JPS61155400A - インタ−フエロンの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業の利用分野） 本発明は組み換えＤＮＡ技術によって得られる生理活性
を有するポリペプチド、特に生理活性を有するポリペプ
チドをコードする遺伝子を含むプラスミドベクターによ
って形質転換された微生物によって生産されるポリペプ
チドを変性することなく、かつプロテアーゼによって分
解されることなく精製する方法に関する。本発明は−イ
ンターフェロン、特にヒト免疫インターフェロン（以下
、ｈ−ＩＦＮ−ｒと略す）活性を有するポリペプチド生
産微生物の培養物から目的ポリペプチドを精製するのく
有効な方法を提供するものでおる。

（従来の技術） 近年、遺伝子工学的手法の進展により、従来は生体から
の分離、精製に頼っていた多くの生理活性ポリペプチド
馨微生物や動物細胞から生産することが可能となった。

しカルながら、それらの目的物質を薬剤として使用する
のに十分な程純粋に。

しかも変性や分解ケ受けることなく抽出−精製する方法
は未だ十分確立されているとは言えない。

組換え微生物の生産するポリペグチドｆｔｔｎ酸グアニ
ジンや尿素などを用いて抽出、精製する方法（′Ｖ！開
昭５９−１６１３２１号公報および米国特許４．４７６
．０４９）や、モノクローナル抗体な用いた精製法（％
開昭５９−１８６９９５号公報）など精製法に関する技
術が開示されているが、これらの方法においても、目的
物質が変性や分解を受けず。

その活性が損われることなく十分精製され得るとは限ら
ない。

特に目的物質の生理活性を損うことなく、あるいは変性
を伴うことなく目的物質生産微生物の培養物からの目的
ポリペプチドを抽出、Ｖ′＃製する技術は医薬品として
使用する場合に重要であり、その技術の確立が産業上有
用であることは言をまたない。

このような精製技術は、現在医薬品としての利用が進め
られているインターフェロンについて特に望まれている
。インターフェロンは、物理化学的性質や免疫学的性質
の違いによって主にα・βおよびｒ型（各４．ＩＦＮ−
（！ＩＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γと略す）に分けられろ。

いずれも抗ウィルス活性乞有するが、その中でもＩＦＮ
−ｒは特に細胞増殖抑制作用が強いことから５抗ウイル
ス剤の他、抗腫瘍剤、免疫調節剤としての利用が期待さ
れる。また、インターフェロン活性は種特異性があるこ
とから例えばそれらを薬剤としてヒトに用いろ場合、ヒ
ト由来のインターフェロンを用いることが望まれる。遺
伝子工学的に生産されるインターフェロンでは特にその
抽出、晴製工程の確立が望まれている。

（発明が酵決しようとする問題点） 通常、岨換え微生物からのポリペプチドの抽出。

精製においては、まず培養微生物を殺菌剤を用いて死菌
としだ後（安全性の面から必須の工程）。

菌体を破砕し、続いて抽出操作に付す。これらの処理に
おいて目的とするポリペプチドが変性したり、その活性
が損われることがおる。また、これらの処理は菌体に含
まれるプロテアーゼの活性化？起しやすく、目的ポリペ
プチドが分解されることもある。

これまで、岨換え微生物から目的ポリペプチドを精製す
る場合、尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤で変性
、可溶化させた蛋白を抽出し、精製過程で変性剤を除く
手法が開示されている（前掲、特開昭５９−１６１！１
２１号公１１、゛米国特許４．４７６，０４９等）。し
かしながら、変性剤を除去しても目的ポリペプチドが完
全に復元した保証な得るのは困難である。従って、この
方法は目的ポリペプチドを医薬品として使用する場合は
好しいことではない。何故なら、一部変性したものが混
在する場合は、抗原となりうるからである。

