 것이 바람직하다. 광 조사에 이용되는 광은 특별히 한정되지 않지만, 광반응성 화합물이 신남산인 경우 자외광이 바람직하다. 자외광의 파장은, 광반응성 다당의 글리코시드 결합은 절단하지 않지만 광반응성 기의 광이량체화 반응을 유발하도록 선택되어야 한다. 이러한 기준에 따라, 예를 들어 200∼600 nm의 파장이 이용될 수 있다. 자외선 램프로서는, 고압 수은 램프 또는 할로겐화금속 램프가 바람직하다. 필요하다면, 예를 들어 컷 필터(cut filter)에 의해 광원으로부터 불필요한 파장을 제거하는 것이 바람직하다. 조사광의 바람직한 선량은 약 0.01∼200 J/cm2이며, 원하는 형태(겔, 스폰지, 복합재 또는 필름)에 따라 적절하게 선택한다.
본 발명의 광가교 다당의 가교율은, 상기 광반응성 다당에 도입된 광반응성 기의 치환도, 가교 반응의 조건 등에 따라 달라지지만, 통상 약 1∼60%이다. 가교율은 후술하는 실시예에 기재된 측정 방법에 의해 결정할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 광반응성 다당의 광조사 단계에서의 조건을 변화시킬 경우, 겔, 스폰지, 복합재, 복합재 필름 또는 필름 등의 여러 가지 형태의 생성물을 제공할 수 있다.
가교된 겔
본 발명의 일 양태에 따르면, 다당은 물을 보유하는 3차원 구조를 형성하여 "하이드로겔"을 형성하는 정도로 가교될 수 있다. 상기 광가교 다당 겔은 미국 특허 제6,031,017호에 기재되어 있는 바와 같은 공지의 방법으로 제조할 수 있다. 다당이 히알루론산인 경우, 예를 들면, 본 발명에 따른 광반응성 히알루론산의 용액을 먼저 제조하는 단계를 포함하는 방법이 이용될 수 있다. 그 용액을 자외광이 투과하기 쉬운 형태 또는 형상으로 만들고, 이 용액에 자외광을 조사한다. 제조 방법의 보다 상세한 설명은 미국 특허 제6,031,017호에 기재된 방법을 참조할 수 있다. 자외선 노광시의 광반응성 히알루론산 용액을 위한 수성 매질로는 물, 완충액, 생리 염수, 완충 생리 염수 등을 들 수 있다. 상기 생성물을 의료용 재료에 이용하는 경우, 완충액, 생리 염수 및 완충 생리 염수를 사용하는 것이 바람직하다.
가교된 스폰지
본 발명에 따르면, 스폰지형으로 이용되는 광가교 다당은 독립 발포체 또는 연통 발포체를 갖는 다공성 물질이며, 탄성을 지니고, 흡수성(吸水性) 및 배수성(排水性)이 우수하며, 물과 그 밖의 수성 매질에 불용성이다. 보다 구체적으로는, 상기 광가교 다당은 스폰지형 광가교 다당을 건조 상태로 물 또는 그 밖의 수성 매질에 침지했을 때, 물을 조속히 흡수하여 팽윤하며, 팽윤 후에 가압하거나 흡수지 상에 놓았을 때 그것에 흡수된 물 등의 액체 매질을 조속히 배출하는 특성을 갖는 물질이다. 스폰지의 다공성 구조는 광반응성 다당의 종류, 제조 조건 등에 따라 다르지만, 통상 단위 면적당 전체 세공의 50% 이상의 세공이 10∼50 ㎛의 세공 크기를 갖고 있고, 따라서 액체 매질의 흡수성 및 방출성이 우수하며, 또한 강도도 높게 유지된다.
광가교 다당 스폰지의 제조 방법은 (A) 본 발명에 따라 제조된 광반응성 다당의 용액을 동결 또는 동결 건조시키는 단계 및 (B) 동결 용액 또는 동결 건조물에 광을 조사함으로써 광반응성 다당이 가교된 광가교 다당 스폰지를 얻는 단계를 포함한다. 보다 상세하게는, WO 02/060971 공보에 기재된 방법에 의해 스폰지를 제조할 수 있고, 세공 크기 역시 WO 02/060971 공보에 기재된 방법으로 측정할 수 있으며, 상기 공보는 본 명세서에서 참고 문헌으로 인용한다.
가교된 겔/스폰지 복합재
본 발명에 따르면, 겔과 스폰지의 특성을 둘 다 갖는 광가교 다당(이하, 광가교 다당 복합재라 함)은, 전술한 광가교 다당 겔의 제조 방법과 전술한 광가교 다당 스폰지의 제조 방법을 병용하여 제조할 수 있으며, 겔 재료와 스폰지 재료의 특성을 겸비한 생성물이다. 보다 구체적으로는, 상기 복합재는 광가교 다당 겔이 나타내는 높은 장벽 효과와, 광가교 다당 스폰지가 나타내는 높은 강도를 둘 다 갖는 것이다.
본 발명의 광가교 다당 복합재의 제조 방법은, 예를 들어 다당이 히알루론산일 경우, 다음과 같다. 고농도의 히알루론산 수용액을 제조한다. 그 용액을, 그 형태를 자외광이 투과하기 쉬운 형상으로 형성하고 자외광을 조사하여 겔형 생성물을 얻는다. 얻어진 겔형 생성물을 동결시키고, 동결 상태를 유지한 채로 동결된 생성물에 자외광을 추가로 조사하거나, 또는 겔형 생성물을 동결 건조시키고, 동결 건조물에 자외광을 추가로 조사한다. 상기 두 방법은 모두 가교 다당의 복합재 형태를 제공한다.
복합재 필름
본 발명에 따르면, 본 발명의 광가교 다당 복합재는 다음과 같은 방법에 의해 필름으로서 이용할 수 있다. 전술한 광가교 다당 복합재를 얇은 필름이 되도록 건조시키고, 그 후 이 얇은 필름에 자외광을 조사하여 필름형 생성물을 얻는다(이하, 광가교 다당 복합재 필름이라 함). 이 광가교 다당 복합재 필름은 광가교 다당 복합재보다 손상에 대해 훨씬 우수한 장벽 효과와 더 높은 강도를 나타낸다.
가교된 필름
본 발명의 광가교 다당 필름은 본 발명에 따른 광반응성 다당의 용액을, 예를 들어 기재 상에 원하는 두께로 도포하는 방식으로 제조할 수 있다. 그 후, 이것을 공기로 건조시키고, 형성된 얇은 필름에 자외광을 조사하여 얇은 필름을 제조한다. 보다 구체적으로, 이것은 미국 특허 제5,462,976호 및 미국 특허 제5,763,504호에 기재된 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 광가교 다당 필름은 우수한 장벽 특성을 보유하나, 젖게 되면 미끌거리거나 강도가 약해진다.
디글리시딜 에테르를 가교제로서 사용하여 다당을 가교시키는 종래의 방법(예를 들어 문헌[Eur. J. Pharm. Sci., 2002 Mar; 15(2): 139-48]에 기재된 방법)에서는, 가교를 다당 간에 직접 형성하여 그 물리화학적 성질을 개질한다. 이에 반해, 본 발명에 따른 겔, 스폰지, 복합재 또는 필름 등의 광가교 다당 생성물의 전술한 제조 방법은, 하기와 같은 점에서 종래의 방법과 현저히 다르고, 종래의 화합물에 비해 크게 개선되어 있다.
