HRP20040170A2

HRP20040170A2 - Combination therapy for the treatment of cancer

Info

Publication number: HRP20040170A2
Application number: HR20040170A
Authority: HR
Inventors: Jaime Masferrer; Parul Doshi; Julie Cherrington
Original assignee: Sugen; Pharmacia Corp
Priority date: 2001-08-15
Filing date: 2004-02-20
Publication date: 2004-08-31
Also published as: ECSP045021A; WO2003015608A3; EP1427326A2; JP2005501843A; SK1412004A3; HUP0500424A3; RS13204A; KR100656004B1; EA008137B1; US20030216410A1; US7320996B2; DE60229959D1; KR20040043193A; MA27060A1; BR0211978A; IL159887A0; CO5560544A2; BG108622A; AU2002329744B2; MXPA04001464A

Description

Područje izuma

Ovaj se izum odnosi na postupke liječenja ili sprečavanja neoplastičnih bolesti upotrebom inhibitora tirozin-kinaza u kombinaciji s inhibitorima ciklooksigenaze, naročito selektivnim inhibitorima ciklooksigenaze-2.

Stanje tehnike

Neoplazma ili tumor je abnormalna, nepravilna i neorganizirana proliferacija staničnog rasta. Neoplazma je maligna, ili kancerozna, ukoliko posjeduje svojstva destruktivnog rasta, invazivnost i metastaziranje. Invazivnost se odnosi na lokalno širenje neoplazme infiltracijom ili razaranjem okolnog tkiva, tipično prodiranjem kroz bazalne lamine koje određuju granice tkiva, čime često ulaze u tjelesni cirkulacijski sustav. Metastaziranje se tipično odnosi na rasipanje tumorskih stanica limfnim ili krvnim žilama. Metastaziranje se također odnosi na migriranje tumorskih stanica izravnim širenjem kroz serozne šupljine, subarahnoidne ili druge prostore. Kroz proces metastaziranja, migriranje tumorskih stanica do drugih dijelova tijela uspostavlja neoplazme u područjima udaljenima od mjesta početne pojave.

Rak je drugi vodeći uzrok smrti u Sjedinjenim Državama i više od 8 000 000 osoba u Sjedinjenim Državama ima dijagnosticiran rak. U 1995, rak je uzrokovao 23,3% svih smrti u Sjedinjenim Državama (v. U.S. Dept. of Health and Human Services, National Center for Health Statistics, Health United States 1996-97 i Injury Chartbook 117 (1997)).

Na molekularnoj razini, rak nije potpuno protumačen. Poznato je da izlaganje stanice karcinogenu, kao što su neki virusi, kemikalije ili zračenje, dovodi do promjena na DNA koje inaktiviraju "supresivni" gen ili aktiviraju "onkogen". Supresivni geni su geni regulatori rasta, koji uslijed mutacije ne mogu više kontrolirati stanični rast. Onkogeni su isprva normalni geni (nazvani proonkogeni) koji mutacijom ili promijenjenim kontekstom ekspresije postaju transformirajući geni. Produkti transformirajućih gena uzrokuju neprikladan stanični rast. Više od dvadeset različitih normalnih staničnih gena mogu postati onkogeni uslijed genetske promjene. Transformirane stanice razlikuju se od normalnih na više načina, uključujući staničnu morfologiju, međustanične interakcije, sadržaj membrana, strukturu citoskeleta, sekreciju proteina, ekspresiju gena i mortalitet (transformirane stanice mogu beskonačno rasti).

Rak se danas liječi primarno jednom ili kombinacijom tri tipa terapija: kirurškom, radijacijskom i kemoterapijom. Kirurgija uključuje grubo uklanjanje bolesnog tkiva. Dok je kirurški pristup ponekad učinkovit u uklanjanju tumora smještenih na nekim mjestima, na primjer, dojci, debelom crijevu i koži, ne može se koristiti u liječenju tumora smještenih u drugim područjima, kao što su kralješnica, niti u liječenju razasutih neoplastičnih stanja, kao što je leukemija.

Kemoterapija uključuje prekid stanične replikacije ili staničnog metabolizma. Koristi se najčešće u liječenju raka dojke, pluća i testisa.

Štetni učinci sistemske kemoterapije koja se koristi u liječenju neoplastične bolesti najviše plaše pacijente koji se liječe od raka. Od tih štetnih učinaka, najčešći i najteži popratni učinci su mučnina i povraćanje. Drugi štetni učinci uključuju citopeniju, infekcije, kaheksiju, mukozitis u pacijenata koji primaju visoke doze kemoterapije, uz spašavanje koštane srži ili radijacijsku terapiju; alopeciju (gubitak kose); kožne komplikacije (v. M. D. Abeloff i sur.: Alopecia and Cutaneous Complications, str. 755-56. U: Abeloff, M.D., Armitage, J.O., Lichter, A.S. i Niederhuber, J.E. (ur.) Clinical Oncology, Churchill Livingston, New York, 1992, za kožne reakcije na kemoterapijska sredstva), kao što su pruritis, urtikarija i angioedem; neurološke komplikacije; plućne i srčane komplikacije u pacijenata koji primaju zračenje ili kemoterapiju; te reproduktivne i endokrine komplikacije.

Popratni učinci izazvani kemoterapijom značajno utječu na kvalitetu života pacijenta i mogu dramatično utjecati na njegovo pristajanje na tretman.

Nadalje, štetni popratni učinak povezan s kemoterapijskim sredstvima općenito je glavna toksičnost koja ograničava dozu (DLT) u primjeni ovih lijekova. Na primjer, mukozitis je jedna od glavnih toksičnosti koja ograničava dozu nekih sredstava protiv raka, uključujući antimetaboličko citotoksično sredstvo 5-FU, metotreksat i antitumorske antibiotike, kao što je doksorubicin. Mnogi od tih popratnih učinaka izazvanih kemoterapijom, ukoliko su teški, mogu dovesti do hospitalizacije ili zahtijevaju tretman analgeticima da bi se ublažila bol.

Štetni popratni učinci izazvani kemoterapijskim sredstvima i radijacijskom terapijom postali su od glavnog značaja za kliničko upravljanje pacijenatima oboljelima od raka.

Trenutno, znanstvenici proučavaju liječenje raka upotrebom antiangiogenih sredstava. Smatra se da je angiogeneza mehanizam kojim tumori dobivaju potrebne hranjive tvari da bi rasli i metastazirali na druga mjesta u tijelu. Antiangiogena sredstva interferiraju s tim procesima i razaraju ili kontroliraju tumore.

Na primjer, U.S. patent br. 5 854 205 opisuje izolirani protein endostatin koji je inhibitor proliferacije endotelnih stanica i angiogeneze; U.S. patent br. 5 843 925 opisuje postupak inhibiranja angiogeneze i proliferacije endotelnih stanica upotrebom 7-[supstituirani amino]-9-[supstituirani gliciloamido]-6-demetil-6-deoksitetraciklin; U.S. patent br. 5 861 372 opisuje upotrebu agregiranog endotelnog inhibitora, angiostatina, i njegovu primjenu u dobivanju antioangiogenog učinka i/ili smanjenja propusnosti krvnih žila; Tai-Ping D. opisuje potencijalne antiangiogene terapije, v. Trends Pharmacol. Sci. 16, br. 2, 57-66, 1995; Lode H i sur. opisuju sinergizam između antioangiogenog antagonista integrina alfa V i fuzijskog proteina antitijela i citokina, što iskorjenjuje spontano metastaziranje tumora, v. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 96(4), 1591-1596, 1999; Giannis A. i sur. opisuju antagoniste integrina i ostale spojeve niske molekulske mase kao inhibitore angiogeneze, v. New drugs in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 36(6), 588-590, 1997; WO 97/41 844 opisuje postupak upotrebe kombinacije angiostatskih spojeva za sprečavanje i/ili liječenje neovaskularizacije u ljudskih pacijenata; WO 98/22 101 opisuje postupak upotrebe [pirozol-1-il]benzensulfonamida kao antiangiogenih sredstava; a U.S. patent 5 792 783 opisuje upotrebu 3-heteroaril-2-indolinona koji su inhibitori protein-kinaza i antiangiogenih sredstava u liječenju različitih oblika raka.

Nedavno je objavljeno da je liječenje kolorektalnog raka selektivnim inhibitorom ciklooksigenaze-2, specifično Celecoxib®, u kombinaciji s inhibitorom ART-2, specifično, Herceptin®, učinkovitije nego kad se bilo koje od tih sredstava koristi zasebno. U skladu s time, postoji potreba za otkrivanjem novih kombinacija kemoterapijskih sredstava koja su, korištena zajedno, učinkovitija nego kod zasebne upotrebe. Ovaj izum ispunjava tu potrebu.

Bit izuma

U jednom aspektu, ovaj izum usmjeren je prema postupku liječenja ili sprečavanja raka, što obuhvaća primjenu, u sisavca kod kojeg postoji potreba za takvim tretmanom, terapeutski učinkovite količine:

inhibitora protein-kinaze, formule (I):

[image]

gdje:

R je izabran iz grupe koju čine vodik, piperazin-1-il-metil, 4-metilpiperazin-1-il-metil, piperidin-1-il-metil, 2-hidroksimetilpirolidin-1-il-metil, 2-karboksipirolidin-1-il-metil i pirolidin-1-il-metil;

R1 je izabran iz grupe koju čine vodik, halo, alkil, supstituirani alkil, cikloalkil, supstituirani cikloalkil, aril, heteroaril, heteroaliciklička grupa, hidroksi, alkoksi, -C(O)NR8R9, -NR13R14, -(CO)R15 i -(CH2)rR16;

R2 je izabran iz grupe koju čine vodik, halo, alkil, supstituirani alkil, trihalometil, hidroksi, alkoksi, cijano, -NR13R14, -NR13C(O)R14, -(CO)R15, aril, heteroaril i -S(O)2NR13R14;

R3 je izabran iz grupe koju čine vodik, halogen, alkil, supstituirani alkil, trihalometil, hidroksi, alkoksi, aril, heteroaril, -NR13R14, -NR13S(O)2R14, -S(O)2NR13R14, -NR13C(O)R14, -NR13C(O)OR14, -(CO)R15 i -SO2R19;

R4 je izabran iz grupe koju čine vodik, halogen, alkil, supstituirani alkil, hidroksi, alkoksi i -NR13R14;

R5 je izabran iz grupe koju čine vodik, alkil, supstituirani alkil i -C(O)R10;

R6 je izabran iz grupe koju čine vodik, alkil, supstituirani alkil i -C(O)R10;

R7 je izabran iz grupe koju čine vodik, alkil, supstituirani alkil, aril, heteroaril, -C(O)R17 i -C(O)R10, uz uvjet da kad je R vodik, bar jedan od R5, R6 i R7 je -C(O)R10; ili

R6 i R7 mogu zajedno tvoriti grupu izabranu između -(CH2)4-, -(CH2)5- i -(CH2)6-;

R8 i R9 su neovisno izabrani iz grupe koju čine vodik, alkil, supstituirani alkil i aril;

R10 je izabran iz grupe koju čine hidroksi, alkoksi, ariloksi, -N(R11)(alkilen)nR12, gdje je alkilenska grupa po želji supstituirana hidroksi-grupom, i -NR13R14;

R11 je izabran iz grupe koju čine vodik, alkil i supstituirani alkil;

R12 je izabran iz grupe koju čine -NR13R14, hidroksi, -(CO)R15, aril, heteroaril, -N+(O-)R13R14, -N(OH)R13 i -NHC(O)R18 (gdje je R18 alkil, supstituirani alkil, haloalkil ili aralkil);

R13 i R14 su neovisno izabrani iz grupe koju čine vodik, alkil, supstituirani alkil, niži alkil supstituiran hidroksialkilamino-grupom, cijanoalkil, cikloalkil, supstituirani cikloalkil, aril i heteroaril; ili

R13 i R14 mogu zajedno tvoriti heterocikličku grupu;

R15 je izabran iz grupe koju čine vodik, hidroksi, alkoksi i ariloksi;

R16 je izabran iz grupe koju čine vodik, -NR13R14, -(CO)R15 i -C(O)NR13R14;

R17 je izabran iz grupe koju čine alkil, supstituirani alkil, cikloalkil, aril i heteroaril;

R19 je izabran iz grupe koju čine alkil, supstituirani alkil, aril, aralkil, heteroaril ili heteroaralkil, a

n i r su, neovisno, 1, 2, 3 ili 4;

u kombinaciji s inhibitorom ciklooksigenaze, ili njegovom farmaceutski prihvatljivom soli.

Poželjno je da se inhibitor protein-kinaze formule (I) koristi u kombinaciji sa selektivnim inhibitorom ciklooksigenaze-2, izabranog iz grupe koju čine:

(i) spoj formule (II):

[image]

gdje:

G je izabran iz grupe koju čine O, S i -NRa-, pri čemu je Ra vodik ili alkil;

R10a je izabran iz grupe koju čine vodik i aril;

R11a je izabran iz grupe koju čine karboksil, alkil, aralkil, aminokarbonil, alkilsulfonilaminokarbonil i alkoksikarbonil;

R12a je izabran iz grupe koju čine haloalkil, alkil, aralkil, cikloalkil i aril, po želji supstituirani jednim ili više radikala izabranima između alkiltio, nitro i alkilsulfonil-grupe; a

R13a mogu biti jedan ili više radikala, neovisno izabrani iz grupe koju čine vodik, halo, alkil, aralkil, alkoksi, ariloksi, heteroariloksi, aralkiloksi, heteroaralkiloksi, haloalkil, haloalkoksi, alkilamino, arilamino, aralkilamino, heteroarilamino, heteroarilalkilamino, nitro, amino, aminosulfonil, alkilaminosulfonil, arilaminosulfonil, heteroarilaminosulfonil, aralkilaminosulfornil, heteroaralkilaminosulfonil, heterociklosulfonil, alkilsulfonil, hidroksiarilkarbonil, nitroaril, po želji supstituirani aril, po želji supstituirani heteroaril, aralkilkarbonil, heteroarilkarbonil, arilkarbonil, aminokarbonil i alkilkarbonil;

ili R13a, zajedno s prstenom E tvori naftilni prsten; ili

(ii) spoj formule (III):

[image]

gdje:

A je izabran iz grupe koju čine djelomično nezasićeni ili nezasićeni heterociklički i djelomično nezasićeni ili nezasićeni karbociklički prstenovi;

R1b je izabran iz grupe koju čine heterociklil, cikloalkil, cikloalkenil i aril, pri čemu je R1b po želji supstituiran, na položaju gdje je to moguće, jednim ili više radikala neovisno izabranima između grupa alkil, haloalkil, cijano, karboksil, alkoksikarbonil, hidroksil, hidroksialkil, haloalkoksi, amino, alkilamino, arilamino, nitro, alkoksialkil, alkilsulfinil, halo, alkoksi i alkiltio;

R2b je izabran iz grupe koju čine metil i amino; a

R3b je izabran iz grupe koju čini radikal izabran između sljedećih grupa: vodik, halo, alkil, alkenil, alkinil, okso, cijano, karboksil, cijanoalkil, heterocikliloksi, alkiloksi, alkiltio, alkilkarbonil, cikloalkil, aril, haloalkil, heterociklil, cikloalkenil, aralkil, heterociklilalkil, acil, alkiltioalkil, hidroksialkil, alkoksikarbonil, arilkarbonil, aralkilkarbonil, aralkenil, alkoksialkil, ariltioalkil, ariloksialkil, aralkiltioalkil, araloksialkil, alkoksiaralkoksialkil, alkoksikarbonilalkil, aminokarbonil, aminokarbonilalkil, alkilaminokarbonil, N-arilaminokarbonil, N-alkil-N-arilaminokarbonil, alkilaminokarbonilalkil, karboksialkil, alkilamino, N-arilamino, N-aralkilamino, N-alkil-N-aralkilamino, N-alkil-N-arilamino, aminoalkil, alkilaminoalkil, N-arilaminoalkil, N-aralkilaminoalkil, N-alkil-N-aralkilaminoalkil, N-alkil-N-arilaminoalkil, ariloksi, aralkoksi, ariltio, aralkiltio, alkilsulfinil, alkilsulfonil, aminosulfonil, alkilaminosulfonil, N-arilaminosulfonil, arilsulfonil i N-alkil-N-arilaminosulfonil;

ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol.

Poželjno je da se gornji spojevi primjenjuju kao farmaceutski pripravak koji sadrži jedan ili više gornjih spojeva i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent. Specifično, terapeutska sredstva ovog izuma mogu se formulirati kao odvojeni pripravci koji se daju istovremeno ili u različita vremena, ili se terapeutska sredstva mogu dati kao jedan pripravak.

Postupci ovog izuma korisni su u liječenju ili prevenciji neoplastičnih bolesti, uključujući akralni lentiginozni melanom, aktinske keratoze, adenokarcinom, adenoidni cistični karcinom, adenome, adenosarkom, adenoskvamozni karcinom, astrocitne tumore, karcinom Bartholinijevih žlijezda, karcinom bazalnih stanica, karcinom bronhijalne žlijezde, kapilarni tumor, karcinoid, karcinom, karcinosarkom, kavernozni tumor, kolangiokarcinom, hondrosarkom, papilom/karcinom korioidnog pleksusa, karcinom svijetlih stanica, cistadenom, tumor endodermalnog sinusa, endometrijalnu hiperplaziju, endometrijalni stromalni sarkom, endometrioidni adenokarcinom, ependimalni tumor, epiteloidni tumor, Ewingov sarkom, fibrolamelarni tumor, fokalnu nodularnu hiperplaziju, gastrinom, tumore zametnih stanica, glioblastom, glukagonom, hemangioblastome, hemangioendoteliom, hemangiom, hepatički adenom, hepatičku adenomatozu, hepatocelularni karcinom, inzulinom, intraepitelnu neoplaziju, interepitelnu neoplaziju pločastih stanica, invazivni karcinom pločastih stanica, karcinom velikih stanica, lejomiosarkom, maligni lentiginozni melanom, maligni melanom, maligne mezotelne tumore, meduloblastom, meduloepiteliom, melanom, meningealni tumo, mezotelni tumor, metastatski karcinom, mukoepidermoidni karcinom, neuroblastom, neuroepitelni adenokarcinom, nodularni melanom, karcinom sitnih stanica, oligodendroglijalni tumor, osteosarkom, papilarni serozni adenokarcinom, tumor pinealnih stanica, tumore hipofize, plazmacitom, pseudosarkom, plućni blastom, karcinom bubrežnih stanica, retinoblastom, rabdomiosarkom, sarkom, serozni karcinom, karcinom malih stanica, karcinome mekog tkiva, tumor koji luči somatostatin, pločasti karcinom, karcinom pločastih stanica, submezotelijalni tumor, površinski melanom koji se širi, nediferencirani karcinom, uvealni melanom, verukozni karcinom, vipom, dobro diferencirani karcinom i Wilmsov tumor.

Postupci ovog izuma omogućuju jedno ili više poboljšanja. Jedno poboljšanje je u tome što se pripravci, sredstva i terapije ovog izuma primjenjuju u kombinaciji niske doze, to jest, u dozi nižoj od konvencionalno korištenoj u kliničkim situacijama za svaku od pojedinačnih komponenti.

Prednost snižavanja doze spojeva, pripravaka, sredstava i terapija ovog izuma primijenjenih u sisavcu uključuje smanjenje pojave štetnih učinaka povezanih s višim dozama. Na primjer, smanjenje doze kemoterapeutskog sredstva, kao što je metotreksat, doći će do smanjenja učestalosti i težine mučnina i povraćanja, u usporedbi s višim dozama. Slične prednosti bile su cilj ovog izuma, gdje je korišten inhibitor protein-kinaze u kombinaciji s inhibitorom ciklooksigenaze, naročito sa selektivnim inhibitorom ciklooksigenaze-2.

Smanjenjem pojave štetnih učinaka, postiže se poboljšanje kvalitete života pacijenta koji se liječi od raka. Dodatne prednosti smanjenja pojave štetnih učinaka uključuju poboljšanu suradnju s pacijentom, smanjenje potrebe za hospitalizacijom u cilju liječenja popratnih pojava, kao i smanjenje primjene analgetskih sredstava potrebnih za liječenje boli povezane sa štetnim učincima.

Dodatna prednost je u tome što je inhibicija tumora veća prilikom korištenja inhibitora protein-kinaze u kombinaciji s inhibitorom ciklooksigenaze, naročito sa selektivnim inhibitorom ciklooksigenaze-2, nego kad se bilo koje od ovih sredstava primjenjuje zasebno.

Ovaj izum nadalje uključuje komplete koji obuhvaćaju inhibitor COX-2 i inhibitor protein-kinaze formule (I).

Detaljan opis izuma

Definicije

Ukoliko nije drukčije naznačeno, sljedeći izrazi, korišteni u specifikaciji i zahtjevima imaju značenja navedena u nastavku:

"Alkil" se odnosi na zasićeni alifatski ugljikohidratni radikal, što uključuje ravnolančane i razgranate grupe od 1 do 20 ugljikovih atoma (kad je u tekstu naveden numerički raspon, npr. "1-20", to znači da grupa, u ovom slučaju alkilna grupa, može imati 1 ugljikov atom, 2 ugljikova atoma, 3 ugljikova atoma, itd., do i uključujući 20 ugljikovih atoma). Alkilne grupe koje sadrže od 1 do 4 ugljikova atoma navode se kao niže alkilne grupe. Kad navedene niže alkilne grupe nemaju supstituenata, navode se kao niže alkilne grupe. Poželjnije je da je alkilna grupa alkil srednje veličine od 1 do 10 ugljikovih atoma, npr. metil, etil, propil, 2-propil, n-butil, izo-butil, terc-butil, pentil i slično. Još je poželjnije da je to niži alkil od 1 do 4 ugljikova atoma, npr. metil, etil, propil, 2-propil, n-butil, izo-butil ili terc-butil i slično.

"Supstituirani alkil" odnosi se na alkilnu grupu, kako je gore definirana, koja je supstituirana jednim ili više, poželjno jednim do tri, a još bolje jednim ili dva supstituenta, neovisno izabranima iz grupe koju čine halo, hidroksi, niži alkoksi, aril, po želji supstituiran jednom ili više grupa, poželjno jednom, dvjema ili trima grupama koje su, neovisno jedna od druge, halo, hidroksi, niži alkil ili niža alkoksi grupa, ariloksi, po želji supstituiran jednom ili više grupa, poželjno jednom, dvjema ili trima grupama koje su, neovisno jedna od druge, halo, hidroksi, niži alkil ili niža alkoksi grupa, 6-člani heteroaril koji u prstenu sadrži 1 do 3 dušikova atoma, pri čemu su ugljikovi atomi u prstenu po želji supstituirani jednom ili više grupa, poželjno jednom, dvjema ili trima grupama koje su, neovisno jedna od druge, halo, hidroksi, niži alkil ili niža alkoksi grupa, 5-člani heteroaril koji sadrži 1 do 3 heteroatoma, izabrana iz grupe koju čine dušik, kisik i sumpor, a ugljikovi i dušikovi atomi u grupi mogu po želji biti supstituirani jednom ili više grupa, poželjno jednom, dvjema ili trima grupama koje su, neovisno jedna od druge, halo, hidroksi, niži alkil ili niža alkoksi grupa, 5- ili 6-člana heteroaliciklička grupa s 1 do 3 heteroatoma izabrana iz grupe koju čine dušik, kisik i sumpor, pri čemu su ugljikovi i dušikovi (ukoliko su prisutni) atomi po želji supstituirani jednom ili više grupa, poželjno jednom, dvjema ili trima grupama koje su, neovisno jedna od druge, halo, hidroksi, niži alkil ili niža alkoksi grupa, merkapto, (niži alkil)tio, ariltio, po želji supstituiran jednom ili više grupa, poželjno jednom, dvjema ili trima grupama koje su, neovisno jedna od druge, halo, hidroksi, niži alkil ili niža alkoksi grupa, cijano, acil, tioacil, O-karbamil, N-karbamil, O-tiokarbamil, N-tiokarbamil, C-amido, N-amido, nitro, N-sulfonamido, S-sulfonamido, R18S(O)-, R18S(O)2-, -C(O)OR18, R18C(O)O- i -NR18R19, gdje su R18 i R19 neovisno izabrani iz grupe koju čine vodik, niži alkil, trihalometil, (C3-C6)cikloalkil, niži alkenil, niži alkinil i aril, po želji supstituirani jednom ili više grupa, poželjno jednom, dvjema ili trima grupama koje su, neovisno jedna od druge, halo, hidroksi, niži alkil ili niža alkoksi grupa.

Poželjno je da je alkilna grupa supstituirana jednim ili više supstituenata neovisno izabranima iz grupe koju čine hidroksi, 5- ili 6-člana heteroaliciklička grupa s 1 do 3 heteroatoma izabrana iz grupe koju čine dušik, kisik i sumpor, pri čemu su ugljikovi i dušikovi (ukoliko su prisutni) atomi po želji supstituirani jednom ili više grupa, poželjno jednom, dvjema ili trima grupama koje su, neovisno jedna od druge, halo, hidroksi, niži alkil ili niža alkoksi grupa, 5-člani heteroaril s 1 do 3 heteroatoma izabrana iz grupe koju čine dušik, kisik i sumpor, pri čemu su ugljikovi i dušikovi atomi u grupi po želji supstituirani jednom ili više grupa, poželjno jednom, dvjema ili trima grupama koje su, neovisno jedna od druge, halo, hidroksi, niži alkil ili niža alkoksi grupa, 6-člani heteroaril s 1 do 3 dušikova atoma u prstenu, pri čemu su ugljikovi atomi u prstenu po želji supstituirani jednom ili više grupa, poželjno jednom, dvjema ili trima grupama koje su, neovisno jedna od druge, halo, hidroksi, niži alkil ili niža alkoksi grupa ili -NR18R19, gdje su R18 i R19 neovisno izabrani iz grupe koju čine vodik i niži alkil. Još je poželjnije da je alkilna grupa supstituirana jednim ili dva supstituenta koji su, neovisno jedan o drugome, hidroksi, dimetilamino, etilamino, dietilamino, dipropilamino, pirolidino, piperidino, morfolino, piperazino, 4-niži alkilpiperazino, fenil, imidazolil, piridinil, piridazinil, pirimidinil, oksazolil, triazinil i slično.

"Cikloalkil" se odnosi na 3 do 8-člani posve ugljikov monociklički prsten, posve ugljikov 5-člani/6-člani ili 6-člani/6-člani spojeni biciklički prsten ili multiciklički spojeni prsten ("spojen" prstenasti sustav znači da svaki prsten u sustavu dijeli susjedni par ugljikovih atoma s drugim prstenom u sustavu), gdje jedan ili više prstenova može sadržati jednu ili više dvostrukih veza, ali nijedan od prstenova nema potpuno konjugirani pi-elektronski sustav.

Primjeri cikloalkilnih grupa, bez ograničenja, su ciklopropan, ciklobutan, ciklopentan, ciklopenten, cikloheksan, cikloheksadien, adamantan, cikloheptan, cikloheptatrien i slično.

"Supstituirani cikloalkil" odnosi se na cikloalkilnu grupu, kako je gore definirana, koja je supstituirana jednim ili više, poželjnije jednim ili dva supstituenta, neovisno izabranima iz grupe koju čine niži alkil, trihaloalkil, halo, hidroksi, niži alkoksi, aril, po želji supstituiran jednom ili više, poželjno jednom ili dvjema grupama koje su, neovisno jedna od druge, halo, hidroksi, niži alkil ili niža alkoksi grupa, ariloksi, po želji supstituiran jednom ili više, poželjno jednom ili dvjema grupama koje su, neovisno jedna od druge, halo, hidroksi, niži alkil ili niža alkoksi grupa, 6-člani heteroaril koji u prstenu sadrži 1 do 3 dušikova atoma, pri čemu su ugljikovi atomi u prstenu po želji supstituirani jednom ili više, poželjno jednom ili dvjema grupama koje su, neovisno jedna od druge, halo, hidroksi, niži alkil ili niža alkoksi grupa, 5-člani heteroaril koji sadrži 1 do 3 heteroatoma, izabrana iz grupe koju čine dušik, kisik i sumpor, a ugljikovi i dušikovi atomi u grupi mogu po želji biti supstituirani jednom ili više, poželjno jednom ili dvjema grupama koje su, neovisno jedna od druge, halo, hidroksi, niži alkil ili niža alkoksi grupa, 5- ili 6-člana heteroaliciklička grupa s 1 do 3 heteroatoma izabrana iz grupe koju čine dušik, kisik i sumpor, pri čemu su ugljikovi i dušikovi (ukoliko su prisutni) atomi po želji supstituirani jednom ili više, poželjno jednom ili dvjema grupama koje su, neovisno jedna od druge, halo, hidroksi, niži alkil ili niža alkoksi grupa, merkapto, (niži alkil)tio, ariltio, po želji supstituiran jednom ili više, poželjno jednom ili dvjema grupama koje su, neovisno jedna od druge, halo, hidroksi, niži alkil ili niža alkoksi grupa, cijano, acil, tioacil, O-karbamil, N-karbamil, O-tiokarbamil, N-tiokarbamil, C-amido, N-amido, nitro, N-sulfonamido, S-sulfonamido, R18S(O)-, R18S(O)2-, -C(O)OR18, R18C(O)O- i -NR18R19, definirani kao gore.

"Alkenil" se odnosi na nižu alkilnu grupu, kako je ovdje definirano, koja se sastoji od bar dva ugljikova atoma i bar jedne ugljik-ugljik dvostruke veze. Reprezentativni primjeri uključuju, ali bez ograničenja, etenil, 1-propenil, 2-propenil, 1-, 2- ili 3-butenil i slično.

"Alkinil" se odnosi na nižu alkilnu grupu, kako je ovdje definirano, koja se sastoji od bar dva ugljikova atoma i bar jedne ugljik-ugljik trostruke veze. Reprezentativni primjeri uključuju, ali bez ograničenja, etinil, 1-propinil, 2-propinil, 1-, 2- ili 3-butinil i slično.

"Aril" se odnosi na posve ugljikove monocikličke ili policikličke grupe spojenih prstenova (tj. prstenovi dijele susjedne parove ugljikovih atoma) od 1 do 12 ugljikovih atoma s potpuno konjugiranim pi-elektronskim sustavom. Arilna grupa može biti supstituirana ili nesupstituirana. Kad je supstituirana, supstituiranih je grupa poželjno jedna ili više, poželjnije jedna, dvije ili tri, još poželjnije jedna ili dvije grupe, neovisno izabrane iz grupe koju čine niži alkil, trihaloalkil, halo, hidroksi, niži alkoksi, merkapto, (niži alkil)tio, cijano, acil, tioacil, O-karbamil, N-karbamil, O-tiokarbamil, N-tiokarbamil, C-amido, N-amido, nitro, N-sulfonamido, S-sulfonamido, R18S(O)-, R18S(O)2-, -C(O)OR18, R18C(O)O- i -NR18R19, pri čemu su R18 i R19 definirani kao gore. Poželjno je da je arilna grupa eventualno supstituirana jednim ili dvama supstituentima, neovisno izabranima između halo, nižeg alkila, trihaloalkila, hidroksi, merkapto, cijano, N-amido, mono ili dialkilamino, karboksi ili N-sulfonamido.

"Heteroaril" se odnosi na monociklički ili spojeni prsten (tj. prstenovi koji dijele susjedne parove atoma) s 5 do 12 atoma u prstenu, koji sadrži jedan, dva ili tri prstenova heteroatoma izabrana između N, O i S, preostali prstenasti atomi su C, i, osim toga, imaju potpuno konjugirani pi-elektronski sustav. Primjeri, bez ograničenja, nesupstituiranih heteroarilnih grupa su pirol, furan, tiofen, imidazol, oksazol, tiazol, pirazol, piridin, pirimidin, kinolin, izokinolin, purin i karbazol. Heteroarilna grupa može biti supstituirana ili nesupstituirana. Kad je supstituirana, supstituentske grupe su poželjno jedna ili više, bolje jedna, dvije ili tri, još bolje jedna ili dvije grupe, neovisno izabrane iz grupe koju čine niži alkil, trihaloalkil, halo, hidroksi, niži alkoksi, merkapto, (niži alkil)tio, cijano, acil, tioacil, O-karbamil, N-karbamil, O-tiokarbamil, N-tiokarbamil, C-amido, N-amido, nitro, N-sulfonamido, S-sulfonamido, R18S(O)-, R18S(O)2-, -C(O)OR18, R18C(O)O- i -NR18R19, pri čemu su R18 i R19 definirani kao gore. Poželjno je da je heteroarilna grupa eventualno supstituirana s jednim ili dva supstituenta, neovisno izabranima između halo, nižeg alkila, trihaloalkila, hidroksi, merkapto, cijano, N-amido, mono ili dialkilamino, karboksi ili N-sulfonamido.

"Heteroaliciklički" se odnosi na na monocikličku ili spojenu prstenastu grupu s 5 do 9 atoma u prstenu, pri čemu su jedan ili dva atoma u prstenu heteroatomi izabrani između N, O ili S(O)n (gdje je n cijeli broj od 0 do 2), a preostali atomi su C. Prstenovi također mogu imati jednu ili više dvostrukih veza. Međutim, prstenovi nemaju potpuno konjugirani pi-elektronski sustav. Primjeri nesupstituiranig heteroalicikličkih grupa su, bez ograničenja, pirolidino, piperidino, piperazino, morfolino, tiomorfolino, homopiperazino i slično. Heteroaliciklički prsten može biti supstituiran ili nesupstituiran. Kad je supstituiran, supstituentske grupe su poželjno jedna ili više, još bolje jedna, dvije ili tri, još bolje jedna ili dvije grupe, neovisno izabrane iz grupe koju čine niži alkil, trihaloalkil, halo, hidroksi, niži alkoksi, merkapto, (niži alkil)tio, cijano, acil, tioacil, O-karbamil, N-karbamil, O-tiokarbamil, N-tiokarbamil, C-amido, N-amido, nitro, N-sulfonamido, S-sulfonamido, R18S(O)-, R18S(O)2-, -C(O)OR18, R18C(O)O- i -NR18R19, pri čemu su R18 i R19 definirani kao gore. Poželjno je da je heteroaliciklička grupa eventualno supstituirana s jednim ili dva supstituenta, neovisno izabranima između halo, nižeg alkila, trihaloalkila, hidroksi, merkapto, cijano, N-amido, mono ili dialkilamino, karboksi ili N-sulfonamido.

"Heterociklički" se odnosi na zasićeni ciklički radikal s 3 do 8 atoma u prstenu u kojem su jedan ili dva atoma heteroatomi izabrani između N, O ili S(O)n (gdje je n cijeli broj od 0 do 2), a preostali atomi su C, pri čemu jedan ili dva C atoma mogu biti zamijenjeni karbonilnom grupom. Heterociklički prsten može po želji biti supstituiran neovisno jednim, dvama ili trima supstiturentima izabranima između po želji supstituiranog nižeg alkila (supstituiranog jednim ili dvama supstituentima neovisno izabranima između karboksi- ili esterske grupe), haloalkila, cijanoalkila, halo, nitro, cijano, hidroksi, alkoksi, amino, monoalkilamino, dialkilamino, aralkila, heteroaralkila, -COR (gdje je R alkil) ili -COOR (gdje je R vodik ili alkil). Specifičnije, izraz "heterociklički" uključuje, ali bez ograničenja, tetrahidropiranil, 2,2-dimetil-1,3-dioksolan, piperidino, N-metilpiperidin-3-il, piperazino, N-metilpirolidin-3-il, 3-pirolidino, morfolino, tiomorfolino, tiomorfolino-1-oksid, tiomorfolino-1,1-dioksid, 4-etiloksikarbonilpiperazino, 3-oksopiperazino, 2-imidazolidon, 2-pirolidinon, 2-oksohomopiperazino, tetrahidropirimidin-2-on, i njihove derivate. Poželjno je da je heterociklička grupa eventualno supstituirana jednim ili dvama supstituentima neovisno izabranima između halo, nižeg alkila, nižeg alkila supstituiranog karboksi-grupom, ester-hidroksi, mono- ili dialkilamino.

"Hidroksi" se odnosi na -OH grupu.

"Alkoksi" se odnosi na -O-alkilnu i -O-cikloalkilnu grupu. Reprezentativni primjeri uključuju, ali bez ograničenja, npr. metoksi, etoksi, propoksi, butoksi, ciklopropiloksi, ciklobutiloksi, ciklopentiloksi, cikloheksiloksi i slično.

"Ariloksi" se odnosi na -O-arilnu i -O-heteroarilnu, kako je ovdje definirano. Reprezentativni primjeri uključuju, ali bez ograničenja, fenoksi, piridiniloksi, furaniloksi, tieniloksi, pirimidiniloksi, piraziniloksi i slično, kao i njihove derivate.

"Merkapto" se odnosi na -SH grupu.

"Alkiltio" se odnosi na -S-alkilnu i -S-cikloalkilnu grupu. Reprezentativni primjeri uključuju, ali bez ograničenja, npr. metiltio, etiltio, propiltio, butiltio, ciklopropiltio, ciklobutiltio, ciklopentiltio, cikloheksiltio i slično.

"Ariltio" se odnosi na -S-arilnu i -S-heteroarilnu, kako je ovdje definirano. Reprezentativni primjeri uključuju, ali bez ograničenja, feniltio, piridiniltio, furaniltio, tieniltio, pirimidiniltio i slično, kao i njihove derivate.

"Acil" se odnosi na -C(O)-R" grupu, pri čemu je R" izabran iz grupe koju čine vodik, niži alkil, trihalometil, cikloalkil, aril, po želji supstituiran jednim ili više, poželjno jednim, dvama ili trima supstituentima izabranima iz grupe koju čine niži alkil, trihalometil, niži alkoksi, halo i - NR18R19grupe, heteroaril (vezan preko ugljika u prstenu), po želji supstituiran jednim ili više, poželjno jednim, dvama ili trima supstituentima izabranima iz grupe koju čine niži alkil, trihaloalkil, niži alkoksi, halo i - NR18R19grupe i heteroaliciklička grupa (vezana preko ugljika u prstenu), po želji supstituirana jednim ili više, poželjno jednim, dvama ili trima supstituentima izabranima iz grupe koju čine niži alkil, trihaloalkil, niži alkoksi, halo i - NR18R19grupe. Reprezentativne acilne grupe uključuju, ali bez ograničenja, acetil, trifluoroacetil, benzoil i slično.

"Aldehid" se odnosi na acilnu grupu u kojoj je R" vodik.

"Tioacil" se odnosi na -C(S)-R" grupu, gdje je R" definiran kako je navedeno.

"Ester" se odnosi na -C(O)O-R" grupu, gdje je R" definiran kako je navedeno, osim što ne može biti vodik.

"Acetil" se odnosi na -C(O)CH3 grupu.

"Halo" se odnosi na fluor, klor, brom ili jod, poželjno fluor ili klor.

"Trihalometil" se odnosi na -CX3 grupu, gdje je X halo-grupa kako je ranije definirano.

"Trihalometansulfonil" se odnosi na X3CS(=O)2- grupe, pri čemu je X definiran kao gore.

"Cijano" se odnosi na -C≡N grupu.

"Metilendioksi" se odnosi na -OCH2O- grupu u kojoj su dva atoma kisika vezana na susjedne ugljikove atome.

"Etilendioksi" se odnosi na -OCH2CH2O- grupu u kojoj su dva atoma kisika vezana na susjedne ugljikove atome.

"S-sulfonamido" se odnosi na -S(O)2NR18R19 grupu, gdje su R18 i R19 definirani kao gore.

"N-sulfonamido" se odnosi na - NR18S(O)2R19 grupu, gdje su R18 i R19 definirani kao gore.

"O-karbamil" se odnosi na -OC(O)NR18R19 grupu, gdje su R18 i R19 definirani kao gore.

"N-karbamil" se odnosi na R18OC(O)NR19 grupu, gdje su R18 i R19 definirani kao gore.

"O-tiokarbamil" se odnosi na -OC(S)NR18R19 grupu, gdje su R18 i R19 definirani kao gore.

"N-tiokarbamil" se odnosi na R18OC(S)NR19 grupu, gdje su R18 i R19 definirani kao gore.

"Amino" se odnosi na -NR18R19 grupu, gdje su i R18 i R19 vodik.

"C-amido" se odnosi na -C(O)NR18R19 grupu, gdje su R18 i R19 definirani kao gore.

"N-amido" se odnosi na R18C(O)NR19 grupu, gdje su R18 i R19 definirani kao gore.

"Nitro" se odnosi na -NO2 grupu.

"Haloalkil" označava alkil, poželjno niži alkil, kako je ranije definirano, koji je supstituiran jednim ili više istih ili različitih halogenih atoma, npr. -CH2Cl, -CF3, -CH2CF3, -CH2CCl3 i slično.

"Aralkil" označava alkil, poželjno niži alkil, kako je ranije definirano, koji je supstituiran arilnom grupom koja je gore definirana, npr. -CH2fenil, -(CH2)2fenil, -(CH2)3fenil, CH3CH(CH3)CH2fenil i slično, kao i njihove derivate.

"Heteroaralkil" označava alkil, poželjno niži alkil, kako je ranije definirano, koji je supstituiran heteroarilnom grupom koja je gore definirana, npr. -CH2piridinil, -(CH2)2pirimidinil, -(CH2)3imidazolil i slično, kao i njihove derivate.

"Monoalkilamino" označava radikal -NHR, gdje je R nesupstituirana alkilna ili cikloalkilna grupa kako je gore definirano, npr. metilamino, (1-metiletil)amino, cikloheksilamino i slično.

"Dialkilamino" označava radikal -NRR, gdje je svaki R neovisno nesupstituirana alkilna ili cikloalkilna grupa, kako je gore definirano, npr. dimetilamino, dietilamino, (1-metiletil)-etilamino, cikloheksilmetilamino, ciklopentilmetilamino i slično.

"Cijanoalkil" označava alkil, poželjno niži alkil kako je gore definirano, koji je supstituiran jednim ili dvjema cijano-grupama.

"Po želji" ili "eventualno" znači da se potom opisani događaj ili okolnost može, ali ne mora dogoditi, te da opis uključuje slučajeve gdje se događaj ili okolnost dešava i slučajeve gdje se ne dešava. Na primjer, "heterociklička grupa po želji supstituirana alkilnom grupom" znači da alkil može, ali ne mora biti prisutan, a opis uključuje situacije gdje je heterociklička grupa supstituirana alkilnom grupom, kao i situacije u kojima heterociklička grupa nije supstituirana alkilnom grupom.

Izrazi "2-indolinon", "indolin-2-on" i 2-oksindol" ovdje su korišteni naizmjence i odnose se na molekulu kemijske strukture:

[image]

Izraz "pirol" odnosi se na molekulu kemijske strukture:

[image]

Izraz "pirolom supstituirani 2-indolinon" i "3-pirolidenil-2-indolinon" ovdje su naizmjence korišteni i odnose se na kemijski spoj opće strukture prikazane u formuli (I).

Spojevi iste molekulske formule koji se razlikuju u prirodi ili redoslijedu vezanja atoma ili rasporedu atoma u prostoru nazvani su "izomeri". Izomeri koji se razlikuju po rasporedu atoma u prostoru nazvani su "stereoizomeri".

Stereoizomeri koji nisu međusobne zrcalne slike nazvani su "dijastereomeri", a oni koji su zrcalne slike koje se ne mogu preklopiti nazvani su "enantiomeri". Kad spoj ima asimetrični centar, na primjer, vezan je na četiri različite grupe, moguć je par enantiomera. Enantiomer može biti karakteriziran apsolutnom konfiguracijom asimetričnog centra i opisan je R- i S-slijedom pravila po Cahnu i Prelogu, ili na način na koji molekula rotira ravninu polariziranog svjetla i označava se kao dekstrorotatorna ili levorotatorna (tj. kao (+) ili (-) izomeri). Kiralni spoj može postojati kao pojedinačni enantiomer ili kao njihova smjesa. Smjesa koja sadrži jednake udjele enantiomera naziva se "racemična smjesa".

Spojevi ovog izuma mogu imati jedan ili više asimetričnih centara; takvi spojevi mogu se prema tome proizvesti kao pojedinačni (R) ili (S)-stereoizomeri ili kao njihove smjese. Na primjer, ako je supstituent R6 u spoju formule (I) 2-hidroksietil, ugljik na koji je hidroksilna grupa pričvršćena je asimetrični centar, pa tako spoj formule (I) može postojati kao (R) ili (S)-stereoizomer. Ukoliko nije drukčije naznačeno, opis ili imenovanje određenog spoja u specifikaciji i zahtjevima uključuje oba pojedinačna enantiomera i njihove smjese, racemične ili drukčije. Postupci za određivanje stereokemije i odvajanje stereoizomera dobro su poznati u struci (v. raspravu u poglavlju 4 "Advanced Organic Chemistry", 4th ed. J. March, John Wiley and Sons, New York, 1992).

Spojeiv ovog izuma mogu pokazivati pojavu tautomerije i strukturne izomerije. Na primjer, ovdje opisani spojevi formule (I) mogu poprimiti E ili Z konfiguraciju oko dvostruke veze koja povezuje 2-indolinonsku jedinicu s pirolnom jedinicom, ili može biti smjesa E i Z. Ovaj izum obuhvaća bilo koji tautomerni ili strukturno izomerni oblik i njihove smjese, koji može modulirati RTK, CTK i/ili STK aktivnost i nije ograničen ni na koji tautomerni ili strukturni izomerni oblik.

"Farmaceutski pripravak" odnosi se na smjesu jednog ili više ovdje opisanih spojeva, ili njihove fiziološki/farmaceutski prihvatljive soli ili prolijekove, s drugim kemijskim komponentama, kao što su fiziološki/farmaceutski prihvatljivi nosači i ekscipijenti. Namjena farmaceutskog pripravka je olakšanje primjene spoja u organizmu.

Spojevi ovog izuma mogu također djelovati kao prolijekovi. "Prolijek" se odnosi na sredstvo koje se in vivo prevodi u matični lijek. Prolijekovi su često korisni zato što u nekim situacijama može biti lakše primijeniti prolijek od matičnog lijeka. Mogu, na primjer, biti bioraspoloživi oralnom primjenom, dok matični lijek nije. Prolijek također može imati poboljšanu topljivost u farmaceutskim pripravcima, u usporedbi s matičnim lijekom. Primjer prolijeka, bez ograničenja, bio bi spoj ovog izuma koji se primjenjuje kao ester ("prolijek") da bi se olakšao prijenos kroz staničnu membranu, gdje je topljivost u vodi štetna za pokretnost, ali zatim se unutar stanice, gdje je topljivost u vodi poželjna, metabolički hidroliziran u karboksilnu kiselinu - aktivnu cjelinu.

Dodatni primjer prolijeka može biti kratak polipeptid, na primjer, ali bez ograničenja, polipeptid od 2-10 aminokiselina, vezan preko amino-terminalne grupe za karboksi-grupu spoja ovog izuma, pri čemu se polipeptid hidrolizira ili metabolizira in vivo da bi se oslobodila aktivna molekula. Prolijekovi spoja formule (I) su unutar opsega ovog izuma.

Nadalje, računa se da će spoj formule (I) biti metaboliziran enzimima u tijelu organizma kao što je ljudsko biće, da bi nastao metabolit koji može modulirati aktivnost protein-kinaza. Takvi metaboliti su unutar opsega ovog izuma.

Kako je ovdje korišteno, "fizološki/farmaceutski prihvatljiv nosač" odnosi se na nosač ili sredstvo za razrjeđivanje koje ne uzrokuje značajno nadraženje organizma i ne narušava biološku aktivnost i svojstva primijenjenog spoja.

"Farmaceutski prihvatljiv ekscipijent" odnosi se na inertnu tvar dodanu farmaceutskom pripravku da bi dodatno olakšala primjenu spoja. Primjeri ekscipijenata, bez ograničenja, uključuju kalcijev karbonat, kalcijev fosfat, razne šećere i oblike škroba, derivate celuloze, želatinu, biljna ulja i polietilen-glikole.

Kako je ovdje korišteno, izaz "farmaceutski prihvatljiva sol" odnosi se na soli koje zadržavaju biološku učinkovitost i svojstva matičnog spoja. Takve soli uključuju:

(1) kisele adicijske soli, dobivene reakcijom slobodne baze matičnog spoja s anorganskim kiselinama, kao što su klorovodična kiselina, bromovodična kiselina, nitratna kiselina, fosforna kiselina, sumporna kiselina i perklorna kiselina i slično, ili s organskim kiselinama, kao što su octena kiselina, oksalna kiselina, (D) ili (L)-malična kiselina, maleinska kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, salicilna kiselina, tartarna kiselina, limunska kiselina, sukcinska kiselina ili malonska kiselina i slično, poželjno klorovodična kiselina ili (L)-malična kiselina, kao što su L-malatna sol 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina(2-dietilaminoetil)amid; ili

(2) soli dobivene zamjenom kiselog protona iz matičnog spoja metalnim ionom, npr. ionom alkalijskog metala, ionom zemno-alkalijskog metala; ili koordinacijom s organskom bazom. Primjeri iona uključuju aluminij, kalcij, litij, magnezij, kalij, natrij i cink u uobičajenim valencijama. Poželjne organske baze uključuju protonirane tercijarne amine i kvaterne amonijeve katione, uključujući djelomično trimetilamin, dietilamin, N,N'-dibenziletilendiamin, kloroprokain, kolin, dietanolamin, etilendiamin, meglumin (N-metilglukamin) i prokain.

"Postupak" se odnosi na načine, sredstva, tehnike i protokole za ispunjavanje zadanog zadatka, uključujući, ali bez ograničenja, već poznate načine, sredstva, tehnike i protokole, kao i one razvijene iz poznatih načina, sredstava, tehnika i protokola, od strane kemijskih, farmaceutskih, bioloških, biokemijskih i medicinskih stručnjaka.

"Liječenje" i "tretman" odnosi se na bilo koji postupak, djelovanje, primjenu, terapiju ili slično, gdje je sisavac, uključujući ljudsko biće, cilj medicinske pomoći s ciljem poboljšanja njegovog stanja, izravno ili neizravno. Posebno gledajući rak, ovi izrazi jednostavno se odnose da će očekivana duljina života jedinke pogođene rakom biti povećana, ili se može odnositi na jedan ili više simptoma bolesti. To se može pratiti, između ostalog, odgođenom pojavom primarnih ili sekundarnih tumora, usporenim razvojem primarnih ili sekundarnih tumora, smanjenom pojavnošću primarnih ili sekundarnih tumora, usporenom ili smanjenom težinom sekundarnih pojava bolesti, usporenim rastom tumora i njihovim povlačenjem.