一方、モノクローナル抗体を用いた精製法も報告されて
いるが（前掲、特開昭５９−１８６９９５など）、使用
するモノクローナル抗体のｇ識する抗原決定基によって
は変性された好しくないポリペプチドや、二量体、三量
体のような重合したポリペプチドも結合し得ることが考
えられろ。最近、ポリペプチドのプロテアーゼによる分
解ｔｍ止する目的で、プロテアーゼインヒビター共存下
で組換え太ＩＩｍの生産するｈ−ＩＦＮ−ｒｔ！：：抽
出する方法が前掲米国特許に開示されたが、ここで用い
られる塩酸グアニジンは蛋白変性剤としても知られてお
り（例えば、特開昭５９−１６１３２１号公報）、プロ
テアーゼによるポリペプチドの切断１ま抑制し得るが、
変性蛋白が生成されることが千りされるう （問題点解決のための手段） 本発明における精製方法はポリペプチドの変性を伴うこ
となく、また５プロテアーゼによるポリペプチドの分解
を抑えつ〜、効率良く、実質的に純粋な目的生理活性を
有するポリペプチドを提供しようとするものである。尚
、本発明は便宜上ｈ−ＩＦＮ−ｒ活性を有するポリペプ
チドの精製につい℃以下に説明するが、本発明の方法は
組換え礒生物の産生するＡｒｇ−ＬｙｓＪＩＦｊＡｒｇ
−Ａｒｇなどのプロテア−９分解を受は易いような部位
を含むｈ−ＩＦＮ−ｒ以外のポリペプチドの抽出、精製
にも適用できる。

本発明によれば、抽出過程においてブロタミンを添加す
ることにより、上記の様な間粗点？解決した。更に詳細
には１組換え微生物の培Ｊｌｌｉ体を緩衝液に＠濁し、
ブロタミンを添加した後、菌体を破砕し、その上１′＃
を得て、適当な精製工程に移ることにより、目的ポリペ
プチドを変性させることなく、又、プロテアーゼによろ
切断を受けることなく、繁雑な精製工程を加えることな
く、該ポリペプチドを精製できる。

ブロタミンは、アルギニン含量の高い強塩基性タンパク
でサケ、マス、ニシン、サバ等の梢子核中にデオキシリ
ボ核酸と結合したヌクレオブロタミンとして存在し、そ
の構造は、種特異性があり一部アミノ酸配列の解明され
たものもある。

本発明以前、既に、効力持続性インシェリン製造や抗ヘ
パリン剤であるブロタミン注射液が臨床薬剤として使用
されており、さらに除核酸剤として、又、除タンパク剤
として酸性タンパクの除去にも用いられている。

本発明者らは、上記ブロタミンがプロテアーゼインヒビ
ターとして使用しうろことを見出し１本発明？完成した
。

本発明に用いうるブロタミンとして檀々の物質が考えら
れるが、特にサルミン（サケ情子由来のブロタミン）が
好ましい。又、添加量は、菌株やブロタミンの種類によ
り最適濃度に違いが認められるが一般的には１チ〜５チ
が好ましい。

ブロタミンは培萎軒Ｔ後の菌体を緩衝浴液で懸濁した後
上記濃度となる様に添加し、Ｓ体を破砕して遠心により
上清を得て精製工程に入る。精製は従来より用いられて
いる橿４のカラム、透析法？適宜組み合わせて行なえる
。場合により塩析を工程中に含めることもある。詳しく
は後述する実施例で説明する。

本発明のも５１つの目的として１本発明の抽出精製法に
よって得られたｈ−ＩＦＮ−ｒ活性を有する実質的に純
粋なポリペプチドの提供がわげられろ。

本発明で述べるｈ−ＩＦＮ−γ活性を有するポリペプチ
ド生産株の１つであるＷ３１１０／ｐ　ｌＮ５Ｔ４の造
成については特願昭５８−１３２５２４に開示されてい
る。この生産株によって生産されるポリペプチドはＧＩ
Ｆ１４６と命名され次のアミノ酸配列ｔ１）で示される
。

Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔ
ｙｒ　Ｍａｌ　Ｌｙｓ　ＧｌｕＡｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ
　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　ＬＹＳ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　
Ａ１ａＧｌｙ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌ
ａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＴｈｒＬｅｕ　Ｐｈｅ　
Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔ
ｒｐ　ＬｙｓＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ
　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　ＳｅｒＧｉｎ　Ｉ
ｌｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙ
ｓ　Ｌｅｕ　ＰｂｅＬｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　
Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　ＧｉｎＬｙ
ｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ
　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　ＭｅｔＡｓｎ　Ｙａｌ　Ｌｙｓ　Ｐ
ｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　ＬＹｓ　Ｌｙ
ｓＬｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｑｌｕ　
Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ＡｓｎＴｙｒ　Ｓｅｒ　Ｖａ
ｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ
　ＡｒｇＬｙｓ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｌ
ｅｕ　工ｌｅ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　ＭｅｔＧｌｙ　Ａｒｇ
　ＡｒｇＡｌａ　Ｓｅｒ　ＧｉｎこのＧＩＦｉ４６生産
株は下記のＧＩＦ１４６をコードするＤＮＡ配列（Ｉｌ
ｌで示すＤＮＡ断片？含むプラスミドベクターで大腸ｄ
Ｗ３１１０に形質転換したものである。

ＴＧＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧ　ＣＡＣＣＣＡ　ＴＡＣＧＴ
Ｇ　ＡＡＧ　ＧＡＡＡＣＧ　ＡＴＧ　ＡＣＧ　ＧＴＣＣ
ｒＧ　ＧＧＴ　ＡＴＧ　ＣＡＣ’ＩＴＣＣＴＴＧＣＩ’
　ＧＡＡ　ＡＡＣＣＴＧ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＴＡＣＴＴ
ＣＡＡＣＧＣＴα込ＣＩＴ　ＴＴＧ　ＧＡＣＴＴＣＴＴ
Ｔ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＴＴＧα込（３ＧＴ　ＣＡＴ　Ｔ
Ｃｒ　ＧＡＣＧｒＴ　ＧＣＴ　弘ＣＡＡＣ（３＆”Ｔ　
ＡＣｒＣＣＡ　ＧＴＡＡ（Ｉ　ＣｒＧ　ＣＡＡ　ＣＧＡ
　ＣＴＧ　Ｔ’ｌ’Ｇ　ＣＣＡ　ＴＱＡＣＴＧ　ＴＴＣ
ＣＴＧ　ＧＧＴ　ＡＴＣＣＴＧ　ＡＡＡ　ＡＡＣＴＯＧ
　ＡＡＡＧＡＣＡＡＧ　ＱＡＣＣＣＡ　ＴＡＧ　ＧＡＣ
ＴＴｒ　ＴＴＧ　ＡＣＣＴＴＴＧＡＡ　ＧＡＡ　ＴＣＴ
　ＧＡＣＣＧｒ　ＡＡＡ　ＡＴＣＡＴＧ　ＣＡＧ　ＴＣ
ＴＣｒＴ　ＣｒＴ　ＡＧＡ　ＣＴＧ　ＯＣＡ　ＴＴｒ　
ＴＡＧ　ＴＡＣＡＴＣＡＧＡＣＡＧ　ＡＴＣＧＴｒ　Ｔ
ＣＴ　ＴｒＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧ　ＣＴＧ　ＴｒＣＧＴ
ＣＴＡＧ　ＣＡＡ　ＡＧＡ　ＡＡＧＡＴＧ　ＡＡＧ　Ｔ
ＴＣＧＡＣＡＡＧＡＡＡ　ＡＡＣＴＴＣＡＡＧ　ＧＡＣ
ＧＡＣＣＡＧ　ＴＣＴ　ＡＴＣＣＡＧＴＴＴ　ＴＴＧＡ
ＡＧ　ＴＴＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＴＣＡＧＡ　ＴＡＧ　
ＧｒＣＡＡＡ　ＴＣｒ　ＧＵＴ　ＧＡＡ　ＡＣｒ　ＡＴ
ＣＡＡＧ　ＧＡＡ　ＣａＣＡＴＧＴｒＴ　ＡＧＡ　ＣＡ
Ａ　ＣＴｒ　ＴＧＡ　ＴＡＧ　ＴＴＣαＴαＧ　ＴＡＣ
ＡＡＣＣＴＩ’　ＡＡＧ　ＴｒＣＴｒＣＡＡＣＴＣＴ　
ＡＡＣＡＡＧＡＡＡＴＴＧ　ＣＡＡ　ＴＴＣＡＡＧＡＡ
Ｇ　ＴＴＧＡ（Ａ　ＴＴＧ　ＴＴＣＴＴＴＡＡＧ　ＣＧ
Ｔ　（ＡＣＧんＣＴＴＣＧ入Ａ　ＡＡＧαＴ　ＡＣＴ　
ＡＡＣＴＴＣＧＣＡ　ＣｒＧ　ＣＴＧＡＡＧ　ＣＴＴ　
ＴｒＣＧＡＡ　Ｔ（３Ａ　ＴｒＧＴＡＣＴＣＴ　ＧｒＴ
　ＡＣＴ　（３ＡＣＣＴＴ　ＡＡＴ　ＧｒＡ　ＣＡＧ　
ＣＧＴＡＴＧ　ＡＣＡＣＡＡ　ＴＧＡαＧ匡刊ｎ　ＣＡ
Ｔ　ＧＴＧ’　ＧＣＡＡＡＡ　ＧＣＴ　ＡＴＣＣＡＴ　
ＧＡＡ　ＣＴＧ　ＡＴＣＣＡＧ　ＧｒＴ　ＡＴＧ’ｎ’
Ｔ　ＣＣＡＴＡＧ　ＧＴＡ　ＣＴＴ　（ＡＣＴＡＧ　Ｇ
ＴＣＣＡＡ　ＴＡＣＧＣＴ　ＱＡＡ　ＣＴＧ　ＴＣＣＣ
ＣＧ　ＧＣＴ　ＯＣＴ　ＡＡＡ　ＡＣＴ　απＣＧＡ　
ＣＴＴ　ＣＡＣＡＧＧ　ＧＧＣＣＣａ　ＣＧＡ　’ｒ’
ｒ’ｒ　’ｒＧＡＣＣＡＡＡＧ　ＣＧｒ　ＡＡＡ　ＡＧ
Ａ　ＴＣＴ　ＣＡＧＡＴＧ　ＣＴＧ　ＴｒＣＣＧＴＴＴ
ＣＧＣＡ　ＴＴＴ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＧｒＣＴＡＣＧｋ
ｃ　ＡＡＧ　ＧＣＡ（ＥＧＴ　ＣＧＴ　ＣＧＴ　（３Ｃ
Ｔ　ＴＣＴ　ＣＡＧＴＡＡＣＣＡ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　Ｃ
ＣＡＡＧＡ　ＧＴＣＡＴＴ（［） 一方、ｈ−ＩＦＮ−ｒ活性？有し、次のアミン酸配列ｔ
ｘｔで示されるポリペプチド（ＧＩＦ１４３と言う）の
生産株（Ｗ３１１０／ｐ　ｌＮ５Ｔ４Ｎ１４５　）は参
考例で詳しく説明するが以下のように造成することがで
きる。