우선, 본 발명의 방법에서는, 다당 자체가 광반응성 화합물과의 사전 결합으로 인해 광반응성이기 때문에 광가교 단계에서 원하는 형태의 생성물이 형성된다. 본 발명에 따르면, 광반응성 다당의 제조 단계에서 가교가 전혀 발생하지 않으며, 이때, 광반응성 화합물의 글리시딜 에스테르가 다당으로 도입되고 그에 따라 광반응성 화합물의 미반응 글리시딜 에스테르는 광반응성 다당에 포집되지 않으나 충분한 세정 및 정제에 의해 제거할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 다당과 광반응성 화합물의 글리시딜 에스테르와의 반응액을 에탄올에 부어 침전물을 분리함으로써 순수한 광반응성 다당을 수득하는 것이 가능하다. 그 이유는 광반응성 화합물의 글리시딜 에스테르는 물에 거의 용해되지 않고 에탄올에는 쉽게 용해되는 한편, 반응 생성물인 광반응성 다당은 에탄올에 거의 용해되지 않기 때문이다. 따라서, 광반응성 화합물의 미반응 글리시딜 에스테르의 대부분이 에탄올에 용해되어 침전물로 혼입되지 않는다. 수득된 광반응성 다당의 침전물을 에탄올로 추가로 충분히 세정할 경우, 그 주위에 부착된 광반응성 화합물의 미반응 글리시딜 에스테르를 용이하게 씻어 버릴 수 있기 때문에, 매우 높은 순도의 광반응성 다당을 얻을 수 있다.
광반응성 화합물의 글리시딜 에스테르를 다당에 도입하는 경우, 다른 축합제 및 촉매를 필요로 하지 않기 때문에 불필요한 물질에 의한 오염을 방지할 수 있다. 또한, 광반응성 다당을 원하는 형상으로 성형한 후 광을 조사하여 가교 생성물을 얻을 수 있기 때문에, 용도에 부합되는 형상의 가교 생성물을 얻는 것이 가능하다.
의료용 재료/제품
본 발명의 광가교 다당은 "의료용 재료" 또는 "의료용 제품"으로서, 예를 들어 수술 후 조직 간 유착을 방지하기 위한 의료용 제품("유착 방지재"), 약제 서방용 디바이스를 구성하기 위한 의료용 제품("약제 서방용 기재"), 세포 배양시의 기본 구조를 위한 기재("세포 배양용 기재"), 창상부의 보호를 위한 의료용 제품("창상 피복재"), 생체내의 공간을 유지하기 위한 의료용 제품("간극 유지재"), 뼈 등의 결합 조직의 공동을 충전하기 위한 의료용 제품("뼈 충전재"), 인공 체액(인공 관절액, 인공 누액, 안과 수술용 보조재 등), 생체 표면의 보습을 위한 제품("보습재"), 의약 등의 제형을 유지하기 위해 첨가하는 첨가제("부형제") 등으로서 사용할 수 있다. 이것은 특히 유착 방지재, 약제 서방용 기재 또는 세포 배양용 기재로서 유용하다. 그 밖에도, 스폰지, 복합재 및 필름 형태의 본 발명에 따른 생성물은, 광가교 다당이 강도를 지니면서도 분해성이 우수하기 때문에 유착 방지재로서 특히 유용하다.
본 발명의 광가교 다당은 광가교 다당의 삼차원 망상 구조 내에 포매된 약제의 서방형 방출을 위한 기재로서 이용할 수 있다. 약제로서는 본 발명의 광가교 다당의 망상 구조 내에 유지되어 제어 방출될 수 있는 약제인 한 특별히 한정되지 않지만, 하기의 약제가 예시된다
ㆍ 살리실산, 아스피린, 메페남산, 톨페남산, 플루페남산, 디클로페낙, 술린닥, 펜부펜, 인도메타신, 아세메타신, 암페낙, 에토돌락, 펠비낙, 이부프로펜, 플루비프로펜, 케토프로펜, 나프록센, 프라노프로펜, 페노프로펜, 티아프로펜산, 옥사프로진, 록소프로펜, 알루미노프로펜, 잘토프로펜, 피록시캄, 테녹시캄, 롤녹시캄, 멜록시캄, 티아라미드, 톨메틴, 디플루니살, 아세트아미노펜, 플록타페닌, 티노리딘, 염산티아라미드 및 메피리졸 등의 비스테로이드성 소염 진통제,
ㆍ 메토트렉세이트, 플루오로우라실, 황산빈크리스틴, 미토마이신 C, 액티노마이신 C 및 염산다우노루비신 등의 항암제,
ㆍ 아세글루타미드 알루미늄, L-글루타민, p-(트랜스-4-아미노메틸시클로헥산카르보닐)페닐프로피온산 염산염, 염산세트렉세이트, 설피리드, 게파네이트 및 시메티딘 등의 항궤양제,
ㆍ 키모트립신, 스트렙토키나제, 염화 리소자임, 브로멜라인 및 우로키나제 등의 효소 제제,
ㆍ 염산클로니딘, 염산부니트롤롤, 염산부나조신, 캅토프릴, 황산베타니딘, 타르타르산메토프롤롤 및 메틸도파 등의 혈압 강하제,
ㆍ 염산플라복세이트 등의 비뇨기관용제,
ㆍ 헤파린, 디쿠마롤 및 와파린 등의 항혈액응고제,
ㆍ 클로피브레이트, 심피브레이트, 엘라스타제 및 니코몰 등의 동맥경화용제,
ㆍ 염산니카르디핀, 염산니모디핀, 사이토크롬 C 및 니코틴산토코페롤 등의 순환기관용제,
ㆍ 히드로콜티손, 프레드니솔론, 덱사메타손 및 베타메타손 등의 스테로이드제,
ㆍ 성장 인자 및 콜라겐 등의 창상 치유 촉진제(일본 특개소 60-222425호 참조).
그 밖의 예로는 생리 활성을 갖는 폴리펩티드, 호르몬제, 항결핵제, 지혈제, 당뇨병 치료제, 혈관 확장제, 부정맥 치료제, 강심제, 항알레르기제, 항우울제, 항간질제, 근육 이완제, 진해/거담제, 항생제 등을 들 수 있다.
본 발명의 광가교 다당은, 세포(배양 세포 및 초대 배양 세포를 포함함) 및 조직(생체로부터 적출한 조직편 등)의 배양을 위한 배지를 광가교 다당에 함침시켜 배지가 충분히 포함되게 할 경우, 세포 또는 조직을 배양하기 위한 기재로서도 유용하다.
본 발명의 배양 기재에 적용되는 "세포" 및 "조직"은, 생체외에서 증식시킬 수 있는 세포 및 조직인 한, 특별히 한정되지 않는다. 그 구체적인 예로는 중배엽 유래의 세포/조직을 들 수 있으며, 바람직한 예로는 결합 조직 유래의 세포/조직을 들 수 있고, 특히 바람직한 예로는 상피 세포, 연골 세포, 간 세포 및 신경아세포를 들 수 있다.
이하, 본 발명을 양태를 더욱 상세한 실시예로 설명한다. 하기 실시예에서, 퍼센트 농도는 특별히 명시하지 않는 한 중량% 농도를 의미한다.
본 실시예에서 이용된 분석 방법 등은 이하에 설명한다.