Izraz "sprečavanje" uključuje bilo sprečavanje pojave klinički uočljive neoplazije ili sprečavanje pojave preklinički uočljivog stadija neoplazije u rizičnih pojedinaca. Ovom definicijom također je uključeno sprečavanje inicijacije malignih stanica ili zaustavljanje ili povlačenje napredovanja premalignih stanica u maligne. To uključuje profilaktički tretman jedinki s rizikom razvoja neoplazije.

Fraza "terapeutski učinkovito" treba označiti količinu svakog sredstva koje će postići cilj poboljšanja u težini neoplastične bolesti i učestalosti neoplastične bolesti nakon tretmana svakim sredstvom zasebno, uz izbjegavanje štetnih popratnih učinaka, tipično povezanih s alternativnim terapijama.

"Terapeutski učinak" ili "terapeutski učinkovita količina" označava količinu sredstva protiv raka potrebnu da ublaži, do neke mjere, jedan ili više simptoma neoplastične bolesti, uključujući, ali bez ograničenja: 1) smanjenje broja stanica raka; 2) smanjenje veličine tumora; 3) inhibiciju (tj. usporavanje do neke mjere, poželjno zaustavljanje) metastaza tumora; 4) inhibiciju, do neke mjere, rasta tumora; 5) ublažavanje ili smanjivanje, do neke mjere, jednog ili više simptoma povezanih s bolešću; i/ili 6) ublažavanje ili smanjenje popratnih učinaka povezanih s primjenom sredstava protiv raka.

Fraza "kombinacijska terapija" (ili "ko-terapija") obuhvaća primjenu inhibitora protein-kinaze i inhibitora ciklooksigenaze-2, kao dio specifičnog režima tretiranja, namijenjenog postizanju povoljnog učinka iz zajedničkog djelovanja ovih terapijskih sredstava. Primjena ovih terapijskih sredstava u kombinaciji tipično se provodi kroz definirani vremenski period (obično minute, sate, dane ili tjedne, ovisno o izabranoj kombinaciji). "Kombinacijska terapija" općenito ne namjerava obuhvatiti primjenu dvaju ili više od ovih terapijskih sredstava kao dio odvojenih režima monoterapije koji slučajno i proizvoljno rezultiraju u kombinaciji ovog izuma. "Kombinacijska terapija" treba obuhvatiti primjenu ovih terapijskih sredstava uzastopce, to jest, bilo da se svako terapeutsko sredstvo primjenjuje u različito vrijeme, kao i primjenu ovih terapeutskih sredstava, ili bar dva terapeutska sredstva, istovremeno. Istovremena primjena može se postići, na primjer, primjenom jedne kapsule koja sadrži stalan omjer svakog terapeutskog sredstva ili u više odvojenih kapsula za svako od terapeutskih sredstava. Uzastopna ili istovremena primjena svakog terapeutskog sredstva može se postići bilo kojim prikladnim putem, uključujući, ali bez ograničenja, oralni put, intravenski put, intramuskularni put, kao i izravnu apsorpciju kroz tkiva mukoznih membrana. Terapeutska sredstva mogu se primijeniti istim putem ili različitim putevima. Na primjer, prvo terapeutsko sredstvo izabrane kombinacije može se primijeniti intravenskom injekcijom, dok se druga terapeutska sredstva kombinacije mogu primijeniti oralno. Alternativno, na primjer, oba terapeutska sredstva mogu se primijeniti oralno ili intravenskom injekcijom. Slijed primjene terapeutskih sredstava nije nužno kritičan. "Kombinacijska terapija" također može obuhvatiti primjenu terapeutskih sredstava, kako je ovdje opisano, u dodatnoj kombinaciji s drugim biološki aktivnim sastojcima (kao što je, ali bez ograničenja, drugo i različito antineoplastično sredstvo) i terapije bez lijekova (kao što su, ali bez ograničenja, kirurško ili radijacijsko liječenje). Kad kombinacijska terapija dodatno uključuje radijacijsko liječenje, ono se može provesti u bilo koje prikladno vrijeme tako dugo dok se postiže povoljan učinak od istovremenog djelovanja kombinacije terapeutskih sredstava i terapije zračenjem. Na primjer, u prikladnim slučajevima, povoljan učinak još uvijek se postiže kad se radijacijsko liječenje privremeno prestane primjenjivati, dok se terapeutska sredstva i dalje primjenjuju, kroz dane ili čak tjedne.

"Dodatna terapija" obuhvaća liječenje ispitanika sredstvima koja smanjuju ili izbjegavaju popratne učinke povezane s kombinacijskom terapijom ovog izuma, uključujući, ali bez ograničenja, sredstva koja, na primjer, smanjuju toksični učinak lijekova protiv raka, npr. inhibitore resorpcije kosti, kardioprotektivna sredstva, sredstva koja sprečavaju ili smanjuju pojavnost mučnine i povraćanja povezane s kemoterapijom, radioterapijom ili operacijom; ili smanjuju pojavnost infekcije povezane s primjenom mijelosupresivnih lijekova protiv raka.

Poželjna ostvarenja

Dok je najšira definicija postavljena u poglavlju Bit izuma, neki spojevi formula (I), (II) i (III) opisani u nastavku poželjni su za izvedbu ovog izuma.

Inhibitori protein-tirozin-kinaze - spojevi formule (I):

(1) Poželjna grupa spojeva formule (I) je ona u kojoj su R1, R3 i R4 vodik.

(2) Druga poželjna grupa spojeva formule (I) je ona gdje su R1, R2 i R4 vodik.

(3) Još jedna poželjna grupa spojeva formule (I) je ona gdje su R1, R2 i R3 vodik.

(4) Još jedna poželjna grupa spojeva formule (I) je ona gdje su R2, R3 i R4 vodik.

(5) Još jedna poželjna grupa spojeva formule (I) je ona gdje su R1, R2, R3 i R4 vodik.

(6) Još jedna poželjna grupa spojeva formule (I) je ona gdje su R5, R6 ili R7, poželjno R5 ili R6, još bolje R6 je -COR10, pri čemu je R10 -NR11(CH2)nR12, gdje:

R11 je vodik ili niži alkil, poželjno vodik ili metil;

n je 2, 3 ili 4, poželjno 2 ili 3; a

R12 je -NR13R14, pri čemu su R13 i R14 neovisno alkil, poželjnije niži alkil, ili su R13 i R14 spojeni i tvore grupu izabranu između -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)2-O-(CH2)2- ili -(CH2)2-N(CH3)(CH2)2-, poželjno je da su R13 i R14 neovisno vodik, metil, etil ili se spajaju da bi formirali morfolin-4-il, pirolidin-1-il, piperazin-1-il ili metilpiperazin-1-il.

Poželjnije je da je R5 ili R6 iz gornje točke (6) N-(2-dimetilaminoetil)aminokarbonil, N-(2-etilaminoetil)-N-metilaminokarbonil, N-(3-dimetilaminopropil)-aminokarbonil, N-(2-dietilaminoetil)aminokarbonil, N-(3-etilaminopropil)aminokarbonil, N-(3-dietilaminopropil)aminokarbonil, 3-pirolidin-1-il-propilaminokarbonil, 3-morfolin-4-il-propil-aminokarbonil, 2-pirolidin-1-il-etilaminokarbonil, 2-morfolin-4-il-etilaminokaronil, 2-(4-metilpiperazin-1-il)etilaminokarbonil, 2-(4-metilpiperazin-1-il)propilaminokarbonil, 2-(3,5-dimetilpiperazin-1-il)etilaminokarbonil ili 2-(3,5-dimetilpiperazin-1-il)propilaminokarbonil, još poželjnije N-(2-dietil-aminoetil)aminokarbonil ili N-(2-etilaminoetil)amino-karbonil.

(7) Još jedna poželjna grupa spojeva formule (I) je ona u kojoj su R5, R6 ili R7, poželjno R5 ili R6, još bolje R6 je -COR10, pri čemu je R10 -NR13R14, pri čemu je R13 vodik, a R14 alkil, poželjno niži alkil supstituiran hidroksi, arilnom, heteroarilnom, heteroalicikličkom ili karboksi-grupom, poželjnije metil, etil, propil ili butil supstituiran hidroksi-, arilnom, heteroalicikličkom grupom, kao što su piperidin, piperazin, morfolin i slično, heteroarilnom ili karboksi-grupom. Još je poželjnije kad su R5 ili R6 unutar grupe (7) 2-etoksikarbonilmetil-aminokarbonil, karboksimetilaminokarbonil, 3-hidroksipropil-aminokarbonil, 2-hidroksietilaminokarbonil, 3-triazin-1-il-propilaminokarbonil, triazin-1-il-etilaminokarbonil, 4-hidroksi-feniletilaminokarbonil, 3-imidazol-1-il-propil-aminokarbonil, piridin-4-il-metilaminokarbonil, 2-piridin-2-il-etilaminokarbonil ili 2-imidazol-1-il-etilaminokarbonil.

(8) Još jedna poželjna grupa spojeva formule (I) je ona u kojoj su R5, R6 ili R7, poželjno R5 ili R6, još bolje R6 je -COR10, pri čemu je R10 -NR11(CH2)nR12, gdje:

R11 je vodik ili alkil, poželjno vodik ili metil;

n je 2, 3 ili 4, poželjno 2 ili 3; a

R12 je -NR13R14, pri čemu R13 i R14 zajedno tvore heterocikal, poželjno od 5, 6 ili 7 članova, tako da sadrži karbonilnu grupu i 1 ili 2 dušikova atoma. Poželjno je da je R5 ili R6 2-(3-etoksikarbonilmetilpiperazin-1-il)etilaminokarbonil, 2-(3-oksopiperazin-1-il)etilaminokarbonil, 2-(imidazolidin-1-il-2-on)etilaminokarbonil, 2-(tetrahidropirimidin-1-il-2-on)etilaminokarbonil, 2-(2-oksopirolidin-1-il)-etilaminokarbonil, 3-(4-metilpiperazin-1-il)-propilaminokarbonil, 3-(3-etoksikarbonilmetilpiperazin-1-il)-propilaminokarbonil, 3-(3-oksopiperazin-1-il)propil-aminokarbonil, 3-(imidazolidin-1-il-2-on)propil-aminokarbonil, 3-(tetrahidropirimidin-1-il-2-on)-propilaminokarbonil, 3-(2-oksopirolidin-1-il)propil-aminokarbonil, 2-(2-oksohomopiperidin-1-il)etilamino-karbonil ili 3-(2-oksohomopiperidin-1-il)propilaminokarbonil.

(9) Još jedna poželjna grupa spojeva formule (I) je ona u kojoj su R5, R6 ili R7, poželjno R5 ili R6, još bolje R6 je -COR10, gdje:

(a) R10 je-NR11(CH2)nR12, gdje:

R11 je vodik ili alkil, poželjno vodik ili metil;

n je 2, 3 ili 4, poželjno 2 ili 3; a

R12 je -NR13R14, pri čemu je R13 vodik, a R14 cijanoalkil ili -NHCORa, gdje je Ra alkil; ili

(b) R10 je -NR13R14, pri čemu R13 i R14 zajedno tvore heterocikal koji ne sadrži karbonilnu grupu unutar prstena. Poželjno je da je R5 ili R6 2-(2-cijanoetilamino)etilaminokarbonil, 2-(acetilamino)-etilaminokarbonil, morfolinokarbonil, piperidin-1-il-karbonil, 2-cijanometilaminoetilaminokarbonil ili piperidin-1-il-karbonil.

(10) Još jedna poželjna grupa spojeva formule (I) je ona u kojoj je R5 -COR10, pri čemu je R10 -NR13R14, gdje je R13 vodik, a R14 niži alkil supstituiran hidroksi-grupom, nižim alkilom supstituiranim hidroksialkilamino, karboksi ili -NR18R19, gdje su R18 i R19 neovisno vodik ili niži alkil, a poželjnije je da je R5 2-[(dietilamino)-2-hidroksietil]aminokarbonil, 2-(N-etil-N-2-hidroksietilamino)etilaminokarbonil, karboksimetilamino-karbonil ili 2-(2-hidroksietilamino)etilamino-karbonil.

(11) Još jedna poželjna grupa spojeva formule (I) je ona u kojoj je R6 -COR10, pri čemu je R10 -NR13R14, gdje je R13 vodik, a R14 niži alkil supstituiran hidroksi-grupom, nižim alkilom supstituiranim hidroksialkilamino, karboksi ili -NR18R19, gdje su R18 i R19 neovisno vodik ili niži alkil, a poželjnije je da je R6 2-[(dietilamino)-2-hidroksietil]aminokarbonil, 2-(N-etil-N-2-hidroksietilamino)etilaminokarbonil, karboksimetilamino-karbonil ili 2-(2-hidroksietilamino)etilamino-karbonil.

(12) Još jedna poželjna grupa spojeva formule (I) je ona u kojoj je R5 -COR10, pri čemu je R10 -NR11(CH2)nR12, gdje je R12 -N+(O-)NR13R14 ili -N(OH)R13, pri čemu su R13 i R14 neovisno izabrani iz grupe koju čine vodik i niži alkil, a poželjno je da je R5 2-(N-hidroksi-N-etilamino)-etilaminokarbonil ili 2-[N+(O-)(C2H5)2]etil-aminokarbonil.

(13) Još jedna poželjna grupa spojeva formule (I) je ona u kojoj je R6 -COR10, pri čemu je R10 -NR11(CH2)nR12, gdje je R12 -N+(O-)NR13R14 ili -N(OH)R13, pri čemu su R13 i R14 neovisno izabrani iz grupe koju čine vodik i niži alkil, a poželjno je da je R6 2-(N-hidroksi-N-etilamino)-etilaminokarbonil ili 2-[N+(O-)(C2H5)2]etil-aminokarbonil.

(14) U gore poželjnim grupama (6)-(13), kad je R5 -COR10, poželjnija grupa spojeva je ona u kojoj:

R6 je izabran iz grupe koju čine vodik i alkil, poželjno vodik, metil, etil, izopropil, terc-butil, izobutil ili n-butil, poželjnije vodik ili metil; a

R7 je izabran iz grupe koju čine vodik, alkil, aril, heteroaril i -C(O)R17, pri čemu je R17 hidroksi, alkil ili aril, bolje vodik, metil, etil, izopropil, n-, izo- ili terc-butil, fenil, benzoil, acetil ili karboksi, još bolje metil, vodik ili fenil.

(15) U gore poželjnim grupama (6)-(13), kad je R5 -COR10, još jedna poželjnija grupa spojeva je ona u kojoj se R6 i R7 spajaju da bi nastao -(CH2)4-.

(16) U gore poželjnim grupama (6)-(13), kad je R6 -COR10, poželjnija grupa spojeva je ona u kojoj:

R5 je izabran iz grupe koju čine vodik i alkil, poželjno vodik, metil, etil, izopropil, terc-butil, izobutil ili n-butil, poželjnije vodik ili metil; a

(17) U gore poželjnim i još poželjnijim grupama (6)-(16), još poželjnija grupa spojeva je ona u kojoj:

R1 je vodik, alkil, -C(O)NR8R9, cikloalkil ili aril, poželjno vodik, fenil, 3,4-dimetoksifenilaminokarbonil, 4-metoksi-3-klorofenil-aminokarbonil, još bolje vodik ili metil, a najbolje vodik;

R2 je cijano, vodik, halo, niži alkoksi, aril ili -S(O)2NR13R14, gdje je R13 vodik, a R14 vodik, aril ili alkil, a poželjno je da je R2 vodik, kloro, bromo, fluoro, metoksi, etoksi, fenil, dimetilaminosulfonil, 3-klorofenil-aminosulfonil, karboksi, metoksi, aminosulfonil, metilaminosulfonil, fenilaminosulfonil, piridin-3-il-aminosulfonil, dimetilaminosulfonil, izopropilamino-sulfonil, poželjnije vodik, fluoro ili bromo;

R3 je izabran iz grupe koju čine vodik, niži alkoksi, -C(O)R15, -NR13C(O)R14, aril, poželjno aril eventualno supstituiran jednim ili dvama supstituentima izabranima iz grupe koju čine niži alkil, halo ili niži alkoksi, i heteroaril, poželjno heteroaril eventualno supstituiran jednim ili dvama supstituentima izabranima iz grupe koju čine niži alkil, halo ili niži alkoksi; poželjno vodik, metoksi, karboksi, fenil, piridin-3-il, 3,4-diklorofenil, 2-metoksi-5-izopropilfenil, 4-n-butilfenil, 3-izopropilfenil, poželjnije vodik ili fenil; a

R4 je vodik.

(18) Još jedna poželjnija grupa spojeva formule (I) je ona u kojoj:

R1 je vodik, alkil, -C(O)NR8R9, cikloalkil ili aril, poželjno vodik, 3,4-dimetoksifenilaminokarbonil, 4-metoksi-3-klorofenil-aminokarbonil, još bolje vodik ili metil, naročito vodik;

R4 je vodik.

Unutar gore poželjne grupe (18), još poželjnija je grupa spojeva u kojoj:

R5 je -COR10, gdje je R10 definiran kao u poglavlju "Bit izuma", poželjno -NR11(CH2)nR12 ili -NR13R14, kako je definirano kao u poglavlju "Bit izuma".

Unutar gore poželjne grupe (18), još poželjnija je grupa spojeva u kojoj:

R6 je -COR10, gdje je R10 definiran kao u poglavlju "Bit izuma", poželjno -NR11(CH2)nR12 ili -NR13R14, kako je definirano kao u poglavlju "Bit izuma".

(19) Još jedna poželjnija grupa spojeva formule (I) je ona u kojoj:

R1 i R4 su vodik;

R2 je izabran iz grupe koju čine vodik, halo, niži alkoksi, -C(O)R15 i -S(O)2NR13R14;

R3 je izabran iz grupe koju čine vodik, niži alkoksi, -C(O)R15, -S(O)2NR13R14, aril i heteroaril;

R5 je -COR10;

R6 je izabran iz grupe koju čine vodik i niži alkil; a

R7 je izabran iz grupe koju čine vodik, niži alkil i -C(O)R17.

U još jednom ovdje poželjnom ostvarenju ovog izuma, u spoju čija je struktura opisana u točki (15):

R10 je izabran iz grupe koju čine hidroksi, niži alkoksi i -NR11(CH2)nR12, gdje

n je 2 ili 3;

R11 je izabran iz grupe koju čine vodik i niži alkil; a

R12 je izabran iz grupe koju čine aril i -NR13R14.

Dodatno, ovdje poželjno ostvarenje ovog izuma je ono gdje su, u spoju čija je struktura ona opisana u prethodna dva odlomka, R13 i R14 neovisno izabrani iz grupe vodik, niži alkil i, spojeno, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)2O(CH2)2 ili -(CH2)N(CH3)(CH2)2-.

(20) Još jedno ovdje poželjno ostvarenje ovog izuma je spoj u kojem:

R1 je izabran iz grupe koju čine vodik, niži alkil, -(CH2)rR16 i -C(O)NR8R9;

R2 je izabran iz grupe koju čine vodik, halogen, aril i -S(O)2NR13R14;

R3 je izabran iz grupe koju čine vodik, niži alkil, niži alkoksi, aril, heteroaril i -C(O)R15;

R4 je vodik;

R5 je izabran iz grupe koju čine vodik i niži alkil;

R6 je -COR10;

R7 je izabran iz grupe koju čine vodik, niži alkil i aril;

R16 je izabran iz grupe koju čine hidroksi i -C(O)R15; a

r je 2 ili 3.

Ovdje poželjno ostvarenje ovog izuma je spoj čija je struktura ona upravo opisana u ovom odlomku, a u kojoj je R3 aril eventualno supstituiran jednom ili više grupa izabranima iz grupe koju čine niži alkil, niži alkoksi i halo.

(21) Slično tome, poželjno je ostvarenje ovog izuma spoj u kojem:

R1 je izabran iz grupe koju čine vodik, niži alkil, -(CH2)rR16 i -C(O)NR8R9;

R2 je izabran iz grupe koju čine vodik, halogen, aril i -S(O)2NR13R14;

R4 je vodik;

R5 je izabran iz grupe koju čine vodik i niži alkil;

R6 je -COR10;

R7 je izabran iz grupe koju čine vodik, niži alkil i aril;

R16 je izabran iz grupe koju čine hidroksi i -C(O)R15; a

r je 2 ili 3,

R10 je izabran iz grupe koju čine hidroksi, niži alkoksi, -NR13R14 i -NR11(CH2)nR12, pri čemu je n 1, 2 ili 3, R11 je vodik, a R12 je izabran iz grupe koju čine hidroksi, niži alkoksi, -C(O)R15, heteroaril i -NR13R14.

(22) Još jedno ovdje poželjno ostvarenje ovog izuma je spoj čija je struktura upravo opisana u prethodnom odlomku, a u kojoj su R13 i R14 neovisno izabrani iz grupe koju čine vodik, niži alkil, heteroaril i, spojeni, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)2O(CH2)2 ili -(CH2)N(CH3)(CH2)2-.

(23) Još jedno poželjno ostvarenje ovog izuma je spoj u kojem:

R1 je -C(O)NR8R9, pri čemu je R8 vodik, a R9 aril, eventualno supstituiran jednom ili više grupa izabranima iz grupe koju čine halo, hidroksi i niži alkoksi;

R2 je izabran iz grupe koju čine vodik, halogen, aril i -S(O)2NR13R14;

R4 je vodik;

R5 je izabran iz grupe koju čine vodik i niži alkil;

R6 je -COR10;

R7 je izabran iz grupe koju čine vodik, niži alkil i aril; a

r je 2 ili 3.

(24) Još jedno poželjno ostvarenje ovog izuma je spoj u kojem:

R1 je izabran iz grupe koju čine vodik i niži alkil;

R2 je izabran iz grupe koju čine vodik, halo, niži alkoksi, aril, -C(O)R15 i -S(O)2NR13R14;

R3 je izabran iz grupe koju čine vodik, halo, aril, heteroaril i -C(O)R15;

R4 je vodik;

R5 je -COR10; a

R6 i R7 zajedno tvore -(CH2)4- grupu.

U spoju čija je struktura upravo opisana u prethodnom odlomku, poželjno je ostvarenje u kojem je R10 izabran iz grupe koju čine hidroksi, alkoksi, -NR13R14 i -NH(CH2)nNR13R14, pri čemu je n 2 ili 3.

Ovdje je poželjno ostvarenje ovog izuma u kojem su, u spoju čija je struktura upravo opisana u prethodna dva odlomka, R13 i R14 neovisno izabrani iz grupe koju čine vodik, niži alkil i, spojeni, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)2O(CH2)2 ili -(CH2)N(CH3)(CH2)2-.

Reprezentativni spojevi formule (I) prikazani su u Tablici I u nastavku.

[image]

[image] [image] [image]

[image] [image] [image] [image] [image] [image] [image] [image] [image]

[image] [image] [image] [image] [image] [image] [image] [image] [image] [image]

Brojevi spojeva odgovaraju brojevima primjera u sekciji Primjeri. To jest, sinteza Spoja 1 u Tablici 1 opisana je u Primjeru 1. Spojevi predstavljeni u Tablici 1 samo su primjeri i nisu konstruirani s namjerom da na bilo koji način ograniče domete ovog izuma. Dodatni inhibitori protein-kinaza koji se mogu koristiti ovim postupkom uključuju 3-(3,5-dimetilpirol-2-il-metiliden)-2-indolinon (su 5416); 3-[3,5-dimetil-4-(2-karboksietil)pirol-2-il-metiliden]-2-indolinon (su 6668) i 3-[3-(2-karboksietil)-5-metilpirol-2-il-metiliden)-2-indolinon.

Selektivni inhibitori ciklooksigenaze-2 - spojevi formula (II) i (III):

Neograničavajući primjeri inhibitora COX-2 koje je moguće koristiti u ovom izumu prikazani su u Tablicama II i III u nastavku.

TABLICA II

[image] [image]

Pirazoli se mogu prirediti postupcima opisanima u WO 95/15316, zatim, postupcima opisanima u WO 95/15315 i WO 96/03385. Analozi tiofena mogu se prirediti postupcima opisanima u WO 95/00501. Priprema analoga tiofena također je opisana u WO 94/15932. Oksazoli se mogu prirediti postupcima opisanima u WO 95/00501. Priprema oksazola također je opisana u WO 94/27980. Izoksazoli se mogu prirediti postupcima opisanima u WO 96/25405. Imidazoli se mogu prirediti postupcima opisanima u WO 96/03388. Priprema imidazola također je opisana u WO 96/03387. Ciklopentanski inhibitori ciklooksigenaze-2 mogu se prirediti postupcima opisanima u U.S. patentu br. 5 344 991. Priprema ciklopentanskih Cox-2 inhibitora također je opisana u WO 95/00501. Terfenilni spojevi mogu se prirediti postupcima opisanima u 96/16934. Tiazolni spojevi mogu se prirediti postupcima opisanima u WO 96/03392. Piridinski spojevi mogu se prirediti postupcima opisanima u WO 96/003392. Priprema piridinskih spojeva također je opisana u WO 96/24585.

Celekoksib, korišten u terapeutskim kombinacijama ovog izuma, može se prirediti na način izložen u U.S. patentu br. 5 466 823.

Valdekoksib, korišten u terapeutskim kombinacijama ovog izuma, može se prirediti na način izložen u U.S. patentu br. 5 633 272.

Parekoksib, korišten u terapeutskim kombinacijama ovog izuma, može se prirediti na način izložen u U.S. patentu br. 5 932 598.

Rofekoksib, korišten u terapeutskim kombinacijama ovog izuma, može se prirediti na način izložen u U.S. patentu br. 5 968 974.

Japan Tobacco JTE-522, korišten u terapeutskim kombinacijama ovog izuma, može se prirediti na način izložen u JP 90/52882.

Lumirakoksib (Cox-189), korišten u terapeutskim kombinacijama ovog izuma, može se prirediti na način izložen u WO 99/11605.

Etorikoksib (MK 663), korišten u terapeutskim kombinacijama ovog izuma, može se prirediti na način izložen u WO 98/03484.

Bristol Myers Squibb BMS 34070, korišten u terapeutskim kombinacijama ovog izuma, može se prirediti na način izložen u U.S. patentu br. 6 180 651.

Gornje reference, navedene u Tablicama II i III, opisuju različite COX-2 inhibitore prikladne za upotrebu u ovdje opisanom izumu, kao i postupke njihove proizvodnje, i ovdje su pojedinačno uključene citatom.

Poželjni COX-2 inhibitori koje je moguće koristiti u ovom izumu uključuju, ali bez ograničenja:

C1)

[image]

JTE-522, 4-(4-cikloheksil-2-metiloksazol-5-il)-2-fluorobenzensulfonamid;

C2)

5-kloro-3-(4-(metilsulfonil)fenil)-2-(metil-5-piridinil)piridin;

C3)

2-(3,5-difluorofenil)-3-4-(metilsulfonil)fenil-2-ciklopenten-1-on;

C4)

[image]

4-[5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il]-benzensulfonamid;

C5)

[image]

rofekoksib, 4-[4-(metilsulfonil)fenil]-3-fenil-2(5H)-furanon;

C6)

[image]

4-(5-metil-3-fenilizoksazol-4-il)benzensulfonamid;

C7)

N-[[4-(5-metil-3-fenilizoksazol-4-il)fenil]sulfonil]propanamid;

C8)

[image]

4-[5-(4-klorofenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il]benzensulfonamid;

C9)

[image]

C10)

[image]

C11)

[image]

6-[[5-(4-klorobenzoil-1,4-dimetil-1H-pirol-2-il]metil]-3(2H)-piridazinon;

C12)

[image]

N-(4-nitro-2-fenoksifenil)metansulfonamid;

C13)

[image]

C14)

[image]

3-(3,4-difluorofenoksi)-5,5-dimetil-4-[4-(metilsulfonil)fenil]-2(5H)-furanon;

C15)

[image]

N-[6-[(2,4-difluorofenil)tio]-2,3-dihidro-1-okso-1H-inden-5-il]metansulfonamid;

C16)

[image]

3-(4-klorofenil)-4-[4-(metilsulfonil)fenil]-2(3H)-oksazolon;

C17)

[image]

4-[3-(4-fluorofenil)-2,3-dihidro-2-okso-4-oksazolil]benzensulfonamid;

C18)

[image]

3-[4-(metilsulfonil)fenil]-2-fenil-2-ciklopenten-1-on;

C19)

[image]

4-(2-metil-4-fenil-5-oksazolil)benzensulfonamid;

C20)

[image]

3-(4-fluorofenil)-4-[4-(metilsulfonil)fenil]-2(3H)-oksazolon;

C21)

[image]

5-(4-fluorofenil)-1-[4-(metilsulfonil)fenil]-3-(trifluorometil)-1H-pirazol;

C22)

[image]

4-[5-fenil-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il]-benzensulfonamid;

C23)

[image]

4-[1-fenil-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-5-il]benzensulfonamid;

C24)

[image]

4-[5-(4-fluorofenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il]benzensulfonamid;

C25)

[image]

N-[2-(cikloheksiloksi)-4-nitrofenil]metansulfonamid;

C26)

[image]

N-[6-(2,4-difluorofenoksi)-2,3-dihidro-1-okso-1H-inden-5-il]metansulfonamid;

C27)

[image]

3-(4-klorofenoksi)-4-[(metilsulfonil)amino]benzensulfonamid;

C28)

[image]

3-(4-fluorofenoksi)-4-[(metilsulfonil)amino]benzensulfonamid;

C29)

[image]

3-[(1-metil-1H-imidazol-2-il)tio]-4-[(metilsulfonil)amino]benzensulfonamid;

C30)

[image]

5,5-dimetil-4-[4-(metilsulfonil)fenil]-3-fenoksi-2(5H)-furanon;

C31)

[image]

N-[6-[(4-etil-2-tiazolil)tio]-1,3-dihidro-1-okso-5-izobenzofuranil]metansulfonamid;

C32)

[image]

3-[(2,4-diklorofenil)tio]-4-[(metilsulfonil)amino]benzensulfonamid;

C33)

[image]

1-fluoro-4-[2-[4-(metilsulfonil)fenil]ciklopenten-1-il]benzen;

C34)

[image]

4-[5-(4-klorofenil)-3-(difluorometil)-1H-pirazol-1-il]benzensulfonamid;

C35)

[image]

3-[1-[4-(metilsulfonil)fenil]-4-(trifluorometil)-1H-imidazol-2-il]piridin;

C36)

[image]

4-[2-(3-piridinil)-4-(trifluorometil)-1H-imidazol-1-il]benzensulfonamid;

C37)

[image]

4-[5-(hidroksimetil)-3-fenilizoksazol-4-il]benzensulfonamid;

C38)

[image]

4-[3-(4-klorofenil)-2,3-dihidro-2-okso-4-oksazolil]benzensulfonamid;

C39)

[image]

3-[5-(difluorometil)-3-fenilizoksazol-4-il]benzensulfonamid;

C40)

[image]

[1,1':2',1''-terfenil-4-sulfonamid;

C41)

[image]

4-(metilsulfonil)-1,1',2,1''-terfenil;

C42)

[image]

4-(2-fenil-3-piridinil)benzensulfonamid;

C43)

[image]

N-(2,3-dihidro-1,1-dioksido-6-fenoksi-1,2-benzizotiazol-5-il)metansulfonamid; i

C44)

[image]

N-[3-(formilamino)-4-okso-6-fenoksi-4H-1-benzopiran-7-il]metansulfonamid;

C45)

[image]

C46)

[image]

C47)

[image]

C48)

[image] ; i

C49) lumirakoksib (COX-189)

[image]

2-[(2-kloro-6-fluorofenil)amino]-5-metilbenzenoctena kiselina

C50) etorikoksib (MK 663)

[image]

5-kloro-6'-metil-3-[4-(metilsulfonil)fenil]-2,3'-bipiridin

C51) BMS 34070

[image]

Poželjniji inhibitori COX-2 koje je moguće koristiti u ovom izumu izabrani su iz grupe koju čine:

I)

[image]

JTE-522, 4-(4-cikloheksil-2-metiloksazol-5-il)-2-fluorobenzensulfonamid;

II)

5-kloro-3-(4-(metilsulfonil)fenil)-2-(metil-5-piridinil)piridin;

III)

2-(3,5-difluorofenil)-3-4-(metilsulfonil)fenil-2-ciklopenten-1-on;

IV)

[image]

4-[5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il]-benzensulfonamid;

V)

[image]

rofekoksib, 4-[4-(metilsulfonil)fenil]-3-fenil-2(5H)-furanon;

VI)

[image]

4-(5-metil-3-fenilizoksazol-4-il)benzensulfonamid;

VII)

N-[[4-(5-metil-3-fenilizoksazol-4-il)fenil]sulfonil]propanamid;

VIII)

[image]

4-[5-(4-klorofenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il]benzensulfonamid; i

IX) lumirakoksib (COX-189)

[image]

2-[(2-kloro-6-fluorofenil)amino]-5-metilbenzenoctena kiselina

Još poželjniji inhibitori COX-2 koje je moguće koristiti u ovom izumu uključuju, ali bez ograničenja, celekoksib, valdekoksib, parekoksib, rofekoksib, lumirakoksib i Japan Tobacco JTE-522.

U kombinaciju ovog izuma također su uključeni izomerni oblici, prolijekovi i tautomeri opisanih spojeva, kao i njihove farmaceutski prihvatljive soli. Ilustrativne farmaceutski prihvatljive soli pripremaju se iz mravlje, octene, propionske, sukcinske, glikolne, glukonske, mliječne, malične, tartarne, limunske, askorbinske, glukuronske, maleinske, fumarne, pirogrožđane, asparaginske, glutaminske, benzojeve, antranilične, mezilne, stearinske, salicilne, p-hidroksibenzojeve, feniloctene, mandelne, embonske (pamoične), metansulfonske, etansulfonske, benzensulfonske, pantotenske, toluensulfonske, 2-hidroksietansulfonske, sulfanilne, cikloheksilaminosulfonske, algenske, b-hidroksibutirne, galaktarne i galakturonske kiseline.

Upotreba

Spojevi ovog izuma su inhibitori protein-kinaza (PK) i enzima ciklooksigenaze, naročito ciklooksigenaze-2, i prema tome su korisni u liječenju raka.

PK, čiju katalitičku aktivnost moduliraju spojevi formule (I) ovog izuma, uključuju protein-tirozin-kinaze, kao što su receptorske tirozin-kinaze (RTK), stanične tirozin-kinaze (CTK) i serin-treonin-kinaze (STK). Prijenos signala posredovan RTK potaknut je izvanstaničnom interakcijom sa specifičnim faktorom rasta (ligandom), nakon čega slijede dimerizacija receptora, prolazna stimulacija unutarnje aktivnosti protein-tirozin-kinaze i fosforilacija. Time se formiraju vezna mjesta za unutarstanične signalne molekule, što dovodi do nastajanja komleksa s nizom citoplazmatskih signalnih molekula koje olakšavaju odgovarajući stanični odgovor (npr. stanična dioba, metabolički učinci na izvanstaničnu mikrookolinu, itd.). V. Schlessinger i Ullrich, 1992, Neuron 9:303-391.

Pokazano je da tirozinska fosforilacijska mjesta na receptorima za faktore rasta funkcioniraju kao vezna mjesta visokog afiniteta za SH2 (src homologija) domene signalnih molekula. Fantl i sur., 1992, Cell 69:413-423, Songyang i sur., 1994, Mol. Cell Biol. 14:2777-2785, Songyang i sur., 1993, Cell 72:767-778 i Koch i sur., 1991, Science 252:668-678. Identificirano je nekoliko unutarstaničnih supstratnih proteina koji se vežu za RTK. Mogu se podijeliti u dvije osnovne grupe: (1) supstrate koji imaju katalitičku domenu, i (2) supstrate kojima takva domena nedostaje, ali koji služe kao adapteri i vežu se s katalitički aktivnim molekulama. Songyang i sur., 1993, Cell 72:767-778. Specifičnost interakcija između receptora i SH2 domena njihovih supstrata određena je aminokiselinskim ostacima koji neposredno okružuju fosforilirani tirozinski ostatak. Razlike u afinitetu vezivanja između SH2 domena i aminokiselinskih slijedova koji okružuju fosfotirozinske ostatke određenih receptora u skladu su s opaženim razlikama u fosforilacijskim profilima supstrata. Songyang i sur., 1993, Cell 72:767-778. Ova opažanja upućuju na to da funkcija svake RTK nije određena samo načinom ekspresije i raspoloživošću liganda, već i slijedu nizvodnih puteva prijenosa signala koji su aktivirani određenim receptorom. Tako fosforilacija čini važan regulatorni korak koji određuje selektivnost signalnih puteva potaknutih specifičnim receptorima za faktore rasta, kao i receptorima diferencijacijskih faktora.

STK, koje su prvenstveno citosolne, utječu na unutarnju biokemiju stanice, često kao nizvodni odgovor na PTK događaj. STK su uključene u signalne procese koji iniciraju sintezu DNA i mitozu, što vodi proliferaciji stanice.

Na taj način, prijenos signala PK rezultira, između ostalog, staničnom proliferacijom, diferencijacijom, rastom i metabolizmom. Abnormalna stanična proliferacija može dovesti do širokog niza poremećaja i bolesti, uključujući razvoj neoplazije, kao što su karcinomi, sarkomi, glioblastomi i hemangiomi, poremećaja kao što su leukemija, psorijaza, arterioskleroza, artritis i dijabetička retinopatija, te drugih poremećaja povezanih s nekontroliranom angiogenezom i/ili vaskulogenezom.

Za primjenu ovog izuma nije neophodno detaljno razumijevanje mehanizma kojim spojevi ovog izuma inhibiraju PK. Međutim, iako time nisu vezani za neki određeni mehanizam ili teoriju, smatra se da spojevi formule (I) ulaze u interakcije s aminokiselinama u katalitičkoj regiji PK. PK tipično posjeduju bilobarnu strukturu, pri čemu izgleda da se ATP veže u pukotinu između dva režnja u regiji gdje su aminokiseline između različitih PK ostale konzervirane. Za inhibitore PK smatra se da se vežu nekovalentnim interakcijama, kao što su vodikove veze, van der Waalsove sile i ionske interakcije, u istu opću regiju gdje se prethodno spomenuti ATP veže za PK. Specifičnije, smatra se da se 2-indolinonska komponenta spojeva formule (I) veže u prostor koji normalno zauzima adeninski prsten ATP. Specifičnost određene molekule za određenu PK proizlazi iz dodatnih interakcija između različitih supstituenata na 2-indolinonskoj jezgri i aminokiselinskih domena specifičnih za određene PK. Tako različiti indolinonski supstituenti mogu doprinijeti preferencijalnom vezanju za određene PK. Sposobnost izbora spojeva aktivnih na različitim ATP (ili drugih nukleotida)-veznim mjestima čini spojeve formule (I) korisnima za usmjeravanje prema bilo kojem proteinu s takvim mjestom. Ovdje objavljeni spojevi formule (I) tako su primjenjivi u in vitro testovima za takve proteine, kao i u iskazivanju terapeutskih učinaka in vivo kroz interakcije s takvim proteinima.

Nadalje, spojevi formule (I) daju terapeutski pristup liječenju mnogih oblika čvrstih tumora, uključujući, ali bez ograničenja, karcinome, sarkome, uključujući Kaposijev sarkom, eritroblastome, glioblastome, meningiome, astrocitome, melanome i mioblastome. Liječenje ili prevencija ne-čvrstih tumorskih tvorevina, kao što je leukemija, također je uključeno u ovaj izum. Indikacije mogu uključiti, ali bez ograničenja, rak mozga, mjehura, jajnika, želuca, gušterače, debelog crijeva, krvi, pluća i kosti.

Dodatni primjeri oblika bolesti povezanih s neprikladnom aktivnošću PK, a za koje spojevi ovog izuma mogu biti korisni u sprečavanju, liječenju i proučavanju, bez ograničenja, uključuju poremećaje proliferacije stanica, fibrotične poremećaje i metaboličke poremećaje.

Poremećaji proliferacije stanica, koje je moguće spriječiti, liječiti ili dodatno proučavati pomoću ovog izuma, uključuju rak, poremećaje proliferacije krvnih žila i mezangijskih stanica.

Poremećaji proliferacije krvnih žila odnose se na poremećaje povezane s abnormalnom vaskulogenezom (formiranjem krvnih žila) i angiogenezom (širenjem krvnih žila). Dok vaskulogeneza i angiogeneza igraju važne uloge u raznim normalnim fiziološkim procesima, kao što su embrionalni razvitak, nastajanje žutog tijela, zacjeljivanje rana i regeneracija organa, one također igraju i ključnu ulogu u razvoju raka, gdje rezultiraju nastajanjem novih kapilara, potrebnih za održavanje tumora vitalnim. Ostali primjeri poremećaja proliferacije krvnih žila uključuju artritis, gdje nove kapilare ulaze u zglob i razaraju hrskavicu, i očne bolesti, kao što je dijabetička retinopatija, gdje nove kapilare u mrežnici ulaze u staklovinu, krvare i uzrokuju sljepoću.

Dvije strukturno srodne RTK identificirane su da visokim afinitetom vežu VEGF: receptor fms-sličnog tirozina-1 (fit-1, Shibuya i sur., 1990, Oncogene, 5:519-524; De Vries i sur., 1992, Science, 255:989-991) i KDR/FLK-1 receptor, također poznat kao VEGF-R2. Vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF) poznat je kao mitogen specifičan za endotelne stanice, pri čemu pospješuje aktivnost endotelnog staničnog rasta in vitro. Ferrara & Henzel, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm., 161-851-858; Vaisman i sur., 1990, J. Biol. Chem., 265: 19461-19566. Informacije iznesene u U.S. prijavi ser. br. 08/193 829, 08/038 596 i 07/975 750 upućuju na to da VEGF nije odgovoran samo za proliferaciju endotelnih stanica, već je i glavni regulator normalne i patološke angiogeneze. V. općenito Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology, 3(10)699-702; Houck i sur., 1992, J. Biol. Chem., 267:26031-26037.

Normalna vaskulogeneza i angiogeneza igraju važne uloge u raznim fiziološkim procesima, kao što su embrionalni razvitak, zacjeljivanje rana, regeneracija organa i reproduktivni procesi u žene, što se odnosi na razvoj folikula i žutog tijela tijekom ovulacije i razvoj placente u trudnoći. Folkman & Shing, 1992, J. Biological Chem., 267(16): 10931-34. Nekontrolirana vaskulogeneza i/ili angiogeneza povezuje se s poremećajima kao što je dijabetes, kao i s malignim čvrstim tumorima kojima je vaskularizacija neophodna za rast. Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology 3(10):699-702, Folkman, 1991, J. Natl. Cancer. Inst., 82:4-6; Weidner i sur., 1991, New Engl. J. Med., 324: 1-5.

Pretpostavljena uloga VEGF u proliferaciji i migraciji endotelnih stanica tijekom angiogeneze i vaskulogeneze ukazuje na važnu ulogu KDR/FLK-1 receptora u ovim procesima. Bolesti, kao diabetes mellitus (Folkman, 198, u XIth Congress of Thrombosis and Haemostasis (Verstraeta i sur., ur.), str. 583-596, Leuven University Press, Leuven) i artritis, kao rast malignih tumora mogu rezultirati iz nekontrolirane angiogeneze. V. npr. Folkman, 1971, N. Engl. J. Med., 285: 1182-1186. Receptori za koje se specifično veže VEGF važni su i moćni terapeutski ciljevi za regulaciju i modulaciju vaskulogeneze i/ili angiogeneze, te raznih teških bolesti koje uključuju abnormalni stanični rast uzrokovan takvim procesima. Plowman i sur., 1994, DN&P, 7(6):334-339. Specifičnije, visoko specifična uloga KDR/FLK-1 receptora u neovaskularizaciji čini ga ciljem izbora za terapeutski pristup liječenju raka i drugih bolesti koje uključuju nekontrolirano stvaranje krvnih žila.

Tako ovaj izum daje spojeve koji mogu regulirati i/ili modulirati prijenos signala putem tirozin-kinaza, uključujući prijenos signala putem KDR/FLK-1 receptora, s ciljem da se inhibira ili pospješi angiogeneza i/ili vaskulogeneza, to jest, spojeve koji inhibiraju, sprečavaju ili međudjeluju sa signalom kojeg prenosi KDR/FLK-1 kad je aktiviran ligandima kao što je VEGF. Iako se smatra da spojevi ovog izuma djeluju na receptor ili drugu komponentu duž puta prijenosa signala tirozin-kinaze, oni možda mogu djelovati izravno na tumorske stanice koje su nastale uslijed nekontrolirane angiogeneze.

Iako se nomenklatura ljudskih i mišjih kopija generičkog "flk-1" receptora razlikuju, oni su, u više pogleda, zamjenjivi. Mišji receptor, Flk-1, i njegov ljudski pandan, KDR, dijele homologiju sekvence od 93,4% unutarstanične domene. Slično tome, mišji FLK-1 veže ljudski VEGF istim afinitetom kao i mišji VEGF i, u skladu s time, aktivira ga ligand iz bilo koje vrste. Millauer i sur., 1993, Cell, 72: 835-846; Quinn i sur., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7533-7537. FLK-1 također asocira i zatim fosforilira tirozine ljudskih RTK supstrata (npr. PLC-γ ili p85), kad je koeksprimiran u 293 stanicama (ljudski embrionalni fibroblasti bubrega).

Prema tome, modeli koji se temelje na FLK-1 receptoru izravno su primjenjivi u razumijevanju KDR receptora. Na primjer, upotreba mišjeg FLK-1 receptora u postupcima za identifikaciju spojeva koji reguliraju puteve prijenosa signala u miša može se prenijeti na identifikaciju spojeva koji bi se mogli koristiti u regulaciji puteva prijenosa signala u ljudi, to jest, u regulaciji aktivnosti povezane uz KDR receptor. Tako se kemijski spojevi, prepoznati kao inhibitori KDR/FLK-1 in vitro mogu potvrditi u prikladnim modelima in vivo. Modeli miša i štakora in vivo pokazali su se vrlo vrijednima u ispitivanju kliničkog potencijala sredstava koja djeluju na put prijenosa signala potaknut KDR/FLK-1.

Ovaj izum tako daje spojeve koji reguliraju, moduliraju i/ili inhibiraju vaskulogenezu i/ili angiogenezu mijenjanjem enzimske aktivnosti KDR/FLK-1 receptora i utjecanjem na signal koji se tim receptorom prenosi. Time ovaj izum daje terapeutski pristup liječenju mnogih oblika čvrstih tumora, uključujući, ali bez ograničenja, glioblastom, melanom i Kaposijev sarkom, kao i karcinome jajnika, pluća, dojke, prostate, gušterače, debelog crijeva i epidermoida. Nadalje, podaci upućuju da primjena spojeva, koji inhibiraju put prijenosa signala posredovan KDR/Flk-1, može također biti korisna u liječenju hemangioma, restenoze i dijabetičke retinopatije.

Nadalje, ovaj se izum odnosi na inhibiciju vaskulogeneze i angiogeneze posredovane drugim receptorima, uključujući put koji obuhvaća flt-1 receptor.

Prijenos signala posredovan receptorskim tirozin-kinazama potaknut je izvanstaničnom interakcijom sa specifičnim faktorom rasta (ligandom), nakon čega slijedi dimerizacija receptora, prolazna stimulacija unutarnje aktivnosti protein tirozin-kinaze i autofosforilacija. Time se stvaraju vezna mjesta za unutarstanične molekule prijenosa signala, što dovodi do nastajanja kompleksa s nizom citoplazmatskih signalnih molekula, što olakšava odgovarajući stanični odgovor, npr. staničnu diobu i metaboličke učinke na izvanstaničnu mikrookolinu. V. Schlessinger i Ullrich, 1992, Neuron, 9:1-20.

Visoka homologija intracelularnih regija KDR/FLK-1 s PDGF-β receptorom (50,3% homologije) i/ili srodnim flt-1 receptorom upućuje na indukciju puteva prijenosa signala koji se međusobno preklapaju. Na primjer, za PDGF-β receptor pokazalo se da članovi src obitelji (Twamley i sur., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7696-7700), fosfatidilinozitol-3'-kinaza (Hu i sur., 1992, Mol. Cell. Biol., 12:981-990), fosfolipaza cγ (Kashishian & Cooper, 1993, Mol. Cell. Biol., 4:49-51), ras-GTPaza aktivirajući protein (Kashishian i sur., 1992, EMBO J., 11:1373-1382), PTP-ID/syp (Kazlauskas i sur., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6939-6943), Grb2 (Arvidsson i sur., 1994, Mol. Cell. Biol., 14:6715-6726) i adapterske molekule Shc i Nck (Nishimura i sur., 1993, Mol. Cell. Biol., 13:6889-6896) vežu regije koje uključuju različita mjesta autofosforilacije. V. općenito Claesson-Welsh, 1994, Prog. Growth Factor Res., 5:37-54. Tako je vjerojatno da put prijenosa signala, kojeg aktivira KDR/FLK-1, uključuje put ras (Rozakis i sur., 1992, Nature, 360:689-692), PI-3' kinazu, te puteve posredovane src i plcγ. Svaki od ovih puteva može imati presudnu ulogu u angiogenom i/ili vaskulogenom učinku KDR/FLK-1 u endotelnim stanicama. Dakle, još jedan aspekt ovog izuma odnosi se na upotrebu ovdje opisanih organskih spojeva u modulaciji angiogeneze i vaskulogeneze, budući da su ti procesi kontrolirani ovim putevima.

I obrnuto, poremećaji povezani uz smanjenje, kontrakciju ili zatvaranje krvnih žila, kao što je restenoza, također su uključeni i mogu se liječiti ili spriječiti postupcima ovog izuma.

Fibrotični poremećaji odnose se na abnormalno nastajanje izvanstaničnog matriksa. Primjeri fibrotičnih poremećaja uključuju cirozu jetre i poremećaje proliferacije mezangijskih stanica. Ciroza jetre karakterizirana je porastom sadržaja izvanstaničnog matriksa, što dovodi do nastajanja jetrenih ožiljaka. Povećani sadržaj izvanstaničnog matriksa koji rezultira pojavom jetrenih ožiljaka može također biti uzrokovan virusnom infekcijom, kao što je hepatitis. Čini se da glavnu ulogu u cirozi jetre imaju lipociti. Ostali fibrotični poremećaji uključuju aterosklerozu.

Poremećaji proliferacije mezangijskih stanica odnose se na poremećaje uzrokovane abnormalnom proliferacijom mezangijskih stanica. Oni uključuju razne bubrežne bolesti čovjeka, kao što su glomeluronefritis, dijabetička neuropatija i maligna nefroskleroza, kao i poremećaje kao što su sindrom trombocitne mikroangiopatije, odbacivanje transplantata i glomerulopatije. RTK PDGFR uključen je u održavanje proliferacije mezangijskih stanica. Floege i sur., 1993, Kidney International 43:47S-54S.