＊ Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇ
ｌｕ　Ａｌａ　Ｇ１ｕ’ＡｓｎＬｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ
　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　
５ｅｒＡｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌ
ｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　ＬｅｕＧｌｙ　Ｉｌｅ　
Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇ
ｌｕ　５ｅｒＡｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ
　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　工ｌｅ　ＶａｌＳｅｒ　Ｐ
ｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙ
ｓ　Ａｓｎ　ＰｈｅＬｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　
Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　ＶａｌＧｌ
ｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ
　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｓ
ｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓ
ｐＡｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　
Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　ＭａｌＴｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅ
ｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｌ
ａ　ｌ１ｅＨｉｓ　　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ　Ｇｉ
ｎ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　ＬｅｕＳｅｒ　
Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌ
ｙｓ　Ａｒｇ　ＬｙｓＡｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ
　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　ＡｒｇＡ
ｌａ　　８ｅｒ　　Ｇｌｎ （鳳） （尚、Ｇｌｎ＊ｋｔ　Ｇｌ　ｎまたはｐ−Ｇ１ｎ１示す
。）また、このポリペプチド（ＧＩＦ１４り）　１に：
コードするＤＮＡ配列で示されるＤＮＡ断片が目的プラ
スミドベクターの造成に使用でき、る。

ＣＡＧ　ＧＡＣＣＣＡ　ＴＡＣＧｒＧ晶Ｇω人απ賜ハ
ＣＧｒＣＣＴＧ　ＧＧＴ　ＡＴＧ　ＣＡＣＴＴＣＣＴＴ
　ＣＧＡ　ＣＴＴ　ＴｒＧＣｒＧ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　Ｔ