에폭시 당량의 측정은 본 명세서에서 참고로 인용하는 JIS K7236:2001에 기재된 에폭시 수지에 대한 에폭시 당량 시험 방법에 따라 수행하였다.
회전 점도의 측정은 E형 회전 점도계(TOKI RE-8OH; 도키 산요 제조)를 이용하여 수행하였다. 회전 점도가 50 Pa·s를 초과하는 생성물을 시험하는 경우, 직경 14 mm의 3°콘을 이용하여 25℃ 및 1.0 rpm에서 측정을 실시하였다. 다른 한편, 회전 점도가 50 Pa·s 이하인 생성물을 시험하는 경우, 직경 24 mm의 1°콘을 이용하여 20℃ 및 1.0 rpm에서 측정을 실시하였다. 그러나, 회전 점도가 약 50 Pa·s인 생성물을 시험하는 경우, 어느 조건에서도 측정을 실시할 수 있다.
파단 강도의 측정은 텍스쳐 분석기 TA-XT2(Texture Analyzer TA-XT2; 스테이블 마이크로 시스템스 제조)를 이용하여 실시하였다. 피검 생성물을 증류수에서 미리 충분히 팽윤시키고 6×2.5 cm 크기의 장방형으로 절단하여 피검 생성물을 얻었다. 이 생성물을 분석기의 스테이지 상에 고정하고, 이것에 직경 12.7 mm의 구형 프로브를 1 mm/sec의 속도로 추진하였다. 프로브가 생성물을 관통하는 시점에서 파단 강도를 측정하였다.
광반응성 가교기의 치환도 측정치는 글리코사미노글리칸의 반복 이당 단위에 도입된 광반응성 가교기의 수를 백분율로 나타낸 값을 의미한다. 치환도의 계산에 필요한 글리코사미노글리칸의 양은 검량선을 이용하여 카르바졸 측정법에 의해 측정하는 한편, 광반응성 가교기의 양은 검량선을 이용하여 흡광도 측정법에 의해 측정하였다.
가교율의 측정은 다음과 실시하였다. 먼저, 피검 생성물(1 g)을 1 mol/l 수산화나트륨 수용액 1 ml로 1 시간 동안 비누화하고, 얻어진 용액을 산성으로 만들고, 광반응성 가교기로부터 유도된 물질(단량체 및 이량체)을 아세트산에틸로 추출하였다. 이 추출물을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석하고, 검량법으로 이량체의 양을 측정하였다. 그 후, 글리코사미노글리칸으로 도입된 광반응성 가교기의 이량체로 전환된 광반응성 가교제의 몰수를 백분율로 나타내어 가교율로서 이용하였다.
참고예 1
광반응성 화합물의 글리시딜 에스테르의 합성
1. 신남산글리시딜의 합성
트랜스-신남산(와코 퓨어 케미칼 제조) 7.5 g에 브롬화테트라에틸암모늄(와코 퓨어 케미칼 제조) 3 g 및 에피클로로히드린(와코 퓨어 케미칼 제조) 100 ml를 첨가하고, 이 혼합물을 110℃에서 3 시간 동안 가열 환류하고, 여기에 증류수 50 ml를 첨가하고 유기층을 분리하여 80℃에서 진공 하에 농축한 후, 6 mmHg의 감압 하에 증류하였으며, 130∼160℃의 분획을 회수하여 신남산글리시딜 12 g을 얻었다. 이 신남산글리시딜의 에폭시 당량은 240.3이었다.
수득된 신남산글리시딜은 기체 크로마토그래피로 분석하였다. 기체 크로마토 그래피에서는, GC-17A(시마즈 제조)를 이용하였고, 컬럼 DB-5(막 두께: 0.5 ㎛; 내경: 0.25 mm; 길이: 30 m)를 이용하여 컬럼 온도 100℃(0∼5 분) 내지 250℃(5℃/min으로 승온)로 측정을 행하였다(도 1 참조). 그 결과, 32.6 분에서 최대의 피크가 확인되었고, 신남산글리시딜의 생성을 확인할 수 있었다.
피크 에피클로로히드린 3.6 분
트랜스-신남산 22.5 분
신남산글리시딜 32.6 분
2. 티오펜아크릴산글리시딜의 합성
트랜스-3-3-티오펜아크릴산(알드리치 제조) 2.5 g에 브롬화테트라에틸암모늄(와코 퓨어 케미칼 제조) 1 g 및 에피클로로히드린(와코 퓨어 케미칼 제조) 60 ml를 첨가하고, 이 혼합물을 110℃에서 3 시간 동안 가열 환류한 후, 여기에 증류수 30 ml를 첨가하여 유기층을 분리하고, 80℃에서 진공 하에 농축하여 티오펜아크릴산글리시딜 6.5 g을 얻었다. 이 티오펜아크릴산글리시딜의 에폭시 당량은 596.8이었다.
3. 신나밀리덴아세트산글리시딜의 합성
신나밀리덴아세트산(랭커스터 제조) 9.0 g에 브롬화테트라에틸암모늄(와코 퓨어 케미칼 제조) 3.5 g 및 에피클로로히드린(와코 퓨어 케미칼 제조) 100 ml를 첨가하고, 이 혼합물을 110℃에서 3 시간 동안 가열 환류한 후, 여기에 증류수 50 ml를 첨가하여 유기층을 분리하고, 80℃에서 진공 하에 농축하여 신나밀리덴아세트산글리시딜 17.3 g을 얻었다. 이 신나밀리덴아세트산글리시딜의 에폭시 당량은 444.3이었다.
4. 소르브산글리시딜의 합성
소르브산(와코 퓨어 케미칼 제조) 1.8 g에 브롬화테트라에틸암모늄(와코 퓨어 케미칼 제조) 1 g 및 에피클로로히드린(와코 퓨어 케미칼 제조) 60 ml를 첨가하고, 이 혼합물을 110℃에서 3 시간 동안 가열 환류한 후, 여기에 증류수 30 ml를 첨가하여 유기층을 분리하고 80℃에서 진공 하에 농축하여 소르브산글리시딜 3.5 g을 얻었다. 이 소르브산글리시딜의 에폭시 당량은 367.4였다.
실시예 1
신남산글리시딜이 도입된 히알루론산(이하, 종종 GLCN-HA라 함) 및 그 가교 생성물의 제조
1-(1). GLCN-HA의 합성(역침전법)
1 중량% 히알루론산(중량 평균 분자량: 800,000) 수용액 100 ml에 주사용수 50 ml 및 1,4-디옥산 75 ml를 첨가하고, 여기에 신남산글리시딜(에폭시 당량: 240.3) 3 ml를 첨가하고, 계속해서 50℃ 항온조에서 24 시간 동안 교반하였다.
상기 용액에 염화나트륨(1 g)을 첨가한 후 교반하고, 이 혼합물을 에탄올 800 ml에 부어, 면형 침전물을 얻었다. 이 침전물을 에탄올로 충분히 세정하고 건조시켜 GLCN-HA 1.1 g을 얻었다. 신남산글리시딜의 치환도는 2.9%였다.
1-(2). GLCN-HA의 합성(순침전법)
1-(1)에서와 동일한 방법으로 제조한 용액에 염화나트륨(1 g)을 첨가한 후 교반하고, 여기에 에탄올 500 ml를 천천히 부어 분말형 침전물을 얻었다. 이 침전 물을 에탄올로 충분히 세정하고 건조시켜 GLCN-HA 1.1 g을 얻었다. 신남산글리시딜의 치환도는 3.5%였다.