Mnogi oblici raka su poremećaji proliferacije stanica a, kako je ranije naznačeno, PK se povezuju s takvim poremećajima. Tako ne iznenađuje da su PK, kao na primjer, članovi obitelji RTK, povezani s razvojem raka. Neki od tih receptora, kao EGFR (Tuzi i sur., 1991, Br. J. Cancer 63:227-233, Torp i sur., 1992, APMIS 100:713-719), HER2/neu (Slamon i sur., 1989, Science 244:707-712)) i PDGF-R (Kumabe i sur., 1992, Oncogene, 7:627-633) prekomjerno su eksprimirani u mnogim tumorima i/ili se uporno aktiviraju putem autokrinih petlji. U stvari, u najčešćim i najtežim oblicima raka pokazana je prekomjerna ekspresija ovih receptora (Akbasak i Suner-Akbasak i sur., 1992, J. Neurol. Sci., 111:119-13, Dickson i sur., 1992, Cancer Treatment Res. 61:249-273, Korc i sur., 1992, J. Clin. Invest. 90:1352-1360) i autokrine petlje (Lee i Donoghue, 1992, J. Cell. Biol., 118:1057-1070, Korc i sur., ranije, Akbasak i Suner-Akbasak i sur., ranije). Na primjer, EGFR se povezuje s karcinomom pločastih stanica, astrocitomom, glioblastomom, rakom glave i vrata, rakom pluća i rakom mjehura. HER2 se povezuje s rakom dojke, jajnika, želuca, pluća, gušterače i mjehura. PDGFR se povezuje s glioblastomom i melanomom, kao i s rakom pluća, jajnika i prostate. RTK c-met je također povezan s nastajanjem malignih tumora. Na primjer, c-met se povezuje s, između ostalog, kolorektalnim, tiroidnim, pankreatičkim, želučanim i hepatocelularnim karcinomima i limfomima. Osim toga, c-met je povezan s leukemijom. Prekomjerna ekspresija gena c-met utvrđena je u pacijenata s Hodgkinovom i Burkittovom bolešću.

IGF-IR, osim što je uključen u staničnu prehranu i dijabetes tipa II, povezan je također i s nekoliko oblika raka. Na primjer, IGF-I se smatra autokrinim stimulatorom rasta za nekoliko oblika tumora, npr. stanice ljudskog karcinoma dojke (Arteaga i sur., 1989, J. Clin. Invest. 84:1418-1423) i tumora malih stanica pluća (Macauley i sur., 1990, Cancer Res., 50:2511-2517). Nadalje, čini se da IGF-1, osim što je integralno uključen u normalni rast i diferencijaciju živčanog sustava, djeluje i kao autokrini stimulator ljudskih glioma. Sandberg-Nordqvist i sur., 1993, Cancer Res. 53:2475-2478. Važnost IGF-IR i njegovih liganada u staničnoj proliferaciji dodatno je potkrijepljena činjenicom da IGF-I stimulira rast mnogih tipova stanica u kulturi (fibroblasta, epitelnih stanica, glatkih mišićnih stanica, T-limfocita, mijeloidnih stanica, hondrocita i osteoblasta (zametnih stanica koštane srži)). Goldring i Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Expression, 1:301-326. Baserga i Coppola sugeriraju da IGF-IR igra središnju ulogu u mehanizmu transformacije i, kao takav, mogao bi biti cilj izbora za terapijske intervencije širokog spektra ljudskih malignoma. Baserga, 1995, Cancer Res., 55:249-252, Baserga, 1994, Cell 79:927-930, Coppola i sur., 1994, Mol. Cell. Biol., 14:4588-4595.

STK su uključene u mnoge oblike raka uključujući, pogotovo, rak dojke (Cance i sur., Int. J. Cancer, 54:571-77 (1993)).

Veza između abnormalne aktivnosti PK i bolesti nije ograničena na rak. Na primjer, RTK se povezuju s bolestima kao što su psorijaza, šećerna bolest, endometrioza, angiogeneza, razvoj ateromatoznih plakova, Alzheimerovom bolesti, restenozom, von Hippel-Lindauovom bolesti, epidermalnom hiperproliferacijom, neurodegenerativnim bolestima, staračkom makularnom degeneracijom i hemangiomima. Na primjer, EGFR je uključen u zacjeljivanje kožnih rana i povreda rožnice. Poremećaji inzulin-R i IGF-1R povezuju se sa šećernom bolesti tipa II. Potpunija korelacija između specifičnih RTK i njihovih terapeutskih indikacija iznesena je u Plowman i sur., 1994, DN&P 7:334-339.

Kako je ranije spomenuto, ne samo RTK, već i CTK, uključujući, ali bez ograničenja, src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lck, blk, hck, fgr i yrk (pregledni rad Bolen i sur., 1992, FASEB J., 6:3403-3409) su uključene u proliferativne puteve i puteve prijenosa metaboličkih signala, čime se, kako je pokazano, može očekivati da su uključeneu mnoge poremećaje posredovane PTK, a prema kojima je ovaj izum usmjeren. Na primjer, mutirani src (v-src) se pokazao kao onkoprotein (pp60v-src) u pilića. Štoviše, njegov stanični homolog, protoonkogen pp60c-src prenosi onkogene signale mnogih receptora. Prekomjerna ekspresija EGFR ili HER2/neu u tumorima vodi konstitutivnoj aktivaciji pp60c-src, što je karakteristika malignih, ali ne i normalnih stanica. S druge strane, miševi koji ne eksprimiraju c-src pokazuju osteopetrozni fenotip, što upućuje na ključnu ulogu c-src u funkciji osteoklasta i moguću uključenost u srodne poremećaje.

Slično tome, Zap70 uključen je u signalizaciju T-stanica, što se može povezati s autoimunim poremećajima.

STK se povezuju s upalom, autoimunim bolestima, imunim odgovorom i hiperproliferativnim poremećajima, kao što su restenoza, fibroza, psorijaza, osteoartritis i reumatoidni artritis.

PK su također uključene u implantaciju embrija. Tako spojevi ovog izuma mogu dati učinkoviti postupak sprečavanja te implantacije i time bi mogli biti korisni kao sredstva kontrole rađanja. Dodatni poremećaji koje je moguće liječiti ili spriječiti spojevima ovog izuma su imunološki poremećaji, kao što su autoimune bolesti, AIDS i kardiovaskularne bolesti, kao što je ateroskleroza.

Napokon, i RTK i CTK mogle bi biti uključene u hiperimune poremećaje.

Primjeri učinka nekih primjera spojeva ovog izuma na različite PTK prikazani su u Tablici 2 u nastavku. Prikazani spojevi i podaci nisu konstruirani tako da na bilo koji način ograniče cilj ovog izuma.

Inhibitor ciklooksigenaze-2 ili inhibitor COX-2 uključuje sredstva koja specifično inhibiraju grupu enzima, ciklooksigenazu-2, uz manje značajnu inhibiciju ciklooksigenaze-1. Poželjno je da uključuje spojeve za koje je IC50 prema ciklooksigenazi-2 manji od oko 0,2 μM, te da imaju omjer selektivnosti inhibicije ciklooksigenaze-2 prema ciklooksigenazi-1 od barem 50, još bolje barem 100. Još je bolje da spojevi imaju IC50 prema ciklooksigenazi-1 veći od oko 1 μM, a još bolje veći od 10 μM.

Studije upućuju da prostaglandini, koje sintetiziraju ciklooksigenaze, igraju kritičnu ulogu u inicijaciji i promociji raka. Štoviše, COX-2 je eksprimirana u neoplastičnim lezijama debelog crijeva, dojke, pluća, prostate, jednjaka, gušterače, tankog crijeva, grlića maternice, jajnika, mokraćnog mjehura, te glave i vrata. U nekoliko životinjskih modela i modela in vitro, inhibitori COX-2 inhibirali su rast i metastaziranje tumora.

Osim u stanicama raka kao takvima, COX-2 je također eksprimirana u angiogenoj vaskulaturi unutar i oko hiperplastičnih i neoplastičnih lezija, što upućuje na to da COX-2 igra ulogu u angiogenezi. U miša i štakora, inhibitori COX-2 značajno inhibiraju neovaskularizaciju potaknutu bFGF. Korisnost inhibitora COX-2 kao kemopreventivnih, antiangiogenih i kemoterapeutskih sredstava opisana je u literaturi (Koki i sur., Potential utility of COX-2 inhibitors in chemoprevention and chemotherapy. Exp. Opin. Invest. Drugs (1999) 8(10), str. 1623-1638, ovdje uključeno citatom). Amplifikacija i/ili prekomjerna ekspresija HER-2/neu (ErbB2) događa se u 20-30% ljudskih karcinoma dojke i jajnika, kao i u 5-15% karcinoma želuca i jednjaka, i povezuje se s lošom prognozom. Osim toga, nedavno je otkriveno in vitro da je ekspresija COX-2 pojačana u stanicama koje prekomjerno eksprimiraju HER-2/neu onkogen (Subbaramaiah i sur., Increased expression of cyclooxygenase-2 in HER-2/neu-overexpressing breast cancer. Cancer Research (poslano 1999), ovdje uključeno citatom). U ovoj studiji, značajno povišene razine proizvodnje PGE2, proteina COX-2 i mRNA detektirane su u epitelnim stanicama sisavaca transformiranima HER-2/neu, u usporedbi s netransformiranom paralelnom staničnom linijom. Produkti aktivnosti COX-2, tj. prostaglandini, potiču proliferaciju, povećavaju invazivnost malignih stanica i povećavaju proizvodnju vaskularnog endotelnog faktora rasta, koji pospješuje angiogenezu. Osim toga, HER-2/neu potiče proizvodnju angiogenih faktora, kao što je vaskularni endotelni faktor rasta.

Dakle, primjena inhibitora COX-2 u kombinaciji s anti-HER-2/neu protutijelima, kao što je trastuzumab (Herceptin®) i drugim terapijama usmjerenim k inhibiciji HER-2/neu mogla bi biti korisna u liječenju onih oblika raka u kojima je HER-2/neu prekomjerno eksprimiran.

Također se smatra da su razine COX-2 povišene u tumorima s amplifikacijom i/ili prekomjernom ekspresijom drugih onkogena, uključujući, ali bez ograničenja, c-myc, N-myc, L-myc, K-ras, H-ras, N-ras. Produkti aktivnosti COX-2 aktivno stimuliraju staničnu proliferaciju, inhibiraju imuni nadzor, povećavaju invazivnost malignih stanica i pospješuju angiogenezu. Dakle, primjena inhibitora protein-kinaze u kombinaciji s inhibitorom COX-2 ovog izuma korisna je u sprečavanju ili liječenju onih oblika raka u kojima su onkogeni prekomjerno eksprimirani.

Specifični inhibitori COX-2 korisni su u liječenju raka (WO 98/16227) i u nekim animalnim modelima smanjuju angiogenezu potaknutu različitim faktorima rasta (WO 98/22101). Anti-angiogeneza je postignuta inhibitorom COX-2 u štakora kojima je ucijepljen bFGF, vaskulani endotelni faktor rasta (VEGF) ili smjesa galaktana, proteina s dobro poznatim angiogenim svojstvima (Masferrer i sur., 89th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, March 1998).

Farmaceutski pripravci i primjena

Spoj ovog izuma ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol može se primijeniti kao takva ljudskom pacijentu ili se može primijeniti u farmaceutskim pripravcima u kojima su prethodno spomenuti materijali pomiješani s odgovarajućim nosačima ili ekscipijentima. Tehnike za formulaciju i primjenu lijekova mogu se pronaći u "Remington's Pharmacological Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA., zadnje izdanje.

Kako je ovdje korišteno, "primijeniti" ili "primjena" odnosi se na davanje spoja formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili farmaceutskog pripravka koji sadrži spoj formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu sol ovog izuma organizmu s ciljem sprečavanja ili liječenja poremećaja povezanog s PK.

Prikladni putevi primjene uključuju, bez ograničenja, oralnu, rektalnu, topikalnu, transmukoznu ili crijevnu primjenu, ili intramuskularne, supkutane, intramedularne, intratekalne, izravne intraventrikularne, intravenske, intravitrealne, intraperitonealne, intranazalne ili intraokularne injekcije. Poželjni putevi primjene su oralni i parenteralni.

Alternativno, moguće je primijeniti spoj lokalno, a ne na sistemski način, na primjer, injekcijom spoja izravno u čvrsti tumor, često u formulacijama za pohranu ili neprekidno otpuštanje.

Nadalje, moguće je lijek primijeniti u sustavu ciljanog davanja lijeka, na primjer, u liposomu prekrivenim protutijelom specifičnim za tumor. Liposomi će se usmjeriti i selektivno unijeti u tumor.

Farmaceutski pripravci ovog izuma mogu se proizvesti postupcima koji su dobro poznati u struci, npr. putem uobičajenog miješanja, otapanja, granuliranja, izrade dražeja, mrvljenja, emulgiranja, kapsuliranja, hvatanja ili liofiliziranja.

Farmaceutski pripravci za upotrebu u skladu s ovim izumom mogu se formulirati na konvencionalan način upotrebom jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača koji sadrže ekscipijente i pomoćne tvari koje olakšavaju preradu aktivnih spojeva u pripravke koje je moguće koristiti u farmaciji. Točna formulacija ovisi o izabranom putu primjene.

Za injekcije, spojevi ovog izuma mogu se formulirati u vodenim otopinama, poželjno u fiziološki kompatibilnim puferima kao što su Hanksova otopina, Ringerova otopina ili fiziološki pufer. Za transmukoznu prijenu u formulaciji se koriste penetranti koji odgovaraju barijeri koju treba prijeći. Takvi penetranti općenito su poznati u struci.

Za oralnu primjenu, spojevi se mogu formulirati kombiniranjem aktivnih spojeva s farmaceutski prihvatljivim nosačima koji su dobro poznati u struci. Takvi nosači omogućuju spojevima ovog izuma formulaciju u obliku tableta, pilula, pastila, dražeja, kapsula, tekućina, gelova, sirupa, gustih otopina, suspenzija i sličnog, koje bi pacijent uzeo oralnim putem. Farmaceutski pripravci za oralnu primjenu mogu se pripremiti uz upotrebu čvrstog ekscipijenta, eventualno mrvljenjem nastale smjese, i preradom smjese granula, nakon dodatka ostalih pogodnih pomoćnih tvari po potrebi, da bi se dobila srž tablete ili dražeje. Korisni ekscipijenti su naročito punila, kao šećeri, uključujući laktozu, saharozu, manitol ili sorbitol, celulozni pripravci kao, na primjer, kukuruzni škrob, pšenični škrob, rižin škrob i krumpirov škrob, te drugi materijali, kao što su želatina, tragakant, metil-celuloza, hidroksipropilmetil-celuloza, natrij-karboksimetilceluloza i/ili polivinil-pirolidon (PVP). Po želji je moguće dodati sredstva za dezintegraciju, kao što su umreženi polivinil-pirolidon, agar ili alginska kiselina. Moguće je koristiti i sol kao što je natrijev alginat.

Na srž dražeja dodaju se prikladni omotači. U tu svrhu mogu se koristiti koncentrirane šećerne otopine, koje po želji mogu sadržati gumiarabiku, talk, polivinil-pirolidon, carbopol gel, polietilen-glikol i/ili titan-dioksid, otopine laka i prikladna organska otapala ili smjese otapala. Omotačima za tablete ili dražeje mogu se dodati sredstva za bojanje ili pigmenti koji omogućuju identifikaciju ili za karakterizaciju različitih kombinacija doza aktivnih spojeva.

Farmaceutski pripravci koji se koriste oralno uključuju push-fit kapsule, kao i meke, zatvorene kapsule izrađene od želatine i sredstva za plastifikaciju, kao što su glicerol ili sorbitol. Push-fit kapsule mogu sadržati aktivne sastojke u primjesi s punilom, kao što je laktoza, vezivom, kao što je škrob i/ili sredstvom za vlaženje, kao što su talk ili magnezijev stearat i, po želji, stabilizatorom. U mekim kapsulama, aktivni spojevi mogu biti otopljeni ili suspendirani u odgovarajuće tekućine, kao što su masna ulja, tekući parafin ili tekući polietilen-glikoli. U ove formulacije mogu se dodati i stabilizatori.

Kapsule se mogu pakirati i boce od smeđeg stakla ili plastike da bi se aktivni spoj zaštitio od svjetla. Spremnici koji sadrže formulacije za kapsule aktivnog spoja moraju se pohraniti pri kontroliranoj sobnoj temperaturi (15-30 °C).

Za primjenu inhalacijom, spojevi za upotrebu u skladu s ovim izumom uobičajeno se daju u obliku aerosolnog spreja, upotrebom pakiranja pod tlakom ili raspršivača i prikladnog propelenta, npr., bez ograničenja, diklorodifluorometana, triklorofluorometana, diklorotetra-fluoroetana ili ugljičnog dioksida. U slučaju da se koristi aerosol pod tlakom, jedinica doziranja može se kontrolirati zaliskom koji će dostavljati mjerljivu količinu. Kapsuel i spremnici od, na primjer, želatine, za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru mogu se formulirati tako da sadrže smjesu praha spoja i prikladne osnove za prah, kao što su laktoza ili škrob.

Spojevi se također mogu formulirati za parenteralnu primjenu, npr. za injekcije u bolusu ili kontinuirane infuzije. Formulacije za injekcije mogu se pripremati u obliku jedinica doziranja, npr. u ampulama ili spremnicima za više doza, s dodanim konzervansom. Pripravci mogu imati oblike suspenzija, otopina ili emulzija u uljnim ili vodenim nosačima, i mogu sadržati materijale za formulaciju, kao što su sredstva za suspendiranje, stabilizaciju i/ili disperziju.

Farmaceutski pripravci za parenteralnu primjenu uključuju vodene otopine oblika topljivog u vodi, kao što je, bez ograničenja, sol aktivnog spoja. Nadalje, suspenzije aktivnog spoja mogu se pripremiti u lipofilnom nosaču. Prikladni lipofilni nosači uključuju masna ulja, kao što su sezamovo ulje, sintetske estere masnih kiselina, kao što su etil-oleat i trigliceridi, ili materijale kao što su liposomi. Vodene suspenzije za injekcije mogu sadržati tvari koje povećavaju viskoznost suspenzije, kao što su natrij-karboksimetil-celuloza, sorbitol ili dekstran. Po želji, suspenzija može također sadržati prikladne stabilizatore i/ili sredstva koja povećavaju topljivost spojeva, da bi omogućili pripremu visoko koncentriranih otopina.

Alternativno, aktivni sastojak može biti u obliku praha za konstituciju s prikladnim nosačem prije upotrebe, npr., sterilnom vodom bez pirogena.

Spojevi također mogu biti formulirani u rektalne pripravke, kao što su čepići ili klistiri za zadržavanje, uz upotrebu, npr. prikladne osnove za čepiće, kao što su kakaov maslac ili drugi gliceridi.

Osim prethodno opisanih formulacija, spojevi se također mogu formulirati u pripravke za pohranu. Takve, dugo djelujuće formulacije, mogu se primijeniti implantacijom (na primjer, supkutano ili intramuskularno) ili intramuskularnom injekcijom. Spoj ovog izuma može se formulirati za ovaj način primjene s prikladnim polimernim ili hidrofobnim materijalima (na primjer, u emulziji s farmakološki prihvatljivim uljem), s ionsko-izmjenjivačkim smolama ili kao slabije topljiv derivat, kao što su, bez ograničenja, slabo topljive soli.

Neograničavajući primjer farmaceutskog nosača za hidrofobne spojeve ovog izuma je sustav više otapala koji sadrži benzilni alkohol, nepolarni surfaktant, organski polimer koji se miješa s vodom i vodenu fazu, kao što je sustav VPD više otapala. VPD je otopina 3% w/v benzilnog alkohola, 8% w/v nepolarnog surfaktanta Polysorbate 80 i 65% w/v polietilen-glikola 300, priređenih u volumenu apsolutnog etanola. VPD sustav više otapala (VPD:D5W) sastoji se od VPD razrijeđenog 1:1 5%-tnom dekstrozom u vodenoj otopini. Ovaj sustav više otapala dobro otapa hidrofobne spojeve, a sam stvara nisku toksičnost po sistemskoj primjeni. Naravno, omjeri takvih sustava više otapala mogu znatno varirati bez narušavanja karakteristika topljivosti i toksičnosti. Nadalje, vrsta komponenti više otapala može varirati: na primjer, umjesto Polysorbate 80 moguće je koristiti druge nepolarne surfaktante niske toksičnosti, udio polietilen-glikola može varirati, polietilen-glikol može biti nadomješten drugim biokompatibilnim polimerima, npr. polivinil-pirolidonom, a kao zamjena za dekstrozu mogu biti drugi šećeri ili polisaharidi.

Alternativno, mogu se upotrijebiti drugi sustavi za davanje hidrofobnih farmaceutskih pripravaka. Liposomi i emulzije dobro su poznati primjeri nosača za davanje hidrofobnih lijekova. Osim toga, mogu se upotrijebiti i neka organska otapala, kao što je dimetilsulfoksid, iako često uz rizik veće toksičnosti.

Nadalje, spojevi se mogu davati uz upotrebu sustava za kontinuirano otpuštanje, kao što su polupropusni kalupi čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže terapeutsko sredstvo. U struci su poznati razni materijali za kontinuirano otpuštanje. Kapsule za kontinuirano otpuštanje mogu, ovisno o kemijskoj prirodi, otpuštati spoj tijekom nekoliko tjedana do preko 100 dana. Ovisno o kemijskoj prirodi i biološkoj stabilnosti terapeutskog reagensa, mogu se upotrijebiti dodatni postupci za stabilizaciju proteina.

Ovdje prikazani farmaceutski pripravci također mogu sadržati prikladne nosače ili ekscipijente čvrste ili gel-faze. Primjeri takvih nosača ili ekscipijenata uključuju, ali bez ograničenja, kalcijev karbonat, kalcijev fosfat, razne šećere, škrob, derivate celuloze, želatinu i polimere, kao što su polietilen-glikoli.

Mnogi spojevi modulatori PK ovog izuma mogu se davati kao fiziološki prihvatljive soli, gdje zahtijevani spoj može tvoriti negativno ili pozitivno nabijenu vrstu. Primjeri soli u kojima spoj tvori pozitivno nabijenu jedinicu uključuju, bez ograničenja, kvaterne amonijeve (definiranu na drugom mjestu) soli, kao što su hidroklorid, sulfat, karbonat, laktat, tartrat, malat, maleat, sukcinat, pri čemu je dušikov atom kvaterne amonijeve grupe dušik izabranog spoja ovog izuma koji je reagirao s odgovarajućom kiselinom. Soli u kojima spoj ovog izuma tvori negativno nabijenu vrstu uključuju, bez ograničenja, natrijeve, kalijeve, kalcijeve i magnezijeve soli nastale reakcijom karboksilne grupe spoja s odgovarajućom bazom (npr. natrijevim hidroksidom (NaOH), kalijevim hidroksidom (KOH), kalcijevim hidroksidom (Ca(OH)2), itd.).

Farmaceutski pripravci prikladni za upotrebu u ovom izumu uključuju pripravke u kojima su aktivni sastojci sadržani u količini dovoljnoj da postignu namjeravani cilj, npr. modulaciju aktivnosti PK ili liječenje ili sprečavanje poremećaja povezanog s PK.

Specifičnije, terapeutski učinkovita količina znači količinu spoja učinkovitu u sprečavanju, ublažavanju ili poboljšanju simptoma bolesti ili produljenju preživljenja jedinke koju se liječi.

Određivanje terapeutski učinkovite količine poznato je stručnjacima područja, naročito u svjetlu detaljnog opisa koji je ovdje dan.

Za bilo koji spoj korišten u postupcima ovog izuma, terapeutski učinkovita količina ili doza može se najprije procijeniti iz testova staničnih kultura, Zatim se doziranje može formulirati za upotrebu u životinjskim modelima tako da se postigne raspon koncentracija u cirkulaciji, što uključuje IC50, određenu u staničnoj kulturi (tj. koncentraciju ispitivanog spoja koja postiže polovicu maksimalne inhibicije aktivnosti PK). Ta infromacija može se zatim koristiti za točnije određivanje korisnih doza u ljudi.

Toksičnost i terapeutska učinkovitost ovdje opisanih spojeva može se odrediti standardnim farmaceutskim postupcima u staničnim kulturama ili eksperimentalnim životinjama, npr. određivanjem IC50 i LD50 (oboje je diskutirano na drugim mjestima) za ispitivani spoj. Podaci dobiveni iz testova staničnih kultura i studija na životinjama mogu se koristiti za formuliranje raspona doza za upotrebu u ljudi. Doziranje može varirati, ovisno o upotrijebljenom obliku doziranja i načinu primjene. Točna formulacija, način primjene i doziranje odabrat će pojedini liječnik, ovisno o pacijentovu stanju. (V. npr. Fingl i sur., 1975, u "The Pharmacological Basis of Therapeutics", p. 1, str. 1.)

Količina i interval doziranja mogu se prilagoditi individualno, da bi se omogućile razine aktivnih vrsta u plazmi, dovoljne za održavanje učinaka modulacije kinaza. Te plazmatske razine nazivaju se minimalne efektivne koncentracije (MECs). MEC će varirati za svaki spoj, ali može se procijeniti iz podataka in vitro, npr. koncentracija potrebna da se postigne 50-90% inhibicije kinaze može se ustanoviti upotrebom ovdje opisanih testova. Doziranje potrebno za postizanje MEC ovisit će o individualnim osobinama i načinu primjene. Za određivanje koncentracija u plazmi mogu se koristiti testovi putem HPLC ili biotestovi.

Intervali doziranja također se mogu odrediti upotrebom MEC vrijednosti. Spojevi bi se trebali primjenjivati režimom koji cijelo vrijeme održava razine u plazmi 10-90% iznad MEC, poželjno između 30 i 90%, a najbolje između 50 i 90%.

Trenutno terapeutski učinkovite količine spojeva formule (I) mogu se kretati u rasponu od približno 0,25 mg/m2 do 1500 mg/m2 po danu, poželjno oko 3 mg/m2/dan. Još je bolje 50 mg/m2/d do 400 mg/d.

Terapeutski učinkovite količine inhibitora ciklooksigenaze su od oko 0,1 mg do oko 10 000 mg za liječenje gore navedenih stanja, s time da su poželjne razine od oko 1,0 mg do oko 1000 mg.

Količina aktivnog sastojka koja se može kombinirati s drugim sredstvima protiv raka da bi se dobio jedinstveni oblik doziranja varirat će ovisno o liječenoj jedinki i određenom načinu primjene.

Kod lokalne primjene ili selektivnog unosa, efektivna lokalna koncentracija lijeka ne mora biti povezana s koncentracijom u plazmi i moguće je primijeniti i druge postupke poznate u struci da bi se odredila točna količina doziranja i interval.

Količina primijenjenog spoja ovisit će, naravno, o pojedincu kojeg se liječi, težini bolesti, načinu primjene, procjeni liječnika, itd.

Pripravci se mogu, ukoliko je poželjno, dostaviti u sredstvu za pakiranje i dispenziranje, kao što je komplet odobren od strane FDA, koji može sadržati jedan ili više jediničnih oblika doziranja koji sadrže aktivni sastojak. Sredstvo za pakiranje ili dispenziranje može biti popraćeno uputama za primjenu, te bilješkom u obliku koji propisuje agencija za reguliranje proizvodnje, upotrebe ili prodaje farmaceutika, a koja odražava odobrenje agencije za upotrebu pripravaka za ljudsku ili veterinarsku primjenu. Takva bilješka, na primjer, može biti oznaka koju odobrava U.S. Food and Drug Administration za propisivanje lijekova. Također se mogu pripremiti pripravci koji sadrže spoj ovog izuma formuliran u odgovarajućem farmaceutskom nosaču, staviti u odgovarajući spremnik i označiti za liječenje naznačenog stanja. Odgovarajuća stanja naznačena na oznaci mogu uključivati liječenje tumora, inhibiciju angiogeneze, liječenje fibroze, dijabetesa i sličnog.

Još je jedan aspekt ovog izuma da se ovdje opisani spoj, ili njegova sol ili prolijek, mogu kombinirati s drugim kemoterapeutskim sredstvima za liječenje ranije opisanih bolesti i poremećaja. Na primjer, spoj, sol ili prolijek ovog izuma mogu se kombinirati sa alkilirajućim sredstvima, kao što je fluorouracil (5-FU), sam ili u dodatnoj kombinaciji s leukovorino, ili drugim alkilirajućim sredstvima, kao što su, bez ograničenja, drugi pirimidinski analozi, kao što su UFT, kapecitabin, gemcitabin i citarabin, alkil-sulfonati, npr. busulfan (koristi se u liječenju kronične granulocitne leukemije), improsulfan i piposulfan; aziridini, npr. benzodepa, karbokon, meturedepa i uredepa; etilenimini i metilmelamini, npr. altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilolmelamin; i dušikovi plinovi, npr. klorambucil (koristi se u liječenju kronične limfocitne leukemije, primarne makroglobulinemije i non-Hodgkin limfoma), ciklofosfamid (koristi se u liječenju Hodgkinove bolesti, multiplog mijeloma, neuroblastoma, raka dojke, jajnika, pluća, Wilmsovog tumora i rabdomiosarkom), estramustin, ifosfamid, novembricin, prednimustin i uracil (koriste se u liječenju primarne trombocitoze, non-Hodgkin limfoma, Hodgkinove bolesti i raka jajnika), i triazini, npr. dakarbazin (koristi se u liječenju sarkoma mekog tkiva).

Spoj, sol ili prolijek ovog izuma može se također koristiti u kombinaciji s drugim antimetabolitnim kemoterapeutskim sredstvima, kao što su, bez ograničenja, analozi folne kiseline, npr. metotreksat (koristi se u liječenju akutne limfocitne leukemije, koriokarcinoma, mikoznog raka dojke, raka glave i vrata, te osteogenog sarkoma) i pteropterin; te purinski analozi, kao što su merkaptopurin i tiogvanin, koji se koriste u liječenju akutne granulocitne, akutne limfocitne i kronične granulocitne leukemije.

Smatra se da se spoj, sol ili prolijek ovog izuma također može koristiti u kombinaciji s kemoterapeutskim sredstivma koja se baziraju na prirodnim proizvodima, kao što su, bez ograničenja, vinca-alkaloidi, npr. vinblastin (koristi se u liječenju raka dojke i testisa), vinkristin i vindezin; epipodofilotoksini, npr. etopozid i tenipozid, oboje su korisni u liječenju raka testisa i Kaposijevog sarkoma; antibiotska kemoterapeutska sredstva, npr. daunorubicin, doksorubicin, epirubicin, mitomicin (koriste se u liječenju raka želuca, cerviksa, debelog crijeva, dojke, mjehura i gušterače), daktinomicin, temozolomid, plikamicin, bleomicin (koriste se u liječenju raka kože, jednjaka i genitourinarnog trakta); te enzimatska kemoterapeutska sredstva, kao što je L-asparaginaza.

U nastavku, spoj, sol ili prolijek ovog izuma može se također koristiti u kombinaciji s koordinacijskim kompleksima platine (npr. cisplatinom), supstituiranim urejama, kao što su hidroksiurea; derivatima metilhidrazina, npr. prokarbazinom; adrenokortikalnim supresantima, npr. mitotanom, aminoglutetimidom; te hormonima i antagonistima hormona, kao što su adrenokortikosteroidi (npr. prednison), progestini (npr. hidroksiprogesteron-kaproat), estrogeni (npr. dietilstilbesterol), antiestrogeni kao što je tamoksifen, androgeni, npr. testosteron-propionat, i inhibitori aromataze, kao što je anastrozol.

U kombinacijskoj terapiji ovog izuma mogu se koristiti i druga antineoplastična sredstva poznata u struci. Primjeri tih antineoplastičnih sredstava navedeni su u U.S. patentnoj prijavi ser. br. 60/113 786, podnesenoj 23. prosinca 1998. i PCT publikaciji prijave br. WO 00/38716, čije je objavljivanje ovdje u potpunosti uključeno citatom.

Napokon, također se smatra da će kombinacija spoja ovog izuma biti učinkovita u kombinaciji s mitoksantronom ili paklitakselom, za liječenje čvrstih tumora ili leukemija, kao što je, bez ograničenja, akutna mijelogena (ne-limfocitna) leukemija.

PRIMJERI

Sintetski primjeri

Sljedeće pripreme i primjeri dani su s namjerom da omoguće stručnjacima područja jasnije razumijevanje i primjenu ovog izuma. Ne bi se smjeli shvatiti kao ograničenje opsega izuma, već samo kao ilustracija i njegovo predstavljanje.

SINTEZA INHIBITORA PROTEIN-KINAZE IZ OVOG IZUMA - SPOJEVI FORMULE (I)

Opći sintetski postupak:

Za pripremu spojeva ovog izuma može se koristiti sljedeća opća metodologija:

Odgovarajuće supstituirani 2-oksindol (1 ekv.), odgovarajuće supstituirani aldehid (1,2 ekv.) i baza (0,1 ekv.) miješaju se u otapalu (1-2 mL/mmol 2-oksindola), a smjesa se zatim zagrijava od oko 2 do oko 12 sati. Nakon hlađenja, nastali talog se filtrira, ispere hladnim etanolom ili eterom i osuši u vakuumu da bi dao čvrsti produkt. Ukoliko ne nastaje talog, reakcijska smjesa se koncentrira, a ostatak se smrvi u diklorometan/eteru, nastala krutina se skupi filtriranjem i zatim osuši. Produkt se eventualno može dodatno pročistiti kromatografijom.

Baza može biti organska ili anorganska baza. Ako se koristi organska baza, poželjno je da je dušikova. Primjeri organskih dušikovih baza uključuju, ali bez ograničenja, diizopropilamin, trimetilamin, trietilamin, anilin, piridin, 1,8-diazabiciklo[5.4.1]undec-7-en, pirolidin i piperidin.

Primjeri anorganskih baza su, bez ograničenja, amonijak, hidroksidi alkalijskih ili zemno-alkalijskih metala, fosfati, karbonati, bikarbonati, bisulfati i amidi. Alkalijski metali uključuju litij, natrij i kalij, dok zemno-alkalijski metali uključuju kalcij, magnezij i barij.

U ovdje poželjnom ostvarenju ovog izuma, kad je otapalo protonsko, kao što su voda ili alkohol, baza je anorganska baza alkalijskog ili zemno-alkalijskog metala, poželjno njihov hidroksid.

Stručnjacima područja bit će jasno, na osnovi poznatih općih principa organske sinteze i ovdje objavljenim opisima, koja je baza najprikladnija za razmatranu reakciju.

Otapalo u kojem se provodi reakcija može biti protonsko ili aprotonsko, poželjno je protonsko otapalo. "Protonsko otapalo" je ono koje ima atom(e) vodika kovalentno vezane na atome kisika ili dušika, što čini vodikove atome znatno kiselijima i tako im omogućuje "diobu" s otopljenom tvari kroz vodikove veze. Primjeri protonskih otapala uključuju, bez ograničenja, vodu i alkohole.

"Aprotonsko otapalo" može biti polarno ili nepolarno, ali u oba slučaja ne sadrži kisele vodike te, prema tome, nije sposobno stvarati vodikove veze s otopljenim tvarima. Primjeri nepolarnih aprotonskih otapala su, bez ograničenja, pentan, heksan, benzen, toluen, metilen-klorid i ugljik-tetraklorid. Primjeri polarnih aprotonskih otapala su kloroform, tetrahidrofuran, dimetilsulfoksid i dimetilformamid.

U ovdje poželjnom ostvarenju ovog izuma, otapalo je protonsko otapalo, poželjno voda ili alkohol, kao što je etanol.

Reakcija se provodi na temperaturi višoj od sobne. Temperatura je općenito od oko 30°C do oko 150°C, poželjno oko 80°C do oko 100°C, najbolje oko 75°C do oko 85°C, što je oko točke vrelišta etanola. Izraz "oko" znači da je poželjni temperaturni raspon unutar 10 Celzijevih stupnjeva od naznačene temperature, bolje unutar 5 Celzijevih stupnjeva od naznačene temperature, a najbolje unutar 2 Celzijeva stupnja od naznačene temperature. Tako, na primjer, pod "oko 75°C" se misli 75°C ± 10°C, poželjno 75°C ± 5°C, a najbolje 75°C ± 2°C.

2-oksindoli i aldehidi mogu se lako sintetizirati upotrebom tehnika dobro poznatih u kemijskoj struci. Stručnjaci područja primijetit će da se za dobivanje spojeva ovog izuma mogu koristiti i drugi sintetski putevi, te da sljedeći tekst služi kao primjer, a ne kao ograničenje.

Postupak A: formilacija pirola

POCl3 (1,1 ekv.) dodaje se kap po kap dimetilformamidu (3 ekv.) pri -10°C, nakon čega se dodaje odgovarajući pirol otopljen u dimetilformamidu. Nakon miješanja od dva sata, reakcijska smjesa razrijeđena je H2O i zalužena do pH 11 dodatkom 10 N KOH. Nastali talog skupljen je filtriranjem, ispran H2O i osušen u vakuumskoj peći da bi dao željeni aldehid.

Postupak B: saponifikacija estera pirolkarboksilne kiseline

Smjesa estera pirolkarboksilne kiseline i KOH (2-4 ekv.) u EtOH zagrijavana je pri refluksu dok tankoslojna kromatografija (TLC) ne ukaže na završetak reakcije. Ohlađena reakcijska smjesa zakiseljena je do pH 3 dodatkom 1 N HCl. Nastali talog skupljen je filtriranjem, ispran H2O i osušen u vakuumskoj peći da bi dao željenu pirolkarboksilnu kiselinu.

Postupak C: amidacija

Otopini pirolkarboksilne kiseline otopljene u dimetilformamidu (0,3 M) uz miješanje se dodaju 1-etil-3-(3-dimetilamino-propil)karbodiimid (1,2 ekv.), 1-hidroksibenzotriazol (1,2 ekv.) i trietilamin (2 ekv.). Doda se odgovarajući amin (1 ekv.) i reakcija se miješa dok TLC ne ukaže na završetak reakcije. Zatim se reakcijskoj smjesi doda etil-acetat i otopina se ispere zasićenom otopinom NaHCO3 i slanom vodom (s dodatnom soli), osuši se pomoću bezvodnog MgSO4 i koncentrira da bi dala željeni amid.

Postupak D: kondenzacija aldehida i oksindola koji sadrže karboksilne supstituente

Smjesa oksindola (1 ekv.), 1 ekvivalent aldehida i 1-3 ekvivalenta piperidina (ili pirolidina) u etanolu (0,4 M) miješa se pri 90-100 °C dok TLC ne ukaže na završetak reakcije. Smjesa se zatim koncentrira, a ostatak zakiseli dodatkom 2 N HCl. Nastali talog ispere se H2O i EtOH, te se zatim osuši u vakuumskoj peći da bi dao produkt.

Postupak E: kondenzacija aldehida i oksindola koji ne sadrže karboksilne supstituente

Smjesa oksindola (1 ekv.), 1 ekvivalent aldehida i 1-3 ekvivalenta piperidina (ili pirolidina) u etanolu (0,4 M) miješa se pri 90-100°C dok TLC ne ukaže na završetak reakcije. Smjesa se zatim ohladi na sobnu temperaturu, a nastala krutina prikupi se vakuum-filtracijom, ispere etanolom i osuši da bi dala produkt. Ako hlađenjem reakcijske smjese ne nastaje talog, smjesa se koncentrira i pročisti kromatografijom na koloni.

Primjeri sinteze oksindola

Sljedeći primjeri sinteze reprezentativnih oksindola nemaju namjeru da na bilo koji način ograniče opseg ovog izuma. Stručnjacima područja bit će jasno, na temelju sljedećih opisa, da postoje i alternativni putevi za prikazane oksindole, kao i za druge oksindole pomoću kojih je moguće dobiti spojeve ovog izuma. Takve sinteze i oksindoli su unutar opsega i smisla ovog izuma.

5-amino-2-oksindol

5-nitro-2-oksindol (6,3 g) hidrogeniran je u metanolu uz 10% paladij na ugljiku da bi dao 3,0 g (prinos 60%) spoja iz naslova kao bijelu krutinu.

5-bromo-2-oksindol

2-oksindol (1,3 g) u 20 mL acetonitrila ohlađen je na -10 °C i uz miješanje je polako dodano 2,0 g N-bromosukcinimida. Reakcijska smjesa miješana je 1 sat na -10 °C i još 2 sata na 0 °C. Talog je prikupljen, ispran vodom i osušen da bi dao 1,0 g (prinos 90%) spoja iz naslova.

4-metil-2-oksindol

Dietil-oksalat (30 mL) u 20 mL suhog etera dodan je uz miješanje na 19 g kalijevog etoksida suspendiranog u 50 mL suhog etera. Smjesa je ohlađena u ledenoj kupelji i polako je dodano 20 mL 3-nitro-o-ksilena u 20 mL suhog etera. Gusta, tamnocrvena smjesa zagrijavana je pri refluksu 0,5 h, koncentrirana u tamnocrvenu krutinu i tretirana 10%-tnim natrijevim hdiroksidom dok se gotovo sva krutina ne otopi. Tamnocrvena smjesa tretirana je 30%-tnim vodikovim peroksidom do promjene crvene boje u žutu. Smjesa je tretirana alternativno 10%-tnim natrijevim hidroksidom i 30%-tnim vodikovim peroksidom do gubitka tamnocrvene boje. Krutina je odfiltrirana, a filtrat je zakiseljen 6N klorovodičnom kiselinom. Nastali talog skupljen je vakuum-filtracijom, ispran vodom i osušen u vakuumu da bi dao 9,8 g (prinos 45%) 2-metil-6-nitrofeniloctene kiseline, kao prljavo bijelu krutinu. Krutina je hidrogenirana u metanolu uz 10%-tni paladij na ugljiku da bi dala 9,04 g spoja iz naslova kao bijelu krutinu.

7-bromo-5-kloro-2-oksindol

5-kloro-2-oksindol (16,8 g) i 19,6 g N-bromosukcinimida suspendirano je u 140 mL acetonitrila i zagrijavano pri refluksu 3 sata. Tankoslojna kromatografija (silikagel, etil-acetat) je nakon 2 sata refluksa pokazala 5-kloro-2-oksindol ili N-bromosukcinimid (Rf 0,8), produkt (Rf 0,85) i drugi produkt (Rf 0,9), čiji se omjeri nisu mijenjali nakon još jednog sata refluksa. Smjesa je ohlađena na 10°C, talog je skupljen vakuum-filtracijom, ispran s 25 mL etanola i suh usisan 20 min u lijevak da bi dao 14,1 g mokrog produkta. Krutina je suspendirana u 200 mL denaturiranog etanola i isprana miješanjem i refluksom 10 minuta. Smjesa je ohlađena u ledenoj kupelji na 10°C. Kruti produkt skupljen je vakuum-filtracijom, ispran s 25 mL etanola i osušan u vakuumu pri 40 °C da bi dao 12,7 g (prinos 51%) 7-bromo-5-kloro-2-oksindola.

5-fluoro-2-oksindol

5-fluoroizatin (8,2 g) otopljen je u 50 mL hidrazin-hidrata i zagrijavan pri refluksu 1 sat. Reakcijska smjesa zatim je izlivena u ledenu vodu. Nastali talog je zatim odfiltriran, ispran vodom i osušen u vakuumskoj peći da bi dao spoj iz naslova.

5-nitro-2-oksindol

2-oksindol (6,5 g) otopljen je u 25 mL koncentrirane sumporne kiseline i smjesa je održavana na -10 do -15°C dok je dodavano 2,1 mL dimne nitratne kiseline. Nakon dodatka nitratne kiseline, reakcijska smjesa miješana je pri 0°C 0,5 h i izlivena je u ledenu vodu. Talog je prikupljen filtriranjem, ispran vodom i kristaliziran iz 50%-tne octene kiseline. Kristalni produkt je zatim filtriran, ispran vodom i osušen u vakuumu da bi dao 6,3 g (70%) 5-nitro-2-oksindola.

5-aminosulfonil-2-oksindol

U 100 mL tikvicu napunjenu sa 27 mL klorosulfonske kiseline sporo je dodano 13,3 g 2-oksindola. Reakcijska temperatura tijekom dodavanja održavana je ispod 30°C. Nakon dodavanja, reakcijska smjesa miješana je pri sobnoj temperaturi 1,5 h, zagrijavana na 68°C 1 h, ohlađena i izlivena u vodu. Talog je ispran vodom i osušen u vakuumskoj peći da bi dao 11,0 g 5-klorosulfonil-2-oksindola (prinos 50%), koji je korišten bez dodatnog pročišćavanja.

5-klorosulfonil-2-oksindol (2,1 g) dodan je 10 mL amonijevog hidroksida u 10 mL etanola i miješano je preko noći na sobnoj temperaturi. Smjesa je koncentrirana i krutina je prikupljena vakuum-filtracijom da bi dala 0,4 g (prinos 20%) spoja iz naslova kao prljavo bijelu krutinu.

5-izopropilaminosulfonil-2-oksindol

Suspenzija 3 g 5-klorosulfonil-2-oksindola, 1,15 g izopropilamina i 1,2 mL piridina u 50 mL diklorometana miješana je pri sobnoj temperaturi 4 sata. Za to vrijeme nastajala je bijela krutina. Krutina je skupljena vakuum-filtracijom, isprana vrućim etanolom, ohlađena, skupljena vakuum-filtracijom i osušena u vakuumu pri 40°C preko noći da bi dala 1,5 g 45%) 5-izopropilaminosulfonil-2-oksindola.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,69 (s, br, 1H, NH), 7,63 (dd, J = 2 i 8 Hz, 1H), 7,59 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,32 (d, J = 7 Hz, 1H, NH-SO2-), 6,93 (d, J = 8 Hz, 1H), 3,57 (s, 2H), 3,14-3,23 (m, 1H, CH-(CH3)2), 0,94 (d, J = 7 Hz, 6H, 2×CH3).

5-fenilaminosulfonil-2-oksindol

Suspenzija 5-klorosulfonil-2-oksindola (1,62 g, 7 mmol), anilina (0,782 mL, 8,4 mmol) i piridina (1 mL) u diklorometanu (20 mL) miješana je pri sobnoj temperaturi 4 sata. Reakcijska smjesa razrijeđena je etil-acetatom (300 mL) i zakiseljena 1N klorovodičnom kiselinom (16 mL). Organski sloj ispran je natrijevim bikarbonatom i slanom vodom, osušen je i koncentriran. Ostatak je ispran etanolom (3 mL) i zatim propušten kroz kromatografiju na silikagelu, uz eluciju metanol/diklorometanom 1:9 da bi dao 5-fenilaminosulfonil-2-oksindol.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,71 (s, br, 1H, NH), 10,10 (s, br, 1H, NH), 7,57-7,61 (m, 2H), 7,17-7,22 (m, 2H), 7,06-7,09 (m, 2H), 6,97-7,0 (m, 1H), 6,88 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 3,52 (s, 2H).

2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonska kiselina piridin-3-il-amid

Otopina 5-klorosulfonil-2-oksindola (3 g) i 3-aminopiridina (1,46 g) u piridinu (15 mL) miješana je pri sobnoj temperaturi preko noći, pri čemu se formirala smeđa krutina. Krutina je filtrirana, isprana etanolom i osušena u vakuumu da bi dala 1,4 g (38%) 2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonska kiselina piridin-3-il-amida.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,74 (s, 1H, NH), 10,39 (s, 1H, SO2NH), 8,27-8,28 (d, 1H), 8,21-8,23 (m, 1H), 7,59-7,62 (m, 2H), 7,44-7,68 (m, 1H), 7,24-7,28 (m, 1H), 6,69-6,71 (d, 1H), 3,54 (s, 2H).

MS m/z (APCI+) 290,2.

5-feniloksindol

5-bromo-2-oksindol (5 g, 23,5 mmol) otopljen je u 110 L toluena i 110 mL etanola uz miješanje i lagano zagrijavanje. Dodan je tetrakis(trifenilfosfin)paladij (0) (1,9 g, 1,6 mmol), a nakon toga benzen-borna kiselina (3,7 g, 3,6 mmol) i smjesa je miješana u uljnoj kupelji pri 100°C 12 sati. Reakcijska smjesa je ohlađena, razrijeđena etil-acetatom (500 mL), isprana zasićenom otopinom natrij-bikarbonata (200 mL), vodom (200 mL), 1N HCl (200 mL) i slanom vodom (200 mL). Organski sloj osušen je na magnezijevom sulfatu i koncentriran da bi dao smeđu krutinu. Mrvljenje u diklorometanu dalo je 3,8 g (77%) 5-fenil-2-oksindola kao tamnu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,4 (br s, 1H, NH), 7,57 (dd, J = 1,8 i 7,2 Hz, 1H), 7,5 do 7,35 (m, 5H), 7,29 (m, 1H), 6,89 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 3,51 (s, 2H, CH2CO).

MS m/z 209 [M+].

Na sličan način mogu se pripremiti sljedeći oksindoli:

6-(3,5 diklorofenil)-1,3-dihidroindol-2-on

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,46 (br, 1H, NH), 7,64 (d, J = 1,8 Hz, 2H), 7,57 (m, 1H), 7,27 (m, 2H), 7,05 (d, J = 1,1 Hz, 1H), 3,5 (s, 2H).

MS-EI m/z 277/279 [M]+.

6-(4-butilfenil)-1,3-dihidroindol-2-on

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,39 (s, 1H, NH), 7,49 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,25 (d, J = 8 Hz, 3H), 7,17 (dd, J = 1,5 i 7,8 Hz, 1H), 6,99 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 3,48 (s, 2H, CH2CO), 2,60 (t, J = 7,5 Hz, 2 Hz, CH2CH3), 1,57 (m, 2H, CH2), 1,32 (m, 2H, CH2), 0,9 (t, J = 7,5 Hz, 3H, CH3).

6-(5-izopropil-2-metoksifenil)-1,3-dihidroindol-2-on

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,29 (br s, 1H, NH), 7,16-7,21 (m, 2H), 7,08 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,97-7,01 (m, 2H), 6,89 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 3,71 (s, 3H, OCH3), 3,47 (s, 2H, CH2CO), 2,86 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,19 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH(CH3)2).

MS-EI m/z 281 [M]+.

6-(4-etilfenil)-1,3-dihidroindol-2-on

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,39 (br s, 1H, NH), 7,50 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,28 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,25 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,17 (dd, J = 1,6 & 7,5 Hz, 1H), 6,99 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 3,48 (s, 2H, CH2CO), 2,63 (q, J = 7,6 Hz, 2H, CH2CH3), 1,20 (t, J = 7,6 Hz, 3H, CH2CH3).