ＡＣ’ＩＴＣ’　ＡＡＣＧＣＴ　ＧＧＴ　ＣＡＴ　Ｔα
ＧＡＣＴｒＣＴｒＴ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＴＴＧ　ＣＧＡ
　ＣＣＡ　ＧｒＡ　ＡＧＡＧＡＣσＴ　ＧＣＴ　ＧＡＣ
ハＣσ迂ＡごＯＴＧ　ＴＴＣαＧＣＴＧ　ＣＡＡ　ＣＧ
Ａ　ＣＴＧ　’ＩＴＧ　ＣＣＡ　ＴＧＡ　ＧＡＣ、静、
Ｇｌ、ＣＧＧＴ　ＡＴＣ’　ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＡＡＣＴ
ＧＧ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＱＡＡ　ＴＣＴＣＣＡ　ＴＡＧ
　ＧＡＣＴ’ｌＴ　ＴＴＧ　ＡＣＣＴＴＴ　ＣＴｒ　Ｃ
ＴＴ　ＡＧＡＧＡＣＣＧＴ　ＡＡＡ　ＡＴＣＡＴＧ　Ｃ
ＡＧ　ＴＣｒ　ＣＡＧ　ＡＴＣＧｒＴＣＴＧ　ＧＣＡ　
ＴＴＴ　ＴＡＧ　ＴＡＣＧＴＣＡＧＡＧＴＣＴＡＧ　Ｃ
ＡＡＴＣＴ　ＴＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧ　ＣＴＧ　ＴＴ
ＣＡＡＡ　ＡＡＣＴｒＣＡＧＡ　ＡＡＣＡＴＧ　ＡＡＧ
　ＴｒＣＧＡＣＡＡＧ　ＴＴＴ　ＴＴＧ　ＡＡＧＡＡＧ
　ＧＡＣＧＡＣＣＡＧ　ＴＣＴ　ＡＴＣＣＡＧ　ＡＡＡ
　ＴＣＴ　ＧｒＴＴｒＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＴＣＡＧＡ
　ＴＡＧ　ＧｒＣＴｒＴ　ＡＧＡ　ＣＡＡ艶、ＡＡＣＡ
ＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＴＧ舐Ｇ貫ＡＡＧＣＴＴ　ＴＧＡ
　丁ＡＧ　ＴＴＣＣｒＴ　　ＣＴＧ　ＴＡＣＴＴＧ　Ｃ
ＡＡ　ＴｒＣＴｒＣＴＴＣＡＡＣＴＣＴ　ＡＡＣＡＡＧ
　ＡＡＡ　ＡＡＧ　ＣＧＴ　ＧＡＣＡＡＧ　ＡＡＧ　Ｔ
ｒＧ　ＡＧＡ　ＴＴＧ　ＴＴＣＴＴＴ　ＴＴＣＧＣＡ口
℃ＧＡＣＴｒＣＧＡＡ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＡＣＴ　ＡＡ
ＣＴＡＣＴＣＴ　ＧＴＴｃＴＧ　ＡＡＧ　ＣＴｒ　’Ｉ
Ｔｃ　ＧＡＡ　ＴＧＡ　ＴＴＧ　ＡＴＧ　Ａ（ｊＡ　Ｃ
ＡＡＡＣＩ’　ＧＡＣＣＴＴ　ＡＡＴ　ＧＴＡ　ＣＡＧ
　ＣＧＴ　ＡＡＡ　ＧＣｒ　ＡＴＣＴＧＡ　ＣＴＧ　Ｇ
ＡＡ　ＴｒＡ　ＣＡＴ　ＧｒＣＧＣＡ　ＴＴｒ　αＩ　
ＴＡＧＣＡＴ　ＧＡＡ　ＣＴＧ　ＡＴＣ、ＣＡＧ　Ｇｒ
Ｔ　ＡＴＧ　ＧＣｒ　ＧＡＡ　ＣＴＧＧＴＡ　ＣＴＴ　
ＧＡＣＴＡＧ　ＧＴＣＣＡＡ　ＴＡＣＣＧＡ　ＣＴｒ　
ＧＡＣＴＣＣＣＣＧ　ＧＣＴ　ＧＣｒ　ＡＡＡ　ＡＣＴ
　ＧＧＴ　ＡＡＧ　ＣＧＴＡＡＡＡＧＧ　ＧＧＣＣＣＡ
　ＣＧＡ　ＴｒＴ　ＴＧＡ　ＣＣＡ　ＴＴＣＧＣＡ　Ｔ
ＴＴＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＡＧ　ＴＡＡ ＣＧＡＡＧＡＧＴＣＡＴＩ′（Ｉｖ） まずｐＧＩＦ５４（特開昭５８−２０１９９５中に開示
され℃いるｐＧＩＦ４と実質的に同じプラスミド）１７
’）Ａｒｔ［ｌとＢｇｊ！Ｉｆ切断により得られるＤＮ
Ａ断片を、さらＶｃｋｖａｌｌで処理し、ｆＡ付の一面
に示す様なＡｖａＯ−Ｂｇｆ［Ｉ断片を得る。次に、こ
の断片のＡｖｓｌｌサイトと、ｐＩＮ５Ｔ４　（特願昭
５８’−１５２５２４に開示）ｋＢｇＪ［ｌとＥｃｏＲ
ｌで処理して得゛られるテトラサイクリン耐性遺伝子（
Ｔｃ）ｆｔ持つ長い方のＤＮＡ断片のＥｃｏＲ１サイト
の間に、両端にＥｃｏＲｌとＡｖａ　Ｉｔのサイトを持
つ合成リンカ−＆ＤＮＡリガーゼ存在下罠挿入すること
により。

