HU202921B - Process for producing coding dns for human tumor necrosis factor the corresponding polypeptide with utilizing them and pharmaceutical compositions containing this polypeptide as active component - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás

1) humán tumor nekrózis faktor polipeptidnek, vagy annak fő részének vagy részeinek, vagy a humán nekrózis faktor polipeptidet kódoló DNS alléi mutánsából származó polipeptidnek - továbbiakban alléi mutáns polipetid - megfelelő bázisszekvenciát tartalmazó DNS, előállítására;

2) a fenti DNS-t tartalmazó vektor előállítására, a vektor gazdaszervezetbe való bevitelére, és ennek segítségével a DNS-nek megfelelő polipeptid - azaz a humán tumor nekrózis faktornak, vagy annak fő részének vagy részeinek megfelelő polipeptid, vagy egy humán tumor nekrózis faktorhoz hasonló anyag, vagy annak fő része vagy részei, - előállítására a gazdaszervezetben;

3) a fenti polipeptidet vagy anyagokat tartalmazó tumorellenes hatású gyógyszerkészítmények előállítására.

Carswell és munkatársai felfedezték, hogy a Calmette-Guérin bacilussal (BCG) fertőzött, majd endotoxinnal kezelt egerek széruma olyan anyagot tartalmaz, amely elöli a transzplantált Meth A szarkómát. A fenti anyagot tumor nekrózis faktornak - továbbiakban TNF - nevezték el [Proc. Nat. Acad. Sci. USA,

72, 3666 (1975)].

A TNF-et egy, a makrofágokból felszabaduló, fiziológiailag aktív anyagnak tekintik, amelyre az jellemző, hogy

i) ha bizonyos fajta tumort - például Meth A szarkómát - hordozó állatnak beadják, a tumort elpusztítja, és az állat meggyógyul;

ii) bizonyos fajta tumorsejtekkel - például egér L-sejt - szemben in vitro citotoxikus hatást mutat, míg a normál sejteket alig károsítja; és iii) aktivitása nem faj-specifikus állatban.

Fenti tulajdonságai következtében a TNF-et mint új típusú tumorellenes szert érdemes kifejleszteni.

TNF-et, illetve TN-szerű anyagot ismertetnek az alábbi irodalmi helyeken:

Green és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA,

73, 381 (1976); Matthews és munkatársai: Br. J. Cancer, 42, 416 (1980); Ruff és munkatársai: J. Immunoi., 125, 1671 (1980); Mánnel és munkatársai: Infect. Immunty, 28, 204 (1980); Haranaka és munkatársai: Japán J. Exp. Med., 51, 191 (1981); továbbá a 90892 és 86475 közzétételi számú európai szabadalmi leírásban és a 21621/1983 közzétételi számú japán szabadalmi leírásban.

A fenti irodalmi helyeken ismertetett leírások szerint a TNF-et nyúl, egér, hörcsög vagy tengerimalac szövetekből vagy test-folyadékokból - például vérből - állítják elő, tisztítással. A termékeket azonban nem definiálják pontosan, és nyilvánvalóan különböző korlátái is vannak ezeknek az eljárásoknak, a nyersanyagforrások és a végtermék tisztaságának tekintetében.

Immunológiai szempontból klinikai alkalmazásra humán eredetű TNF lenne a legmegfelelőbb tumorellenes szer. A fenti ismert eljárásokat azonban nem lehet humán TNF előállítására alkalmazni.

Humán eredetű tumorellenes hatású citotoxinként ismertek a humán perifériás monociták és humán mielocitás monocita leukémia sejtek által termelt citotoxinok [Matthews: Immunology, 44, 135 (1981)]; humán perifériás vérsejtekhez tartozó sejtek által termelt citotoxinok [Reed és munkatársai: J. Immunoi., 115, 395 (1975)]; és a humán B-sejt-vonalak által termelt citotoxinok [Williamson és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 80, 5397 (1983)]. A fenti anyagok citotoxikus aktivitással rendelkeznek, de nincsenek világosan definiálva ezek sem.

A találmány szerinti, rekombináns DNS technológián alapuló eljárással sikerült a humán TNF polipeptidet kódoló cDNS-t klónozni. A kutatások során azt is kimutattuk, hogy a humán TNF cDNS kódolja a prekurzor polipeptidet is. A találmány szerinti eljárással sikerült továbbá egy gazdaszervezetbe bevitt, klónozott humán TNF cDNS-t tartalmazó expressziós vektor segítségével a gazdaszervezetben humán TNF polipeptidet előállítani, és azt a homogenitás eléréséig tisztítani.

A leírásban az egyszerűség kedvéért az alábbi rövidítéseket alkalmazzuk.

A	adenin
C	citozin
G	guanin
T	timin
Alá	alanin
Arg	arginin
Asn	aszparagin
Asp	aszparaginsav
Cys	cisztein
Gin	glutamin
Glu	glutaminsav
Gly	glicin
His	hisztidin
Ile	izoleucin
Leu	leucin
Lys	lizin
Met	metionin
Phe	fenilalanin
Pro	prolin
Ser	szerin
Thr	treonin
Trp	triptofán
Tyr	tirozin
Val	valin
DNS	dezoxiribonukleinsav
cDNS	komlementer DNS
sscDNS	egyszálú cDNS
dscDNS	kettős szálú DNS
RNS	ribonukleinsav
mRNS	messenger-RNS
poli(A)mRNS	poli(A)-t tartalmazó mRNS
dATP	dezoxiadenozin-trifoszfát
dCTP	dezoxicitidin-trifoszfát
dGTP	dezoxiguanozin-trifoszfát
dTTP	dezoxitimidin-trifoszfát
oligo(dC)	oligodezoxicitidinsav
oligo(dG)	oligodezoxiguanilsav
oligo(dT)	oligodezoxitimidilsav

HU 202 921 Β

poli(A)	poliadenilsav
poli(U)	poliuridilsav
poli(dC)	polidezoxicitidilsav
poli(dG)	polidezoxiguanilsav
ATP	adenozin-trifoszfát
EDTA	etiléndiamin-tetraecetsav
kb	kilobázis (ezer bázis)
kbp	kilobázispár
bp	bázispár
Meth A szarkóma	metil-kolantrénnel indukált szarkóma
TNF	tumor nekrózis faktor
rHu-TNF	rekombináns humán TNF

A leírásban az egyszálú bázisszekvencia az értelmes 15 szál bázisszekvenciáját jelenti, és a bal vége az 5’-vég, a jobb oldali a 3’-vég. Az aminosavszekvenciában a bal oldali vég az N-terminális, a jobb oldali vég a Cterminális.

A találmány szerinti eljárást részleteiben, az előz- 20 ményeket is beleértve az alábbiakban ismertetjük.

[1-1] Nyúl TNF-et kódoló DNS, és a nyúl TNF

Rekombináns DNS technológiát alkalmazva sikerült kutatásaink során klónozni a nyúl TNF-et kódoló 25 cDNS-t, és felderíteni a nyúl TNF szerkezetét. Közelebbről, nyúl makrofágokat in vitro megfelelő indukáló anyagokkal együtt tenyésztettünk, megbizonyosodtunk róla, hogy nyúl TNF keletkezett és a táptalajba ürült. Ezt követően olyan tenyésztési körülményeket 30 kerestünk, amelyek között a makrofágokban nagy koncentrációban képződött és felhalmozódott a nyúl TNF 1-1. táblázat: (1-1) képletű DNS-szekvencia

(5’)—	TCA	GCT	TCT	CGG	GCC	CTG	AGT	GAC	AAG
CCT	CTA	GCC	CAC	GTA	GTA	GCA	AAC	CCG	CAA
GTG	GAG	GGC	CAG	CTC	CAG	TGG	CTG	AGC	CAG
CGT	GCG	AAC	GCC	CTG	CTG	GCC	AAC	GGC	ATG
AAG	CTC	ACG	GAC	AAC	CAG	CTG	CTG	GTG	CCG
GCC	GAC	GGG	CTG	TAC	CTC	ATC	TAC	TCC	CAG
GTT	CTC	TTC	AGC	GGT	CAA	GGC	TGC	GCG	TCC
TAC	GTG	CTC	CTC	ACT	CAC	ACT	GTC	AGC	CGC
TTC	GCC	GTC	TCC	TAC	CCG	AAC	AAG	GTC	AAC
CTC	CTC	TCT	GCC	ATC	AAG	AGC	CCC	TGC	CAC
CGG	GAC	ACC	CCC	GAG	GAG	GCT	GAC	CCC	ATG
GCC	TGG	TAC	GAG	CCC	ATC	TAC	CTG	GGC	GGC
GTC	TTC	CAG	TTG	GAG	AAG	GGT	GAC	CGG	CTC
AGC	ACC	GAG	GTC	AAC	CAG	CCT	GAG	TAC	CTG
GAC	CTT	GCC	GAG	TCC	GGG	CAG	GTC	TAC	TTT
GGG	ATC	ATT	GCC	CTG-(3’)

mRNS. Ezután sikerült klónoztunk a nyúl TNF-et kódoló cDNS-t, és meghatároznunk bázisszekvenciáját, és azt is kimutattuk, hogy a nyúl TNF mint prekurzor keletkezik. Sikerült továbbá klónozott cDNS-t hordozó expressziós vektort bevinnünk egy gazdaszervezetbe, és ott nyúl TNF-et termelni.

A nyúl TNF-et kódoló cDNS-t és a nyúl TNF-et részletesen például a 677 680 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás és a 84 114 325.8 számú európai szabadalmi leírás ismerteti. Lényegüket az alábbiakban foglalhatjuk össze.

A biológiailag aktív nyúl TNF-et kódoló jellegzetes DNS-szekvenciát az 1-1. táblázatban közölt (1-1) képlet jellemzi.

Az (1-1) képletű bázisszekvenciával rendelkező DNS az 1-2. táblázatban közölt (1-2) képletű polipeptidet kódolja.

A nyúl TNF-et kódoló DNS kódolja a nyúl TNF egy prekurzorát. A nyúl TNF perkurzorát kódoló jellegzetes DNS szerkezetét a 2-1. táblázatban megadott (2-1) képlet jellemzi, vagy egy olyan DNS, amelyet úgy kapunk, hogy a DNS 5’-végéhez egy ATG triplettet adunk.

A (2-1) képletű bázisszekvenciát tartalmazó DNS a 2-2. táblázatban ismertetett (2-2) képletű polipeptidet kódolja.

Az (1-2) képletű aminosavszekvenciával rendelkező polipeptid, azaz a biológiailag aktív nyúl TNF nem faj-specifikus, és tumorellenes szerként használható, mivel tumorsejtekkel szemben szelektív citotoxikus hatást fejt ki, és tumoros állatokban a tumort visszafejleszti.

1-2. táblázat: (1-2) képletű polipeptid

Ser	Alá	Ser	Arg	Alá	Leu	Ser	Asp	Lys	Pro
Leu	Alá	His	Val	Val	Alá	Asn	Pro	Gin	Val
Glu	Gly	Gin	Leu	Gin	Trp	Leu	Ser	Gin	Arg
Alá	Asn	Alá	Leu	Leu	Alá	Asn	Gly	Met	Lys
Leu	Thr	Asp	Asn	Gin	Leu	Val	Val	Pro	Alá
Asp	Gly	Leu	Tyr	Leu	He	Tyr	Ser	Gin	Val
Leu	Phe	Ser	Gly	Gin	Gly	Cys	Arg	Ser	Tyr
Val	Leu	Leu	Thr	His	Thr	Val	Ser	Arg	Phe

HU 202 921 Β

Alá	Val	Ser	Tyr	Pro	Asn	Lys	Val	Asn	Leu
Leu	Ser	Alá	Ile	Lys	Ser	Pro	Cys	His	Arg
Glu	Thr	Pro	Glu	Glu	Alá	Glu	Pro	Met	Alá
Trp	Tyr	Glu	Pro	Ile	Tyr	Leu	Gly	Gly	Val
Phe	Gin	Leu	Glu	Lys	Gly	Asp	Arg	Leu	Ser
Thr	Glu	Val	Asn	Gin	Pro	Glu	Tyr	Leu	Asp
Leu	Alá	Glu	Ser	Gly	Gin	Val	Tyr	Phe	Gly
Ile	Ile	Alá	Leu

2-1. táblázat: (2-1) képletű DNS-szekvencia

(5’)-	AGC	ACT	GAG	AGT	ATG	ATC	CGG	GAC	GTC
GAG	CTG	GCG	GAG	GGG	CCG	CTC	CCC	AAG	AAG
GCA	GGG	GGG	CCC	CAG	GGC	TCC	AAG	CGC	TGC
CTC	TGC	CTC	AGC	CTC	TTC	TCT	TTC	CTG	CTC
GTG	GCT	GGA	GCC	ACC	ACG	CTC	TTC	TGC	CTG
CTG	CAC	TTC	AGG	GTG	ATC	GGC	CCT	CAG	CAG
GAA	GAG	CAG	TCC	CCA	AAC	AAC	CTC	CAT	CTA
GTC	AAC	CCT	GTG	GCC	CAG	ATG	GTC	ACC	CTC
AGA	TCA	GCT	TCT	CGG	GCC	CTG	AGT	GAC	AAG
CCT	CTA	GCC	CAG	GTA	GTA	GCA	AAC	CCG	CAA
GTG	GAG	GGC	CAG	CTC	CAG	TGG	CTG	AGC	CAG
CGT	GCG	AAC	GCC	CTG	CTG	GCC	AAC	GGC	ATG
AAG	CTC	ACG	GAC	AAC	CAG	CTG	GTG	GTG	CCG
GCC	GAC	GGG	CTG	TAC	CTC	ATC	TAC	TCC	CAG
GTT	CTC	TTC	AGC	GGT	CAA	GGC	TGC	CGC	TCC
TAC	GTG	CTC	CTC	ACT	CAC	ACT	GTC	AGC	CGC
TTC	GCC	GTC	TCC	TAC	CCG	AAC	AAG	GTC	AAC
CTC	CTC	TCT	GCC	ATC	AAG	AGC	CCC	TGC	CAC
CGG	GAC	ACC	CCC	GAG	GAG	GCT	GAG	CCC	ATG
GCC	TGG	TAC	GAG	CCC	ATC	TAC	CTG	GGC	GGC
GTC	TTC	CAG	TTG	GAG	AAG	GGT	GAC	CGG	CTC
AGC	ACC	GAG	GTC	AAC	CAG	CCT	GAG	TAC	CTG
GAC	CTT	GCC	GAG	TCC	GGG	CAG	GTC	TAC	TTT
GGG	ATC	ATT	GCC	CTG-(3’)

2-2. táblázat: (2-2) képletű polipeptid

Ser	Thr	Glu	Ser	Met	Ile	Arg	Asp	Val	Glu
Leu	Alá	Glu	Gly	Pro	Leu	Pro	Lys	Lys	Alá
Gly	Gly	Pro	Gin	Gly	Ser	Lys	Arg	Cys	Leu
Cys	Leu	Ser	Leu	Phe	Ser	Phe	Leu	Leu	Val
Alá	Gly	Alá	Thr	Thr	Leu	Phe	Cys	Leu	Leu
His	Phe	Arg	Val	Ile	Gly	Pro	Gin	Glu	Glu
Glu	Gin	Ser	Pro	Asn	Asn	Leu	His	Leu	Val
Asn	Pro	Val	Alá	Gin	Met	Val	Thr	Leu	Arg
Ser	Alá	Ser	Arg	Alá	Leu	Ser	Asp	Lys	Pro
Leu	Alá	His	Val	Val	Alá	Asn	Pro	Gin	Val
Glu	Gly	Gin	Leu	Gin	Trp	Leu	Ser	Gin	Arg
Alá	Asn	Alá	Leu	Leu	Alá	Asn	Gly	Met	Lys
Leu	Thr	Asp	Asn	Gin	Leu	Val	Val	Pro	Alá
Asp	Gly	Leu	Tyr	Leu	Ile	Tyr	Ser	Gin	Val
Leu	Phe	Ser	Gly	Gin	Gly	Cys	Arg	Ser	Tyr
Val	Leu	Leu	Thr	His	Thr	Val	Ser	Arg	Phe
Alá	Val	Ser	Tyr	Pro	Asn	Lys	Val	Asn	Leu
Leu	Ser	Alá	Ile	Lys	Ser	Pro	Cys	His	Arg
Glu	Thr	Pro	Glu	Glu	Alá	Glu	Pro	Met	Alá
Trp	Tyr	Glu	Pro	Ile	Tyr	Leu	Gly	Gly	Val
Phe	Gin	Leu	Glu	Lys	Gly	Asp	Arg	Leu	Ser
Thr	Glu	Val	Asn	Gin	Pro	Glu	Tyr	Leu	Asp
Leu	Alá	Glu	Ser	Gly	Gin	Val	Tyr	Phe	Gly
Ile	Ile	Alá	Leu

HU 202 921 Β

A 3. táblázatban látható a nyúl TNF-et kódoló cDNS-nak megfelelő bázisszekvencia egy példája. A 2-1. táblázatban látható bázisszekvencia a 3. táblázatban közölt bázisszekvencia 37-738. bázisának felel meg. Az első 15 bázis egy oligo(dG)-végcsoport, melyet a cDNS-nek a vektorba való illesztése céljából adtunk a molekulához.

3. táblázat: cDNS bázisszekvenciája

20, 30

GGGGGGGGGG GGGGGCCCTC TGGAGAGAGC CCCCCGGGAG ACCTCTCTpG I Q cccccccccc

80 ' 90

GTCGAGCTGG CGGAGGGGCC GCTCCCCAAÓ CAGCTCGACC GCCTCCCCGG CGAGGGGTTC 130 140 150

TGCCTCTGCC TCAGCCTCTT CTCTTTCCTG ACGGAGACGG AGTCGGAGAA GAGAAAGGAC

190 200

CTGCTGCACT TCAGGGTGAT

GACGACGTGA

250

CTAGTCAACC

210

CGGCCCTCAG AGTCCCACTA GCCGGGAGTC

260

CTGTGGCCCÁ

GATCAGTTGG GACACCGGGT

310

AAGCCTCTAG

TTCGGAGATC

370

CAGCGTGCGÁ

320

270

GATGGTCACC

CTACCAGTGG

330

CCCACGTAGT AGCAAACCCG GGGTGCATCA TCGTTTGGGC

380

390

ACGCCCTGCT GGCCAACGGC

GTCGCACGCT TGCGGGACGA CCGGTTGCCG

Haell 40 50

GqCATGAGCÁ CTGAGAGTAT CGGTACTCGT GACTCTCATA 100 110

AAGGCAGGGGGGCCCCAGGG TTCCGTCCCC CCGGGGTCCC 160 17Ó

CTCGTGGCTG GAGCCACCAC GAGCACCGAC CTCGGTGGTG 220 230

GAGGAAGAGC AGTCCCCAAÁ CTCCTCGCTC GTCAGGGGTT 280 Aval 290 CTCAGATCAG CTTCjTCGGrGC GAGTCTAGTCGAAGAGCdCG 340 350

CAAGTGGAGG GCCAGCTCCÁ GTTCACCTCC CGGTCGAGGT 400 410

ATGAAGCTCAC GGACAACCÁ TACTTCGAGT GCCTGTTGGT

GATCCGGGAC

CTAGGCCCTG

120

CTCCAAGCGC

GAGGTTfcGCG Haell 180 GCTCTTCTGC

CGAGAAGACG

240

CAACCTCCAT

TGTTGGAGGTA

300

CCTGAGTGAC

GAACTCACTG

360

GTGGCTGAGC

CACCGACTCG

420

GCTGGTGGTG

CGACCACCAC

3. táblázat (folytatás)

430

440

450

460

470

480

CCGGCCGACGGGCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTTCTCTTCAGCGGTCAAGGCTGCCGC

GGCCGGCTGCCCGACATGGAGTAGATGAGGGTCCAAGAGAAGTCGCCAGTTCCGACGGCG

490

530

540

500 510 520

TCCTACGTGCTCCTCACTCÁCACTGTCAGCCGCTTCGCCGTCTCCTACCCGAACAAGGTC

AGGATGCACGAGGAGTGAGTGTGACAGTCGGCGAAGCGGCAGAGGATGGGCTTGTTCCAG

550 560 570 580 I 590 600

AACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCACCGGGAGÁcCcLxGffiGÁGGCTGAGCgC

TTGGAGGAGAGACGGTAGTTCTCGGGGACGGTGGCCCTCTGGGGGCT1CCTCCGACTCGGG

Ava |

610 620 630 640 *650 660

ATGGCCTGGTACGAGCCCATCTACCTGGGCGGCGTCTTCCAGTTGGAGAAGGGTGACCGG

TACCGGACCATGCTCGGGTAGATGGACCCGCCGCAGAAGGTCAACCTCTTCCCACTGGCC

670 680 690 700 710 720 • · ι l ι i

CTCAGCACCGAGGTCAACCAGCCTGAGTACCTGGACCTTGCCGAGTCCGGGCAGGTCTAC

GAGTCGTGGCTCCAGTTGGTCGGACTCATGGACCTGGAACGGCTCAGGCCCGTCCAGATG

730 740 750 760 770 780

TTTGGGATCATTGCCCTGTGAGGGGACTGACCACCACTCCTCCCCCTCTCCCACCCCAGC

AAACCCTAGTAACGGGACACTCCCCTGACTGGTGGTGAGGAGGGGGAGAGGGTGGGGTCG

790 800

CCCCÍTCACTCTGGGCGCCCTCAG

GGGGAGTGAGACCCGCGGGAGTC

HU 202 921 Β [1-2] A találmány szerinti eljárással előállított DNSek humán tumor nekrózis faktornak (humán TNF), vagy annak fő része(i)nek, vagy alléi mutáns polipeptidjének megfelelő bázisszekvenciájúak, vagy ilyen bázisszekvenciát tartalmaznak, vagy a fenti bázisszekvencia módosításával nyerhetők. Közelebbről, a találmány szerinti eljárással előállított DNS-ek az (I) általános képletű aminosavszekvenciának (Y)p-(X)n-(B)_m-A a) megfelelő bázisszekvenciájúak, vagy olyan bázisszekvenciát tartalmaznak, amelyben egy fenti bázisszekvencia 3'-végéhez egy terminációs kodon kapcsolódik. Az (I) általános képletben

A jelentése (la) képletű polipeptid, amelyből egy vagy több aminosav hiányozhat, vagy amelyben egy vagy több aminosav más aminosavval lehet helyettesítve, de a homológia mértéke legalább 95%;

B jelentése (Ib) képletű peptid, amelyből 1-3 aminosav hiányozhat,

X jelentése az érett TNF-ben nem szereplő, teljes vagy részleges prekurzor szekvencia

Y jelentése Met és 10 m, n és p értéke 1 vagy 0.