MS-EI m/z 237 [M]+.

6-(3-izopropilfenil)-1,3-dihidroindol-2-on

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,37 (br s, 1H, NH), 7,43 (m, 1H), 7,35-7,39 (m, 1H), 7,17-7,27 (m, 3H), 7,01 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 3,49 (s, 2H, CH2CO), 2,95 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,24 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH(CH3)2).

MS-EI m/z 251 [M]+.

6-(2,4-dimetoksifenil)-1,3-dihidroindol-2-on

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,28 (br s, 1H, NH), 7,17 (m, 2H), 6,93 (dd, J = 1,6 & 7,6 Hz, 1H), 6,86 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,58 (dd, J = 2,4 & 8,5 Hz, 1H), 3,79 (s, 3H, OCH3), 3,74 (s, 3H, OCH3), 3,45 (s, 2H, CH2CO).

MS-EI m/z 269 [M]+.

6-piridin-3-il-1,3-dihidroindol-2-on

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,51 (s, 1H, NH); 8,81 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 8,55 (dd, J = 1,8 i 5,7 Hz, 1H), 8 (m, 1H), 7,45 (dd, J = 5,7 i 9,3 Hz, 1H), 7,3 (m, 2H), 7,05 (s, 1H), 3,51 (s, 2H, CH2CO).

MS m/z 210 [M]+.

2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-4-karboksilna kiselina (3-kloro-4-etoksifenil)-amid

Otopini 4-karboksi-2-oksindola (200 mg, 1,13 mmol) i 3-kloro-4-metoksifenilamina (178 mg, 1,13 mmol) u dimetilformamidu (15 mL) pri sobnoj temperaturi dodani su benzotriazol-1-il-oksitris(dimetilamino)fosfonij-heksafluorofosfat (BOP reagens, 997 mg, 2,26 mmol) i 4-dimetilaminopiridin (206 mg, 1,69 mmol). Smjesa je miješana pri sobnoj temperaturi 72 sata. Reakcijska smjesa zatim je razrijeđena etil-acetatom (300 mL), isprana zasićenom otopinom natrijevog bikarbonata (100 mL), vodom, 2N klorovodičnom kiselinom (100 mL); vodom (3 × 200 mL) i slanom vodom. Zatim je osušena pomoću magnezijevog sulfata i koncentrirana. Ostatak je smrvljen u etil-acetatu da bi dao 2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-4-karboksilna kiselina (3-kloro-4-metoksifenil)-amid kao ružičastu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,50 (s, br, 1H, NH), 10,12 (s, br, 1H, NH), 7,9 (s, J = 2,5 Hz, 1H), 7,62 (dd, J = 2,5 & 9 Hz, 1H), 7,38 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,32 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,13 (d J = 9 Hz, 1H), 6,98 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 3,83 (s, 3H, OCH3), 3,69 (s, 2H, CH2).

MS-EI m/z 316 [M]+.

4-karboksi-2-oksindol

Otopina trimetilsilildiazometana u heksanu (2 M) dodana je, kap po kap, otopini 2,01 g 2-kloro-3-karboksi-nitrobenzena u 20 mL metanola pri sobnoj temperaturi dok ne prestane razvijanje plina. Zatim je dodana octena kiselina da ugasi suvišak trimetilsilildiazometana. Reakcijska smjesa uparena je u vakuumu, a ostatak je osušen u peći preko noći. Dobiveni 2-kloro-3-metoksikarbonilnitrobenzen bio je dovoljno čist za sljedeću reakciju.

Dimetil-malonat (6,0 mL) dodan je u ledeno hladnu suspenziju 2,1 g natrijevog hidrida u 15 mL DMSO. Reakcijska smjesa miješana je pri 100°C 1 sat i zatim je ohlađena na sobnu temperaturu. U jednom dijelu dodan je 2-kloro-3-metoksikarbonilnitrobenzen (2,15 g) i smjesa je zagrijavana na 100°C 1,5 h. Reakcijska smjesa zatim je ohlađena na sobnu temperaturu, izlivena u ledenu vodu, zakiseljena do pH 5 i ekstahirana etil-acetatom. Organski sloj ispran je slanom vodom, osušen pomoću bezvodnog natrijevog sulfata i koncentriran da bi dao 3,0 g dimetil-2-metoksikarbonil-6-nitrofenil-malonata.

Dimetil-2-metoksikarbonil-6-nitrofenilmalonat (3,0 g) zagrijavan je pri refluksu u 50 mL 6N klorovodične kiseline preko noći. Smjesa je koncentrirana dosuha, dodano je 20 mL etanola i 1,1 g kositar(II)-klorida i smjesa je zagrijavana pri refluksu 2 sata. Smjesa je filtrirana kroz Celite, koncentrirana i propuštena kroz kromatografiju na silikagelu uz eluciju etil-acetat:heksan:octenom kiselinom da bi dala 0,65 g (37% 4-karboksi-2-oksindola kao bijelu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 12,96 (s, br, 1H, COOH), 10,74 (s, br, 1H, NH), 7,53 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,39 (t, J = 8 Hz, 1H), 7,12 (d, J = 8 Hz, 1H), 3,67 (s, 2H).

Sinteza pirol-supstituiranih 2-indolinona

Primjer 1

4-metil-5-(2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-2-karboksilna kiselina

4-metil-2-pirolkarboksilna kiselina etil-ester (komercijalno dostupan) formiliran je prema postupku A da bi dao (73%( 5-formil-4-metil-2-pirolkarboksilna kiselina etil-ester. On je zatim hidroliziran prema postupku B da bi dao 5-formil-4-metil-1H-pirol-2-karboksilnu kiselinu (58%).

Oksindol (133 mg, 1 mmol) kondenziran je s 5-formil-4-metil-1H-pirol-2-karboksilnom kiselinom (153 mg) prema postupku D da bi dao 268 mg (100%) spoja iz naslova kao narančasto-crvenu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,84 (s, br, 1H, NH), 12,84 (s, br, 1H, COOH), 10,98 (s, br, 1H, NH); 7,82 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,67 (s, 1H, H-vinil), 7,18 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,01 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 6,88 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 6,71 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 2,32 (s, 3H, CH3).

MS (negativni način) 266,8 [M-1]+.

Primjer 2

4-metil-5-(1-metil-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-2-karboksilna kiselina

1-metil-1,3-dihidroindol-2-on (147 mg, 1 mmol) kondenziran je s 5-formil-4-metil-1H-pirol-2-karboksilnom kiselinom (153 mg) prema postupku D, da bi nastalo 250 mg (86%) spoja iz naslova.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,82 (s, br, 1H, NH), 12,88 (s, br, 1H), 7,83 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,65 (s, 1H, H-vinil), 7,26 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,02-7,09 (m, 2H), 6,70 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 2,32 (s, 3H, CH3).

MS m/z 283,0 [M+1]+.

Primjer 3

4-metil-5-(2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-2-karboksilna kiselina metil-ester

Oksindol (105 mg, 0,79 mmol) kondenziran je s 5-formil-4-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina metil-esterom (110 mg, 0,67 mmol) prema postupku E da bi nastalo 153,2 mg (81%) spoja iz naslova.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,98 (s, br, 1H, NH), 10,97 (s, br, 1H, NH), 7,82 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,67 (s, 1H, H-vinil), 7,2 (dt, J = 1,2 & 7,7 Hz, 1H), 7,01 (dt, J = 1,2, 7,7 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 6,7 7 (d, J = 2 Hz, 1H).

MS (ES) m/z 283 [M++1].

Primjer 4

5-(5-kloro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-4-metil-1H-pirol-2-karboksilna ksielina etil-ester

5-kloro-1,3-dihidroindol-2-on (2,22 g, 13,2 mmol) kondenziran je s 5-formil-4-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina etil-esterom (2,43 g) prema postupku E ad bi nastalo 4,1 g (94%) spoja iz naslova kao narančasta krutina.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,95 (s, br, 1H, NH), 7,98 (d, J = 2,2 Hz, 1H, H-4), 7,78 (s, 1H, H-vinil), 7,18 (dd, J = 2,2 & 8,3 Hz, 1H, H-6), 6,87 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-7), 7,34 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H-3'), 4,27 (q, J = 7,2 Hz, 2H, OCH2CH3), 2,33 (s, 3H, CH3), 1,29 (t, J = 7,2 Hz, 3H, =CH2CH3).

MS-EI m/z 330 [M+].

Primjer 5

5-(5-kloro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-4-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina

Smjesa 5-(5-kloro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-4-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina etil-estera (1,3 g, 4 mmol), kalijevog hidroksida u metanolu (25 mL) i etanola (25 mL) zagrijavana je do refluksa preko noći. Netopljivi materijali uklonjeni su filtriranjem, a smjesa je neutralizirana 6N klorovodičnom kiselinom da bi dala 0,876 g (70%) spoja iz naslova.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,80 (s, br, 1H, NH), 12,90 (s, br, 1H, COOH), 11,06 (s, br, 1H, NH), 8,02 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H-4), 7,81 (s, 1H; H-vinil), 7,20 (dd, J = 1,8 & 8,3 Hz, 1H, H-6), 6,89 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-/), 6,72 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H-3'), 2,35 (s, 3H, CH3).

MS-EI m/z 302 [M+].

Primjer 6

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-4-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-pirolidin-1-il-propil)amid

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (0,16 g, 0,76 mmol) kondenziran je s 5-formil-4-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-pirolidin-1-il-propil)amidom (0,2 g, pripremljeno postupkom C) da bi nastalo 60 mg (17%) spoja iz naslova kao narančasta krutina.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 11,02 (s, br, 1H, NH), 8,42 (t, J = 5,8 z, 1H, CONHCH2), 8,12 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H-4), 7,78 (s, 1H, H-vinil), 7,30 (dd, J = 1,8 & 8,4 Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-7), 6,77 (d, J = 2,4 Hz, 1H, H-3'), 3,22-3,31 (m, 2H, CH2), 2,38-2,43 (m, 6H, 3×CH2), 2,35 (s, 3H, CH3), 1,62-1,71 (m, 6H, 3×CH2).

MS-EI m/z 456 i 458 [M+-1 i M++2].

Primjer 7

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-4-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-dietilamino-propil)amid

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (0,16 g, 0,75 mmol) je kondenziran s 5-formil-4-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom (0,2 g, pripremljeno postupkom C) da bi dao 30 mg (8%) spoja iz naslova kao narančastu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 11,02 (s, br, 1H, NH), 8,40 (m, 1H, CONHCH2), 8,12 (d, J = 1,5 Hz, 1H, H-4), 7,78 (s, 1H, H-vinil), 7,30 (dd, J = 1,5 & 8,2 Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, J = 8,2 Hz, 1H, H-7), 6,78 (d, J = 2,4 Hz, 1H, H-3'), 3,23 (m, 2H, CH2), 2,38-2,45 (m, 6H, CH2 & N(CH2CH3)2), 2,35 (s, 3H, CH3), 1,61 (m, 2H, CH2), 0,93 (t, J = 7,1 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EI m/z 458 i 460 [M+-1 i M++2].

Primjer 8

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amid

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (212 mg, 1 mmol) kondenziran je s 5-formil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (pripremljenim iz etil-pirol-2-karboksilata postupcima A, B i C) ad bi dao 162 mg (38%) spoja iz naslova.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,53 (s, br, 1H, NH), 11,06 (s, br, 1H, NH), 8,37 (t, 1H, CONHCH2), 7,89 (m, 2H), 7,32 (dd, J = 2,0 Hz, 1H), 6,96 (s, 1H), 6,80-6,84 (m, 2H), 3,3 (m, 2H, CH2), 2,45-2,55 (m, 6H, N(CH2CH3)2 & CH2), 0,95 (t, J = 7,2 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EI m/z 430 i 432 [M+-1 i M++1].

Primjer 9

5-(2-okso-6-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amid

6-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (209 mg, 1 mmol) kondenziran je s 5-formil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom da bi dao 182 mg (42%) spoja iz naslova.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,56 (s, br, 1H, NH), 11,06 (s, br, 1H, NH), 8,36 (t, 1H, CONHCH2), 7,77 (s, 1H, H-vinil), 7,73 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,64 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,46 (m, 2H), 7,32 (m, 2H), 7,11 (s, 1H), 6,96 (m, 1H), 6,80 (m, 1H), 3,31-3,32 (m, 2H, CH2), 2,46-2,53 (m, 6H, N(CH2CH3)2 & CH2), 0,96 (t, J = 6,9 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EI m/z 428 [M+].

Primjer 10

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)-metil-amid

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (212 mg, 1 mmol) kondenziran je s 5-formil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)metilamidom da bi dao 246 mg (55%) spoja iz naslova.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,54 (s, br, 1H, NH), 11,06 (s, br, 1H, NH), 7,90 (m, 2H), 7,33 (dd, J = 1,8 & 8,4 Hz, 1H), 6,82-6,85 (m, 3H), 3,55 (s, br, 2H, CH2), 3,25 (s, br, 3H, NCH3), 2,57 (t, J = 6,5 Hz, 2H, CH2), 2,45 (m, 4H, N(CH2CH3)2), 0,91 (m, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EI m/z 444 i 446 [M+-1 i M++1].

Primjer 11

5-(2-okso-6-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)metilamid

6-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (209 mg, 1 mmol) kondenziran je s 5-formil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)metilamidom da bi dao 277 mg (63%) spoja iz naslova.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,58 (s, br, 1H, NH), 11,04 (s, br, 1H, NH), 7,78 (s, 1H, H-vinil), 7,73 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,64 (d, j = 7,5 Hz, 2H), 7,46 (m, 2H), 7,33-7,36 (m, 2H), 7,11 (s, 1H), 6,84 (m, 1H), 6,78 (m, 1H), 3,55 (s, br, 2H, CH2), 3,25 (s, br, 3H, NCH3), 2,58 (t, 2H, CH2), 2,44 (m, 4H, N(CH2CH3)2), 0,92 (m, 6H, N(CH2CH3)2).

Primjer 12

3-metil-5-(2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amid

Oksindol (66,5 mg, 0,5 mmol) kondenziran je s 5-formil-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom (pripremljenim iz 3-formil-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina etil-estera postupcima B i C) da bi dao 39 mg (21%) spoja iz naslova.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,34 (s, br, 1H, NH), 10,88 (s, br, 1H, NH), 7,62-7,67 (m, 3H), 7,17 (m, 1H), 6,99 (m, 1H), 6,87 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 1 Hz, 1H), 3,26-3,32 (m, 2H, CH2), 2,41-2,48 (m, 6H, CH2 & N(CH2CH3)2), 2,29 (s, 3H, CH3), 1,63 (m, 2H, CH2), 0,93 (t, J = 7,2 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EI m/z 380 [M+].

Primjer 13

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-dietilamino-propil)amid

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (106 mg, 0,5 mmol) kondenziran je s 5-formil-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom da bi dao 35 mg (15%) spoja iz naslova.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,35 (s, br, 1H, NH), 11,00 (s, br, 1H, NH), 7,89 (d, j = 1,9 Hz, 1H, H-4), 7,80 (s, 1H, H-vinil), 7,74 (t, J = 5,3 Hz, 1H, CONHCH2), 7,31 (dd, J = 1,9 & 8,4 Hz, 1H, H-6), 6,83 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-7), 6,63 (s, 1H, H-3'), 3,26 (m, 2H, CH2), 2,41-2,48 (m, 6H, CH2 & N(CH2CH3)2), 2,29 (s, 3H, CH3), 1,63 (m, 2H, CH2), 0,93 (t, J = 7,1 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EI m/z 458 i 460 [M+-1 i M++1].

Primjer 14

3-metil-5-(2-okso-6-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amid

6-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (105 mg, 0,5 mmol) kondenziran je s 5-formil-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom da bi dao 67,8 mg (30%) spoja iz naslova.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,37 (s, br, 1H, NH), 11,02 (s, br, 1H, NH), 7,23-7,73 (m, 11H), 3,29 (m, 2H, CH2), 2,41-2,48 (m, 6H, CH2 & N(CH2CH3)2), 2,29 (s, 3H, CH3), 1,64 (m, 2H, CH2), 0,94 (t, J = 7,0 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EI m/z 456 [M+].

Primjer 15

5-(5-metoksi-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-dietilamino-propil)amid

5-metoksi-1,3-dihidroindol-2-on (82,5 mg, 0,5 mmol) kondenziran je s 5-formil-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom da bi dao 80 mg (39%) spoja iz naslova.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,45 (s, br, 1H, NH), 10,70 (s, br, 1H, NH), 7,68-7,70 (m, 2H), 7,32 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 6,72-6,79 (m, 2H), 6,60 (s, 1H), 3,73 (s, 3H, OCH3), 3,28 (m, 2H, CH2), 2,41-2,48 (m, 6H, CH2 & N(CH2CH3)2), 2,29 (s, 3H, CH3), 1,63 (m, 2H, CH2), 0,93 (t, J = 7,0 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS m/z 410 [M+].

Primjer 16

5-(6-metoksi-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-dietilamino-propil)amid

6-metoksi-1,3-dihidroindol-2-on (82,5 mg, 0,5 mmol) kondenziran je s 5-formil-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom da bi dao 63 mg (31%) spoja iz naslova.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,22 (s, br, 1H, NH), 10,86 (s, br, 1H, NH), 7,39-7,63 i 6,37-6,55 (m, 6H), 3,73 (s, 3H, OCH3), 3,3 (m, 2H, CH2), 2,45 (m, 6H, CH2 & N(CH2CH3)2), 2,28 (s, 3H, CH3), 1,63 (m, 2H, CH2), 0,93 (m, 6H, N(CH2CH3)2).

MS m/z 410 [M+].

Primjer 17

3-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-4,5,6,7-tetrahidro-2H-izoindol-1-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid

4,5,6,7-tetrahidro-2H-izoindol-1-karboksilna kiselina etil-ester (May, Donald A.; Lash, Timothy D.; J. Org. Chem., 1992, 57:18, 4820-4828) formiliran je postupcima A i B da bi dao 3-formil-4,5,6,7-tetrahidro-2H-izoindol-1-karboksilnu kiselinu.

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (1,43 g, 6,8 mmol) kondenziran je s 3-formil-4,5,6,7-tetrahidro-2H-izoindol-1-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (1,97 g) da bi dao 2,2 (67%) spoja iz naslova kao žuto-narančastu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,47 (s, 1H, NH), 11,0 (s, 1H, NH), 8,0 (d, 1H, NH), 7,70 (s, 1H, CH), 7,28 (dd, J = 2,1 i 28,2 Hz, 1H, ArH), 7,16 (m, 1H, ArH), 6,8 (d, J = 8,3 Hz, 1H, ArH), 3,3 (s, 2H, CONH), 2,5 (m, 6H, 3×NCH2), 2,78 (br, m, 2H, pirol CH2), 2,72 (br m, 2H, pirol CH2), 1,7 (br m, 4H, N(CH2CH3)2), 1,74 (br s, 4H, CH2CH2CH2CH2), 0,96 (t, J = 7,4 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EI m/z 484 i 486 [M+-1 i M++1].

Primjer 18

3-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-4,5,6,7-tetrahidro-2H-izoindol-1-karboksilna kiselina (3-dietilamino-propil)amid

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (20 mg, 0,1 mmol) kondenziran je s 3-formil-4,5,6,7-tetrahidro-2H-izoindol-1-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom (30 mg) da bi dao 33 mg (46%) spoja iz naslova kao narančastu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10,9 (s, 1H, NH), 8,0 (m, 1H, NH), 7,68 (m, 1H, ArH), 7,4 (m, 1H, ArH), 7,29 (d, J = 1,9 i 8,5 Hz, 1H, ArH), 6,8 (d, J = 8 Hz, 1H, ArH), 2,7 (br m, 4H, 2×NCH2), 2,4 (m, 8H, 4×NCH2), 1,7 (br m, 4H, N(CH2CH3)2), 1,6 (br m, 2H, CH2CH2CH2), 0,93 (t, J = 7,4 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EI m/z 499 i 501 [M+ i M++2].

Primjer 19

3-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-4,5,6,7-tetrahidro-2H-izoindol-1-karboksilna kiselina (3-pirolidin-1-il-propil)amid

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (80 mg, 0,4 mmol) kondenziran je s 3-formil-4,5,6,7-tetrahidro-2H-izoindol-1-karboksilna kiselina (3-pirolidin-1-il-propil)amidom (120 mg) da bi dao 43 mg (22%) spoja iz naslova kao tamno narančastu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,4 (s, 1H, NH), 10,9 (s, 1H, NH), 8,0 (m, 1H, NH), 7,69 (m, 1H, ArH), 7,49 (m, 1H, ArH), 7,28 (d, J = 1,7 i 7,8 Hz, 1H, ArH), 6,8 (d, J = 8 Hz, 1H, ArH), 3,3 (br m, 2H, 2×NCH2), 2,8 (m, 4H, 2×pirolCH2), 2,5 (br m, 4H, N(CH2CH3)2), 1,6 (br m, 8H, 2×pirolCH2CH2, CH2CH2CH2 i CONHCH2).

MS-EI m/z 497 i 499 [M+ i M++2].

Primjer 20

3-(2-okso-6-piridin-3-il-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-4,5,6,7-tetrahidro-2H-izoindol-1-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amid

6-piridin-3-il-1,3-dihidroindol-2-on (60 mg, 0,4 mmol) kondenziran je s 3-formil-4,5,6,7-tetrahidro-2H-izoindol-1-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (80 mg) da bi dao 50 mg (38%) spoja iz naslova kao crvenkastu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,4 (s, 1H, NH), 11 (s, 1H, NH), 8,9 (d, 1H, NH), 8,7 (dd, 1H, ArH), 8,1 (dd, 1H, ArH), 7,9 (d, 1H, ArH), 7,6 (s, 1H, CH), 7,5 (dd, 1H, ArH), 7,3 (dd, 1H, ArH), 7,1 (m, 2H, ArH), 3,35 (m, 2H, CONHCH2), 2,8 (m, 4H, 2×pirolCH2), 2,5 (br m, 6H, N(CH2CH3)2 i NCH2), 1,75 (br s, 4H, 2×pirolCH2CH2), 0,9 (t, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EI m/z 484 [M+].

Primjer 21

4-benzoil-5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amid

Smjesi benzoil-klorida (1 ekv.) i aluminij-klorida (1 ekv.) u dikloroetanu pri 0 °C dodan je etil-3,5-dimetil-2-pirolkarboksilat (1 ekv.). Smjesa je miješana pri 80 °C 4 sata. Smjesa je zatim ekstrahirana etil-acetatom (EtOAc) i H2O. Spojeni organski ekstrakti isprani su zasićenom otopinom natrijevog bikarbonata i slanom vodom, osušeni i koncentrirani da bi dali (51%) 4-benzoil-3,5-dimetil-1H-pirol-2-karboksilnu kiselinu.

Smjesa 4-benzoil-3,5-dimetil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina etil-estera (4,13 g, 15,2 mmol) i cerij-amonij-nitrata (33 g, 4 ekv.) u 50 mL tetrahidrofuran (THF): octena kiselina (HOAc): H2O 1:1:1 zagrijavana je pri refluksu preko noći. Reakcijska smjesa zatim je ohlađena, ekstrahirana EtOAc i zalužena do pH 9 natrijevim karbonatom. Organski sloj zatim je ispran slanom vodom, osušen (MgSO4) i koncentriran, te propušten kroz kromatografiju na koloni da bi dao 3,25 g (75%) 4-benzoil-5-formil-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina etil-estera kao žutu krutinu.

5-bromo-1,3-dihidro-indol-2-on je kondenziran s 4-benzoil-5-formil-3-metil-1H-pirol-2-karboksilnom kiselinom prema postupku D da bi dao 4-benzoil-5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-3-metil-1H-pirol-2-karboksilnu kiselinu.

Gornja karboksilna kiselina zatim je spojena s N,N-dietil-1,3-propandiaminom prema postupku C da bi dala spoj iz naslova.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 7,96 (m, 1H, CONHCH2), 7,76 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 7,68 (t, 1H), 7,56 (m, 2H), 7,40 (s, 2H), 7,33 (dd, J = 1,6 & 8,3 Hz, 1H, H-6), 6,84 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-7), 3,33 (m, 2H, CH2), 2,42-2,46 (m, 6H, 3×CH2), 2,10 (s, 3H, CH3), 1,65 (m, 2H, CH2), 0,94 (t, J = 7,0 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS utjecaj elektrona m/z 564 [M++1].

Primjer 22

4-benzoil-5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-morfolin-4-il-propil)amid

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 14,10 (s, 1H, NH), 11,14 (br s, 1H, NH), 7,92 (m, 1H, CONHCH2), 7,75 (m, 2H), 7,69 (t, 1H), 7,56 (m, 2H), 7,42 (m, 2H), 7,33 (dd, J = 1,9 & 8,3 Hz, 1H, H-6), 6,85 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-7), 3,56 (m, 4H, 2×CH2), 3,33 (m, 2H, CH2), 2,35 (m, 6H, 3×CH2), 2,10 (s, 3H, CH3), 1,70 (m, 2H, CH2).

Primjer 23

4-benzoil-3-metil-5-(2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-pirolidin-1-il-propil)amid

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,18 (s, 1H, NH), 11,14 (br s, 1H, NH), 8,01 (m, 1H, CONHCH2), 7,74 (m, 1H), 7,67 (m, 1H), 7,55 (m, 1H), 7,32 (s, 1H, H-vinil), 7,17 (m, 1H), 6,92 (m, 1H), 3,36 (m, 2H, CH2), 2,44 (m, 6H, 3×CH2), 2,11 (s, 3H, CH3), 1,65-1,75 (m, 6H, 3×CH2).

MS utjecaj elektrona m/z 482 [M+].

Primjer 24

4-benzoil-5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-pirolidin-1-il-propil)amid

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 14,01 (s, 1H, NH), 11,18 (br s, 1H, NH), 7,98 (m, 1H, CONHCH2), 7,75 (m, 2H), 7,68 (m, 1H), 7,55 (m, 2H), 7,40 (m, 2H), 7,33 (dd, J = 2,0 & 8,2 Hz, 1H, H-6), 6,84 (d, J = 8,2 Hz, 1H, H-7), 3,34 (m, 2H, CH2), 2,42-2,47 (m, 6H, 3×CH2), 2,09 (s, 3H, CH3), 1,70 (m, 2H, CH2), 1,64 (m, 4H, 2×CH2).

Primjer 25

4-benzoil-3-metil-5-(2-okso-6-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-pirolidin-1-il-propil)amid

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,15 (s, 1H, NH), 11,16 (br s, 1H, NH), 7,98 (m, 1H, CONHCH2), 7,77 (d, J = 7,7 Hz, 2H), 7,69 (m, 1H); 7,53-7,63 (m, 4H), 7,44 (m, 2H), 7,33-7,37 (m, 2H), 7,24 (s, 2H); 7,12 (s, 1H); 3,36 (m, 2H, CH2), 2,43-2,48 (m, 6H, 3×CH2), 2,12 (s, 3H, CH3), 1,74 (m, 2H, CH2), 1,69 (m, 4H, 2×CH2).

MS utjecaj elektrona m/z 558 [M+].

Primjer 26

4-benzoil-5-(6-metoksi-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-pirolidin-1-il-propil)amid

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,99 (s, 1H, NH), 11,05 (br s, 1H, NH), 7,93 (m, 1H, CONHCH2), 7,72 (m, 2H), 7,65 (m, 1H), 7,54 (m, 2H), 7,15 (s, 1H, H-vinil), 7,04 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-4), 6,51 (dd, J = 2,3 & 8,4 Hz, 1H, H-5), 6,44 (d, J = 2,3 Hz, 1H, H-7), 3,74 (s, 3H, OCH3), 3,35 (m, 2H, CH2), 2,42-2,46 (m, 6H, 3×CH2), 2,10 (s, 3H, CH3), 1,72 (m, 2H, CH2), 1,65 (m, 4H, 2×CH2).

MS utjecaj elektrona m/z 512 [M+].

Primjer 27

4-benzoil-5-(5-metoksi-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-pirolidin-1-il-propil)amid

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 14,24 (s, 1H, NH), 10,90 (br s, 1H, NH), 7,97 (m, 1H, CONHCH2), 7,75 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,69 (m, 1H), 7,56 (m, 2H), 7,24 (s, 1H, H-vinil), 6,79 (m, 2H), 6,66 (m, H), 3,67 (s, 3H, OCH3), 3,34 (m, 2H, CH2), 2,43-2,48 (m, 6H, 3×CH2), 2,14 (s, 3H, CH3), 1,71 (m, 2H, CH2), 1,66 (m, 4H, 2×CH2).

MS utjecaj elektrona m/z 512 [M+].

Primjer 28

4-benzoil-5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-pirolidin-1-il-propil)amid

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,20 (s, 1H, NH), 11,14 (br s, 1H, NH), 8,03 (m, 1H, CONHCH2), 7,75 (m, 2H), 7,68 (m, 1H), 7,55 (m, 2H), 7,38 (s, 1H, H-vinil), 7,08 (m, 1H), 7,01 (m, 1H), 6,87 (m, 1H), 3,34 (m, 2H, CH2), 2,42-2,48 (m, 6H, 3×CH2), 2,09 (s, 3H, CH3), 1,70 (m, 2H, CH2), 1,65 (m, 4H, 2×CH2).

MS utjecaj elektrona m/z 500 [M+].

Primjer 29

4-acetil-5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amid

5-bromo-1,3-dihidro-indol-2-on kondenziran je sa 4-acetil-5-formil-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom (pripremljenim iz 4-acetil-5-formil-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina etil-estera postupcima B i C) da bi nastao spoj iz naslova.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,19 (s, 1H, NH), 11,19 (br s, 1H, NH), 8,15 (m, 1H, CONHCH2), 8,11 (s, 1H, H-vinil), 7,72 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H-4), 7,38 (dd, J = 1,8 & 8,2 Hz, 1H, H-6), 6,87 (d, J = 8,2 Hz, 1H, H-7), 3,27 (m, 2H, CH2), 2,57 (s, 3H, CH3CO), 2,46 (m, 9H, CH3 & 3×CH2), 1,64 (m, 2H, CH2), 0,93 (t, J = 7,1 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

Primjer 30

4-acetil-5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-pirolidin-1-il-propil)amid

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8,14 (m, 1H, CONHCH2), 8,10 (s, 1H, H-vinil), 7,70 (d, 1H, H-4), 7,36 (dd, J = 1,6 & 8,1 Hz, 1H, H-6), 6,85 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H-7), 3,32 (m, 2H, CH2), 2,57 (s, 3H, CH3CO), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,35-2,48 (m, 6H, 3×CH3), 1,65-1,71 (m, 6H, 3×CH2).

MS m/z 499 & 501 [M+] & [M++2].

Primjer 31

4-acetil-5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-morfolin-4-il-propil)amid

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,20 (s, 1H, NH), 11,26 (br s, 1H, NH), 8,09 (m, 2H, H-vinil & CONHCH2), 7,73 (d, J = 1,5 Hz, 1H, H-4), 7,38 (dd, J = 1,5 & 8,3 Hz, 1H, H-6), 6,87 (d, J= 8,3 Hz, H, H-7), 3,55 (m, 4H, 2×CH2), 3,26 (m, 2H, CH2), 2,57 (s, 3H, CH3CO), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,35 (m, 6H, 3×CH3), 1,68 (m, 2H, CH2).

MS m/z 514 & 516 [M+-1] & [M++1].

Primjer 32

4-acetil-5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (3-hidroksipropil)amid

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 14,17 (s, 1H, NH), 11,25 (br s, 1H, NH), 8,10 (s, 1H, H-vinil), 8,03 (m, 1H, CONHCH2), 7,71 (br s, 1H, H-4), 7,37 (br d, J = 8,4 Hz, 1H, H-6), 6,87 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-7), 4,51 (br s, 1H, OH), 3,51 (br s, 2H, CH2), 3,36 (m, 2H, CH2), 2,57 (s, 3H, CH3CO), 2,43 (s, 3H, CH3), 1,70 (m, 2H, CH2).

MS-EI m/z 445 & 447 [M+-1] & [M++1].

Primjer 34

4-acetil-5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (2-morfolin-4-il-etil)amid

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 14,19 (s, 1H, NH), 11,14 (br s, 1H, NH), 8,10 (s, 1H, H-vinil), 7,84 (m, 1H, CONHCH2), 7,71 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H-4), 7,38 (dd, J = 1,8 & 8,2 Hz, 1H, H-6), 6,87 (d, J = 8,2 Hz, 1H, H-7), 3,58 (m, 4H, 2×CH2), 3,40 (m, 2H, CH2), 2,57 (s, 3H, CH3CO), 2,49 (m, 4H, 2×CH2), 2,45 (m, CH3 & CH2).

MS-EI m/z 500 & 502 [M+-1] & [M++1].

Primjer 35

4-acetil-5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amid

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 14,17 (s, 1H, NH), 11,23 (s, 1H, NH), 8,11 (s, 1H, H-vinil), 7,91 (m, 1H, CONHCH2), 7,73 (d, J = 1,9 Hz, 1H, H-4), 7,39 (dd, J = 1,9 & 8,3 Hz, 1H, H-6), 6,88 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-7), 3,40 (m, 2H, CH2), 2,62 (m, 2H, CH2), 2,57 (s, 3H, CH3CO), 2,49 (m, 4H, 2×CH2), 2,44 (s, 3H, CH3), 1,69 (m, 4H, 2×CH2).

Primjer 36

4-acetil-5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-3-metil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina [2-(4-hidroksifenil)etil]amid

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,221 (s, 1H, NH), 11,18 (s, 1H, OH), 9,09 (s, 1H, NH), 8,06-8,10 (m 2H), 7,73 (s, 1H), 7,38 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,04 (d, J = 7,1 Hz, 2H), 6,88 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 6,67 (d, J = 7,1 Hz, 2H), 3,42 (m, 2H, CH2), 2,72 (m, 2H, CH2), 2,56 (s, 3H, CH3CO), 2,37 (s, 3H, CH3).

MS-EI m/z 507 & 509 [M+-1] & [M++1].

Primjer 37

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2-izopropil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amid

Smjesa 2-aminoacetofenon-hidroklorida (1 ekv.), etil-izobutirilacetata (1,2 ekv.) i natrijevog acetata (2,4 ekv.) u H2O miješana je pri 100 °C 18 sati i zatim je ohlađena na sobnu temperaturu. Vodeni sloj je odliven, a ulje je otopljeno u etil-acetatu. Zatim je isprano vodom i slanom vodom, te osušeno da bi dalo (93%) 2-izopropil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina etil-ester kao crveno-smeđe ulje.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11,21 (s, br, 1H, NH), 7,14-7,27 (m, 5H), 6,70 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 4,02 (q, J = 7,1 Hz, 2H, OCH2CH3), 3,65 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,22 (d, J = 7,5 Hz, 6H, CH(CH3)2), 1,04 (t, J = 7,1 Hz, 3H, OCH2CH3).

MS-EI m/z 257 [M+].

Gornji pirol formiliran je postupkom A da bi dao (41%) 5-formil-2-izopropil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina etil-estera kao crvenkastu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12,35 (s, br, 1H, NH), 9,14 (s, 1H, CHO), 7,6 (s, 5H), 3,96 (q, J = 7,1 Hz, 2H, OCH2CH3), 3,74 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,29 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH3)2), 0,90 (t, J = 7,1 Hz, 3H, OCH2CH3).

MS-EI m/z 285 [M+].

Ester pirolkarboksilne kiseline hidroliziran je postupkom B da bi dao (57%) 5-formil-2-izopropil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilnu kiselinu kao žućkastu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12,28 (s, br, 1H, COOH), 12,02 (s, br, 1H, NH), 9,10 (s, 1H, CHO), 7,35 (s, 5H), 3,81 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,28 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH3)2).

MS-EI m/z 257 [M+].

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (120 mg, 0,31 mmol) je kondenziran s 5-formil-2-izopropil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom (pripremljenim postupkom C) da bi dao 120 mg (71%) spoja iz naslova.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,23 (s, br, 1H, NH), 11,08 (s, br, 1H, NH), 7,38-7,55 (m, 7H, Ar-H & CONHCH2), 7,30 (s, 1H, H-vinil), 7,26 (dd, J = 1,8 & 7,8 Hz, 1H), 6,85 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 3,36 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,07 (m, 2H, CH2), 2,34 (q, J = 7,1 Hz, 4H, N(CH2CH3)2), 2,22 (t, J = 6,9 Hz, 2H, CH2), 1,40 (m, 2H, CH2), 1,31 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH3)2), 0,86 (t, J = 7,1 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS m/z 565,1 [M++1].

Primjer 38

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2-izopropil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-pirolidin-1-il-propil)amid

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2-izopropil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (127 mg, 0,28 mmol) kondenzirana je s 3-pirolidin-1-il-propilaminom (43 mg, 0,336 mmol) da bi dala 140 mg (66%) spoja iz naslova.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,40 (s, br, 1H, NH), 7,38-7,47 (m, 7H), 7,23-7,27 (m, 2H), 6,84 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,36 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,08 (m, 2H, CH2), 2,30 (m, 4H, 2×CH2), 2,20 (t, J = 7,0 Hz, 2H, CH2), 1,62 (m, 4H, 2×CH2), 1,42 (t, J = 7,0 Hz, 2H, CH2), 1,31 (d, J = 7,2 Hz, 6H, CH(CH3)2).

MS-EI m/z 560 i 562 [M+-1 i M++1].

Primjer 39

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2-izopropil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amid

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (57 mg, 0,27 mmol) kondenziran je s 5-formil-2-izopropil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (120 mg) da bi dao 78 mg (53%) spoja iz naslova kao žutu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,23 (s, br, 1H, NH), 11,09 (s, br, 1H, NH), 7,38-7,51 (m, 6H), 7,25-7,28 (m, 2H), 7,19 (t, 1H, CONHCH2), 6,85 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 3,43 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,11 (m, 2H, CH2), 2,28-2,39 (m, 6H, N(CH2CH3)2 & CH2), 1,31 (d, J = 6,9 Hz, CH(CH3)2), 0,85 (t, J = 7,0 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EI m/z 548 i 550 [M+-1 i M++1].

Primjer 40

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2-izopropil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina [3-(4-metilpiperazin-1-il)propil]amid

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (53 mg, 0,25 mmol) kondenziran je s 5-formil-2-izopropil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina [3-(4-metilpiperazin-1-il)propil]amidom (300 mg) da bi dao 65 mg spoja iz naslova.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,22 (s, br, 1H, NH), 11,08 (s, br, 1H, NH), 7,23-7,50 (m, 9H), 6,85 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 3,37 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,05 (m, 2H, CH2), 2,24 (m, 8H, 4×CH2), 2,11 (m, 5H, CH2 & CH3), 1,42 (m, 2H, CH2), 1,31 (d, J = 7,2 Hz, 6H, CH(CH3)2).

MS-EI m/z 589 i 591 [M+-1 i M++1].

Primjer 41

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2-izopropil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina

5-bromo-1,3-dihidroinodl-2-on (170 mg, 0,8 mmol) kondeziran je s 5-formil-2-izopropil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilnom kiselinom (205 mg) prema postupku D da bi dao 210 mg (58%) spoja iz naslova kao žutu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,31 (s, br, 1H, NH), 11,61 (s, br, 1H, NH), 7,26-7,44 (m, 7H), 7,11 (s, 1H, H-vinil), 6,85 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 3,78 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,34 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH3)2).

MS-EI m/z 452 [M++1].

Primjer 42

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2-metil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amid

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (44 mg, 0,21 mmol) kondenziran je s 5-formil-2-metil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amidom (70 mg, pripremljeno na isti način kao izopropilni analog, ranije) da bi dao 0,03 g (27%) spoja iz naslova kao žutu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,87 (s, br, 1H, NH), 11,11 (s, br, 1H, NH), 7,36-7,51 (m, 6H), 7,26 (dd, J = 1,8 & 8,1 Hz, 1H), 7,2 (s, 1H, H-vinil), 7,09 (m, 1H, CONHCH2), 6,83 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,17 (m, 2H, NCH2), 2,48 (m, CH3), 2,29-2,35 (m, 6H, 3×NCH2), 1,59 (m, 4H, 2×CH2).

MS-EI m/z 518 i 520 [M+-1 i M++1].

Primjer 43

5-[6-(2-metoksifenil)-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-2-metil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amid

6-(2-metoksifenil)-1,3-dihidroindol-2-on (50 mg, 0,21 mmol) kondenziran je s 5-formil-2-metil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amidom (70 mg) da bi dao 0,04 g (35%) spoja iz naslova kao žuto-narančastu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,82 (s, br, 1H, NH), 11,02 (s, br, 1H, NH), 7,48 (m, 2H), 7,43 (m, 1H), 7,38 (m, 2H), 7,32 (m, 1H), 7,24 (m, 2H), 7,16 (s, 1H, H-vinil), 7,08 (m, 2H), 7,03 (m, 1H), 7,0 (m, 2H), 3,74 (s, 3H, OCH3), 3,19 (m, 2H, NCH2), 2,49 (m, CH3), 2,32-2,38 (m, 6H, 3×NCH2), 1,59 (m, 4H, 2×CH2).

MS-EI m/z 546 [M+].

Primjer 44

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2-metil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amid

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (46 mg, 0,22 mmol) kondenziran je s 5-formil-2-metil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amidom (65 mg) da bi dao 60 mg (55%) spoja iz naslova kao žutu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,86 (s, br, 1H, NH), 11,09 (s, br, 1H, NH), 7,47-7,49 (m, 2H), 7,38-7,41 (m, 4H), 7,26 (dd, J = 2,2 & 8,3 Hz, 1H), 7,21 (s, 1H, H-vinil), 7,04 (m, 1H, CONHCH2), 6,77 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 3,15 (m, 2H, NCH2), 2,48 (m, CH3), 2,16 (t, J = 6,8 Hz, 2H, 3×NCH2), 2,02 (s, 6H, 2×NCH3).

MS m/z 493 i 494,8 [M+ i M++2].

Primjer 45

5-[6-(2-metoksifenil)-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-2-metil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amid

6-(2-metoksifenil)-1,3-dihidroindol-2-on (53 mg, 0,22 mmol) kondenziran je s 5-formil-2-metil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amidom (65 mg) da bi dao 0,05 g (44%) spoja iz naslova kao narančastu gumastu masu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,82 (s, br, 1H, NH), 11,02 (s, br, 1H, NH), 7,37-7,52 (m, 5H), 7,32 (m, 1H), 7,22-7,27 (m, 2H), 7,16 (s, 1H), 7,08 (m, 2H), 7,03 (m, 1H), 7,0 (m, 2H), 3,74 (s, 3H, OCH3), 3,15 (m, 2H, NCH2), 2,49 (m, CH3), 2,16 (t, J = 6,5 Hz, 2H, NCH2), 2,02 (s, 6H, 2×NCH3).

MS m/z 521 [M++1].

Primjer 46

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2-metil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina etil-ester

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (60 mg, 0,29 mmol) kondenziran je s 5-formil-2-metil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina etil-esterom (75 mg) da bi dao 78 mg (60%) spoja iz naslova kao narančastu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 14,01 (s, br, 1H, NH), 11,13 (s, br, 1H, NH), 7,42-7,46 (m, 3H), 7,27-7,34 (m, 4H), 7,12 (s, 1H), 6,84 (dd, J = 2,2 & 8,3 Hz, 1H), 3,99-4,03 (m, 2H, OCH2CH3), 2,61 (s, 3H, CH3), 0,98-1,03 (m, 3H, OCH2CH3).

MS-EI m/z 450 i 452 [M+-1 i M++1].

Primjer 47

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2-metil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amid

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (0,47 g, 2,2 mmol) kondenziran je s 5-formil-2-metil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom (0,75 g) da bi dao 0,11 g (42%) spoja iz naslova kao narančastu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,86 (s, br, 1H, NH), 7,42-7,46 (m, 3H), 7,37-7,50 (m, 7H), 7,24-7,28 (m, 2H), 6,83 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,09 (m, 2H, NCH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,38 (q, J = 7,1 Hz, 4H, 2×NCH2CH3), 2,26 (t, J = 6,9 Hz, 2H, NCH2), 1,42 (m, 2H, NCH2), 0,87 (t, J = 7,1 Hz, 6H, 2×NCH2CH3).

MS-EI m/z 535,0 i 537 [M+ i M++2].

Primjer 48

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilamino-etil)amid

Smjesa terc-butil-3-oksobutirata i natrijevog nitrita (1 ekv.) u octenoj kiselini miješana je pri sobnoj temperaturi da bi dala terc-butil-2-hidroksiimino-3-oksobutirat.

Etil-3-oksobutirat (1 ekv.), cinkov prah (3,8 ekv.) i grubi terc-butil-2-hidroksiimino-3-oksobutirat u octenoj kiselini miješan je pri 60 °C 1 sat. Reakcijska smjesa izlivena je u H2O, a filtrat je skupljen da bi dao (65%) 2-terc-butiloksikarbonil-3,5-dimetil-4-etoksikarbonilpirol.

Smjesa 2-terc-butiloksikarbonil-3,5-dimetil-4-etoksikarbonilpirola i trietil-ortoformijata (1,5 ekv.) u trifluorooctenoj kiselini miješana je pri 15 °C 1 sat. Reakcijska smjesa je koncentrirana, a ostatak je pročišćen da bi dao (64%) 2,4-dimetil-3-etoksikarbonil-5-formilpirola kao žute iglice.

2,4-dimetil-3-etoksikarbonil-5-formilpirol hidroliziran je postupkom B da bi dao (90%) 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilnu kiselinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 12 (br, s, 2H, NH i CO2H), 9,58 (s, 1H, CHO), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3).

MS m/z 267 [M+].

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (0,17 g, 0,8 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amidom (0,2 g, pripremljeno postupkom C) prema postupku B da bi dao 0,3 g (83%) spoja iz naslova kao žutu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,60 (s, br, 1H, NH), 10,94 (s, br, 1H, NH), 8,07 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H-4), 7,75 (s, 1H, H-vinil), 7,44 (t, J = 5,2 Hz, 1H, CONHCH2), 7,24 (dd, J = 1,8 & 8,4 Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-7), 3,26-3,33 (m, 2H, NCH2), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J = 6,7 Hz, 2H, NCH2), 2,18 (s, 6H, N(CH3)2).

MS-EI m/z 430 i 432 [M+-1 i M++1].

Primjer 49

2,4-dimetil-5-(2-okso-6-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amid

6-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (0,17 g, 0,8 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amidom (0,2 g) da bi dao 0,13 g (36%) spoja iz naslova kao žuto-narančastu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,59 (s, br, 1H, NH), 10,93 (s, br, 1H, NH), 7,85 (d, J = 7,92 Hz, 1H, H-4), 7,63-7,65 (m, 3H), 7,40-7,47 (m, 3H), 7,32-7,36 (m, 1H, Ar-H), 7,30 (dd, J = 1,6 & 7,9 Hz, 1H, H-5), 7,11 (d, J = 1,6 Hz, 1H, H-7), 3,28-3,34 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J = 6,8 Hz, 2H, NCH2), 2,18 (s, 6H, N(CH3)2).

MS-EI m/z 428 [M+].

Primjer 50

5-(5-kloro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilamino-etil)amid

5-kloro-1,3-dihidroindol-2-on (0,1 g, 0,6 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amidom (0,15 g) da bi dao 0,22 g (90%) spoja iz naslova kao žuta krutina.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,98 (s, br, 1H, NH), 7,96 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-4), 7,75 (s, 1H, H-vinil), 7,50 (t, J = 5,5 Hz, 1H, CONHCH2), 7,12 (dd, J = 2,0 & 8,3 Hz, 1H, H-6), 6,86 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-7), 3,26-3,31 (m, 2H, NCH2), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 2,36 (t, J = 6,6 Hz, 2H, NCH2), 2,17 (s, 6H, N(CH3)2).

MS-EI m/z 386 [M+].

Primjer 51

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (0,17 g, 0,8 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (0,2 g) da bi dao 0,09 g (26%) spoja iz naslova kao žutu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,98 (s, br, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,7 Hz, 1H, H-4), 7,76 (s, 1H, H-vinil), 7,42 (t, J = 5,5 Hz, 1H, CONHCH2), 7,24 (dd, J = 1,7 & 8,0 Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H-7), 3,23-3,32 (m, 2H, NCH2), 2,46-2,55 (m, 6H, 3×NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,42 (s, 3H, CH3), 0,96 (t, J = 7,2 Hz, 6H, 2×NCH2CH3).

MS-EI m/z 458 i 460 [M+-1 i M++1].

Primjer 52

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amid

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (0,09 g, 0,4 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amidom (0,1 g) da bi dao 0,14 g (81%) spoja iz naslova kao žuto-narančastu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,98 (s, br, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,9 Hz, 1H, H-4), 7,76 (s, 1H, H-vinil), 7,53 (t, J = 5,5 Hz, 1H, CONHCH2), 7,24 (dd, J = 1,9 & 8,5 Hz, 1H, H-6), 6,81 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-7), 3,29-3,35 (m, 2H, NCH2), 2,54 (t, J = 6,9 Hz, 2H, NCH2), 2,47 (m, ispod DMSO), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,66-1,69 (m, 4H, 2×CH2).

MS-EI m/z 456 i 458 [M+-1 i M++1].

Primjer 53

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-imidazol-1-il-propil)amid

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (0,09 g, 0,4 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-imidazol-1-il-propil)amidom (0,1 g) da bi dao 0,1 g (59%) spoja iz naslova kao narančastu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,63 (s, br, 1H, NH), 10,99 (s, br, 1H, NH), 8,09 (d, J = 2,2 Hz, 1H, H-4), 7,77 (s, 1H, H-vinil), 7,71 (t, J = 5,7 Hz, 1H, CONHCH2), 7,65 (s, 1H, Ar-H), 7,25 (dd, J = 2,2 & 8,4 Hz, 1H, H-6), 7,20 (s, 1H, Ar-H), 6,89 (s, 1H, Ar-H), 6,81 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-7), 4,02 (t, J = 6,7 Hz, 2H, NCH2), 3,18 (q, J = 6,7 Hz, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 1,93 (m, 2H, CH2).

MS-EI m/z 467 i 469 [M+-1 i M++1].

Primjer 54

5-[6-(2-metoksifenil)-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amid

6-(2-metoksifenil)-1,3-dihidroindol-2-on (30 mg, 0,13 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amidom (30 mg) da bi dao 0,66 g (100%) spoja iz naslova kao žuto-narančastu gumastu masu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,60 (s, br, 1H, NH), 10,89 (s, br, 1H, NH), 7,79 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,63 (s, 1H, H-vinil), 7,46 (t, J = 5,5 Hz, 1H, CONHCH2), 7,28-7,35 (m, 2H), 6,99-7,11 (m, 4H), 3,76 (s, 3H, OCH3), 3,27-3,31 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,39 (s, 3H, CH3), 2,37 (m, 2H, NCH2), 2,18 (s, 6H, N(CH3)2).