目的とするプラスミドｐＩＮ５Ｔ４Ｎ１４３　　を得る
。

これは、ＧＩＦｌ　４６のＮ末端側の６個のアミノ酸残
基からなる配列、Ｃｙｓ　−Ｔｙｒ　−Ｃｙｓ　　配列
が欠除したポリペプチドＧＩＦ１４３に対応する遺伝子
を含んでいる。続いて、このプラスミドｐＩＮ５Ｔ４Ｎ
１４３　　Ｋより宿主（Ｅ、Ｃｏ１１　Ｗ５１１０）’
を常法により形質転換して％ＧＩＦ１４３生産形質転換
大腸菌株（Ｗり１１０／ｐＩＮ５Ｔ４Ｎ１４３）　　を
得ろ。

なお、実施例においてはブロタミン仁してサルミンな用
いた精製例を述べるが、ブロタミンとしてはこれに限る
ことなく、他の種由来のものでも用いうろことは明らか
であるう以下参考例および実施例で本発明をさらに詳し
く説明する。

参考例　（ＧＩＦ１４３発現ベクターの作製）ＧＩＦ１
４３発現ベクターを以下の手順に従って作製した。

ｄｃｍ　大腸菌（シトシンのメチル化反応が欠損した株
）形質転換体であるＷＡ８０２／ｐＧＩＦ５４より常法
に従ってｐＧＩＦ５４　（ＧＩＦ１４６に相当する遺伝
子を含むｐＧＩＦ４　と実質的にｌＮｊ等なプラスミド
）を得た。５ｐｔのｐＧＩＦ５４　’ｔ　２０　ｕｎｉ
ｔのＡａｔｌｌ及び２０　ｕｎｉｔのＢｇ！’ｄで処理
し、約６００塩基対の、ＧＩＦ１４６遺伝子の一部とＬ
　ａｃＵＶ５プロモーターを含むＤＮＡｌｆｒ片を得た
。次に、このＤＮＡ断片約α５μｉｉ”ｋｓｕｎ口のＡ
Ｖａ　Ｉｔ　’に用いて切断し、ＧＩＦ１４６遺伝子の
一部を含む約４００塩基対のＤＮＡ断片を得た。一方ｐ
ＩＮ５Ｔ４５μｙを、２０ｕｎｉｔのＥｃｏＲｌと２０
ｕｎｉ−のＢｇｒｌｌ＆用いて切断し、テトラサイクリ
ン耐性遺伝子、　１１）Ｉ）プロモーター、及び複製起
点を含むＤＮＡ断片を得た。この両ＤＮＡ断片を添付の
図面に示した化学合成リンカ−（ＤＮＡ　５ｙｒｃｔｈ
ｅｓｉｚｅｒ：Ａｐｐｌｉｅｒ　Ｂｉｃｓｙｓｔｅｍｓ
　　３ＢＯＡ？！’用いて合成）０．５μ？を混合ライ
ゲーションすることにより。

ｐＩＮ５Ｔ４Ｎ１４５　　な得た。さらに得られたｐＩ
Ｎ５Ｔ４Ｎ１４５　　を常法例えば、特願昭５６−１６
３３０３　　記載の方法によりＷ５１１０に形質転換し
、Ｗ３１１Ｑ／ｐＩＮ５Ｔ４Ｎ１４３　ｆｊｔ得た。

得られた形質転換体がＧＩＦ１４３生産株であることは
、以下に示す手順で確認した。

Ｗ５１１０／ｐＩＮ５Ｔ４Ｎ１４６を、ポリペプトン６
ｓ１酵母工？２２％、ｆ　、Ａｚ　：ｆｆ　−ス：２　
％　、　ＫＨ２ＰＯ４０，５’に、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２
００，０１％およびテトラサイクリン２０μ）／Ｒｔヲ
含む培地１．５　ｍｌと共に１６．５１ＥＩＩ藏験看で
３０℃、２４時間振盪培養した。