1-(3). GLCN-HA의 합성(순침전법)
60℃ 항온조에서 48 시간 동안 교반한 것을 제외하고는 1-(1)에서와 동일한 반응으로 제조한 용액에 염화나트륨(1 g)을 첨가한 후 교반하고, 여기에 에탄올 약 500 ml를 천천히 부어 분말형 침전물을 얻었다. 이 침전물을 에탄올로 충분히 세정하고 건조시켜 GLCN-HA 1.1 g을 얻었다. 신남산글리시딜의 치환도는 10.1%였다.
광가교 히알루론산 겔의 제조
1-(1)에서 제조한 GLCN-HA를 농도가 3%가 되도록 증류수에 용해하고, 얻어진 수용액을 간극 1 mm의 경질 유리 용기에 넣어, 3-kW 할로겐화금속 램프(우시오 덴키 제조)를 이용하여 한 면에 25.0 J/cm2(측정 파장: 280 nm)씩 양 면에 총 50.0 J/cm2의 선량으로 자외선을 조사하여 겔형 생성물을 얻었다. 수득된 겔형 생성물의 가교율과 이성화율을 측정한 바, 가교율은 18.4%, 이성화율은 71.4%였다.
이 겔형 생성물 0.5 ml의 회전 점도를 측정한 바 142.0 Pa·s였다. 자외선을 조사하지 않은 GLCN-HA 수용액의 회전 점도는 83.0 Pa·s였다.
이성화율은 트랜스-신남산으로부터 시스-신남산으로 전환되는 비율이다. 시스-신남산은, 트랜스-신남산이 이중 결합을 형성하기 위해서 필요한 여기 상태를 거친 후에 생성되기 때문에, 이것은 광반응이 적절히 행해졌는지를 판단하는 지표가 되며, 이 값은 미리 시스-신남산의 검량선을 제작하여 정량적으로 계산한다.
광가교 히알루론산 필름의 제조
1-(1)에서 제조한 GLCN-HA를 농도가 1%가 되도록 증류수에 용해하고, 얻어진 수용액 5 ml를 직경 50 mm의 플라스틱 페트리 디쉬에 부어 50℃ 항온조에 넣고 건조시켜 투명한 필름을 얻었다. 800-W 고압 수은 램프(오크 세이사쿠쇼 제조)로부터의 자외선으로 면당 각각 2.5 J/cm2(측정 파장: 280 nm)의 선량으로 필름의 양 면을 조사하여 수불용성인 필름형 생성물을 얻었다. 이 필름형 생성물의 가교율과 이성화율을 측정한 바, 가교율은 7.2%, 이성화율은 68.5%였다.
자외선을 조사하여 얻은 필름형 생성물을 물에 침지할 경우, 이것은 즉시 팽윤하였으며, 그대로 실온에서 수중에 1 개월 동안 방치하는 경우에도 그 형상이 여전히 유지되었다. 이 생성물의 팽윤 후 파단 강도를 측정한 바 29.8 g이었다.
광가교 히알루론산 스폰지(1)의 제조
1-(1)에서 제조한 GLCN-HA를 농도가 3%가 되도록 증류수에 용해하고, 얻어진 수용액을 고밀도 폴리에틸렌 백에 충전하고 밀봉하여 간극 1 mm의 2 장의 경질 유리판 사이에 삽입하여, -40℃의 에탄올조에서 동결시켰다. 동결 상태를 유지한 채로, 800-W 고압 수은 램프(오크 세이사쿠쇼 제조)를 이용하여 한 면당 2.0 J/cm2(측정 파장: 280 nm)의 자외선을 조사한 후 용융시켜 스폰지형 생성물[이하, GLCN-HA 스폰지(1)라 함]을 얻었다. 이 스폰지형 생성물의 가교율과 이성화율을 측정한 바, 가교율은 16.8%, 이성화율은 68.2%였다.
동결 후에 자외선을 조사하지 않고 다시 한 번 용융시킨 생성물의 경우, 이 것은 여전히 용액 상태였고 물성의 변화가 전혀 확인되지 않았다. 얻어진 스폰지형 생성물의 파단 강도를 측정한 바 178.7 g이었다.
광가교 히알루론산 스폰지(3)의 제조
1-(3)에서 제조한 GLCA-HA의 4% 수용액을 이용하고, 면당 각각 9.0 J/cm2(측정 파장: 280 nm)의 자외선을 조사한 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방법을 수행하여 스폰지형 생성물[이하, GLCN-HA 스폰지(3)라 함]을 얻었다. 이 스폰지형 생성물의 가교율과 이성화율을 측정한 바, 가교율은 39.6%, 이성화율은 66.4%였다.
광가교 히알루론산 복합재 시트(1)의 제조
1-(1)에서 제조한 GLCN-HA를 농도가 3%가 되도록 증류수에 용해하고, 얻어진 수용액을 고밀도 폴리에틸렌 백에 충전하고 밀봉하여, 간극 1 mm의 2 장의 경질 유리판 사이에 삽입하고, 800-W 고압 수은 램프(오크 세이사쿠쇼 제조)를 이용하여 양 면에 총 10 J/cm2(측정 파장: 280 nm)의 자외선을 조사하였다.
그 후, 이것을 그대로 -40℃의 에탄올조에서 동결시켰다. 동결 상태를 유지한 채로, 이것의 각 면에 0.5 J/cm2(측정 파장: 280 nm)의 자외선을 조사한 후 용융시켜 약간 백색을 띠는 반투명한 시트형 생성물[이하, GLCN-HA 시트(1)라 함]을 얻었다. 이 복합재 시트의 가교율과 이성화율을 측정한 바, 가교율은 6.0%, 이성화율은 68.5%였다. 얻어진 복합재 시트의 파단 강도를 측정한 바 110.9 g이었다.
광가교 히알루론산 복합재 시트(3)의 제조
1-(3)에서 제조한 GLCN-HA의 4% 수용액에 3-kW 할로겐화금속 램프(우시오덴키 제조)로부터의 자외선을, 면당 각각 50.0 J/cm2씩 양 면에 100.0 J/cm2(측정 파장: 280 nm)의 선량으로 조사하고, 계속해서, 800-W 고압 수은 램프(오크 세이사쿠쇼 제조)를 면당 각각 9.0 J/cm2(측정 파장: 280 nm)의 선량으로 사용한 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방법으로 동결 상태에서의 조사를 행하여, 시트형 생성물[이하, GLCN-HA 시트(3)라 함]을 얻었다. 이 복합재 시트의 가교율과 이성화율을 측정한 바, 가교율은 48.0%, 이성화율은 67.3%였다.
광가교 히알루론산 복합재 필름의 제조
상기 실시예 1-(3)에서 제조한 GLCN-HA의 4% 수용액을 고밀도 폴리에틸렌 백에 충전하고 밀봉하여, 간극 1 mm의 2 장의 경질 유리판 사이에 삽입하고, 800-W 고압 수은 램프(오크 세이사쿠쇼 제조)를 이용하여 면당 각각 5 J/cm2(측정 파장: 280 nm)씩, 즉 총 10 J/cm2의 자외선을 각 면에 조사하여 겔형 생성물을 얻었다. 그 후, 겔형 생성물을 -20℃의 주위 조건 하에 그대로 동결시켰다. 동결 상태를 유지한 채로, 800-W 고압 수은 램프를 이용하여 면당 0.2 J/cm2(측정 파장: 280 nm)씩, 즉 총 0.4 J/cm2의 선량으로 각각의 면에 자외선을 조사하였다. 그 후, 이것을 해동하여 시트형 생성물을 얻었다. 얻어진 시트형 생성물을 50℃ 항온조에 넣어 건조시킨 후, 800-W 고압 수은 램프를 이용하여 한 면당 0.2 J/cm2(측정 파장: 280 nm)씩 각각의 면에 자외선을 재차 조사하여 유백색의 반투명한 필름형 생성물을 얻었다. 이 필름형 생성물의 가교율과 이성화율을 측정한 바, 가교율은 9.8%, 이성화율은 67.8%였다.