Az (la) képletű polipeptid aminosavszekvenciája az alábbi:

Thr	Pro	Ser	Asp	Lys
Val	Ala	Asn	Pro	Gin
Gin	Trp	Leu	Asn	Arg
Leu	Ala	Asn	Gly	Val
Gin	Leu	Val	Val	Pro
Leu	Ile	Tyr	Ser	Gin
Gin	Gly	Cys	Pro	Ser
Thr	His	Thr	Ile	Ser
Tyr	Gin	Thr	Lys	Val
Ile	Lys	Ser	Pro	Cys
Glu	Gly	Ala	Glu	Ala
Pro	Ile	Tyr	Leu	Gly
Glu	Lys	Gly	Asp	Arg
Asn	Arg	Pro	Asp	Tyr
Ser	Gly	Gin	Val	Tyr

Leu

Pro	Val	Ala	His	Val
Ala	Glu	Gly	Gin	Leu
Arg	Ala	Asn	Ala	Leu
Glu	Leu	Arg	Asp	Asn
Ser	Glu	Gly	Leu	Tyr
Val	Leu	Phe	Lys	Gly
Thr	His	Val	Leu	Leu
Arg	Ile	Ala	Val	Ser
Asn	Leu	Leu	Ser	Ala
Gin	Arg	Glu	Thr	Pro
Lys	Pro	Trp	Tyr	Glu
Gly	Val	Phe	Gin	Leu
Leu	Ser	Ala	Glu	Ile
Leu	Asp	Phe	Ala	Glu
Phe	Gly	Ile	Ile	Ala

Az (Ib) képletű peptid aminosavszekvenciája a következő:

Ser -Ser -Ser -Arg (Ib)

Az (I) általános képletben X előnyösen egy (Ic) képletű polipeptidet jelent.

Ser	Thr	Glu	Ser	Met	Ile	Arg	Asp	Val	Glu
Leu	Ala	Glu	Glu	Ala	Leu	Pro	Lys	Lys	Thr
Gly	Gly	Pro	Gin	Gly	Ser	Arg	Arg	Cys	Leu
Phe	Leu	Ser	Leu	Phe	Ser	Phe	Leu	Ile	Val (Ic)
Ala	Gly	Ala	Thr	Thr	Leu	Phe	Cys	Leu	Leu
His	Phe	Gly	Val	Ile	Gly	Pro	Gin	Arg	Glu
Glu	Phe	Pro	Arg	Asp	Leu	Ser	Leu	Ile	Ser
Pro	Leu	Ala	Gin	Ala	Val	Arg

A fenti (la), (Ib) és (Ic) képletű aminosav-szekvenciáknak az alábbi (Ha), (Ilb) és (IIc) képletű bázisszekvenciák felelnek meg.

(5’)-	ACC	CCG	AGT	GAC	AAG	CCT	GTA	GCC
CAT	GTT	GTA	GCA	AAC	CCT	CAA	GCT	GAG	GGG
CAG	CTC	CAG	TGG	CTG	AAC	CGC	CGG	GCC	AAT
GCC	CTC	CTG	GCC	AAT	GGC	GTG	GAG	CTG	AGA
GAT	AAC	CAG	CTG	GTG	GTG	CCA	TCA	CAG	GGC
CTG	TAC	CTC	ATC	TAC	TCC	CAG	GTC	CTC	TTC
AAG	GGC	CAA	GGC	TGC	CCC	TCC	ACC	CAT	GTG
CTC	CTC	ACC	CAC	ACC	ATC	AGC	CGC	ATC	GCC
GTC	TCC	TAC	CAG	ACC	AAG	GTC	AAC	CTC	CTC
TCT	GCC	ATC	AAG	AGC	CCC	TGC	CAG	AGG	GAG
ACC	CCA	GAG	GGG	GCT	GAG	GCC	AAG	CCC	TGG
TAT	GAG	CCC	ATC	TAT	CTG	GGA	GGG	GTC	TTC
CAG	CTG	GAG	AAG	GGT	GAC	CGA	CTC	AGC	GCT

HU 202 921 Β

GAG	ATC	AAT	CGG	CCC	GAC	TAT	CTC	GAC	TTT
GCC	GAG	TCT	GGG	CAG	GTC	TAC	TTT	GGG	ATC
ATT	GCC	CTG-(3’)
(5’)-	TCA - CT	-TCT -	CGA -	(3’)
(5’)-	AGC	ACT	GAA	AGC	ATG	ATC	CGG	GAC
GTG	GAG	CTG	GCC	GAG	GAG	GCG	CTC	CCC	AAG
AAG	ACA	GGG	GGG	CCC	CAG	GGC	TCC	AGG	CGG
TGC	TTG	TTC	CTC	AGC	CTC	TTC	TCC	TTC	CTG
ATC	GTG	GCA	GGC	GCC	ACC	ACG	CTC	TTC	TGC
CTG	CTG	CAC	TTT	GGA	GTG	ATC	GGC	CCC	CAG
AGG	GAA	GAG	TTC	CCC	AGG	GAC	CTC	TCT	CTA
ATC	AGC	CCT	CTG	GCC	CAG	GCA	GTA	AGA-(3’)

A találmány szerinti eljárással az alábbi DNS-ek állíthatók elő:

1) humán TNF polipeptidet, vagy annak fő részét vagy részeit kódoló DNS-ek,

2) humán TNF polipeptidet vagy annak fő része(i)t kódoló DNS alléi mutáns DNS-ei,

3) humán TNF polipeptidet vagy annak alléi mutáns 20 polipeptidjét kódoló DNS módosításával nyert DNS-ek,

4) humán TNF polipeptidet vagy annak alléi mutáns polipeptidjét kódoló DNS-ek kémiai vagy enzimatikus módosításával nyert DNS-ek,

5) humán TNF polipeptid vagy annak fő iésze(i) aktivitásával lényegében azonos aktivitású polipeptidet kódoló DNS-ek,

6) humán TNF polipeptidet vagy annak fő része(i)t kódoló degeneratív DNS-ek,

7) humán TNF polipeptidet kódoló olyan DNS-ek, amelyekből egy vagy több kodon hiányzik, vagy más kodon(ok)kal van helyettesítve,

8) humán TNF polipeptidet vagy annak fő része(i)t kódoló DNS-ek, amelyekben iniciációs kodon és/vagy 35 terminációs kodon és/vagy egy, az iniciációs kodonnal ellentett irányban Shine-Dalgamo szekvenciával folytatódó promoter van,

9) olyan DNS-ek, amelyek bázisszekvenciája különbözik ugyan a nyúl TNF-et kódoló bázisszekvenciától, de a fenti bázisszekvencia egy részével vagy részeivel erősen homológ.

4. táblázat

-30 -20 -10 -1

CTCCACCCTC TCTCCCCTGG AAAGGACACC ₍1 10 20 30

ÁTGAGCACTÓ AAAGCATGAT CCGGGACGTG MetSerThrGluSerMetlleArgAspVal

50 60

GAGCTGGCCGAGGAGGCGCT CCCCAAGAAG

GluLeuAlaGluGluAlaLeuProLysLys 70 80 90

ACAGGGGGGCCCCAGGGCTC CAGGCGGTGC ThrGlyGlyProGlnGlySerArgArgCys

100 110 120 TTGTTCCTCÁ GCCTCTTCTC CTTCCTGATC LeuPheLeuSerLeuPheSerPheLeuIle

130 140 150

GTGGCAGGCG CCACCACGCT CTTCTGCCTG ValAlaGlyAlaThrThrLeuPheCysLeu

A találmány szerinti eljárással előállított DNS-ek közül előnyösek az alábbiak:

1) az olyan bázisszekvenciájú DNS, amely olyan (I) általános képletű aminosavszekvenciának felel meg, ahol A jelentése (la), B jelentése (lb), X jelentése (Ic), m és n értéke 1, és Y és p jelentése az (I) általános képletre fent megadott,

2) az olyan bázisszekvenciájú DNS, amely olyan (I) általános képeltű aminosavszekvenciának felel meg, ahol A jelentése (la), B jelentése (lb), m értéke 1, n értéke 0, és Y és p jelentése a fenti,

3) az olyan bázisszekvenciájú DNS, amely olyan (I) általános képletű aminosavszekvenciának felel meg, ahol A jelentése (la), m és n értéke 0, és Y és p az (I) képletre megadott jelentésű.

Különösen előnyös az olyan bázisszekvenciájú

DNS, amely olyan (I) általános képletű aminosavszekvenciának felel meg, ahol A jelentése (la), B jelentése (lb), m értéke 1 vagy 0, és n és p értéke 0.

Az a bázisszekvencia, amely olyan (I) általános képletű aminosavszekvenciának felel meg, ahol A jelentése (la), B jelentése (lb), X jelentése (Ic), és m, n és p értéke 1, a 4. táblázatban megadott bázisszekvencia 1-699. számú bázisaiból álló fragmenssel azonos. Az (la) képletű aminosavszekvenciának megfelelő bázisszekvencia a 4. táblázat 247-699. számú bázisaiból álló fragmenssel azonos, és a fenti bázis-szekvenciának megfelelő aminosavszekvenciában az aminosavak

GACCCACGG

HU

202 921 Β

160 170 180

CTGCACTTTG GAGTGATCGG CCCCCAGAGG LeuHisPheGlyValIleGlyProGlnArg

190 200 210

GAAGAGTTCC CCAGGGACCT CTCTCTAATC GluGluPheProArgAspLeuSerLeuIle

220 230 r- 240

AGCCCTCTGG CCCAGGCAGT CAGAjTCATCT SerProLeuAlaGlnAlaValArgíSerSer

250 260 L 279

TCTCGAACCCCGAGTGACAÁ GCCTGTAGCC SerArgThrProSerAspLysProValAla

280 290 300

CATGTTGTAÓ CAAACCCTCÁ AGCTGAGGGG HisValValAlaAsnProGlnAlaGluGly

310 320 330

CAGCTCCAGT GGCTGAACCG CCGGGCCAAT GlnLeuGlnTrpLeuAsnArgArgAlaAsn

340 350 360

GCCCTCCTGG CCAATGGCGT GGAGCTGAGÁ AlaLeuLeuAlaAsnGlyValGluLeuArg

370 380 390

GATAACCAGÓ TGGTGGTGCC ATCAGAGGGC AspAsnGlnLeuValValProSerGluGly

400 410 420

CTGTACCTCÁ TCTACTCCCÁ GGTCCTCTTC LeuTryLeuIleTyrSerGlnValLeuPhe

430 440 450

AAGGGCCAAG GCTGCCCCTC CACCCATGTG LysGlyGlnGlyCysProSerThrHisVal

460 470 480

CTCCTCACCC ACACCATCAG CCGCATCGCC LeuLeuThrHisThrlleSerArglleAla

490 500 510

GTCTCCTACC AGACCAAGGT CAACCTCCTC ValSerTyrGlnThrLysValAsnLeuLeu

520 530 540

TCTGCCATCÁ AGAGCCCCTG CCAGAGGGAG SerAlalleLysSerProCysGlnArgGlu

550 560 570

ACCCCAGAGGGGGCTGAGGC CAAGCCCTGG ThrProGluGlyAlaGluAlaLysProTrp

580 590 600

TATGAGCCCÁ TCTATCTGGG AGGGGTCTTC TyrGluProIleTyrLeuGlyGlyValPhe

610 620 630

CAGCTGGAGÁAGGGTGACCG ACTCAGCGCT GlnLeuGluLysGlyAspArgLeuSerAla

640 650 660

GAGATCAATCGGCCCGACTÁ TCTCGACTTT GluIleAsnArgProAspTyrLeuAspPhe

670 680 690

GCCGAGTCTG GGCAGGTCTÁ CTTTGGGATC AlaGluSerGlyGlnValTyrPheGlylle

700 710 720

ATTGCCCTG1TGAGGAGGACG AACATCCAAC IleAlaLeuJ

739 740

CTTCCCAAACGCCTCCCCTGC száma összesen 151.

HU 202 921 Β

A 4. táblázatban a felsó sorok a bázisszekvenciát, az alsó sorok a megfelelő aminosavszekvenciát jelentik.

Az olyan (la) képletű polipeptidek példájaként, ahol egy vagy több aminosav hiányzik, vagy más amino- 5 savval van helyettesítve, az alábbiakat említjük meg:

4) olyan (la) képletű polipeptid, amelynek az N-terminális végen 1. helyzetben lévő Thr aminosavja hiányzik,

5) olyan (la) képletű polipeptid, amelyből az 1. hely- 10 zetű Thr-tól a 6. helyzetű Pro-ig terjedő aminosavszekvencia hiányzik az N-terminális végen,

6) olyan (la) képletű polipeptid, amelynek N-terminális végéről az 1. helyzetű Thr-tól a 9. helyzetű His-ig terjedő aminosavszekvencia hiányzik. 15

7) olyan (la) képletű polipeptid, amelynek N-tenminális végéről az 1. helyzetű Thr-tól 12. helyzetű Ala-ig terjedő aminosavszekvencia hiányzik, és

8) olyan (la) képletű polipeptid, amelyben az N-terminálistól számított 66. helyzetben lévő Thr Hisnel, és a 67. helyzetben lévő His Thr-nal vagy Tyrnak van helyettesítve.

Véleményünk szerint biológiai aktivitással rendelkező polipeptidek kódolására a DNS-nek fontos része

9) az 5. táblázat felső sorában feltüntetett bázisszekvenciából legalább az 577-708. számú bázisokból álló fragmens, és még pontosabban

10) az 5. táblázat felső sorában feltüntetett bázisszekvenciából legalább a 658-708. számú bázisokból álló fragmens.

5. táblázat

Felső sorok: humán TNF prekurzort kódoló bá- 55 zisszekvencia

Alsó sorok: nyúl TNF prekurzort kódoló bázisszekvencia

HU 202 921 Β

360

540

AACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGC AACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGC

CAGA

CACC

GGGAGACCCCA

GAGGGGGCTGAG

3GGAGACCCCC3AGGAGGCTGAGC

570 g|cc~

CC

600

CCTGGTATGAGCCCATCTAT

CTGGGA

ΑΓ 3 33CTGGTA 3GAGCCCATCTACCTGGG “630

TGGAGAAGGGTGACCGA GG|3|GTCTTCCAGfr[rGGAGAAGGGTGACCG 3 - -660 gg:

GTCTTCCAG

CTCAGC

CTCAGCA

T G A Gj Afr C A AtTlClG dCClCÍG AfcjTAjr GAGGTCAACCAGCCTGAGTAC

690

TTTGGGATCATTGCCCTGTGA

TTTGGGATCATTGCCCTGTGA

A bekeretezett részek homológ szakaszokat jelentenek

---jelentése: egy kodon hiányzik *** jelentése: terminációs kodon [1-3] A találmány értelmében a DNS-eket az alábbi eljárások szerint állíthatjuk elő.

A humán TNF polipeptidet, vagy annak fő részét kódoló DNS-t úgy állítjuk elő, hogy humán makrofágokat indukálószer(ek)kel együtt tenyésztünk, a humán TNF mRNS-t tartalmazó frakciót elválasztjuk az indukált sejtekből, a frakcióból egy cDNS-t állítunk elő, és a humán TNF cDNS-t differenciál hibridizációs módszerrel klónozzuk, mintaként megfelelő DNS-t például nyúl TNF cDNS-fragmenst - használva, vagy differenciál hibridizációs módszert használunk, mRNS hibridizáció-transzlációs vizsgálattal kiegészítve.

A DNS-t tehát az alábbi lépésekkel állíthatjuk elő:

A) humán makrofágokat indukálószer(ek)kel együtt tenyésztünk,

B) a humán TNF mRNS-t tartalmazó frakciót elválasztjuk az indukált sejtekből,

C) a mRNS-ból reverz transzkriptázzal sscDNS-t állítunk elő, majd azt dscDNS-sé alakítjuk,

D) a dscDNS-t egy vektorba illesztjük,

E) a rekombináns vektort egy gazdaszervezetbe juttatva a gazdaszervezetet oly módon transzformáljuk, hogy az egy cDNS génállományt képezzen,

F) kiválasztjuk a hTNF-et kódoló kiónokat, és

G) a humán TNF polipeptidet vagy annak fő részét kódoló cDNS-t a fenti génállományból klónozzuk. A DNS előállítását részletesen az alábbiakban isimertetjük, a korlátozás szándéka nélkül.

-101

HU 202 921 Β (1) Humán TNF mRNS előállítása

A humán TNF mRNS-t humán makrofágokból állíthatjuk elő, például az alábbiak szerint.

A humán makrofágokat például humán alveoluszból nyerhetjük, Sone és munkatársai [J. Immunoi. 729, 1313 (1982)] módszerével, vagy vérből, Matthews [Br. J. Cancer, 48, 405 (1983)] módszere, szerint vagy placentából, Wilson és munkatársai [J. Immunological Methods, 56, 305 (1983)] módszerével, vagy egyéb szövetekből.

A kapott makrofágokat egy csészébe oltjuk le, 2·1Ο⁴-1·1Ο⁶ sejt/cm² sejtsűrűséget biztosítva, majd 35-38 ’C-on, előnyösen 37 ’C körüli hőmérsékleten 5% szén-dioxidot tartalmazó, telített páratartalmú légtérben 30 perc - 2 órán át előtenyésztjük.

Ezután indukálószerként egy Gram-negatív baktériumból kapott endotoxint - előnyösen Escherichia coli-ból, Pseudomonas aeruginosa-ból vagy Salmonella typhi-ből származó lipopoliszacharidot -, és proteinszintézis-inhibitorként cikloheximidet adunk a sejtekhez. A tenyésztést 3-8 órán át tovább folytatjuk, hogy a makrofágokban felhalmozódjon a humán TNF mRNS. Az előtenyésztést el is hagyhatjuk. Az endotoxin mennyisége általában 0,1-1000 mikrogramm/ml, előnyösen 1-100 mikrogramm/ml. Ekkor indukálószerként egy fórból-észtert - például fórból-12-mirisztát13-acetátot, forbol-12,13-didekanoátot vagy forbol12,13-dibenzoátot - is adhatunk a rendszerhez 1-2000 ng/ml koncentrációban. A proteinszintézis-inhibitor mennyisége annak típusától függően változik. Cikloheximidből például 0,1-50 mikrogramm/ml mennyiséget használunk. Tápközegként emlős sejtek tenyésztésére alkalmas különféle táptalajokat használhatunk, például RPMI-1640 táptalajt, Eagleféle minimáltáptalajt (MÉM), vagy Dulbecco-féle módosított minimáltáptalajt [a fenti táptalajok összetételét például a „Cell Cultivation Manual”, szerkesztő Y. Sohmura, Kodansha (1982), vagy J. Paul: ”Cell and Tissue Culture”. E. and A. Livingstone Ltd. (1970) irodalmi helyeken találhatjuk meg], A tápközeghez előnyösen állati szérumot - például magzati marhaszérumot vagy borjúszérumot - is adunk, 1-20% mennyiségben.

A tenyésztési szakasz befejeztével, az RNS-t a szokásos módszerekkel - például Chirgwin és munkatársai [Biochemistry, 18, 5294 (1979)] módszerével extraháljuk a sejtekből, majd oligo(dT9-cellulózon vagy poli(U)-Sepharose-on affinitási oszlopkromatográfiás eljárással, vagy szakaszos módszerrel elválasztjuk a poli(A)mRNS-t tartalmazó frakciót. A poli(A)mRNS-t tartalmazó frakciót sav-kaibamid agaróz gélelektroforézisnek, vagy szacharóz súrúséggrasdiens centrifugálásnak alávetve humán TNF mRNS-ben feldúsult mRNS-ffakciót nyerhetünk.

Annak megerősítésére, hogy a kapott mRNS-frakció valóban a humán TNF polipeptidet kódoló mRNS-t tartalmazza, a mRNS-sel fehérjét szintetizáltunk, és a kapott fehérje biológiai aktivitását megvizsgáltuk. Ezt a vizsgálatot például úgy végezhetjük el, hogy a mRNS-t Xenopus laevis oocitájába injektáljuk, vagy megfelelő protein-szintetizáló rendszerhez - például retikulocita-lizátumhoz vagy búzacsíra sejtmentes protein-szintetizáló rendszerhez - adjuk, és kimutatjuk, hogy a transzláció révén keletkezett protein egér Lsejtekkel szemben in vitro citotoxikus hatást fejt ki.

(2) Humán TNF cDNS klónozása

A fenti (1) lépés szerint kapott poli(A)mRNS-frakciót vagy a feldúsított mRNS-frakciót használjuk templátként, és printerként egy oligo(dT)-t használunk sscDNS előállítására, reverz transzkriptáz - például madár mieloblasztozis vírusból származó reverz transzkriptáz (AMV) - segítségével, dATP, dGTP, dCTP és dl ΓΡ jelenlétében. Ezután az sscDNS-t templátként használva dscDNS-t szintetizálunk, reverz transzkriptáz vagy E. coli DNS-polimeráz I (nagy fragmens) segítségével.