培養＃％Ｔ後（ＯＤ６ｇ。中７）培養液０．５　ｄを１
．５ｄ谷エツベンドル７カップにとり、遠心分離（１０
，００Ｏｒｐｍ・５分間）することにより集菌した。こ
れを、ＩＱ／ａ／リゾチーム・１ｍＭΦＥＤＴＡ馨含む
ＰＢＳＦｉＧｆｉ（０，８％ＮａＣ１０，０２％ＫＣｌ
００１１５　％Ｎａ２ＨＰＯｉ　、０−０２％ＮａＨ２
ＰＯ，）０．５ｄに恕濁し、０°Ｃ・５０分間反応後、
凍結融解を６回繰り返すことにより細胞を破壊し、遠心
分離（１０，００Ｏｒｐｍ、１０分間）して上清画分乞
回収した。この上ｒ！１画分を特開昭５８−２０１９９
５に記載の方法に従って抗ウィルス活性を検討した。

その結果６Ｘ１０’　　ｕｎｉｔ／ｍの抗ウィルス活性
を認めた。一方、同様に集菌し得られた菌体をＳＤＳサ
ンプル浴液（７Ｍ尿素、１チＳＤＳ、１俤２−メルカプ
トエタノールを含んだ１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，２
）２００μノに溶解後、沸騰水浴中で１０分間加熱した
。このサンプル２０μｍを１６％ＳＤＳ／ＰＡＧＥで分
離後、コマ−ジブルーで蛋白栗色を行った。その結果、
大腸菌総蛋白の約２０幅に相当するＧＩＦ１４５蛋白（
分子賃約１８Ｋｄ）の生産を認めた。

実施例Ｉ　　ＧＩＦ１４６の抽出、精製ＧＩＦ１４６生
産株であるＷ＋１１０／ｐＩＮ５Ｔ４を、ポリペプトン
５Ｔｏ、酵母エキス２％、グルコース２チ、ＫＨ２ＰＯ
４０，５憾、Ｍｇ　Ｓｏ　、・７Ｈ２００，０１％およ
びテトラサイクリン２０μｆ−Ａ−を含む培地で６０℃
、２４時間１通気攪拌培養した。

培養液の菌体なグルコン酸クロルヘキシジンで完全に殺
菌後、遠心分離しく　８．００　Ｏｒｐｍ、　１０分間
）Ｗ３１１０／ｐ　ｌＮ５Ｔ４の湿菌体１００？を得た
。これを２０ｍＭ）リス塩陵バッファー（以下ＴＵＢ）
ｐＨ７，５７００ａｔｊ　Ｋ懸濁し、これにサルマン（
サケ***由来ブロタミン硫酸、和光紬薬）を最終濃度２
０ｑ／ｙｄとなる様に加え、氷冷したＭａｎｉｏｎＧａ
ｕｌ　ｉｎ社製ホモジナイザーＭ１５で破砕した後。

遠心分離しくス０００ｒｐｍ・２０分間）上清を得た。

次に、この上ｆｆｉ’に２０ｍＭ　ＴＨＢ　ｐＨ７，５
で平向化した。ＤＥＡＥ）−ヨーパールとＣＭ）−ヨー
パール（いずれも東洋曹達製）の連続カラムにかけ。

０　０、６　Ｍ　ＮａＣｊ直ＩＷ濃度勾配により！出し
、活性画分を集めた。なお、インターフェロン活性は。

特開昭５８−２０１９９５に記載した方法に準じて測定
した。次にこの画分に硫酸アンモニウムを加え２０壬砲
相とした後、２０ｍＭＴＨＢ　ｐＨ７，５（含２０憾（
ＮＨ２）２Ｓ０４）で平向化したプチルトーヨーパール
（東洋曹達社製）カラムにかけ、２０ｒｒｕ’ｖｉ　Ｔ
ＨＢ　ｐＨ７，５により溶出し、活性画分を集めた。こ
の両分’ｔ　２０　ｍＭ　ＴＵＢ・ｐＨ７，５で平向化
した亜鉛キレートカラム（ファルマシア社表）にかけ、
０−４０ｍＭＥＤＴＡ直線濃度勾配により溶出し、活性
画分な、２０ｍＭＴＨＢ、ｐＨ７，５（０，１％２−メ
ルカプトエタノール、以下２−ＭＥ）で平向化したＣＭ
トーヨーバールによる再クロマトグラフィーを行ない、
最終精製品として１００μ？の蛋白を得た。（インター
フェロン比活性＝１．６ｘ１０６ｔＪ／＃ＩＰ蛋白）。

この蛋白の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気体動（
以下５ＤＳ−ＰＡＧＥ）による純度検定では、純度９９
チ以上であり、又、同５ＤＳ−ＰＡＧＥのバンドの位ｉ
は、分解を受けていないＧＩＦ１４６の位置と一致した
。さらに、アミノ酸分析により、得られた蛋白が前記ア
ミン酸配列＋１１と則じアミノ酸配列を有することも確
認し、本発明の抽出、精製方法が有用であることが認め
られた。