MS-EI m/z 458 [M+].

Primjer 55

5-[6-(3-metoksifenil)-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amid

6-(3-metoksifenil)-1,3-dihidroindol-2-on (30 mg, 0,13 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amidom (30 mg) da bi dao 8 mg (14%) spoja iz naslova kao žuto-narančastu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,59 (s, br, 1H, NH), 10,92 (s, br, 1H, NH), 7,84 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,65 (s, 1H, H-vinil), 7,42 (m, 1H, CONHCH2), 7,36 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,29 (dd, J = 1,6 & 7,6 Hz, 1H), 7,20 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,14 (d, J = 2,8 HZ, 1H), 7,11 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 6,91 (dd, J = 2,8 & 7,8 Hz, 1H), 3,82 (s, 3H, OCH3), 3,21-3,33 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 2,36-2,40 (m, 2H, NCH2), 2,18 (s, 6H, N(CH3)2).

MS-EI m/z 458 [M+].

Primjer 56

2,4-dimetil-5-(2-okso-5-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amid

5-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (80 mg, 0,4 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (0,1 g) prema postupku B da bi dao 79 mg (46%) spoja iz naslova.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,66 (s, br, 1H, NH), 10,95 (s, br, 1H, NH), 8,15 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 7,81 (s, 1H, H-vinil), 7,71 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,40-7,47 (m, 4H), 7,31 (m, 1H), 6,95 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,2-3,31 (m, 2H, NCH2), 2,46-2,55 (m, 6H, 3×NCH2), 2,44 8s, 6H, 2×CH3), 0,96 (t, J = 7,4 Hz, 6H, 2×NCH2CH3).

MS-EI m/z 456 [M+].

Primjer 57

2,4-dimetil-5-(2-okso-5-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amid

5-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (0,04 g, 0,2 mmol) kondenziran je s 5-fomril-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amidom (0,04 g) da bi dao spoj iz naslova kao žuto-narančastu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,65 (s, br, 1H, NH), 10,96 (s, br, 1H, NH), 8,15 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 7,80 (s, 1H, H-vinil), 7,71 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,49 (t, J = 6,3 Hz, 1H, CONHCH2), 7,41-7,46 (m, 3H), 7,31 (m, 1H), 6,95 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,08 (m, 4H, 2×NCH2), 3,32 (m, 2H, NCH2), 2,55 (t, J = 7,1 Hz, 2H, NCH2), 2,47 (m, ispod DMSO), 2,43 (s, 6H, 2×CH3), 1,66 (m, 4H, 2×CH2).

MS-EI m/z 454 [M+].

Primjer 58

2,4-dimetil-5-(2-okso-5-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-imidazol-1-il-propil)amid

5-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (8 mg, 0,04 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-imidazol-1-il-propil)amidom (10 mg) da bi dao 10 mg (59%) spoja iz naslova kao narančastu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,67 (s, br, 1H, NH), 10,96 (s, br, 1H, NH), 8,16 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 7,81 (s, 1H, H-vinil), 7,65-7,72 (m, 4H), 7,44 (m, 3H), 7,31 (m, 1H, CONHCH2), 7,21 (s, 1H, Ar-H), 4,02 (t, J = 6,5 Hz, 2H, NCH2), 3,19 (q, J = 6,5 Hz, 2H, CONHCH2), 2,44 (s, 6H, 2×CH3), 1,93 (m, 2H, CH2CH2CH2).

MS-EI m/z 465 [M+].

Primjer 59

2,4-dimetil-5-(2-okso-6-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amid

6-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (0,08 g, 0,4 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (0,1 g) da bi dao 65 mg (38%) spoja iz naslova kao žutu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,99 (s, br, 1H, NH), 7,86 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,62-7,66 (m, 3H), 7,40-7,47 (m, 3H), 7,28-7,36 (m, 2H), 7,10 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 3,26 (m, 2H, NCH2), 2,46-2,55 (m, 6H, 3×NCH2), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J = 7,2 Hz, 6H, 2×NCH2CH3).

MS-EI m/z 456 [M+].

Primjer 60

2,4-dimetil-5-(2-okso-6-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amid

6-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (30 mg, 0,15 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amidom (40 mg) da bi dao 5,9 gm (8,5%) spoja iz naslova kao narančasto-žutu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,60 (s, br, 1H, NH), 10,99 (s, br, 1H, NH), 7,86 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,63-7,66 (m, 3H), 7,51 (m, 1H, CONHCH2), 7,45 (m, 2H), 7,28-7,36 (m, 2H), 7,10 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 3,31 (m, 6H, 3×NCH2), 2,55 (t, J = 6,6 Hz, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2×CH2).

MS-EI m/z 454 [M+].

Primjer 61

2,4-dimetil-5-(2-okso-6-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-imidazol-1-il-propil)amid

6-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (8 mg, 0,04 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-imidazol-1-il-propil)amidom (10 mg) da bi dao 7,3 mg (43 %) spoja iz naslova kao narančastu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,62 (s, br, 1H, NH), 10,99 (s, br, 1H, NH), 7,86 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,62-7,70 (m, 5H), 7,45 (m, 2H), 7,35 (m, 1H), 7,30 (dd, J = 1,4 & 8,2 Hz, 1H), 7,21 (s, 1H), 7,10 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 6,89 (s, 1H), 4,02 (t, J = 6,9 Hz, 2H, CH2), 3,19 (m, 2H, NCH2CH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 1,93 (t, J = 6,9 Hz, 2H, NCH2).

MS-EI m/z 465 [M+].

Primjer 62

5-[6-(3,5-diklorofenil)-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amid

6-(3,5-diklorofenil)-1,3-dihidroindol-2-on (64 mg, 0,23 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (60 mg) da bi dao 53 mg (44 %) spoja iz naslova kao svijetlo smeđu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,62 (s, br, 1H, NH), 10,99 (s, 1H, NH), 7,89 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-4), 7,69-7,71 (m, 3H), 7,55 (m, 1H, CONHCH2), 7,37 (m, 2H), 7,14 (d, J = 1,4 Hz, 1H, H-7), 3,27 (m, 2H, NCH2), 2,48-2,58 (m, 6H, 2×NCH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,42 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J = 6,8 Hz, 6H, 3×NCH2CH3).

MS-EI m/z 526,9 [M+].

Primjer 63

2,4-dimetil-5-(2-okso-6-piridin-3-il-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amid

6-piridin-3-il-1,3-dihidroindol-2-on (40 mg, 0,19 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (50 mg) da bi dao 29 mg (33 %) spoja iz naslova kao svijetlo narančastu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,62 (s, br, 1H, NH), 11,05 (s, br, 1H, NH), 8,86 (s, br, 1H), 8,53 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 8,04 (m, 1H), 7,91 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H, H-vinil), 7,40-7,48 (m, 2H), 7,35 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,14 (s, 1H), 3,26 (m, 2H, NCH2), 2,48-2,55 (m, 3×NCH2), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,38 (s, 3H, CH3), 0,96 (t, J = 6,9 Hz, 6H, 2×NCH2CH3).

MS-EI m/z 457 [M+].

Primjer 64

2,4-dimetil-5-(2-okso-6-piridin-3-il-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amid

6-piridin-3-il-1,3-dihidroindol-2-on (60 mg, 0,28 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amidom (75 mg) da bi dao 90 mg (71%) spoja iz naslova kao svijetlo narančastu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 11,05 (s, br, 1H, NH), 8,86 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 8,54 (dd, J = 1,5 & 4,8 Hz, 1H), 8,05 (m, 1H), 7,91 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H, H-vinil), 7,44-7,53 (m, 2H), 7,36 (dd, J = 1,5 & 8,1 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, NCH2), 2,47-2,57 (m, 6H, 3×NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2×CH2).

MS-EI m/z 455 [M+].

Primjer 65

2,4-dimetil-5-(2-okso-6-piridin-3-il-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dimetilaminopropil)amid

6-piridin-3-il-1,3-dihidroindol-2-on (42 mg, 0,2 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dimetilaminopropil)amidom (50 mg) da bi dao 67 mg (75%) spoja iz naslova kao žuto-smeđu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, br, 1H, NH), 11,00 (s, br, 1H, NH), 8,86 (s, br, 1H), 8,54 (s, br, 1H), 8,04 (m, 1H), 7,90 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,69 (s, 1H, H-vinil), 7,63 (m, 1H), 7,45-7,48 (m, 1H), 7,35 (dd, J = 1,7 & 8,0 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 3,21-3,27 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,28 (m, 2H, NCH2), 2,14 (s, 6H, 2×NCH3), 1,64 (m, 2H, CH2).

MS-EI m/z 443 [M+].

Primjer 66

2,4-dimetil-5-(2-okso-5-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dimetilaminopropil)amid

5-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (67 mg, 0,32 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dimetilaminopropil)amidom (81 mg) da bi dao 40 mg (28%) spoja iz naslova kao narančastu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,66 (s, br, 1H, NH), 10,92 (s, br, 1H, NH), 8,14 (s, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,71 (m, 2H), 7,62 (m, 1H), 7,44 (m, 3H), 7,32 (m, 1H), 6,95 (m, 1H), 3,33 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 6H, 2×CH3), 2,27 (m, 2H, NCH2), 2,13 (s, 6H, 2×NCH3), 1,63 (m, 2H, CH2).

MS-EI m/z 442 [M+].

Primjer 67

2,4-dimetil-5-(2-okso-5-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amid

5-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (1,5 g, 7,16 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom (2 g) da bi dao 1,3 g (40%) spoja iz naslova kao žuto-narančastu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,64 (s, 1H, NH), 10,91 (s, 1H, NH), 8,14 (d, J = 1,4 Hz, 1H, ArH), 7,8 (s, 1H, ArH), 7,7 (dd, J = 1,2 i 8,5 Hz, 2H, ArH), 7,6 (t, J = 5,3 Hz, 1H, CONHCH2), 7,4 (m, 3H, ArH), 7,3 (t, J = 7,4 Hz, 1H, ArH), 6,9 (d, J = 8,0 Hz, 1H, ArH), 3,2 (m, 2H, CONHCH2), 2,5 (m, 12H, 3× NCH2 i 2×CH3), 1,61 (m, 2H, CH2CH2CH2), 0,93 (t, J = 6,7 Hz, 6H, NCH2CH3).

MS-EI m/z 470 [M+].

Primjer 68

2,4-dimetil-5-(2-okso-6-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amid

6-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (1,5 g, 7,16 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom (2 g) da bi dao 1,9 g (57%) spoja iz naslova kao narančastu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,58 (s, 1H, NH), 10,94 (s, 1H, NH), 7,8 (d, J = 7,9 Hz, 1H, ArH), 7,6 (m, 4H, ArH), 7,4 (t, J = 7,5 Hz, 2H, ArH), 7,3 (m, 2H), 7,1 (m, 2H), 7,1 (d, J = 1,4 Hz, 1H, ArH), 3,2 (m, 2H, CONHCH2), 2,5 (m, 12H, 3× NCH2 i 2×CH3), 1,61 (m, 2H, CH2CH2CH2), 0,93 (t, J = 6,7 Hz, 6H, NCH2CH3).

MS-EI m/z 470 [M+].

Primjer 69

3-[4-(3-dietilaminopropilkarbamoil)-3,5-dimetil-1H-pirol-2-il-metilen]-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-4-karboksilna kiselina (3-kloro-4-metoksifenil)amid

2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-4-karboksilna kiselina (3-kloro-4-metoksifenil)amid (1 g, 3,16 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom (1 g, 3,58 mmol) da bi dao 1,7 g (85%) spoja iz naslova kao žuto-narančastu krutinu.

MS-EI m/z 578,2 [M+].

Primjer 70

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dietilamino-propil)amid

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (0,5 g, 2,36 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom (0,51 g) da bi dao 0,84 g spoja iz naslova kao crveno-narančastu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,61 (s, 1H, NH), 10,99 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,8 Hz, 1H, ArH), 7,7 (m, 4H), 7,2 (dd, J = 1,8 i 8,3 Hz, 2H, ArH), 6,8 (d, J = 7,8 Hz, 1H, ArH), 3,3 (br s, 4H, 2×NCH2), 3,2 (m, 2H, CONHCH2), 2,6 (br 2, 2H, NCH2 i 2×CH3), 2,4 (s, 6H, 2×CH3), 1,66 (m, 2H, CH2CH2CH2), 0,98 (t, J = 7,1 Hz, 6H, NCH2CH3).

MS-EI m/z 472 i 474 [M+-1 i M++1].

Primjer 71

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-diizopropil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (100 mg, 0,47 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-diizopropil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (150 mg) da bi dao 0,15 g (62%) spoja iz naslova kao žuto-narančastu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,97 (s, 1H, NH), 10,95 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,3 Hz, 1H, ArH), 7,84 (m, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,23 (dd, J = 1,3 i 8,1 Hz, 1H, ArH), 6,8 (d, J = 8,1 Hz, 1H, ArH), 3,5 (m, 1H, CH), 3,3 (m, 3H, CH i NHCH2), 2,5 (br m, 6H, 3×NCH2), 1,28 (d, J = 6,9 Hz, 6H, 2×CH3), 1,23 (d, J = 6,6 Hz, 6H, 2×CH3), 0,96 (m, 6H, 2×CH2CH3).

MS-EI m/z 514 i 516 [M+-1 i M++1].

Primjer 72

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-diizopropil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dietilamino-propil)amid

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (90 mg, 0,42 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-diizopropil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminopropil)amidom (140 mg) da bi dao 54 mg (25%) spoja iz naslova kao crveno-smeđu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,98 (s, 1H, NH), 10,96 (s, 1H, NH), 8,09 (d, J = 1,7 Hz, 2H), 7,78 (s, 1H, H-vinil), 7,23 (dd, J = 1,7 i 8,1 Hz, 1H, ArH), 6,82 (d, J = 8,1 Hz, 1H, ArH), 3,5 (m, 1H, CH), 3,25 (m, 2H, NHCH2), 3,15 (m, 1H, CH), 2,7 (br s, 6H, 3×NCH2), 1,7 (br m, 2H, CH2CH2CH2), 1,28 (d, J = 6,9 Hz, 6H, 2×CH3), 1,24 (d, J = 5,9 Hz, 6H, 2×CH3), 1,06 (m, 6H, 2×CH2CH3).

MS-EI m/z 528 i 530 [M+-1 i M++1].

Primjer 73

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-diizopropil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-pirolidin-1-il-propil)amid

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (130 mg, 0,6 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-diizopropil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-pirolidin-1-il-propil)amidom (150 mg, 0,45 mmol) da bi dao 36 mg (15%) spoja iz naslova kao tamno narančastu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,98 (s, 1H, NH), 10,97 (s, 1H, NH), 8,10 (d, J = 1,6 Hz, 2H), 7,78 (s, 1H, H-vinil), 7,23 (dd, J = 1,6 i 7,6 Hz, 1H, ArH), 6,82 (d, J = 7,6 Hz, 1H, ArH), 3,5 (m, 1H, CH), 3,25 (m, 2H, NHCH2), 3,15 (m, 1H, CH), 2,7 (br s, 6H, 3×NCH2), 1,7 (br m, 6H, 3×NCH2CH2), 1,28 (d, J = 5,6 Hz, 6H, 2×CH3), 1,24 (d, J = 57, Hz, 6H, 2×CH3).

MS-EI m/z 526 i 528 [M+-1 i M++1].

Primjer 74

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (piridin-4-il-metil)amid

5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (170 mg, 0,8 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (piridin-4-il-metil)amidom (200 mg) da bi dao 14 mg (4%) spoja iz naslova kao žutu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,67 (s, 1H, NH), 11,01 (s, br, 1H, NH), 8,51 (dd, J = 1,6 & 4,3 Hz, 2H), 8,23 (t, J = 6,0 Hz, 1H, CONHCH2), 8,11 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,78 (s, 1H, H-vinil), 7,31 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 7,25 (dd, J = 1,9 & 8,1 Hz, 1H), 6,82 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,45 (d, J = 6,0 Hz, 2H, NCH2), 2,46 (s, 6H, 2×CH3).

MS-EI m/z 450 i 452 [M+-1 i M++1].

Primjer 75

5-[6-(4-butilfenil)-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amid

5-[6-(4-butilfenil)]-1,3-dihidroindol-2-on (50 mg, 0,19 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amidom (50 mg) da bi dao 74 mg (76%) spoja iz naslova kao narančastu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,58 (s, 1H, NH), 10,93 (s, br, 1H, NH), 7,82 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,63 (s, 1H, H-vinil), 7,54 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 7,46 (m, 1H, CONH), 7,26 (m, 3H), 7,09 (s, 1H), 3,30 (m, 2H, CH2), 2,52-2,63 (m, 4H, 2×CH2), 2,49 (m, 4H, 2×CH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,68 (m, 4H, 2×CH2), 1,58 (m, 2H, CH2), 1,34 (m, 2H, CH2), 0,91 (t, J = 7,2 Hz, 3H, CH2CH3).

MS-EI m/z 510 [M+].

Primjer 76

5-[6-(5-izopropil-2-metoksifenil)-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amid

6-(5-izopropil-2-metoksifenil)-1,3-dihidroindol-2-on (50 mg, 0,17 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amidom (45 mg) da bi dao 67 mg (75%) spoja iz naslova kao narančastu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,60 (s, 1H, NH), 10,82 (s, br, 1H, NH), 7,77 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,61 (s, 1H, H-vinil), 7,45 (m, 1H, CONH), 7,0-7,19 (m, 5H), 3,73 (s, 3H, OCH3), 3,32 (m, 2H, CH2), 2,87 (m, 1H, CH(CH3)2), 2,56 (m, 2H, CH2), 2,48 (m, 4H, 2×CH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,68 (m, 4H, 2×CH2), 1,21 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH(CH3)2).

MS-EI m/z 527,2 [M+].

Primjer 77

5-[6-(4-etilfenil)-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amid

6-(4-etilfenil)-1,3-dihidroindol-2-on (45 mg, 0,19 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amidom (50 mg) da bi dao 60 mg (65%) spoja iz naslova kao žuto-narančastu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,59 (s, 1H, NH), 10,96 (s, br, 1H, NH), 7,83 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,64 (s, 1H, H-vinil), 7,51-7,56 (m, 3H), 7,25-7,30 (m, 3H), 7,08 (d, J = 1 Hz, 1H), 3,31 (m, 2H, CH2), 2,63 (m, 2H, CH2CH3), 2,55 (m, 2H, CH2), 2,49 (m, 4H, 2×CH2), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2×CH2), 1,20 (t, J = 7,5 Hz, 3H, CH2CH3).

MS-EI m/z 482 [M+].

Primjer 78

5-[6-(2,4-dimetoksifenil)-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amid

6-(2,4-dimetoksifenil)-1,3-dihidroindol-2-on (51 mg, 0,19 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amidom (50 mg) da bi dao 30 mg (31%) spoja iz naslova kao narančastu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,59 (s, 1H, NH), 10,86 (s, br, 1H, NH), 7,75 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,60 (s, 1H, H-vinil), 7,49 (m, 1H, CONH), 7,2 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,03 (m, 1H), 6,97 (s, 1H), 6,58-6,65 (m, 2H), 3,79 (s, 3H, OCH3), 3,76 (s, 3H, OCH3), 3,33 (m, 2H, CH2), 2,55 (m, 2H, CH2), 2,50 (m, 4H, 2×CH2), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,39 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2×CH2).

MS-EI m/z 514 [M+].

Primjer 79

5-[6-(3-izopropilfenil)-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amid

6-(3-izopropilfenil)-1,3-dihidroindol-2-on (48 mg, 0,19 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amidom (50 mg) da bi dao 59 mg (63%) spoja iz naslova kao narančastu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,63 (s, 1H, NH), 10,97 (s, br, 1H, NH), 7,87 (d, J= 7,8 Hz, 1H), 7,68 (s, 1H, H-vinil), 7,24-7,55 (m, 6H), 7,13 (s, 1H), 3,34 (m, 2H, CH2), 3,30 (m, 1H, CH(CH3)2), 2,60 (m, 2H, CH2), 2,50 (m, 4H, 2×CH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,43 (s, 3H, CH3), 1,70 (m, 4H, 2×CH2), 1,27 (d, J = 6,9 Hz, 6H, CH(CH3)2).

MS-EI m/z 496 [M+].

Primjer 80

5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid

5-fluoro-1,3-dihidroindol-2-on (0,54 g, 3,8 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom da bi dao 0,83 g (55%) spoja iz naslova kao žuto-zelenu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,66 (s, 1H, NH), 10,83 (s, br, 1H, NH), 7,73 (dd, J = 2,5 & 9,4 Hz, 1H), 7,69 (s, 1H, H-vinil), 7,37 (t, 1H, CONHCH2CH2), 6,91 (m, 1H), 6,81-6,85 (m, 1H), 3,27 (m, 2H, CH2), 2,51 (m, 6H, 3×CH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 0,96 (t, J = 6,9 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EI m/z 398 [M+].

Primjer 80 (alternativna sinteza)

5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid

Hidrazin-hidrat (55%, 3000 mL) i 5-fluoro-izatin (300 g) zagrijavani su na 100°C. Dodatni 5-fluoro-izatin (500 g) dodavan je u dijelovima (100 g) kroz 120 minuta uz miješanje. Smjesa je zagrijana na 110°C i miješana 4 sata. Smjesa je ohlađena na sobnu temperaturu i krutine su prikupljene vakuum-filtracijom da bi se dobio grubi (2-amino-5-fluoro-fenil)-acetat-hidrazid (748 ). Hidrazid je suspendiran u vodi (700 mL) i pH smjese prilagođen je na pH < 3 pomoću 12N klorovodične kiseline. Smjesa je miješana 12 sati na sobnoj temperaturi. Krutine su prikupljene vakuum-filtracijom i dvaput su isprane vodom. Produkt je osušen u vakuumu da bi dao 5-fluoro-1,3-dihidro-indol-2-on (600 g, prinos 73%) kao smeđi prah. 1H NMR (dimetilsulfoksid-d6) δ 3,46 (s, 2H, CH2), 6,75, 6,95, 7,05 (3×m, 3H, aromat), 10,35 (s, 1H, NH). MS m/z 152 [M+1].

3,5-dimetil-1H-pirol-2,4-dikarboksilna kiselina 2-terc-butil-ester-4-etil-ester (2600 g) i etanol (7800 mL) snažno su miješani dok je sporo dodavana 10N klorovodična kiselina (3650 mL). Temperatura je porasla s 25°C na 35°C i započelo je razvijanje plina. Smjesa je zagrijana na 54°C i miješana uz daljnje zagrijavanje jedan sat, za koje vrijeme je temperatura dosegla 67°C. Smjesa je ohlađena na 5°C i polako je dodano 32 L ledene vode uz miješanje. Krutina je prikupljena vakuum-filtracijom i isprana triput vodom. Krutina je osušena na zraku do konstantne mase da bi dala 2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina etil-ester (1418 g, prinos 87%) kao ružičastu krutinu. 1H NMR (dimetilsulfoksid-d6) δ 2,10, 2,35 (2×s, 2×3H, 2×CH3), 4,13 (q, 2H, CH2), 6,37 (s, 1H, CH), 10,85 (s, 1H, NH). MS m/z 167 [M+1].

Dimetilformamid (322 g) i diklorometan (3700 mL) ohlađeni su u ledenoj kupelji na 4°C i dodan je fosfor-oksiklorid (684 g) uz miješanje. Kruti 2,4-dimetil-1H-pirol-karboksilna kiselina-etil-ester (670 g) sporo je dodavan u dijelovima kroz 15 minuta. Maksimalna dosegnuta temperatura bila je 18°C. Smjesa je zagrijavana do refluksa jedan sat, ohlađena je na 10°C u ledenoj kupelji i brzo je dodano 1,6 L ledene vode uz žestoko miješanje. Temperatura je porasla na 15°C. Dodana je 10N klorovodična kiselina (1,6 L) uz snažno miješanje. Temperatura je porasla na 22°C. Smjesa je ostavljena da stoji 30 minuta i pritom su razdvojeni slojevi. Temperatura je dosegla maksimum od 40°C. Vodenom sloju podešen je pH 12-13 dodatkom 10N kalijevog hidroksida (3,8 L) brzinom koja je omogućavala da temperatura dosegne i ostane na 55°C tijekom dodavanja. Nakon dodavanja, smjesa je ohlađena na 10°C i miješana 1 sat. Krutina je prikupljena vakuum-filtracijom i isprana četiri puta vodom da bi dala 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina etil-ester (778 g, prinos 100%) kao žutu krutinu. 1H NMR (DMSO-d6) δ 1,25 (t, 3H, CH3), 2,4, 2,48 (2×s, 2×3H, 2×CH3), 4,16 (q, 2H, CH2), 9,59 (s, 1H, CHO), 12,15 (br s, 1H, NH). MS m/z 195 [M+1].

5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina etil-ester (806 g), kalijev hidroksid (548 g), voda (2400 mL) i metanol (300 mL) zagrijavani su pri refluksu dva sata uz miješanje i zatim je smjesa ohlađena na 8°C. Smjesa je dvaput ekstrahirana diklorometanom. Vodenom sloju pH je podešen na 4 pomoću 1000 mL 10N klorovodične kiseline, uz održavanje temperature ispod 15°C. Voda je dodana da olakša miješanje. Krutina je prikupljena vakuum-filtracijom, isprana triput vodom i osušena u vakuumu pri 50°C da bi dala 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilnu kiselinu (645 g, prinos 93,5%) kao žutu krutinu. 1H NMR (DMSO-d6) δ 2,40, 2,43 (2×s, 2×3H, 2×CH3), 9,57 (s, 1H, CHO), 12,07 (br s, 2H, NH+COOH). MS m/z 168 [M+1].

5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (1204 g) i 6020 mL dimetilformamida miješani su pri sobnoj temperaturi. Pritom su dodavani 1-(3-dimetil-aminopropil)-3-etilkarbodiimid-hidroklorid (2071 g), hidroksibenzotriazol (1460 g), trietilamin (2016 mL) i dietiletilendiamin (1215 mL). Smjesa je miješana 20 sati pri sobnoj temperaturi. Smjesa je razrijeđena s 3000 mL vode, 2000 mL slane vode i 3000 mL zasićene otopine natrijevog bikarbonata, a pH je podešen na veći od 10 dodatkom 10N natrijevog hidroksida. Smjesa je ekstrahirana dvaput s 5000 mL 10% metanola u diklorometanu i ekstrakti su spojeni, osušeni pomoću bezvodnog magnezijevog sulfata i rotiranjem upareni dosuha. Smjesa je razrijeđena s 1950 mL toluena i ponovo rotiranjem uparena dosuha. Ostatak je smrvljen u 3:1 heksan:dietil-eteru (4000 mL). Krutine su prikupljene vakuum-filtracijom, dvaput isprane s 400 mL etil-acetata i osušene pod vakuumom pri 34°C 21 sat da bi se dobio 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)-amid (819 g, prinos 43%). 1H NMR (dimetilsulfoksid-d6) δ 0,96 (t, 6H, 2×CH3), 2,31, 2,38 (2×s, 2×CH3), 2,51 (m, 6H, 3×CH2), 3,28 (m, 2H, CH2), 7,34 (m, 1H, amid NH), 9,56 (s, 1H, CHO), 11,86 (s, 1H, pirol NH). MS m/z 166 [M+1].

5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)-amid (809 g), 5-fluoro-1,3-dihidro-indol-2-on (438 g), etanol (8000 mL) i pirolidin (13 mL) zagrijavani su pri 78 °C 3 sata. Smjesa je ohlađena na sobnu temperaturu i krutine su prikupljene vakuum-filtracijom i isprane etanolom. Krutine su miješane u etanolu (5900 mL) pri 72°C 30 minuta. Smjesa je ohlađena na sobnu temperaturu. Krutine su prikupljene vakuum-filtracijom, isprane etanolom i osušene u vakuumu pri 54°C kroz 130 sati da bi se dobio 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (1013 g, prinos 88%) kao narančasta krutina. 1H NMR (dimetilsulfoksid-d6) δ 0,98 (t, 6H, 2×CH3), 2,43, 2,4 (2×s, 6H, 2×CH3), 2,50 (m, 6H, 3×CH2), 3,28 (q, 2H, CH2), 6,84, 6,92, 7,42, 7,71, 7,50 (5×m, 5H, aromat, vinil, CONH), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,68 (s, 1H, pirol NH). MS m/z 397 [M-1].

Primjer 81

3-[4-(2-dietilaminoetilkarbamoil)-3,5-dimetil-1H-pirol-2-il-metilen]-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-6-karboksilna kiselina

2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-6-karboksilna kiselina (80 g, 0,45 mmol) kondenzirana je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom da bi dala 210 mg (92%) spoja iz naslova kao žuto-narančastu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,6 (s, 1H, NH), 7,76 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,66 (s, 1H, H-vinil), 7,57 (dd, J = 1,5 & 8,0 Hz, 1H), 7,40-7,42 (m, 2H), 3,28 (m, 2H, CH2), 2,88 (m, H-piperidin), 2,54 (m, 6H, 3×CH2), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,56 (m, H-piperidin), 0,97 (t, J = 6,98 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS m/z 424 [M+].

Primjer 82

5-(5-dimetilsulfamoil-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amid

2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonska kiselina dimetilamid (90 g, 0,38 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amidom (100 mg) da bi dao 100 mg (54%) spoja iz naslova kao žutu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,65 (s, 1H, NH), 11,30 (s, br, 1H, NH), 8,25 (d, 1H), 7,92 (s, 1H, H-vinil), 7,48-7,53 (m, 2H), 7,07 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, CH2), 2,61 (s, 6H, N(CH3)2), 2,56 (t, 2H, CH2), 2,49 (m, 4H, 2×CH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,44 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2×CH2).

MS m/z 485 [M+].

Primjer 83

5-[5-(3-klorofenilsulfamoil)-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amid

2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonska kiselina (3-kloro-fenil)amid (120 g, 0,38 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amidom (100 mg) da bi dao 150 mg (69%) spoja iz naslova kao žuto-narančastu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,55 (s, 1H, NH), 11,26 (br s, 1H, NH), 10,30 (br s, 1H, NH), 8,26 (d, 1H), 7,79 (s, 1H, H-vinil), 7,51-7,57 (m, 2H), 7,22 (t, J = 8,1 Hz, 1H), 7,15 (m, 1H), 7,07 (m, 1H), 7,0 (m, 2H), 3,44 (m, 2H, CH2), 2,57 (t, J = 7,0 Hz, 2H, CH2), 2,49 (m, 4H, 2×CH2), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,43 (s, 3H, CH3), 1,68 (m, 4H, 2×CH2).

MS m/z 568 [M+].

Primjer 84

2,4-dimetil-5-[2-okso-5-(piridin-3-il-sulfamoil)-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amid

2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonska kiselina piridin-3-il-amid (110 g, 0,38 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amidom (100 mg) da bi dao 150 mg (74%) spoja iz naslova kao narančastu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,58 (s, 1H, NH), 8,21 (d, J = 2,0 Hz, 2H), 8,04 (m, 1H), 7,76 (s, 1H, H-vinil), 7,49-7,54 (m, 2H), 7,41 (m, 1H), 7,14 (m, 1H), 6,94 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, CH2), 2,56 (t, J = 7,06 Hz, 2H, CH2), 2,49 (m, 4H, 2×CH2), 2,43 (s, 6H, 2×CH3), 1,68 (m, 4H, 2×CH2).

MS m/z 535 [M+].

Primjer 85

3-[3,5-dimetil-4-(4-metilpiperazin-1-karbonil)-1H-pirol-2-il-metilen]-4-(2-hidroksietil)-1,3-dihidroindol-2-on

4-(2-hidroksietil)-1,3-dihidroindol-2-on (71 mg, 0,4 mmol) kondenziran je s 3,5-dimetil-4-(4-metil-piperazin-1-karbonil)-1H-pirol-2-karbaldehidom da bi dao 90 mg (55%) spoja iz naslova kao narančastu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14,25 (s, 1H, NH), 10,88 (s, 1H, NH), 7,57 (s, 1H, H-vinil), 7,03 (m, 1H), 6,75-6,82 (m, 2H), 4,86 (m, 1H, OH), 3,70 (m, 2H, CH2), 3,04 (m, 2H, CH2), 2,48 (m, 4H, 2×CH2), 2,28 (br s, 7H), 2,19 (s, 3H, CH3), 2,18 (s, 3H, CH3).

MS m/z (+ve) 409,3 [M+].

Primjer 86

3-[3,5-dimetil-4-(4-metilpiperazin-1-karbonil)-1H-pirol-2-il-metilen]-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonska kiselina fenilamid

2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-sulfonska kiselina fenilamid (110 mg, 0,4 mmol) kondenziran je s 3,5-dimetil-4-(4-metil-piperazin-1-karbonil)-1H-pirol-2-karbaldehidom (100 mg) da bi dao 50 mg (24%) spoja iz naslova kao žutu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,52 (s, 1H, NH), 11,26 (s, 1H, NH), 10,08 (s, 1H, NH), 8,21 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 7,75 (s, 1H, H-vinil), 7,50 (dd, J = 1,6 & 8,3 Hz, 1H), 7,19 (m, 2H), 7,10 (m, 2H), 6,97 (m, 2H), 2,49 (m, 4H, 2×CH2), 2,28 (m, 10H, 2×CH3 & 2×CH2), 2,18 (s, 3H, CH3).

MS-EI m/z 519 [M+].

Primjer 87

5-(5-dimetilsulfamoil-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amid

2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-sulfonska kiselina dimetilamid (90 mg, 0,38 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (100 mg) da bi dao 80 mg (43%) spoja iz naslova kao žutu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11,30 (s, 1H, NH), 8,27 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 7,94 (s, 1H, H-vinil), 7,49 (dd, J = 1,7 & 8,0 Hz, 1H), 7,44 (m, 1H, CONHCH2CH2), 7,07 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 3,26 (m, 2H, CH2), 2,60 (s, 6H, N(CH3)2), 2,53 (m, 2H, CH2), 2,45-2,50 (m, 10H, 2× CH3 & N(CH2CH3)2), 0,96 (t, J = 7,2 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS-EI m/z 487 [M+].

Primjer 88

5-[5-(3-klorofenilsulfamoil)-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amid

2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-sulfonska kiselina (3-kloro-fenil)amid (120 mg, 0,38 mmol) kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (100 mg) da bi dao 80 mg (37%) spoja iz naslova kao žutu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,55 (s, 1H, NH), 11,24 (s, 1H, NH), 10,29 (s, 1H, NH), 8,25 (d, J = 1,87 Hz, 1H), 7,79 (s, 1H, H-vinil), 7,52 (dd, J = 1,87 & 8,3 Hz, 1H), 7,42 (m, 1H, CONHCH2CH2), 7,22 (t, J = 8,02 Hz, 1H), 7,15 (t, J = 2 Hz, 1H), 7,08 (m, 1H), 7,0 (m, 2H), 3,27 (m, 2H, CH2), 2,48-2,57 (m, 6H, 3×CH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,44 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J = 7,0 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS m/z 570,1 [M+].

Primjer 95

3-(2-okso-5-fenil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-4,5,6,7-tetrahidro-2H-izoindol-1-karboksilna kiselina etil-ester

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,74 (s, 1H, NH), 11,00 (s, 1H, NH), 8,13 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 7,74 (s, 1H, H-vinil), 7,70 (d, J = 7,7 Hz, 2H), 7,49 (dd, J = 1,7 & 8,0 Hz, 1H), 7,44 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 7,32 (m, 1H), 6,96 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,26 (q, J = 7,0 Hz, 2H, OCH2CH3), 2,79 (m, 2H, CH2), 2,72 (m, 2H, CH2), 1,73 (m, 4H, 2×CH2), 1,30 (t, J = 7,0 Hz, 3H, OCH2CH3).

MS-EI m/z 412 [M+].

Primjer 99

3-(2-okso-5-fenilsulfamoil-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-4,5,6,7-tetrahidro-2H-izoindol-1-karboksilna kiselina etil-ester

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,64 (s, 1H, NH), 11,33 (s, 1H, NH), 10,07 (s, 1H, NH), 8,24 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,74 (s, 1H, H-vinil), 7,57 (dd, J = 1,8 & 8,0 Hz, 1H), 7,21 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 7,11 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 6,99 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,98 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,27 (q, J = 7,0 Hz, 2H, OCH2CH3), 2,80 (m, 2H, CH2), 2,73 (m, 2H, CH2), 1,73 (m, 4H, 2×CH2), 1,30 (t, J = 7,0 Hz, 3H, OCH2CH3).

MS-EI m/z 491 [M+].

Primjer 109

3-[3-(morfolin-4-karbonil)-4,5,6,7-tetrahidro-2H-izoindol-1-il-metilen]-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-6-karboksilna kiselina

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,60 (s, 1H, NH), 12,75 (br s, 1H, COOH), 11,08 (s, 1H, NH), 7,85 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,71 (s, 1H, H-vinil), 7,62 (dd, J = 1,4 & 7,8 Hz, 1H), 7,41 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 3,65 (m, 4H, 2×CH2), 3,55 (m, 4H, 2×CH2), 2,81 (m, 2H, CH2), 2,54 (m, 2H, CH2), 1,73 (m, 4H, 2×CH2).

MS-EI m/z 421 [M+].

Primjer 112

5-bromo-3-[3-(pirolidin-1-karbonil)-4,5,6,7-tetrahidro-2H-izoindol-1-il-metilen]-1,3-dihidro-indol-2-on

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,56 (s, 1H, NH), 11,00 (s, 1H, NH), 8,05 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,74 (s, 1H, H-vinil), 7,28 (dd, J = 1,3 & 8,3 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 3,57 (m, 4H, 2×CH2), 2,79 (m, 2H, CH2), 2,65 (m, 2H, CH2), 1,88 (m, 4H, 2×CH2), 1,71 (m, 4H, 2×CH2).

MS-EI m/z 439 & 441 [M+-1] & [M++1].

Primjer 114

3-(3-dimetilkarbamoil-4,5,6,7-tetrahidro-2H-izoindol-1-il-metilen)-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-6-karboksilna kiselina

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,60 (s, 1H, NH), 12,72 (br s, 1H, COOH), 1,05 (s, 1H, NH), 7,85 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,72 (s, 1H, H-vinil), 7,62 (dd, J = 1,3 & 7,9 Hz, 1H), 7,42 (d, J = 1,3 Hz, 1H), 3,03 (s, 6H, N(CH3)2), 2,81 (m, 2H, CH2), 2,5 (m, 2H, CH2), 1,73 (m, 4H, 2×CH2).

MS-EI m/z 379 [M+].

Primjer 115

4-metil-5-(5-metilsulfamoil-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-3-karboksilna kiselina

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,56 (br s, 1H, NH), 8,24 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 7,86 (s, 1H, H-vinil), 7,74 (d, J = 2,96 Hz, 1H), 7,56 (dd, J = 1,5 & 8,1 Hz, 1H), 7,20 (br m, 1H, NHCH3), 7,03 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 2,57 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3).

MS-EI m/z 361 [M+].

Primjer 116

{[4-metil-5-(4-metil-5-metilsulfamoil-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-3-karbonil]-amino}-octena kiselina etil-ester

4-metil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina etil-ester (lit. ref. D. O. Cheng, T. L. Bowman i E. LeGoff; J. Heterocyclic Chem.; 1976; 13; 1145-1147) formiliran je postupkom A, hidroliziran postupkom B i amidiran (postupkom C) da bi dao [(5-formil-4-metil-1H-pirol-3-karbonil)-amino]-octena kiselina etil-ester.

4-metil-5-metilaminosulfonil-2-oksindol (50 mg, 0,21 mmol) kondenziran je s [(5-formil-4-metil-1H-pirol-3-karbonil)-amino]-octena kiselina etil-esterom (100 mg, 0,42 mmol) i piperidinom (0,1 mL) u etanolu (2 mL) da bi dao 50 mg (52%) spoja iz naslova.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,59 (s, 1H, NH), 11,29 (br s, 1H, NH-CO), 8,33 (t, J = 5,8 Hz, 1H, CONHCH2), 7,83 (d, J = 3,11 Hz, 1H), 7,80 (s, 1H, H-vinil), 7,71 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,34 (br m, 1H, NHCH3), 6,89 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 4,11 (q, J = 7,1 Hz, 2H, OCH2CH3), 3,92 (d, J = 5,8 Hz, 2H, GlyCH2), 2,86 (s, 3H, CH3), 2,48 (s, 3H, CH3), 2,42 (d, J = 4,71 Hz, 3H, HNCH3), 1,20 (t, J = 7,1 Hz, 3H, OCH2CH3).

MS-EI m/z 460 [M+].

Primjer 117

{[4-metil-5-(5-metilsulfamoil-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-3-karbonil]-amino}-octena kiselina etil-ester

Smjesa 5-metilaminosulfonil-2-oksindola (0,06 g, 0,22 mmol), [(5-formil-4-metil-1H-pirol-3-karbonil)-amino]-octena kiselina etil-estera (0,075 g, 0,27 mmol) i piperidina (2 kapi) u etanolu (5 mL) zagrijavana je u zatvorenoj cijevi pri 90 °C 12 sati. Nakon hlađenja, talog je prikupljen vakuum-filtracijom, ispran etanolom, smrvljen u diklorometan/eteru i osušen da bi dao 0,035 g (36%) spoja iz naslova kao žućkasto-smeđu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,6 (s, 1H, NH), 11 (br s 1H, NH-CO), 8,30 (t, J = 5,7 Hz, 1H, CONHCH2), 8,25 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 7,88 (s, 1H, H-vinil), 7,84 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,57 (dd, J = 1,9 & 8,5 Hz, 1H), 7,14 (br m, 1H, NHCH3), 7,04 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 4,11 (q, J = 6,7 Hz, 2H, OCH2CH3), 3,92 (d, J = 5,7 Hz, 2H, GlyCH2), 2,55 (s, 3H, CH3), 2,41 (m, 3H, NCH3), 1,20 (t, J = 6,7 Hz, 3H, OCH2CH3).

MS-EI m/z 446 [M+].

Primjer 118

{[4-metil-5-(5-metilsulfamoil-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-3-karbonil]-amino}-octena kiselina

Smjesa [(5-formil-4-metil-1H-pirol-3-karbonil)-amino]-octena kiselina etil-estera (0,142 g, 0,59 mmol) i 1N NaOH (1,2 mL) u metanolu (10 mL) miješana je pri sobnoj temperaturi 1 sat. Reakcijska smjesa je koncentrirana i ostatak je kondenziran s 5-metilaminosulfonil-2-oksindolom (0,13 g, 0,48 mmol) i piperidinom (0,12 mL) u etanolu (12 mL) da bi dao 0,11 g (52%) spoja iz naslova.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,98 (br s, 1H, NH), 8,17 (s, 1H), 7,80 (s, 1H), 7,75 (d, J = 3,1 Hz, 1H), 7,51 (dd, J = 2 & 8,2 Hz, 1H), 7,21 (m na br s, 2H), 6,97 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,41 (d, J = 4,2 Hz, 2H, CH2NH), 2,54 (s, 3H, pirol-CH3), 2,39 (s, 3H, ArCH3).

MS m/z 417 [M-1]+.

Primjer 120

5-metil-2-(2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-3-karboksilna kiselina

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,77 (br s, 1H, NH), 12,49 (s, 1H, COOH), 11,07 (s, 1H, NH), 8,39 (s, 1H, H-vinil), 7,43 (d, J = 7,47 Hz, 1H), 7,20 (t, J = 7,47 Hz, 1H), 7,03 (t, J = 7,47 Hz, 1H), 6,91 (d, J= 7,47 Hz, 1H), 6,49 (d, J = 7,47 Hz, 1H), 6,49 (d, J= 1,53 Hz, 1H), 2,34 (s, 3H, CH3).

MS m/z 269 [M+H]+.

Primjer 121

5-metil-2-(2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-3-karboksilna kiselina etil-ester

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,79 (s, 1H, NH), 11,08 (s, 1H, NH), 8,31 (s, 1H, H-vinil), 7,45 (d, J = 7,52 Hz, 1H), 7,20 (t, J = 7,52 Hz, 1H), 7,03 (t, J = 7,52 Hz, 1H), 6,91 (d, J = 7,52 Hz, 1H), 6,50 (d, J= 2,1 Hz, 1H), 4,26 (q, J = 7,2 Hz, 2H, OCH2CH3), 2,33 (s, 3H, CH3), 1,32 (t, J = 7,2 Hz, 3H, OCH2CH3).

MS m/z 297,1 [M+H]+.

Primjer 122

2-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-5-metil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina etil-ester

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,72 (s, 1H, NH), 11,16 (s, 1H, NH), 8,29 (s, 1H, H-vinil), 7,53 (d, J= 2,0 Hz, 1H), 7,35 (dd, J = 2,0 & 8,05 Hz, 1H), 6,87 (t, J = 8,05 Hz, 1H), 6,53 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,28 (q, J = 7,03 Hz, 2H, OCH2CH3), 2,35 (s, 3H, CH3), 1,33 (t, J = 7,2 Hz, 3H, OCH2CH3).

MS m/z 375 & 377 [M+H]+.

Primjer 123

2-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-5-metil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,72 (s, 1H, NH), 12,57 (s, 1H, COOH), 11,19 (s, 1H, NH), 8,36 (s, 1H, H-vinil), 7,51 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 7,34 (dd, J = 1,4 & 8,17 Hz, 1H), 6,87 (t, J = 8,17 Hz, 1H), 6,52 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 2,35 (s, 3H, CH3).

MS m/z 347 & 349 [M+H]+.

Primjer 124

2-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-5-metil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)-amid

Otopini 2-formil-5-metil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline (250 mg, 1,63 mmol) u dimetilformamidu (3 mL) dodani su 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid (376 mg, 1,2 ekv.), 1-hidroksibenzotriazol (265 mg, 1,2 ekv.), trietilamin (0,45 mL, 2 ekv.) i 1-(2-aminoetil)pirolidin (0,23 mL, 1,1 ekv.). Nakon miješanja pri sobnoj temperaturi preko noći, reakcijska smjesa razrijeđena je zasićenom otopinom natrijevog bikarbonata i slanom vodom (sa suviškom soli) i ekstrahirana 10%-tnim metanolom u diklorometanu. Spojeni organski slojevi isprani su slanom vodom, osušeni pomoću bezvodnog natrijevog sulfata i koncentrirani da bi dali 130 mg 2-formil-5-metil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)-amida.

Smjesa 5-bromo-2-oksindola (106 mg, 0,5 mmol), 2-formil-5-metil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)-amida (125 mg, 1 ekv.) i piperidina (0,2 mL) u etanolu (2 mL) zagrijavana je u zatvorenoj cijevi pri 80 °C 1 sat, nakon čega je ohlađena. Nastali talog prikupljen je vakuum-filtracijom, ispran etanolom i etil-acetatom i osušen da bi dao spoj iz naslova kao narančastu krutinu.

1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,62 (s, 1H, NH), 11,06 (br s, 1H, NH), 8,56 (s, 1H, H-vinil), 8,15 (m, 1H, CONHCH2), 7,48 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,31 (dd, J = 1,8 & 7,9 Hz, 1H), 6,86 (d, J= 7,9 Hz, 1H), 6,60 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 3,35 (m, 2H, HNCH2CH2), 2,56 (t, J = 6,91 Hz, 2H, HNCH2CH2), 2,35 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2×CH2).

MS m/z 443/445 [M+ i M++2].

Primjer 125

2-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-5-metil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)-amid

Otopini 2-formil-5-metil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline (320 mg, 2,1 mmol) u dimetilformamidu (3 mL) dodani su 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid (483 mg, 1,2 ekv.), 1-hidroksibenzotriazol (340 mg, 1,2 ekv.), trietilamin (0,59 mL, 2 ekv.) i N,N-dietiletilendiamin (0,32 mL, 1,1 ekv.). Nakon miješanja pri sobnoj temperaturi preko noći, reakcijska smjesa razrijeđena je zasićenom otopinom natrijevog bikarbonata i slanom vodom (sa suviškom soli) i ekstrahirana 10%-tnim metanolom u diklorometanu. Spojeni organski slojevi isprani su slanom vodom, osušeni pomoću bezvodnog natrijevog sulfata i koncentrirani da bi dali 2-formil-5-metil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)-amid.

Smjesa 5-bromo-2-oksindola (106 mg, 0,5 mmol), 2-formil-5-metil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)-amida (126 mg, 1 ekv.) i piperidina (0,2 mL) u etanolu (2 mL) zagrijavana je u zatvorenoj cijevi pri 80 °C 1 sat, nakon čega je ohlađena. Nastali talog prikupljen je vakuum-filtracijom, ispran etanolom i etil-acetatom i osušen da bi dao spoj iz naslova kao narančastu krutinu.

1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,62 (s, 1H, NH), 11,11 (br s, 1H, NH), 8,54 (s, 1H, H-vinil), 8,1 (m, 1H, CONHCH2), 7,49 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,31 (dd, J = 2,2 & 8,3 Hz, 1H), 6,86 (d, J= 8,3 Hz, 1H), 6,58 (d, J = 2,24 Hz, 1H), 3,31 (m, 2H, HNCH2CH2), 2,59 (m, 6H, 3×CH2), 2,36 (s, 3H, CH3), 0,99 (t, J = 6,8 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS m/z 445/447 [M+ i M++2].

Primjer 126

2,4-dimetil-5-(2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)-amid

Smjesa 1,3-dihidro-indol-2-ona (266 mg, 2 mmol), 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)-amida (530 mg, 2 mmol) i piperidina (1 kap) u etanolu zagrijavana je pri 90 °C 2 sata. Reakcijska smjesa ohlađena je na sobnu temperaturu, nastali talog prikupljen je vakuum-filtracijom, ispran etanolom i osušen da bi dao 422 mg (55%) spoja iz naslova kao svijetložutu krutinu.

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,7 (s, 1H, NH), 10,9 (s, 1H, NH), 7,88 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,64 (s, 1H, H-vinil), 7,41 (t, J = 5,4 Hz, 1H, NH), 7,13 (dt, J = 1,2 & 7,6 Hz, 1H), 6,99 (dt, J = 1,2 & 7,6 Hz, 1H), 6,88 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 3,28 (m, 2H), 2,48-2,55 (m, 6H), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J = 7,2 Hz, N(CH2CH3)2).

MS + ve APCI 381 [M++1].

Primjer 127

5-(5-kloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid

Smjesa 5-kloro-1,3-dihidro-indol-2-ona (335 mg, 2 mmol), 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)-amida (530 mg, 2 mmol) i piperidina (1 kap) u etanolu zagrijavana je pri 90 °C 2 sata. Reakcijska smjesa ohlađena je na sobnu temperaturu, nastali talog prikupljen je vakuum-filtracijom, ispran etanolom i osušen da bi dao 565 mg (68%) spoja iz naslova kao narančastu krutinu.