A kapott dscDNS-t például a pBR322 piazmidba illesztjük, a restrikciós endonukleáz Pst 1 hasítási helyén, a szokásos módon, például poli(dG)-poli(dC) homopolimer extenziós módszerrel [T.S. Nelson: Methods in Enzymology, 68, 41 (1979), Academic Press Inc., New York]. A kapott rekombináns plazmidokat ezután egy gazdasejtbe - például E. coli 1776-ba juttatjuk Cohen és munkatársai [Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)] módszere szerint, transzformálás céljából, majd a tetraciklin- rezisztens telepek kiválasztásával egy cDNS (telep) génállományt készítünk.

A cDNS génállományt ezután telep-hibridizációnak vetjük alá [D. Hanahan és munkatársai: Gene, 10, 63 (1980)1, mintaként az 1. referenciapélda szerint előállított ³ P-jelzett nyúl TNF cDNS fragmensét használva, és a kívánt, humán TNF polipeptidet kódoló beillesztett cDNS-t tartalmazó rekombináns plazmidokat befogadó kiónokra szűrővizsgálatot végzünk.

Ha a fenti módon nem kapunk megfelelő TNF cDNS-mintát, a kívánt kiónokra telep-hibridizációs szűrővizsgálatot végzünk, pozitív és negatív indukciós mintákat használva, és hibridizációs transzlációs vizsgálatot, az alábbiak szerint.

Az (1) lépés szerint előállított, humán TNF mRNS-t tartalmazó poli(A)mRNS-frakciót vagy dúsított mRNS-frakciót templátként használva ³²P-jelzett cDNS-t szintetizálunk, és pozitív indukciós mintaként használjuk. Egy másik mRNS-frakciót - melyet szintén a fentiek szerint állítottunk elő, azzal az eltéréssel, hogy nem indukált makrofágokat használtunk kiindulási anyagként - templátként használva ³²P-jelzett cDNS-t szintetizálunk, melyet negatív indukciós mintaként használunk. A fenti módon kapott cDNS génállományból kiválasztjuk azokat a plazmid-klónokat, amelyek a pozitív indukciós mintával erősen hibridizálódnak, de a negatív indukciós mintával nem hibridizálódnak.

Annak megerősítésére, hogy a kapott kiónok valóban befogadták a humán TNF polipeptidet kódoló beillesztett cDNS-t, a követekező vizsgálatot végezzük el. A fenti kiónokból izoláljuk a plazmid DNS-eket, melegítéssel vagy lúgos kezeléssel egyszálú DNS-sé alakítjuk, és nitrocellulóz szűrőre visszük. A humán

-111

HU 202 921 Β

TNF mRNS-t tartalmazó mRNS-frakciót hozzáadjuk a szúrón lévő DNS-hez, hibridizálás céljából. Ezután a hibridizált mRNS-t eluáljuk és visszanyerjük. A visszanyert mRNS-t Xenopus laevis oocitáiba injektálva megállapítjuk, hogy a visszanyert mRNS valóban humán TNF polipeptidet kódol-e.

A fenti módszerekkel olyan transzformált DNS-ekhez jutunk, amelyek a humán TNF mRNS bázisszekvenciájával komplementer DNS- fragmensét tartalmazó rekombináns plazmidot fogadtak be.

Ha a kapott klónozott cDNS-ek nem tartalmazzák a humán TNF polipeptid kódolásához szükséges teljes molekulaszakaszt, nagyobb méretű cDNS-eket úgy választhatunk ki a cDNS génállományból, hogy mintákét a transzformált DNS-ekből szelektált klónozott TNF cDNS-fragmenseket használjuk.

A humán TNF polipeptid aminosavszekvenciáját tartalmazó polipeptidet kódoló klónozott cDNS-t végül úgy is előállíthatjuk, hogy a kapott klónozott cDNS-fragmensek bázisszekvenciáját például Maxam5 Gilbert módszerrel [Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 74, 560 (1977)] meghatározzuk, megkeressük a nyúl TNF cDNS bázisszekvenciájával homológ bázisszekvenciákat, és kiválasztjuk azokat a cDNS-eket, amelyek a humán TNF polipeptid teljes kódoló régiójának meg10 felelő bázisszekvenciát tartalmazzák.

A nyúl TNF-et és a humán TNF polipeptidet kódoló bázisszekvenciák közötti homológiát, valamint az ebből következtetett, nyúl TNF és humán TNF polipeptid aminosavszekvenciák közötti homológiát az 5. és 6.

táblázatban mutatjuk be.

6. táblázat _10

Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val

Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val

Glu Leu Ala Glu Glu Ala Glu Leu Ala Glu Gly Pro

Leu Pro Lys Lys Leu Pro Lys Lys

-πτ

Felső sorok: humán TNF prekurzor t

Alsó sorok: nyúl TNF prekurzor i

-121

HU 202 921 Β

6. táblázat (folytatás)

Glu

Lys

130

Ser Glu Gly Leu Tyr Leu lle Tyr Ser Gin Alá Asp Gly Leu Tyr Leu lle Tyr Ser Gin

150

Asn Leu Leu Ser Alá lle Lys Ser Pro Cys Asn Leu Leu Ser Alá lle Lys Ser Pro Cys --Γ5ΊΓ

Gin His	Arg Glu Thr Pro Glu Arg Glu Thr Pro Glu	Gly Glu	Alá Glu Alá Glu	Alá Pro
					200
Lys Pro Met Alá	Trp Tyr Glu Pro lle Tyr Leu Gly Trp Tyr Glu Pro lle Tyr Leu Gly

Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg

Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg -

Leu	Ser	Alá!Glu	lle	Asn	Arg	Pro	Asp	Tyr
Leu	Ser	ThrjGlu _	!Val	Asn	Gin	Pro	Glu	Tyr

Leu Asp Phe Alá Glu Ser Gly Gin Val Tyr Leu Asp Leu Alá Glu Ser Gly Gin Val Tyr

Phe Gly lle lle Alá Leu Phe Gly lle lle Alá Leu

A bekeretezett részek homológ szakaszokat jelentenek ---jelentése: egy aminosav hiányzik

A fenti homológiákat és a nyúl plazma TNF meghatározott N-terminális és C-terminális aminosavszekvenciáit (3. referenciapélda) figyelembe véve megállapítható, hogy a humán TNF cDNS a humán TNF 233 45 aminosavból álló prekurzor polipeptidjét kódolja, és a biológiailag aktív humán TNF polipeptid olyan polipeptid, amely prekurzorának C-terminális végétől számított 155 aminosavból álló szekvenciának felel meg.

A biológiailag aktív humán TNF polipeptidet olyan 50 bázisszekvencia kódolja, amely olyan (I) általános képletű polipeptidnek felel meg, ahol A jelentése (la) képletű aminosavszekvencia, B jelentése (Ib) képletű aminosavszekvencia, és m értéke 1, n és p értéke 0.

A humán TNF prekurzor polipeptidet olyan bá- 55 zisszekvencia kódolja, amely olyan (I) általános képletű polipeptidnek felel meg, ahol A jelentése (la) képletű aminosavszekvencia, B jelentése (Ib) képletű aminosavszekvencia, X jelentése (Ic) képletű aminosavszekvencia, m, n és p értéke 1, és Y jelentése Met. 60

A bázisszekvenciában és aminosavszekvenciában megfigyelhető nagy mértékű homológia arra utal, hogy a humán és nyúl TNF-ek filogenetikusán ugyanabból a génből származnak, és arra enged következtetni, hogy a közös régiók jelentős része(i) olyan szekvenciát jelentenek, amely a biológiai hatás kifejeződéséhez szükséges. Azonban a biológiailag aktív humán TNF polipeptid immunológiailag nem ad keresztreakciót a nyúl plazma TNF-fel, mint az alább látható. Valószínűleg a biológiailag aktív humán TNF polipeptid teljes aminosavszekvenciája nem minden esetben szükséges a hatás megmutatkozásához, és egy részben módosított humán TNF polipeptid is hatásos lehet abban az esetben, ha a biológiailag aktív TNF polipeptid aktív helyeit tartalmazza.

[II-1] A találmány humán tumor nekrózis faktor polipeptid, vagy egy azt tartalmazó polipeptid, vagy annak fő része(i), vagy humán tumor nekrózis faktorhoz hasonló anyag, és annak fő része(i) előállítására is vo13

-131

HU 202 921 Β natkozik. A fenti vegyületek közelebbről az (I) általános képlettel (Y)p-(X)n-(B)_m-A a) jellemezhetők, vagy annak származékai vagy sói. A fenti képletben

A jelentése (la) képletű polipeptid, amelyből egy vág) több aminosav hiányozhat, vagy más aminosav(ak)kal lehet helyettesítve, de a homológia mértéke legalább 95%;

Thr	Pro	Ser	Asp	Lys	Pro	Val	Alá	His	Val
Val	Alá	Asn	Pro	Gin	Alá	Glu	Gly	Gin	Leu
Gin	Trp	Leu	Asn	Arg	Arg	Alá	Asn	Alá	Leu
Leu	Alá	Asn	Gly	Val	Glu	Leu	Arg	Asp	Asn
Gin	Leu	Val	Val	Pro	Ser	Glu	Gly	Leu	Tyr
Leu	Ile	Tyr	Ser	Gin	Val	Leu	Phe	Lys	Gly
Gin	Gly	Cys	Pro	Ser	Thr	His	Val	Leu	Leu
Thr	His	Thr	Ile	Ser	Arg	Ile	Alá	Val	Ser
Tyr	Gin	Thr	Lys	Val	Asn	Leu	Leu	Ser	Alá
Ile	Lys	Ser	Pro	Cys	Gin	Arg	Glu	Thr	Pro
Glu	Gly	Alá	Glu	Alá	Lys	Pro	Trp	Tyr	Glu
Pro	Ile	Tyr	Leu	Gly	Gly	Val	Phe	Gin	Leu
Glu	Lys	Gly	Asp	Arg	Leu	Ser	Alá	Glu	Ile
Asn	Arg	Pro	Asp	Tyr	Leu	Asp	Phe	Alá	Glu
Ser	Gly	Gin	Val	Tyr	Phe	Gly	Ile	Ile	Alá

Leu

B jelentése 25

Ser-Ser-Ser-Arg (lb) képletű peptid, amelyből 1-3 amninosav hiányozhat, vagy más aminosav(ak)kal lehet helyettesítve, 30

X jelentése az érett TNF-ben nem szereplő, teljes vagy részleges prekurzor szekvencia Y jelentése Met és m, n, és p értéke 1 vagy 0.

Előnyösek azok az (I) általános képletű polipeptidek, amelyek képletében X jelentése (Ic) képletű polipeptid:

Ser	Thr	Gly	Ser	Met
Leu	Alá	Glu	Glu	Alá
Gly	Gly	Pro	Gin	Gly
Phe	Leu	Ser	Leu	Phe
Alá	Gly	Alá	Thr	Thr
His	Phe	Gly	Val	Ile
Glu	Phe	Pro	Arg	Asp
Pro	Leu	Alá	Gin	Alá

Ile	Arg	Asp	Val	Glu
Leu	Pro	Lys	Lys	Thr
Ser	Arg	Arg	Cys	Leu
Ser	Phe	Leu	Ile	Val
Leu	Phe	Cys	Leu	Leu
Gly	Pro	Gin	Arg	Glu
Leu	Ser	Leu	Ile	Ser
Val	Arg

A találmány szerinti eljárással tehát az alábbi polipeptidek állíthatók elő:

1) egy, a fenti [I] fejezetben ismertetett DNS-nek megfelelő polipeptid, amelyet egy olyan expressziós vektorral transzformált gazdaszervezetben állítunk elő, amelybe egy fenti DNS-t illesztettünk be;

2) humán TNF polipeptid, vagy annak polipeptid prekurzora;

3) olyan humán TNF polipeptid, amelyből egy vagy több aminosav hiányzik, vagy más aminosav(ak)kal van helyettesítve; de a homológia mértéke legalább 95%;

4) olyan polipeptid, amely a humán TNF polipeptid lényeges részét tartalmazza;

5) olyan, a nyúl TNF polipeptidtől eltérő polipeptid, amely a nyúl TNF polipeptid egy részével vagy részeivel nagy homológiát mutató polipeptidből áll, vagy ilyen polipeptidet tartalmaz;

60'

6) humán TNF polipeptid dagradációs terméke, amely a gazdaszervezetben keletkezett;

7) humán TNF polipeptid kémiai vagy enzimatikus módosításával nyert polipeptid, vagy annak származékai; és

8) a humán TNF polipeptid biológiai aktivitásával lényegében ekvivalens aktivitással rendelkező, vagy potenciálisan rendelkező polipeptidek.

A találmány szerinti eljárással előnyösen az alábbi polipeptidek állíthatók elő:

1) az olyan (I) általános képletű polipeptidek, amelyek képletében A jelentése (la), B jelentése (lb), m értéke 1, n értéke 0, és Y és p jelentése az (I) általános képletre megadott;

2) az olyan (I) általános képletű polipeptidek, amelyek képletében A jelentése (la), m és n értéke 0, Y és p jelentése az (I) általános képletre megadott;

-141

HU 202 921 Β

3) az olyan (I) általános képletű polipeptidek, amelyek képletében A jelentése (la), B jelentése (lb), X jelentése (Ic), m és n értéke 1, Y és p jelentése az (I) általános képletre megadott.

Különösen előnyös az a polipeptid, amelynek (I) általános képletében A jelentése (la), B jelentése (lb), m értéke 1 vagy 0, és n és p értéke 0, vagy gyógyászatilag elfogadható sói.

Az (la) képletű polipeptidnek a 6. táblázat alsó sorában feltüntetett aminosavszekvencia 86-236. aminosavakból álló szakasza felel meg.

Az olyan (la) általános képletű polipeptidekre példaként, amelyekből egy vagy több aminosav hiányzik, vagy egy más aminosavra van cserélve, az alábbiakat említjük:

4) olyan (la) képletű polipeptid, amelyből az N-terminálishoz képest 1. helyzetben lévő Thr hiányzik;

5) olyan (la) képletű polipeptid, amelyből az N-terminálishoz képest 1. helyzetben lévő Thr-tól a 6. helyzetben lévő Pro-ig tartó aminosavszekvencia hiányzik;

6) olyan (la) képletű polipeptid, amelyből az N-terminálishoz képest 1. helyzetben lévő Thr-tól a 9-es helyzetben lévő His-ig tartó aminosavszekvencia hiányzik;

7) olyan (la) képletű polipeptid, amelyből az N-terminálishoz képest 1. helyzetben lévő Thr-tól a 12. helyzetben lévő Ala-ig tartó aminosavszekvencia hiányzik; és

8) olyan (la) képletű polipeptid, amelyben az N-terminálishoz képest 66. helyzetben lévő Thr His-re, a 67. helyzetben lévő His Thr-ra vagy Tyr-ra van cserélve.

Véleményünk szerint a biológiai aktivitás szempontjából a polipeptid aminosavszekvenciájából fontos

9) a 6. táblázat alsó sorában a 193. helyzetű Trp-tól a 236. helyzetű Leu-ig tartó aminosavszekvencia, és közelebbről

10) a 6. táblázat alsó sorában a 220. helyzetű Tyr-tól a 236. helyzetben lévő Leu-ig tartó aminosavszekvencia.

Az (I) általános képletű polipeptidek aggregátumok formájában, például trimerként is létezhetnek, a fenti aggregátumok természetesen szintén a találmány tárgykörébe tartoznak.

A találmány értelmében az (I) általános képletű humán TNF polipeptidet az alábbiak szerint állítjuk elő:

A) az (I) általános képletű humán TNF polipeptidet kódoló bázisszekvenciájú DNS-t kívánt esetben egy heterológ polipeptidet kódoló DNS-sel összekapcsolunk, egy expressziós vektorba illesztjük;

B) a rekombináns vektort bevisszük egy gazdaszervezetbe;

C) a rekombináns vektorral transzformált gazdaszervezetet tenyésztve előállítjuk a polipeptidet;

D) a tenyésztett sejteket összegyűjtjük és a termelt polipeptidet a sejtekből extraháljuk; és

E) a polipeptidet a proteinek tisztítására szokásosan alkalmazott eljárásokkal tisztítjuk.

(1) Humán TNF polipeptid előállítása

A találmány szerinti eljárással előállított DNS segítségével az alábbiak szerint állítjuk elő a humán TNF polipeptidet.

A humán TNF polipeptid előállításához szükséges expressziós vektort úgy nyerhetjük, hogy a humán TNF polipeptidet kódoló DNS-t megfelelő vektorba illesztjük. Minden olyan vektor megfelel a fenti célra, amely a transzformálandó mikroorganizmusban proliferál. Példaként a plazmidokat - például E. coli pBR322 plazmid -, fágokat - például fág-származékok -, és a vírusokat - például az SV40 vírust - említjük. A fenti vektrorokat külön- külön, vagy kombinációban alkalmazhatjuk, például pBR322-SV40 hibrid plazmidként. A DNS beillesztésének helyét célszerűen megválaszthatjuk. Más szóval, a megfelelő vektort annak megfelelő helyén egy megfelelő restrikciós endonukleázzal hasíthatunk, ismert módon, és a hasítás helyére beilleszthetjük a megfelelő hosszúságú klónozott cDNS-t.

Még pontosabban, a nem fuzionált polipeptid előállítására alkalmas expressziós vektort úgy állítjuk elő, hogy a humán TNF polipeptidet kódoló bázisszekvenciát tartalmazó DNS-fragmenst - amelynek 5'-végéhez egy ATG iniciációs kodon van adva és amely 3’végén egy terminációs kodont (TAA, TAG vagy TGA) tartalmaz - egy megfelelő promoterTel és Shine-Dalgamo-szekvenciával rendelkező DNS-fragmenshez adjuk, és egy vektorba illesztjük. A fuzionált polipeptidek előállítására alkalmas expressziós vektort úgy állíthatjuk elő, hogy a humán TNF polipeptidet kódoló bázisszekvenciát tartalmazó cDNS-t - amelyben a terminációs kodon a 3’-véghez van adva - úgy illesztjük a vektorba, hogy a transzlációs leolvasó szerkezet egybeessen a fuzionálandó strukturális génével. A humán TNF polipeptidet azért előnyös fuzionált polipeptidként előállítani, mert így a transzformált gazdasejtekben minimálisra csökkenthető a tennék degradálódása. Ebben az esetben a humán TNF polipeptidet ki kell vágni a fuzionált termékből. A biológiailag aktív humán TNF polipeptid - amely a 6. táblázat felső sorába a 82. helyzetben lévő Ser-tői a 236. helyzetű Leu-ig tartó aminosavszekvenciának felel meg - nem tartalmaz egy metionin-aminosavmaradékot sem. Ezért olyan expressziós vektort alkalmazva, amelyet úgy állítottunk elő, hogy a humán TNF cDNS-fragmenst a fuzionálandó struktúrális gén bázisszekvenciájának 3’végéhez egy metionin- kodonon (ATG) keresztül kapcsoltuk, a fuzionált termékből könnyen visszanyerhetjük a humán TNF polipeptidet a metionin- peptidkötés hasítására alkalmas módszerekkel, például bróm-ciános kezeléssel [Itakura K. és munkatársai: Science, 198, 1054 (1977)].

A promoterekre példaként a lac, trp, tac, phoS, phoA, PL és SV40- t, mint korai promotert említjük.

A transzformált sejteket úgy kapjuk, hogy az expressziós vektort egy gazdaszervezetbe - például mikroorganizmusba, állati vagy növényi sejtbe - visszük be. Az E. coli-t például Cohen és munkatársai [Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)] módszere sze15

-151

HU 202 921 Β rint transzformáljuk. Ezután a transzformált sejtek tenyésztésével előállíthatjuk a humán TNF polipeptidet, vagy egy olyan fenti polipeptidet, amelynek N-terminálisán metionin van. A tennék vagy a gazdaszervezet citoplazmájában, vagy a periplazmájában halmozódik fel, attól függően, hogy az expressziós vektort milyen módszerrel szerkesztettük meg. Abból a célból, hogy a polipeptid a periplazmába választódjon ki, egy szekréciós protein génjének - például egy lúgos foszfatáz génnek (phoA) vagy foszfát-kötő protein génnek (phoS) felhasználásával úgy szerkesztjük meg az expressziós vektort, hogy a humán TNF polipeptidet kódoló DNS-t a helyes transzlációs leolvasó rendben a fenti génhez kapcsoljuk, egy megfelelő helyen, a szignál-pepiidet kódoló DNS-régiót követően.

A kapott transzformált sejteket ezután az azok tenyésztésére alkalmas körülmények között tenyésztjük, míg a kívánt polipeptid megfelelő mennyiségben termelődik. Mikor a termek polipeptid a citoplazmában felhalmozódott, a gazdasejteket elroncsoljuk - például lizozimes emésztéssel, és fagyasztással és felolvasztással, vagy ultrahangos kezeléssel, vagy egy French prést alkalmazva majd centrifugálással vagy szűréssel összegyűjtjük az extraktumot. Ha a termék a periplazmában halmozódott fel, onnan extraháljuk, például Willsky és munkatársai [J. Bacteriol., 727, 595 (1976)] módszere szerint.

A kapott nyers peptidet ezután ismert módon tisztítjuk, például a kisózás, ultraszűrés, dialízis, ioncserélő kromatográfia, gélszűrés, elektroforézis, affinitási kromatográfia, stb. kombinálásával.

A fenti eljárással humán TNF-polipeptidet és/vagy olyan polipeptidet állíthatunk elő, amely az N-terminálison metionint tartalmaz.

A humán TNF polipeptidtől, és az N-terminálison metionint tartalmazó polipeptidtől eltérő polipeptideket is előállíthatunk a találmány szerinti eljárással, a kívánt DNS-t lényegében a fentiek szerint használva, vagy ismert eljárások megfelelő kombinálásával.