実施例２　　ＧＩＦ１４！ｌの抽出、精製ＧＩＦ１４３
生産株であるＥ、Ｃｏ１１　（Ｗ３１１０／ｐＩＮ５Ｔ
４Ｎ１４３）を実施例１と同様に培養、殺菌、集菌して
、５０？の湿菌体な得た。これを、２０ｍＭＴＨＢ　１
ｐＨ７，４に懸濁した後、最終濃度３０Ｉｎ９／ｄとな
る様にサルマンを添加し、氷冷したマントンゴーリンホ
モジナイザーＭ１５にて菌体を破砕し、遠心分離（１５
，００Ｏｒｐｍ、１５分間）して、上清３５０ｗＬｔｋ
得た。この上清Ｆｉｅ２０ｍＭＴＨＢ。

ｐＨ７，４で平衡化した、ＤＥＡＥトーヨーパールとＣ
Ｍ）−ヨーパールの連続カラムにかけ、〇−０−５ＭＮ
ａ（Ｊ直ｍａ度勾配により溶出し活性画分を得た。この
両分に硫酸アンモニウム？加え５０チ／飽和とした後、
２０　ｍＭＴＨＥ＝　ｐＨ７，４（２０チ硫酸アンモニ
ウムを含む）で平向化したプチルトーヨーバールカラム
にかけ、２０ｍＭＴＨＢ　ｐＨ１４で溶出し、活性画分
な得た。これを蒸留水に対して透析した後、２０ｍＭＴ
ＨＢで平衡化したＣＭセファローズＣＬ６Ｂ（ファルマ
シア仕裂）カラムにかけ、ＮａＣｊの直ａ撲度勾配（０
−０，６５Ｍ）で溶出し、活性画分をセファクリルＳ−
２００（ファルマシア社製）分子篩クロママドグラフィ
ーを行ない最終稍爬品として、９７〜の蛋白を得た。（
インターフェロン比活性：２．９Ｘ１０Ｕ／ダｐｒｏｔ
　）得られた蛋白について実施例１と同様に５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ　　及びアミノ酸分析を行なったところ、前記ア
ミノ酸配列ｌと同じアミノ酸配列を有し、純度９９チ以
上であることが確認された。

【図面の簡単な説明】

図面は、本発明の方法が適用されるＧＩＦ１４３を生産
するための大腸菌形質転換用プラスミドベクターｐＩＮ
５Ｔ４Ｎ１４３　　の造成経路を説明する図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）組換えＤＮＡ技術によつて得られる生理活性を有す
   るポリペプチドの生産微生物を培養して得られる培養物
   から、該ポリペプチドを抽出、精製する工程においてブ
   ロタミンを添加することを特徴とする生理活性を有する
   ポリペプチドの精製方法。 ２）前記生産微生物の培養物から得られる微生物細胞を
   懸濁した溶液にブロタミンを加え、破砕することを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の精製方法。 ３）前記生理活性を有するポリペプチドがインターフェ
   ロン活性を有するポリペプチドである特許請求の範囲第
   １項又は第２項記載の精製方法。 ４）前記ブロタミン添加量が１％以上５％未満である特
   許請求の範囲第１項、第２項または第３項記載の精製方
   法。 ５）前記ポリペプチドがヒト免疫インターフェロン活性
   を有するポリペプチドである特許請求の範囲第１項から
   第４項のいずれかの項に記載の精製方法。 ６）ヒト免疫インターフェロン活性を有するポリペプチ
   ドがＧＩＦ１４６である特許請求の範囲第５項記載の精
   製方法。 ７）ヒト免疫インターフェロン活性を有するポリペプチ
   ドがＧＩＦ１４６をコードするＤＮＡ配列（II）を含ん
   だ複製可能なプラスミド形質転換された微生物によつて
   産生されるポリペプチドである特許請求の範囲第６項記
   載の精製方法。 ８）ヒト免疫インターフェロン活性を有するポリペプチ
   ドがＧＩＦ１４３である特許請求の範囲第６項記載の精
   製方法。 ９）ヒト免疫インターフェロン活性を有するポリペプチ
   ドがＧＩＦ１４３をコードするＤＮＡ配列（IV）を含ん
   だプラスミドで形質転換された微生物又は動物細胞によ
   つて発現されるポリペプチドである特許請求の範囲第６
   項記載の精製方法。