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,65 (s, 1H, NH), 11,0 (s, 1H, NH), 7,98 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,77 (s, 1H, H-vinil), 7,44 (t, NH), 7,13 (dt, J = 2,1 & 8,4 Hz, 1H), 6,87 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 3,28 (m, 2H), 2,48-2,53 (m, 6H), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,43 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J = 7,0 Hz, 6H, N(CH2CH3)2).

MS + ve APCI 415 [M++1].

Primjer 128

2,4-dimetil-5-(2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-etil)-amid

1,3-dihidro-indol-2-on kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)-amidom da bi nastao spoj iz naslova.

MS + ve APCI 379 [M++1].

Primjer 129

5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)-amid

5-fluoro-1,3-dihidro-indol-2-on kondenziran je s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)-amidom da bi nastao spoj iz naslova.

MS + ve APCI 397 [M++1].

Postupak uvećanja:

5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (61 g), 5-fluoro-1,3-dihidro-indol-2-on (79 g), etanol (300 mL) i pirolidin (32 mL) zagrijavani su pri refluksu 4,5 sati. Smjesi je dodana octena kiselina (24 mL) i refluks je nastavljen još 30 minuta. Smjesa je ohlađena na sobnu temperaturu i krutine su prikupljene vakuum-filtracijom i dvaput isprane etanolom. Krutine su miješane 130 minuta u 40%-tnom acetonu u vodi (400 mL), uz dodatak 12 N klorovodične kiseline (6,5 mL). Krutine su prikupljene vakuum-filtracijom i dvaput isprane 40%-tnim acetonom u vodi. Zatim su osušene u vakuuu da bi se dobila 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (86 g, prinos 79%) kao narančasta krutina. 1H NMR (dimetilsulfoksid-d6) δ 2,48, 2,50 (2×s, 6H, 2×CH3), 6,80, 6,88, 7,68, 7,72 (4×m, 4H, aromatska i vinil-grupa), 10,88 (s, 1H, CONH), 12,12 (s, 1H, COOH), 13,82 (s, 1H, pirol NH). MS m/z 299 [M-1].

5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (100 g) i dimetilformamid (500 mL) su miješani i dodani su benzotriazol-1-il-oksitris(dimetilamino)fosfonij-heksafluorofosfat (221 g), 1-(2-aminoetil)pirolidin (45,6 g) i trietilamin (93 mL). Smjesa je miješana 2 sata pri ambijentalnoj temperaturi. Kruti produkt prikupljen je vakuum-filtracijom i ispran etanolom. Krutine su isprane miješanjem u etanolu (500 mL) jedan sati pri 64 °C i ohlađene na sobnu temperaturu. Zatim su prikupljene vakuum-filtracijom, isprane etanolom i osušene u vakuumu da bi se dobio 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)-amid (101,5 g, prinos 77%). 1H NMR (dimetilsulfoksid-d6) δ 1,60 (m, 4H, 2×CH2), 2,40, 2,44 (2×s, 6H, 2×CH3), 2,50 (m, 4H, 2×CH2), 2,57, 3,35 (2×m, 4H, 2×CH2), 7,53, 7,70, 7,73, 7,76 (4×m, 4H, aromatska i vinil-grupa), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,67 (s, 1H, pirol-NH). MS m/z 396 [M+1].

Primjer 130

5-(5-kloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)-amid

5-kloro-1,3-dihidro-indol-2-on je kondenziran s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)-amidom da bi nastao spoj iz naslova.

MS + ve APCI 413 [M++1].

Primjer 131

2,4-dimetil-5-(2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)-amid

1,3-dihidroindol-2-on je kondenziran s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilamino-etil)amidom da bi nastao spoj iz naslova.

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,63 (s, 1H, NH), 10,90 (s, 1H, NH), 7,78 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,63 (s, 1H, H-vinil), 7,48 (t, 1H, NH), 7,13 (dt, 1H), 6,98 (dt, 1H), 3,31 (q, J = 6,6 Hz, 2H), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 2,19 (s, 6H, N(CH2CH3)2).

MS + ve APCI 353 [M++1].

Primjer 132

5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)-amid

5-fluoro-1,3-dihidro-indol-2-on je kondenziran s 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amidom da bi nastao spoj iz naslova.

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,68 (s, 1H, NH), 10,90 (s, 1H, NH), 7,76 (dd, J = 2,4 & 9,4 Hz, 1H), 7,71 (s, 1H, H-vinil), 7,51 (t, 1H, NH), 6,93 (m, 1H), 6,84 (dd, J = 4,6 & 8,4 Hz, 1H), 3,31 (q, J = 6,6 Hz, 2H), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 2,19 (s, 6H, N(CH2CH3)2).

MS + ve APCI 371 [M++1].

Primjer 193

5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-etilamino-etil)-amid

5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-etilamino-etil)-amid (99 g), etanol (400 mL), 5-fluoro-2-oksindol (32 g) i pirolidin (1,5 g) zagrijavani su pri refluksu 3 sata uz miješanje. Smjesa je ohlađena na sobnu temperaturu i krutine su prikupljene vakuum-filtracijom. Krutine su miješane u etanolu pri 60 °C, ohlađene na sobnu temperaturu i prikupljene vakuum-filtracijom. Produkt je osušen u vakuumu da bi se dobio 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-etilamino-etil)-amid (75 g, prinos 95%). 1H NMR (dimetilsulfoksid-d6) δ 1,03 (t, 3H, CH3), 2,42, 2,44 (2×s, 6H, 2×CH3), 2,56 (q, 2H, CH2), 2,70, 3,30 (2×t, 4H, 2×CH2), 6,85, 6,92, 7,58, 7,72, 7,76 (5×m, 5H, aromat, vinil i CONH), 10,90 (br s, 1H, CONH), 13,65 (br s, 1H, pirol NH). MS m/z 369 [M-1].

Primjer 195

5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietil-N-oksoamino-etil)-amid

Postupak A:

5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)-amid (598 mg) i diklorometan (60 mL) u ledenoj kupelji tretirani su 3-kloroperbenzojevom kiselinom (336 mg) i smjesa je miješana pri sobnoj temperaturi preko noći. Otapalo je rotiranjem upareno i ostatak je suspendiran u metanolu (20 mL). Dodana je voda (20 mL) koja sadrži natrijev hidroksid (240 mg) i smjesa je miješana jedan sat. Talog je prikupljen vakuum-filtracijom, ispran s 5 mL vode i osušen u vakuumu da bi dao 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietil-N-oksoamino-etil)-amid (510 mg, prinos 82%) kao narančastu krutinu. 1H NMR (DMSO-d6) δ 13,72 (br s, 1H, NH), 11,02 (br s, 1H, CONH), 9,81 (br s, 1H, CONH), 7,75 (dd, 1H, aromat), 7,70 (s, 1H, aromat), 6,93 (td, 1H, aromat), 6,84 (m, 1H, aromat), 3,63 (m, 2H, CH2), 3,29 (m, 2H, CH2), 3,14 (m, 4H, 2×CH2), 2,47 (s, 1H, CH3), 2,45 (s, 3H, CH3), 1,64 (t, 6H, 2×CH3). MS m/z 415 [M+1].

Postupak B:

5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)-amid (10 g) je suspendiran u diklorometanu (100 mL) i ohlađen u ledenoj kupelji. Dodana je 3-kloroperoksibenzojeva kiselina (13,1 g) uz miješanje te je smjesa ostavljena da se zagrije na sobnu temperaturu i miješana je preko noći. Smjesa je uparena rotiranjem dosuha i propuštena kroz kromatografsku kolonu silikagela, uz eluciju 20%-tnim metanolom u diklorometanu. Frakcije koje sadrže produkt su spojene i rotiranjem uparene dosuha da bi dale 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietil-N-oksoamino-etil)-amid (9 g, prinos 83%).

5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietil-N-oksoamino-etil)-amid (9 g), 5-fluoro-1,3-dihidro-indol-2-on i pirolidin (0,1 g) zagrijavani su pri refluksu u etanolu (30 mL) 4 sata. Smjesa je ohlađena u ledenoj kupelji, a talog je prikupljen vakuum-filtracijom i ispran etanolom. Krutine su miješane u etil-acetatu (30 mL), prikupljene vakuum-filtracijom, isprane etil-acetatom i osušene u vakuumu da bi dale 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietil-N-oksoamino-etil)-amid (510 mg, prinos 82%) kao narančastu krutinu. 1H NMR (DMSO-d6) δ 13,72 (br s, 1H, NH), 11,02 (br s, 1H, CONH), 9,81 (br s, 1H, CONH), 7,75 (dd, 1H, aromat), 7,70 (s, 1H, aromat), 6,93 (td, 1H, aromat), 6,84 (m, 1H, aromat), 3,63 (m, 2H, CH2), 3,29 (m, 2H, CH2), 3,14 (m, 4H, 2×CH2), 2,47 (s, 1H, CH3), 2,45 (s, 3H, CH3), 1,64 (t, 6H, 2×CH3). MS m/z 415 [M+1].

Primjer 190

5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(piridin-1-il)etil]-amid

5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (120 mg, 0,4 mmol) potresana je uz EDC, HCl (96 mg, 0,5 mmol), bezvodni 1-hidroksi-benzotriazol (68 mg, 0,5 mmol) i 2-(2-aminoetil)piridin, naručen od Aldricha u bezvodnom DMF (3 mL) 2-3 dana na sobnoj temperaturi. Reakcijska smjesa razrijeđena je 1M NaHCO3 (1,5 mL), zatim s 8 mL vode. Istaloženi grubi produkt prikupljen je filtracijom, ispran vodom, osušen i pročišćen kristalizacijom ili kromatografijom da bi dao 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(piridin-1-il)etil]-amid.

Primjer 189

5-[5-kloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(piridin-1-il)etil]-amid

Slijedeći postupak kao u prethodnom primjeru, ali uz zamjenu 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline 5-[5-kloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilnom kiselinom (127 mg), dobiven je 5-[5-kloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(piridin-1-il)etil]-amid.

Primjer 192

5-[5-bromo-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(piridin-1-il)etil]-amid

Slijedeći postupak kao u Primjeru 190, ali uz zamjenu 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline 5-[5-bromo-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilnom kiselinom (145 mg), dobiven je 5-[5-bromo-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(piridin-1-il)etil]-amid.

Primjer 191

5-[2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(piridin-1-il)etil]-amid

Slijedeći postupak kao u Primjeru 190, ali uz zamjenu 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline 5-[2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilnom kiselinom (113 mg), dobiven je 5-[2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(piridin-1-il)etil]-amid.

Primjer 203

5-[5-cijano-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(piridin-1-il)etil]-amid

Slijedeći postupak kao u Primjeru 190, ali uz zamjenu 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline 5-[5-cijano-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilnom kiselinom (123 mg), dobiven je 5-[5-cijano-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(piridin-1-il)etil]-amid.

Primjeri 142, 186, 187, 188 i 204

Slijedeći postupak kao u Primjerima 190, 189, 191, 192 i 203, ali uz zamjenu 2-(2-aminoetil)piridina 1-(2-aminoetil)pirolidinom, nabavljenim od Aldrich Chemical Company, Inc., dobiveni su željeni spojevi.

Primjeri 143-147

Slijedeći postupak kao u Primjerima 190, 189, 191, 192 i 203, ali uz zamjenu 2-(2-aminoetil)piridina 1-(2-aminoetil)imidazolin-2-onom (pripremljenim zagrijavanjem dimetil-karbonata s bis(2-aminoetil)aminom (2 ekv.) u začepljenoj tikvici na 150 °C 30 min, nakon toga slijedeći postupak opisan u U.S. patentu 2613212 (1950) od Rohm & Haas Co. Grubi produkt pročišćen je na silikagelu, uz elucijsku smjesu kloroform-metanol-vodeni amonijak 80:25:2), dobiveni su željeni spojevi.

Primjeri 148-151 i 184

Slijedeći postupak kao u Primjerima 190, 189, 191, 192 i 203, ali uz zamjenu 2-(2-aminoetil)piridina 4-(2-aminoetil)piperazin-1-octena kiselina etil-esterom (pripremljenim kako slijedi: Piperazin-1-octena kiselina etil-ester (11,22 g) tretiran je jodoacetonitrilom (5,0 mL) u prisutnosti kalijevog karbonata (6,9 g) u etil-acetatu (260 mL) pri 0°C. Nakon potpunog dodavanja jodoacetonitrila (45 min), reakcijska smjesa je miješana pri sobnoj temperaturi 11 sati. Reakcijska smjesa je filtrirana, a filtrati su upareni. Ostatak je hidrogeniran u prisutnosti kobalt-borida (pripremljenog iz CoCl2 i natrijevog borohidrida) pri sobnoj temperaturi i 50 psi 2 dana u etanolu. Filtracija, uparavanje i kromatografsko pročišćavanje uz elucijsku smjesu kloroform-metanol-vodeni amonijak 80:25:2 dalo je željeni amin (3,306 g) kao blijedožuto ulje), dobiveni su željeni spojevi.

Primjeri 152-153

Slijedeći postupak kao u Primjerima 190, 189, 191, 192 i 203, ali uz zamjenu 2-(2-aminoetil)piridina 2-[(2-aminoetilamino)]acetonitrilom (pripremljenim kako slijedi: Otopina jodoacetonitrila (50 mmol) u etil-alkoholu (80 mL) dodana je otopini etilen-diamina (150 mL) u etil-alkoholu (60 mL) pri 0 °C kroz period od 30 minuta. Miješanje je nastavljeno još 1 h pri 0°C, zatim na sobnoj temperaturi kroz 14 sati. Dodano je 55 mmol kalijevog karbonata, miješano je 30 minuta, filtrirano, i filtrat je koncentriran pri sobnoj temperaturi. Ostatak je pročišćen na silikagelu uz elucijsku smjesu kloroform-metanol-vodeni amonijak 80:15:1,5, da bi dao 2-[(2-aminoetilamino)]-acetonitril (3,550 g) koji je odmah korišten), dobiveni su željeni spojevi.

Primjeri 154-158

Slijedeći postupak kao u Primjerima 190, 189, 191, 192 i 203, ali uz zamjenu 2-(2-aminoetil)piridina 1-(3-aminopropil)-azepin-2-onom (pripremljenim prema postupku u Kraft A.: J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 6, 1999, 705-14, osim što je hidroliza DBU provedena pri 145 °C u prisutnosti litijevog hidroksida (1 sat, 5 mL DBU, 2 mL vode, 420 mg litij-hidroksid-hidrata). Pročišćavanje grubog produkta na silikagelu uz elucijsku smjesu kloroform-metanol-vodeni amonijak 80:40:4 dalo je 1-(3-aminopropil)azepin-2-on (4,973 g, prinos 87%)), dobiveni su željeni spojevi.

Primjeri 133-135, 159 i 200

Slijedeći postupak kao u Primjerima 190, 189, 191, 192 i 203, ali uz zamjenu 2-(2-aminoetil)piridina N-acetil-etilen-diaminom (pripremljenim zagrijavanjem smjese etil-acetata s etilen-diaminom (1,5 ekv.) pri 160 °C 1 sat u zatvorenoj posudi. Vakuum-destilacija dala je željeni produkt u prinosu od 56%. N-acetiletilen-diamin također je dostupan od Aldricha), dobiveni su željeni spojevi.

Primjer 146-140

Slijedeći postupak kao u Primjerima 190, 189, 191, 192 i 203, ali uz zamjenu 2-(2-aminoetil)piridina 1-(3-aminopropil)-tetrahidro-pirimidin-2-onom (pripremljenim na isti način kao 1-(3-aminopropil)-azepin-2-on prema postupku u Kraft A.: J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 6, 1999, 705-14: ukratko, 1,3,4,6,7,8-heksahidro-2H-pirimido[1,2-a]pirimidin (4,939 g), litij-hidroksid-hidrat (918 mg) i 2 mL vode zagrijavani su bez otapala u zatvorenoj posudi pri 145 °C 1 sat. Grubi produkt pročišćen je na koloni silikagela u klorofor-metanol-vodenom amonijaku 80:40:4 da bi dao čisti amin (5,265 g, prinos 94%)), dobiveni su željeni spojevi.

Primjeri 141, 160-162 i 185

Slijedeći postupak kao u Primjerima 190, 189, 191, 192 i 203, ali uz zamjenu 2-(2-aminoetil)piridina 1-(2-aminoetil)-piperazin-2-onom (pripremljenim kako slijedi: Čisti terc-butildifenilsilil-klorid (25 mL, 97,7 mmol) dodan je kap po kap u otopinu DBU (19,5 mL, 130 mmol) i bis(2-aminoetil)amina (4,32 mL, 40 mmol) u bezvodnom dimetil-acetamidu (80 mL) pri sobnoj temperaturi nakon hlađenja u vodenoj kupelji 5 minuta. Smjesa je miješana 5 sati. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu, dodan je bromooctena kiselina etil-ester (6,70 mL, 60 mmol). Reakcijska smjesa miješana je 25 minuta, zatim uparena u visokom vakuumu. Ostatak je otopljen u metanolu (200 mL), dodani su KHCO3 (10 g) i KF (12 g, 200 mmol) i smjesa je miješana pri 60 °C 5 sati. Dodano je 10 g Na2CO3, miješano je 10 minuta, ohlađeno i filtrirano. Filtrati su upareni. Ostatak je ekstrahiran heksanima (2 puta 250 mL). Materijal netopljiv u heksanima otopljen je u etanolu (60 mL), filtriran i uparen. Ostatak je pročišćen na koloni silikagela u klorofor-metanol-vodenom amonijaku 80:40:4 da bi dao čisti amin (4,245 g, prinos 74%)), dobiveni su željeni spojevi.

Primjeri 163-167

Slijedeći postupak kao u Primjerima 190, 189, 191, 192 i 203, ali uz zamjenu 2-(2-aminoetil)piridina 3-[(2-aminoetil)amino]propionitrilom (pripremljenim iz etilen-diamina (150 mmol) i akrilonitrila (50 mmol) u THF pri sobnoj temperaturi, kako je opisano u Israel, M. i sur.: J. Med. Chem. 7, 1964, 710-16, što daje željeni amin (4,294 g)), dobiveni su željeni spojevi.

Primjer 168

5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(4-metilpiperazin)-1-il)-etil]-amid

Mutnoj žutoj smjesi 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline (90 mg), DMF (0,8 mL) i TEA (0,084 mL) koja se miješa u reakcijskoj cijevi od 20 mL, dodan je BOP reagens (199 mg). Smjesa je postala bistra za 5 min. U bistru smjesu dodan je 2-(4-metilpiperazin-1-il)etilamin1 (51 mg). Nastala otopina miješana je pri sobnoj temperaturi preko noći. Žuti čvrsti produkti istaloženi su iz reakcijskog sustava. Tankoslojna kromatografija (10% metanol u metilen-kloridu) pokazala je da je sav početni materijal preveden u produkt. Krutina je izolirana vakuum-filtracijom i isprana jedanput etanolom (1 mL). Krutina je sonicirana u dietil-eteru (2 mL) 20 min i prikupljena vakuum-fitlracijom. Nakon sušenja u vakuumu, dobiven je 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(4-metilpiperazin)-1-il)-etil]-amid (79 mg, prinos 62%).

1H NMR (DMSO-d6) δ 2,13 (s, 3H, CH3), 2,40, 2,42 (2×s, 6H, 2×CH3), 2,41 (m, 2H, CH2), 2,47 (m, 8H, 4×CH2), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,82 (dd, J = 4,5 & 8,7 Hz, 1H), 6,91 (td, 2J = 2,4, 3J = 8,8 Hz, 1H), 7,43 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,75 (dd, J = 2,8 & 9,6 Hz, 1H, aromat i vinil), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,67 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 424,4 (M-1).

Primjer 169

5-(5-kloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (4-metilpiperazin)-1-il-etil)-amid

Slijedeći postupak iz Primjera 168, ali uz zamjenu 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline 5-[5-kloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilnom kiselinom (95 mg, 0,3 mmol), dobiven je 5-(5-kloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (4-metilpiperazin)-1-il-etil)-amid (76 mg, 58%).

1H NMR (DMSO-d6) δ 2,13 (s, 3H, CH3), 2,41, 2,42 (2×s, 6H, 2×CH3), 2,42 (m, 2H, CH2), 2,48 (m, 8H, 4×CH2), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,84 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,11 (dd, J = 2,0 & 8,0 Hz, 1H), 7,44 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 7,97 (d, J = 2,0 Hz, 1H, aromat i vinil), 10,98 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 440,2 (M-1).

Primjer 170

5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (4-metilpiperazin)-1-il-etil)-amid

Slijedeći postupak iz Primjera 168, ali uz zamjenu 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline 5-[5-bromo-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilnom kiselinom, dobiven je 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (4-metilpiperazin)-1-il-etil)-amid (39 mg, 54%) iz SU011670 (54 mg, 0,15 mmol).

1H NMR (DMSO-d6) δ 2,14 (s, 3H, CH3), 2,41, 2,42 (2×s, 6H, 2×CH3), 2,42 (m, 2H, CH2), 2,48 (m, 8H, 4×CH2), 3,31 (m, 2H, CH2), 6,80 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,23 (dd, J = 2,0 & 8,0 Hz, 1H), 7,44 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 8,09 (d, J = 2,0 Hz, 1H, aromat i vinil), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,61 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 486,6 (M).

Primjer 172

5-(2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (4-metilpiperazin)-1-il-etil)-amid

Slijedeći postupak iz Primjera 168, ali uz zamjenu 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline SU014900 5-[2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilnom kiselinom, dobiven je 5-(2-okso-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (4-metilpiperazin)-1-il-etil)-amid (136 mg, 84%).

1H NMR (DMSO-d6) δ 2,13 (s, 3H, CH3), 2,39, 2,42 (2×s, 6H, 2×CH3), 2,42 (m, 2H, CH2), 2,48 (m, 8H, 4×CH2), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,86 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,96 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,10 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,41 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 7,41 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 7,62 (s, 1H), 7,76 (d, J = 7,6 Hz, 1H, aromat i vinil), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,61 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 406,6 (M-1).

Primjer 171

5-[2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(3,5-dimetilpiperazin-1-il)etil]amid

Mutnoj žutoj smjesi 5-[2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline (112,8 mg, 0,4 mmol), DMF (0,5 mL) i trietilamina (0,111 mL) koja se miješa u reakcijskoj cijevi od 20 mL, dodan je BOP reagens (265 mg). Smjesa je postala bistra za 5 min. U bistru smjesu dodan je 2-(2,6-dimetilpiperazin-1-il)etilamin (68,6 mg) (v. Tapia, L. Alonso-Cires, P. Lopez-Tudanca, R. Mosquera, L. Labeaga, A. Innerarity, A. Orjales, J. Med. Chem., 1999, 42, 2870-2880). Nastala otopina miješana je pri sobnoj temperaturi preko noći. Tankoslojna kromatografija (10% metanol u metilen-kloridu) pokazala je da je sav početni materijal preveden u produkt. Reakcijska smjesa uparena je dosuha i zatim pročišćena "flash" kromatografijom (CH2Cl2/CH3OH = 20/1-15/1), a nakon toga je rekristalizacija dala 5-[2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(3,5-dimetilpiperazin-1-il)etil]amid (83 mg, prinos 50%).

1H NMR (DMSO-d6) δ 1,15, 1,16 (2×s, 6H, 2×CH3), 1,95 (t, J = 11,6 Hz, 2H, CH2), 2,41, 2,47 (2×s, 6H, 2×CH3), 2,50 (m, 2H, CH2), 3,03 (d, J = 10 Hz, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,86 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,97 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 7,11 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,48 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,75 (d, J = 7,6 Hz, 1H, aromat i vinil), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 422,2 (M+1).

Primjer 173

5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(3,5-dimetilpiperazin-1-il)etil]amid

Slijedeći postupak opisan u Primjeru 168, dobiven je željeni produkt (60 mg, 0,2 mmol).

1H NMR (DMSO-d6) δ 0,891, 0,907 (2×s, 6H, 2×CH3), 1,49 (t, J = 10,4 Hz, 2H), 2,40, 2,42 (2×s, 6H, 2×CH3), 2,41 (m, 2H, CH2), 2,74 (m, 4H), 3,30 (m, 2H), 6,82 (dd, J = 4,5 & 8,7 Hz, 1H), 6,90 (td, 2J = 2,4, 3J = 8,4 Hz, 1H), 7,42 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,74 (dd, J = 4,6 & 8,4 Hz, 1H, aromat i vinil), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,65 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 438,4 (M-1).

Primjer 174

5-[5-kloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(3,5-dimetilpiperazin-1-il)etil]amid

Slijedeći postupak iz Primjera 171, dobiven je željeni produkt (31,2 mg, 34%) iz 5-[5-kloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline (63 mg, 0,2 mmol).

1H NMR (DMSO-d6) δ 1,15, 1,16 (2×s, 6H, 2×CH3), 1,95 (t, J = 11,6 Hz, 2H, CH2), 2,40, 2,42 (2×s, 6H, 2×CH3), 2,50 (m, 2H, CH2), 3,03 (d, J = 11,2 Hz, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,85 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,11 (dd, J = 2,0 & 8,0 Hz, 1H), 7,52 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 7,97 (d, J = 2,0 Hz, 1H, aromat i vinil), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,63 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 456,2 (M+1).

Primjer 175

5-[5-bromo-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(3,5-dimetilpiperazin-1-il)etil]amid

Slijedeći postupak iz Primjera 171, dobiven je željeni produkt (40 mg, 40%) iz 5-[5-bromo-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline (74 mg, 0,2 mmol).

1H NMR (DMSO-d6) δ 1,15, 1,16 (2×s, 6H, 2×CH3), 1,95 (t, J = 11,6 Hz, 2H, CH2), 2,40, 2,42 (2×s, 6H, 2×CH3), 2,50 (m, 2H, CH2), 3,03 (d, J = 11,2 Hz, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,81 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,24 (dd, J = 2,0 & 8,4 Hz, 1H), 7,51 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 8,10 (d, J = 2,0 Hz, 1H, aromat i vinil), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 498,4 (M-1).

Primjer 205

(3Z)-3-[(3,5-dimetil-1H-pirol-2-il)-metiliden]-1-[1-(4-metilpiperazinil)metil]-1,3-dihidro-2H-indol-2-on

N-metilpiperazin (10 g, 100 mmol) dodan je u vodenu otopinu formaldehida (10 g 38%-tne otopine, 100 mmol) i 3-(3,5-dimetil-1H-pirol-2-il-metiliden)-1,3-dihidro-indol-2-ona (2,38 g, 10 mmol) u metanolu (100 mL) uz miješanje. Otopina je zagrijavana na 60 °C 1 h, koncentrirana je na mali volumen i talog je odfiltriran, ispran metanolom i osušen da bi dao 2,38 g spoja iz naslova, t.t. 160-164 °C. HPLC Rt 4,72 min. 1H NMR (CDCl3) δ 2,26 (s, 3H), 2,33 (s, 3H), 2,38 (s, 3H), 2,43 (br s, 4H), 2,70 (br s, 4H), 4,59 (s, 2H), 5,96 (d, 1H), 7,02-7,08 (m, 2H), 7,15 (dd, 1H), 7,38 (s, 1H), 7,48 (dd, 1H) i 13,0 (br s, 1H). Analiza izračunata za C21H26N4O: C, 71,97; H, 7,48; N, 15,99. Nađeno: C, 71,75; H, 7,46; N, 15,87.

(3Z)-3-[(3,5-dimetil-1H-pirol-2-il)-metiliden]-1-[1-(4-metilpiperazinil)metil]-1,3-dihidro-2H-indol-2-on je preveden u dihidrokloridnu sol.

Primjer 206

Sinteza (3Z)-3-[(3,5-dimetil-1H-pirol-2-il)-metiliden]-1-(1-pirolidinmetil)-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona

Pirolidin (450 mg, 6,3 mmol) je dodan u vodenu otopinu formaldehida (500 mg 38%-tne otopine, 6,0 mmol) i 3-(3,5-dimetil-1H-pirol-2-il-metiliden)-1,3-dihidro-indol-2-ona (900 mg, 3,8 mmol) u metanolu (50 mL) uz miješanje. Nakon 15 min, otopina je ohlađena na 0 °C, a talog je odfiltriran, ispran vodom i osušen da bi dao 1,08 g spoja iz naslova, t.t. 129-132 °C. HPLC Rt 4,87 min. 1H NMR [(CD3)2SO] δ 1,65 (m, 4H), 2,32 (s, 3H), 2,34 (s, 3H), 2,62 (m, 4H), 4,72 (s, 2H), 6,07 (s, 2H), 6,07 (d, 1H), 7,00 (m, 1H), 7,15 (m, 2H), 7,61 (s, 1H), 7,76 (d, 2H) i 13,1 (br s, 1H). Analiza izračunata za C20H23N3O: C, 74,74; H, 7,21; N, 13,07. Nađeno: C, 74,61; H, 7,25; N, 13,03.

Biološki primjeri

Inhibitori protein-kinaze, formule (I):

Sljedeći testovi mogu se koristiti za određivanje razine aktivnosti i učinka spojeva formule (I) na jednu ili više protein-kinaza (nadalje PK). Slične testove moguće je dizajnirati na analogan način za bilo koje PK upotrebom tehnika poznatih struci.

Procedure za testove

Neki od ovdje opisanih testova izvedeni su u ELISA-načinu (Enzyme-Linked Immunosorbent Sandwich Assay, Voller i sur., 1980, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay", Manual of Clinical Immunology, 2nd ed., Rose i Friedman, Am. Soc. of Microbiology, Washington, D.C., str. 359-371). Opći postupak je kako slijedi: spoj formule (I) uveden je u stanice koje eksprimiraju testiranu kinazu, bilo prirodno ili rekombinantno, u određenom vremenskom periodu nakon kojeg se, ukoliko je testirana kinaza receptor, dodaje ligand za koji je poznato da aktivira receptor. Stanice se liziraju i lizat se prenese u jažice ELISA ploče, prethodno prekrivene specifičnim protutijelom koje prepoznaje supstrat reakcije enzimske fosforilacije. Ne-supstratne komponente staničnog lizata isperu se, a količina fosforilacije supstrata detektira se protutijelom koje specifično prepoznaje fosfotirozin, u usporedbi s kontrolnim stanicama koje nisu bile u kontaktu s ispitivanim spojem.

Ovdje poželjni protokoli za provođenje ELISA eksperimenata za specifične PK navedeni su u nastavku. Međutim, prilagodba tih protokola za određivanje aktivnosti spojeva protiv drugih receptorskih tirozin-kinaza (RTK), kao i za citoplazmatske tirozin-kinaze (CTK) i serin-treonin-kinaze (STK) također je obuhvaćena znanjem stručnjaka područja. Drugi ovdje opisani testovi mjere količinu DNA nastalu kao odgovor na aktivaciju testirane kinaze, što je opća mjera proliferativnog odgovora. Opći postupak tog testa je kako slijedi: spoj se uvodi u stanice koje eksprimiraju testiranu kinazu, bilo prirodno ili rekombinantno, u određenom vremenskom periodu nakon kojeg se, ukoliko je testirana kinaza receptor, dodaje ligand za koji je poznato da aktivira receptor. Nakon inkubacije barem preko noći, dodaje se sredstvo za obilježavanje DNA, kao što je 5-bromodeoksiuridin (BrdU) ili 3H-timidin. Količina obilježene DNA detektira se ili s anti-BrdU protutijelom ili mjerenjem radioaktiviteta i uspoređuje se s kontrolnim stanicama koje nisu bile u kontaktu s ispitivanim spojem.

GST-FLK-1 BIOTEST

Ovaj test analizira aktivnost tirozin-kinaze GST-Flk 1 na poli (glu, tyr) peptidima.

Materijali i reagensi:

Corning ELISA ploče od 96 jažica (Corning kataloški broj 5805-96).

poli (glu, tyr) 4:1, liofilizat (Sigma, kataloški broj #P0275).

Priprema poli (glu, tyr)(pEY) prekrivenih ploča za testiranje: nanijeti 2 μg/jažici poli (glu, tyr)(pEY) u 100 μL PBS, inkubirati na sobnoj temperaturi 2 sata ili na 4 °C preko noći. Dobro prekriti ploče da bi se spriječilo isparavanje.

PBS pufer: za 1 L, pomiješati 0,2 g KH2PO4, 1,15 g Na2HPO4, 0,2 g KCl i 8 g NaCl u približno 900 mL dH2O. Kad se svi reagensi otope, prilagoditi pH na 7,2 dodatkom HCl. Nadopuniti do ukupnog volumena od 1 L dodatkom dH2O.

PBST pufer: 1 L PBS pufera dodati 1,0 mL Tween-20.

TBB - pufer za blokiranje: za 1 L, pomiješati 1,21 g TRIS, 8,77 g NaCl, 1 mL Tween-20 u približno 900 mL dH2O. Prilagoditi pH do 7,2 dodatkom HCl. Dodati 10 g BSA, miješanjem otopiti. Nadopuniti do ukupnog volumena od 1 L dodatkom dH2O. Filtrirati da se ukloni preostali materijal.

1% BSA u PBS: za 1× radnu otopinu, dodati 10 g BSA u približno 990 mL PBS pufera, miješanjem otopiti. Prilagoditi ukupni volumen do 1 L pomoću PBS pufera, filtrirati da se ukloni preostali materijal.

50 mL Hepes pH 7,5.

GST-Flk 1 cd pročišćeno od sf9 rekombinantne transformaije bakulovirusom (SUGEN, Inc.).

4% DMSO u dH2O.

10 mM ATP u dH2O.

40 mM MnCl2.

Pufer za razrijeđenje kinaze (Kinase Dilution Buffer, KDB): pomiješati 10 mL Hepes (pH 7,5), 1 mL 5M NaCl, 40 μL 100 mM natrijevog ortovanadata i 0,4 mL 5% BSA u dH2O s 88,56 mL dH2O.

NUNC polipropilenske ploče od 96 jažica s V-dnom, Applied Scientific Catalog #AS-72092.

EDTA: pomiješati 14,12 etilendiamintetraoctene kiseline (EDTA) u približno 70 mL dH2O. Dodati 10N NaOH dok se EDTA ne otopi. Prilagoditi pH na 8,0. Prilagoditi ukupni volumen na 100 mL dodatkom dH2O.

1° pufer za razrijeđenje protutijela: pomiješati 10 mL 5% BSA u PBS puferu s 89,5 mL TBST.

Anti-fosfotirozinsko monoklonsko protutijelo konjugirano na peroksidazu iz hrena (PY99 HRP, Santa Cruz Biotech).

2,2'-azinobis(3-etilbenztiazolin)-6-sulfonska kiselina (ABTS, Moss, kat. br. ABST).

10% SDS.

Postupak:

Prekriti Corning ELISA ploče od 96 jažica s 2 μg poliEY peptida u sterilnom PBS, kako je opisano u koraku 3 poglavlja "Materijali i reagensi".

Ukloniti nevezanu tekućinu iz jažica okretanjem ploče. Isprati jednom s TBST. Ocijediti ploču na papirnatom ručniku da se ukloni suvišak tekućine.

Dodati 100 μL 1% BSA u PBS u svaku jažicu. Inkubirati 1 sat na sobnoj temperaturi, uz potresanje.

Ponoviti korak 2.

Natopiti jažice s 50 mM HEPES (pH 7,5) (150 μL/jažici).

Razrijediti ispitivani spoj s dH2O/4% DMSO do 4 puta od poželjne konačne koncentracije u testu u polipropilenskim pločama od 96 jažica.

Dodati 25 μL razrijeđenog ispitivanog spoja na ELISA ploču. U kontrolne jažice, nanijeti 25 μL dH2O/4% DMSO.

Dodati 25 μL 40 mM MnCl2 s 4× ATP (2 μM) u svaku jažicu.

Dodati 25 μL 0,5 M EDTA u jažice za negativnu kontrolu.

Razrijediti GST-Flk 1 na 0,005 μg (5 ng)/jažici s KDB.

Dodati 50 μL razrijeđenog enzima u svaku jažicu.

Inkubirati 15 minuta na sobnoj temperaturi, uz potresanje.

Zaustaviti reakciju dodatkom 50 μL 250 mM EDTA (pH 8,0).

Isprati 3× TBST i ocijediti ploču na papirnatom ručniku da se ukloni suvišak tekućine.

Dodati 100 μL po jažici anti-fosfotirozin HRP konjugata, razrijeđenje 1:5000 u puferu za razrijeđivanje protutijela. Inkubirati 90 min na sobnoj temperaturi, uz potresanje.

Isprati kao u koraku 14.

Dodati 100 μL otopine ABTS pri sobnoj temperaturi u svaku jažicu.

Inkubirati, uz potresanje, 10 do 15 minuta. Ukloniti mjehuriće.

Zaustaviti reakciju dodatkom 20 μL 10% SDS u svaku jažicu.

Očitati rezultate na Dynatech MR7000 ELISA čitaču s test-filterom na 410 nM i referentnim filterom na 630 nM.

PYK2 BIOTEST

Ovaj test koristi se za mjerenje kinazne aktivnosti in vitro HA epitop-obilježenog pyk2 pune dužine (FL.pyk2-HA) u ELISA testu.

Materijali i reagensi:

Corning Elisa ploče od 96 jažica.

12CA5 monoklonsko anti-HA protutijelo (SUGEN, Inc.).

PBS (Dulbeccov Phosphate-Buffered Saline, Gibco katalog #450-1300EB).

TBST pufer: za 1 L, pomiješati 8,766 g NaCl, 6,057 g TRIS i 1 mL 0,1% Triton X-100 u približno 900 mL dH2O. Prilagoditi pH na 7,2, nadopuniti volumen do 1 L.

Pufer za blokiranje: za 1 L, pomiješati 100 g 10% BSA, 12,1 g 100 mM TRIS, 58,44 g 1M NaCl i 10 mL 1% Tween-20.

FL.pyk2-HA iz sf9 staničnih lizata (SUGEN, Inc.).

4% DMSO u MilliQue H2O.

10 mM ATP u dH2O.

1M MnCl2.

1M MgCl2.

1M ditiotreitol (DTT).

10× kinazni fosforilacijski pufer: pomiješati 5,0 mL 1M Hepes (pH 7,5), 0,2 mL 1M MnCl2, 1,0 mL 1M MgCl2, 1,0 mL 10% Triton X-100 u 2,8 mL dH2O. Prije upotrebe dodati 0,1 mL 1M DTT.

NUNC polipropilenske ploče od 96 jažica s V-dnom.

500 mM EDTA u dH2O.

Pufer za razrijeđivanje protutijela: za 100 mL, 1 mL 5% BSA/PBS 1 mL 10% Tween-20 u 88 mL TBS.

HRP-konjugirano anti-Ptyr PY99, Santa Cruz Biotech kat. br. SC-7020.

ABTS, Moss, kat. br. ABST-2000.

10% SDS.

Postupak:

Prekriti Corning ELISA ploče od 96 jažica s 0,5 μg po jažici 12CA5 anti-HA protutijela u 100 μL PBS. Pohraniti preko noći na 4 °C.

Ukloniti nevezano HA protutijelo iz jažica okretanjem ploče. Isprati ploču dH2O. Ocijediti ploču na papirnatom ručniku da se ukloni suvišak tekućine.

U svaku jažicu dodati 150 μL pufera za blokiranje. Inkubirati, uz potresanje, 30 min pri sobnoj temperaturi.

Isprati ploču 4× TBS-T.

Razrijediti lizat u PBS (1,5 μg lizata/100 μL PBS).

U svaku jažicu dodati 100 μL razrijeđenog lizata. Potresati pri sobnoj temperaturi 1 sat.

Isprati kao u koraku 4.

Dodati 50 μL 2× kinaznog pufera na ELISA ploču koja sadrži vezano pyk2-HA.

Dodati 25 μL 400 μM ispitivanog spoja u 4% DMSO u svaku jažicu. Za kontrolne jažice koristiti samo 4% DMSO.

Dodati 25 μL EDTA u jažice za negativnu kontrolu.

Dodati 25 μL 20 μM ATP u sve jažice. Inkubirati, uz potresanje, 10 minuta.

Zaustaviti reakciju dodatkom 25 μL 500 mM EDTA (pH 8,0) u sve jažice.

Isprati kao u koraku 4.

U svaku jažicu dodati 100 μL HRP-konjugiranog anti-ptyr razrijeđenog 1:6000 u puferu za razrijeđivanje protutijela. Inkubirati, uz potresanje, 1 sat na sobnoj temperaturi.

Isprati ploču 3× s TBST i 1× s PBS.

Dodati 100 μL ABST otopine u svaku jažicu.

Ukoliko je potrebno, zaustaviti reakciju razvijanja dodatkom 20 μL 10% SDS u svaku jažicu.

Očitati ploču na ELISA čitaču s test-filterom na 410 nM i referentnim filterom na 630 nM.

FGFR1 BIOTEST

Ovaj test koristi se za mjerenje kinazne aktivnosti FGF1-R in vitro u ELISA-testu.

Materijali i reagensi:

Costar Elisa ploče od 96 jažica (Corning katalog #3369).

Poli(Glu-Tyr) (Sigma katalog #PO275).

PBS (Gibco katalog #450-1300EB).

50 mM Hepes puferska otopina

Pufer za blokiranje (5% BSA/PBS).

Pročišćeni GST-FGFR1 (SUGEN, Inc.).

Pufer za razrijeđenje kinaze.

Pomiješati 500 μL 1M Hepes (GIBCO), 20 μL 5% BSA/PBS, 10 μL 100 mM natrijevog ortovanadata i 50 μL 5M NaCl.

10 mM ATP

Smjesa za fosforilaciju ATP/MnCl2: pomiješati 20 μL ATP, 400 μL 1M MnCl2 i 9,56 mL dH2O.

NUNC polipropilenske ploče od 96 jažica s V-dnom (Applied Scientific Catalog #AS-72092).

0,5M EDTA.

0,05% TBST.

Dodati 500 μL Tween na 1 L TBS.

Poliklonski anti-fosfotirozinski serum kunića (SUGEN, Inc.).

Anti-zečji IgG peroksidazni konjugat iz koze (Biosource, katalog #AL10404).

Otopina ABTS.

Otopina ABTS/H2O2.

Postupak:

Prekriti Costar ELISA ploče od 96 jažica s 1 μg po jažici poli(Glu,Tyr) u 100 μL PBS. Pohraniti preko noći na 4 °C.

Isprati prekrivene ploče jedanput s PBS.

Dodati 150 μL 5% BSA/PBS pufera za blokiranje u svaku jažicu. Inkubirati, uz potresanje, 1 h na sobnoj temperaturi.

Isprati ploču 2× s PBS, zatim jednom s 50 mM Hepes. Ocijediti ploče na papirnatom ručniku da se ukloni suvišak tekućine i mjehurići.

Dodati 25 μL 0,4M ispitivanog spoja u 4% DMSO ili 4% samog DMSO (kontrola) na ploču.

Razrijediti pročišćeni GST-FGFR1 u puferu za razrijeđivanje kinaze (5 ng kinaze/50 μL KDB/jažici).

Dodati 50 μL razrijeđene kinaze u svaku jažicu.

Započeti reakciju kinaze dodatkom 25 μL/jažici svježe pripremljenog ATP/Mn++ (0,4 mL 1M MnCl2, 40 μL 10 mM ATP, 9,56 mL dH2O).

Ovo je brza reakcija kinaze i mora se zaustaviti dodatkom 25 μL 0,5M EDTA slično kao što je dodan ATP.

Isprati ploču 4× svježim TBST.

Prirediti pufer za razrijeđenje protutijela: za 50 mL:

Pomiješati 5 mL 5% BSA, 250 μL 5% mlijeka i 50 μL 100 mM natrijevog vanadata, nadopuniti do ukupnog volumena 0,05% TBST.

Dodati 100 μL po jažici anti-fosfotirozina (1:10000 razrijeđenje u ADB).

Inkubirati, uz potresanje, 1 h na sobnoj temperaturi.

Isprati kao u koraku 10.

Dodati 100 μL po jažici Biosource anti-zečjeg IgG peroksidaznog konjugata koze (1:6000 razrijeđenje u ADB). Inkubirati, uz potresanje, 1 h na sobnoj temperaturi.

Isprati kao u koraku 10, zatim s PBS, da se uklone mjehurići i suvišak Tween.

Dodati 100 μL otopine ABTS/H2O2 u svaku jažicu.

Inkubirati, uz potresanje, 10 do 20 minuta. Ukloniti mjehuriće.

Očitati test na Dynatech MR7000 elisa čitaču: test-filter na 410 nM, referentni filter na 630 nM.

EGFR BIOTEST

Materijali i reagensi:

Corning Elisa ploče od 96 jažica.

SUMO1 monoklonsko anti-EGFR protutijelo (SUGEN, Inc.).

PBS.

TBST pufer.

Pufer za blokiranje: za 100 mL, pomiješati 5,0 g Carnation Instant Non-fat Milk® i 100 mL PBS.

Lizat A431 stanica (SUGEN, Inc.).

TBS pufer.

TBS + 10% DMSO: za 1 L, pomiješati 1,514 g Tris, 2,192 g NaCl i 25 mL DMSO; nadopuniti do ukupnog volumena od 1 L s dH2O.

ATP (adenozin-5'-trifosfat, iz konjskog mišića, Sigma kat. br. A-5394), 1,0 M otopina u dH2O. Ovaj reagens mora se prirediti neposredno prije upotrebe i držati na ledu.

1,0 mM MnCl2.

Smjesa ATP/MnCl2 za fosforilaciju: za priređivanje 10 mL, pomiješati 300 μL 1 mM ATP, 500 μL MnCl2 i 9,2 mL dH2O. Pripremiti neposredno prije upotrebe, držati na ledu.

NUNC polipropilenske ploče od 96 jažica s V-dnom.

EDTA.

Poliklonski anti-fosfotirozinski serum kunića (SUGEN, Inc.).

Anti-zečji IgG peroksidazni konjugat iz koze (Biosource, kat.br. AL10404).

ABTS.

30%-tni vodikov peroksid.

ABTS/H2O2.

0,2 M HCl.

Postupak:

Prekriti Corning ELISA ploče od 96 jažica s 0,5 μg SUMO1 u 100 μL PBS po jažici, pohraniti preko noći na 4 °C.

Ukloniti nevezano SUMO1 iz jažica okretanjem ploče radi uklanjanja tekućine. Isprati 1× dH2O. Ocijediti ploču na papirnatom ručniku da se ukloni suvišak tekućine.

Dodati 150 μL pufera za blokiranje u svaku jažicu. Inkubirati, uz potresanje, 30 min na sobnoj temperaturi.

Isprati ploču 3× deioniziranom vodom, zatim jednom s TBST. Ocijediti ploču na papirnatom ručniku da se ukloni suvišak tekućine i mjehurići.

Razrijediti lizat u PBS (7 μg lizata/100 μL PBS).

Dodati 100 μL razrijeđenog lizata u svaku jažicu. Potresati na sobnoj temperaturi 1 h.

Isprati ploče kao u koraku 4 ranije.

Dodati 120 μL TBS na ELISA ploču koja sadrži vezani EGFR.

Razrijediti ispitivani spoj 1:10 u TBS, nanijeti u jažice.

Dodati 13,5 μL razrijeđenog ispitivanog spoja na ELISA ploču. U kontrolne jažice, dodati 13,5 μLTBS u 10% DMSO.

Inkubirati, uz potresanje, 30 minuta na sobnoj temperaturi.

Dodati 15 μL smjese za fosforilaciju u sve jažice osim u jažice koje služe kao negativna kontrola. Konačni volumen jažice treba biti približno 150 μL s konačnim koncentracijama 3 μM ATP/5 mM MnCl2 u svakoj jažici. Inkubirati, uz potresanje, 5 minuta.

Zaustaviti reakciju dodatkom 16,5 μL otopine EDTA, uz potresanje. Potresati još 1 min.

Isprati 4× deioniziranom vodm i 2× TBST.

Dodati 100 μL anti-fosfotirozina (razrijeđenje 1:3000 u TBST) po jažici. Inkubirati, uz potresanje, 30-45 min na sobnoj temperaturi.

Isprati kao u koraku 4, ranije.

Dodati 100 μL Biosource anti-zečjeg IgG peroksidaznog konjugata koze (1:2000 razrijeđenje u TBST) u svaku jažicu. Inkubirati, uz potresanje, 30 min na sobnoj temperaturi.

Isprati kao u koraku 4, ranije.

Dodati 100 μL otopine ABTS/H2O2 u svaku jažicu.

Inkubirati 5 do 10 minuta uz potresanje. Ukloniti mjehuriće.

Ukoliko je potrebno, zaustaviti reakciju dodatkom 100 μL 0,2 M HCl po jažici.

PDGFR BIOTEST

Materijali i reagensi:

Corning Elisa ploče od 96 jažica.

28D4C10 monoklonsko anti-PDGFR protutijelo (SUGEN, Inc.).

PBS.

TBST pufer.

Pufer za blokiranje (isti kao za EGFR biotest).

Lizat NIH 3T3 stanica koje eksprimiraju PDGFR-β (SUGEN, Inc.).

TBS pufer.

TBS + 10% DMSO.

ATP.

MnCl2.

Smjesa kinaznog pufera za fosforilaciju: za 10 mL, pomiješati 250 μL 1M TRIS, 200 μL 5 mM NaCl, 100 μL 1M MnCl2 i 50 μL 100 mM Triton X-100 u dovoljno dH2O za pripremu 10 mL.

NUNC polipropilenske ploče od 96 jažica s V-dnom.

EDTA.

Poliklonski anti-fosfotirozinski serum kunića (SUGEN, Inc.).

Anti-zečji IgG peroksidazni konjugat iz koze (Biosource, kat.br. AL10404).

ABTS.

30%-tni vodikov peroksid.

ABTS/H2O2.

0,2 M HCl.

Postupak:

Prekriti Corning ELISA ploče od 96 jažica s 0,5 μg 28D4C10 u 100 μL PBS po jažici, pohraniti preko noći na 4 °C.

Ukloniti nevezano 28D4C10 iz jažica okretanjem ploče radi uklanjanja tekućine. Isprati 1× dH2O. Ocijediti ploču na papirnatom ručniku da se ukloni suvišak tekućine.

Razrijediti lizat u HNTG (10 μg lizata/100 μL HNTG).

Dodati 100 μL razrijeđenog lizata u svaku jažicu. Potresati na sobnoj temperaturi 60 min.

Isprati ploče kao u koraku 4 ranije.

Dodati 80 μL radne smjese kinaznog pufera na ELISA ploču koja sadrži vezani PDGFR.