(2) Humán TNF polipeptid módosítása

Módosított humán TNF polipeptidek alatt a humán TNF polipeptidet kódoló DNS alléi mutánsaiból származtatható polipeptideket (alléi mutáns polipeptidek); a humán TNF polipeptid vagy az alléi mutáns polipeptid C- vagy N-terminálisához egy aminosav, vagy két vagy több aminosavat tartalmazó peptid hozzáadásával nyert polipeptideket; a humán TNF polipeptidből vagy alléi mutáns polipeptidből egy vagy több aminosav törlésével nyert polipeptideket (például a humán TNF polipeptid N-terminálisán 4 aminosav törlésével nyert polipeptidet, melyet a [ΠΙ-l] fejezetben a (6) pontban ismertetünk);

A humán TNF polipeptid, vagy alléi mutánsának módosítását például Means, G.E. és Feeney, R.E. módszerével [Chemical Modification of Proteins„, Holden-Day, Inc. Califomia (1971)] végezhetjük el, önmagában ismer módon.

[ΙΠ] A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek jellegzetes képviselőinek kémiai és fizikai16 kémiai tulajdonságait, biológiai aktivitását és immunológiai tulajdonságait az alábbiakban ismertetjük.

A 4. példa szerint előállított, tisztított humán TNF polipeptid (továbbiakban rekombináns humán TNF, rövidítve rHU-TNF) tulajdonságait az alábbiakban ismertetjük.

[ΙΠ-l] Kémiai és fizikai-kémiai tulajdonságok (1) Molekulatömeg

Az rHu-TNF molekulatömegét gélszűréssel határoztuk meg, TSK-gélen, G3000 SW oszlopon (7,5·600 mm, Toyo Soda), nagynyomású folyadékkromatográfiás technikát alkalmazva, oldószerként 0,2 mól/1 koncentrációjú foszfát-puffért (pH 7) használtunk, 8 mól/1 karbamid és 0,5% 2-merkapto-etanol-tartalom mellett, vagy anélkül. Ismert molekulatömegű proteinként marha szérumalbumint (móltömeg 6,6· 10⁴), nyúl triózfoszfát-izomerázt (móltömeg 5.340⁴), ovalbumint (mól tömeg 4,5 40⁴), sertés pepszint (móltömeg 3,2740⁴). szója tripszin-inhibitort (móltömeg 2.0540⁴), ló mioglobint (móltömeg 1,78· 10⁴) és ló citokróm C-t (móltömeg 1,2440⁴) használtunk.

Vizsgálataink szerint a rHu-TNF relatív móltömege 45 000 ± 5000 dalton, karbamid és 2-merkapto-etanol távollétében, és 18 000 ± 3000 dalton, azok jelenlétében.

A pHTR9l expressziós plazmidba illesztett cDNS egy 155 aminosavból álló peptidláncot kódol (az iniciációs ATG kodonnak megfelelő metionint elhagyva). A rHu-TNF elméletileg számított molekulatömege 17 097 dalton, az aminosavszekvencia alapján. A számított molekulatömeg egyezik a karbamid és 2-merkapto-etanol jelenlétében mért molekulatömeggel.

A fenti eredmények azt mutatják, hogy a rHu-TNF karbamid és 2-merkapto-etanol jelenlétében monomerként (alegység) van jelen, míg a denaturálószerek távollétében aggregátumot - például trimert - képez.

(2) Izoelektromos pont

Az izoelektromos pontot izoelektromos fókuszáló gél-elektroforézissel határoztuk meg, 3 watt mellett, 3 órán át, 5%-os poliakrilamid géllemezt használva, pH 4,0 - pH 6,5 tartományba eső pH-gradienssel, melyet Pharmalyte-tel (Pharmacia) állítottunk elő.

A proteint Coomassie brilliant blue festékkel festettük meg. Egy másik gélt 3 mm széles csíkokra vágtunk, és a proteint 20 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl (pH 7,8) pufferoldatba merítve eluáltuk. Citotoxikus aktivitást azokból a gélszeletekből származó eluátumokban észleltünk, amelyek helyzete megegyezett a festéssel detektált protein helyzetével.

A rHu-TNF izoelektromos pontja vizsgálataink szerint 5,9 ± 0,3.

(3) Aminosav-összetétel

A rHu-TNF aminosav-összetételét mikro-aminosavanalizátorban (Shimadzu Seisakusho) határoztuk meg, fluorometriás módszerrel, a mintát hidrogén-kloridos hidrolízis ortoftálaldehiddel kezelve.

-161

HU 202 921 Β mikrogramm rHu-TNF-et 6 n hidrogén-kloridoldattal 110 °C-on hidrolizáltunk. Az aminosav-tartalmat úgy számítottuk ki, hogy a mért értékeket a 24, 48 és 72 órán át hidrolizált mintában meghatározott értékek alapján korrigáltuk. A cisztint (vagy ciszteint) ciszteinsav formájában határoztuk meg, perhangyasavas oxidáció után. A triptofánt fluormetriásan mértük, Pajot [Eur. J. Biochem., 63,263 (1976)] módszere szerint.

Az eredményeket a 7. táblázatban foglaltuk össze.

7. táblázat

Aminosav	Relatív moláris mennyiség
Asp + Asn	12,1
Thr	5,5
Ser	12,4
Glu + Gin	20,3
Pro	10,3
Gly	10,6
Alá	13,0
Cys	1,5
Val	12,1
Met	<0,1
Ile	8,0
Leu	17,7
Tyr	6,8
Phe	3,9
His	2,8
Lys	6,1
Arg	7,5
Τφ	1,6

Az aminosav-összetétel jól egyezik a humán TNF polipeptidet kódoló bázisszekvencia alapján következtetett összetétellel.

(4) N-terminális aminosavszekvencia meghatározása

A rHu-TNF N-terminális aminosavszekvenciáját Edman-lebontással határoztuk meg Arch. Biochem. Biophys., 22, 475 (1949).

Az N-terminális aminosav Edman-lebontásával nyert fenil- tiohidantoin-aminosavat nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással azonosítottuk, TSKgél 120A-val (Toyo Soda) töltött 4,6·250 mm-es oszlopot használva. A fenti eljárást sorozatosan megismételve meghatároztuk az újonnan kialakult N-terminális aminosavakat, szekvenciálisán.

Vizsgálataink szerint a rHu-TNF N-terminális aminosavszekvenciája az alábbi:

NH2-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp—

Ismert, hogy számos, rekombináns DNS-technikával mikroorganizmusokban előállított polipeptid metionin-aminosavmaradékot tartalmaz az N-terminális végen, ami az iniciációs kodonból (ATG) származik.

Az 5. példa szerint előállított rHu-TNF esetén azonban nem lehetett az N-teiminálison metionint kimutatni, az onnan teljesen el lett távolítva.

(5) C-terminális aminosavszekvencia meghatározása

A rHu-TNF C-terminális aminosavszekvenciáját enzimatikus lebontással határoztuk meg, karboxipeptidázt használva.

A rHu-TNF-et karboxipeptidáz-A-val és karboxipeptidáz-Y-nal emésztettük, az enzim: szubsztrát mólarány 1:25, illetve 1:1000 volt. A rHu-TNF C-teiminálisáról felszabaduló aminosavakat mikro-aminosavanalizátorral (Shimadzu Seisakusho) azonosítottuk, megfelelő időközönként (2 perc - 180 perc, az emésztés kezdetétől számítva) vett mintákban.

Vizsgálataink szerint a rHu-TNF C-terminális aminosavszekvenciája az alábbi:

—Tyr-Phe-Gly-Ile-Ala-Leu-COOH (6) rHu-TNF tripszines emésztése

500 mikrogramm rHu-TNF-et 20 mikrogramm TPCK-kezelt tripszinnel (XIII. típus, SIGMA Chemical Co.) emésztettünk, 5 mmól/1 koncentrációjú TrisHC1 pufferoldatban (pH 7,8), szobahőmérsékleten, 5 órán keresztül. A kapott terméket a 4. példa (2) lépésben leírtak szerint preparatív izoelektromos fókuszáló gél-elektroforézisnek vetettük alá. A proteineket Coomassie brilliant blue-val festettük. Egy másik lemezt 3 mm széles csíkokra vágtunk, és a proteint 20 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl pufferrel (pH 7,8) eluáltuk.

Vizsgálataink szerint a rHu-TNF izoelektromos pontjánál kb. 0,3 pH-értékkel alacsonyabb pH értéknek megfelelő zónából eluált emésztett terméknek volt citotoxikus aktivitása.

A citotoxikus aktivitással rendelkező emésztett terméknek a fentebb ismertetett módon meghatároztuk a C-terminális és N-terminális aminosavszekvenciáját.

Vizsgálataink szerint az emésztett termék részleges aminosavszekvenciája az alábbi:

N-terminális: NH2-Thr-Pro-Ser-Asp—

C-terminális: —Ile-Ala-Leu-COOH.

Az aminosavszekvenciából következtetve az emésztett tennék egy olyan polipeptid, amely a rHu-TNF-ből négy N-terminális aminosav lehasadásával keletkezik, és citotoxikus aktivitással rendelkezik. Ez azt jelenti, hogy a rHu-TNF N-terminális végén levő négy aminosav nem lényeges a biológiai aktivitás szempontjából.

[ΠΙ-2] Biológiai aktivitás (1) Egér L-M sejtekkel szembeni citotoxikus hatás

A citotoxikus aktivitást egér L-M sejtekkel (ATCC, CCL 1.2) szemben az alábbiak szerint határoztuk meg.

0,1 ml mintát az alább említett táptalajjal sorozatban hígítottunk, és a 96 lyukú lemez (Flow Labs.) minden egyes lyukába 0,1 ml 1·10^{4 5} sejt/ml töménységű L-M sejt szuszpenziót mértünk. Táptalajként Eagle-féle minimáltáptalajt [J. Paule: „Cell and Tissue Culture”, E and S. Livingstone Ltd. (1970)] használtunk, J% mag17

-171

HU 202 921 Β zati marhaszérummal kiegészítve. A lemezt 37 ’C-on 48 órán át inkubáltuk, 5% szén-dioxidot tartalmazó, telített páratartalmú légtérben. Az inkubálás befejeztével az élő sejteket 20 mikroliter 25%-os glutáraldehid hozzáadásával fixáltuk. A fixálás után a lemezt mostuk és szárítottuk. Ezután a fixált sejteket 0,1 ml 0,05%-os metilénkék-oldattal megfestettük. A metilénkék feleslegét lemostuk, és a lemezt szárítottuk. A fixált sejtekhez kötődött metilénkéket 200 mikroliter 0,36 n sósavoldattal eluáltuk, és a 665 nm-nél mutatott abszorpciót Titerek Multiscan (Flow Labs.) fotométerrel mértük. Az abszorpció az élő sejtek számával arányos. Az L-M sejtek 50%-ának elpusztításához szükséges koncentrációt mint 1 egység/ml-t definiáltuk. A fenti módon meghatározott, egér L-M-sejtekkel szembeni citotoxikus aktivitást a egér L-929 sejtekre kifejtett citotoxikus aktivitástól való megkülönböztetés céljából mint egység (LM)- et adjuk meg.

A proteintartalmat Lowry, O.H. és munkatársai [J. Bioi. Chem., 193, 265 (1951)] módszere szerint határoztuk meg.

Vizsgálataink szerint a rHu-TNF specifikus aktivitása 2·10⁶ egység (LM)/mg protein, vagy még ennél is magasabb érték.

(2) Egérbe transzplantált Meth A szarkóma elleni hatás

A tumorellenes hatást Meth A szarkómát hordozó egéren az alábbiak szerint vizsgáltuk.

g átlagos súlyú BALB/c egerekbe a hasi bőr alá 2Ί0⁵ Meth A szarkóma sejtet ültettünk be intradermálisan. Hét nap múlva kiválogattuk azokat az egereket, amelyekben a tumor átmérője 6-7 mm volt. A tumor beültetése utáni 7. napon a tumorba, vagy intravénásán bevittük a rHu-TNF-et. A rHu-TNF endotoxon-tartalma kisebb, mint 0,01 ng/MO⁴ egység (LM).

Abban az esetben, mikor a tumorba magába vittük be a rHu-TNF-et, 1·10³, 3·1Ο³ és 1·10⁴ egység (LM)/egér dózisban, 24 órával az injektálás után min10 den egérben tumomekrózist észleltünk, és a tumor az egyes dózisok alkalmazása esetén 3/5, 5/5, illetve 5/5 arányban teljesen visszafejlődött. Intravénás kezelés esetén 3·1(τ és blO⁴ egység (LM)/egér dózisok alkalmazása mellett minden egérben észleltük a nekrotikus választ, a teljes visszafejlődés aránya 3/5, illetve 4/5 volt.

(3) rHu-TNF humán tumor-sejtekre kifejtett gátló hatása in vitro

A rHu-TNF humán tumor-sejtekre és normál sejtekre kifejtett növekedésgátló hatását in vitro az alábbiak szerint vizsgáltuk.

lyukú lemez minden egyes lyukába 1 ml, 10% magzati marhaszérumot tartalmazó Eagle-minimáltáptalajt mértünk, és lyukanként blO⁴ sejttel - humán tumor-sejttel vagy normál sejttel - beoltottuk. A rHuTNF-et 100 egység (LM)/ml végkoncentrációban hozzáadtuk, és a sejteket 37 ’C-on 4 napon át inkubáltuk, 5% szén-dioxidot tartalmazó teljesen telített páratartalmú légtérben. A tenyésztés befejezte előtt 4 órával minden lyukba 1 mikrocurie ³H-timidint adtunk. A tenyésztés befejezése után a sejteket foszfát-pufferes sóoldattal mostuk, és 0,5% nátrium-dodecil-szulfáttal lizáltuk. A sejtekbe beépült H-timidin mennyiségét a lizátum radioaktivitásának mérésével határoztuk meg.

Az inhibitor hatást, melyet a növekedésgátlás arányával adtunk meg, a következő egyenlet segítségével számoltuk ki:

Növekedésgátlás aránya (%) - (a-b)/a · 100, ahol a az rHu-TNF távollétében, b az rHu-TNF jelenlétében beépült radioaktivitást jelenti.

Az eredményeket a 8. táblázatban foglaltuk össze:

A fenti eredmények azt mutatják, hogy a rHu-TNF jelentős mértékben gátolja a humán tumor-sejtek növekedését, míg a normál sejtekre nézve hatástalan. A fentiek szerint a rHu-TNF szelektíven a tumoros sejteket támadja meg.

8. táblázat

Humán sejt	Eredet	Növekedésgátlás aránya (%)
Normál sejtek
WI-38	(ATCC CCL 75) tüdő diploid	nincs gátlás
MRC-5	(ATCC CCL 171) tüdő diploid	nincs gátlás
IMR-90	(ATCC CCL 186) tüdő diploid	nincs gátlás
Tumor-sejtek
G-361	(ATCC CRL 1424) melanoma	75
HT-1376	(ATCC CRL 1472) hólyag karcinóma	49
ZR-75-1	(ATCC CRL 1500) mell karcinóma	97
HŐS	(ATCC CRL 1543) csont szarkóma	47
WiDr	(ATCC CCL 218) vastagbél adenokarcinóma	37
MCF7	(ATCC HTB 22) mell adenokarcinóma	69
G-402	(ATCC CRL 1440) vese leiomioblasztóma	98
PANC-1	(ATCC CRL 1469) hámszerű karcinóma	59
HeLa	(ATCC CCL 2) hámszerű karcinóma	31

-181

HU 202 921 Β [ΙΠ-3] Immunológiai sajátságok

100 egység (LM)/ml koncentrációjú rHu-TNF-oldatot azonos térfogatú, 100-szoros hígítású, tisztított nyúl plazma TNF elleni antitesttel kevertünk össze, melyet a 4. referencia példa szerint állítottuk elő. 37 ‘C-on 2 őrás inkubálás után a fent ismertetett módon, célsejtként L-M sejteket használva meghatároztuk a reakcióelegy citotoxikus aktivitását.

Vizsgálati eredményeink szerint a rHu-TNF citotoxikus hatását az antitest egyáltalán nem semlegesítette, ebből a tényből arra következtethetünk, hogy a humán TNF polipeptid immunológiailag megkülönböztethető a nyúl TNF-től.

[IV] A találmány szerinti eljárással előállított polipeptideket oldat vagy liofilizett termék formájában állíthatjuk elő, amelyekből gyógyszerkészítményeket készíthetünk. A hosszú távú stabilitás szempontjából kedvezőbb, ha a termék liofilezett formában van. A termékhez előnyösen hordozóanyagot és stabilizálószereket is adunk. Stabilizálőszerként például albumint, globulint, zselatint, protamint, protaminsókat, glükózt, galaktózt, xilózt, mannitot, glukoronsavat, trehalózt, dextránt, hidroxi-etil-keményítőt, és nemionos felületaktív szereket - például poli(oxi-etilén)-zsírsavésztereket, poli(oxi-etilén)-alkil-étereket, poli(oxi-etilén)-alkil-fenil-étereket, poli(oxi-etilén)-szorbitán-zsírsav-észtereket, poli(oxi-etilén)-glicerin-zsírsav-észtereket, poli(oxi-etilén)-hidrogénezett ricinusolajat, poli(oxi-etilén)-ricinusolajat, poli(oxi-etilén)-poli(oxipropilén)-alkil-étereket, poli(oxi-etilén)-poli(oxi-propilén) blokk-kopolimereket, szorbitán, zsírsav-észtereket, szacharóz-zsírsav-észtereket és glicerin-zsírsavésztereket - használhatunk.

[V] A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek tumorsejtekkel szemben szelektív citotoxikus hatással rendelkeznek, és tumoros állatokban a tumort visszafejlesztik, fenti hatásuk következtében gyógyszerkészítmények hatóanyagaként tumorellenes szerként használhatók.

A polipeptid készítményeket parenterálisan vagy helyileg alkalmazhatjuk. Parenterális - például intravénás vagy intramuszkuláris - alkalmazást akkor választunk, ha a tumorsejtek nagy területen szóródtak szét vagy metasztázisban vannak, vagy a metasztázist akarjuk megakadályozni. Helyi tumoros szöveteket előnyösen közvetlen intratumoros alkalmazással kezelünk. A dózis a tumorok típusától és nagyságától, a beteg állapotától és az alkalmazás módjától függően változik. Rendszerint a dózis 1·10² - lxlO⁷ egység (LM)/kg, előnyösen 1Ί0³ - 1·10⁶ egység (LM)/kg.

A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi példák és referenciapéldák segítségével kívánjuk ismertetni a korlátozás szándéka nélkül.

A példák könnyebb megértése céljából a leírást az 1-5. ábrákkal is kiegészítettük.

Az 1. ábra a DNS-fragmensek előállítására használt restrikciós endonukleáz hasítási helyeit mutatja, és a humán TNF polipeptidet kódoló klónozott cDNS bázisszekvenciájának meghatározása során a szekvenálás irányát és mértékét [1-(9). példa].

A 2. ábrán a pHTT26 expressziós plazmid kialakítására szolgáló eljárást mutatjuk be [2-(1). példa].

A 3. ábra a pHTR91 expressziós plazmid kialakítására szolgáló eljárást szemlélteti [2-(2). példa].

A 4. ábrán a pHTS115 expressziós plazmid előállítási eljárása látható [2-(3). példa].

Az 5. ábra a pHTS37 expressziós plazmid előállítási eljárását mutatja [2-(4). példa],

1. példa (1) TNF mRNS előállítása humán alveolusz makrofágokból

A humán alveoláris makrofágokat foszfáttal pufferolt sóoldattal végzett broncho-alveoláris öblítéssel gyűjtjük össze. Az alveoláris makrofágokat - 6,3· 10⁷ sejtet - 10% magzati marhaszérumot tartalmazó RPMI-1640 táptalajban szuszpendáljuk, és 8 cm átmérőjű Petri-csészére oltjuk, 9·10⁶ sejt/csésze sejtsűrűséget biztosítva. A tenyészetet 37 'C-on 1 órán át előtenyésztjük, 5% szén-dioxidot tartalmazó, telített páratartalmú légtérben. Ezután a csészékbe 10 mikrogramm/ml végkoncentrációban endotoxint (E. coliból származó lipopoliszacharidot), 10 ng/ml végkoncentrációban TPA-t (forbol-12-mirisztát-13-acetátot) és 1 mikrogramm/ml végkoncentrációban cikloheximidet (proteinszintézis-inhibitor) mérünk. A tenyésztést 44,5 órán át tovább folytatjuk (a teljes tenyésztési idő 5-5,5 óra). A tápfolyadékot leszívatjuk, és a csészéhez tapadt makrofágokat 0,6% nátrium-N-lauroil-szarkozinátot és 6 mmól/1 nátrium-citrátot tartalmazó 5 mól/1 koncentrációjú guanidil-tiocianát-oldattal lizáljuk és homogenizáljuk. A homogenizátumot 0,1 mól/1 EDTAt tartalmazó 5,7 mól/1 koncentrációjú cézium-kloridoldatra öntjük, és 20 órán át 26 500 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk, ultracentrifugában (RPS27-2 rotor, Hitachi Koki), a teljes RNS-ffakciót szemcse formájában kapjuk. A szemcséket kis mennyiségű, 0,35 mól/1 nátrium-kloridot, 20 mmól/1 Tris-HCl-t (pH 7,4) és 20 mmól/1 EDTA-t tartalmazó 7 mól/1 koncentrációjú karbamidoldatban oldjuk, és etanolból kicsapva visszanyerjük. 159 mikrogramm össz-RNS-t kapunk a fenti módon. Az össz-RNS-frakciót 1 ml, 1 mmól/1 EDTA-t tartalmazó 10 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferben (pH 7,4) - továbbiakban TE-oldatként említjük - oldjuk, és az oldatot 65 °C-on 5 percen keresztül melegítjük. Az oldathoz 0,5 mól/1 végkoncentrációban nátrium-klorid-oldatot adunk, és az elegyet előzőleg 0,5 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó TE-oldattal ekvilibrált oligo(dT)-cellulóz-oszlopra visszük. Az oszlopról TE-oldattal 8 mikrogramm poli(A)mRNS-t eluálunk.