실시예 2
티오펜아크릴산글리시딜이 도입된 히알루론산(이하, GLTA-HA라 함) 및 그 가교 생성물의 제조
티오펜아크릴산글리시딜이 도입된 히알루론산(GLTA-HA)의 합성:
1 중량% 히알루론산(중량 평균 분자량: 800,000) 수용액 100 ml에 주사용수 50 ml 및 1,4-디옥산 75 ml를 첨가하고, 여기에 티오펜아크릴산글리시딜(에폭시 당량: 596.8) 3 ml를 첨가한 후, 50℃ 항온조에서 24 시간 동안 교반하였다.
생성된 용액에 염화나트륨(1 g)을 첨가한 후 교반하고, 이 혼합물을 에탄올 800 ml에 부어 면형 침전물을 얻었다. 얻어진 침전물을 에탄올로 충분히 세정하고 건조시켜 GLTA-HA 1.1 g을 얻었다. 티오펜아크릴산글리시딜의 치환도를 측정한 바 1.4%였다.
광가교 히알루론산 겔의 제조
GLTA-HA를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 겔형 생성물의 제조 방법에서와 동일한 방법으로 겔형 생성물을 제조하였다.
이 겔형 생성물 0.5 ml의 회전 점도를 측정한 바 246.5 Pa·s였다. 자외선을 조사하지 않은 GLTA-HA 수용액의 회전 점도는 90.5 Pa·s였다.
광가교 히알루론산 필름의 제조
GLTA-HA를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 필름형 생성물의 제조 방법에서와 동일한 방법으로 수불용성 필름을 제조하였다.
자외선을 조사하여 얻은 필름을 물에 침지할 경우, 이것은 즉시 팽윤하였으며, 그대로 실온에서 수중에 1 개월 동안 방치하더라도 그 형상은 여전히 유지되었다. 이 필름의 파단 강도를 측정한 바 76.8 g이었다.
광가교 히알루론산 스폰지의 제조
GLTA-HA를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 스폰지형 생성물의 제조 방법에서와 동일한 방법으로 GLTA-HA를 광가교한 스폰지형 생성물(이하, GLTA-HA라 함)을 제조하였다. 이 스폰지형 생성물의 파단 강도를 측정한 바 92.6 g이었다.
동결 후에 자외선을 조사하지 않고 용융시킨 생성물의 경우, 이것은 여전히 용액 상태였으며 물성의 변화가 전혀 확인되지 않았다.
광가교 히알루론산 복합재 시트의 제조
GLTA-HA를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 복합재 시트의 제조 방법에서와 동일한 방법으로 약간 백색을 띠는 반투명한 시트형 생성물(이하, GLTA-HA 시트라 함)을 얻었다. 이 반투명한 복합재 시트의 파단 강도를 측정한 바 87.8 g이었다.
실시예 3
신나밀리덴아세트산글리시딜이 도입된 히알루론산(이하, GLCdN-HA라 함) 및 그 가교 생성물의 제조
신나밀리덴아세트산글리시딜이 도입된 히알루론산(GLCdN-HA)의 합성:
1 중량% 히알루론산(중량 평균 분자량: 800,000) 수용액 100 ml에 주사용수 50 ml 및 1,4-디옥산 75 ml를 첨가하고, 여기에 신나밀리덴아세트산글리시딜(에폭시 당량: 444.3) 3 ml를 첨가한 후, 50℃ 항온조에서 24 시간 동안 교반하였다. 이 용액에 염화나트륨(1 g)을 첨가한 후 교반하고, 이 혼합물을 에탄올 800 ml에 부어 면형 침전물을 얻었다. 얻어진 침전물을 에탄올로 충분히 세정하고 건조시켜 GLCdN-HA 1.1 g을 얻었다. 신나밀리덴아세트산글리시딜의 치환도를 측정한 바 3.1%였다.
광가교 히알루론산 겔의 제조
GLCdN-HA를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 겔형 생성물의 제조 방법에서와 동일한 방법으로 겔형 생성물을 제조하였다.
이 겔형 생성물 0.5 ml의 회전 점도를 측정한 바 220.0 Pa·s였다. 자외선을 조사하지 않은 GLCdN-HA의 수용액의 회전 점도는 61.0 Pa·s였다.
광가교 히알루론산 필름의 제조
GLCdN-HA를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 필름형 생성물의 제조 방법에서와 동일한 방법으로 수불용성 필름을 제조하였다.
자외선을 조사하여 제조한 필름을 물에 침지할 경우, 이것은 즉시 팽윤하였으며, 그대로 실온에서 수중에 1 개월 동안 방치하더라도 그 형상은 여전히 유지되었다.
이 필름의 파단 강도를 측정한 바 23.6 g이었다.
광가교 히알루론산 스폰지의 제조
GLCdN-HA를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 스폰지형 생성물의 제조 방법에서와 동일한 방법으로 스폰지형 생성물(이하, GLCdN-HA 스폰지라 함)을 제조하였다. 이 스폰지형 생성물의 파단 강도를 측정한 바 70.3 g이었다.
동결 후에 자외선을 조사하지 않고 용융시킨 생성물의 경우, 이것은 여전히 용액 상태였고 물성의 변화가 전혀 확인되지 않았다.
광가교 히알루론산 복합재 시트의 제조
GLCdN-HA를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 복합재 시트의 제조 방법에서와 동일한 방법으로 약간 백색을 띠는 반투명한 시트형 생성물(이하, GLCdN-HA 시트라 함)을 제조하였다.
이 반투명한 복합재 시트의 파단 강도를 측정한 바 102.2 g이었다.
실시예 4
소르브산글리시딜이 도입된 히알루론산(이하, GLSR-HA라 함) 및 그 가교 생성물의 제조
소르브산글리시딜이 도입된 히알루론산(GLSR-HA)의 합성:
1 중량% 히알루론산(중량 평균 분자량: 800,000) 수용액 100 ml에 주사용수 50 ml 및 1,4-디옥산 75 ml를 첨가하고, 여기에 소르브산글리시딜(에폭시 당량: 367.4) 3 ml를 첨가한 후, 50℃ 항온조에서 24 시간 동안 교반하였다.
이 용액에 염화나트륨(1 g)을 첨가한 후 교반하고, 이 혼합물을 에탄올 800 ml에 부어 면형 침전물을 얻었다. 얻어진 침전물을 에탄올로 충분히 세정하고 건조 시켜 GLSR-HA 1.1 g을 얻었다. 소르브산글리시딜의 치환도를 측정한 바 1.7%였다.
광가교 히알루론산 겔의 제조
GLSR-HA를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 겔형 생성물의 제조 방법에서와 동일한 방법으로 겔형 생성물을 제조하였다.