Razrijediti ispitivani spoj 1:10 u TBS na polipropilenskim pločama od 96 jažica.

Dodati 10 μL razrijeđenog ispitivanog spoja na ELISA ploču. U kontrolne jažice, dodati 10 μLTBS + 10% DMSO. Inkubirati, uz potresanje, 30 minuta na sobnoj temperaturi.

Dodati 10 μL ATP izravno u sve jažice osim u jažicu za negativnu kontrolu (konačni volumen u jažici treba biti približno 100 μL s 20 μM ATP u svakoj jažici). Inkubirati 30 minuta uz potresanje.

Zaustaviti reakciju dodatkom 10 μL otopine EDTA u svaku jažicu.

Isprati 4× deioniziranom vodm i dvaput TBST.

Isprati kao u koraku 4, ranije.

Dodati 100 μL otopine ABTS/H2O2 u svaku jažicu.

Inkubirati 10 do 30 minuta uz potresanje. Ukloniti mjehuriće.

Ukoliko je potrebno, zaustaviti reakciju dodatkom 100 μL 0,2 M HCl po jažici.

STANIČNI HER-2 KINAZNI TEST

Ovaj test koristi se za mjerenje aktivnosti HER-2 kinaze u stanicama pomoću ELISA testa.

Materijali i reagensi:

DMEM (GIBCO katalog #11965-092).

Fetalni goveđi serum (FBS, GIBCO katalog #16000-044), toplinski inaktiviran u vodenoj kupelji 30 min na 56 °C.

Tripsin (GIBCO katalog #25200-056).

L-glutamin (GIBCO katalog #25030-081).

HEPES (GIBCO katalog #15630-080).

Medij za rast

Pomiješati 500 mL DMEM, 55 mL toplinski inaktiviranog FBS, 10 mL HEPES i 5,5 mL L-glutamina.

Medij za gladovanje

Pomiješati 500 mL DMEM, 2,5 mL toplinski inaktiviranog FBS, 10 mL HEPES i 5,5 mL L-glutamina.

PBS.

Mikrotitarske ploče za tkivne kulture od 96 jažica s ravnim dnom (Corning katalog #25860).

Posude za tkivne kulture od 15 cm (Corning katalog #08757148).

Corning ELISA ploče od 96 jažica.

NUNC polipropilenske ploče od 96 jažica s V-dnom.

Costar patrone za prijenos Transtar 96 (Costar katalog #7610).

SUMO1: monoklonsko anti-EGFR protutijelo (SUGEN, Inc.).

TBST pufer.

Pufer za blokiranje: 5% Carnation Instant Milk® u PBS.

EGF ligand: EGF-201, Shinko American, Japan. Suspendirati prah u 100 μL 10 mM HCl. Dodati 100 μL 10 mM NaOH. Dodati 800 μL PBS i prenijeti u Eppendorf epruvetu, pohraniti na -20 °C do primjene.

HNTG pufer za lizu.

Za stock 5×HNTG, pomiješati 23,83 g Hepes, 43,83 g NaCl, 500 mL glicerola i 100 mL Triton X-100 i dovoljno dH2O za pripremu ukupno 1 L otopine.

Za 1× HNTG*, pomiješati 2 mL HNTG, 100 μL 0,1 M Na3VO4, 250 μL 0,2 M Na4P2O7 i 100 μL EDTA.

EDTA.

Na3VO4. Za pripremu stock otopine, pomiješati 1,84 g Na3VO4 i 90 mL dH2O. Prilagoditi pH na 10. Kuhati u mikrovalnoj pećnici 1 minutu (otopina postaje bistra). Ohladiti na sobnu temperaturu. Prilagoditi pH na 10. Ponoviti grijanje i hlađenje dok pH ne ostane na 10.

200 mM Na4P2O7.

Poliklonski antiserum kunića specifičan za fosfotirozin (anti-Ptyr protutijelo, SUGEN, Inc.).

Pročišćen afinitetni antiserum, anti-zečje IgG protutijelo koze, peroksidazni konjugat (Biosource Cat #AL10404).

Otopina ABTS.

30%-tna otopina vodikovog peroksida.

ABTS/H2O2.

0,2 M HCl.

Postupak:

Prekriti Corning ELISA ploče od 96 jažica s 1,0 μg SUMO1 PBS po jažici, konačni volumen 100 μL po jažici. Pohraniti preko noći na 4 °C.

Na dan upotrebe, ukloniti pufer za prekrivanje i isprati ploču 3 puta dH2O i jednom TBST puferom. Sva ispiranja u ovom testu trebaju se izvesti na ovaj način, ukoliko drukčije nije naznačeno.

Dodati 100 μL pufera za blokiranje u svaku jažicu. Inkubirati ploču, uz potresanje, 30 min na sobnoj temperaturi. Isprati ploču neposredno prije upotrebe.

Za ovaj test koristiti EGFr/HER-2 kimernu/3T3-C7 staničnu liniju.

Izabrati posude s konfluencijom 80-90%. Prikupiti stanice tripsinizacijom i centrifugirati na 1000 rpm na sobnoj temperaturi 5 min.

Resuspendirati stanice u mediju za gladovanje i izbrojati pomoću trypan-blue. Potrebna je vijabilnost iznad 90%. Nasaditi stanice u mediju za gladovanje u gustoći od 2500 stanica po jažici, 90 μL po jažici, u mikrotitarske pločice od 96 jažica. Inkubirati nasađene stanice preko noći na 37 °C uz 5% CO2.

Započeti test dva dana nakon nasađivanja.

Ispitivani spojevi otopljeni su u 4% DMSO. Uzorci su dodatno razrijeđeni izravno na pločama s medijem za gladovanje-DMEM. Tipično, ovo razrijeđenje bit će 1:10 ili veće. Sve jažice zatim se prenesu na ploču sa stanicama u dodatnom 1:10 razrijeđenju (10 μL uzorka i medija u 90 μL medija za gladovanje). Konačna koncentracija DMSO treba biti 1% ili manja. Može se koristiti i standardno serijsko razrijeđenje.

Inkubirati uz 5% CO2 pri 37 °C 2 sata.

Pripremiti EGF ligand razrijeđivanjem stock-otopine EGF (16,5 μM) u toplom DMEM na 150 nM.

Pripremiti svježi HNTG* u količini dovoljnoj za 100 μL po jažici; staviti na led.

Nakon 2 sata inkubacije s ispitivanim spojem, dodati pripremljni EGF ligand na stanice, 50 μL po jažici, do konačne koncentracije od 50 nM. Jažice za pozitivnu kontrolu primit će istu količinu EGF. Negativna kontrola ne dobija EGF. Inkubirati na 37 °C 10 min.

Ukloniti ispitivani spoj, EGF i DMEM. Isprati stanice jedanput s PBS.

Prenijeti HNTG* na stanice, 100 μL po jažici. Ostaviti na ledu 5 minuta. U međuvremenu, ukloniti pufer za blokiranje s ELISA ploče i isprati.

Sastrugati stanice s ploče pomoću mikropipetora i homogenizirati stanični materijal opetovanim usisavanjem i dispenziranjem HNTG* pufera za lizu. Prenijeti lizat na prekrivene, blokirane i isprane ELISA ploče. Ili koristiti Costar patrone za prijenos lizata na ploču.

Inkubirati, uz potresanje, na sobnoj temperaturi 1 sat.

Ukloniti lizat i isprati. Prenijeti svježe razrijeđeno anti-Ptyr protutijelo (1:3000 u TBST) na ELISA ploču, 100 μL po jažici.

Inkubirati, uz potresanje, na sobnoj temperaturi 30 min.

Ukloniti anti-Ptyr protutijelo, isprati. Prenijeti svježe razrijeđeno BIOSOURCE protutijelo na ELISA ploču (1:8000 u TBST, 100 μL po jažici).

Inkubirati, uz potresanje, na sobnoj temperaturi 30 min.

Ukloniti BIOSOURCE protutijelo, isprati. Prenijeti svježe pripremljenu otopinu ABTS/H2O2 na ELISA ploču, 100 μL po jažici.

Inkubirati, uz potresanje, 5-10 minuta. Ukloniti mjehuriće.

Zaustaviti reakciju dodatkom 100 μL 0,2M HCl po jažici.

CDK2/CIKLIN A TEST

Ovaj test koristi se za mjerenje serin/treonin-kinazne aktivnosti ljudskog cdk2/ciklina A in vitro u Testu blizine scintilacije (Scintillation Proximity Assay, SPA).

Materijali i reagensi:

Wallac polietilen-tereftalatne (flexi) ploče od 96 jažica (Wallac Catalog #1450-401).

Amerham Redivue [γ33P] ATP (Amersham Catalog #AH 9968).

Amersham poliviniltoluenske SPA kuglice prekrivene streptavidinom (Amersham catalog #RPNQ0007). Kuglice treba rekonstituirati u PBS bez magnezija ili kalcija, na 20 mg/mL.

Aktivirani cdk2/ciklin A enzimski kompleks, pročišćen iz Sf9 stanica (SUGEN, Inc.).

Biotinilirani peptidni supstrat (Debtide). Peptid biotin-X-PKTPKKAKKL je otopljen u dH2O u koncentraciji od 5 mg/mL.

Smjesa peptida/ATP: za 10 mL, pomiješati 9,979 mL dH2O, 0,00125 mL "hladnog" ATP, 0,010 mL Debtide i 0,010 mL [γ33P] ATP. Konačna koncentracija po jažici bit će 0,5 μM "hladnog" ATP, 0,1 μg Debtide i 0,2 μCi [γ33P] ATP.

Kinazni pufer: za 10 mL, pomiješati 8,85 mL dH2O, 0,625 mL TRIS (pH 7,4), 0,25 mL 1M MgCl2, 0,25 mL 10% NP40 i 0,025 mL 1M DTT, dodano svježe neposredno prije upotrebe.

10 mM ATP u dH2O.

1M Tris, pH prilagođen na 7,4 pomoću HCl.

1M MgCl2.

1M DTT.

PBS (Gibco Catalog #14190-144).

0,5M EDTA.

Otopina za zaustavljanje: za 10 mL, pomiješati 9,25 mL PBS, 0,005 mL 100 mM ATP, 0,1 mL 0,5M EDTA, 0,1 mL 10% Triton X-100 i 1,25 mL 20 mg/mL SPA kuglica.

Postupak:

Pripremiti otopine ispitivanih spojeva u 5× željene konačne koncentracije u 5% DMSO. Dodati 10 μL u svaku jažicu. Za negativne kontrole, koristiti 10 μL samog 5% DMSO u jažicama.

Razrijediti 5 μL otopine cdk2/ciklina A s 2,1 mL 2× kinaznog pufera.

Dodati 20 μL enzima u svaku jažicu.

Dodati 10 μL 0,5M EDTA u jažice za negativnu kontrolu.

Za započinjanje kinazne reakcije, dodati 20 μL smjese peptida/ATP u svaku jažicu. Inkubirati 1 sat bez potresanja.

Dodati 200 μL otopine za zaustavljanje u svaku jažicu.

Držati barem 10 minuta.

Centrifugirati ploču na približno 2300 rpm 3-5 min.

Brojati ploču pomoću Trilux ili sličnog čitača.

TEST MET TRANSFOSFORILACIJE

Ovaj test koristi se za mjerenje razine fosfotirozina na poli(glutaminska kiselina:tirozin (4:1)) supstrata kao postupak identifikacije agonista/antagonista met-transfosforilacije supstrata.

Materijali i reagensi:

Corning Elisa ploče od 96 jažica, Corning catalog #25805-96.

Poli(glu,tyr) 4:1, Sigma, kat. br. P0275.

PBS, Gibco catalog #450-1300EB

50 mM HEPES

Pufer za blokiranje: otopiti 25 g goveđeg serumskog albumina, Sigma kat br. A7888, u 500 mL PBS, filtrirati kroz 4 μm filter.

Pročišćeni GST fuzijski protein koji sadrži domenu Met-kinaze, Sugen Inc.

TBST pufer.

10%-tni vodeni (MilliQue H2O) DMSO.

10 mM vodeni (dH2O) adenozin-5'-trifosfat, Sigma kat. br. A5394.

2× pufer za razrijeđenje kinaze: za 100 mL, pomiješati 10 mL 1M HEPES, pH 7,5, s 0,4 mL 5% BSA/PBS, 0,2 mL 0,1 M natrijevog ortovanadata i 1 mL 5 M natrijevog klorida u 88,4 mL dH2O.

4× ATP reakcijska smjesa: za 10 mL, pomiješati 0,4 mL 1 M manganovog klorida i 0,02 mL 0,1 M ATP u 9,56 mL dH2O.

4× smjesa za negativnu kontrolu: za 10 mL, pomiješati 0,4 mL 1 M manganovog klorida u 9,6 mL dH2O.

NUNC polipropilenske ploče od 96 jažica s V-dnom, Applied Scientific Catalog #S-72092.

500 mM EDTA.

Pufer za razrijeđivanje protutijela: za 100 mL, pomiješati 10 mL 5% BSA/PBS, 0,5 mL 5% Carnation Instant Milk® u PBS i 0,1 mL natrijevog ortovanadata u 88,4 mL TBST.

Poliklonsko antifosfotirozinsko protutijelo kunića, Sugen, Inc.

Anti-zečje protutijelo konjugirano na peroksidazu hrena, iz koze, Biosource, Inc.

ABTS otopina: za 1 L, pomiješati 19,21 g limunske kiseline, 35,49 g Na2HPO4 i 500 mg ABTS s dovoljno dH2O za pripremu 1 L.

ABTS/H2O2: pomiješati 15 mL ABTS otopine s 2 μL H2O2 pet minuta prije upotrebe.

0,2 M HCl.

Postupak:

Prekriti ELISA ploče s 2 μg poli(Glu-Tyr) u 100 μL PBS, pohraniti preko noći na 4 °C.

Blokirati ploču sa 150 μL 5% BSA/PBS kroz 60 min.

Isprati ploču dvaput s PBS, jednom s 50 mM Hepes puferom pH 7,4.

Dodati 50 μL razrijeđene kinaze u sve jažice. (Pročišćena kinaza razrijeđena je s puferom za razrijeđivanje kinaze. Konačna koncentracija treba biti 10 ng/jažici.)

Dodati 25 μL ispitivanog spoja (u 4% DMSO) ili sam DMSO (4% u dH2O) kao kontrolu na ploču.

Inkubirati smjesu kinaze i spoja 15 minuta.

Dodati 25 μL 40 mM MnCl2 u jažice za negativnu kontrolu.

Dodati 25 μL smjese ATP/MnCl2 u sve ostale jažice (osim u one za negativnu kontrolu). Inkubirati 5 min.

Dodati 25 μL 500 mM EDTA radi zaustavljanja reakcije.

Isprati ploču 3× s TBST.

U sve jažice dodati 100 μL zečjeg poliklonskog anti-Ptyr razrijeđenog 1:10000 u puferu za razrijeđivanje protutijela. Inkubirati, uz potresanje, pri sobnoj temperaturi jedan sat.

Isprati ploču 3× s TBST.

Razrijediti Biosource HRP-konjugirano anti-zečje protutijelo 1:6000 u puferu za razrijeđivanje protutijela. Dodati 100 μL po jažici i inkubirati na sobnoj temperaturi, uz potresanje, kroz jedan sat.

Isprati ploču 1× s PBS.

Dodati 100 μL otopine ABTS/H2O2 u sve jažice.

Ukoliko je potrebno, zaustaviti razvijanje reakcije dodatkom 100 μL 0,2 M HCl po jažici.

TEST TRANSFOSFORILACIJE IGF-1

Ovaj se test koristi za mjerenje razine fosfotirozina u poli(glutaminska kiselina:tirozin)(4:1) za identifikaciju agonista/antagonista gst-IGF-1 transfosforilacije supstrata.

Materijali i reagensi:

Corning Elisa ploče od 96 jažica.

Poli(Glu-Tyr) (4:1), Sigma kat. br. P0275.

PBS, Gibco catalog #450-1300EB.

50 mM HEPES.

TBB pufer za blokiranje: za 1 L, pomiješati 100 g BSA, 12,1 g TRIS (pH 7,5), 58,44 g natrijevog klorida i 10 mL 1% Tween-20.

Pročišćeni GST fuzijski protein koji sadrži IGF-1 kinaznu domenu (Sugen, Inc.).

TBST pufer: za 1 L, pomiješati 6,057 g Tris, 8,766 g natrijevog klorida i 0,5 mL Tween-20 s dovoljno dH2O za pripremu 1 L.

4% DMSO u Milli-Q H2O.

10 mM ATP u dH2O.

2× pufer za razrijeđivanje kinaze: za 100 mL, pomiješati 10 mL 1 M HEPES (pH 7,5), 0,4 mL 5% BSA u dH2O, 0,2 mL 0,1 M natrijevog ortovanadata i 1 mL 5 M natrijevog klorida s dovoljno dH2O za pripremu 100 mL.

4× ATP reakcijska smjesa: za 10 mL, pomiješati 0,4 mL 1 M MnCl2 i 0,008 mL 0,01 M ATP i 9,56 mL dH2O.

4× smjesa za negativnu kontrolu: pomiješati 0,4 mL 1 M manganovog klorida u 9,60 mL dH2O.

NUNC polipropilenske ploče od 96 jažica.

500 mM EDTA u dH2O.

Poliklonsko antifosfotirozinsko protutijelo kunića, Sugen, Inc.

Anti-zečje HRP-konjugirano protutijelo iz koze, Biosource, Inc.

ABTS otopina.

0,2 M HCl u dH2O.

Postupak:

Prekriti ELISA ploču 2,0 μg/jažici poli(Glu,Tyr) 4:1 (Sigma P0275) u 100 μL PBS. Pohraniti preko noći na 4 °C.

Isprati ploču jednom s PBS.

Dodati 100 μL TBB pufera za blokiranje u svaku jažicu. Inkubirati ploču 1 sat na sobnoj temperaturi, uz potresanje.

Isprati ploču jednom s PBS, zatim dvaput s 50 mM Hepes puferom pH 7,5.

Dodati 25 μL ispitivanog spoja u 4% DMSO (dobivenog razrijeđivanjem stock-otopine 10 mM ispitivanog spoja u 100% DMSO pomoću dH2O) na ploču.

Dodati 10,0 ng gst-IGF-1 kinaze u 50 μL pufera za razrijeđivanje kinaze u sve jažice.

Započeti kinaznu reakciju dodatkom 25 μL 4× ATP reakcijske smjese u sve testirane jažice i jažice za pozitivnu kontrolu. Dodati 25 μL 4× smjese za negativnu kontrolu u sve jažice za negativnu kontrolu. Inkubirati 10 minuta uz potresanje na sobnoj temperaturi.

Dodati 25 μL 0,5M EDTA (pH 8,0) u sve jažice.

Isprati ploču 4× TBST puferom.

U sve jažice dodati zečji poliklonski anti-fosfotirozinski antiserum u razrijeđenju 1:10000 u 100 μL pufera za razrijeđivanje protutijela. Inkubirati, uz potresanje, na sobnoj temperaturi 1 sat.

Isprati ploču kao u koraku 9.

U sve jažice dodati 100 μL Biosource anti-zečjeg HRP u razrijeđenju 1:10000 u puferu za razrijeđivanje protutijela. Inkubirati, uz potresanje, na sobnoj temperaturi 1 sat.

Isprati ploču kao u koraku 9, nakon toga još jednom isprati PBS da bi se smanjili mjehurići i suvišak Tween-20.

Razviti dodavanjem 100 μL/jažici ABTS/H2O2 u svaku jažicu.

Nakon oko 5 minuta, očitati na ELISA čitaču, s test-filterom na 410 nm i referentnim filterom na 630 nm.

TESTOVI UGRADNJE BrdU

Sljedeći testovi koriste stanice dizajnirane tako da eksprimiraju izabrani receptor i zatim procjenjuju učinak proučavanog spoja na aktivnost sinteze DNA inducirane ligandom, ugradnjom BrdU u DNA.

Sljedeći materijali, reagensi i postupak općenitisu za svaki od narednih testova ugradnje BrdU. Naznačene su varijante specifičnih testova.

Materijali i reagensi:

Odgovarajući ligand.

Stanice dizajnirane na odgovarajući način.

Reagens za obilježavanje BrdU: 10 mM u PBS (pH 7,4) (Boehringer Mannheim, Njemačka).

FixDenat: otopina za fiksaciju (spremna za upotrebu) (Boehringer Mannheim, Njemačka).

Anti-BrdU-POD: mišje monoklonsko protutijelo konjugirano na peroksidazu (Boehringer Mannheim, Njemačka).

TMP otopina supstrata: tetrametilbenzidin (TMB, Boehringer Mannheim, Njemačka).

PBS otopina za ispiranje: 1× PBS, pH 7,4.

Goveđi albumin (BSA), frakcija V prah (Sigma Chemical Co., USA).

Opći postupak:

Stanice se nasade u gustoći 8000 stanica/jažici u 10% CS, 2 mM Gln u DMEM, u ploču od 96 jažica. Stanice se inkubiraju preko noći na 37 °C uz 5% CO2.

Nakon 24 sata, stanice se isperu s PBS, a zatim se izgladnjuju u mediju bez seruma (0% CS DMEM s 0,1% BSA) kroz 24 sata.

Trećeg dana, stanicama se istovremeno dodaju odgovarajući ligand i ispitivani spoj. Jažice za negativnu kontrolu dobit će DMEM bez seruma sa samo 0,1% BSA; jažice za pozitivnu kontrolu dobit će ligand, ali ne i ispitivani spoj. Ispitivani spojevi pripremaju se u DMEM bez seruma s ligandom na ploči od 96 jažica i serijski se razrijede na 7 ispitivanih koncentracija.

Nakon 18 sati aktivacije ligandom, dodaje se razrijeđeni reagens za obilježavanje BrdU (1:100 u DMEM, 0,1% BSA) i stanice se inkubiraju s BrdU (konačna koncentracija 10 μM) 1,5 h.

Nakon inkubacije s reagensom za obilježavanje, medij se uklanja dekantiranjem i cijeđenjem izokrenute ploče na papirnatom ručniku. Dodaje se FixDenat otopina (50 μL/jažici) i ploče se inkubiraju na sobnoj temperaturi 45 minuta na drmalici.

FixDenat otopina pažljivo se ukloni dekantiranjem i cijeđenjem izokrenute ploče na papirnatom ručniku. Dodaje se mlijeko (5% dehidrirano mlijeko u PBS, 200 μL/jažici) kao otopina za blokiranje i ploča se inkubira 30 minuta na sobnoj temperaturi na drmalici.

Otopina za blokiranje ukloni se dekantiranjem i jažice se isperu jednom s PBS. Dodaje se anti-BrdU-POD otoina (razrijeđenje 1:200 u PBS, 1% BSA, 50 μL/jažici) i ploča se inkubira 90 minuta na sobnoj temperaturi na drmalici.

Konjugat protutijela pažljivo se ukloni dekantiranjem i ispiranjem jažica 5 puta s PBS, te se ploča osuši izvrtanjem i cijeđenjem na papirnatom ručniku.

Dodaje se TMB otopina supstrata (100 μL/jažici) i inkubira 20 minuta na sobnoj temperaturi na drmalici, dok razvijanje boje nije dovoljno za fotometrijsku detekciju.

Apsorbancija uzoraka mjeri se na 410 nm (na način "dvostruke valne duljine" s filterom za očitanje na 490 nm, kao referentna valna duljina) na Dynatech ELISA čitaču ploča.

Test ugradnje BrdU potaknut EGF

Materijali i reagensi:

Mišji EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).

3T3/EGFRc7.

Test ugradnje BrdU potaknut EGF i Her-2

Materijali i reagensi:

Mišji EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).

3T3/EGFr/Her2/EGFr (EGFr s Her-2 kinaznom domenom).

Test ugradnje BrdU potaknut EGF i Her-4

Materijali i reagensi:

Mišji EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).

3T3/EGFr/Her4/EGFr (EGFr s Her-4 kinaznom domenom).

Test ugradnje BrdU potaknut PDGF

Materijali i reagensi:

Ljudski PDGF B/B (Boehringer Mannheim, Njemačka).

3T3/EGFRc7.

Test ugradnje BrdU potaknut FGF

Materijali i reagensi:

Ljudski FGF2/bFGF (Gibco BRL, SAD).

3T3c7/EGFr.

Test ugradnje BrdU potaknut IGF-1

Materijali i reagensi:

Ljudski rekombinantni G511 (Promega Corp., SAD).

3T3/IGF1r.

Test ugradnje BrdU potaknut inzulinom

Materijali i reagensi:

Inzulin, kristalni, goveđi, Zinc (13007, Gibco BRL, SAD).

3T3/H25.

Test ugradnje BrdU potaknut HGF

Materijali i reagensi:

Rekombinantni ljudski HGF (Kat. br. 249-HG, R&D Systems, Inc. SAD).

BxPC-3 stanice (ATCC CRL-1687).

Postupak:

Stanice se nasade u gustoći 9000 stanica/jažici u RPMI 10% FBS u ploču od 96 jažica. Stanice se inkubiraju preko noći na 37 °C uz 5% CO2.

Nakon 24 sata, stanice se isperu s PBS, a zatim izgladnjuju u 100 μL medija bez seruma (RPMI s 5% BSA) 24 sata.

Trećeg dana, stanicama se dodaje 25 μL liganda (pripremljenog u koncentraciji 1 μg/mL u RPMI s 0,1% BSA; konačna konc. HGF je 200 ng/mL) i ispitivanih spojeva. Jažice za negativnu kontrolu primaju samo 25 μL RPMI bez seruma s 0,1% BSA; jažice za pozitivnu kontrolu primaju ligand (HGF), ali ne i ispitivani spoj. Ispitivani spojevi pripremaju se u koncentracijama 5 puta većim od konačne, u RPMI bez seruma s ligandom na ploči od 96 jažica, i serijski se razrjeđuju da bi dali 7 ispitivanih koncentracija. Tipično, najviša konačna koncentracija ispitivanog spoja je 100 μM, a koriste se razrijeđenja 1:3 (tj. raspon konačnih koncentracija ispitivanog spoja je 0,137-100 μM).

Nakon 18 sati aktivacije liganda, u svaku jažicu se dodaje 12,5 μL razrijeđenog reagensa za obilježavanje BrdU (1:100 u RPMI, 0,1% BSA) i stanice se inkubiraju s BrdU (konačna koncentracija je 10 μM) kroz 1 sat.

Isto kao Opći postupak.

Otopina za blokiranje uklanja se dekantiranjem i jažice se isperu jedanput s PBS. Dodaje se anti-BrdU-POD otopina (razrijeđenje 1:100 u PBS, 1% BSA, 100 μL/jažici) i ploča se inkubira 90 minuta na sobnoj temperaturi na drmalici.

Isto kao Opći postupak.

HUV-EC-C test

Ovaj se test koristi za mjerenje aktivnosti spoja protiv PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF ili Flk-1/KDR, koji su svi eksprimirani u HUV-EC stanicama.

DAN 0.

Isprati i tripsinizirati HUV-EC-C stanice (ljudske endotelne stanice umbilikalne vene, American Type Culture Collection, kat. br. 1730 CRL). Isprati Dulbeccovim fosfatnim puferom (D-PBS, nabavljno od Gibco BRL, kat. br. 14190-029) dvaput oko 1 mL/10 cm2 bočice za tkivne kulture. Tripsinizirati s 0,05% tripsin-EDTA u neenzimatskoj otopini za disocijaciju stanica (Sigma Chemical Company, kat. br. C-1544). 0,05% tripsin priređen je razrijeđivanjem 0,25% tripsina/1 mM EDTA (Gibco, kat. br. 25200-049) u otopini za disocijaciju stanica. Tripsinizirati s oko 1 mL/25-30 cm2 bočice za tkivne kulture oko 5 minuta pri 37 °C. Nakon što su se stanice odvojile od bočice, dodati jednak volumen medija u kojem se test provodi, i prenijeti u sterilnu centrifugalnu epruvetu od 50 mL (Fisher Scientific, kat. br. 05-539-6).

Isprati stanice s oko 35 mL medija u sterilnoj centrifugalnoj epruveti od 50 mL, dodati medij, centrifugirati 10 min pri približno 200× g, odsisati supernatant i resuspendirati s 35 mL D-PBS. Ponoviti ispiranje još dvaput s D-PBS, resuspendirati stanice u oko 1 mL medija/15 cm2 bočice za tkivne kulture. Medij u kojem se provodi testiranje sastoji se od F12K medija (Gibco BRL, kat. br. 21127-014) i 0,5% toplinski inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma . Izbrojati stanice na Coulter Counter® (Coulter Electronics, Inc.) i dodati medij stanicama tako da se postigne koncentracija 0,8-1,0×105 stanica/mL.

Dodati stanice na ploče od 96 jažica s ravnim dnom, 100 μL/jažici ili 0,8-1,0×104 stanica/jažici, inkubirati ~24h pri 37°C, 5% CO2.

DAN 1.

Prirediti dvostruke titracije ispitivanog spoja u odvojenim pločama od 96 jažica, općenito od 50 μM prema 0 μM. Koristiti isti medij za testiranje kao onaj koji je spomenut za dan 0, korak 2, ranije. Titracije se priređuju dodavanjem 90 μL ispitivanog spoja/jažici u koncentraciji 200 μM (4× konačna koncentracija u jažici) u gornju jažicu određene kolone na ploči. Kako je stock-otopina ispitivanog spoja obično 20 nM u DMSO, koncentracija lijeka od 200 μM sadrži 2% DMSO.

Sredstvo za razrijeđivanje, priređeno od 2% DMSO u mediju za testiranje (F12K + 0,5% fetalni goveđi serum) koristi se za razrijeđivanje titracija ispitivanih spojeva s ciljem da se ispitivani spoj razrijedi, ali koncentracija DMSO održi konstantnom. Dodati ovu otopinu u preostale jažice u koloni u volumenu 60 μL/jažici. Uzeti 60 μL od 120 μL razrijeđenja ispitivanog spoja od 200 μM u gornjoj jažici kolone i pomiješati sa 60 μL u drugoj jažici kolone. Uzeti 60 μL iz ove jažice i pomiješati sa 60 μL u trećoj jažici kolone, i tako dalje, dok dvostruke titracije nisu potpune. Kod miješanja predzadnje jažice, uzeti 60 μL od 120 μL u toj jažici i baciti. Ostaviti zadnju jažicu sa 60 μL DMSO/medija za razrijeđivanje, kao kontrolu koja ne sadrži ispitivani spoj. Prirediti 9 kolona titriranog ispitivanog spoja, dovoljno za triplikatne jažice za: (1) VEGF (nabavljen od Pepro Tech Inc., kat. br. 100-200), (2) faktor rasta endotelnih stanica (ECGF) (također poznat kao kiseli faktor rasta fibroblasta, ili aFGF) (nabavljen od Boehringer Mannheim Biochemica, kat. br. 1439 600), ili (3) ljudski PDGF B/B (1276-956, Boehringer Mannheim, Njemačka) i medij kao kontrolu. ECGF dolazi kao pripravak s natrij-heparinom.

Prenijeti 50 μL/jažici razrijeđenja ispitivanog spoja na ploče od 96 jažica koje sadrže 0,8-1,0×104 stanica/100 μL/jažici HUV-EC-C stanica od dana 0 i inkubirati ~2 h na 37 °C, 5% CO2.

U triplikatima, dodati 50 μL/jažici 80 μg/mL VEGF, 20 ng/mL ECGF ili kontrolnog medija u svaki ispitivani spoj. Kao i s ispitivanim spojevima, koncentracije faktora rasta su 4× od željene konačne koncentracije. Koristiti medij od dana 0, korak 2, za priređivanje koncentracija faktora rasta. Inkubirati približno 24 sata na 37 °C, 5% CO2. Svaka jažica imat će 50 μL razrijeđenja ispitivanog spoja, 50 μL faktora rasta ili medija i 100 μL stanica, što je ukupno 200 μL. Tako 4× koncentracije ispitivanih spojeva i faktora rasta postaju 1× kako su dodane u jažice.

DAN 2.

Dodati 3H-timidin (Amersham, kat. br. TRK-686), 1 μCi/jažici (10 μL/jažici otopine 100 μCi/mL priređenoj u RPMI mediju + 10% toplinski inaktiviranog goveđeg seruma) i inkubirati ~24 h na 37 °C, 5% CO2. RPMI je nabavljen od Gibco BRL, kat. br. 11875-051.

DAN 3.

Smrznuti ploče preko noći na -20 °C.

DAN 4.

Otopiti ploče i pokupiti pomoću sakupljača stanica za ploče od 96 jažica (Tomtec Harvester 96®) na filterske podloške (Wallac, kat. br. 1205-401), očitati otkucaje na Wallac BetaplateTM brojaču za tekuću scintilaciju.

Tablica 2 prikazuje rezultate biološkog testiranja nekih primjera spojeva Formule (I). Rezultati su izraženi kao IC50, gdje je mikromolarna (μM) koncentracija ispitivanog spoja koja uzrokuje 50% promjene u aktivnosti ciljne PTK uspoređena s aktivnošću PTK kontrole u koju nije dodan ispitivani spoj. Specifično, prikazani rezultati pokazuju koncentraciju ispitivanog spoja potrebnu da dovede do 50%-tne redukcije aktivnosti ciljne PTK. Biotestovi korišteni za procjenu spojeva detaljno su opisani u nastavku.

TABLICA 2

[image] [image] [image] [image]

ŽIVOTINJSKI MODELI IN VIVO

ŽIVOTINJSKI MODELI KSENOGRAFTA

Mogućnost ljudskih tumora da rastu kao ksenografti u atimičkim miševima (npr. Balb/c, nu/nu) daje koristan model in vivo za proučavanje biološkog odgovora na terapije za ljudske tumore. Od prve uspješne ksenotransplantacije ljudskih tumora u atimične miševe, (Rygaard i Pvlsen, 1969, Acta Pathol. Microbial. Scand. 77:758-760), mnoge su različite humane stanične linije (npr. dojke, pluća, genitourinarne, gastrointestinalne, glave i vrata, glioblastoma, kosti i malignih melanoma) presađene i uspješno uzgojene u "golim" miševima. Sljedeći testovi mogu se koristiti za određivanje razine aktivnosti, specifičnosti i učinka različitih spojeva formule (I).

Tri su opća oblika testova koji su korisni u evaluaciji spojeva formule (I): stanični/katalitički, stanični/biološki i in vivo. Cilj staničnih/katalitičkih testova je određivanje učinka spoja formule (I) na sposobnost TK za fosforilaciju tirozina na poznatom supstratu u stanici. Cilj staničnih/bioloških testova je određivanje učinka spoja formule (I) na biološki odgovor potaknut TK u stanici. Cilj testova in vivo je određivanje učinka spoja formule (I) u životinjskom modelu određene bolesti, kao što je rak.

Prikladne stanične linije za supkutane pokuse sa ksenograftima uključuju C6 stanice (gliom, ATCC #CCL107), A375 stanice (melanom, ATCC #CRL1619), A431 stanice (epidermoidni karcinom, ATCC #CRL1555), Calu 6 stanice (pluća, ATCC #HTB56), PC3 stanice (prostata, ATCC #CRL 1435), SKOV3TP5 stanice i NIH3T3 fibroblasti, genetski dizajnirane da prekomjerno eksprimiraju EGFR, PDGFR, IGF-1R ili bilo koju drugu test-kinazu. Sljedeći protokol može se koristiti za provođenje pokusa sa ksenograftima:

Ženke atimičnih miševa (BALB/c, nu/nu) nabavljene su od Simonsen Laboratories (Gilroy, CA). Sve životinje održavane su u uvjetima čiste prostorije u mikroizolacijskim kavezima s Alpha-dri steljom. Primale su sterilnu hranu za glodavce i vodu ad libitum.

Stanične linije uzgojene su u odgovarajućem mediju (na primjer, MEM, DMEM, Ham F10, ili Ham F12 uz 5%-10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i 2 mM glutamina (Gln)). Svi mediji za stanične kulture, glutamin i fetalni goveđi serum nabavljeni su od Gibco Life Technologies (Grand Island, NY), ukoliko nije drukčije naznačeno. Sve stanice uzgojene su u vlažnoj atmosferi s 90-95% zraka i 5-10% CO2 pri 37 °C. Sve stanične linije rutinski su presađivane dvaput tjedno i negativne su na mikoplazme, što je određeno Mycotect metodom (Gibco).

Stanice su prikupljane pri ili blizu konfluencije s 0,05% tripsin-EDTA i istaložene su pri 450× g kroz 10 min. Talozi su resuspendirani u sterilnom PBS ili mediju (bez PBS) do određene koncentracije i stanice su usađene u stražnji dio bedra miša (8-10 miševa po skupini, 2-10×106 stanica/životinji). Rast tumora mjeren je kroz 3 do 6 tjedana pomoću šestara. Volumeni tumora računati su kao produkt duljina×širina×visina, ukoliko nije drukčije naznačeno. P vrijednosti izračunate su Studentovim t-testom. Ispitivani spojevi formule (I) u 50-100 μL ekscipijenta (DMSO ili VPD:D5W) mogu se davati IP injekcijom u različitim koncentracijama, uglavnom počevši dan nakon implantacije.

MODEL INVAZIJE TUMORA

Razvijen je sljedeći model invazije tumora koji je moguće koristiti za evaluaciju terapeutske vrijednosti i učinkovitosti spojeva formule (I) za koje je pokazano da selektivno inhibiraju KDR/FLK-1 receptor.

Postupak

Kao eksperimentalne životinje korišteni su osam tjedana stari "goli" miševi (ženke) (Simonsen Inc.). Implantacija tumorskih stanica provodi se u laminaru sa sterilnim protokom zraka. Kao anestezija, primijenjena je mješavina ksilazin/ketamin (100 mg/kg ketamina i 5 mg/kg ksilazina). Učinjen je središnji rez da se izloži abdominalna šupljina (približno 1,5 cm duljine) i da se injicira 107 tumorskih stanica u volumenu od 100 μL medija. Stanice su injicirane ili u duodenalni režanj pankreasa ili ispod seroze debelog crijeva. Potrbušnica i mišići zatvoreni su pomoću 6-10 kontinuiranih šavova, a koža je zatvorena pomoću stezaljki za rane. Životinje su svakodnevno promatrane.

Analiza

Nakon 2-6 tjedana, ovisno o općem promatranju životinja, miševi su žrtvovani, a lokalne metastaze tumora u razne organe (pluća, jetra, mozak, želudac, slezena, srce, mišić) izrezane su i analizirane (mjerenje veličine tumora, stupnja invazije, imunokemija, in situ hibridizacija, itd.).

C-KIT TEST

Ovaj test korišten je za utvrđivanje stupnja c-kit fosforilacije tirozina.

MO7E stanice (ljudska akutna mijeloidna leukemija) izgladnjivane su preko noći u 0,1% seruma. Stanice su prethodno tretirane spojem formule (I) (istovremeno s izgladnjivanjem), prije stimulacije ligandom. Stanice su stimulirane s 250 ng/mL rh-SCF kroz 15 minuta. Nakon stimulacije, stanice su lizirane i imunoprecipitirane s anti-c-kit protutijelom. Razine fosfotirozina i proteina određene su Western blotom.

MTT TEST PROLIFERACIJE

MO7E stanice izgladnjivane su i prethodno tretirane spojem formule (I) kako je opisano za pokuse fosforilacije. Stanice su nasađene ~4×105 stanica/jažici u posudu od 96 jažica, u 100 μL RPMI + 10% seruma. Dodan je rh-SCF (100 ng/mL) i ploča je inkubirana 48 sati. Nakon 48 sati, dodano je 10 μL 5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolij-bromid) i ostavljeno je na inkubaciju od 4 sata. Dodan je kiseli izopropanol (100 μL 0,04 N HCl u izopropanolu) i mjerena je optička gustoća pri valnoj duljini od 550 nm.

TEST APOPTOZE

MO7E stanice inkubirane su +/- SCF i +/- spoj formule (I) u 10% FBS, uz rh-GM-CSF (10 ng/mL) i rh-IL-3 (10 ng/mL). Uzorci su mjereni nakon 24 i 48 sati. Za mjerenje aktivirane caspase-3, uzorci su isprani s PBS i učinjeni propusnima pomoću ledenog 70%-tnog etanola. Stanice su zatim obojene PE-konjugiranim poliklonalnim anti-aktivnim caspase-3 iz kunića i analizirane pomoću FACS uređaja. Za mjerenje pocijepanog PARP, uzorci su lizirani i analizirani Western blotom uz anti-PARP protutijelo.

Dodatni testovi

Dodatni testovi koje je moguće koristiti za evaluaciju spojeva formule (I) uključuju, bez ograničenja, bio-flk-1 test, test EGF receptor-HER2 kimernog receptora u cijelim stanicama, bio-src test, bio-lck test i test koji mjeri funkciju fosforilacije raf. Protokoli za svaki od tih testova mogu se pronaći u U.S. prijavi ser. br. 09/099 842, koja je ovdje uključena citatom, uključujući i crteže.

Mjerenje stanične toksičnosti

Terapeutski spojevi trebali bi biti jači inhibitori aktivnosti receptorske tirozin-kinaze, u usporedbi s pokazivanjem citotoksičnog učinka. Mjerenje učinkovitosti i stanične toksičnosti spoja može se dobiti određivanjem terapeutskog indeksa, tj. IC50/LD50. IC50, doza potrebna da se postigne 50% inhibicije, može se mjeriti upotrebom standardnih tehnika, kao što su one ovdje opisane. LD50, doza koja uzrokuje 50%-tnu toksičnost, može se također mjeriti standardnim tehnikama (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods, 65:55-63), mjerenjem količine oslobođenog LDH (Korzeniewski i Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods, 64:313, Decker i Lohmann-Matthes, 1988, J. Immunol. Methods, 115:61), ili mjerenjem letalne doze u životinjskim modelima. Poželjni su spojevi s visokim terapeutskim indeksom. Terapeutski indeks trebao bi biti veći od 2, poželjno barem 10, još bolje barem 50.

Primjer rezultata staničnih testova uz upotrebu 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (spoj 80)

Da bi se potrdilo djelovanje 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (spoj 80), pokazano u biokemijskim testovima (v. dalje), sposobnost navedenog spoja da inhibira RTK fosforilaciju ovisnu o ligandu procijenjena je u staničnim testovima uz upotrebu NIH-3T3 mišjih stanica, dizajniranih da prekomjerno eksprimiraju Flk-1 ili ljudski PDGFRβ. 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (spoj 80) je inhibirao VEGF-ovisnu Flk-1 fosforilaciju tirozina s IC50 vrijednošću od približno 0,33 μM. Ova vrijednost slična je Ki vrijednosti od 0,009 μM određenoj za inibiciju Flk-1 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amidom (spoj 80), što je provedeno u biokemijskim testovima. To ukazuje na to da 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (spoj 80) lako prodire u stanice. Sukladno biokemijskim podacijma (v. naprijed), koji pokazuju da 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (spoj 80) ima usporedivu aktivnost protiv Flk-1 i PDGFRβ, pronađeno je također da inhibira PDGF-ovisnu fosforilaciju u stanicama s IC50 vrijednošću od približno 0,03 μM. Sposobnost 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (spoj 80) da inhibira c-kit, srodnu TRK koja veže faktor zametnih stanica (stem cell factor, SCF), određena je pomoću MO7E stanica koje eksprimiraju taj receptor. U ovim stanicama, 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (spoj 80) inhibirao je SCF-ovisnu c-kit fosforilaciju s IC50 vrijednošću od 0,01-0,1 μM. Ovaj spoj također inhibira SCF-stimuliranu c-kit fosforilaciju u blastima akutne mijeloidne leukemije (AML), izoliranima iz periferne krvi pacijenta.

Osim testiranja sposobnosti 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (spoj 80) da inhibira ligand-ovisnu receptorsku fosforilaciju, proučavan je i njegov učinak in vitro na ligand-ovisan proliferativni odgovor stanica (v. Tablicu 4). U tim studijama, stanice su dovedene u mirovanje izgladnjivanjem preko noći i inducirana im je sinteza DNA nakon dodatka odgovarajućeg mitogenog liganda. Kako je prikazano u Tablici 3, 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (spoj 80) inhibira PDGF-induciranu proliferaciju NIH-3T3 stanica koje prekomjerno eksprimiraju PDGFRβ ili PDGFRα s IC50 vrijednostima 0,031 i 0,069 μM, a SCF-induciranu proliferaciju MO7E stanica s IC50 vrijednošću 0,007 μM.

TABLICA 3

[image]

Kako je prikazano u Tablici 3, postoji opće slaganje biokemijske i stanične aktivnosti 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (spoj 80), što podržava zaključak da ovaj spoj prolazi kroz stanične membrane. Nadalje, može se zaključiti da su stanični odgovori rezultat aktivnosti spoja 80 protiv naznačenog cilja. Suprotno tome, kod testiranja u prisutnosti potpunog hranjivog medija in vitro, bile su potrebne značajno više koncentracije 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (spoj 80) (>10 mM) za inhibiciju rasta raznih ljudskih tumorskih stanica (v. Tablicu 4). To ukazuje da spoj nije izravno inhibirao rast tih stanica u koncentracijama potrebnima za inhibiciju ligand-ovisne receptorske fosforilacije i stanične proliferacije.

TABLICA 4

[image]

Ukratko, rezultati prikazani u Tablici 4 dobiveni su inkubacijom stanica 48 sati u potpunom hranjivom mediju u prisutnosti serijskih razrijeđenja 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida. Na kraju perioda određenog za rast, određen je relativni broj stanica. IC50 vrijednosti izračunate su kao koncentracija spoja koja inhibira rast stanica 50% u odnosu na netretirane stanice. LD50 vrijednosti izračunate su kao koncentracija spoja koja dovodi do 50%-tnog smanjenja u broju stanica u odnosu na početak pokusa.

Relevantniji stanični test u kojem se procjenjuje anti-angiogeni potencijal 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (spoj 80) je test mitogeneze in vitro uz upotrebu ljudskih endotelnih stanica umbilikalne vene (HUVEC) kao modelnog sustava za proliferaciju endotelnih stanica u odgovoru na angiogeni proces. U tom testu, mitogeni odgovor, mjeren kao porast u sintezi DNA, potaknut je u izgladnjelim HUVEC stanicama nakon dodatka VEGF ili FGF. U tim stanicama, 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (spoj 80) inhibirao je mitogeni odgovor potaknut VEGF ili FGF ovisno o dozi, s IC50 vrijednostima od 0,004 mM odnosno 0,7 mM, kad je spoj bio prisutan kroz cijelo vrijeme 48-satnog testiranja.

Ukratko, prethodno spomenuti rezultati dobiveni su upotrebom izgladnjelih HUVEC stanica koje su inkubirane s mitogenim koncentracijama VEGF (100 ng/mL) ili FGF (30 ng/mL), u prisutnosti serijskih razrijeđenja 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (spoj 80) kroz 24 sata. Mitogeni odgovor tijekom sljedeća 24 sata u prisutnosti liganda i inhibitora kvantificiran je mjerenjem sinteze DNA, što se temelji na ugradnji bromodeoksiuridina u staničnu DNA.

U odvojenim pokusima, spoj 80 inhibirao je VEGF-ovisnu fosforilaciju ERK 1/2 (p42/44 MAP kinaza), rani nizvodni cilj Flk-1/KDR, i to ovisno o dozi. Također je pokazano da inhibitorna aktivnost spoja 80 u ovom sustavu dugo traje; uz inhibiciju VEGF-ovisne fosforilacije ERK 1/2 kroz 48 sati nakon uklanjanja 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (spoj 80) iz medija nakon kratkog (2 h) izlaganja mikromolarnim koncentracijama spoja.

Pokazano je da je VEGF važan faktor preživljenja endotelnih stanica. Budući da 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (spoj 80) inhibira VEGF-ovisan mitogeni odgovor HUVEC stanica, proučavan je učinak spoja na njihovo preživljenje. U tim pokusima, cijepanje caspase 3 supstrata poli-ADP-ribozil-polimeraze (PARP) korišteno je kao očitavanje apoptoze. HUVEC stanice uzgojene u uvjetima bez seruma kroz 24 sata pokazale su značajne razine cijepanja PARP, što je utvrđeno nakupljanjem fragmenta veličine 23 kDa koji nastaje cijepanjem PARP. To je značajno spriječeno dodatkom VEGF u stanični medij, što pokazuje da VEGF djeluje kao faktor preživljenja u ovom testu. Pokazano je da 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (spoj 80) inhibira KDR signalizaciju. U skladu s time, 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (spoj 80) inhibirao je preživljenje HUVEC posredovano VEGF, i to ovisno o dozi. Tako ovi podaci ukazuju da je spoj 80 potaknuo apoptozu u endotelnim stanicama u kulturi u prisutnosti VEGF.

Studije učinkovitosti in vivo

Učinkovitost protiv ustanovljenih tumorskih ksenografta

Učinkovitost 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (spoj 80) in vivo proučavana je u potkožnim (SC) modelima ksenografta upotrebom ljudskih tumorskih stanica usađenih u stražnji dio bedra atimičnih miševa. Nakon usađivanja, tumori su rasli do veličine 100-550 mm3 prije početka oralnog tretmana sa spojem.

Dnevna oralna primjena spoja 80 uzrokovala je inhibiciju rasta A431 tumora ovisnu o dozi, kad je tretman započet nakon što su tumori dosegli veličinu od 400 mm3. Statistički značajna (P<0,05) inhibicija rasta tumora opažena je u dozama od 40 mg/kg/dan (74% inhibicije) i 80 mg/kg/dan (84% inhibicije) (v. Tablicu 6). U preliminarnim pokusima, viša (160 mg/kg/dan) doza spoja nije bila učinkovitija protiv ustanovljenih A431 tumora od doze 80 mg/kg/dan. Nadalje, miševi tretirani dozom spoja od 160 mg/kg/dan gubili su tjelesnu težinu, što ukazuje da više doze nisu bile dobro podnesene. Slični rezultati dobiveni su u pokusu u kojem su A431 tumori narasli samo do 100 mm3 (v. Tablicu 4). U ovom drugom pokusu, potpuno povlačenje tumora dogodilo se u šest od osam životinja tretiranih s 80 mg/kg/dan tijekom 21 dana. U tih šest životinja, tumori nisu ponovno narasli u periodu promatranja od 110 dana nakon završetka tretmana. U dvije životinje u kojima su tumori ponovno narasli do velike veličine (2000-3000 mm3), tumori su se povukli nakon drugog tretmana spojem 80. Važno je da je u svim pokusima učinkovitosti 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (spoj 80) u dozi 80 mg/kg/dan bio dobro podnošen, čak i kad je doziran kontinuirano dulje od 100 dana.