A poli(A)mRNS-t 1,9 ng/nl koncentrációban desztillált vízben oldjuk, és az oldatot mikroinjekciós módszerrel közel 50 nl/oocita dózisban beinjektáljuk a Xe19

-191

HU 202 921 Β nopus laevis oocitáiba. 10 oocitát 100 mikroliter Barthtáptalajban [J.B. Gurdon; J. Embryol. Exp. Morphol., 20,401 (1968)] 22 ’C-on 24 órán át inkubálunk. Az oocitákat homogenizáljuk és 10000 fordulat/perc sebességgel 10 percen át centrifugáljuk. A felülúszó TNF-aktivitását úgy határozzuk meg, hogy mérjük az egér L929 sejtekre kifejtett citotoxikus aktivitást.

Az egér L-929 sejtekkel szembeni citotoxikus hatást az alábbiak szerint mérjük.

0,1 ml mintát az alább említett táptalajjal sorozathígítunk, majd a 96 lyukú lemez (Flow Labs.) minden egyes lyukába 0,1 ml, 5·10⁵ sejt/ml töménységű L-929 sejt-szuszpenziót mérünk. Táptalajként 1% magzati marhaszérumot tartalmazó Eagle-féle minimáltáptalajt használunk. A lemezt 38,5 ’C-on 18 órán át inkubáljuk, 5% szén-dioxidot tartalmazó, telített páratartalmú légtérben.

Az éld L-929 sejtek számát, és a biológiai aktivitás kiszámítását ugyanúgy végezzük, mint azt a [111-2-(1)] fejezetben az egér L-M sejtekkel végzett citotoxikus aktivitás meghatározásával kapcsolatban már leírtuk.

A fenti módon, egér L-929 sejtekre kifejtett citotoxikus aktivitást egység (L-929)-ként adjuk meg, az egér L-M sejtekkel szembeni citotoxikus hatástól való megkülönböztetés miatt.

A fenti módon előállított felülúszó citotoxikus aktivitása 6,6 egység (L-929)/ml. Ez azt jelenti, hogy a poli(A)-mRNS készítmény TNP mRNS-t tartalmaz.

(2) cDNS szintézis

Az (1) lépésben kapott poli(A)mRNS-t templátként használva a komplementer DNS-t Gubler és Hoffman [Gene, 25, 263 (1983)] módszere szerint szintetizáljuk.

mikrogramm poli(A)mRNS-t 40 mikroliter, 10 mmól/1 magnézium-kloridot, 10 mmól/1 ditiotreitolt, 4 mmól/1 nátrium-pirofoszfátot, 1,25 mmól/1 dGTP-t, 1,25 mmól/1 dATP-t, 1,25 mmól/1 dTTP-t, 0,5 mmól/1 dCTP-t, 167 nmól/1 a ²P-dCTP-t (fajlagos radioaktivitása 3000 Ci/mmól), 4 mikrogramm oligo(dT)i2-l8at és 120 egység reverz transzkriptázt (madár mieloblasztózis vírusból (AMV)] tartalmazó 50 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferben (pH 8,3) oldunk, és az oldatot 43 ’C-on 30 percen át inkubáljuk. Ezután a reakciót EDTA hozzáadásával leállítjuk. A reakcióelegyet 1:1 arányú fenol-kloroform eleggyel extraháljuk, és a vizes fázishoz 2,5 mól/1 végkoncentrációban ammónium-acetátot adunk. A kapott cDNS-mRNS hibridet a vizes fázisból etanolos kicsapással nyerjük vissza. A cDNS-mRNS hibrid csapadékot 100 mikroliter, 5 mmól/1 magnézium-kloridot, 10 mmól/1 ammónium-szulfátot, 100 mmól/1 kálium-kloridot, 0,15 mmól/1 β-nikotinamid-adenin- dinukleotidot, 5 mikrogramm marha szérumalbumint, 0,04 mml/1 dGTP-t, 0,04 mmól/1 dATP-t, 0,04 mmól/1 dTTP-t, 0,04 mmól/1 dCTP-t, 0,9 egység E. coli ribonukleáz H-t és 23 egység E. coli DNS-polimeráz I-et tartalmazó 20 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferben (pH 7,5) oldjuk, és 12 ’C-on 60 percen át, majd 22 ’C-on 60 percen át inkubálva dscDNS-t szintetizálunk. A reakciót EDTA hozzáadásával állítjuk le. A dscDNS-t fenol-kloroform eleggyel extraháljuk, és etanolból kicsapva nyerjük vissza, mint azt fent leírtuk.

(3) Oligo(dC)-végű cDNS előállítása

A fenti lépésben kapott dscDNS-t 100 mikroliter, 2 mmól/1 kobalt-kloridot, 0,2 mmól/1 ditiotreitolt, 0,1 mól/1 a-³²P-dCTP-t (fajlagos radioaktivitása 3 Ci/mmól), és 10 egység terminális dezoxinukleotidiltranszferázt tartalmazó 100 mmól/1 koncentrációjú nátrium-kakodilát-pufferben (pH 7,2) oldjuk, és 37 ’C-on 30 percen át inkubáljuk, hogy a dscDNS 3'-végéhez hozzákapcsolódjon az oligo(dC)-vég.

A reakciót EDTA hozzáadásával leállítjuk. Az oligo(dC)-végű dscDNS-t fenol-kloroform eleggyel extraháljuk, és etanolból kicsapva visszanyerjük. Az oligo(dC)-végű dscDNS-t 2 mikrogramm/ml végkoncentrációban 1 mmól/1 EDTA-t, és 100 mmól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 10 mmól/1 koncentrációjú TrisHCl-pufferben (pH 7,4) oldjuk.

(4) Oligo(dG)-végü pBR322 DNS előállítása mikrogramm pBR322 DNS-t mikroliter, 10 mmól/1 magnézium-kloridot, 50 mmól/1 ammóniumszulfátot és 10 mikrogramm marha szérumalbumint tartalmazó 20 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferben (pH 7,4) oldunk, és 15 egység restrikciós endonukleáz Pstl-et adunk hozzá. Az elegyet 37 ’C-on 1 órán át inkubáljuk. A reakció befejeződése után a reakcióelegyet fenol-kloroform eleggyel extraháljuk és a vizes fázisból a kapott DNS-t etanolból végzett kicsapással nyerjük vissza. A kapott DNS-t 200 mikroliter, a dscDNS oligo(dC)-véggel való ellátásánál használt pufferével azonos összetételű, de még 80 egység terminális dezoxinukleotidil-transzferázzal kiegészített, és ³²P-dCTP helyett ³H-dGTP-t tartalmazó pufferben oldjuk, és 37 ’C-on 20 percen át inkubálva a 3’-véghez egy 10-15 dezoxiguanilsav-maradékból (dG) álló végcsoportot kapcsolunk. A reakcióelegyet fenol-kloroform eleggyel extraháljuk, és az oligo(dG)végű pBR322 DNS-t a vizes fázisból etanolból végzett kicsapással visszanyerjük. A kapott, végcsoporttal ellátott pBR322 DNS-t az oligo(dC)-végű dscDNS oldására használt pufferével azonos öszetételű puffeiben oldjuk, 20 mikrogramm/ml végkoncentrációban.

(5) Rekombináns plazmid előállítása

120 mikroliter oligo(dC)-végű cDNS-oldatot azonos térfogatú oligo(dG)-végű pBR322 DNS-oldattal elegyítünk, és az elegyet 65 ‘C-on 5 percen át, majd 57 ’C-on 120 percen át inkubálva hőkezeljük, és kialakítjuk a rekombináns plazmidot.

(6) Transzformált sejtek kiválasztása

A fenti módon kapott rekombináns plazmiddal E. coli χ1776 törzset transzformálunk, az alábbiak szerint.

Az E. coli χ1776 törzset 20 ml, 100 mikrog' ramm/ml diamino-pimelinsavval és 40 mikrog' ramm/ml timidinnel kiegészített L-táptalajban (összetétel: 10 g tripton, 5 g élesztőkivonat, 5 g nátrium-klo-201

HU 202 921 Β rid és 1 g glükóz/1 liter táptalaj; pH 7,2) tenyésztjük, míg a tenyészet zavarossága eléri a 0,5 értéket 600 nm-en. A sejteket 4 ’C-on centrifugálással összegyűjtjük és 10 ml, 50 mmól/1 kalcium-kloridot tartalmazó 10 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel (pH 7,3) mossuk. A sejteket 2 ml azonos összetételű pufferben szuszpendáljuk, és 0 ’C-on 5 percen át állni hagyjuk. 0,2 ml fenti szuszpenzióhoz 0,1 ml (5) lépésben kapott rekombináns plazmid-oldatot adunk. Az elegyet 0 ’Con 15 percen át állni hagyjuk, s majd 2 percen át 42 ’C-on tartjuk. Ezután hozzáadunk 0,5 ml kiegészített L-táptalajt, és a sejteket 1 órán át rázatva tenyésztjük. A tenyészetből mintát veszünk, 15 mikrogramm/ml tetraciklint tartalmazó, kiegészített L-táptalajos agarlemezre létegezzük és 37 ’C-on 12 órán át tenyésztjük. A cDNS génállományt a tetraciklin-rezisztens transzformált sejtek kiválasztásával kapjuk.

(7) Humán TNF cDNS klónozása

A fenti módon kapott cDNS génállományból telephibridizációs vizsgálattal választjuk ki a humán TNF polipeptidet kódoló cDNS-t tartalmazó rekombináns plazmidot befogadó transzformált sejteket, a hibridizálásra mintaként nyúl TNF-et kódoló klónozott cDNS-ből előállított DNS-fragmenseket használunk.

Közelebbről, a nyúl TNF-et kódoló cDNS-t az 1. referenciapéldában leírtak szerint izoláljuk rekombináns pRTNF802 plazmidból. Bázisszekvenciája a 3. táblázatban látható. A cDNS-t Aval vagy Haell restrikciós endonukleázzal emésztjük. Az emésztett DNSfragmenseket etanolból kicsapva nyerjük vissza. A kívánt DNS-fragmenseket poliakrilamid gél-elektroforézissel izoláljuk.

A 3. táblázatban látható, 285-583. bázisszekvenciának megfelelő DNS-ffagmenset (299 bázispár) Aval restrikciós endonukleázzal végzett lebontással kapjuk, és a továbbiakban Aval-ffagmensnek nevezzük. A 3. táblázat 33-120. bázisszekvenciájának megfelelő másik DNS-fragmenset (88 bázispár) Haell restrikciós endonukleázzal végzett emésztéssel nyerjük, a továbbiakban Haell-fragmensnek nevezzük. Az Aval-fragmenst és Haell-fragmenst ³²P-vel jelezzük. A jelzett DNS-fragmenseket használjuk mintaként a humán TNF polipeptidet kódoló cDNS-t tartalmazó plazmidot befogadó transzformált sejtek kiválasztására a cDNS génállományból, a Hanahan és Meselson Gene, 10, 63 (1980) módszere szerint végzett telep-hibridizációs vizsgálatban.

Közel 20 000 klón közül 43 kiónt szelektáltunk az első vizsgálatban, P-jelzett Aval-ffagmenset használva mintaként. A kapott 43 kiónt a második vizsgálatban mintaként ³²P-jelzett Haell-fragmenssel hibridizáltuk.

Végül 6 olyan cDNS-t tartalmazó rekombináns plazmidot befogadó kiónt szelektálunk, amely erősen hibridizált mind a kétféle nyúl TNF cDNS-fragmenssel.

(8) Expresszió

A (7) lépésben leírtak szerint szelektált hat transzformáit kiónból Wilkie és munkatársai [Nucleic Acid Rés., 7, 859 (1979)] módszere szerint izoláltuk a rekombináns plazmid DNS-eket, melyeket pHTNFl, pHTNF4, pHTNF5, pHTNF13, pHTNF22, illetve pHTNF26 plazmidnak neveztünk el. Minden egyes rekombináns plazmidot E. coli HB101 törzsbe viszünk be, a (6) lépésben leírt módon, a rekombináns plazmidokat befogadó transzformált sejtek előállítása céljából.

A transzformált sejteket 50 ml LB-táptalajban (öszszetétel: 10 g tripton, 5 g élesztőkivonat és 10 g nátrium-klorid/1 liter táptalaj; pH 7,5) tenyésztjük, míg a tenyészet zavarossága 600 nm-en eléri a 0,8 értéket. Ezután a kb. 3—5· 10³⁰ sejtet összegyűjtjük, és Nagata és munkatársai [Natúré, 284, 316 (1980)] módszere szerint lizáljuk, csekély változtatással. A sejteket 1 ml, 0,1% lizozimet és 30 mmól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 50 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferben (pH 8,0) újraszuszpendáljuk. A szuszpenziót 30 percen át jeges vízben állni hagyjuk, majd a sejteket hatszor megismételt fagyasztással és felolvasztással feltárjuk. A sejttörmeléket centrifugálással eltávolítva tiszta lizátumot kapunk. A transzformált sejtekből a fenti módon előállított lizátumot L-929 sejteket használva citotoxikus aktivitás szempontjából megvizsgáltuk.

Vizsgálataink szerint a pHTNFl3 plazmidot befogadó transzformánsból előállított lizátum citotoxikus aktivitása 186,1 egység (L-929)/ml.

(9) Klónozott cDNS bázisszekvenciájának meghatározása

A pHTNF13 rekombináns plazmidot a fent leírt módon izoláljuk. A plazmid DNS-t PstI restrikciós endonukleázzal hasítva izoláljuk a vektorba illesztett klónozott cDNS-t. A klónozott cDNS-fragmenst különféle restrikciós endonukleázokkal tovább hasítjuk, és a kapott 16 fragmens bázisszekvenciáját Maxam-Gilbert módszerrel meghatározzuk.

Az 1. ábra a fragmensek előállítására használt restrikciós endonukleázok hasítási helyeit mutatja, és a szekvenciameghatározás irányát a nyilak jelzik. A bekeretezett terület a humán TNF prekurzor polipeptidet kódoló régiót jelenti. A meghatározott bázisszekvenciát, és az abból következtetett aminosavszekvenciát a 4. táblázat mutatja. A humán TNF polipeptidet kódoló régiót a nyúl TNF-et kódoló bázisszekvenciával mutatott homológia alapján határozzuk meg.

A humán TNF polipeptidet kódoló DNS kódolja a 233 aminosav-maradékból álló prekurzor polipeptidet. A biológiailag aktív humán TNF polipeptid a prekurzor polipeptid kaiboxil-végétől számított 155 aminosav-maradékból álló polipeptidnek felel meg, amelyet a 4. táblázat 235-699. bázisából álló bázisszekvencia kódol (a 4. táblázatban a zárójelbe tett régió). A humán TNF polipeptidet kódoló utolsó kodont követő terminációs kodon egy TGA kodon.

(10) A humán TNF polipeptid immunológiai tulajdonságai

A fenti módon kapott lizátumban a humán TNF polipeptid nyúl plazma TNF elleni antitesttel adott immunológiai keresztreakcióját az alábbiak szerint vizsgáljuk.

-211

HU 202 921 Β

A lizátumhoz azonos térfogatú 100-szoros hígítású, tisztított nyúl plazma TNF elleni antitestet adunk, melyet a 4. referenciapélda szerint állítottunk elő. Az elegyet 37 ’C-on 2 órán át inkubáljuk, majd a reakcióelegy citotoxikus aktivitását a fent leírt módon, célsejtként L-929 sejtet használva meghatározzuk. Kontroll

TNF-készítményként a 2. referenciapélda szerint előállított, előzetesen foszfát-puffetrel hígított nyúl plazma TNF-et használunk. Mint az alábbi eredmények mutatják, a humán TNF polipeptid citotoxikus aktivi5 tását az antitest nem semlegesítette.

Minta	Nyúl plazma TNF elleni antitest	Citotoxikus aktivitás* [egység (L-929)/ml]
pHTNFl3 plazmidot befogadó	nincs hozzáadva	186,1
transzformáns lizátuma	hozzáadva	191,0
nyúl plazma TNF	nincs hozzáadva	572,3
	hozzáadva	<0,1

* a citotoxikus aktivitást a vizsgált eredeti oldatminta aktivitásaként adtuk meg.

2. példa

Humán TNF polipeptid előállítása Escherichia coli 20 sejtben (1) Expressziá tac promoter szabályozás mellett

A klónozott cDNS-t - mint azt az 1. példában említettük - a rekombináns pHTNF13 plazmidból izoláljuk. A cDNS-t EcoRI restrikciós endonukleázzal to- 25 vább emésztjük, hogy a TNF-et kódoló régiótól lefelé eső nem-kódoló légió egy részét lehasítsuk. A kapott DNS-fragmensét (kb. 1100 bázispár) egy pBR322 plazmidból Pstl és EcoRI restrikciós endonukleázos emésztéssel előállított nagyobb DNS-fragmensbe il- 30 lesztve olyan rekombináns plazmidot nyerünk, amelyben TNF cDNS és egy tetraciklin-rezisztencia gén van, a fenti plazmidot pHTl 13-nak nevezzük.

A biológiailag aktív humán TNF polipeptidet kódoló cDNS-t hordozó pHTT26 expressziós plazmid elő- 35 állítását a 2. ábrán szemléltetjük.

A pHT113-ból izolált cDNS-t Aval és Hindin restrikciós endonukleázokkal emésztjük, és a kapott DNSfragmenst (578 bázispár), amely a biológiailag aktív humán TNF polipeptidet kódoló régió nagy részét tar- 40 talmazza (továbbiakban HTNF-fragmensnek nevezzük), poliakrilamid gél-elektroforézissel izoláljuk.

A tac promoter régiót magában foglaló DNS-ffagmenst az alábbiak szerint izoláljuk.

300 mikrogramm pDR54O plazmid DNS-t [P-L Bi- 45 ochemicals; Russell, D.R. és munkatársai: Gene, 20,

231 (1982)] 2 ml, 50 mmól/1 nátrium-kloridot, 6 mmól/1 magnézium-kloridot és 6 mmól/1 2- merkapto-etanolt tartalmazó 10 mmól/1 koncentrációjú TrisHC1- pufferben (pH 7,5) oldunk, és EcoRI és BamHI 50 restrikciós endonukleázokkal 37 ’C-on 60 percen át inkubálva emésztjük. Az elegyhez 0,3 mól/1 végkoncentrációban nátrium-kloridot adunk, majd az emésztett DNS-fiagmenseket etanolból visszanyerjük. A tac promoter régiót magában foglaló DNS-fragmenst po- 55 liakrilamid gél- elektroforézissel izoláljuk, a hozam 8,3 mikrogramm.

A tac promoter fragmenst kémiailag szintetizált, ’ -G ATCCATGTCATCTTCTCG AACC

3’-GTACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT 60 képletű oligodezoxiribonukleotid adapterrel kapcsoljuk össze. A fenti adapter egy ATG iniciációs kodont és a biológiailag aktív humán TNF polipeptidet kódoló bázisszekvenciának 5’-terminális részét foglalja magában, és BamHI és Aval kohéziós terminálisokkal rendelkezik. A kapott DNS-fragmenst a továbbiakban tac promoter-adapter-fragmensnek nevezzük.

Fentiektől függetlenül, egy kb. 4300 bázispárból álló, nagyobb, ampicillin-rezisztencia gént magában foglaló DNS-fragmenst vágunk ki pBR322 plazmidból, HindlII és EcoRI restrikciós endonukleázokkal végzett emésztéssel, és a fragmenst alacsony olvadáspontú agarózt (0,7%) használva, gél-elektroforézissel izoláljuk. A fenti fragmenst a továbbiakban pBR322Amp^r-fragmensnek nevezzük.

mikrogramm HTNF-fragmenst és 6 mikrogramm pBR322-Amp^r-fragmenst 6,6 mmól/1 magnézium-kloridot tartalmazó, 66 mmól/1 koncentrációjú Tris-Hclpufferben (pH 7,6) oldunk, és az oldatot 55 ’C-on 10 percen át inkubáljuk. Az elegyhez ezután 1 mmól/1 ATP-t és 10 mmól/1 ditiotreitolt, továbbá 168 egység T4 DNS-ligázt adunk, és 22 ’C-on 120 percen át inkubáljuk. A kapott DNS-fragmenst fenolos extrakcióval nyerjük vissza, a hozam 4 mikrogramm. 0,8 mikrogramm DNS-fragmenst 0,3 mikrogramm tac promoter-adapter-fragmenssel kapcsolunk össze, a fentiekben alkalmazott körülmények között, azzal az eltéréssel, hogy 63 egység T4 DNS-ligázt használunk. A reakcióelegyet desztillált vízzel 6-szorosára hígítjuk, és azonos térfogatú, kalciummal kezelt E. coli JM103 sejtszuszpenzióval (P-L Biochemicals) elegyítjük. Az elegyet jeges vízfürdőn 20 percen át, majd 42 ’C-on 1 percen át, végül szobahőmérsékleten 10 percen át inkubáljuk, és LB-táptalajt adunk hozzá. Az elegyet 37 ’C-on 60 percen át rázatjuk. A kapott sejtszuszpenzióból vett mintát 25 mikrogramm/ml ampicillint tartalmazó, LB-táptalajos agar-lemezre rétegezzük, és egy éjszakán át 37 ’C-on tenyésztjük. Az ampicillinrezisztens telepeket szelektájuk.

A humán TNF polipeptid termelésére képes transzformánsok egyikét JM103/pHTT26-nak nevezzük.