이 겔형 생성물 1.0 ml의 회전 점도를 측정한 바 51.8 Pa·s였다. 자외선을 조사하지 않은 GLSR-HA 수용액의 회전 점도는 31.1 Pa·s였다.
광가교 히알루론산 필름의 제조
GLSR-HA를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 필름형 생성물의 제조 방법에서와 동일한 방법으로 수불용성 필름형 생성물을 제조하였다. 이 필름의 파단 강도를 측정한 바 68.9 g이었다.
자외선을 조사하여 제조한 필름은 물에 침지할 경우, 이것은 즉시 팽윤하였으며, 그대로 실온에서 수중에 1 개월 동안 방치하더라도 그 형상은 여전히 유지되었다.
광가교 히알루론산 스폰지의 제조
GLSR-HA를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 스폰지형 생성물의 제조 방법에서와 동일한 방법으로 스폰지형 생성물(이하, GLSR-HA 스폰지라 함)을 제조하였다. 이 스폰지형 물질의 파단 강도를 측정한 바 35.5 g이었다.
동결 후에 자외선을 조사하지 않고 용융시킨 생성물의 경우, 이것은 여전히 용액 상태였으며 물성의 변화가 전혀 확인되지 않았다.
광가교 히알루론산 복합재 시트의 제조
GLSR-HA를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 복합재 시트의 제조 방법에서와 동일한 방법으로 약간 백색을 띠는 반투명한 시트형 생성물(이하, GLSR-HA 시트라 함)을 제조하였다.
참고예 2
신남산아미노프로필이 도입된 히알루론산(이하, 3APC-HA라 함) 및 그 가교 생성물의 제조
신남산아미노프로필이 도입된 히알루론산(3APC-HA)의 제조:
일본 특허 공개 제2002-249501호에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 요컨대, 1 중량% 히알루론산(중량 평균 분자량: 800,000) 수용액 100 ml에 증류수 50 ml 및 1,4-디옥산 75 ml를 첨가한 후, 여기에 N-히드록시숙신이미드(HOSu) 172 mg, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(EDCl·HCl) 143 mg 및 신남산아미노프로필 염산염(HCl·H2N(CH2)3OCO-CH=CH-Ph: 여기서 -Ph는 페닐임) 181 mg을 순차 첨가하여, 이 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 반응시키고, 여기에 탄산수소나트륨 0.5 g을 첨가한 후 주야 교반하고, 여기에 염화나트륨 6 g을 첨가하고 반응액에 에탄올 400 ml를 부어 침전물을 분리하였다. 침전물을 80% 에탄올로 2회 세정하여 회수한 후, 40℃에서 진공 하에 건조시켜 3APC-HA 1.0 g을 얻었다. 신남산아미노프로필의 치환도를 측정한 바 8.2%였다.
광가교 3APC-HA 스폰지의 제조
3APC-HA를 농도가 3%가 되도록 증류수에 용해시킨 수용액을 고밀도 폴리에틸 렌 백에 충전하고 밀봉하여, 간극 1 mm의 2 장의 경질 유리판 사이에 삽입하고, -40℃의 에탄올조에서 동결시켰다. 동결 상태를 유지한 채로, 면당 2.0 J/cm2(측정 파장: 280 nm)의 선량으로 그 양 면에 자외선을 조사하고 융해하여 스폰지형 생성물(이하, 3APC-HA 스폰지라 함)을 얻었다. 광가교 3APC-HA 스폰지의 가교율은 32.8%였다.
이 스폰지형 생성물의 파단 강도를 측정한 바 157.8 g이었다.
광가교 3APC-HA 복합재 시트의 제조
3APC-HA를 농도가 3%가 되도록 증류수에 용해시킨 수용액을 고밀도 폴리에틸렌 백에 충전하고 밀봉하여, 간극 1 mm의 2 장의 경질 유리판 사이에 삽입하고, 면당 각각 5.0 J/cm2(측정 파장: 280 nm)씩 그 양 면에 자외선을 조사하였다.
그 후, 이것을 -40℃의 에탄올조에서 동결시키고, 동결 상태를 유지한 채로, 면당 각각 0.5 J/cm2(측정 파장: 280 nm)의 선량으로 양 면에 자외선을 조사한 후에 융해한 바, 약간 백색을 띠는 반투명한 시트형 생성물(이하, 3APC-HA 시트라 함)을 얻었다.
광가교 3APC-HA 복합재 시트의 가교율은 5.8%였다.
이 반투명한 복합재 시트의 파단 강도를 측정한 바 181.7 g이었다.
참고예 3
디글리시딜 에테르 가교 히알루론산 스폰지의 제조
일본 특허 공개 제2002-233542호에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 요컨대, 1 중량% 히알루론산(중량 평균 분자량: 800,000) 수용액 100 ml에 디글리시딜 에테르(상품명: 데나콜 EX-303; 나가세 가세이 고교) 1 ml를 첨가하고, 얻어진 용액을, 액 두께가 약 2 mm가 되도록 폴리프로필렌제 용기에 유입시켜, 50℃ 항온조에서 9 시간 동안 정치하여 반응시킨 후, 반응액을 -80℃의 냉동고에서 급속 동결시키고 10 Pa에서 동결 건조시켰다. 계속해서, 얻어진 디글리시딜 에테르 가교 히알루론산 스폰지를 충분한 양의 주사용수로 아주 충분히 세정하였다. 이 생성물을 다시 한 번 동결 건조시켜 디글리시딜 에테르 가교 히알루론산 스폰지(이하, DGLE-HA 스폰지라 함)를 얻었다.
실시예 5
(분해성 조사)
실시예 1 내지 4와 참고예 2의 광가교 다당 생성물 각각을 시험하였다. 광가교 다당 각각에 대해 크기 2 cm×1 cm 및 두께 1 mm의 3개의 시트를 제조하였다(도 2에 도시). 이 시트를 0.5 N NaOH 수용액 중에서 교반하였다. 시트의 비누화에 요구되는 시간을 측정하여 시트의 분해성을 비교하였다. 그 결과를 도 2에 도시하며, 여기서 가로 막대는 시간의 평균값을 나타내고 "┥"는 시간의 표준 편차를 나타낸다.
판정은 시각적으로 행하였고, 0.5 N NaOH 수용액 중에 고형물이 확인되지 않는 시점을 종료 시간으로 정하였다.
도 2에서, "GLCN-HA"는 신남산글리시딜이 도입된 히알루론산이고, "GLCdN-HA"는 신나밀리덴아세트산글리시딜이 도입된 히알루론산이며, "GLTA-HA"는 티오펜 아크릴산글리시딜이 도입된 히알루론산이고, "GLSR-HA"는 소르브산글리시딜이 도입된 히알루론산이며, "3APC-HA"는 신남산아미노프로필이 도입된 히알루론산이다. "시트"는 본 발명의 복합재 시트를 의미하고, "스폰지"는 본 발명의 스폰지형 생성물을 의미한다.
대조군으로서 SepraFilmTM(젠자임 제조; 가켄 세이야쿠 판매)을 이용하였다.
도 2로부터, 3APC-HA의 경우, 스폰지 형태에서는 알칼리 비누화에 거의 1 시간이 소요되었고, 복합재 시트 형태에서도 소실에 57 초가 소요된 반면, GLCN-HA의 경우, 그 형태에 관계없이 15 초 내에 소실된 것이 확인되었다.
치환도와 가교율을 높인 GLCN-HA[GLCN-HA 스폰지(3) 및 GLCN-HA 시트(3)]에 있어서도, 그 스폰지 및 복합재 시트 형태에 관계없이 17 초 이내에 전부 소실되었다. 일반적으로 치환도 및 가교율이 높아질 경우 분해성이 저하하는 것으로 알려져 있지만, 본 발명에 있어서는 치환도 및 가교율에 관계없이 일정하게 우수한 분해성을 얻을 수 있음이 확인되었다.
실시예 6
생체내 분해성 조사
복벽 결손 및 맹장 찰상이 있는 하기의 래트를 이용하여, 유착 방지 효과 및 분해성을 조사하였다.
래트의 맹장측을 몇 차례 가볍게 찰과한 후, 복벽측에 30×40 mm의 결손부를 형성하고, 4 cm×5 cm×0.3 mm의 크기로 표 1에 기재된 광가교 다당 생성물로 피복 하였다. 7 일 후, 래트를 해부하여, 복벽과 맹장 사이의 유착의 유무 및 각각의 광가교 다당 생성물의 잔류물의 유무를 판정함으로써 유착 방지 효과 및 분해성을 조사하였다. 그 결과를 하기 표 1에 제시한다.
각각의 광가교 다당 생성물은 실시예 1, 참고예 2 및 참고예 3에 따라 제조하였다. 또한, GLCN-HA로서는 GLCN-HA 스폰지(1) 및 GLCN-HA 시트(1)를 이용하였다.
시험 결과, 신남산글리시딜이 도입된 광가교 히알루론산의 복합재 시트[GLCN-HA 시트(1)]의 경우, 3 가지 사례 전부에서 유착이 확인되지 않았다. 또한, 복합재 시트는 완전히 소실되었고, 또, 간 및 그 밖의 장기에도 이상이 확인되지 않았다.
신남산아미노프로필이 도입된 광가교 히알루론산의 복합재 시트(3APC-HA 시트)의 경우, 3 가지 사례 전부에서 유착이 확인되지 않았지만, 복합재 시트는 그 형태를 확실히 유지한 채로 잔류하고 있었다.
신남산글리시딜이 도입된 광가교 히알루론산의 스폰지[GLCN-HA 스폰지(1)]의 경우, 11 가지의 사례에서 전부 유착이 확인되지 않았다. 또한, 스폰지는 완전히 소실되었고, 또, 간 및 그 밖의 장기에도 이상이 확인되지 않았다.
신남산아미노프로필이 도입된 광가교 히알루론산의 스폰지(3APC-HA 스폰지)의 경우, 이것은 2 가지 사례 전부에서 유백색의 수지상 상태로 잔류하여, 창상부에 심각한 유착이 발생하였다.
디글리시딜 에테르 가교 히알루론산 스폰지(DGLE-HA 스폰지)의 경우, 2 가지 사례 전부에서 유착이 확인되었다. 스폰지 자체는 완전히 소실되었지만, 간 주변 영역이 비대화하여, 광범위하게 백탁이 확인되었다.
전술한 바와 같이, 3APC-HA 스폰지의 경우, 심각한 유착이 확인된 반면, GLCN-HA 스폰지의 경우, 모든 사례에 있어서 유착 방지 효과가 확인되었다. 이것은 GLCN-HA 스폰지의 분해성이 3APC-HA 스폰지의 분해성보다 우수하다는 사실에 의한 것으로 생각된다.
광반응성 다당 GLCN-HA 3APC-HA DGLE-HA

광가교 다당
복합재 시트
 분해성 소실 잔존 /
유착 방지 효과 유착 방지 유착 방지 /
장기 소견 이상 없음 이상 없음 /

광가교 다당
스폰지
 분해성 소실 잔존 소실
유착 방지 효과 유착 방지 심각한 유착 유착
장기 소견 이상 없음 이상 없음 간 백탁
실시예 7
생체내 유착 방지 효과 조사
장관 유착 토끼를 이용하여, SepraFilmTM(젠자임 제조; 가켄 세이야쿠 판매)의 유착 방지 효과와 본 발명에 따른 광가교 다당 복합재 시트의 유착 방지 효과를 비교하였다.
1. 1차 장관 유착이 있는 토끼의 제작
일본산 화이트 토끼(수컷; 약 20 주령; 체중 약 3 kg) 3 마리를 이용하였다. 할로세인(포레인; 다케다 케미칼 인더스트리즈)의 흡입 마취 하에 복부를 개복하고, 공장의 표면을 거즈를 사용하여 일정한 속도로 30회 찰과하였다. 그 후, 찰과한 공장에 인접한 회장 표면을 유사하게 찰과하였다. 찰과한 범위는 폭 15 mm, 길이 30 mm(면적: 450 mm2)였다. 그 후, 찰과한 양쪽 부위를 요오드 팅크제(3% 요오드 및 2% 요오드화칼륨)를 함침시킨 멸균 탈지면으로 덮었다. 7 분 후에 멸균 탈지면을 제거하고, 그 부위를 3 분 동안 건조시킨 후, 복벽 및 피부를 봉합하여 1차 유착이 있는 토끼를 제작하였다. 이러한 작업에 의해, 공장과 회장의 사이에 유착을 형성할 수 있었다.
2. 1차 장관 유착의 박리와 피검 물질의 투여(평가용 모델의 제작)
1차 유착이 있는 토끼 제작 후, 각 토끼를 개복하여 유착의 정도를 관찰하였다. 박막 형성을 수반한 심각한 유착이 확인된 개체를 선택하였다.
유착 부위를 수술용 현미경으로 관찰하면서 박리하고, 유착을 박리한 부위의 면적을 측정한 후, 피검 물질로서 GLCN-HA 시트(1)(실시예 6에서 이용한 것과 동일한 것) 및 SepraFilmTM을 투여하였다. 각 피검 물질은 유착 박리 부위의 면적보다 20% 정도 큰 면적으로 절단하여 유착 박리 부위에 부착시켰다. 대조군에는 아무것도 투여하지 않았다. 피검 물질을 투여한 후, 복벽 및 피부를 봉합하여 평가용 모델의 제작을 완료하였다.
3. 유착 방지 성능의 평가
평가용 모델 제작 2 주 후에 개복을 실시하여 재유착이 발생하였는지를 관찰하였다. 재유착이 발생하였을 경우 그 면적을 측정하였다. 또한, 유착을 4 단계로 스코어를 매겼다. 0: 유착 없음; 1: 경도의 유착; 2: 중간 정도의 유착; 3: 심각한 유착.
결과:
대조군에서는, 스코어 3으로 확인된 심각한 재유착이 있었다. 1차 유착 면적이 350 mm2인 것과 비교하여, 재유착 면적은 1,200 mm2였으며, 따라서 재유착 비율은 342.9%였다.
GLNC-HA 시트(1)의 경우, 1차 유착 면적이 1,900 mm2인 것과 비교하여, 전혀 재유착이 확인되지 않았고, 따라서 스코어는 0이었다. 재유착 면적은 0 mm2였으며, 재유착 비율은 0%였다.
반면, SepraFilmTM의 경우, 스코어 2으로 확인된 중간 정도의 유착이 있었고, 1차 유착 면적이 750 mm2인 것과 비교하여, 재유착 면적은 1,335 mm2였으며, 따라서 재유착 비율은 178.0%였다.
이상으로부터, GLCN-HA 시트가 SepraFilmTM보다 더욱 우수한 유착 방지 효과를 나타내는 것이 분명하다.