TABLICA 5

[image]

Ukratko, rezultati prikazani u Tablici 5 dobiveni su upotrebom A431 stanica (0,5×106 stanica/mišu), koje su usađene SC u stražnji dio bedra atimičnih miševa. Dnevna oralna primjena 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (spoj 80) pomoću nosača na bazi Cremophora ili kontrolnog nosača započela je kad su tumori dosegli naznačeni prosječni volumen. Tumori su mjereni pomoću šestara, a volumen tumora izračunat je kao produkt duljina×širina×visina. P-vrijednosti izračunate su uspoređivanjem veličine tumora životinja koje su tretirane spojem 80 (n = 8) i životinja tretiranih nosačem (n = 16) posljednjeg dana pokusa, upotrebom dvosmjernog Studentovog t-testa.

Učinkovitost spoja 80 protiv ustanovljenih ljudskih tumora različitog porijekla određena je korištenjem Colo205 (karcinom debelog crijeva), SF763T (gliom) i NC1-H460 (karcinom ne-malih stanica pluća) ksenografta (v. Tablicu 6). Ovi pokusi provedeni su oralnom primjenom 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (spoj 80) u dozi 80 mg/kg/dan; dozi koja je bila učinkovita i dobro se podnosila.

TABLICA 6

[image]

U gore opisanim pokusima, spoj 80 primjenjivan je jednom dnevno u dozi 80 mg/kg, s nosačem na bazi Cremophora, kad bi tumori dosegli naznačenu veličinu. Postotak inhibicije u usporedbi s kontrolnom grupom, tretiranom nosačem, izračunat je na kraju pokusa. P-vrijednosti izračunate su uspoređivanjem veličine tumora životinja tretiranih spojem s veličinama tumora životinja koje su tretirane nosačem, upotrebom dvosmjernog Studentovog t-testa.

Iako je 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (spoj 80) inhibirao rast svih oblika tumora prikazanih u Tablici 7, postoji razlika u odgovoru različitih modela ksenografta. Specifično, rast NC1-H460 i SF763T tumora zaustavljen je ili značajno usporen, dok su se Colo205 tumori, kao i A431 tumori, povukli nakon tretmana 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amidom.

U cilju određivanja molekularne osnove razlike u odgovoru između modela ksenografta, proučavani su SF763T tumori. Dakle, SF763T tumori, koji su slabije odgovarali na tretman 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amidom, evaluirani su na molekularnoj razini pomoću imunohistokemijskih tehnika da bi se odredio učinak tretmana ovim spojem. Ove studije najprije su provedene u ovom tipu tumora jer su SF763T tumori jako prokrvljeni mikrožilama koje izrazito eksprimiraju marker endotelnih stanica CD31 i prema tome su prikladni za studije gustoće mikrožila tumora (microvessel density, MVD). Imunohistokemijska evaluacija SF763T tumora ukazala je da tumori iz tretiranih životinja imaju smanjenu MVD u odnosu na kontrole tretirane nosačem, u skladu s antiangiogenim mehanizmom djelovanja spoja 80; MVD je bila 24,2 ± 4,1 u životinja tretiranih spojem 80, u usporedbi s 39,3 ± 5,7 onih tretiranih samo nosačem. Kako se moglo predvidjeti iz pridruženog zaustavljenog rasta tumora, izrazita inhibicija proliferacije tumorskih stanica bila je očita u tumorima tretiranima spojem 80. Ovi tumori imali su upola manji mitotski indeks od tumora tretiranih nosačem (podaci nisu prikazani). Učinak spoja 80 na MVD i proliferaciju tumorskih stanica ukazuje da spoj ima jaka antiangiogene i antitumorske učinke, čak i u uvjetima kad se tumor ne povlači.

Sposobnost spoja 80 da inhibira fosforilaciju PDGFR i signalizaciju in vivo koja slijedi iza toga, također je procijenjena u SF763T tumorima koji eksprimiraju visoke razine PDGFRβ. Tretman SF763T tumora spojem 80 snažno je inhibiralo fosforilaciju tirozina u PDGFRβ u ustanovljenim SF763T tumorima. Spoj 80 također je snizio razine fosforilirane (aktivirane) fosfolipaze C gama (PLC-γ), prvog nizvodnog indikatora aktivacije PDGFR. Ovi podaci pokazuju da oralna primjena spoja 80 uzrokuje izravan učinak na ciljnu (PDGFR) aktivnost u tumorima in vivo.

Na osnovi pokazanih rezultata da je sposobnost spoja 80 da inhibira VEGF-ovisnu signalizaciju u HUVEC stanicama in vitro dugotrajna (v. ranije), učinkovitost spoja evaluirana je kad je spoj rijetko primjenjivan, u modelu Colo205 tumora. Kako je prikazano u Tablici 7, 80 mg/kg (91% inhibicije) i 40 mg/kg (84% inhibicije) bili su učinkoviti kad su primjenjivani dnevno, ali ne kod primjene dvaput tjedno. Suprotno tome, viša doza spoja 80 (160 mg/kg) inhibirala je (52% inhibicije) rast ustanovljenih Colo205 tumora i kod primjene dvaput tjedno, što upućuje da se ovaj spoj može pokazati učinkovitim kod rijetke primjene u višim dozama. Treba primijetiti da režim doziranja mogu odrediti stručnjaci područja bez pretjeranog eksperimentiranja.

TABLICA 7

[image]

Ukratko, rezultati prikazani u Tablici 7 dobiveni su upotrebom Colo205 stanica (0,5×106 stanica/mišu) koje su implantirane SC u stražnji dio bedra atimičnih miševa. Oralna primjena spoja 80 prema naznačenoj shemi započela je kad su tumori dosegli 400 mm3. Tumori su mjereni pomoću šestara, a volumen tumora izračunat je kao produkt duljina×širina×visina. P-vrijednosti izračunate su uspoređivanjem veličine tumora iz životinja tretiranih spojem 80 i onih iz životinja tretiranih nosačem, posljednjeg dana pokusa, pomoću Studentovog t-testa.

Učinkovitost spoja 80 u modelu raširene bolesti

Osim što podržava neprekidni rast čvrstih primarnih tumora, angiogeneza je također bitna komponenta koja podržava razvoj raširene bolesti zbog metastaziranja iz primarnog tumora. Učinak spoja 80 na razvoj raširene bolesti proučavan je na modelu B16-F1 mišjeg melanoma kolonizacije pluća. U tom modelu, B16-F1 stanice unesene intravenski, putem repne vene atimičnih miševa, koloniziraju pluća i tvore tumore. Kako je prikazano u Tablici 8, oralna primjena spoja 80 u dozi 80 mg/kg/dan učinkovito je smanjila opterećenje pluća B16-F1 stanicama, što je utvrđeno mjerenjem ukupne mase pluća. Ovi podaci upućuju da spoj 80 može inhibirati raširenu bolest in vivo.

TABLICA 8

[image]

Ukratko, rezultati prikazani u Tablici 8 dobiveni su upotrebom atimičnih miševa kojima su inokulirane B16-F1 tumorske stanice (5×105 stanica/mišu) putem repne vene. Miševi su tretirani svakog dana oralnom primjenom spoja 80 u dozi 80 mg/kg/dan (n = 10) ili nosača (n = 18) 24 dana nakon inokulacije tumorskih stanica. Na kraju perioda tretirana, miševi su žrtvovani, a njihova pluća su uklonjena i izvagana. Postotak inhibicije izračunat je usporedbom mase pluća životinja tretiranih spojem 80 s masom pluća životinja tretiranih samo nosačem. P-vrijednosti utvrrđene su dvosmjernim Studentovim t-testom.

COX-2 inhibitori:

Sposobnost COX-2 inhibitora da uspore rast tumora testirana je na Lewisovom modelu pluća, opisanom u nastavku.

Miševi su supkutano injicirani u lijevu šapu (1×106 tumorskih stanica suspendiranih u 30% Matrigela) i volumen tumora evaluiran je pomoću fletismometra dvaput tjedno tijekom 30-60 dana. Krv je uzimana dvaput tijekom eksperimenta u 24 h da bi se dobila plazmatska koncentracija i ukupna izloženost AUC analizom. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost +/- SEM. Studentov i Mann-Whitney test korišteni su za utvrđivanje razlika između srednjih vrijednosti upotrebom softverskog paketa InStat. Celekoksib, davan u hrani u dozama između 160-3200 ppm, usporio je rast ovih tumora. Inhibitorni učinak celekoksiba bio je ovisan o dozi i varirao je od 48% do 85% u usporedbi s kontrolnim tumorima. Analiza metastaza pluća provedena je u svim životinjama brojanjem metastaza u stereomikroskopu i histokemijskom analizom sekcija pluća. Celekoksib nije utjecao na metastaze pluća u dozi manjoj od 160 ppm, međutim, površinske metastaze smanjene su za više od 50% kad je davan u dozama između 480 i 3200 ppm. Nadalje, histopatološka analiza otkrila je da celekoksib smanjuje veličinu metastatskih lezija pluća ovisno o dozi.

2. HT-29 model

Miševi su injicirani supkutano u lijevu šapu (1×106 tumorskih stanica suspendiranih u 30% Matrigela) i volumen tumora evaluiran je pomoću fletismometra dvaput tjedno tijekom 30-60 dana. Implantacija ljudskih stanica karcinoma debelog crijeva (HT-29) u "gole" miševe stvara tumore koji će dosegnuti 0,6-2 mL između 30 i 50 dana. Krv je uzimana dvaput tijekom eksperimenta u 24 h da bi se dobila plazmatska koncentracija i ukupna izloženost AUC analizom. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost +/- SEM. Studentov i Mann-Whitney test korišteni su za utvrđivanje razlika između srednjih vrijednosti upotrebom softverskog paketa InStat.

Miševi injicirani HT-29 tumorskim stanicama tretirani su citoksinom i.p. u dozi od 50 mg/kg na dane 5, 7 i 9, u prisutnosti ili odsutnosti celekoksiba u hrani. Učinkovitost obaju sredstava određena je mjerenjem volumena tumora. Tretman COX-2 inhibitorom koji je srodan celekoksibu (SC-58236) smanjio je volumen tumora za 89%. U istom testu, indometacin, primijenjen u gotovo maksimalnoj toleriranoj dozi od 2 mg/kg/dan u vodi za piće smanjio je stvaranje tumora za 77%. Štoviše, selektivni inhibitor COX-2 potpuno je inhibirao stvaranje metastaza pluća, dok neselektivni NSAID indometacin nije bio učinkovit. Rezultati ovih studija pokazuju da celekoksib primijenjen u hrani kod miševa s tumorima može odgoditi rast tumora i metastaza kad je primijenjen kao jedina terapija. Štoviše, opažen je pozitivan učinak kad je celekoksib primijenjen u kombinaciji s citotoksičnim sredstvom, kao što je ciklofosfamid.

U drugom testu, miševi injicirani HT-29 stanicama karcinoma debelog crijeva tretirani su celekoksibom (10, 40 ili 160 ppm) u hrani, počevši od 10. dana. Opažen je učinak približno ovisan o dozi (Tablica 9).

Tablica 9. Celekoksib inhibira HT-29 ljudski karcinom debelog crijeva

[image]

volumen (mL)

In vivo testovi uz upotrebu inhibitora protein-kinaza u kombinaciji sa selektivnim inhibitorima ciklooksigenaze-2 za liječenje raka

Sposobnost inhibitora protein-kinaze da uspori rast tumora u kombinaciji sa selektivnim inhibitorom COX-2 moguće je testirati u modelu ksenografta 1483, opisanom u nastavku.

1483 ksenograft je životinjski ksenograft koji predstavlja model za ljudske epitelne karcinome koji eksprimiraju ciklooksigenazu-2 (COX-2), u tumorskim stanicama i vaskulaturi.

Ljudski ksenograft tumora u "golim" miševima predstavlja model karcinoma pločastih stanica glave i vrata (stanična linija 1483) koji eksprimira COX-2 u tumorskim stanicama i vaskulaturi, slično ljudskim epitelnim karcinomima. Vjeruje se da ovaj model predstavlja ljudske epitelne karcinome i da bi bio dobar model za koreliranje učinkovitosti lijekova protiv raka koji uključuju inhibitore COX-2 s učinkovitošću u ljudi.

Materijali i metode:

Stanična kultura:

Stanice ljudskog karcinoma pločastih stanica glave i vrata (HNSCC) 1483 pohranjene su u smrznutim posudama koje sadrže 3×106 stanica, 90% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i 10% dimetil-sulfoksida (DMSO). Uzeti smrznutu posudu i brzo otopiti na 37 °C i prenijeti u T-162 cm2 (Corning) bočicu koja sadrži D-MEM/F12 medij (GibcoBRL) s 15 mM Hepes pufera, L-glutamina, piridoksin-hidroklorida i 10% FBS. Stanice su rasle u inkubatoru s 5% CO2 i pri temperaturi od 37°C. Medij je mijenjan svaki drugi dan i stanice su presađivane pri konfluenciji od 80-90%. Za presađivanje stanica, isprati bočicu s 10 mL fosfatnog pufera (PBS), odsisati i dodati 2 mL tripsin/EDTA (0,25%/1 mM, GibcoBRL), vratiti u inkubator. Nakon 5 minuta stanice će se odvojiti. Dodati 8 mL gornjeg medija u bočicu, isprati i prenijeti u sterilnu centrifugalnu epruvetu od 50 mL. Dodati još 30 mL medija, promiješati i izbrojati stanice u hemocitometru, te nasaditi stanice u T-162 cm2 tako da sadrže 3-4×106 stanica.

1483 životinjski model

Promijeniti medij 24 sata prije prikupljanja 1483 stanica i njihovog injiciranja u "gole" miševe. Tripsinizirati 1483 stanice kako je gore opisano (u poglavlju Stanična kultura). Izbrojati stanice i odrediti njihov broj. Centrifugirati stanice pri 1000 rpm kroz 5 minuta na sobnoj temperaturi. Resuspendirati stanične taloge i spojiti ih (ukoliko je više centrifugalnih epruveta od 50 mL) u jednu centrifugalnu epruvetu od 50 mL, s Hank-ovom puferiranom otopinom (HBSS, GibcoBRL), i centrifugirati kao ranije. Trebat će oko 25% više stanica nego što je stvarno potrebno za injekciju. Ukoliko se injicira 72 miša, a na raspolaganju je 100×106 stanica, pripremiti sve stanice za injiciranje u miševe. Injicirati 1483 stanice u količini 1×106 stanica u 0,03 mL/mišu.

Injicirati stanice s 30% Matrigela (Collaborative Biomedical Products) i 70% HBSS. Resuspendirati istaloženi talog s 2,1 mL (70%) hladnog HBSS i zatim dodati 0,9 mL (30%) otopljenog, tekućeg, hladnog Matrigela i dobro izmiješati na ledu. Ovaj stanični pripravak držati na ledu cijelo vrijeme, sve do injiciranja u miša. U ovim studijama korišteni su mužjaci "golih" miševa stari 4-6 tjedana (Harlen). Anestezirati miševe pomoću CO2/O2 plina i zatim ih injicirati u sredinu stražnjeg dijela desne noge pomoću 0,5 cc tuberkulinske štrcaljke (Beckerson & Dickerson). Izvagati tjelesnu težinu miševa (dan 0.) za osnovnu težinu za početak studije. Vagati miševe 7. dan i mjeriti desnu stražnju nogu za mjerenje volumena tumora pomoću fletismometra (Stoelting Co.). Fletismometar je stroj koji mjeri volumen noge izmještanjem vode. Izmjeriti nekoliko lijevih, neinjiciranih nogu i izračunati srednju vrijednost za pozadinsko mjerenje, da bi se oduzelo od desne noge koja nosi tumor.

Davati životinjama ispitivane spojeve u hrani kad su tumori veličine 100-200 μL i nastaviti sa spojevima u hrani tijekom studije. Nekim miševima daje se samo inhibitor protein-kinaze ili selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2. Nekim miševima daju se i inhibitor protein-kinaze i selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 svakodnevno u odgovarajućoj dozi, određenoj na temelju rezultata testova in vitro.

Vagati i mjeriti miševe tijekom studije u dane 7, 10, 14, 17, 21, 24 i 28. Životinjama se može započeti davanje spojeva na dan 0. (profilaktički) ili jednom kad je tumor ustanovljen, oko 7. dana (terapijski). Oko 30. dana, miševi s nosačem (kontrole) imat će velike tumore (~1,0 - 1,5 mL) i počet će gubiti težinu. U to vrijeme završiti s kontrolnim životinjama. Ukoliko je opažena inhibicija tumora u tretiranim grupama i životinje su dobrog zdravlja, eutanazirati polovicu tretiranih grupa, a drugu polovicu držati na životu radi određivanja odgode rasta tumora.

Stručnjak područja opazit će da je ovaj izum prilagođen provođenju ciljeva i dobivanju spomenutih prednosti, kao i onih koje su mu svojstvene. Ovdje opisani molekularni kompleksi i metode, procedure, tretmani, molekule, specifični spojevi reprezentativni za poželjna ostvarenja, samo su primjeri i nije im namjera da budu ograničenje cilja izuma. Stručnjaci područja primijenit će promjene i druge upotrebe koje su obuhvaćene duhom ovog izuma i definirane u zahtjevima.

Za stručnjaka područja očito je da je moguće varirati supstitucije i modifikacije ovog izuma, bez udaljavanja od cilja i duha izuma.

Svi spomenuti patenti i publikacije u specifikaciji indikativni su za stručnjake područja na koje se izum odnosi. Svi patenti i publikacije ovdje su uključeni citatom u istom opsegu kao da je svaka pojedina publikacija specifično i pojedinačno naznačena da je uključena citatom.

Claims

1. Postupak liječenja ili sprečavanja pojave raka koji obuhvaća, u sisavca kojem je takav tretman potreban, primjenu terapeutski učinkovite količine: inhibitora protein-kinaze formule (I): [image] naznačen time da je: R je izabran iz grupe koju čine vodik, piperazin-1-il-metil, 4-metilpiperazin-1-il-metil, piperidin-1-il-metil, 2-hidroksimetilpirolidin-1-il-metil, 2-karboksipirolidin-1-il-metil i pirolidin-1-il-metil; R1 je izabran iz grupe koju čine vodik, halo, alkil, supstituirani alkil, cikloalkil, supstituirani cikloalkil, aril, heteroaril, heteroaliciklička grupa, hidroksi, alkoksi, -C(O)NR8R9, -NR13R14, -(CO)R15 i -(CH2)rR16; R2 je izabran iz grupe koju čine vodik, halo, alkil, supstituirani alkil, trihalometil, hidroksi, alkoksi, cijano, -NR13R14, -NR13C(O)R14, -(CO)R15, aril, heteroaril i -S(O)2NR13R14; R3 je izabran iz grupe koju čine vodik, halogen, alkil, supstituirani alkil, trihalometil, hidroksi, alkoksi, aril, heteroaril, -NR13R14, -NR13S(O)2R14, -S(O)2NR13R14, -NR13C(O)R14, -NR13C(O)OR14, -(CO)R15 i -SO2R19; R4 je izabran iz grupe koju čine vodik, halogen, alkil, supstituirani alkil, hidroksi, alkoksi i -NR13R14; R5 je izabran iz grupe koju čine vodik, alkil, supstituirani alkil i -C(O)R10; R6 je izabran iz grupe koju čine vodik, alkil, supstituirani alkil i -C(O)R10; R7 je izabran iz grupe koju čine vodik, alkil, supstituirani alkil, aril, heteroaril, -C(O)R17 i -C(O)R10, uz uvjet da kad je R vodik, bar jedan od R5, R6 i R7 je -C(O)R10; ili R6 i R7 mogu zajedno tvoriti grupu izabranu između -(CH2)4-, -(CH2)5- i -(CH2)6-; R8 i R9 su neovisno izabrani iz grupe koju čine vodik, alkil, supstituirani alkil i aril; R10 je izabran iz grupe koju čine hidroksi, alkoksi, ariloksi, -N(R11)(alkilen)nR12, gdje je alkilenska grupa po želji supstituirana hidroksi-grupom, i -NR13R14; R11 je izabran iz grupe koju čine vodik, alkil i supstituirani alkil; R12 je izabran iz grupe koju čine -NR13R14, hidroksi, -(CO)R15, aril, heteroaril, -N+(O-)R13R14, -N(OH)R13 i -NHC(O)R18 (gdje je R18 alkil, supstituirani alkil, haloalkil ili aralkil); R13 i R14 su neovisno izabrani iz grupe koju čine vodik, alkil, supstituirani alkil, niži alkil supstituiran hidroksialkilamino-grupom, cijanoalkil, cikloalkil, supstituirani cikloalkil, aril i heteroaril; ili R13 i R14 mogu zajedno tvoriti heterocikličku grupu; R15 je izabran iz grupe koju čine vodik, hidroksi, alkoksi i ariloksi; R16 je izabran iz grupe koju čine vodik, -NR13R14, -(CO)R15 i -C(O)NR13R14; R17 je izabran iz grupe koju čine alkil, supstituirani alkil, cikloalkil, aril i heteroaril; R19 je izabran iz grupe koju čine alkil, supstituirani alkil, aril, aralkil, heteroaril ili heteroaralkil, a n i r su, neovisno, 1, 2, 3 ili 4; u kombinaciji s inhibitorom ciklooksigenaze, ili njegovom farmaceutski prihvatljivom soli.

2. Postupak liječenja ili sprečavanja pojave raka koji obuhvaća, u sisavca kojem je takav tretman potreban, primjenu terapeutski učinkovite količine: inhibitora protein-kinaze formule (I): [image] u kojem: R je izabran iz grupe koju čine vodik, piperazin-1-il-metil, 4-metilpiperazin-1-il-metil, piperidin-1-il-metil, 2-hidroksimetilpirolidin-1-il-metil, 2-karboksipirolidin-1-il-metil i pirolidin-1-il-metil; R1 je izabran iz grupe koju čine vodik, halo, alkil, supstituirani alkil, cikloalkil, supstituirani cikloalkil, aril, heteroaril, heteroaliciklička grupa, hidroksi, alkoksi, -C(O)NR8R9, -NR13R14, -(CO)R15 i -(CH2)rR16; R2 je izabran iz grupe koju čine vodik, halo, alkil, supstituirani alkil, trihalometil, hidroksi, alkoksi, cijano, -NR13R14, -NR13C(O)R14, -(CO)R15, aril, heteroaril i -S(O)2NR13R14; R3 je izabran iz grupe koju čine vodik, halogen, alkil, supstituirani alkil, trihalometil, hidroksi, alkoksi, aril, heteroaril, -NR13R14, -NR13S(O)2R14, -S(O)2NR13R14, -NR13C(O)R14, -NR13C(O)OR14, -(CO)R15 i -SO2R19; R4 je izabran iz grupe koju čine vodik, halogen, alkil, supstituirani alkil, hidroksi, alkoksi i -NR13R14; R5 je izabran iz grupe koju čine vodik, alkil, supstituirani alkil i -C(O)R10; R6 je izabran iz grupe koju čine vodik, alkil, supstituirani alkil i -C(O)R10; R7 je izabran iz grupe koju čine vodik, alkil, supstituirani alkil, aril, heteroaril, -C(O)R17 i -C(O)R10, uz uvjet da kad je R vodik, bar jedan od R5, R6 i R7 je -C(O)R10; ili R6 i R7 mogu zajedno tvoriti grupu izabranu između -(CH2)4-, -(CH2)5- i -(CH2)6-; R8 i R9 su neovisno izabrani iz grupe koju čine vodik, alkil, supstituirani alkil i aril; R10 je izabran iz grupe koju čine hidroksi, alkoksi, ariloksi, -N(R11)(alkilen)nR12, gdje je alkilenska grupa po želji supstituirana hidroksi-grupom, i -NR13R14; R11 je izabran iz grupe koju čine vodik, alkil i supstituirani alkil; R12 je izabran iz grupe koju čine -NR13R14, hidroksi, -(CO)R15, aril, heteroaril, -N+(O-)R13R14, -N(OH)R13 i -NHC(O)R18 (gdje je R18 alkil, supstituirani alkil, haloalkil ili aralkil); R13 i R14 su neovisno izabrani iz grupe koju čine vodik, alkil, supstituirani alkil, niži alkil supstituiran hidroksialkilamino-grupom, cijanoalkil, cikloalkil, supstituirani cikloalkil, aril i heteroaril; ili R13 i R14 mogu zajedno tvoriti heterocikličku grupu; R15 je izabran iz grupe koju čine vodik, hidroksi, alkoksi i ariloksi; R16 je izabran iz grupe koju čine vodik, -NR13R14, -(CO)R15 i -C(O)NR13R14; R17 je izabran iz grupe koju čine alkil, supstituirani alkil, cikloalkil, aril i heteroaril; R19 je izabran iz grupe koju čine alkil, supstituirani alkil, aril, aralkil, heteroaril ili heteroaralkil, a n i r su, neovisno, 1, 2, 3 ili 4; u kombinaciji sa selektivnim inhibitorom ciklooksigenaze-2, izabranim iz grupe koja se sastoji od: (i) spoja formule (II): [image] naznačenog time, da je: G je izabran iz grupe koju čine O, S i -NRa-, pri čemu je Ra vodik ili alkil; R10a je izabran iz grupe koju čine vodik i aril; R11a je izabran iz grupe koju čine karboksil, alkil, aralkil, aminokarbonil, alkilsulfonilaminokarbonil i alkoksikarbonil; R12a je izabran iz grupe koju čine haloalkil, alkil, aralkil, cikloalkil i aril, po želji supstituirani jednim ili više radikala izabranima između alkiltio, nitro i alkilsulfonil-grupe; a R13a je jedan ili više radikala, neovisno izabran iz grupe koju čine vodik, halo, alkil, aralkil, alkoksi, ariloksi, heteroariloksi, aralkiloksi, heteroaralkiloksi, haloalkil, haloalkoksi, alkilamino, arilamino, aralkilamino, heteroarilamino, heteroarilalkilamino, nitro, amino, aminosulfonil, alkilaminosulfonil, arilaminosulfonil, heteroarilaminosulfonil, aralkilaminosulfornil, heteroaralkilaminosulfonil, heterociklosulfonil, alkilsulfonil, hidroksiarilkarbonil, nitroaril, po želji supstituirani aril, po želji supstituirani heteroaril, aralkilkarbonil, heteroarilkarbonil, arilkarbonil, aminokarbonil i alkilkarbonil; ili R13a, zajedno s prstenom E tvori naftilni prsten; ili (ii) spoja formule (III): [image] naznačenog time, da je: A je izabran iz grupe koju čine djelomično nezasićeni ili nezasićeni heterociklički i djelomično nezasićeni ili nezasićeni karbociklički prstenovi; R1b je izabran iz grupe koju čine heterociklil, cikloalkil, cikloalkenil i aril, pri čemu je R1b po želji supstituiran, na položaju gdje je to moguće, jednim ili više radikala neovisno izabranima između grupa alkil, haloalkil, cijano, karboksil, alkoksikarbonil, hidroksil, hidroksialkil, haloalkoksi, amino, alkilamino, arilamino, nitro, alkoksialkil, alkilsulfinil, halo, alkoksi i alkiltio; R2b je izabran iz grupe koju čine metil i amino; a R3b je izabran iz grupe koju čini radikal izabran između sljedećih grupa: vodik, halo, alkil, alkenil, alkinil, okso, cijano, karboksil, cijanoalkil, heterocikliloksi, alkiloksi, alkiltio, alkilkarbonil, cikloalkil, aril, haloalkil, heterociklil, cikloalkenil, aralkil, heterociklilalkil, acil, alkiltioalkil, hidroksialkil, alkoksikarbonil, arilkarbonil, aralkilkarbonil, aralkenil, alkoksialkil, ariltioalkil, ariloksialkil, aralkiltioalkil, araloksialkil, alkoksiaralkoksialkil, alkoksikarbonilalkil, aminokarbonil, aminokarbonilalkil, alkilaminokarbonil, N-arilaminokarbonil, N-alkil-N-arilaminokarbonil, alkilaminokarbonilalkil, karboksialkil, alkilamino, N-arilamino, N-aralkilamino, N-alkil-N-aralkilamino, N-alkil-N-arilamino, aminoalkil, alkilaminoalkil, N-arilaminoalkil, N-aralkilaminoalkil, N-alkil-N-aralkilaminoalkil, N-alkil-N-arilaminoalkil, ariloksi, aralkoksi, ariltio, aralkiltio, alkilsulfinil, alkilsulfonil, aminosulfonil, alkilaminosulfonil, N-arilaminosulfonil, arilsulfonil i N-alkil-N-arilaminosulfonil; ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

3. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 spoj formule (II) u kojem: G je izabran iz grupe koju čine kisik i sumpor; R11a je izabran iz grupe koju čine karboksil, niži alkil, niži aralkil i niži alkoksikarbonil; R12a je izabran iz grupe koju čine niži haloalkil, niži cikloalkil i fenil; a R13a je jedan ili više radikala, neovisno izabran iz grupe koju čine vodik, halo, niži alkil, niži alkoksi, niži haloalkil, niži haloalkoksi, niži alkilamino, nitro, amino, aminosulfonil, niži alkilaminosulfonil, 5-člani heteroarilalkilaminosulfonil, 6-člani heteroarilalkilaminosulfonil, niži aralkilaminosulfonil, 5-člani heterociklosulfonil koji sadrži dušik, 6-člani heterociklosulfonil koji sadrži dušik, niži alkilsulfonil, po želji supstituirani fenil, niži aralkilkarbonil i niži alkilkarbonil; ili R13a, zajedno s prstenom E tvori naftilni radikal.

4. Postupak prema zahtjevu 3, naznačen time da: R11a je karboksil; R12a je niži haloalkil; a R13a je jedan ili više radikala, neovisno izabran iz grupe koju čine vodik, halo, niži alkil, niži alkoksi, niži haloalkil, niži haloalkoksi, niži alkilamino, amino, aminosulfonil, niži alkilaminosulfonil, 5-člani heteroarilalkilaminosulfonil, 6-člani heteroarilalkilaminosulfonil, niži aralkilaminosulfonil, niži alkilsulfonil, 6-člani heterociklosulfonil koji sadrži dušik, po želji supstituirani fenil, niži aralkilkarbonil i niži alkilkarbonil; ili R13a, zajedno s prstenom E tvori naftilni radikal.

5. Postupak prema zahtjevu 4, naznačen time da: R12a je izabran iz grupe koju čine fluorometil, klorometil, diklorometil, triklorometil, pentafluoroetil, heptafluoropropil, difluoroetil, difluoropropil, dikloroetil, dikloropropil, difluorometil i trifluorometil; a R13a je jedan ili više radikala, izabran iz grupe koju čine hidrido, kloro, fluoro, bromo, jodo, metil, etil, izopropil, terc-butil, butil, izobutil, pentil, heksil, metoksi, etoksi, izopropiloksi, terc-butiloksi, trifluorometil, difluorometil, trifluorometoksi, amino, N,N-dimetilamino, N,N-dietilamino, N-fenilmetilaminosulfonil, N-feniletilaminosulfonil, N-(2-furilmetil)aminosulfonil, nitro, N,N-dimetilaminosulfonil, aminosulfonil, N-metilaminosulfonil, N-etilsulfonil, N-(2,2-dimetiletil)aminosulfonil, N,N-dimetilaminosulfonil, N-(2-metilpropil)aminosulfonil, N-morfolinosulfonil, metilsulfonil, benzilkarbonil, 2,2-dimetilpropilkarbonil, fenilacetil i fenil; ili R13a, zajedno s prstenom E tvori naftilni radikal.

6. Postupak prema zahtjevu 5, naznačen time da: R12a je izabran iz grupe koju čine trifluorometil i pentafluoroetil; a R13a je jedan ili više radikala, izabran iz grupe koju čine hidrido, kloro, fluoro, bromo, jodo, metil, etil, izopropil, terc-butil, metoksi, trifluorometil, trifluorometoksi, N-fenilmetilaminosulfonil, N-feniletilaminosulfonil, N-(2-furilmetil)aminosulfonil, N,N-dimetilaminosulfonil, N-metilaminosulfonil, N-(2,2-dimetiletil)aminosulfonil, dimetilaminosulfonil, 2-metilpropilaminosulfonil, N-morfolinosulfonil, metilsulfonil, benzilkarbonil i fenil; ili R13a, zajedno s prstenom E tvori naftilni radikal.

7. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 izabran iz grupe koju čine: 6-kloro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-kloro-7-metil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 8-(1-metiletil)-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-kloro-7-(1,1-dimetiletil)-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-kloro-8-(1-metiletil)-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 2-trifluorometil-3H-naftopiran-3-karboksilna kiselina ; 7-(1,1-dimetiletil)-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-bromo-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 8-kloro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-trifluorometoksi-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 5,7-dikloro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 8-fenil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 7,8-dimetil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6,8-bis(dimetiletil)-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 7-(1-metiletil)-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 7-fenil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-kloro-7-etil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-kloro-8-etil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-kloro-7-fenil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6,7-dikloro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6,8-dikloro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 2-trifluorometil-3H-nafto[2,1-b]piran-3-karboksilna kiselina; 6-kloro-8-metil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 8-kloro-6-metil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 8-kloro-6-metoksi-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-bromo-8-kloro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 8-bromo-6-fluoro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 8-bromo-6-metil-2-trifluorometil-2H-I-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 8-bromo-5-fluoro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-kloro-8-fluoro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-bromo-8-metoksi-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-[[(fenilmetil)amino]sulfonil]-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-[(dimetilamino)sulfonil]-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-[(metilamino)sulfonil]-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-[(4-morfolino)sulfonil]-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-[(l,l-dimetiletil)aminosulfonil]-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-[(2-metilpropil)aminosulfonil]-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-metilsulfonil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 8-kloro-6-[[(fenilmetil)amino]sulfonil]-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-fenilacetil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6,8-dibromo-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 8-kloro-5,6-dimetil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6,8-dikloro-(S)-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-benzilsulfonil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-[[N-(2-furilmetil)amino]sulfonil]-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-[[N-(2-feniletil)amino]sulfonil]-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 6-jodo-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; 7-(1,1-dimetiletil)-2-pentafluoroetil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina; i 6-kloro-2-trifluorometil-2H-1-benzotiopiran-3-karboksilna kiselina; ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.

8. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 spoj izabran iz grupe koju čine: [image] 6-nitro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina [image] 6-kloro-8-metil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina [image] (S)-6-kloro-7-(1,1,dimetiletil)-2-(trifluorometil)-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina [image] 2-trifluorometil-2H-nafto[2,3-b]-piran-3-karboksilna kiselina [image] 6-kloro-7-(4-nitrofenoksi)-2-(trifluorometil)-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina [image] (S)-6,8-dikloro-2-(trifluorometil)-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina [image] 6-kloro-2-(trifluorometil)-4-fenil-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina [image] 6-(4-hidroksibenzoil)-2-(trifluorometil)-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina [image] 2-(trifluorometil)-6-[(trifluorometil)tio]-2H-1-benzotiopiran-3-karboksilna kiselina j) [image] 6,8-dikloro-2-trifluorometil-2H-1-benzotiopiran-3-karboksilna kiselina k) [image] 6-(1,1-dimetiletil)-2-(trifluorometil)-2H-1-benzotiopiran-3-karboksilna kiselina l) [image] 6,7-difluoro-1,2-dihidro-2-(trifluorometil)-3-kinolin-karboksilna kiselina m) [image] 6-kloro-1,2-dihidro-1-metil-2-(trifluorometil)-3-kinolin-karboksilna kiselina n) [image] 6-kloro-2-(trifluorometil)-1,2-dihidro-[1,8]naftiridin-3-karboksilna kiselina o) [image] (S)-6-kloro-1,2-dihidro-2-(trifluorometil)-3-kinolin-karboksilna kiselina ili njihova farmaceutski prihvatljiva sol, ili bilo koja njihova kombinacija.

9. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je navedeni selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 spoj formule (III) izabran iz grupe koju čine: a) [image] b) [image] c) [image] d) [image] e) [image] f) [image] ili njihova farmaceutski prihvatljiva sol, ili bilo koja njihova kombinacija.

10. Postupak prema zahtjevu 3, naznačen time da je navedeni selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 izabran iz grupe koju čine: a) [image] i b) [image] ili njihova farmaceutski prihvatljiva sol, ili bilo koja njihova kombinacija.

11. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je navedeni selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2: [image] ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol.

12. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je navedeni selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2: [image] ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol.

13. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time da je selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 4-[4-(metil)-sulfonil)fenil]-3-fenil-2(5H)-furanon, ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol.

14. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 4-[(5-metil-3-fenil)-4-izoksazolil]fenilsulfonamid, ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol.

15. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time da je selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 2-(6-metilpirid-3-il)-3-(4-metilsulfonilfenil)-5-kloropiridin, ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol.

16. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 4-[5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il]fenilsulfonamid, ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol.

17. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 4-[(2-metil-4-cikloheksil)-5-oksazolil]fenilsulfonamid, ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol.

18. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 4-[5-(3-fluoro-4-metoksifenil)-3-(difluorometil)-1H-pirazol-1-il]-benzensulfonamid, ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol.

19. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 (S)-6,8-dikloro-2-(trifluorometil)-2H-1-benzopiran-3-karboksilna kiselina, ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol.

20. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je selektivni inhibitor ciklooksigenaze-2 spoj formule: [image] gdje je: X je O ili S; R12b je niži haloalkil; R13b je izabran iz grupe koju čine hidrido i halo; R13b' je izabran iz grupe koju čine hidrido, halo, niži alkil, niži haloalkoksi, niži alkoksi, niži aralkilkarbonil, niži dialkilaminosulfonil, niži alkilaminosulfonil, niži aralkilaminosulfonil, niži heteroaralkilaminosulfonil, 5-člani heterociklosulfonil koji sadrži dušik i 6-člani heterociklosulfonil koji sadrži dušik; R13b'' je izabran iz grupe koju čine hidrido, niži alkil, halo, niži alkoksi i aril; a R13b''' je izabran iz grupe koju čine hidrido, halo, niži alkil, niži alkoksi i aril; ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol.

21. Postupak prema zahtjevu 20, naznačen time da: R12b je izabran iz grupe koju čine trifluorometil i pentafluoroetil; R13b je izabran iz grupe koju čine hidrido, kloro i fluoro; R13b' je izabran iz grupe koju čine hidrido, kloro, bromo, fluoro, jodo, metil, terc-butil, trifluorometoksi, metoksi, benzilkarbonil, dimetilaminosulfonil, izopropilaminosulfonil, metilaminosulfonil, benzilaminosulfonil, feniletilaminosulfonil, metilpropilaminosulfonil, metilsulfonil i morfolinosulfonil; R13b'' je izabran iz grupe koju čine hidrido, metil, etil, izopropil, terc-butil, kloro, metoksi, dietilamino i fenil; a R13b''' je izabran iz grupe koju čine hidrido, kloro, bromo, fluoro, metil, etil, terc-butil, metoksi i fenil.

22. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je inhibitor protein-kinaze spoj formule (I) u kojoj: R1 je izabran iz grupe koju čine vodik, halo, alkil, cikloalkil, aril, heteroaril, heteroaliciklička grupa, hidroksi, alkoksi, -(CO)R15,-NR13R14, -(CH2)rR16 i -C(O)NR8R9; R2 je izabran iz grupe koju čine vodik, halo, alkil, trihalometil, hidroksi, alkoksi, -NR13R14, -NR13C(O)R14, -(CO)R15, aril, heteroaril i -S(O)2NR13R14; R3 je izabran iz grupe koju čine vodik, halogen, alkil, trihalometil, hidroksi, alkoksi, -(CO)R15, -NR13R14, aril, heteroaril, -NR13S(O)2R14, -S(O)2NR13R14, -NR13C(O)R14 i -NR13C(O)OR14; R4 je izabran iz grupe koju čine vodik, halogen, alkil, hidroksi, alkoksi i -NR13R14; R5 je izabran iz grupe koju čine vodik, alkil i -C(O)R10; R6 je izabran iz grupe koju čine vodik, alkil i -C(O)R10; R7 je izabran iz grupe koju čine vodik, alkil, aril, 3-karboksipropil, heteroaril, -C(O)R17 i -C(O)R10; R6 i R7 mogu zajedno tvoriti grupu izabranu između -(CH2)4-, -(CH2)5- i -(CH2)6-; R8 i R9 su neovisno izabrani iz grupe koju čine vodik, alkil i aril; R10 je izabran iz grupe koju čine hidroksi, alkoksi, ariloksi, -N(R11)(alkilen)nR12 i -NR13R14; R11 je izabran iz grupe koju čine vodik i alkil; R12 je izabran iz grupe koju čine -NR13R14, hidroksi, -(CO)R15, aril i heteroaril; R13 i R14 su neovisno izabrani iz grupe koju čine vodik, alkil, cikloalkil i heteroaril; R13 i R14 mogu zajedno tvoriti grupu, izabranu iz grupe koju čine -(CH2)4-, -(CH2)5-,-(CH2)2O(CH2)2- i -(CH2)2N(CH3)(CH2)2-; R15 je izabran iz grupe koju čine vodik, hidroksi, alkoksi i ariloksi; R16 je izabran iz grupe koju čine vodik, -(CO)R15, -NR13R14 i -C(O)NR13R14; R17 je izabran iz grupe koju čine alkil, cikloalkil, aril i heteroaril; a n i r su, neovisno, 1, 2, 3 ili 4; ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol.

23. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je inhibitor protein-kinaze spoj formule (I), u kojoj: R6 je -COR10, gdje je R10 -NR11(CH2)nR12, a gdje je: R11 je vodik ili niži alkil; n je 2 ili 3; a R12 je -NR13R14, gdje su R13 i R14, neovisno, niži alkil.

24. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je inhibitor protein-kinaze spoj formule (I), u kojoj: R6 je -COR10, gdje je R10 -NR11(CH2)nR12, a gdje je: R11 je vodik ili niži alkil; n je 2 ili 3; a R12 je -NR13R14, gdje su R13 i R14 spojeni i tvore grupu izabranu između -(CH2)4-, -(CH2)5-,-(CH2)2O(CH2)2- ili -(CH2)2N(CH3)(CH2)2-.

25. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je inhibitor protein-kinaze spoj formule (I) u kojoj je R6 N-(2-dimetilamino-etil)aminokarbonil, N-(2-dietil-aminoetil)-N-metilaminokarbonil, N-(3-dimetilamino-propil)-aminokarbonil, N-(2-dietilaminoetil)-aminokarbonil, N-(2-etilaminoetil)-aminokarbonil, N-(3-etilaminopropil)-aminokarbonil ili N-(3-dietilamino-propil)aminokarbonil.

26. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je inhibitor protein-kinaze spoj formule (I) u kojoj je R6 N-(2-dietilaminoetil)aminokarbonil ili N-(2-etilamino-etil)aminokarbonil.

27. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je inhibitor protein-kinaze spoj formule (I) u kojoj je R6 3-pirolidin-1-il-propilaminokarbonil, 3-morfolin-4-il-propil-aminokarbonil, 2-pirolidin-1-il-etilaminokarbonil, 2-morfolin-4-il-etilaminokaronil, 2-(4-metilpiperazin-1-il)etilaminokarbonil, 2-(3,5-dimetilpiperazin-1-il)propilaminokarbonil, 3-(4-metilpiperazin-1-il)propilaminokarbonil, ili 3-(3,5-dimetilpiperazin-1-il)propilaminokarbonil.

28. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je inhibitor protein-kinaze spoj formule (I) u kojoj je R6 -COR10, gdje je R10 -NR13R14, pri čemu je R13 vodik, a R14 niži alkil supstituiran hidroksi, arilnom, heteroalicikličkom, heteroarilnom ili karboksi-grupom.

29. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je inhibitor protein-kinaze spoj formule (I) u kojoj je R6 2-triazin-1-il-propilaminokarbonil, 2-triazin-1-il-etilaminokarbonil, 3-imidazol-1-il-propilaminokarbonil, piridin-4-il-metil-aminokarbonil, 2-piridin-2-il-etilaminokarbonil ili 2-imidazol-1-il-etilaminokarbonil.

30. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je inhibitor protein-kinaze spoj formule (I), u kojoj: R6 je -COR10, gdje je R10 -NR11(CH2)nR12, a gdje je: R11 je vodik ili niži alkil; n je 2 ili 3; a R12 je -NR13R14, gdje su R13 i R14 spojeni i tvore heterocikličku grupu.

31. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je inhibitor protein-kinaze spoj formule (I), u kojoj: R6 je -COR10, gdje je R10 -NR11(CH2)nR12, a gdje je: R11 je vodik ili niži alkil; n je 2 ili 3; a R12 je -NR13R14, gdje su R13 i R14 spojeni i tvore heterocikličku grupu od 5, 6 ili 7 atoma, koja unutar prstena sadrži karbonilnu grupu i jedan ili dva dušikova atoma.

32. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je inhibitor protein-kinaze spoj formule (I) u kojoj je R6 2-(3-oksopiperazin-1-il)etilaminokarbonil, 2-(imidazolidin-1-il-2-on)etilaminokarbonil, 2-(tetrahidropirimidin-1-il-2-on)etilaminokarbonil, 2-(2-oksopirolidin-1-il)-etilaminokarbonil, 3-(3-oksopiperazin-1-il)propil-aminokarbonil, 3-(imidazolidin1-il-2-on)propil-aminokarbonil, 3-(tetrahidropirimidin-1-il-2-on)-propilaminokarbonil ili 3-(2-oksopirolidin-1-il)propil-aminokarbonil.

33. Postupak prema bilo kojem od zahtjeva 22-32, naznačen time da je inhibitor protein kinaze spoj formule (I) u kojoj: R5 je izabran iz grupe koju čine vodik i niži alkil; a R7 je izabran iz grupe koju čine vodik, alkil, aril, heteroaril i -C(O)R17, pri čemu je R17 hidroksi, niži alkil ili aril.

34. Postupak prema zahtjevu 33, naznačen time da: R1 je vodik, niži alkil, -C(O)NR8R9, cikloalkil ili aril; R2 je vodik, halo, niži alkoksi, cijano, aril, -SO2R20 ili -S(O)2NR13R14, pri čemu je R13 vodik, a R14 je vodik, aril ili alkil; R3 je izabran iz grupe koju čine vodik, niži alkoksi, -C(O)R15, -NR13C(O)R14, aril, heteroaril; a R4 je vodik.

35. Postupak prema zahtjevu 34, naznačen time da: R1 je vodik ili fenil; R2 je vodik, kloro, bromo, fluoro, metoksi, etoksi, fenil, dimetilaminosulfonil, cijano, metilsulfonil, etilsulfonil, benzilsulfonil, 3-klorofenil-aminosulfonil, karboksi, metoksi, aminosulfonil, metilaminosulfonil, fenilaminosulfonil, piridin-3-il-aminosulfonil, dimetilaminosulfonil ili izopropilamino-sulfonil; R3 je izabran iz grupe koju čine vodik, metoksi, karboksi, fenil, piridin-3-il, 3,4-diklorofenil, 2-metoksi-5-izopropilfenil, 4-n-butilfenil, 3-izopropilfenil; a R4 je vodik.

36. Postupak prema zahtjevu 35, naznačen time da: R1 je vodik; R2 je vodik, cijano, fluoro, kloro ili bromo; R3 je fenil; a R4 je vodik.

37. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je: R1 je vodik, niži alkil, -C(O)NR8R9, cikloalkil ili aril; R2 je vodik, halo, niži alkoksi, cijano, aril ili -S(O)2NR13R14, pri čemu je R13 vodik, a R14 je vodik, aril ili alkil; R3 je izabran iz grupe koju čine vodik, niži alkoksi, -C(O)R15, -NR13C(O)R14, aril i heteroaril; a R4 je vodik.

38. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je: R1 je vodik ili metil; R2 je vodik, cijano, kloro, fluoro ili bromo; R3 je izabran iz grupe koju čine vodik ili fenil; a R4 je vodik.

39. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je R6 -COR10, gdje je R10 -NR13R14, pri čemu je R13 vodik, a R14 niži alkil supstituiran hidroksi-grupom, niži alkil supstituiran hidroksialkilamino ili karboksi-grupom, ili -NR18R19, gdje su R18 i R19 neovisno vodik ili niži alkil.

40. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je R6 [2-(dietilamino)-2-hidroksi]etilaminokarbonil, 2-(N-etil-N-2-hidroksietilamino)-etilaminokarbonil, karboksimetilaminokarbonil ili 2-hidroksietil-aminokarbonil.

41. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je R6 -NR11(CH2)nR12, gdje je R12 -N+(O-)NR13R14 ili -N(OH)R13, pri čemu su R13 i R14 neovisno niži alkil.

42. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je R6 2-(N-hidroksi-N-etilamino)etilaminokarbonil ili 2-[N+(O-)(C2H5)2]etil-aminokarbonil.

43. Postupak prema zahtjevu 41 ili 42, naznačen time da je: R5 je izabran iz grupe koju čine vodik ili metil; a R7 je izabran iz grupe koju čine metil, vodik ili fenil.

44. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je: R1 je vodik; R2 je vodik, cijano, kloro, fluoro ili bromo; R3 je vodik; a R4 je vodik.

45. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je inhibitor kinaze izabran iz grupe koju čine: [image] ili njihova L-malatna sol.

46. Postupak prema zahtjevu 2, naznačen time da je inhibitor kinaze spoj formule: [image]

47. Postupak liječenja ili sprečavanja raka, naznačen time da obuhvaća, u sisavca kojem je takav tretman potreban, primjenu terapeutski učinkovite količine: inhibitora protein-kinaze formule (I): [image] u kombinaciji sa selektivnim inhibitorom ciklooksigenaze-2, formule: [image] ili njegovom farmaceutski prihvatljivom soli.

48. Postupak liječenja ili sprečavanja raka, naznačen time da obuhvaća, u sisavca kojem je takav tretman potreban, primjenu terapeutski učinkovite količine: inhibitora protein-kinaze formule (I): [image] u kombinaciji sa selektivnim inhibitorom ciklooksigenaze-2, formule: [image] ili njegovom farmaceutski prihvatljivom soli.

49. Postupak liječenja ili sprečavanja raka, naznačen time da obuhvaća, u sisavca kojem je takav tretman potreban, primjenu terapeutski učinkovite količine: inhibitora protein-kinaze formule (I): [image] u kombinaciji sa selektivnim inhibitorom ciklooksigenaze-2, formule: [image] ili njegovom farmaceutski prihvatljivom soli.

50. Postupak liječenja ili sprečavanja raka, naznačen time da obuhvaća, u sisavca kojem je takav tretman potreban, primjenu terapeutski učinkovite količine: inhibitora protein-kinaze formule (I): [image] u kombinaciji sa selektivnim inhibitorom ciklooksigenaze-2, formule: [image] ili njegovom farmaceutski prihvatljivom soli.