-221

HU 202 921 Β

Az E. coli JM103 sejtek kalciumos kezelését az alábbiak szerint végezzük. 5 ml L-táptalajba E. coli JM103 sejteket oltunk, és egy éjszakán át 37 ’C-on tenyésztjük. A kapott tenyészet 1 ml-ét 100 ml LBtáptalajba oltjuk, és a tenyésztést 37 ’C-on addig folytatjuk, míg a 650 nm-en mért zavarosság eléri a 0,6 értéket. A tenyészetet 30 percen át jeges vízben állni hagyjuk, majd a sejteket centrifugálással összegyűjtjük és 50 ml 50 mmól/1 koncentrációjú kalcium-klorid-oldatban szuszpendáljuk, majd 60 percen át 0 ’C-on tartjuk. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük, 10 ml, 20% glicerint tartalmazó 50 mmől/1 koncentrációjú kalcium-klorid-oldatban újraszuszpendáljuk. A kapott sejtszuszpenziót használjuk kalciummal kezelt E. coli JM103 sejt-szuszpenzióként a fentiekben.

A JM103/pHTT26 transzformánst egy éjszakán át 37 ’C-on tenyésztjük, LB-táptalajban. A tenyészet 0,5 ml-ét 5 ml friss LB-táptalajba oltjuk, és 37 ’C-on 1 órán át tovább tenyésztjük. A tenyészethez ezután 1 mmól/1 végkoncentrációban izopropil-p-D-tiogalaktozidot adunk, és a tenyésztést 4 órán át tovább folytatjuk. A sejteket összegyűjtjük, és 1 ml, 0,1% lizozimet és 30 mmól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, 50 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferben (pH 8,0) szuszpendáljuk, majd 0 ’C-on 30 percen át állni hagyjuk. A szuszpenziót ezután száraz-jég/etanol fürdőn lefagyasztjuk, majd 37 ’C-on felolvasztjuk, és a fagyasztás-felolvasztás műveletét 6-szor megismételjük, a sejttörmeléket centrifugálással eltávolítva tiszta lizátumot kapunk. A lizátumot citotoxikus aktivitása 9,9· 10⁴ egység (L-929)/ml. A fenti citotoxikus aktivitást nem semlegesítette a 4. referenciapélda szerint előállított, nyúl plazma TNF elleni antitest, ami azt bizonyítja, hogy a humán TNF polipeptid nem ad immunológiai keresztreakciót nyúl plazma TNF-fel.

(2) Expresszió trp promoter szabályozás mellett

A pHTR91 expressziós plazmidot a 3. ábrán szemléltetett eljárással állítottuk elő.

A pHTl 13 rekombináns plazmidot Aval és Sáli restrikciós endonukleázokkal végzett emésztéssel 3, körülbelül 800, 1300, illetve 2600 bázispárt tartalmazó fragmensre hasítjuk. Az 1300 bázispárból álló DNSfragmenst, amely a biológiailag aktív humán TNF polipeptidet kódoló régió túlnyomó részét, és a tetraciklin- rezisztencia gén egy részét tartalmazza, és melyet a továbbiakban Aval-Sall-fragmensnek nevezünk, izoláljuk, és egy kémiailag szintetizált,

5’-CGATATGTCATCTTCTCGAACC ’-TATACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT képletű oligodezoxiribonukleotid adapterrel - továbbiakban I. adapterrel - kapcsoljuk össze.

A kapott DNS-fragmenst a továbbiakban HTNFadapter-fragmensnek nevezzük.

Ettől függetlenül, a pDR720 plazmidból [P-L Biochemicals; Russell, D.R. és munkatársai: Gene, 20, 231 (1982)] EcoRI és Hpal restrikciós endonukleázokkal végzett emésztéssel kihasítjuk a trp promoter régió egy részét magában foglaló, 35 bázispárt tartalmazó DNS-fragmenst, és egy kémiailag szintetizált, ’-AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAG GGTAAT ’-TTG ATC ATGCGTTCAAGTGCATTTTTCCC ATTAGC képletű adapterrel kapcsoljuk össze. A kapott DNSfragmenst a továbbiakban tip promoter-fragmensnek nevezzük.

A pBR322 plazmidot EcoRi és Sáli restrikciós endonuldeázokkal emésztjük, és a nagyobb, kb. 3700 bázispárt tartalmazó DNS- fragmenst izoláljuk. A fenti DNS-fragmensek, azaz a HTNF- adapter-fragmens, a trp promoter-fragmens és a nagyobb pBR322 fragmens szekvenciális kapcsolásával egy pHTR91 expressziós plazmidot kapunk. Az expressziós plazmidot az (1) pontban leírt módon E. coli HB101 sejtekbe visszük be, a transzformánsok egyikét HB101/ pHTR91-nek nevezzük.

A HB101/pHTR91 transzformánst egy éjszakán át 37 ’C-on módosított M-9 táptalajban (összetétel: 0,7% dinátrium-hidrogén- foszfát· 12H2O, 0,3% kálium-dihidrogén-foszfát, 0,05% nátrium-klorid, 0,1% ammónium-klorid, 2 mg/1 Bt-vitamin, 0,45% kazaminosav, 1 mmól/1 magnézium-szulfát, 0,1 mmól/1 kalcium-klorid és 0,5% glükóz) tenyésztjük. A tenyészet 0,05 miével 5 ml azonos összetételű táptalajt oltunk be, és 37'C-on 1 órán át tenyésztjük. A tenyészethez ezután 20 mikrogramm/ml végkoncentrációban 3-P-indolakrilsavat adunk, és a tenyésztést 4 órán át folytatjuk. A sejteket az (1) pontban leírtak szerint összegyűjtve és kezelve tiszta lizátumot kapunk.

A lizátumot citotoxikus aktivitása 1,01·10⁶ egység (L- 929)/ml.

(3) Expresszié phoS promoter szabályozás mellett

A szignál-peptiddel, és egy foszfát-kötő protein Nterminális részével fuzionált humán TNF polipeptidet termelésére képes, és a fuzionált proteint a gazdasejt periplazmájába ürítő pHTS115 expressziós plazmid előállítására szolgáló eljárást a 4. ábrán szemléltetjük.

A (2) pontban leírt módon kapott Aval-SalI-fragmenst egy kémiailag szintetizált,

5’-GATCCATGTCATCTTCTCGAACC

3’-GTACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT képletű oligodezoxiribonukleotiddal kapcsoljuk.

Az összekapcsolt DNS-fragmens BamHI restrikciós endonukleázzal emésztve mindkét végén BamHI kohéziós terminálissal rendelkező DNS fragmenst - továbbiakban HTNF-Tet^r»BamHI-fragmensnek nevezzük - állítunk elő.

Fentiektől függetlenül, egy phoS-gént tartalmazó pSN5182 plazmidot [Morita, T. és munkatársai: Eur. J. Biochem., 130, 427 (1983)] Hpal és EcoRi endonukleázokkal emésztve olyan, kb. 4000 bázispárt tartalmazó, phoS promoter régiót és Shine-Dalgamoszekvenciát magában foglaló DNS-fragmenst állítunk elő, amely a szignál- peptidet és a foszfát-kötő protein N-terminális szakaszát kódoló DNS-szekvenciát, továbbá a tetraciklin-rezisztencia gént tartalmazza. A fenti DNS-fragmenst a továbbiakban Hpal-EcoRI23

-231

HU 202 921 Β fragmensnek nevezzük. A Hpal-EcoRI-fragmenst egy kémiailag szintetizált,

5’-CCCGGATCCGGG

3’-GGGCCTAGGCCC szekvenciájú oligodezoxiribonukleotiddal kapcsoljuk össze.

Ezután a kapcsolt DNS-fragmenst BamHI restrikciós endonukleázzal emésztjük. A kapott, kb. 3600 bázispárból álló DNS-fragmenst, amely mindkét végén BamHI kohéziós terminálissal rendelkezik, a továbbiakban phoS promoter-BamHI*Tet^r fragmensnek nevezzük.

A HTNF-Tet^r«BamHI-fragmenst a phoS promoterBamHI*Tet^r-fragmenssel összekapcsolva foszfát-kötő proteinnel fuzionált humán TNF polipeptid termelésére képes expressziós plazmidot kapunk, melyet pHTSl 15-nek nevezünk. A fenti expressziós plazmidot a fent ismertetett eljárással E. coli HB101 sejtekbe visszük be.

A transzformánsok egyikét (HB101/pHTS 115) 5 ml 0,64 mmól/1 kálium-dihidrogén-foszfáttal kiegészített TG-táptalajban (összetétel: 120 mmól/1 koncentrációjú, 0,2% glükózt, 80 mmól/1 nátrium-kloridot, 20 mmól/1 kálium-kloridot, 20 mmól/1 ammónium- kloridot, 3 mmól/1 nátrium-szulfátot, 1 nmól/1 magnéziumkloridot, 0,2 mmól/1 kalcium-kloridot, 200 mmól/1 ferri-kloridot, 20 mg/1 leucint, 20 mg/1 prolint és 10 mg/1 Βι-vitamint tartalmazó Tris-HCl-puffer, pH 7,4), 37 ’C-on, rázatás közben 20 órán át tenyésztjük. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük, 2 ml 0,064 mmól/1 kálium-dihidrogén-foszfáttal kiegészített TG- táptalajban újraszuszpendáljuk és 37 °C-on 6 órán át tenyésztjük. A sejteket lecentrifugáljuk, 1 ml, 30 mmól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 10 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel (pH 7,2) mossuk, majd 0,2 ml 33 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferben (pH 7,2) újraszuszpendáljuk, és azonos térfogatú, 0,1 mmól/1 EDTA-t és 40% szacharózt tartalmazó 33 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-puffeirel (pH 7,2) elegyítjük. Az elegyet 37 ‘C-on 10 percen át inkubáljuk, majd a sejteket összegyűjtjük, 0,4 ml hideg, 0,5 mmól/1 koncentrációjú magnézium-klorid-oldatban újraszuszpendáljuk és jeges vizes fürdőn 10 percen át állni hagyjuk, a szuszpenziót időnként rázogatjuk. A sejttörmeléket centrifugálással eltávolítva tiszta extraktumot kapunk, melyet a továbbiakban periplazmás extraktumnak nevezünk.

A periplazmás extraktum citotoxikus aktivitása l,34»10⁵ egység (L-929)/ml.

A citotoxikus aktivitással rendelkező polipeptid móltömege nátrium-dodecilszulfát (SDS)-poliakrilamid gélben (12,5%) elektroforézissel meghatározva 19000, ami azt jelenti, hogy az előállított polipeptid egy fuzionált protein.

(4) Expresszié phoS promoter szabályozás mellett

A szignál-peptiddel és a foszfát-kötő protein N-terminális részével fuzionált humán TNF polipeptid, továbbá a prekurzorának egy részét is tartalmazó biológiailag aktív humán TNF polipeptid termelésére képes, és azt a gazdasejt periplazmájába ürítő pHTS37 expressziós plazmid előállítását az 5. ábrával szemléltetjük.

A pHTNF13 rekombináns plazmid DNS-t PstI restrikciós endonukleázzal emésztve kivágjuk a kb. 1200 bázispárból álló, humán TNF cDNS-t magában foglaló DNS-fragmenseket. A kapott DNS- fragmenst Bbel restrikciós endonukleázzal tovább emésztve egy kb. 900 bázispárból álló DNS-fragmenst kapunk, melyet a továbbiakban Bbel-Pstl-fragmensnek nevezünk.

mikrogramm Bbel-Pstl-fragmenst 80 mikroliter, 12 mmól/1 kalcium-kloridot, 12 mmól/1 magnéziumkloridot, 0,2 mmól/1 nátrium-kloridot, 1 mmól/1 EDTA-t és 0,02 egység Bal 31 exonukleázt tartalmazó 20 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl- pufferben (pH 8,0) oldunk, és 30 °C-on 30 percen át inkubálva a DNSffagmens mindkét végéről közel 50-150 bázispárt lehasítunk. A fragmensek végeit ezután 37 ’C-on 60 percen át 10 egység E. coli DNS-polimeráz I-gyel (nagy fragmens) inkubálva 0,1 mmól/1 dTGP, 0,1 mmól/1 dGTP, 0,1 mmól/1 dATP, 0,1 mmól/1 dCTP, és 0,1 mmól/1 dTTP, továbbá 50 mikrogramm/ml marha szérumalbumin jelenlétében kijavítjuk. A javított DNSfragmenst EcoRI restrikciós endonukleázzal emésztjük, és a kapott, közel 750 bázispárt tartalmazó DNSfragmenst, amely tompa és egy EcoRI kohéziós véggel rendelkezik - továbbiakban Bal 3 l-EcoRI-ffagmensnek nevezzük izoláljuk, a hozam kb. 3 mikrogramm.

A Bal 31-EcoRI-fragmenst a közel 4000 bázispárból álló Hpal- EcoRI-fragmenssel összekapcsolva - az utóbbit a (3) pontban pSN5182-ből állítottunk elő olyan expressziós plazmidot kapunk, amely phoS promoter régiót, Shine-Dalgamo-szekvenciát, a szignálpeptidet és egy foszfát-kötő protein N-terminális részét kódoló DNS-szekvenciát, és a biológiailag aktív humán TNF polipeptidet és prekurzor polipeptidjének egy részét kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz.

Az expressziós plazmidot pHTS37-nek nevezzük, és E. coli HB101 sejtekbe visszük be, a kapott transzformánst HB101/pHTS37-nek nevezzük. A HB101/pHTS37 transzformáns tenyésztését és a periplazmás extraktum előállítását a (3) pontban leírtak szerint végezzük.

A kapott periplazmás extraktum citotoxikus aktivitása 4,93*10 egység (L-929)/ml.

Az extraktumot SDS-poliakrilamid (12,5%) gélelektroforézisnek vetjük alá. Az elektroforézist 35 V feszültség mellett 12 órán át folytatjuk, 0,1% SDS-t tartalmazó Tris-glicin-puffért (pH 8,3) használva. A proteint Coomassie brilliant blue-val festjük meg. A 22000, illetve 16500 móltömegnek megfelelő helyzetben két olyan protein-sáv található, amely az E. coli HB101 extraktumában nem észlelhető. Egy másik géllemezt 2 mm-es csíkokra vágunk, és minden egyes gélszeletet 1 ml, 1% magzati marhaszérumot tartalmazó Eagle-féle minimáltáptalajban egy éjszakán át 4 ’Con rázatunk, a protein eíuálása céljából. Minden egyes eluátum citotoxikus aktivitását mérjük, célsejtként egér L- 929 sejteket használunk. Vizsgálati eredményeink szerint a Comassie brilliant blue-val festett le-241

HU 202 921 Β mezen a 16500 móltömegnek megfelelő helyen lévő protein erős citotoxikus aktivitással rendelkezik.

A pHTS37 expressziós plazmid szerkezete alapján feltételezhető, hogy a transzformált sejtekben termelt humán TNF polipeptid egy fuzionált protein, amely foszfát-kötő protein egy részéből és prekurzorának egy részét tartalmazó humán TNF polipeptidből áll. A fuzionált protein számított molekulatömege közel 23 000. A biológiailag aktív humán TNF polipeptid molekulatömege viszont 17 097. A fenti vizsgálati eredmény szerint a kapott fuzionált proteint a gazdasejtben korlátozott hidrolízissel biológiailag aktív humán TNF polipeptiddé alakíthatjuk, valószínűleg egy specifikus helyen (Arg-Ser) való hasítással, ahol a biológiailag aktív humán TNF polipeptid a prekurzor-részhez kapcsolódik.

Ha a periplazmás extraktumot 5 mikrogramm/ml tripszinnel (marha pankreászból előállított, Sigma Chemical Co.) 37 ’C-on 1 órán át inkubáljuk, és a reakcióelegyet SDS-poli-akrilamid gél- elektroforézisnek vetjük alá a fenti körülmények között, a 22 000 molekulatömegnek megfelelő helyzetben korábban kimutatott protein-sáv - amely valószínűleg a fuzionált protein sávja - nem észlelhető, a tripszines emésztés következtében eltűnik.

3. példa

Módosított humán TNF polipeptid előállítása

A biológiailag aktív humán TNF polipeptid N-terminális végéről négy aminosav törlésével kapott polipeptidet kódoló DNS-t hordozó pHTRD4 expressziós plazmidot lényegében a 2-(2). példában a pHTR91 expressziós plazmid előállítására szolgáló eljárással állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy az I. adapter helyett az

5’-CGATATGACC

3’-TATACTGGGGCT képletű szintetikus adaptert használjuk.

A fenti adapter használata esetén az iniciációs kodont (ATG) követő bázisszekvencia egy olyan 151 aminosavból álló polipeptidszekvenciát kódol, amely a biológiailag aktív humán TNF polipeptid N-terminálisán lévő négy aminosav (Ser-Ser-Ser- Arg) törlésével keletkezik.

A fenti eljárással előállított pHTRD4 expressziós plazmidot E. coli HB101 sejtekbe visszük be, és a kapott transzformánst egy éjszakán át 37 ’C-on, módosított M-9 táptalajban tenyésztjük. A tenyészet 0,05 ml-ét 5 ml azonos táptalajba oltjuk, és 37 ’C-on 1 órán át tenyésztjük. Ezután 20 mikrogramm/ml végkoncentrációban 3-P-indolakrilsavat adunk a tenyészethez, és a tenyésztést egy éjszakán át tovább folytatjuk. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük, és a 2-(l). példában leírtak szerint kezelve tiszta lizátumot állítunk elő.

A lizátum citotoxikus aktivitása 1,1· 10⁵ egység (L929)/ml.

4. példa

Humán TNF prekurzor polipeptid előállítása Escherichia coli-ban

A humán TNF prekurzor polipeptidet kódoló cDNSt hordozó pHTRP3 expressziós plazmidot a következők szerint állítjuk elő.

A pHT113 rekombináns plazmidból kettős, PstI és Hindin restrikciós endonukleázokkal végzett emésztéssel nyert klónozott cDNS-t HgiAI restrikciós endonukleázzal részlegesen tovább emésztve olyan - kb. 820 bázispárból álló - DNS-fragmenst kapunk, amely a prekurzor polipeptid nagy részét kódoló bázisszekvenciát magában foglalja. A kapott DNS-fragmenst kémiailag szintetizált,

5’-CGATATGAGCA

3’-TATAC képletű oligodezoxiribonukleotiddal kapcsoljuk össze. Az összekapcsolással nyert DNS-fragmenst a továbbiakban Pre-TNF-fragmensnek nevezzük.

Fentiektől függetlenül, a pDR720 plazmidból EcoRl és Hpal restrikciós endonukleázokkal végzett emésztéssel egy, a trp promoter régió egy részét tartalmazó DNS-fragmenst vágunk ki, és a kapott DNS-fragmenst kémiailag szintetizált, ’-AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAG GGTAAT ’-TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTTTTCCC ATTAGC képletű adapterrel kapcsoljuk össze.

A kapott DNS-fragmenst Pre-TNF-fragmenssel kapcsoljuk össze, és az összekapcsolt DNS-fragmenst egy, a pBR322 plazmidból EcoRl és HindlII restrikciós endonukleázos emésztéssel izolált, ampicillin-rezisztencia gént tartalmazó, kb. 4300 bázispárból álló DNSfragmenssel kapcsoljuk össze.

A fenti eljárással előállított pHTRP3 expressziós plazmidot E. coli HB101 sejtekbe visszük be, és a transzformált sejteket egy éjszakán át 37 ’C-on, módosított M-9 tápközegben tenyésztjük. A tenyészet 0,05 ml-ét 5 ml azonos táptalajba oltjuk, és a sejteket 1 órán át 37 ’C-on tenyésztjük. A tenyészethez ezután 20 mikrogramm/ml végkoncentrációban 3-p-indolakrilsavat adunk, és a tenyésztést egy éjszakán át tovább folytatjuk. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük, és a 2-(l). példában leírtak szerint kezelve tiszta lizátumot állítunk elő belőlük.

A lizátum citotoxikus aktivitása 1,8· 10⁴ egység (L929)/ml.

5. példa

Humán TNF polipeptid előállítása és tisztítása (1) Polipeptid előállítása Escherichia coli-ban

A humán TNF polipeptid előállítására a 2-(2). példa szerint előállított HB101/pHTR91 transzformánst használjuk. A transzformánst egy éjszakán át 12,5 mikrogramm/ml tetraciklinnel kiegészített LB-tápközegben 37 ’C-on tenyésztjük. A tenyészetet 10 ml, a 2-(2). példában is használt, módosított M-9 tápközegbe oltjuk, és 37 'C-on 1 órán át tenyésztjük. A tenyészethez 20 mikrogramm/ml végkoncentrációban 3-6-indolakrilsavat adunk, és a tenyésztést 4 órán át tovább folytatjuk. A sejteket a 2-(l). példában ismertetett módon összegyűjtjük, és tiszta lizátumot állítunk elő belőlük.

-251

HU 202 921 Β

A kapott lizátumot használjuk fel a tisztított humán TNF polipeptid előállítására.

(2) Humán TNF polipeptid tisztítása

A humán TNF polipeptidet az (1) pontban leírtak szerint kapott lizátumból a következők szerint tisztítjuk. 5·20 cm-es, előzőleg 20 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel (pH 7,8) ekvilibrált DEAE-Sepharose CL-6B-vel (Pharmacia) töltött oszlopra 1030 ml lizátumot viszünk fel. Az oszlopot 3 liter azonos pufferrei mossuk, majd 133 ml/óra átfolyási sebesség mellett a fenti pufferben 0-0,3 mól/1 lineáris koncentrációgradiensu nátrium- kloriddal eluáljuk. Az eluátumból 10 mles frakciókat gyűjtünk. A citotoxikus aktivitással rendelkező frakciókat összegyűjtjük és félretesszük.