실시예 8
래트 자궁각 모델을 이용한 유착 방지 성능의 조사
래트 자궁각 모델은 토끼 장관 재유착 모델보다도 더욱 심각한 유착을 나타내는 것으로 알려져 있기 때문에, 이러한 모델을 이용하여 유착 방지 성능을 추가로 조사하였다.
1. 모델의 제작
래트로서 Crj:SD 계(SPF.) 암컷 래트(7 주령)를 이용하였고, 시험 전 1 주일 간의 예비 사육을 실시한 후, 본 시험에 사용하였다.
넴부탈 마취 하에 래트 복부의 털을 잘라낸 후, 약 4 cm의 정중선 절개를 하고, (a) 래트의 우측 복벽을 안과용 트레판(trepan; 외과용 톱)을 이용하여 근육층까지 절개하고 근육층을 한 쌍의 핀셋으로 박리하였다. (b) 계속해서, 자궁각을 노출시킨 후, 난소로부터 자궁 경부로 향하여 약 1 cm의 부위에서 2∼3 mm 간격으로 4 곳에 가로 절개를 하고, 창상부의 출혈은 전기 메스로 적절히 지혈하였다. (c) 자궁각 가로 절개부 말단으로부터 약 3∼4 mm의 부위와, 복벽 결손부 말단으로부터 약 3∼4 mm의 부위를 8/0의 방사로 한땀 봉합하여, (a) 및 (b)에서 형성된 창상부를 가까이 하였다.
2. 피검 물질의 투여
복벽 결손부와 자궁각 창상부 사이에, 2.0 cm×1.0 cm 크기의 GLCN-HA 시트(3) 및 SepraFilmTM을 삽입하여 이것을 시험군으로서 이용하였다. 각 군은 10 마리의 래트로 구성되었다.
3. 평가
평가는 다음과 같이 수행한다. 구체적으로 설명하면, 매립 7 일 후, 래트를 에테르 마취 하에 경동맥으로부터 방혈하여 도살하고 해부하여, 유착 발생 부위를 유착의 정도에 따라 하기의 스코어 시스템으로 평가하였다: 0 - 유착 없음; 1 - 경도의 유착, 용이하게 박리됨; 2 - 중간 정도의 유착, 박리 가능; 3 - 심각한 유착, 박리 불가능.
4. 결과
판정 결과를 하기 표 2에 기재한다.
스코어 GLCN-HA 시트(3) SepraFilmTM
0 8 0
1 2 7
2 0 3
3 0 0
유착 방지 스코어 8/10 0/10
본 유착 모델에 있어서는, SepraFilmTM의 경우, 래트 10 마리 전부에서 유착이 확인되어, 효과가 전혀 나타나지 않은 반면, 본 발명에 따른 GLCN-HA 시트(3)의 경우, 래트 10 마리 중 8 마리에서 유착이 방지되었다.
이상의 결과로부터, GLCN-HA 시트는 충분한 유착 방지 효과를 보유하는 것이 분명해졌다.
지금까지 본 발명을 특정 실시형태와 관련하여 상세히 기술하였지만, 당업자에게는 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않도록 본 명세서에 기재된 개시 내용에 다양한 변경 및 수정이 이루어질 수 있음이 명백하다.
본 출원은 2004년 9월 15일에 출원된 일본 출원 제2004-268145호에 기초한 것이며, 상기 제2004-268145호의 전체 내용은 본 명세서에서 참고로 인용한다. 본 명세서에서 인용된 다른 모든 참고 문헌은 그 전체가 참고로 인용된다.
본 발명은, 분자 내에 카르복실기 및 불포화 탄소 이중 결합을 갖는 광반응성 화합물의 글리시딜 에스테르가 다당에 결합되어 있는 광반응성 다당을 광가교함으로써 제조되는 광가교 생성물로서의 광가교 다당을 제공한다. 광가교 생성물의 다양한 형태를 제공할 수 있다. 상기 광가교 다당은 강도 및 생분해성이 우수하며, 또한 종래의 광가교 글리코사미노글리칸 겔 및 스폰지의 우수한 특징이 상기 광가교 다당에 여전히 유지된다. 따라서, 본 발명의 광가교 다당을 사용함으로써 의료용 제품, 특히 수술 후 유착 방지재, 약제 서방용 기재 또는 세포 배양용 기재를 제공하는 것이 가능하다.

Claims (21)

  1. 하기 화학식 (1)로 표시되는 글리시딜 에스테르에 공유 결합된 히알루론산을 포함하는 광반응성 다당:
    Figure 112012098904715-pct00016
    상기 식 중, R1-CO-는 하나 이상의 카르복실기 및 불포화 탄소 이중 결합을 갖는 광반응성 화합물의 잔기를 나타내며, 광반응성 화합물은 신남산, 티오펜아크릴산, 신나밀리덴아세트산 및 소르브산으로 구성되는 군에서 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, 공유 결합이 에스테르 결합인 광반응성 다당.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 광반응성 화합물이 신남산인 광반응성 다당.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제1항에 기재된 광반응성 다당을 가교하여 제조한 광가교 다당.
  13. 제1항에 기재된 광반응성 다당의 용액에 광을 조사하여 제조한 겔형 광가교 다당.
  14. 제1항에 기재된 광반응성 다당의 용액을 동결 또는 동결 건조시키는 단계 및 얻어진 동결 용액 또는 동결 건조물에 광을 조사하는 단계에 의해 제조한 스폰지형 광가교 다당.
  15. (a) 제1항에 기재된 광반응성 다당의 용액에 광을 조사하여 겔형 생성물을 얻는 단계;
    상기 겔형 생성물을 동결시키는 단계; 및
    동결 상태를 유지한 채로 상기 동결된 겔형 생성물에 광을 조사하는 단계에 의해 제조하거나; 또는
    (b) 제1항에 기재된 광반응성 다당의 용액에 광을 조사하여 겔형 생성물을 얻는 단계;
    상기 겔형 생성물을 동결 건조시키는 단계; 및
    상기 동결 건조된 겔형 생성물에 광을 조사하는 단계에 의해 제조한, 겔형 생성물의 특성과 스폰지형 생성물의 특성을 둘 다 갖는 광가교 다당.
  16. 제1항에 기재된 광반응성 다당의 용액을 건조시켜 그 필름을 얻는 단계 및 상기 필름에 광을 조사하는 단계에 의해 제조한 필름형 광가교 다당.
  17. 제1항에 기재된 광반응성 다당의 용액에 광을 조사하여 겔형 생성물을 얻는 단계;
    상기 겔형 생성물을 동결시키는 단계;
    동결 상태를 유지한 채로 상기 동결된 겔형 생성물에 광을 조사하여 겔형 생성물의 특성과 스폰지형 생성물의 특성을 둘 다 갖는 조성물을 얻는 단계;
    상기 조성물을 건조시키는 단계; 및
    그와 같이 건조된 조성물에 광을 조사하는 단계
    를 포함하는 공정에 의해 제조한 광가교 다당.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 광가교 다당을 포함하는 의료용 제품.
  19. 제18항에 있어서, 유착 방지재로서 사용되는 것인 의료용 제품.
  20. 제18항에 있어서, 약제 서방용 기재로서 사용되는 것인 의료용 제품.
  21. 제18항에 있어서, 세포 배양용 기재로서 사용되는 것인 의료용 제품.
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