A fenti lépésben a citotoxikus aktivitás 53%-át nyerjük vissza, a fajlagos aktivitás közel 9-szeresére növekedik.

A félretett frakciókat sómentesítjük, és ultraszűréssel [Diaflo, YM10 membrán (Amicon)] eredeti térfogatának 10-ed részére koncentráljuk.

A koncentrátumot preparatív méretű izoelektromos fókuszáló gél- elektroforézisnek vetjük alá. A koncentrátum egy alikvot mennyiségét 0,2· 10· 10 cm-es poliakrilamid géllemezre visszük, és Immobiline-nel (LKB) pH 5,6-pH 6,1 értékek közé eső pH-gradienst biztosítunk. Az elektroforézist 2400 V mellett, 15 ’Con 16 órán át folytatjuk. A gélt 10 mm széles csíkokra vágjuk, és a proteint 20 mmól/1 koncentrációjú TrisHCl-pufferrel (pH 7,8) eluáljuk. A fenti műveletet megismételjük. A citotoxikus aktivitással rendelkező eluátumokat összegyűjtjük, és ultraszúréssel koncentráljuk, a fenti módon. Végül a koncentrátumot 0,7*25 cm- es, Bio-gel P-6 (BIO-RAD) töltetű oszlopra visszük, és sómentesítjük.

A sómentesített végtermék citotoxikus aktivitása SDS- poliakrilamid gél-elektroforézises vizsgálat alapján homogén, és azt a [ΙΠ) fejezetben említettek szerint mint tisztított humán TNF polipeptidet vizsgáltuk.

6. példa

Liofilizált humán TNF polipeptid előállítása

Az 5. példa szerint előállított tisztított humán TNF polipeptid oldatot használjuk a liofilizált humán TNF polipeptid előállítására.

ml 2,2· 10⁷ egység (LM)/ml) citotoxikus aktivitással rendelkező tisztított humán TNF polipeptid oldatot 0,1 térfogatnyi 0,8%-os, 10% humán szérumalbumint és 20% D-mannitot tartalmazó nátrium-klorid-oldattal elegyítünk. Az oldat pH-ját 6,8-ra állítjuk, majd a kapott oldatot Microflow membránon (Flow Labs., pórusméret: 0,2 mikron) átszűrve sterilizáljuk.

ml steril oldatot üvegcsőbe töltünk, és liofilizáljuk. Minden egyes cső 10'egység (LM) tisztított humán TNF polipeptidet tartalmaz.

1. referenciapélda

Nyúl TNF cDNS előállítása (1) TNF mRNS előállítása nyúl alveolusz makrofágokból

Közel 2,5 kg-os nyulaknak intravénásán 100 mg/nyúl dózisban elölt, száraz Propionibacterium acnes sejteket injektálunk, majd az állatokat 8 nap múlva leöljük. A tüdőt az állat légcsövébe illesztett cső segítségével foszfáttal pufferolt sóoldattal többször átmossuk, és az alveoláris makrofágokat összegyűjtjük. 12 nyúlból körülbelül 3·10⁹ alveoláris makrofágot kapunk.

Az alveoláris makrofágokat 10% magzati marhaszérumot tartalmazó RPMI-táptalajban szuszpendáljuk, és 2·10⁷ sejt/csésze sejtkoncentrációt biztosítva 8 cm átmérűjő Petri-csészére oltjuk. A sejteket 5% szén-dioxidot tartalmazó, telített páratartalmú légtérben 37 ’Con előtenyésztjük. 1 órás előtenyésztés után 10 mikrogramm/ml végkoncentrációban endotoxint (E. coliból származó lipopoliszacharidot), 10 ng/ml végkoncentrációban TPA-t (forbol-12- mirisztát-13-acetátot) és 1 mikrogramm/ml végkoncentrációban cikloheximidet adunk a tenyészethez. A tenyésztést 4-4,5 órán át (azaz összesen 5-5,5 órán keresztül) folytatjuk, a táptalajt leszivatjuk, és a csészéhez tapadt makrofágokat 0,6% nátrium- lauroil-szarkozinátot és 6 mmól/1 nátrium-citrátot tartalmazó 5 mól/1 koncentrációjú guanidil-tiocianát-oldatban homogenizáljuk. A homogenizátumot 0,1 mól/1 EDTA-t tartalmazó, 5,7 mól/1 koncentrációjú cézium-klorid-oldatra visszük, és ultracentrifugában (Hitachi Koki, RPS27-2 rotor) 26 500 fordulat/perc sebességgel 20 órán át centrifugáljuk. Az össz-RNS- frakciót szemcsés formában kapjuk. A szemcséket kis mennyiségű, 0,35 mól/1 nátrium-kloridot, 20 mmól/1 Tris-HCl-puffert (pH 7,4) és 20 mmól/1 EDTA-t tartalmazó, 7 mól/1 koncentrációjú karbamidoldatban oldjuk, majd etanolból kicsapva visszanyerjük. 12 nyúlból 5,2 mg össz-RNS-t kapunk.

A össz-RNS-frakciót 2 ml, az 1-(1). példában használt TE-oldatban oldjuk, és az oldatot 65 ’C-on 5 percen át melegítjük. 0,5 mól/1 koncentrációban nátriumklorid-oldatot adunk hozzá, és az oldatot előzőleg 0,5 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó TE-oldattal ekvilibrált oligo(dT)-ce!lulóz-oszlopra visszük. Az oszlopról TE- oldattal eluáljuk a poli(A)-mRNS-t, a hozam 314 mikrogramm. 200 mikrogramm kapott poli(A)-mRNSt 6 mmól/1 karbamid jelenlétében 1% gélkoncentrációt alkalmazva, pH 4 értéken agaróz gél- elektroforézisnek vetünk alá, és a molekulaméretnek megfelelően 7 frakcióra választjuk szét. A poli(A)mRNS-t minden egyes gélfrakcióból úgy nyerjük ki, hogy a gélt 70 ’C-on 10 percen át melegítve megolvasztjuk, fenollal, majd kloroformmal extraháljuk, és etanolból kicsapjuk. Az egyes frakciókból visszanyert poli(A)mRNS nyúl TNF mRNS tartalmát Xenopos laevis oocitáit használva mRNS transzlációs vizsgálattal határozzuk meg.

A nyúl TNF mRNS-t nagyobb koncentrációban az 1600-2700 bázispámak megfelelő méretű frakcióból nyerjük vissza, melyet a továbbiakban nyúl TNF mRNS-ben feldúsult frakciónak nevezünk.

A nyúl TNF mRNS-ben feldúsult frakciót az alábbi kísérletben használjuk fel.

-261

HU 202 921 Β (2) cDNS szintézise

A cDNS-t az alábbiak szerint szintetizáljuk. 4 mikrogramm TNF mRNS-ben feldúsult frakciót 100 mikroliter, 10 mmól/1 magnézium-kloridot, 70 mmól/1 kálium-kloridot, 1 mmól/1 ditiotreitolt, 0,5 mmól/1 dTTPt, 0,5 mmól/1 dATP-t, 0,5 mmól/1 dGTP-t, 0,5 mmól/1. ³²P-ral jelzett dCTP-t (specifikus aktivitása 4,4*10° beütés/nmól), 3 mikrogramm oligo(dT)i2-i8-at és 80 egység madár mieloblaztozis vírusból származó reverz transzkriptázt tartalmazó, 50 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferben (pH 8,3) oldunk, és 43 °C-on 90 percen át inkubáljuk. A reakciót ezután EDTA hozzáadásával leállítjuk. A kapott cDNS-mRNS hibridet 1:1 arányú fenol- kloroform eleggyel extraháljuk, és etanolból kicsapva a vizes fázisból visszanyerjük. A mRNS templátot 65-70 ’C-on végzett lúgos kezeléssel eltávolítjuk. A szintetizált sscDNS-t etanolos kicsapással visszanyerjük.

Az sscDNS csapadékot 40 mikroliter, 0,5 mmól/1 dATP-t, 0,5 mmól/1 dTTP-t, 0Ó mmól/1 dCTP-t, 0,5 mmól/1 dGTP-t, 5 mmól/1 magnézium- kloridot, 70 mmól/1 kálium-kloridot, 1,5 mmól/1 2-merkapto- etanolt és 8 egység E. coli DNS-polimeráz I-et (nagy fragmens) tartalmazó, 0,1 mól/1 koncentrációjú Hepespufferben (pH 6,9) oldjuk, és 15 ’C-on 20 órán át inkubálva szintetizáljuk a dscDNS-t. A reakciót nátriumdodecil-szulfát hozzáadásával leállítjuk. A dscDNS-t fenol-kloroform eleggyel extraháljuk, és etanolból kicsapva visszanyerjük.

A kapott dscDNS-t 100 mikroliter, 1 mmól/1 cinkszulfátot, 200 mmől/1 nátrium-kloridot, 0,5% glicerint és 0,5 egység SÍ nukleázt tartalmazó, 50 mmól/1 koncentrációjú nátrium-acetát-pufferben (pH 4,5) oldjuk, és 37 ’C-on 20 percen át inkubálva elhasítjuk a hajttf-szerkezetet. A reakciót EDTA hozzáadásával leállítjuk. A reakcióelegyet fenol-kloroform eleggyel, majd dietil-éterrel extraháljuk. A dscDNS-t etanolból kicsapva nyerjük vissza.

(3) Oligo(dC)-végő cDNS előállítása

A fenti (2) pontban kapott dscDNS-t 100 mikroliter, 1 mmól/1 kobalt-kloridot, 0,1 mmól/1 ditiotreitolt, 0,2 mikrogramm poli(A)-t, 0,1 mmól/1 ³H-dCTP-t (specifikus aktivitása 5400 beütés/pmól) és 10 egység terminális dezoxinukleotidil- transzferázt tartalmazó, 130 mmól/1 nátrium-kakodilát-30 mmól/1 Tris-HCl pufferben (pH 6,8) oldjuk, és 37 ‘C-on 20 perces inkubálással a dscDNS 3’-végéhez hozzákapcsoljuk az oligo(dC)- végcsoportot.

A reakciót EDTA hozzáadásával leállítjuk. A reakcióelegyet fenol- kloroform eleggyel, majd dietil-éterrel extraháljuk, és az oligo(dC)-végű dscDNS-t etanolból végzett kicsapással viszanyeijük. Az oligo(dC)-végtf dscDNS-t 0,2 mikrogramm/ml végkoncentrációban 1 mmól/1 EDTA-t és 100 mmól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, 10 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferben (pH 7,4) oldjuk. ⁴ (4) Oligo(dG)-végű pBR322 plazmid DNS előállítása mikrogramm pBR322-t 100 mikroliter, 10 mmól/1 magnézium- kloridot, 50 mmól/1 ammóniumszulfátot és 10 mikrogramm marha szérumalbumint tartalmazó, 20 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl- pufferben (Ph 7,4) oldunk, és hozzáadunk 15 egység PstI restrikciós endonukleázt. Az elegyet 37 °C-on 1 órán át inkubáljuk. A reakció leállítása után a reakcióelegyet fenol- kloroform eleggyel extraháljuk, és a kapott DNS-t etanolból kicsapva a vizes fázisból visszanyerjük. A kapott DNS-t 200 mikroliter, a dscDNS oligo(dC)-véggel való kapcsolására használt pufferével azonos összetételi, de 80 egység terminális dezoxinukleotidil-transzferázt és ³H-dCTP helyett ³H- dGTPt tartalmazó pufferoldatban oldjuk, és 37 ’C-on 20 percen át inkubálva kialakítjuk a kb. 10-15 dG-ből álló végcsoportot. A reakcióelegyet fenol-kloroform eleggyel extraháljuk, az oligo(dG)-végű pBR322 plazmid DNS-t etanolból végzett kicsapás után a vizes fázisból visszanyerjük. A kapott, oligo(dG)- végcsoportot tartalmazó plazmid DNS-t az oligo(dC)-végű dscDNS oldására használt pufferével azonos összetételű pufferben oldjuk, 2 mikrogramm/ml végkoncentrációban.

(5) Rekombináns plazmid előállítása mikroliter oligo(dC)-végű cDNS-oldatot 50 mik-. roliter oligo(dG)-végű pBR322 DNS-oldattal elegyítünk, és az elegyet 65 ’C-on 10 percen át, 57 ’C-on 120 percen át, 45 ‘C-on 60 percen át, 35 ’C-on 60 percen át végül szobahőmérsékleten 60 percen át in-, kubálva hőkezeljük, és kialakítjuk a rekombináns plaz-, midokat.

(6) TTanszformánsok kiválasztása

A fenti (5) pontban kapott rekombináns plazmiddal E. coli χ1776 sejteket transzformálunk.

Közelebbről, az E. coli %1776-t 37 ’C-on 20 ml, 100 mikrogramm/ml diamino-pimelinsavval és 40 mikrogramm/ml timidinnel kiegészített L-táptalajban tenyésztjük, míg a tenyészet zavarossága 600 nm-en eléri a 0,5 értéket. A sejteket 0 ’C-on centrifugálással összegyűjtjük, és 50 mmól/1 kalcium-kloridot tartalmazó, 10 mmól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel (pH 7,3) mossuk. A sejteket 2 ml fenti összetételű pufferben újraszuszpendáljuk, és 0 'C-on 5 percen át állni hagyjuk. A szuszpenzió 0,2 ml-éhez 0,1 ml fent kapott rekombináns plazmidoldatot adunk. Az elegyet 0 ’Con 15 percen át állni hagyjuk, majd 2 percen át 42’Con tartjuk. Ezután hozzáadunk 0,5 ml fenti összetételű kiegészített L- táptalajt, és a sejteket rázatás közben 1 órán át tenyésztjük. A tenyészetből vett alikvot mintát 15 mikrogramm/ml tetraciklint tartalmazó L-tápközeges agarlemezre rétegezzük, és 37 ’C-on 12 órán át tenyésztjük. A tetraciklinre rezisztens transzformánsokat kiválasztjuk, és ezeket használjuk cDNS génállományként.

(7) Hibridizációs vizsgálat

A telep-hibridizációt Hanahan és Meselson módszerével végezzük, mintaként ³²P-jelzett cDNS-t haszná27

-271

HU 202 921 Β lünk, és kiválasztjuk azokat a transzformánsokat, amelyek nyúl TNF-et kódoló cDNS-t tartalmaznak. A pozitív és negatív indukciós, ³²P-ral jelzett sscDNS mintákat a fenti (2) pontban leírtak szerint szintetizáljuk, az (1) pontban leírt módon pozitív és negatív indukciós alveoláris makrofágokból nyert mRNS-eket használva, azzal az eltéréssel, hogy nagy fajlagos aktivitású ³²P-dCTP-t használunk. A fenti vizsgálat során kiválasztjuk azokat a transzformáns-telepeket, amelyek olyan rekombináns plazmidot fogadtak be, amely a pozitív indukciós mintával erősen hibridizál, de a negatív indukciós mintával nem hibridizál. A közel 20 000 telep közül 50 ilyen telepet szelektáltunk.

Az 50 szelektált telep közül 20 telepet ezután mRNS hibridizációs-transzlációs vizsgálatnak vetünk alá, T. Maniatis és munkatársai [(szerkesztő), „Molecular Cloning”, 329 (1980), Cold Spring Harbor Láb.] módszere szerint. Az egyes transzformánsokból extraháljuk a plazmid DNS-t, és hődenaturálás után nitrocellulóz szűrőkre visszük. A szűrőre visszük az (1) pontban leírt módon előállított nyúl TNF mRNS-t tartalmazó poli(A)mRNS-frakciót, és 50 °C-on 3 órán át inkubálva végrehajtjuk a hibridizálást. A hibridizált mRNS-t visszanyerjük, és oocitákba injektáljuk annak kimutatására, hogy a visszanyert mRNS valóban nyúl TNF mRNS-e. A vizsgálat eredményeként 3 olyan telepet szelektáltunk, amelyekben olyan cDNS-t tartalmazó plazmid volt, amely erősen hibridizált a nyúl TNF mRNS-sel. A legnagyobb méretű cDNS-t (kb. 750 bázispárt) tartalmazó plazmidból Ddel restrikciós endonukleázos emésztéssel kapott cDNS-fragmenseket használjuk mintaként a további vizsgálatban. A fenti DNS-fragmenseket ³²P-ral jelezzük. A fenti mintákat használva a (6) pontban kapott cDNS génállományt telep-hibridizációs vizsgálatnak vetjük alá, és kiválasztjuk azokat a telepeket, amelyek a jelzett mintákkal erősen hibridizálódó cDNS-eket tartalmazó plazmiddal rendelkeznek. A fenti vizsgálatban a cDNS génállományt tartalmazó 60 000 telep közül 98 telep bizonyult megfelelőnek. A rekombináns plazmid DNS-t izoláljuk és belőlük PstI restrikciós endonukleázos emésztéssel kivágjuk a betoldott cDNS-eket, és poliakrilamid gélelektroforézissel meghatározzuk azok méretét. 17 olyan transzformáns kiónt szelektálunk, amelyben legalább 1000 bázispárból álló betoldott cDNS van. A leg10 nagyobb méretű cDNS-t tartalmazó transzformánsból (transzformáns száma: %1776/pRTNF802; plazmid száma: pRTNF802) izoláljuk a klónozott cDNS-t, és bázisszekvenciáját az alábbi módszerrel meghatározzuk.

(8) Klónozott cDNS bázisszekvenciájának meghatározása

A fenti (7) pontban leírt módon szelektált %1776/pRTNF802 transzformánst diamino-pimelinsavval és timidinnel kiegészített L-táptalajban te20 nyésztjük. A sejteket Wilkie és munkatársai módszere szerint kezelve plazmid DNS-t kapunk. A plazmid DNS-t PstI restrikciós endonukleázzal emésztjük, és tisztítjuk, a klónozott cDNS előállítása céljából. A klónozott cDNS-fragmenst különféle restrikciós endonuk25 leázokkal tovább emésztjük, és a megfelelő, restrikciós endonukleázzal hasított fragmensek bázisszekvenciáját Maxam-Gilbert módszerrel meghatározzuk.

A fenti módon meghatározott bázisszekvenciát a 9. táblázatban ismertetjük. A 277-738. bázisokból álló bázisszekvencia kódolja a 2. referenciapélda szerint nyúlplazmából tisztított TNF N-terminális és C-terminális aminosavszekvenciájának megfelelő biológiailag aktív nyúl TNF-et. A 34-276. bázisok alkotják azt a bázisszekvenciát, amely feltehetőleg a prekurzor nyúl

TNF felépítéséhez szükséges polipeptidet kódolja.

9. táblázat 10 20 30

GGGGGGGGGGGGGGGCCCTCTGGAGAGAGC

50 60

GCCATGAGCÁCTGAGAGTAT GATCCGGGAC

MetSerThrGluSerMetlleArgAsp 70 80 90

GTCGAGCTGGCGGAGGGGCC GCTCCCCAAG ValGluLeuAlaGluGlyProLeuProLys

100 110 120 AAGGCAGGGG GGCCCCAGGG CTCCAAGCGC LysAlaGlyGlyProGlnGlySerLysArg

130 140 150

TGCCTCTGCC TCAGCCTCTT CTCTTTCCTG CysLeuCysLeuSerLeuPheSerPheLeu

160 170 180

CTCGTGGCTGGAGCCACCACGCTCTTCTGC LeuValAlaGlyAlaThrThrLeuPheCys

190 200 210

CTGCTGCACTTCAGGGTGATCGGCCCTCAG LeuLeuHisPheArgValIleGlyProGln

220 230 240

GAGGAAGAGCAGTCCCCAÁACAACCTCCAT OluGluGluGlnSerProAsnAsnLeuHis

-281

HU 202 921 Β

250 260 270

CTAGTCAACCCTGTGGCCCÁGATGGTCACC LeuValAsnProValAlaGlnMetValThr

280 290 300

CTCAGATCÁGCTTCTCGGGCCCTGAGTGAC LeuArgSerAlaSerArgAlaLeuSerAsp

310 3?0 330

AAGCCTCTAGCCCACGTAGTAGCAAACCCG LysProLeuAlaHisValValAlaAsnPro

340 350 360

CAAGTGGAGGGCCAGCTCCÁGTGGCTGAGC GlnValGluGlyGlnLeuGlnTrpLeuSer

370 380 390

CAGCGTGCGAACGCCCTGCTGGCCAACGGC GlyArgAlaAsnAlaLeuLeuAlaAsnGly

400 410 420

ATGAAGCTCACGGACAACCAGCTGGTGGTG MetLysLeuThrAspAsnGlnLeuValVal

430 440 450

CCGGCCGACGGGCTGTACCTCATCTACTCC ProAlaAspGlyLeuTyrLeuIleTyrSer

460 470 480

CAGGTTCTCTTCAGCGGTCAAGGCTGCCGC GlnValLeuPheSerGlyGlnGlyCysArg

490 500 510 tcctacgtg'ctcctcactcácactgtcagc

SerTyrValLeuLeuThrHisThrValSer

520 530 540 cgcttcgccgtctcctacccgaacaaggtc ArgPheAlaValSerTyrProAsnLysVal

550 560 570

AACCTCCTCTCTGCCATCAÁGAGCCCCTGC AsnLeuLeuSerAlalleLysSerProCys

580 590 600

CACCGGGAGACCCCCGAGGAGGCTGAGCCC HisArgGluThrProGluGluAlaGluPro

610 620 630

ATGGCCTGGTACGAGCCCATCTACCTGGGC MetA laTrpTypGluProIleTyrLeuGly

640 650 660

GGCGTCTTCCAGTTGGAGÁAGGGTGACCGG GlyValPheGlnLeuGluLysGlyAspArg

670 680 690

CTCAGCACCGAGGTCAACCAGCCTGAGTAC LeuSerThrGluValAsnGlnProGluTyr

730 740 750

TTTGGGATC ATTGCCCTGTGAGGGGACTGA PheGlyllelleAlaLeu

760 770 780

CCACCACTCCTCCCCCTCTCCCACCCCAGC

790 8Q0

CCCCTCACTCTGGGCGCCCTCAG

2. referenciapélda

Nyúl plazma TNF izolálása és tisztítása 55

2,5-3,0 kg-os nyulakba intravénásán 50 mg elölt, száraz Propioninbacterium acnes sejtet injektálunk. Nyolc nap múlva a nyulaknak intravénásán 100 mikrogramm endotoxint (E. coliból származó lipopoliszacharidot) injektálunk. Két óra múlva minden nyúltól 60 vért veszünk, szív-punkcióval. A vérhez 100 egység/100 ml koncentrációban nátrium-heparint keverünk, majd 5000 fordulat/perc sebességgel, hűtés közben 30 percen át centrifugálva eltávolítjuk a vérsejteket és az oldhatatlan anyagokat. 400 nyúlból 24 1 plazmát nyerünk.

-291

HU 202 921 Β

A 24 1 plazmához 24 g EDTA-t és 240 g celite-t adunk, és az elegyet 1 órán át keverjük, majd egymást követően 3 mikron, 1 mikron, végül 0,2 mikron pórusméretű szűrőn szűrjük.

1 szűrlethez 12 1 0,04 mól/1 koncentrációjú TrisHCl-puffert (pH 7,8) adunk, és az elegyet 27*45 cm-es DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia) oszlopra viszszük, melyet előzőleg 0,1 mól/1 nátrium- kloridot tartalmazó, 0,04 mól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel (pH 7,8) ekvilibráltunk. Az oszlopot ezután 75 1, 0,1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, 0,04 mól/1 koncentrációjú Tris-HCl- pufferrel (pH 7,8), majd 50 1, 0,15 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, 0,04 mól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel (pH 7,8) mossuk, és végül 0,18 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, 0,04 mól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel (pH 7,2) eluáljuk. Az eluátumból 8 1-es frakciókat szedünk, és a citotoxikus aktivitással rendelkező aktív frakciókat összegyűjtjük. Az aktív frakciókat egyesítjük, és azonos térfogatú 0,04 mól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel (pH 7,8) hígítjuk. A hígított oldatot 10*13 cm-es DEAE-Sepharose CL-6B oszlopra visszük. Az oszlopot 1 liter, 0,1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, 0,04 mól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel (pH 7,8) mossuk, majd 5 1, 0,18 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, 0,04 mól/1 koncentrációjú Tris-HCl- pufferrel (pH 7,2) eluáljuk. Az eluátumból 250 ml-es frakciókat szedünk, és a citotoxikus aktivitással rendelkező frakciókat összegyűjtjük és egyesítjük.

Az aktív frakciót 60 ’C-on 30 percen át melegítjük, majd gyorsan 4 ’C-ra hűtjük. A lehűtött oldatot ultraszűréssel koncentráljuk,

A kapott koncentrátumot 5*80 cm-es Sephacryl S200 (Pharmacia) oszlopra visszük, melyet előzőleg 0,1 mől/1 nátrium-kloridot tartalmazó, 0,005 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,4) ekvilibráltunk, és az oszlopot a fentivel azonos összetételű pufferrel eluáljuk. Az eluátumból 40 ml-es frakciókat szedünk, a citotoxikus aktivitással rendelkező frakciókat összegyűjtjük, egyesítjük és ultraszűréssel koncentráljuk.

Az aktív frakciókból gélszűréssel kapott koncentrátumot Zn²⁺-kelát-Sepharose oszlopra visszük, az alábbi módon. 1,6*20 cm-es oszlopot kelát-Sepharose-zal (imino-diecetsavval fixált gyanta) töltünk meg, melyet J. Porath és munkatársai [Natúré, 258, 598 (1975)] módszere szerint állíthatunk elő, majd 120 ml, 1 mg/ml koncentrációjú cink-klorid-oldattal mossuk, végül 0,1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, 0,05 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,4) ekvilibráljuk. Ezután az oszlopra visszük a fenti lépésben kapott koncentrátumot, és azonos összetételű pufferrel eluáljuk. Az oszlopon nem adszorbeálódott frakciókat gyűjtjük. A fenti frakciókban a citotoxikus aktivitást majdnem teljesen visszanyerjük.

A fenti lépésben kapott aktív frakciókat koncentráljuk, és 1,5*90 cm-es Toyopearl HW-55 (Toyo Soda Co., Ltd.) oszlopra visszük, melyet előzőleg 0,15 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó, 0,005 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,4) teljesen ekvilibráltunk. Az oszlopot azonos összetételű pufferrel eluáljuk, és az aktív frakciókat egyesítjük. A fenti módon kapott készítményt nevezzük tisztított nyúl plazma TNF-nek.

A tisztított nyúl plazma TNF-et a 3. és 4. referenciapéldákban használjuk fel.

3. referenciapélda

Nyúl plazma TNF N-terminális és C-terminális aminosavszekvenciájának meghatározása

A 2. referenciapélda szerint előállított tisztított nyúl plazma TNF N-terminális és C-terminális aminosavszekvenciáját az alábbiak szerint határozzuk meg.

Az N-terminális aminosavszekvenciát Edman-lebontásos módszerrel határozzuk meg. A kapott feniltiohidantoin-aminosavakat nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel azonosítjuk, Zorbax ODS oszlopot (Du Pont) használva.

A C-terminális aminosavszekvenciát enzimatikus módszerrel határozzuk meg, karboxipeptidázokat használva. A tisztított nyúl plazma TNF-et karboxipeptidáz A-val és Y-nal emésztjük, az enzim- szubsztrát arány 1:25, illetve 1:1000. A nyúl plazma TNF C- terminálisáról a kettős emésztés következtében felszabadult aminosavakat az emésztés 2-180 perce között megfelelő időközökben mikro-aminosav-analizátorral (Shimadzu Seisakusho) határozzuk meg.

Vizsgálataink szerint a nyúl plazma TNF N-terminális és C- terminális aminosavszekvenciája a következő:

N-terminális: Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-.....

C-terminális: ....Val-Tyr-Phe-Gly-Ile-Ile-Ala-Leu.

4. referenciapélda

Nyúl plazma TNF elleni antitest előállítása

A 2. referenciapélda szerint előállított 1,9* 10⁵ egység (L- 929) tisztított nyúl plazma TNF-et tartalmazó TNF-oldatot azonos térfogatú Freund-féle komplett adjuvánssal emulgeáljuk, és az emulziót több helyen szubkután módon tengerimalacok hátába injektáljuk. Az állatokat 1, 3 és 6 hét múlva azonos módszerrel immunizáljuk. Ezután 8 hét múlva intraperitoneálisan azonos mennyiségű tisztított nyúl plazma TNF-et injektálunk be, alumínium-hidroxid-géllel együtt. Az első immunizálás után 9 héttel szív-punkciőval levesszük az összes vért, és lecentrifugáljuk. Nyúl plazma TNF elleni antitestet tartalmazó antiszérumot kapunk.

Az antiszérumot normál nyúl szérum-protein komponensekkel kapcsolt Sepharose 4B oszlopra visszük. Ezt 3-szor megismételve nyúl plazma TNF-re specifikus tisztított antitestet kapunk. Immunoelektroforézissel és kettős géldiffúziós módszerrel kimutattuk, hogy az antitest csak a tisztított nyúl plazma TNF- fel képez precipitációs vonalat.

A kapott tisztított antitest 60 000-szeres hígításban 50%-ban semlegesíteni képes 500 egység (L-929) nyúl plazma TNF citotoxikus aktivitását. Az antitest 1000szeres hígításban teljesen semlegesíti 50 egység (LM) nyúl plazma TNF citotoxikus aktivitását.

Claims (21)

1. Eljárás az (Y)p-(X)n-(B)m-A a) általános képletű, humán tumor nekrózis faktor polipeptidet kódoló DNS, vagy a 3’-végen egy terminációs kodont tartalmazó fenti bázisszekvencia előállítására - a képletben

A jelentése

Thr Pro Ser Asp Lys Val Alá Asn Pro Gin Gin Trp Leu Asn Arg Leu Alá Asn Gly Val Gin Leu Val Val Pro Leu Ile Tyr Ser Gin Gin Gly Gys Pro Ser Thr His Thr Ile Ser Tyr Gin Thr Lys Val Ile Lys Ser Pro Cys Glu Gly Alá Glu Alá Pro Ile Tyr Leu Gly Gin Lys Gly Asp Arg Asn Arg Pro Asp Tyr Ser Gly Gin Val Tyr

Pro Val Alá His Val Alá Glu Gly Alá Leu Arg Alá Asn Alá Leu Glu Leu Arg Asp Asn Ser Glu Gly Leu Tyr Val Leu Phe Lys Gly Thr His Val Leu Leu Arg Ile Alá Val Ser Asn Leu Leu Ser Alá Gin Arg Glu Thr Pro Lys Pro Trp Tyr Glu Gly Val Phe Gin Leu Leu Ser Alá Glu Ile Leu Asp Phe Alá Glu Phe Gly Ile Ile Alá

Leu képletű polipeptid, amelyből egy vagy több aminosav hiányozhat, vagy amelyben egy vagy több aminosav más aminosavval lehet helyettesítve, de a homológia mértéke legalább 95%;

B jelentése

Ser-Ser-Ser-Arg (lb) képletű peptid, amelyből 1-3 aminosav hiányozhat, X jelentése az érett TNF-ben nem szereplő, teljes vagy részleges prekurzor-szekvencia,

Y jelentése Met és m, n és p értéke 1 vagy 0 -, azzal jellemezve, hogy (i) humán makrofágokat indukálószer(ek)kel együtt tenyésztünk, (ii) a makrofágokból elválasztjuk a humán tumor nekrózis faktor poliA mRNS-t tartalmazó frakciót,

(iii)a mRNS-ből egyszálú cDNS-t készítünk, reverz Ser Thr Glu Ser Met Leu Alá Glu Glu Alá Gly Gly Pro Gin Gly Phe Leu Ser Leu Phe Alá Gly Alá Thr Thr His Phe Gly Val Be Glu Phe Pro Arg Asp Pro Leu Alá Gin Alá

transzkriptáz alkalmazásával, majd azt kettős szálú cDNS-sé alakítjuk, (iv) a kettős szálú cDNS-t egy vektorba illesztjük, (v) a rekombináns vektort Escherichia coliba vive azt transzformáljuk, és egy cDNS génállományt állítunk elő, (vi) kiválasztjuk a hINF-et kódoló kiónokat és (vii) génállományból klónozzuk a humán tumor nekrózis faktort kódoló cDNS-t.

(Elsőbbsége: 1984. 03. 06.)

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás az (Y)_p-(X)n-(B)m-A (I) általános képletű aminosavszekvenciát kódoló

DNS, vagy a 3’-végen egy terminációs kodont tartalmazó fenti bázisszekvencia előállítására - a képletben

A, Β, Y, m, n és p jelentése az 1. igénypont tárgyi körében megadott, és X jelentése

Ile Arg Asp Val Glu Leu Pro Lys Lys Thr Ser Arg Arg Cys Leu Ser Phe Leu Ile Val Leu Phe Cys Leu Leu Gly Pro Gin Arg Glu Leu Ser Leu Ile Ser Val Arg

képletű polipeptid -, azzal jellemezve, hogy a megfelelő cDNS-eket klónozzuk. (Elsőbbsége: 1984. 03. 06.)

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás az olyan (Y)p-(X)n-(B)_m-A a) általános képletű aminosavszekvenciát kódoló DNS, vagy a 3’-végen egy terminális kodont tartalmazó fenti bázisszekvencia előállítására, ahol a képletben

A jelentése az 1. igénypontban megadott (la) képletű polipeptid,

B jelentése az 1. igénypontban megadott (lb) képletű peptid,

Yésp jelentése az 1. igénypontban megadott,

X jelentése a 2. igénypontban megadott (Ic) képletű polipeptid, és més n értéke 1,

-311

HU 202 921 Β azzal jellemezve, hogy a megfelelő cDNS-eket klónozzuk. (Elsőbbsége: 1984. 03. 06.)

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (Y)p-(X)n-(B)m-A (I) általános képletű aminosavszekvenciát kódoló

DNS, vagy a 3’- végen terminációs kodont tartalmazó fenti bázisszekvencia előállítására, ahol a képletben A jelentése az 1. igénypontban megadott (la) képletű polipeptid,

B jelentése az 1. igénypontban megadott (lb) képletű peptid, m értéke 1, n értéke 0, és

Yésp jelentése az 1. igénypontban megadott, azzal jellemezve, hogy a megfelelő cDNSeket klónozzuk. (Elsőbbsége: 1984. 03. 06.)

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (Y)p-(X)n-(B)m-A (I) általános képletű aminosavszekvenciát kódoló

DNS, vagy a 3’- végen terminációs kodont tartalmazó fenti bázisszekvencia előállítására, ahol a képletben

A jelentése az 1. igénypontban megadott (la) képletű polipeptid, n és m értéke 0, és

Y és p jelentése az 1. igénypontban megadott, azzal jellemezve, hogy a megfelelő cDNS-eket klónozzuk. (Elsőbbsége: 1984. 08. 17.)

5

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (Y)p-(X)n-(B)_m-A (I) általános képletű aminosavszekvenciát kódoló DNS, vagy a 3’-végen terminációs kodont tartalmazó fenti bázisszekvencia előállítására, ahol a képletben

10 A jelentése olyan (la) képletű polipeptid, amelyből egy vagy több aminosav hiányzik, vagy más aminosavval van helyettesítve, de a homológia mértéke legalább 95%, m és n értéke 0, és

15 Yésp jelentése az 1. igénypontban megadott, azzal jellemezve, hogy a megfelelő cDNSeket klónozzuk. (Elsőbbsége: 1984. 08. 17.)

7. Eljárás az (Y)p-(X)n-(B)_m-A (I) általános képletű humán tumor nekrózis faktor polipeptid - a képletben A jelentése

Thr Pro Ser Asp Lys Val Alá Asn Pro Gin Gin Trp Leu Asn Arg Leu Alá Asn Gly Val Gin Leu Val Val Pro Leu He Tyr Ser Gin Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Thr Ile Ser Tyr Gin Thr Lys Val Ile Lys Ser Pro Cys Glu Gly Alá Glu Alá Pro Ile Tyr Leu Gly Glu Lys Gly Asp Arg Asn Arg Pro Asp Tyr Ser Gly Gin Val Tyr

Leu

Pro Val Alá His Val Alá Glu Gly Gin Leu Arg Alá Asn Alá Leu Glu Leu Arg Asp Asn Ser Glu Gly Leu Tyr Val Leu Phe Lys Gly Thr His Val Leu Leu Arg Ile Alá Val Ser Asn Leu Leu Ser Alá Gin Arg Glu Thr Pro Lys Pro Trp Tyr Glu Gly Val Phe Gin Leu Leu Ser Alá Glu Ile Leu Asp Phe Alá Glu Phe Gly Ile Ile Alá

képletű polipeptid, amelyből egy vagy több aminosav hiányozhat, vagy más aminosawal lehet helyettesítve, de a homológia mértéke legalább 95%,

B jelentése

Ser-Ser-Ser-Arg (lb) képletű peptid, amelyből 1-3 aminosav hiányozhat, X jelentése az érett TNF-ben nem szereplő, teljes vagy vagy részleges prekurzor-szekvencia,

Y jelentése Met és m, n és p értéke 1 vagy 0 -, előállítására, azzal jellemezve, hogy a humán tumor nekrózis faktor polipeptidet kódoló 1. igénypont szerinti eljárással előállított DNS-t kívánt esetben egy he45 terológ polipeptidet kódoló DNS-sel összekapcsolunk, egy expressziós vektorba illesztünk, a rekombináns vektorral Escherichia colit transzformálunk, a transzformáit baktériumot tenyésztjük, és a tenyészetből kinyerjük a polipeptidet.

(Elsőbbsége: 1984. 03. 06.)

8. Az 7. igénypont szerinti eljárás olyan (Y)p-(X)n-(B)_ffi-A (I) általános képletű polipeptid előállítására, amelynek képletében

A, Β, Y, m, n és p jelentése a 7. igénypontban megadott, és

X jelentése

Ser Thr Glu Ser Met Leu Alá Glu Glu Alá Gly Gly Pro Gin Gly Phe Leu Ser Leu Phe

Ile Arg Asp Val Glu (Ic) Leu Pro Lys Lys Thr Ser Arg Arg Cys Leu Ser Phe Leu De Val

-321

HU 202 921 Β

Alá Gly Alá Thr Thr His Phe Gly Val Ile Glu Phe Pro Arg Asp Pro Leu Alá Gin Alá

Leu Phe Cys Leu Leu Gly Pro Gin Arg Glu Leu Ser Leu Ile Ser Val Arg

képletű polipeptid, azzal jellemezve, hogy a megfelelő klónozott cDNSt illesztjük az expressziós vektorba.

(Elsőbbsége: 1984. 03. 06.)

9. A 7. igénypont szerinti eljárás olyan (Y)p-(X)n-(B)m-A (I) általános képletű polipeptid előállítására, amelynek képletében

A jelentése a 7. igénypontban megadott (la) képletű polipeptid,

B jelentése a 7. igénypontban megadott (lb) képletű peptid,

X jelentése a 8. igénypontban megadott (Ic) képletű polipeptid, més n értéke 1, és

Y és p jelentése a 7. igénypontban megadott, azzal jellemezve, hogy a megfelelő klónozott cDNS-t illesztjük az expressziós vektorba.

(Elsőbbsége: 1984. 03 . 06.)

10. A 7. igénypont szerinti eljárás olyan (Y)p-(X)n-(B)_m-A (I) általános képletű polipeptid előállítására, amelynek képletében

A jelentése a 7. igénypontban megadott (la) képletű polipeptid,

B jelentése a 7. igénypontban megadott (lb) képletű peptid, m értéke 1, n értéke 0, és

Y és p jelentése a 7. igénypontban megadott, azzal jellemezve, hogy a megfelelő klónozott cDNS-t illesztjük az expressziós vektorba.

(Elsőbbsége: 1984. 03. 06.)

11. A 7. igénypont szerinti eljárás olyan (Y)p-(X)n-(B)_m-A a) általános képletű polipeptid előállítására, amelynek képletében

A jelentése a 7. igénypontban megadott (la) képletű polipeptid, m és n értéke 0, és

Y és p jelentése a 7. igénypontban megadott, azzal jellemezve, hogy a megfelelő klónozott cDNS-t illesztjük az expressziós vektorba.

(Elsőbbsége: 1984. 08. 17.)

12. A 7. igénypont szerinti eljárás olyan (Y)p-(X)n-(B)_m-A (I) általános képletű polipeptid előállítására, amelynek képletében

A jelentése a 7. igénypontban megadott (la) képletű polipeptid,

B jelentése a 7. igénypontban megadott (lb) képletű peptid, m értéke 1, és n és p értéke 0, azzal jellemezve, hogy a megfelelő klónozott cDNSt illesztjük az expressziós vektorba.

(Elsőbbsége: 1984. 03. 06.)

13. A 7. igénypont szerinti eljárás olyan (Y)p-(X)„-(B)_m-A (I) általános képletű polipeptid előállítására, amelynek képletében

A jelentése a 7. igénypontban megadott (la) képletű polipeptid, és m, n és p értéke 0, azzal jellemezve, hogy a megfelelő klónozott cDNSt illesztjük az expressziós vektorba. (Elsőbbsége: 1984. 08. 17.)

14. A 7. igénypont szerinti eljárás olyan (Y)_P-(X)n-(B)_m-A (I) általános képletű polipeptid előállítására, amelynek képletében

A jelentése olyan (la) képletű polipeptid, amelyből egy vagy több aminosav hiányzik, vagy más aminosavval van helyettesítve, de a homológia mértéke legalább 95%, m és n értéke 0, és

Y és p jelentése a 7. igénypontban megadott, azzal jellemezve, hogy a megfelelő klónozott cDNS-t illesztjük az expressziós vektorba.

(Elsőbbsége: 1984. 03. 06.)

15. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (Y)p-(X)n-(B)_m-A (I) általános képletű aminosavszekvenciának - a képletben p értéke 1, és A, Β, X, Y, m és n jelentése az 1. igénypontban megadott - megfelelő bázisszekvenciát a bázisszekvencia 3’-végén egy terminációs kodonnal kívánt esetben egy heterológ polipeptidet kódoló DNS-sel összekapcsolunk és működőképesen egy transzkripciós promotert tartalmazó expressziós vektorba illesztjük.

(Elsőbbsége: 1984. 03. 06.)

16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy transzkripciós promoterként trp promotert vagy tac promotert használunk.

(Elsőbbsége: 1984. 03. 06.)

17. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 15. igénypontban definiált (I) általános képletű aminosavszekvenciának megfelelő, 3’-végen terminációs kodont tartalmazó bázisszekvenciát a helyes transzlációs leolvasási rendben a fuzionálandó proteint kódoló másik bázisszekvenciához kapcsoljuk.

(Elsőbbsége: 1984. 03. 06.)

18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fuzionálandó proteint kódoló másik bázisszekvenciaként phoS gént használunk.

(Elsőbbsége: 1984. 03. 06.)

-331

HU 202 921 Β

19. A 15-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezye, hogy vektorként Escherichia coli plazmidot használunk.

(Elsőbbsége: 1984. 03. 06.)

20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez- 5 ve, hogy Escherichia coli plazmidként pBR322 plazmidot használunk.

(Elsőbbsége: 1984. 03. 06.)

21. Eljárás daganatellenes hatású gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezye, hogy a 7. igénypont szerinti eljárással előállított humán tumor nekrózis faktor polipeptidet, vagy annak biológiailag aktív részét vagy a fenti polipeptidet tartalmazó polipeptidet a gyógyszerkészítésben szokásosan használt hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítjuk.