FI104493B - Pichia pastoris-hiivan happaman fosfataasin geeni - Google Patents

Description

104493

Pi chi a pastori s—hi i van happaman -f os-f ataasi n geeni Tämä keksintö kohdistuu yhdistelmä-DNA-biotekniikan alaan, jossa käytetään hyväksi hiivaisäntäjärjestelmiä ja ilmentämis-vektoreita. Keksinnön eräs piirre kohdistuu uusiin DNA-kappa-leisiin, jotka sisältävät Pichia pastor i s-hi i van happaman -fos-fataasin geenin (SEQ ID NOsl) osittain tai kokonaisuudessaan. Keksinnön eräs toinen piirre kohdistuu uusiin vektoreihin, jotka sisältävät Pichia pastor i s-hi i van happaman fos-fataasin geenistä (SEQ ID N0:1) peräisin olevia DNA-kappaleita. Edelleen oheisen keksinnön eräs muu piirre kohdistuu isäntäsolui hi n, jotka on transformoitu Pichia pastori s-hi i van happaman -fos-fa-taasin geenistä (SEQ ID N0:1) peräisin olevia kappaleita sisältävillä vektoreilla. Edelleen, keksinnön eräs muu piirre kohdistuu edellä kuvattujen DNA—kappaleiden käyttöön heterologis-ten proteiinien ilmentämisen ja/tai erittämisen helpottamiseksi hi i vessa.

Sen ansiosta, että yhdistelmä—DNA—biotekniikka on kehittynyt viime vuosina, mikro-organismien avulla voidaan tuottaa hallitusti hyvin erilaisia käyttökelpoisia polypeptidejä. Monia polypeptidejä, esimerkiksi ihmisen kasvuhormonia, leukosyytti -interferoneja, ihmisen insuliinia sekä ihmisen proinsuliim a on jo tuotettu erilaisilla mikro-organismei11 a. Tällä hetkellä jo käytettävissä olevien tekniikoiden jatkuvan soveltamisen . odotetaan johtavan monien muiden käyttökelpoisten polypeptidi -tuotteiden tuotannon onnistumiseen.

Yhdistelmä—DNA-tekniιkassa käytetyt perustekniikat ovat tuttuja alan asiantuntijalle. Elementeistä, joiden läsnäolo on toivottavaa yhdistelmä—DNA—tekniikkaa käytäntöön sovellettaessa, voidaan mainita seuraavat, niihin kuitenkaan rajoittumatta: (1) geeni, joka koodaa yhtä tai useampaa toivottua polyoeptidiä ja joka on liittynyt toimivasti sopiviin säätelvsekvens— seihin, jotka ovat välttämättömiä geenin ilmentymiselle i säntäorqani smissa; ; (23 vektori, johon tämä geeni voidaan istuttaa; 104493

O

(3) sopiva isäntäorganismi, johon tätä geeniä kantava vektori voidaan trans-f ormoi da; (4) mikäli heterologisen proteiinin erittyminen on toivottavaa, signaalisekvenssi, joka kykenee ohjaamaan heterologisen proteiinin erityspolui 1 e i säntäsol Ltssa, ja edelleen solusta ui os; (5) transformoi ntijärjestelmä; sekä (6) menetelmä trans-f ormantti en valikoimiseksi.

Vhdistelmägeenimuodosteet voidaan suunnitella siten, että yh-distelmäproteiini kulkee isännän erityspolkua pitkin ja erittyy kasvualustaan. Erittyminen on yhdi stel mä-DNA-tekni sen ilmentymisen toivottu tapa useista syistä. Ensinnäkin, eräillä hetero-logisilla proteiineilla on toksista vaikutusta isäntäorganis-miin. Kun tällaiset heterologiset geeni tuotteet erittyvät, eivätkä keräänny isäntään, niin tällöin ne vähemmän todennäköisesti häiritsevät solun normaalitoimintoja. Toiseksi, eräät proteiinit, jotka ovat inaktiivisia solun sisällä tuotettuina, ovat aktiivisia erittyneinä. Kolmanneksi, erittyminen alustaan tekee tarpeettomaksi isäntäsolujen rikkomisen tuotteen talteen— saamiseksi. Tuotteen puhdistaminen on paljon helpompaa ja halvempaa, kun tuote on läsnä kasvual Listassa. Ja neljänneksi, koska vhdistelmä-DNA-tekninen tuote on läsnä elatusalustassa, niin toivottua tuotetta voidaan poistaa jatkuvasti ja alustaa voidaan kierrättää.

Useimmat erittyvät proteiinit ilmentyvät alunperin solun sisällä esiasteena tai esiproteiinimuodossa, joka sisältää amino-päätteeseen liittyneen, signaalipeptidinä tunnetun jatkeen. Tällä signaalipeptidii1 a on olennainen tehtävä siihen liittyneen poiypeptidin kuljettamiseksi solun rajaksi voihin ja/tai niiden läpi. Sitten signaalipeptidaasi pilkkoo signaalipeptidi n proteolyyttisesti erittymisen ai kana tai sen jälkeen, jolloin saadaan täysin kehittynyt proteiinituote.

Heterologisen tai vieraan proteiinin erittyminen voidaan saada aikaan liittämällä heterol ogi sta. DNA: ta oleva koodaava sekvens— ; si si gnaali peptidi ä koodaavaan DNA:hän. Toivottavaa olisi kyetä 104493 eristämään tätä signaalipeptidiä koodaava signaalisekvenssi, mikä helpottaisi erittämistä.

Signaalisekvenssit ovat erityisen käyttökelpoisia muodostettaessa i1mentämisvektoreita. Tällaisten vektoreiden käyttö te' i si mahdolliseksi sopivien isäntäsolujen t ransfor moi nni n siten, että. ne tuottaisivat ja erittäisivät heterol ogi si a geenituotteita. Esimerkkeinä johtosekvensseistä, joita on käytetty menestyksellisesti yhdistelmä—DNA-teknisten proteiinien erittämiseen hiivaisännistä, voidaan mainita johtosekvenssit, jotka ovat peräisin Saccharomvces cerevisiae-hiivan alfa-parit-telutekijän geenistä, a-parittelutekijän geenistä sekä tappaja-toksiinin geenistä. Alalla ei olla kuvattu signaalisekvenssi n eristämistä metyl otrof i sesta hiivasta, kuten Pichia pastori s— hi i vasta.

On tarkoituksenmukaista, että tällaisissa vektoreissa hetero-1ogisten geenituotteiden ilmentymisen säätelemiseksi käytetty promoottori on signaalisekvenssiin luontaisesti liittynyt promoottori. Erityisen edullista olisi se, että signaalisekvens-siin luontaisesti liittynyt promoottori saisi aikaan tehokasta DNA—kapi oitumista ja reagoisi ulkoisiin ympäristöärsykkeisiin. Esimerkkinä tällaisesta promoottori sta voidaan mainita Pi chi a pastori s-hi i van happaman -f os-f ataasi n (PHOT) geenin (SEQ IE) N0:2) 5’-säätelyalue, joka kopioituu tehokkaasti, kun alustassa ei ole läsnä -f os-f aatti a, ja jota alustassa läsnäoleva fosfaatti tukahduttaa.

Usein on toivotavaa transformoida Pichia pastoris-isäntä sellaisella yhdistelmä-DNA-muodosteella, joka yhdentyy täsmälleen tiettyyn asemaan Pichia pastoris—hiivan perimässä. 5’— ja 37— sekvenssit, jotka reunustavat Pichia pastori s PHOl—geeni ä ja jotka tunnetaan myös ensimmäisenä ja toisena istutettavana DNA—kappaleena, vastaavasti, käytetään i1mentämisvektoreissa yhdistelma-DNA-sekvenssien yhdentymisen ohjaamiseksi PHOl-sijäi nti kohtaan. Kyky yhdentää yhdistelmä-DNA-sekvenssejä PH01-kohtaan on edullista ainakin kahdesta syystä, jotka ovat: 1) Ϊ FH01-si iai nti kohdassa tai Pichia-hiιvan muussa sijäi nti kohdassa 104493 4 samanlaisten tai erilaisten i1mentämiskasetti en moninkertaisia kopioita käsittävien Pi chi a pastori s-i1mentämi skanto ien kehittäminen; tai 2) yhden tai useamman i1mentämiskasetin stabiili yhdentäminen vain PH01-si jäi nti kohtaan isäntänä käytetyssä Pichia pastoris-kannassa. jossa olennaisen geenin tai metanoli— metaboliareittiin kuuluvan geenin rikkoutuminen on epätoivottavaa.

Soluissa, joiden PHD1-geeni on rikottu, todetaan samalla happaman f os-fataasi entsyymi n aktiivisuuden häviäminen. Pho---f eno-tyyppi . joka osoittaa PHO_l —geenin rikkoutumisen, voidaan seuloa, maljaamalla solut i ndi kaattori mal joi 1 le, joissa -fos-f aatti pi -toisuus on pieni, ja antamalla pesäkkeiden kasvaa yön yli. Pesäkkeiden, joissa PHQl-qeeni on rikkoutunut, ovat valkoisia, kun taas ne pesäkkeet, joissa PHD1—geeni on ehyt, ovat vihreitä. Tämä koi ori metrinen seulonta on nopea ja helppo menetelmä sellaisten solujen ilmaisemiseksi, joissa soluissa i1mentämis— kasetit ovat yhdentyneet oikealla tavalla PHOl—si jäi nti kohtaan sen rιk koen.

Niinpä alan merkittävä edistysaskel olisi saada eristetyksi sellainen signaeiisekvenssi, joka helpottaisi proteiinien erittymistä ιsäntäsolusta.

Lisäksi olisi edullista saada eristetyksi sellainen 5 ’—säätelyalue, joka johtaisi tehokkaaseen DNA-kopioitumiseen ja joka reagoisi ulkoisille ympäristöärsvkkeiI1 e. Tällä hetkellä alalla ei tunneta mitään sellaista 5’—säätelyaluetta, joka kopioituisi tehokkaasti sen seurauksena, ettei alustassa ole läsnä -kosteat tia, ja jota voitaisi in käyttää erittäin tuotteliaassa Jermentointi hiιvessa Pichia pastoris.

Lisäksi edullista olisi saada eristetyksi happaman -f os-fataasi n (acid phosphatase; AP) rakenneoeeni.

Samoin olisi edullista saada aikaan uusia vektoreita, jotka käsittävät kappaleita happaman -f os-fataasi n geenistä.

104493 5

Lisäksi olisi edullista saada eristetyksi kopioitumisen 3’-päättäjäsekvenssi.

Samoin olisi edullista saada aikaan yhdentävät vektorit, jotka ohjaisivat yhdentymisen Pichia oastoris PHQl-si iaintikohtaan.

Samoin olisi edullista saada aikaan menetelmä hajoamistuotteiden tunnistamiseksi.

Näin ollen oheisen keksinnön tavoitteena on saada aikaan signaali sekvenssi, joka helpottaa proteiinien erittymistä soluista.

keksinnön tavoitteena on myös saada aikaan 5'-säatelyalue, joka kopioituu fosfaatin puuttumisen seurauksena.

Oheisen keksinnön muuna tavoitteena on saada aikaan Pi chi a pastor i s-hi i van happaman -f osf ataasi n rakennegeeni n DNA-sekvens-si (SEQ ID NO:4).

Edelleen, oheisen keksinnön tavoitteena on saada aikaan uudet vektorit, joiden käsittämä säätelyalue ja/tai signaalisekvenssi ovat liittyneet toimivasti sellaiseen heterologiseen DNA—sekvenssiin, johon on koodautunut vähintään yksi polyoeptidi, sekä keino tämän säätelyalueen indusoimiseksi tämän heterologisen DNA—sekvenssi n ilmentämisen helpottamiseksi.

Oheisen keksinnön tavoitteena on edelleen saada aikaan happaman fosfataasin geenistä peräisin oleva kopi oi tumi sen 3’— päättäjä-sekvenssi .

Edelleen, keksinnön tavoitteena on saada aikaan yhdentävät vektorit, jotka ohjaavat yhdentymisen Pichia pastoris-hiivan PH01-si iainti kohtaan.

Lisäksi keksinnön tavoitteena on saada aikaan menetelmä hajoa-mi stuottei den tu.nni stami seksi - 6 104493

Oheisen keksinnön muut piirteet, tavoitteet ja edut ovat ilmeisiä seuraavat kuvauksen, esimerkkien ja patenttivaatimusten perusteella. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

5

Oheisen keksinnön mukaisesti aikaan saadaan uusi DNA-kappale, joka käsittää signaalisekvenssin P-irhia pastori s-hiivan happaman fosfataasin geenistä (SEQ ID NO:3), joka sekvenssi helpottaa proteiinien erittymistä soluista.

10

Keksinnön eräään toisen piirteen mukaisesti aikaan saadaan uusi DNA-kappale, joka käsittää Pirh-ia pastori s-hi -ivan happaman fosfataasin 51-säätelyalueen (SEQ ID N0:2).

15 Oheisen keksinnön erään muun piirteen mukaisesti aikaan saadaan uusi DNA-kappale, joka käsittää DNA-sekvenssin Pirhia pas^nris-hiivan happaman fosfataasin (AP) rakennegeenistä (SEQ ID NO:4).

Edelleen keksinnön erään muun piirteen mukaisesti aikaan saa-20 daan uusia vektoreita, jotka käsittävät mainitun säätelyalueen ja/tai signaalisekvenssin liittyneenä toimivasti sellaiseen he-terologiseen DNA-sekvenssiin, johon on koodautunut vähintään yksi polypeptidi, sekä keino tämän säätelyalueen indusoimiseksi mainitun heterologisen DNA:n ilmentämisen helpottamiseksi.

25

Oheisen keksinnön erään muun piirteen mukaisesti aikaan saadaan uudet DNA-vektorit, jotka käsittävät 3' kopioinnin päättäjä-sekvenssin P-irhia pastoria-hi ivan happaman fosfataasin geenistä (SEQ ID NO:5).

30

Oheisen keksinnön erään muun piirteen mukaisesti aikaan saadaan *· yhdentävät vektorit, jotka ohjaavat vektorin yhdentymisen phqi-sijaintikohtaan Pirhia pastoris-hiivasaa.

3b Edelleen tämän keksinnön eräänä muuna piirteenä on menetelmä rikkoutumistuotteiden tunnistamiseksi.

Kuvio 1 esittää Pirhia pastnris-hiivan happaman fosfataasin geenin (SEQ ID N0:1) restriktiokarttaa.

7 104493 □heisessa keksinnössä saadaan aikaan uusi eristetty DNA-kappa-le, joka käsittää happaman fosfataasin geenin, mukaan lukien sen promoottorin (tai 5’—säätelyalueen), signaali sekvenssi n, kopioinnin päättäjäsekvenssin sekä reunustavat sekvenssit, jotka ovat peräisin Pichia pastoris-hiivasta (SEQ ID N0:1).

Hapan fosfataasi (AP) on solun ulkopuolinen entsyymi, jota Pichia pastoris—hiiva sekä muut hiivat erittävät olosuhteissa, joista epäorgaaninen fosfaatti alkaa ehtyä. Tämä erittynyt hapan fosfataasi katalysoi fosfaatin poistumista orgaanisista substraateista, jolloin fosfaattia saadaan vapautumaan solun kasvua ja elossapysymistä varten.

Hapanta fosfaasia koodaava geeni on eristetty ja sitä on tutkittu monissa hiivai ajeissa, ja happaman fosfataasin geenin ilmentymisen säädeltävä luonne on kyetty paikai 1istamaan happaman fosfataasin promoottorielementtiin. Olosuhteissa, joissa epäorgaanisen fosfaatin pitoisuus alustassa on pieni, happaman fosfataasin promoottori (tai 5'-säätelvaiue) "käynnistyy", happaman fosfataasin geeni kopioituu ja sitten siitä saadaan luennalla hapan fosfataasientsyymi. Tämä juuri syntetoitunut hapan fosfataasientsyymi vapauttaa fosfaattia orgaanisista substraateista, jolloin fosfaattia saadaan solun käyttöön.

Tämän seurausta oleva fosfaattipitoisuuden suureneminen moduloi happaman fosfataasin promoottoria, johtaen happaman fosfataasin geenin vähäisempään kapi oitumiseen samalla kun happaman fosfa-taasioroteilm n tarve pienenee. Täten happaman fosfataasin promoottoria voidaan indusoida tai tukahduttaa vastaavasti pienellä tai suurella f osf aatt i pi toi suudel 1 a. Pichia pastons-hiivan happaman fosfataasin promoottorin tunnistaminen ja eristäminen en merkittävää. Koska happaman fosfataasin ilmentämisen säätely vaihtelee niiden hiivalajien keskuudessa, joissa la-jei ssa tätä ilmentymistä on analysoitu, niin on odotettavaa, että Pichia pastoris-hiivassa havaittu happaman fosfataasin ilmentymisen tiukka säätely riippuu homologisten promoottori-sekvenssien saatavuudesta ja käytöstä.

• B 104493

Pi chi a pastoris-hiivan PH01-geeni n signaalisekvenssin (SEQ ID NO:3) tunnistaminen ja eristäminen on, sen lisäksi, että se on ensimmäinen Pi chi a pastoris-oeenistä eristetty signaalisekvenssi , sikäli merkittävää, että se on ensimmäinen metylotro--fisesta hiivasta eristetty si gnaal i sekvenssi . Se on todettu yhtä hyväksi tai paremmaksi kuin geenin luontainen signaali— sekvenssi, esimerkiksi tPA-geenistä (tPA = kudoksen plasmino— geeni aktivaattori) tai invertaasigeenistä peräisin oleva signaali peptidi, ajatellen kykyä ohjata heterologisten proteiinien kuten tPA:n tai invertaasin erittymistä Pichia pastoris-hii-vasta.

Usein on toivottavaa vhdentää vhdistelmä-DNA-tekniset ilmen-tämisvektorit isännän perimään sen sijaan, että ne jätettäisiin autonomisesti repiikoituviksi elementeiksi. Yhdennetyt vektorit ovat merkittävästi stabiilimpia kuin autonomiset vektorit, ja ne ovat edullisia oheisen keksinnön käytännön sovelutuksissa. Erityisen edullisia ovat lineaariset, kohtaspesifiset vhden-netvt vektorit, joita on kuvattu patenttijulkaisussa US 4 882 279, joka liitetään oheen tällä viittauksella. Tällaiset vektorit käsittävät peräkkäin vähintään 1) ensimmäisen istutettavan DNA-kappaleen; 2) valikoitavan merkιtsingeenin; sekä 3) toisen istutettavan DNA-kappaleen.

Ensimmäinen ja toinen istutettava DNA-kappale ovat kumpikin vähintään noin 200 nukleotidin pituisia, ja niissä on nukleotidi sekvenssejä, jotka ovat homologisia transformoitavan lajin perimä-DNA:n osien kanssa. Yhdentävän vektorin eri komponentit sijaitsevat peräkkäin muodostaen lineaarisen DNA-kappaleen siten, että ι1mentämiskasetti sekä valikoitava merkitsingeeni sijaitsevat ensimmäisen istutettavan DNA-kappaleen 3'-pään ja toisen istutettavan DNA-kappaleen 5’-pään välissä. Ensimmäinen ja toinen istutettava DNA-kappale ovat suuntautuneet toisiinsa nähden tässä peräkkäisessä lineaarisessa kappaleessa samalla tavalla, kuin ne ovat suuntautuneet 1ähtöperimässä.

Ensimmäisenä ja toisena istutettavana DNA-kappaleena kävttö-; kelpoisia nukleotidi sekvenssejä ovat sellaiset nukleotidi sek- 9 104493 venssit, jotka ovat homologisia sen luonnollisen perimäkohdan, jossa perimämuokkauksen on tarkoitus tapahtua, erillisten osien kanssa. Täten, esimerkiksi, jos perimämuokkauksen on tarkoitus tapahtua happaman fosfataasin geenin sijainti kohdassa, niin tällöin käytettyjen ensimmäisen ja toisen istutettavan DNA-kappaleen on oltava sekvenssejä, jotka ovat homologisia hapaman fosfataasin geenin sijäinti kohdan erillisten osien kanssa. Perimämuokkauksen toteuttamiseksi tässä lineaarisessa kappaleessa näiden kahden istutettavan DNA-kappaleen on suuntauduttava toistensa suhteen samalla suhteellisella tavalla kuin 1ähtöperimässä. Esimerkkeinä nukleotidisekvensseistä, joita voidaan käyttää ensimmäisenä ja toisena istutettavana DNA-kappal eena, ovat happaman fosfataasin PH01-oeeni n. aikoholioksi -daasin AOXl-oeenin. hi stidinoli-dehydrogenaasin HIS4-neenin sekä dihydroksiasetoni-syntetaasin DHAS-geeni n joukosta valitut nukleoti di sekvenssi t.

Ensimmäinen istutettava DNA-kappale voi sisältää toimintakykyisen säätelyalueen, joka voi käsittää i1mentämiskasetissa käytetyn säätelyalueen. Tämän ensimmäisen istutettavan DNA-kappaleen käyttö i1mentämiskasetin säätelyalueena on keksinnön edullinen suoritusmuoto. Istutuskohta tai -kohdat sekä 3’-päättä jäsekvenssi voidaan valinnaisesti sijoittaa välittömästi 3’ ensimmäiseen istutettavaan DNA—kappaleeseen nähden. Lineaarisen, kohtaspesifisen yhdentävän vektorin tähän konformaatioon liittyvänä lisäetuna on se, että aikaan saadaan valmis kohta rakennegeenin istuttamiseksi tarvitsematta lisätä yhteensopivaa 3'—päättäjäsekvenssi ä.

DNA—kappaleeseen, jota käytetään isäntäkannan transformointi in, on myös sisällytettävä vähintään yksi valikoitava merkitsin-qeeni. Se helpottaa niiden organismien, joihin transformoiva DNA on sisältynyt, valikointia ja eristämistä. Tämä merkitsin-geeni saa transformoidussa organismissa aikaan sellaisen fenotyyppi sen piirteen, jota isännällä ei ollut, ja josta esimerkkinä voidaan mainita sellaisen erityisen aminohapon, jonka biosvnteettinen polku on puutteellinen transformoimattomassa : isännässä, tuotantokyvyn palautuminen tai antibiootin vastus 104493 10 tuskyky tai muu vastaava. Vaiikoitava merkitsingeeni voidaan valita esimerkiksi Pichia pastoris- ja Saccharomvces cerevi-si ae-hi i vasta peräisin olevan HIS4-qeenin ja ARG4-geenin, Saccharomvces cerevisiae-hiivasta peräisin olevan invertaasigeeni n (SLJC2) sekä E. col i -bakteeri n si i rrettävi stä elementeistä Tn 601 ta: Tn9Q3 peräisin olevan, kanamysiinin vastustuskyvyn aikaansaavan geenin joukosta.

Mikäli ensimmäinen istutettava DNA-kappale ei sisällä säätely-aluetta, niin sopiva säätelyalue täytyy istuttaa toimivasti kytkeytyneenä rakennegeeniin toimintakykyisen i1mentämiskasetin aikaansaamiseksi. Samoin, mikäli istutuskohta ei käsitä täydellisen i1mentämiskasetin edellyttämää 3'-päättäjäsekvenssiä. niin tallein 3’—päättäjäsekvenssi on kytkettävä toimivasti istutettavaan rakennegeeniin.

On tärkeätä, että yhdentyminen tapahtuu perimän sellaisessa asemassa, joka ei häiritse isäntäsolua. Yllättävä havainto oli se, ettei yhdistelmä-DNA—teknisen i1mentämismuodosteen yhdentäminen Pichia pastor i s-hi i van happaman -f os-f at aasi n geenin sijaintipa!kkaan (PHQ1) ollut haitallista Pichia—isännälle. vaan johti yhdistelmä—DNA-sekvenssien pysyvään yhdentymiseen. PHOl-si iaintlkohtaan kohdistettu yhdentäminen toteutetaan käyttämällä yhdistelmä-DNA—teknisissä vektoreissa Pichia pastor i s-hii van PHQ1-geeni ä reunustavia 5’- ja 3’-sekvenssejä . (joi ta kutsutaan myös ensimmäiseksi ja toiseksi istutettavaksi DNA—kappaleeksi).

Toisena havaintona oli menetelmä transformoitujen solujen seulomiseksi siten, että kyettiin tunnistamaan ne solut, joihin i1mentämisvektorin sekvenssit olivat yhdentyneet PHQl-sijäi n — tikohtan rikkoen. Niissä soluissa, joissa PH01—geeni oli rikkoutunut, happaman -f osfataasi entsyymi n aktiivisuus oli samalla menetetty. Pho“—fenotyyppi, joka osoittaa PH01—geeni n rikkoutumisen, voidaan seuloa maljäämällä solut indikaattorimaljoi 1-le, joissa -f os-f aat t i pi toi suu.s on pieni, ja antamalla pesäkkeiden kasvaa von yli. Ne pesäkkeet, joissa PHQ1-geeni on rikkou-• tunut, ovat valkoisia, kun taas ne pesäkkeet, joissa PHOl—geeni M 104493 on ehyt, ovat vihreitä. Tämä koi ori metrinen seulonta on nopea ja vaivaton menetelmä niiden solujen ilmaisemiseksi, joihin soluihin i1mentämiskasetit ovat yhdentyneet oikealla tavalla F'HDl-si jainti kohtaan.

Pichia pastoris-hi i van happaman -fosf ataasin geenin (SEQ ID NO:l) osittainen restriktiokartta on esitetty kuviossa 1. Tämän geenin tunnusomaisia piirteitä on havainnollistettu edelleen nukleotidi sekvenssi 11ä, joka on esitetty taulukossa 1.

Oheisessa keksinnössä saadaan myös aikaan uudet DNA-kaopaleet. jotka käsittävät Pichia pastori s-hi i van happaman f os-f ataasi n 5’-säätelyalueen (SEQ ID NO:2), signaalιsekvenssi n (SEQ ID N0:3), rakennegeenin (SEQ ID NO:4) sekä 3* kopioitumisen päättä jäsekvenssi n (SEQ ID NO:5).

Seuraavissa taulukoissa on esitetty Pichia pastoris-hiivan happaman -f os-f ataasi n geenin (SEQ ID NO: 1) sekä siitä peräisin olevien kappaleiden sekvenssit.

12 104493 TAULUKKO 1

Happaman fosfataasin geeni SEP ID NO:1:

BamHI -390 -370 -350

GGATCCCTATTGTTACTTTTGCTTAACATTCCAATATTCTTCAACGGTTAATTGATTAAC

-330 -310 -290

ACTGTAACCTCTGCCCATGTGCTTCATCCAAATCTGGTAATCTGCTTTCTATTTCTGCCA

-270 -250 -230

AAATAGTTAATCTATGAGACATGTGCCCTCAATTGCGCAGTAGATCGAGTGGAAGTCTTC

-210 -190 -170

TTTGCGTAACACTCAAAGTATATCCCTGTTAGTCTTTATTCACCTGTTGCTGCATTGGTG

-150 -130 -110

TCAGTTACCATTATTGTTTCCACTTGGAAAAGCTTGTTTTTTTTTGATAGCACAGAAACG

-90 -70 -50

TGGGCTCCGATAAGCTAAACTTCAACGAGAATATAAAAGCTGAAAAGATTCTTGTCAAGA

-30 -10 10

ACTTGTACAACGACCAATAAGTCTTTCAAGGCATCAGACATGTTTTCTCCTATTCTAAGT

MetPheSerProlleLeuSer '3 104493 30 50 70 CTGGAAATTATTCTCGCTTTGGCTACTCTCCAATCAGTCTTTGCGGTTGAGTTGCAGCAC LeuGlulle1leLeuAlaLeuAlaThrLeuGInSerValPheAlaValGluLeuGInHis 90 110 Bell 130 GTTCTTGGAGTCAACGACAGACCCTATCCTCAGAGGACAGATGATCAGTACAACATTCTG ValLeuGlyValAsnAspArgProTyrProGlnArgThrAspAspGlnTyrAsnlleLeu 150 170 190 AGACATCTGGGAGGCTTGGGCCCCTACATCGGTTACAATGGATGGGGAATTGCTGCTGAG ArgHlsLeuGlyGlyLeuGlyPRoTyrlleGlyTyrAsnGlyTrpGlylleAlaAlaGlu 210 230 250 TCTGAAATTGAATCCTGTACGATTGATCAGGCTCATCTGTTGATGAGACATGGAGAAAGA SerGlulleGluSerCysThrlleAspGlnAlaHisLeuLeuMetArgHisGlyGluArg 270 290 310 TACCCAAGTACCAATGTGGGGAAACAACTAGAAGCTTTGTACCAGAAACTACTAGATGCT TyrProSerThrAsnValGlyLysGlnLeuGluAlaLeuTyrGlnLysLeuLeuAspAla 330 350 370 GATGTGGAAGTCCCTACAGGACCATTGTCTTTCTTTCAAGACTATGATTACTTCGTCTCT AspValGluValProThrGlyProLeuSerPhePheGlnAspTyrAspTyrPheValSer 390 410 430 GACGCCGCTTGGTACGAGCAAGAAACAACTAAGGGTTTCTACTCGGGGTTAAACACCGCT AspAlaAlaTrpTyrGluGlnGluThrThrLysGlyPheTyrSerGlyLeuAsnThrAla 450 470 490 TTCGATTTTGGTACCACTTTGAGAGAACGATATGAACATTTGATAAACAATAGCGAAGAA PheAspPheGlyThrThrLeuArgGluArgTyrGluHlsLeulleAsnAsnSerGluGlu 510 530 550 GGAAAGAAACTTTCTGTTTGGGCTGGCTCTCAAGAAAGAGTTGTTGACAACGCAAAGTAC GlyLysLysLeuSerValTrpAlaGlySerGlnGluArgValValAspAsnAlaLysTyr 570 590 610 TTTGCTCAAGGATTTATGAAATCTAACTACACCGTTATGGTCGAAGTCGTTGCTCTAGAA PheAlaG InG lyPheMetLysSerAsnTyrThrVaIMetVa1GluVaIVa1AlaLeuGlu 630 650 670 GAGGAGAAATCCCAGGGACTCAACTCTCTAACGGCTCGAATTTCATGTCCAAACTATAAC GluGluLysSerGlnGlyLeuAsnSerLeuThrAlaArglleSerCysProAsnTyrAsn 690 710 730 AGCCATATCTACAAAGATGGCGACTTGGGGAATGACATTGCTCAAAGAGAAGCTGACAGA • * SerHlslleTyrLysAspGlyAspLeuGlyAsnAsplleAlaGinArgGluAlaAspArg 750 770 790 TTGAACACTCTTTCTCCAGGATTTAACATTACTGCAGATGATATTCCAACAATTGCCCTA LeuAsnThrLeuSerProGlyPheAsnlleThrAlaAspAsplleProThrlleAlaLeu ,4 104493 810 830 850 TACTGTGGCTTTGAACTAAATGTAAGAGGTGAGTCATCCTTCTGTGACGTCTTGTCAAGA TyrCysGlyPheGluLeuAsnValArgGlyGluSerSerPheCysAspValLeuSerArg 870 890 910 GAGGCTCTACTGTACACTGCTTATCTTAGAGATTTGGGATGGTATTACAATGTTGGAAAC GluAlaLeuLeuTyrThrAlaTyrLeuArgAspLeuGlyTrpTyrTyrAsnValGlyAsn 930 950 970 GGGAACCCACTTGGAAAGACAATCGGCTACGTCTATGCCAACGCCACAAGACAGCTGTTG GlyAsnProLeuGlyLysThrlleGlyTyrValTyrAlaAsnAlaThrArgGinLeuLeu 990 1010 1030 GAAAACACAGAAGCTGATCCTAGAGATTATCCTTTGTACTTTTCCTTTAGTCATGATACC GluAsnThrGluAlaAspProArgAspTyrProLeuTyrPheSerPheSerHisAspThr 1050 1070 1090 GATCTGCTTCAAGTATTCACTTCACTCGGTCTTTTCAACGTGACAGATCTGCCATTAGAC AspLeuLeuGinValPheThrSerLeuGlyLeuPheAsnValThrAspLeuProLeuAsp 1110 1130 Ncol CAGATTCAATTCCAGACCTCTTTCAAATCTACCGAAATAGTTCCCATGGGAGCAAGATTG GinlleGinPheGinThrSerPheLysSerThrGlulleValProMetGlyAlaArgLeu 1170 1190 1210 CTTACCGAGAGATTATTGTGTACTGTTGAAGGTGAAGAAAAATACTACGTTAGAACTATC LeuThrGluArgLeuLeuCysThrValGluGlyGluGluLysTyrTyrValArgThr1le 1230 1250 1270 CTCAACGATGCAGTCTTCCCACTGAGTGACTGTTCCTCTGGCCCTGGATTCTCTTGTCCG LeuAsnAspAlaValPheProLeuSerAspCysSerSerGlyProGlyPheSerCysPro 1290 1310 1330 TTGAACGATTATGTTTCTAGACTTGAGGCATTGAACGAGGACAGTGACTTTGCGGAAAAC LeuAsnAspTyrValSerArgLeuGluAlaLeuAsnGluAspSerAspPheAlaGluAsn 1350 1370 1390 TGTGGAGTTCCTAAAAATGCTTCCTACCCACTTGAACTATCATTCTTCTGGGATGACTTG CysGlyValProLysAsnAlaSerTyrProLeuGluLeuSerPhePheTrpAspAspLeu 1410 1430 1450 TCATAAAAATGGTAAGGAATGTTTTGCATCAGATACGAGTTCAAAACGATTAAGAAGAGA SerEnd 1470 1490 1510

ATGCTCTTTTTTTTGTTTCTATCCAATTGGACTATTTTCGTTTATTTTAAATAGCGTACA

; 1530 1550 1570

ACTTTAACTAGATGATATCTTCTTCTTCAAACGATACCACTTCTCTCATACTAGGTGGAG

BamHI

GTTCAATGGATCC

'5 104493 TAULUKKO 2 5'-säätelyalue SEQ ID NO:2:

BamHI -390 -370 -350

GGATCCCTATTGTTACTTTTGCTTAACATTCCAATATTCTTCAACGGTTAATTGATTAAC

-330 -310 -290 actgtaacctctgcccatgtgcttcatccaaatctggtaatctgctttctatttctgcca -270 -250 -230 aaatagttaatctatgagacatgtgccctcaattgcgcagtagatcgagtggaagtcttc -210 -190 -170 tttgcgtaacactcaaagtatatccctgttagtctttattcacctgttgctgcattggtg -150 -130 -110 tcagttaccattattgtttccacttggaaaagcttgtttttttttgatagcacagaaacg -90 -70 -50 tgggctccgataagctaaacttcaacgagaatataaaagctgaaaagattcttgtcaaga -30 -10

ACTTGTACAACGACCAATAAGTCTTTCAAGGCATCAGAC

TAULUKKO 3 Signaalisekvenssi SEQ ID NO:3: 10 ATGTTTTCTCCTATTCTAAGT PHOl Signaali sekvenssi-> MetPheSerProlleLeuSer 30 50

CTGGAAATTATTCTCGCTTTGGCTACTCTCCAATCAGTCTTTGCG

LeuGlullelleLeuAlaLeuAlaThrLeuGlnSerValPheAla 16 104493 TAULUKKO 4

Happaman fosfataasin rakennegeeni SEQ ID NO:4: 70

GTTGAGTTGCAGCAC

ValGluLeuGlnHis 90 110 Bell 130 GTTCTTGGAGTCAACGACAGACCCTATCCTCAGAGGACAGATGATCAGTACAACATTCTG ValLeuGlyValAsnAspArgProTyrProGlnArgThrAspAspGlnTyrAsnlleLeu 150 170 190 AGACATCTGGGAGGCTTGGGCCCCTACATCGGTTACAATGGATGGGGAATTGCTGCTGAG ArgHisLeuGlyGlyLeuGlyPRoTyrlleGlyTyrAsnGlyTrpGlylleAlaAlaGlu 210 230 250 TCTGAAATTGAATCCTGTACGATTGATCAGGCTCATCTGTTGATGAGACATGGAGAAAGA SerGlulleGluSerCysThrlleAspGlnAlaHisLeuLeuMetArgHisGlyGluArg 270 290 310 TACCCAAGTACCAATGTGGGGAAACAACTAGAAGCTTTGTACCAGAAACTACTAGATGCT TyrProSerThrAsnValGlyLysGlnLeuGluAlaLeuTyrGlnLysLeuLeuAspAla 330 350 370 GATGTGGAAGTCCCTACAGGACCATTGTCTTTCTTTCAAGACTATGATTACTTCGTCTCT AspValGluValProThrGlyProLeuSerPhePheGlnAspTyrAspTyrPheValSer 390 410 430 GACGCCGCTTGGTACGAGCAAGAAACAACTAAGGGTTTCTACTCGGGGTTAAACACCGCT AspAlaAlaTrpTyrGluGlnGluThrThrLysGlyPheTyrSerGlyLeuAsnThrAla 450 470 490 TTCGATTTTGGTACCACTTTGAGAGAACGATATGAACATTTGATAAACAATAGCGAAGAA • PheAspPheGlyThrThrLeuArgGluArgTyrGluHlsLeulleAsnAsnSerGluGlu 510 530 550 GGAAAGAAACTTTCTGTTTGGGCTGGCTCTCAAGAAAGAGTTGTTGACAACGCAAAGTAC GlyLysLysLeuSerValTrpAlaGlySerGlnGluArgValValAspAsnAlaLysTyr 570 590 610 TTTGCTCAAGGATTTATGAAATCTAACTACACCGTTATGGTCGAAGTCGTTGCTCTAGAA PheAlaGlnGlyPheMetLysSerAsnTyrThrValMetValGluValValAlaLeuGlu : 630 650 670 GAGGAGAAATCCCAGGGACTCAACTCTCTAACGGCTCGAATTTCATGTCCAAACTATAAC GluGluLysSerGlnGlyLeuAsnSerLeuThrAlaArglleSerCysProAsnTyrAsn 690 710 730 AGCCATATCTACAAAGATGGCGACTTGGGGAATGACATTGCTCAAAGAGAAGCTGACAGA SerHlslleTyrLysAspGlyAspLeuGlyAsnAsplleAlaGinArgGluAlaAspArg 104493 750 770 790 TTGAACACTCTTTCTCCAGGATTTAACATTACTGCAGATGATATTCCAACAATTGCCCTA LeuAsnThrLeuSerProGlyPheAsnlleThrAlaAspAsplleProThrlleAlaLeu 810 830 850 TACTGTGGCTTTGAACTAAATGTAAGAGGTGAGTCATCCTTCTGTGACGTCTTGTCAAGA TyrCysGlyPheGluLeuAsnValArgGlyGluSerSerPheCysAspVaILeuSerArg 870 890 910 GAGGCTCTACTGTACACTGCTTATCTTAGAGATTTGGGATGGTATTACAATGTTGGAAAC GluAlaLeuLeuTyrThrAlaTyrLeuArgAspLeuGlyTrpTyrTyrAsnVa1GlyAsn 930 950 970 GGGAACCCACTTGGAAAGACAATCGGCTACGTCTATGCCAACGCCACAAGACAGCTGTTG GlyAsnProLeuGlyLysThrlleGlyTyrValTyrAlaAsnAlaThrArgGinLeuLeu 990 1010 1030 GAAAACACAGAAGCTGATCCTAGAGATTATCCTTTGTACTTTTCCTTTAGTCATGATACC GluAsnThrGluAlaAspProArgAspTyrProLeuTyrPheSerPheSerHisAspThr 1050 1070 1090 GATCTGCTTCAAGTATTCACTTCACTCGGTCTTTTCAACGTGACAGATCTGCCATTAGAC AspLeuLeuGinValPheThrSerLeuGlyLeuPheAsnValThrAspLeuProLeuAsp 1110 1130 Ncol CAGATTCAATTCCAGACCTCTTTCAAATCTACCGAAATAGTTCCCATGGGAGCAAGATTG GinlleGinPheGinThrSerPheLysSerThrGlulloValProMetGlyAlaArgLeu 1170 1190 1210 CTTACCGAGAGATTATTGTGTACTGTTGAAGGTGAAGAAAAATACTACGTTAGAACTATC LeuThrGluArgLeuLeuCysThrVa1GluGlyGluGluLysTyrTyrValArgThr1 le 1230 1250 1270 CTCAACGATGCAGTCTTCCCACTGAGTGACTGTTCCTCTGGCCCTGGATTCTCTTGTCCG LeuAsnAspAlaValPheProLeuSerAspCysSerSerGlyProGlyPheSerCysPro 1290 1310 1330 TTGAACGATTATGTTTCTAGACTTGAGGCATTGAACGAGGACAGTGACTTTGCGGAAAAC LeuAsnAspTyrValSerArgLeuGluAlaLeuAsnGluAspSerAspPheAlaGluAsn 1350 1370 1390 TGTGGAGTTCCTAAAAATGCTTCCTACCCACTTGAACTATCATTCTTCTGGGATGACTTG CysGlyValProLysAsnAlaSerTyrProLeuGluLeuSerPhePheTrpAspAspLeu

TCATAA

SerEnd ,β 104493 TAULUKKO 5 3' kopioiturnisen päättäjäketju SEQ ID NO:5: 1410 1430 1450

AAATGGTAAGGAATGTTTTGCATCAGATACGAGTTCAAAACGATTAAGAAGAGA

1470 1490 1510

ATGCTCTTTTTTTTGTTTCTATCCAATTGGACTATTTTCGTTTATTTTAAATAGCGTACA

1530 1550 1570

ACTTTAACTAGATGATATCTTCTTCTTCAAACGATACCACTTCTCTCATACTAGGTGGAG

BamHI

GTTCAATGGATCC

Happaman -f os-f at aasi n geeni otetaan talteen Pichia pastoris-hiivan, esimerkiksi Pichia pastori s NRRL Y—1143U—kannan viljelmistä menetelmillä, jotka on kuvattu seuraavissa esimer keissä. Yleisessä menetelmässä Pichia pastoris-hiivan hapoaman f os-f ataasi n geenin (SEQ ID NO:l) taiteenottamiseksi käytetään happaman f os-f at aasi n koetinta, esimerkiksi seuraavissa esimerkeissä kuvattuja, -f os-f aatt i pi toi suudel taan pieniä koetti mi a (low phosphate probes; LP—koetti met) Pichia oastoris DNA—kirjaston seulomiseen. Myös muita koetti mi a voitaisiin valita tai syntetoida taulukossa 1 esitetyn sekvenssin perusteella. Koettimien hybridi soi minen voidaan toteuttaa millä tahansa, alan asiantuntijalle tutulla toimenpiteellä. Pichia pastoris-kirjastoja voidaan valmistaa alalla tunnetuilla tekniikoilla, mukaan lukien menetelmä, joka on kuvattu julkaisussa Lregg et ai. (1985), Mol Cel 1 5i. 5, 3370-3335, tenän kuitenkaan rajoi ttumatta.

Vaihtoehtoisesti . haopaman -f os-f ataasi n 5J —saatel yai ue Stu ID NO:2), signaalisekvenssi (SEQ ID NO:3), rakenneqesni (SEQ ID * NO: 4) sekä 3’ -säätel vai Lie (SEQ ID NO: 5) voidaan saada synte-toi mal1 a sopiva, taulukoissa 1—5 määritelty sekvenssi käyttäen tunnettuja enlsvmaattisia tai kemiallisia menetelmiä. Näistä sopivista menetelmistä voidaan mainita -fos+ocriesteri—, ros— -fiitti— tai svanoetvyl i -f os-f orami di i tt i kerni aan perustuvat kemialliset menetelmät, näihin kuitenkaan rajoittumatta.

19 104493

Alan asiantuntijoille on myös ilmeistä, että oheisen keksinnön mukaiset, Pichia pastoris-hiivan eristetyt happaman -f ostat aasi n 5?—säätelyalue (SEQ ID NO:2), signaalisekvenssi (SEQ ID NO:3), rakennegeeni (SEQ ID NO:4) ja 3' kopioitumisen päättäjäsek-venssi (SEQ ID N0:5) voivat sisältää de minimis lukumäärän nukleotidi eroja klonaalisen vaihtelun tai tapahtuneiden sekvenssi virheiden seurauksena Pichia pastoris-hiivasta myöhemmin eristettyyn happaman -fos-fataasin 5' — säätelyalueeseen, signaali-sekvenssiin, rakennegeeniin ja 3* kopioitumisen päättäjäsek-venssiin verrattuna.

Pichia pastori s-hi i van happaman f os-f at aasi n 5’ -säätel yal uet ta (SEQ ID NO:2), signaalisekvenssiä (SEQ ID NO:3), rakennegeeniä (SEQ ID NO:4) ja 3' kopioitumisen päättäjäsekvenssiä (SEQ ID NO:5) voidaan myös muokata esimerkiksi lisäämällä kytkijä-DNA tai toteuttamalla mutageneesi (esimerkiksi M13-mutageneesi) restriktiokohtien ja muiden vastaavien aikaansaamiseksi tai poi stami seksi.

Kun Pichia pastoris-hiivan happaman -f os-f ataasi n geeni on saatu talteen, sitä voidaan ylläpitää tai replikoida eukarioottisissa tai prokarloottisissa plasmidi-isäntä-järjestelmissä, esimerkiksi E.colι-bakteeri ssa säilytetyssä plasmidissa pBR322, tai missä tahansa sopivassa, alalla tunnetussa järjestelmässä.

Alan asiantuntijoille on myös selvää, että käytettyyn vektoriin voidaan sisällyttää monia muita DNA-sekvenssejä, esimerkiksi bakteeriperäistä plasmidi-DNA:ta, erilaisia merkitsingeenejä, bakterio-faagi-DNA: ta, autonomisesti repi i koi tuvi a sekvenssejä ja sentromeerista DNA:ta, vain muutama käyttökelpoinen esimerkki mainiten.

Happaman fosfataasin 5’-säätelyalue (SEQ ID N0:2) sisältyy tähän DNA-kappaleeseen alkaen nukleotidistä -399 ja päättyen noin nukleotidiin 0, kuten kuviosta 1 ja taulukosta 2 nähdään. Tämä kappale kykenee toteuttamaan DNA:n kopioitumisen RNA:ksi vähintään yhtä polypeptidiä koodaavan heterologisen DNA-ketjun 5’-päähän sijoitettuna ja toimivasti liitettynä.

20 104493

Ohessa kuvatun happaman ios-f ataasi n 5’-säätel yal ueen (SEQ ID NO:2) hyväksikäyttöä varten kuviossa 1 ja taulukossa 2 kuvattu kappale voidaan liittää toimivasti vähintään yhtä polypeptidiä koodaaviin heterologisiin DNA—ketjuihi n. Oheisessa kuvauksessa heterologiset DNA—sekvenssit ovat sellaisten DNA—sekvenssi en yhdistelmiä, joita ei esiinny luonnossa isännässä eikä mainitun säätelyalueen yhteydessä. Sopivista, vähintään yhtä polvpep— tidiä koodaavista heterologisista DNA-sekvensseistä, jotka voitaisiin liittää toimivasti happaman fos-fataasin 5'—säätelyalueeseen (SEQ ID NO:2), voidaan mainita kudoksen plasmino-geeniaktivaattori, ihmisen seerumin albumiini ja invertaasi, näihin kuitenkaan rajoittumatta.

Oheisessa keksinnössä käytettyjen heterologisten DNA—sekvenssien tulisi sisältää 5' ATG-aloituskodoni, 3’-pysäytyskodoni ja ne voivat lisäksi sisältää nukleotidi ketjuja, joiden tehtävänä on stabiloida mRNA tai ohjata polvadenylaatiota.

Yhdistelmä, jossa happaman -f ostat aasi n 5’ -säätel yal ue (SEQ ID N0:2) on yhdistetty toimivasti heterologiseen DNA-sekvenssiin, voidaan istuttaa sopivaan vektoriin. Lukuisat hi ivavektori-isäntä-vhdistelmät ovat mahdollisia ja tuttuja alan asiantuntijalle. Läsnä voi myös olla sellaisia ylimääräisiä sekvenssejä, kuten merkitsingeenejä tai muita sellaisia sekvenssejä, joiden ansiosta vektori kykenee kasvumonistumiseen ja nopeaan • lisääntymiseen bakteereissa tai hiivassa.

Sopivista ιsäntäsolui sta, jotka voidaan transformoida happaman f os-f ataasi n 5’-säätelyalueen sisältävällä vektorilla, voidaan mainita esimerkiksi sellaiset hiivat kuten Saccharomvces-,

Pi chia- ja Hansenula-sukuien hiivat, edullisimmin Pichia pastori s.

Sopivan i säntäsol un trans-f ormoi nti happaman tosfataasin 5’-säätelyalueen (SEQ ID NO:2) sisältävällä vektorilla voidaan toteuttaa millä tahansa, alan asiantuntijän tuntemalla transformoi ntitekniikalla.

21 104493

Alustan -fos-faattipitoisuus säätelee happaman -f os-f ataasi n 5' — säätelyaluetta (SEQ ID N0:2). Erityisesti pienet -f os-f aatti pi — toisuudet tukahduttavat tämän säätelyalueen. Niinpä 5’—säätelyaluetta voidaan säätää muuttamalla alustassa läsnäolevaa -fosfaatti pi toi suutta.

Happaman -f os-f ataasi n signaal i sekvenssi (SEQ ID N0:3) sisältyy siihen DNA-kappaleeseen, joka ulottuu nukleotidistä 1 noin nukleotidiin 66, kuten kuviosta 1 ja taulukosta 3 todetaan. Ohessa kuvatun happaman -f os-f ataasi n si gnaal i sekvenssi n (SEQ ID NO:3) hyväksikäyttöä varten kuviossa 1 ja taulukossa 3 kuvattu kappale voidaan liittää toimivasti vähintään yhtä poly-peptidiä koodaaviin heterologisiin DNA-sekvensseihi n. Sopivista heterologisista sekvensseistä voidaan mainita kudoksen plasmi-nogeeniaktivaattorin, ihmisen seerumin albumiinin ja invertaa-sin joukosta valitut DNA-sekvenssit, näihin kuitenkaan rajoittumat ta.

Tämän jälkeen yhdistelmä, jossa happaman -f osf ataasi n siqnaali-sekvenssi SEQ ID NO:3) on kytketty toimivasti heterologiseen DNA-sekvenssiin, voidaan kytkeä sopivaan promoottoriin. Käytettävä promoottori voi olla tarkoituksenmukaisesti johtosek-venssiin liittynyt promoottori. Vaihtoehtoisesti, luonnossa esiintyvä PHOl-promoottori voidaan korvata muilla heterologi-si 11 a promoottorei11 a. jotka tekevät kopioinnin säätelyn mahdolliseksi. Esimerkkinä sopivasta heterologisesta promoottorista voidaan mainita Pichia pastoris-hiivan aikoholioksidaasi-(AQX1 —) promoottori (tai 5'—säätelyalue), joka on kuvattu patentti julkaisussa US 4 80S 537, joka liitetään oheen tällä vi i ttauksella.

Sopivia vektoreita, joihin tämä happaman f os-f ataasi n signaal i — sekvenssin (SEQ ID N0:3) sisältävä DNA-kappale voitaisiin istuttaa, voidaan saada edellä kuvatulla tavalla. Lisäksi sopivista isäntäsoluista, jotka voidaan transformoida tuloksena olevalla vektorilla, jonka sisältämään DNA-kappaleeseen on koodautunut signaalisekvenssi, voidaan mainita esimerkiksi sellaiset hiivat kuten Saccharomyces-. Pi chi a- ja Hansenula- 22 104493 sukujen hiivat, edullisimmin Pichia pastoris. Isäntäsolujen transformointi voidaan toteuttaa millä tahansa sopivalla, alan asiantuntijalle tutulla menetelmällä. Signaalisekvenssi, joka on kytkeytynyt toimivasti jonkin tällaisen vektori/isäntä-jär jestelmän tuottamaan proteiiniin, voi ohjata mainitun proteiinin erittymistä ulos isäntäsolusta.

Happaman -f os-f ataasi n rakennegeeni (SEQ ID N0:4> sisältyy DNA— kappaleeseen, joka ulottuu nukleotidistä 67 nukleotidiin 1407, kuten kuviosta 1 ja taulukosta 4 nähdään. Tätä happaman fos-fa-taasin rakennegeeniä (SEQ ID N0:4) voidaan käyttää yhdistelmä-DNA-biotekniikassa erilaisiin tarkoituksiin, joista voidaan mainita (a) DNA-muodosteet rikkovan homologisen yhdistämisen toteuttamiseksi (prosessi, jossa heterologisia DNA-sekvenssejä istutetaan Pichia pastoris-hiivan perimässä happaman -fos-fataa-sin si jainti kohtaan, jolloin happaman -f osf ataasi n geenin aktiivisuus rikkoutuu), sekä (b) happaman f os-f ataasi protei i ni n tuotanto erilaisia biologisia määrityksiä varten, näihin kuitenkaan rajoittumatta.

Happaman -f os-f ataasi n 37 kopi oi tumi sen päättä jäsekvenssi (SEQ ID N0:5) päättää mRNA:n kopioitumisen tai stabiloi mRNA:n, kun se on kytketty toimivasti polypeptidin tuotantoa koodaavan DNA—sekvenssi n 3'—päähän. Tämä happaman -f os-f ataasi n 3’ kopioi — tumi sen päättäjäsekvenssi (SEQ ID NO: 5) sisältyy siihen DNA-kappaieeseen, joka ulottuu nukleotidistä 1408 suunnilleen nukleotidiin 1594 saakka, kuten kuviosta 1 ja taulukosta 5 nähdään. Tämä happaman -f os-f ataasi n 3' kopi oi tumi sen päättä jäsek — venssi (SEQ ID NO:5) voi olla kytkeytynyt toimivasti polvpep— tidiä koodaavaan heteroloqiseen DNA-sekvenssiin, ja sitä voidaan käyttää mRNA:n kopioitumisen päättämiseen tai mRNA:n stabiloi mi seen esimerkiksi sellaisissa hiivoissa kuten Saccharo-myces-, F'i chi a— ja Hansenul a-suku ien hiivoissa, sen soveltuessa erityisen hyvin Pichia pastoris-hiivaan.

Seuraavilla, keksintöä rajoittamattomi11 a esimerkeillä pyritään havainnollistamaan oheisen keksinnön soveltamista käytäntöön.

23 104493

ESIMERKIT

Kannat

Esimerkeissä on käytetty seuraavia kantoja:

Pichia pastoris KM71 (AQX1. his4)

Pichia pastori s GS115 (his4) NRRL Y-15851 Pichia pastori s GS190 <arg4) NRRL Y-18014 Pichia pastoris GS247 (Ade-)

Pichia pastoris KM71:GS102 (Mut-)

Pichia pastoris GS115:GS102 (Mut*)

Pichia pastoris MD100-20 (hi s4. Ade-)

Pichia pastoris MB102-26 (pho-, his4. ade-)

Pichia pastoris MB102-28 Pichia pastoris MB102-51 Pichia pastoris KM71:pPSU216 (Mut-)

Pichia pastoris GS115:pPSU216 (Mut*)

E. coli JM103 delta (lac pro) thi rpsl (strA) supE end A sbcB hsdR

Bowes-melanooma tPA y1i-i1mentyvä solulinja ATCC# CRL9607 (ihmisen melanoomasoluja).

Alustat, puskurit ia liuokset

Seuraavissa esimerkeissä käytetyillä alustoilla, puskureilla ja liuoksilla oli alla esitetyt koostumukset: " LP-alusta (pieni -fosfaattipitoisuus) biotiini 2 ug/1 kaisiumpantotenaatti 400 Ud/1 foolihappo 2 pg/l nikotiinihappo 400 ug/1 p-aminobentsoehappo 2 pg/1 pyridoksiini-hydrokl ori di 400 pg/1 r i bo-f 1 avi i ni 200 ug/1 tiamiini-HCl 400 ug/1 boori happo 500 ug/1 kupari (11)sulfaatti 40 ug/1 kaliumjodidi 100 pg/l -f err l (111) kl ori di 200 ug/1 mangaanisulfaatti 400 ug/1 sinkkisulfaatti 400 ug/1 inositoli 2 mg/1 natriummolybdaatti 200 ug/1 =* 104493 ammoniumsul-faatti 5 g/1 yksi emäksinen kalium-fosfaatti 30 mg/1 kai i Limkl ori di 1,5 g/1

natriumklori di 1,7 mM

kai siumklori di 0,68 mM

magnesiumsulfaatti 4,2 mM

TE-puskuri

Tris-HCL, pH 8,0 10 mM

EDTA 1 mM

S5PE (IX)

NaCl 180 mM

Na3PCU, pH 7,7 10 mM

EDTA 1 mM

5SC (IX)

NaCl 150 mM

Na-sitraatti 15 mM

Denhardt:in liuos (IX)

Ficoll 200 mg/1 pol yvi nvyl i pvrrol ι dom 200 mg/1 naudan seerumin albumiini 200 mg/1

REB

Li Cl 100 mM

Tris-HCl, pH 7,4 100 mM

EDTA 0,1 mM

PCI

fenoli 500 ml/1 kloroformi 4B0 ml/1 isoamyylialkoholi 20 ml/1 25 104493 ci kloroformi 960 ml/1 isoamyyliaikoholi 40 ml/1 LP-indikaattorimaliät 1 litra IX LP-alustaa 22,5 mli sitruunahappoa, pH 4,8 20 g dekstroosia 60 mg 5-bromi-4-kloori-3-indolyylj-fosfaattia (Sigma) 25 g Noble-agaria (Difco) SCE-puskuri 9,1 g sorbitolia 1,47 g natriumsitraattia

0,168 g EDTA

pH arvoon 5,8 HClillä 50 mlrssa dHzD .ia autoklavointi VMB-alusta 6,75 g hiivan typpi perustaa ilman aminohappoja (Difco) 1 1 : ssa vettä

Esimerkki I

pLP24:n muodostaminen

Seuraavat kokeet toteutettiin happaman fosfataasin geenin (SEQ ID NO:1) eristämiseksi Fichia pastoris-hiivasta ja sen tunnusomaisten piirteiden selvittämiseksi. Fichia pastoris GS115-kantaa (NRRL V-15851) kasvatettiin sekä ympäristössä, jossa f osf aatti oi toi slius oli suuri (HP-ympäri stö) [käsittäen hiivan typpi perustaa ilman aminohappoja (DIFCO), 2 V. dekstroosia ja 20 ml /1 hi stldiiniäl, että ympäristössä, jossa fosfaattipitoi -suus oli pieni (LP-ympäri stö) [käsittäen LP-alustaa, 2 V. dekstroosia ja 20 mg/1 histidiiniäl, kummankin ympäristön kokonaistilavuuden ollessa 300 ml. Solut kasautettiin, pestiin kertaalleen 10 ml :11a BEB-liuosta ja suspendoitiin uudestaan 4 ml:aan REB-1 i uokseen 30 ml: n Core;·:-putkessa. Sitten putkiin lisättiin 26 104493 8 g lasihelmiä ja 4 ml PCI-1iuosta. Suspensiota sekoitettiin pyörresekoittajassa suurella nopeudella, kahddfcSän kertaa kulloinkin 20 sekunnin ajan, jäähdyttäen jäissä 20 sekunnin ajan jokaisen sekoituskerran välillä. Sitten suspensiota sentri-fu-goitiin nopeudella lOOOOxg 10 minuutin ajan. Vesikerros (päällimmäinen kerros) uutettiin kahdesti 4 ml :11a PCI-1iuosta ja 4 ml :11a CI-liuosta. RNA seostettiin vesi-faasista -20 °C:n lämpötilassa 0,1 tilavuudella 3M kaiiumasetaattia, pH 5,2, sekä 2,5 tilavuudella etanolia. Poly A"· RNA valikoitiin menetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa Maniatis et ai.. Mole-cular cloning, A Laboratory Manual, siten, että NaCl oli korvattu LiClzllä. LP tai HP mRNA-merkittyjen cDNA-koettimi en synteesi, käyttäen 2 pg kutakin poly A"*" RNA-tyvppiä, toteutettiin myös edellä mainitun Maniatis et ai. julkaisun mukaisesti.

E, coli MC1061-kannan (Mandel ja Higa, 1970, J- Mol. Bi oi . 53:154) trans-f ormoi nt i i n käytettiin 60 ng YEP13:ssa olevaa puhdistettua Pichia pastoris plasmidikirjastoa [Broach et ai.. Gene: 8121 (1979)H. Tuloksena saatiin noin 8000 pesäkettä.

Nämä pesäkkeet replikoitiin kahdelle nitrosel1 uioosasuodattι-melle, monistettiin LB-maljoi 11 a, jotka sisälsivät 100 pg/ml ampi si 111 i m a ja 170 pq/ml kl oram-f eni koi i a, hajotettiin tavanomaisella tavalla (Grunstein ja Wallis, 1979, Methods in Enzy— moloqy 68, 379-389). 1ämpökäsiteltiin 80 °C:n lämpötilassa 90 minuutin ajan, ja erilliset suodattimet hvbridi soitiln joko LP tai HP cDNA-koettimen kanssa. Hybridi sointi toteutettiin käyttäen 2X SSPE, IX Denhardt:in liuosta, 0,2 7. natriumdode-kyylisulfaattia (SDS) ja 2,5x10* cmp merkittyjä cDNA-koettimi a yhdessä ml:ssa hybridi soi nti aiustaa. Hybridi soi nti toteutettiin 55 °C:n lämpötilassa 40 tunnin ajan, kokonaistilavuuden ollessa 25 ml. Hybrιdi soi nm n jälkeen suodattimet pestiin kahdesti 2>:SSC, 0,1 7- SDS huoneen lämpötilassa ja kahdesti 0,2;·: SSC, 0,1 '/. SDS 65 °C:ssa, minkä jälkeen ne kuivattiin ja niiden annettiin valottaa röntgensäde-filmiä.

Tällä tavalla saatiin tunnistetuksi 24 perimäkioonia, jotka hybridi soituivat voimakkaammin LP cDNA-koettimeen kuin HP cDNA-koettimeen, ja näin ollen niiden voitiin olettaa sisältävän 27 104493 istutteita, joihin oli koodautunut happaman -fos-fataasin geeni. Nämä 24 kloonia seulottiin uudestaan edellä esitetyllä tavalla LP- ja HP-koettimi 11 a, minkä jälkeen 14 tällaista uudestaan seulottua kloonia hybridi soitui jälleen voimakkaammin LP cDNA-koettimeen. Plasmidi-DNA eristettiin kustakin näistä 14 kloonista, pilkottiin EcoRI—entsyymi 11 ä, erotettiin elektroforeet— tisesti agaroosigeeli11ä, siirrettiin imeyttämällä kahdelle nitrosel1 uioosasuodattimelle ja kumpikin suodatin hybridisoi-tiin joko LP tai HP cDNA:n kanssa edellä kuvatuissa olosuhteissa. Neljästä erillisestä kloonista peräisin olevat geeni kappaleet hybridi soituivat voimakkaasti LP cDNA—koettimeen ja heikosti, mikäli lainkaan HP cDNA-koettimeen. Bitten nämä kappaleet kartoitettiin restriktioentsyymei11ä käyttäen EcoRI + Hindi 11-. EcoRI + Sal I— ja EcoRI + BamHI-kaksoi spi1kkeitä. minkä jälkeen ne hybridi soi tiin jälleen LP cDNA-koettimen kanssa. Näihin kappaleisiin oli koodautunut asiaan liittymättömiä, fosfaatin säätelemiä geeni 1 ohkoja, mikä voitiin määrittää niiden restriktiokartoissa todettujen erojen perusteella.

Alueet, joiden tunnistettiin tällä menetelmällä koodaavan LP— säätelyn alaisia geenejä, aiikloonattiin plasmidiin pUCB tai p(JC19 (New England Biolabs). Tuloksena saadut plasmidit leimattiin 32P-isotoopi11 a "nick"-luennalla (Maniatis). Näitä leimattuja plasmideja käytettiin LP ja HP RNA:n RNA-täplien koettimina (5 ug/täplä). Yksi aikuperäisistä 24 kloonista, josta käytettiin merkintää pLP24, valittiin lisätutkimuksia varten.

Esimerkki II

pLP2411:n muodostaminen

Esimerkissä I muodostetun plasmidin pLP24, jonka oletettiin sisältävän Pichia pastoris-hiivan happaman fosfataasin geeni (SEQ ID NO:l) tai sen kappale, tunnusomaisia piirteitä selvitettiin edelleen seuraavalla tavalla. 10 pg plasmidia pLP24 pilkottiin entsyymeillä EcoRI/Sal I ja 2,1 kb:n kappale puhdistettiin geelin avulla.

28 104493 10 pg plasmidia pYM25 (NRRL B—18015) pilkottiin entsyymeillä SphI/Sal I, ja 3,1 kb:n kappale puhdistettiin geelin avulla. 5 pg plasmidia pUC19 pilkottiin entsyymeillä EcoRI/SalI. uutettiin F'CI-1 i uoksel 1 a, uutettiin CI—1 i uoksel 1 a ja saostettiin EtOH:lla. 100 ng EcoRI/Sal 1-1i neansoi tua pUC19—plasmidi a liga— toi iin 200 ng:aan plasmidista pLP24 saatua 2,1 kb:n EcoRI/5alI-kappaletta ja 450 ng:aan plasmidista pYM25 saatua, 3,1 kb:n Sphl/SalI-kappaletta 3-osaisella ligaatiolla, 20 μΐ:ssa 1igaatiopuskuria + 1 mM ATP + 1U T4 DNA-1igaasia. E. col i-kanta MC1061 trans-formoi ti in ja asianmukainen plasmidi tunnistettiin 2,1 kb:n EcoRI/SaiI-kappaleen ja 3,1 kb:n Sphl/SalI—kappaleen läsnäolon perusteella. Tästä asiannmukai-sesta plasmidista käytettiin merkintää pLF’2411.

Esimerkki III

pLF'2412 PHOl-hajotusvektorin muodostaminen ja GS190: pLF'2412: n kehi ttämi nen

Plasmidista pLF’24 (katso esimerkki II) peräisin oleva plasmidi pLF'2411 pilkottiin entsyymillä Xbal, käsiteltiin Klenow DNA-polymeraasi11 a tylppien päiden muodostamiseksi ja ligatoitiin plasmidista pYM25 peräisin olevan 2,1 kb Flpal—kappal een kanssa. Tämä kappale sisälsi Saccharomyces cerevisiae ARG4—geeni n. (Plasmidi pYM25 on saatavana talletuksena NRRL B-18015). Tuloksena saadusta plasmidista käytettiin merkintää pLF'2412. Sitten pLF'2412 pilkottiin entsyymeillä EcoRI ja BamHI. Tuloksena ollut 3,3 kb: n kappale eristettiin ja sillä trans-f ormoi ti ι n FT chi a pastori s GS190 (NRRL Y-18014) Arg*-prototropian aikaansaamiseksi (tr ans-f ormoi nt i i n käytetty menetelmä on kuvattu esimer— kissa IV). Argi ni i m prototro-f i t tunnistettiin sen perusteella, että ne kykenivät kasvamaan arginiinia sisältämättömällä alustalla. Ne eristettiin ja seulottiin LP-indikaattorimaljoi 11 a happaman FosFataasin läsnäolon toteamiseksi. Pesäkkeet toi stomal jätti in LP—indikaattorlmaljoi 11 e ja niiden annettiin kasvaa yön yli 30 °C:n lämpötilassa. LP—indikaattorimaljoi 11 a olevat pesäkkeet olivat joko vihreitä (PHQl) tai valkoisia (phol). Valkoiset pesäkkeet olivat trans-formantteja, jotka sisälsivät edellä kuvatun 3,3 kb i1mentämiskasetin stabiilisti yhdenty— » 104493 neinä Pi chi a pastori 5-perimässä PHQl-si jäi nti kohtaan sen rikkoen.

Stabiilien Arg^-kantojen perimän DNA analysoitiin Southern:in suodatinhybridi säätiöi1 a ilmentämiskasetin sijäinti kohdan määrittämiseksi. 3,3 kb EcoRI—BamHI—kappale, joka sisälsi Saccha-romvces cerevisiae ARG4-qeenin, oli yhdentynyt spesi-fisesti ja rikkonut sen perimäsekvenssin, joka oli analoginen plasmidin pLP2411 sisältämän DNA—kappaleen kanssa, vahvistaen sen, että tähän si jäi nti kohtaan oli koodautunut hapan fosfataasi (PH01) . Tästä trans-formantista käytettiin merkintää SS190: pLP2412.

Esimerkki IV

Pichia pastoris-hiivan transformoi nti

Seuraavaa menettelytapaa käytettiin Pichia pastoris-hiivan transformoimi seksi.

Hiivasoluja siirrostettiin noin 10 ml:aan YPD-alustaa ja niitä viljeltiin ravisteluvi1jelmänä 30 "Csn lämpötilassa 16-20 tunnin ajan. Sitten solut laimennettiin siten, että A«,oo oli noin 0.01-0,1, ja log-vaihetta ylläpidettiin YPD-alustassa 30 cC:n lämpötilassa 6-8 tunnin ajan. 100 ml:aan YPD-alustaa siirros-tettiin 0,5 ml siirrostevi1jelmää siten, että A&oo:ksi saatiin noin 0,1, ja niitä kasvatettiin ravisteluvi1jelmänä 30 °C:ssa noin 16-20 tuntia. Sitten, kun A*oo oli noin 0,2-0,3 (noin 16-20 tunnin kuluttua), solut otettiin talteen sentrifugoimal-la, käyttäen DAMON IEC DPR-6000—sentrifugia, 5 minuutin ajan nopeudella 1500 >: g.

Sferoplastien valmistamiseksi solut pestiin kertaalleen 10 mi:lla steriiliä vettä (solut sentrifugoitiin kunkin pesun jälkeen edellä kuvatulla tavalla), kertaalleen 10 ml :11a juuri valmistettua SED-liuosta, kertaalleen 10 ml:lla steriiliä IM sorbitolia, ja ne suspendoitiin uudestaan 5 ml:aan SCE—puskuria. 5 ui Zvmolyase 60,000 (4 mg/ml; saatu yhtiöstä Miles Laboratories) lisättiin ja soluja inkuboitiin 30 °C:ssa noin 30 minuutin ajan.

30 104493 S-f eropl asti en muodostumista seurattiin seuraavalla tavalla.

100 μ1:η suuruisia solunäytteitä lisättiin 900 pl:aan 5 7. SDS-liuosta ja 900 pl:aan IM sorbitolia juuri ennen Zymolyase-ent-syymin lisäystä tai juuri tämän lisäyksen jälkeen, sekä eri ajanhetki11ä inkubointi jakson aikana. Inkubointi lopetettiin pisteessä, jossa solut hajosivat SDS-1iuoksessa, mutta eivät hajonneet sorbitolissa. Muodostetut s-f eropl asti t pestiin kertaalleen 10 ml:11 a steriiliä IM sorbitolia, sentritugoiden nopeudella 1000>:g 5-10 minuutin ajan, pestiin kertaalleen 10 ml:lla steriiliä CaS-liuosta sentri-f ugoi den, ja suspendoi ti i n uudestaan 0,6 ml:aan CaS—liuosta.

Varsinaista transformointi a varten vedessä tai TE-puskurissa olevat DNA—näytteet lisättiin (kokonaisti1avuus korkeintaann 20 ui) 12 >: 75 mm steriileihin pol ypropyl eeni put ki i n. (Pienten DNA-määrien tapauksessa tehokkaimpaan transformaatioon päästään käyttämällä noin 1 pl sonikoitua E. coli-DNA:ta (5 mg/ml) kussakin näytteessä.) Kuhunkin DNA-näytteeseen lisättiin 100 μΐ sferoplasteja, ja näytteitä inkuboitiin huoneen lämpötilassa noin 20 minuuttia. Jokaiseen näytteeseen lisättiin 1 ml PEG— liuosta ja näytteitä inkuboitiin huoneen lämpötilassa noin 15 minuutin ajan. Näytteitä sentrifugoiti in nopeudella 1000xg 5— 10 minuutin ajan ja supernatanttι hylättiin. Kasaumat suspen-doitiin uudestaan 150 μΐ:aan SOS-liuosta ja niitä inkuboitiin huoneen lämpötilassa 30 minuutin ajan. Kuhunkin näytteeseen lisättiin 850 μΐ steriiliä IM sorbitolia ja näytteet maljattiin edellä kuvatulla tavalla.

10 ml regenerointiagarιa kaadettiin kuhunkin maljaan vähintään 30 minuuttia ennen transformointinäytteiden valmistumista. 10 ml:n suuruisia annoksia regeneroi ntiagaria annosteltiin myös putkiin 45-50 "Cm hauteessa sinä aikana, kun transformointi -näytteet olivat S03-1iuoksessa. Sitten näytteet lisättiin putkiin. kaadettiin maljoille, jotka sisälsivät jähmeän pohja-agarkerroksen, ja maljoja inkuboitiin 30 °C:ssa 3-5 vuorokauden ajan.

31 104493

Sferoplastien laatu eri ajanhetkillä määritettiin seuraavasti. 10 μΐ: n näyte otettiin .ia laimennettiin 100;-; lisäämällä se 990 plsaan IM sorbitolia. Tästä laimennoksesta otettiin 10 μΐ ja se lisättiin uudestaan 990 μΐ:n suuruiseen annokseen IM sorbitolia. lOO μΐ kumpaakin laimennosta levitettiin YPD-agar-alustaa sisältävään maljaan, millä toimenpiteellä pyrittiin määrittämään valmisteessa jäljellä olevien, sferoplasteiksi muuttumattomien kokonaisten solujen pitoisuus. 100 μΐ kutakin laimennosta, lisättiin 10 ml : aan regeneroi nti agari a, johon oli lisätty täydennökseksi 40 pg/ml kaikkia isännän tarvitsemia aminohappoja regeneroituvien sferoplastien kokonaismäärän määrittämiseksi. Tämän transformointi kokeen hyvät arvot olivat yhteensä 1-3::107, regeneroi tuvaa sf eropl asti a/ml ja noin 1«103 kokonaista solua/ml.

Esimerkki V

Hiivan DNA:n valmistus

Seuraavaa menetelmää käytettiin Pihiä pastoris-hiivan DNA:n vaimi stami seksi.

Hiivasoluja kasvatettiin lOO ml:ssa YNB-alustaa, johon oli lisätty 2 V. dekstroosia, 30 ®C:ssa kunnes arvoksi A^oo saatiin 1-2, minkä jälkeen solut kasautettiin käyttäen Damon IEC DPR-6000-sentrifugia, nopeudella 2000«g 5 minuutin ajan. Kasauma pestiin kertaalleen dH20:lla, kertaalleen SED:llä, kertaalleen IM sorbitolilla ja sitten se suspendoitiin uudestaan 5 ml:aan liuosta, joka sisälsi O,IM Tri s—HC1, pH 7,0, ja IM sorbitolia. Sitten soluihin sekoitettiin 50—100 μΐ Zymolyase 60 000—entsyymiä (Miles Laboratories) 4 mg/ml pitoisena liuoksena, ja seosta inkuboitiin 30 *C:ssa 1 tunnin ajan. Sitten tuloksena saatuja sferoplasteja sentrifugoitiin nopeudella 1000«g 5-10 minuutin ajan ja ne suspendoiti in 5 ml saan hajotuspuskuria CO, 1 7. SDS, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA ja 50 mM NaCll. Sekä tuotetta Proteinase K (Boehringer Mannheim) että tuotetta RNase A (Sigma) lisättiin pitoisuudeksi 100 pg/ml ja liuosta inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuutin ajan. DNAssta poistettiin proteiinit sekoittamalla saatuun valmisteeseen varovasti yhtä 32 104493 suuri tilavuus CI-liuosta, ja -faasit erotettiin sentrifugoi— maila nopeudella 12000>:g 20 minuutin ajan. Ylempi (vesi-) -faasi imettiin puhtaaseen putkeen ja se uutettiin yhtä suurella tilavuudella PCI-liuosta. Faasit erotettiin edellä kuvatulla tavalla, ja ylempi -faasi laitettiin putkeen, joka sisälsi 2-3 tilavuutta kylmää, 100 V. etanolia. Näytettä sekoitettiin varovasti ja DNA otettiin talteen kiertämällä se muovi sauvan päälle.

DNA liuotettiin välittömästi 1 ml:aan TE-puskuria, ja sitä dialysoitiin yön yli 4 “C:ssa TE-puskurin lOO tilavuutta vastaan.

Esimerkki VI

Täysipituisen PHOl-qeenin eristäminen

Plasmidin, joka sisältää koko Pichia pastoris PH01-geenin (SEQ ID N0:1), eristämiseksi MC1061:ssä oleva alkuperäinen Pi chi a pastori s perimäkirjasto hybridi soitiin edellä kuvatuissa olosuhteissa plasmidista pLP24 peräisin olevan 600 emäsparin pituisen BamHI-kappaleen kanssa. Tällä menetelmällä tunnistettiin viisi positiivista kloonia. Plasmidi-DNA:ta valmistettiin näistä klooneista, pilkottiin entsyymillä BamHI. imeytettiin nitrosel1 uioosasuodattimi 11 e ja hybrιdi soitiin saman 600 emäs-parin pituisen koettimen kanssa. Kukin näistä viidestä kloonista käsitti 2,0 kb:n BamHI-kappaleen. joka sisälsi Pi chi a pastor i s PHOl-qeenin. Eräs näistä klooneista valittiin lisä-analyysiä varten, ja siitä käytettiin merkintää pLP2420.

Kloonin pLP2420 2,0 kb:n BamHI-kappaleen sekvenssi määritettiin restriktioentsyvmei1lä pilkottujen ja M13:een (saatavana yhtiöstä New England Biolabs) aiik 1oonattujen kappaleiden tavan— omaisei 1 a dideoksi—sekvenssi määrityksel1ä. Sekvenssi analyysi paljasti 46B aminohapon pituisen avoimen lukukehyksen, joka sisältyi täydellisesti tähän 2,0 kb:n BamHI-kappaleeseen.

33 104493

Esimerkki VII

Kantojen MB102-26:pLP2430-Tl ja MB102-26:pLP2430-T3 kehittäminen

Plasmidista pLP2420 peräisin oleva, PHOl-oeenin sisältävä 2,0 kb:n BamHI-kappale ligatoitiin plasmidin pYMS BamHI-kohtaan, joka plasmidi pYM8 sisältää Saccharomvces cerevisiae HIS4-gee-nin sekä pBR322—sekvenssit. CpYM8 voidaan valmistaa seuraavasti: 10 UQ pYA2:ta (NRRL B-15874) pilkottiin entsyymeillä SphI/ThaI ja 3,4 kb:n kappale geelipuhdistettiin. 10 pg pBR322:tä pilkottiin entsyymeillä SphI/NruI ja 3,95 kb:n kappale geelipuhdistettiin. 100 ng tätä 3,95 kb:n pBR322-kappa— letta ja 250 ng 3,4 kb:n pYA2-kappalettä ligatoitiin keskenään tavanomaisissa olosuhteissa. Asianmukainen plasmidi tunnistettiin 3,1 kb:n Xhol/Sphl-kappaleen perusteella ja siitä käytettiin merkintää pYM8.3 Tuloksena olleesta plasmidista käytettiin merkintää pLP2430, ja se kykeni repiikoi tumaan autonomisesti Pichia pastoris-hiivassa satunnaisen ARS-toiminnon ansiosta (autonominen repiιkoi nti sekvenssi), joka ARS sijaitsi Saccharomvces cerevisiae HIS4-aeeni sekvenssi ssä.

GS190: pLF'2412 (Pho-):n, joka on Pichia pastorιs-kanta, josta puuttuu happaman -fos-fataasin aktiivisuus (katso esimerkki III), annettiin pariutua Pichia pastori s—kannan MD100-20 (hi s4. Ade* kanssa. Käytetty parittelumenetelmä oli patenttijulkaisussa US 4 812 405 kuvatun menetelmän mukainen, joka julkaisu liitetään oheen tällä viittauksella. Kanta MD100-20 kehitettiin seuraavasti : Pichia pastoris-kannan GS115 (hi s4) NRRL Y-15851 soluja sekoitettiin kannan GS247 (Ade~) soluihin olosuhteissa, joiden tiedetään edistävän zygoottien muodostumista ja diploi-disaatiota (tämän menetelmän kuvaus on löydettävissä patenttijulkaisusta US 4 812 405, joka liitetään oheen tällä viittauksella) ja mal jätti in YNB + dekstroosi mal joi 11 e prototro-f i sten diploi di en valikoimiseksi. Diploi di a kantaa kutsuttiin MD100:ksi. MDIOO—kantaa viljeltiin olosuhteissa, joiden tiedetään indusoivan Pichia pastoris-diploidien itiönmuodostusta (sporulaaatiota) (ja jotka on samoin kuvattu julkaisussa US

4 812 405) ia itiötuotteita viljeltiin maljoilla, jotka sisäl-• *" 04 104493 sivät YNB dekstroosia + adeniinia + histidiiniä. Yksittäisten pesäkkeiden kyky kasvaa ilman adeniini- tai hi stidiinitäyden-nöstä testattiin. Kanta, joka kykeni kasvamaan ilman histi — diinitäydennöstä, muttei kyennyt kasvamaan ilman adeniinitäy-dennöstä, tunnistettiin ja siitä käytettiin merkintää MD100-20.

Tästä risteytyksestä peräisin oleva diploidi kanta MB102 Phot/Pho-, HIS4/hi s4. Ade^/Ade-, saatettiin tuottamaan itiöitä (US 4 812 405) haploidien jälkeläisten tuottamiseksi. Nämä jälkeläiset seulottiin LP-indikaattorimaljoi 11 a sekä YNB-dekst-roosimaljoi 11 a, joihin joko oli tai ei oltu lisätty täyden— nökseksi histidiiniä tai adeniinia, kannan MB102-26 (Pho~, hi s4. Ade~) eristämiseksi.

Kanta MB102-26 transformoitiin plasmidilla pLP2430 esimerkissä IV kuvatulla tavalla. Hi s*—transformantit valikoitiin ja seulottiin happaman fos-fataasin ilmentymisen suhteen LP—indikaattori mal joi 11 a (katso esimerkki III). Viisi transformanttia oli positiivisia happaman -f os-f ataasi n ilmentämisen suhteen.

Kahdesta näistä transformantista. MB102-26: pLP243ö-T1 ja MB102-26:pLP2430—T3 analysoitiin happaman fosfataasin ilmentymisen asianmukainen säätely. Kumpaakin kantaa kasvatettiin HP- tai LP—alustalla 24 tuntia siten, että arvoksi AÄOo saatiin 2,0. Molempien viljelmien soluista määritettiin happaman fosfataasin ilmentyminen (Bostian et ai. 1980; Proc. Natl. Acad. 5ci. 77: 4504-4508) käyttäen rinnakkain transformoimattomia HI54-soluja (MB102-28) , jotka kantavat Pho-—f enotyyppi a, sekä H154—soi li ja (MB102-51), jotka kantavat Pho--vi11ityypin fenotyyppiä (taulukko I). pLF'2430-transformanttien induktiotaso oli käytännöllisesti katsoen yhtäsuuri kuin villityypin kannan induktiotaso. Täten PH01_—geenin sisältävä 2,0 kb:n BamHI—kappale, joka on istutettu plasmidiin pLF'2430, sisälsi koko hapanta fosf ataasi a koodaavan alueen sekä sekvenssit, jotka riittivät saamaan aikaan asianmukaisei 1 a tavalla fosfaatin säätelemän happaman fosfataasin ilmentymisen.

35 104493

Taulukko 1

Yksikköä -kertainen

Kanta_Genotyyppi_AP/DD^00_induktio MB102-26:pLP2430-T1 ade", ΗΙΞ4, PH01 707 30244 43 MB102-26:pLP2430-T3 ade", HIB4. PH01 852 28198 33 MB102-51 ade", HIS4, PH01 61,4 1975 32 MB102—28 ade-, HIS4, phol 0,02 0,03 1,5

Esimerkki Vili

Invertaasin eritys Tässä esimerkissä osoitetaan, että PHQl-si onaali sekvenssi (SEQ ID NO: 3) toimii, kun se on kytketty toimivasti heterol ogi si i n geeneihin. Saccharomvces cerevisiae SUC2-geeni n sisältävä 2,2 kb:n Smal-PvuII-kappale eristettiin plasmidista pSEYC306 [Johnson et ai.. Cel 1 48, 875 (1987)3 _ia se kloonattiin joko pfiOBlOzn tai pPSV21B:n SmaI—kohtaan (nämä 1ähtopiasmidit on kuvattu esimerkeissä XI ja XII). Tällä toimenpiteellä saatiin vastaaavsti plasmidit pAPINVl ja pAPINV2. Niissä käytettiin Pichia pastoris A0X1-promoottoria. joka sääteli avoimen lukukehyksen kopioitumista PHQl-si gnaali ket iusta (SEQ ID ND:3) SUC2-rakenneqeeniιn:

PH01-sekvenssi ___GTGTTCGCT

pSEYC3Q6:sta peräisin olevat kytkijäsekvenssit CGA GAA TCC CCC GG5 GAT CCG

ACC TGC ABC CCA GCT TTG

5UC2—sekvenssi ACA AAC GAA...

Kymmenen ug kumpaakin plasmidi a pAPINVl tai pAPINV2 pilkottiin entsyymillä Bql 11 ja käytettiin GS115:n transformoi ntiin esimerkissä IV kuvatulla tavalla. Trans-f ormanti t, jotka sisälsivät BqlII-kappaleen plasmidista pAPINVl, ja joista käytettiin merkintää GS115:pAPINVl, valikoitiin histisiiniprototrofian suh- * 36 104493 teen ja niistä seulottiin Mut--·fenotyyppi, mikä osoittaa asianmukaisen yhdentymisen ja rikkoutumisen AQXl-si jainti kohdassa. Mut—seulonta toteutettiin toi stomaljaamal1 a glukoosia sisältävältä alustalta peräisin olevat pesäkkeet metanolia sisältävälle alustalle ja arvioimalla metanolilla saavutettu kasvunopeus. Metanolilla saavutettu hidas kasvu osoitti Mut---f eno-tyypin. Transtormantit, jotka sisälsivät BolII—kappaleen plas-midista pAPINV2, ja joista käytettiin merkintää GS115:pAPINV2, valikoitiin myös hi sti di i ni prototro-f i an suhteen, mutta niistä seulottiin Phol-—fenotyyppi, joka osoitta asianmukaisen yhdentymisen ja rikkoutumisen PHOl-si iainti kohdassa (katso esimerkki III) .

Kummankin luokan transformantit tunnistettiin ja niitä viljeltiin alustassa YNB + 2 7. glyserolia rinnan Pichia pastoris-kantojen KM71: GS102 (Mut-) ja GS115: GS102 (Mut'*') kanssa, joiden sisältämät yhdentyneet plasmidit ovat muuten samanlaisia kuin pAPINVl, paitsi että SUC2-qeeni sisältää luonnollisen signaali-sekvenssinsä ja että siitä puuttuu PHOl-siqnaalisekvenssi.

Nämä kaksi kantaa on kuvattu patenttijulkaisussa EP 256 421. Rinnakkain viljeltiin samoin kantoja KM71:pPSV216(Mut-) ja GS115:pPSV216(Mut*), joiden sisältämät yhdentyneet plasmidit ovat muuten samanlaisia kuin pAPINV2, paitsi että SUC2-sekvens-sit puuttuvat.

Kutakin viljelmää kasvatettiin alustalla YNB+27. glyserolia siten, että arvoksi AAO° saatiin noin 3,0. Kustakin viljelmästä otettiin näyte, joka pestiin steriilillä vedellä ja suspendoi— ti in uudestaan 10 ml : aan YNB+0,5X MeOH. Mut*-·vi 1 jelmät suspen— doitiin uudestaan siten, että arvoksi AÄO° saatiin 0,02, ja Mut——vi1jelmat suspendoitiιn uudestaan siten, että arvoksi A*00 saatiin 0,2, ja niiden annettiin kasvaa 30 'C:ssa 24 tunnin ajan siten, että arvoksi AAO° saatiin noin 0,3-0,4. Sitten invertaasiaktiivisuus määritettiin noin 1,0 m0D^oo:sta. Tulokset on esitetty taulukossa II.

104493 ο·7

Taulukko II

Signaali- Erittynyt Kokonais- Erityksen Viljelmä Mut sekvenssi invertaasi* invertaasib tehokkuus*1 GS115: - PH01 20,3 30,5 0,67 pAPINVl KM71: - SUC2 12,5 18,9 0,66 GS102 KM71: - ΡΗ01“* 0 0- PPSV216 GS115: + PHG1 6,1 6,7 0,91 PAPINV2 GSli5; + SUC2 5,3 5,7 0,93 SS102 GSll5; + PH01- 0 0 - PPSV216 ** Erittynyt invertaasi, määritetty Goldstein: in ja Lampenun menetelmän (Goldstein ja Lampen, Methods in Enzymoloov. 42:504-511, 1975) mukaisesti ilman Tritonia, ja se on esi tetty muodossa invertaasiyksikköä/A*°° analysoitua viljelmää. 1 yksikkö = 1 pmoolia vapautunutta glukoosia minuutissa, 37 ®C:n lämpötilassa.

Kokonai si nvertaasi määritettiin siten, että läsnä oli 0,2 '1 Triton X-100.

^ Erityksen tehokkuus = erittynyt invertaasi/määritetty koko-naisi nvertaasi.

*" PH01-si gnaal l oli läsnä, ei 5UC2-sekvensse iä.

^ämä tulokset osoittavat selvästi, että PH01-signaalisekvenssi toimii yhtä tehokkaasti kuin SUC2-signaalisekvenssi ajatellen hiiden kykyä edistää invertaasi n eritystä Pichia pastori s—hi i — v*sta.

38 104493

Esimerkki IX

tPA:n (kudoksen plasminogeeniaktivaattorin) eritys Tämä esimerkki osoittaa, että PH01-siqnaali sekvenssi (SEQ ID NO:3) toimii, kun se on kytketty toimivasti heterologisiin geeneihin.

1. tPA:ta koodaavan cDNA:n eristäminen

Bowes-melanooman yli-i1mentyvä tPA-soluiinja, ATCC CRL9607, oli RNA—lähde, jota käytettiin cDNA—kirjaston muodostamiseen. Muut ovat käyttäneet tätä soluiinjaa tPA-sekvenssien kloonaamiseen (Fennica et ai.. Nature. 301:214, 1983; Edlund et ai., PNfiS 80:349, 1983; Lemontt et ai., DNA 4:419, 1985). Poly A+ RNA eristettiin ja oli go dT—aiustettiin noudattaen yleisesti menetelmää, joka on kuvattu teoksessa Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, 1932). Tätä RNA:ta käytettiin cDNA:n valmistamiseen käyttäen kaupallista cDNA—kloonauspakkausta (saatavana yhtiöstä Amers— ham) ja se istutettiin Ägt 11-k. 1 oonausvektor i i n . Istutteita sisältävä Agtll— -faaqi i n-f ektoi t i i n E. col i —i säntään Y1088, käyttäen kaupallista pakkausseosta (saatavana yhtiöstä Strata-gene).

Tämä kirjasto maljattiin kolminkertaisesti ja sen koettimina käytettiin kolmea erilaista oiiqonuk1eotidiä, jotka oli suun-' niteltu ihmis—tFA:n cDNA: n julkaistujen sekvenssien perusteella (Fennica et ai., edellä). Nämä oiigonukleotidit vastasivat cDNA:n 5’-1 ohkoa, keski lohkoa ja 3'—lohkoa, ja niiden sekvenssit olivat seuraavat: 3’-koetin: 5’ GAC TGG ATT CGT GAC AAC ATG CGA CCG TGA 3’ keski koetin: 5’ TCA CAG TAC TCC CAC GTC AGO CTG C6G TTC 3’ 5’-koetin: 57 GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT GAT TGC T 3’ Tällöin tunnistettiin kolme plakkia, jotka hybridi soituivat kaikkiin kolmeen koettimeen. Näissä klooneissa olevien istutteiden pi 1kkominen restriktioentsyymei1lä osoitti niiden koodaavan tPA:ta julkaistujen restri ktiokuvioiden perusteella 39 104493 (Fennica et ai-, edellä). Kloonit erosivat toisistaan ainoastaan läsnäolevan koodaamattoman 5'-sekvenssin suuruuden suhteen. Kloonit 4 ja 5 poimittiin muiden tunnusomaisten piirteiden selvittämiseksi, koska ne sisälsivät EcoRI-pi1 kkomi sen perusteella 0,8 kb:n <5'-pää), 0,47 kb:n (keskusta) ja 1,3 kbin (CC-pää) DNA-i stuttei ta, minkä perusteella voidaan olettaa, että läsnä on täysi pituista tPAsta koodaava sekvenssi. Kloonista 4 peräisin oleva BqlII—kappale alikloonattiin BamHI-leikattuun plasmidiin pUC18, ja tämä ligaatio siirrettiin E. col i MC1061—soluihin. Positiiviset trans-f ormanti t tunnistettiin EcoRI—oi 1konnalla. Klooni, joka käsitti istutteen "sense"-suuntautuneena, tunnistettiin 420 emäsparin, 624 emäsparin, 760 emäsparin ja 2,7 ki1oemäsparin kappaleita sisältävän Pstl-restriktiokuvion perusteella ja siitä käytettiin merkintää pUC18#3. Klooni, joka käsitti istutteen "antisense"-suuntautu-neena, tunnistettiin 420 emäsparin, 624 emäsparin ja 3,46 kilo-emäsparin kappaleita sisältävän PstI—restri ktiokuvion perusteella, ja siitä käytettiin merkintää pUC18#2. Tämän istutteen koodaus alkaa kaksi nukleotidiä ennen kypsän tPA:n ensimmäistä aminohappoa, jatkuen koodaamattoman 3'-sekvenssin 1972 nukleotidin läpi.

2. Vektorin pT37 (PHOls-tPA—pUC) muodostaminen Muodosteesta pUC18#2 peräisin oleva tPA-istute kloonattiin Richia pastoris ι1mentämisplasmidiin pA0810. Tämä plasmidi pA0810 koostuu Pichia pastoris A0X1-promoottori sta. Pi chi a « pastori s PHOl-siqnaalisekvenssi stä. AQX1-kopioi nm n päättä iästä, Pichia pastoris HIS4-qeenistä valikointia varten, fl-repli-kaation aloituskohdasta, sekä sekvensseistä, jotka ovat välttämättömiä bakteereissa tapahtuvaa repiikoitumista ja valintaa ajatellen. pAOSlO muodostaminen on kuvattu esimerkissä XI.

2 UQ muodosteesta pUC18#2 saatua 1600 emäsparin Sal^I/Smal-kappaletta, joka oli ensin puhdistettu 1 '/. aqaroosi qeel 111 ä, ia johon on koodautunut tPA:n 5'—osa, ligatoitiin 300 nqraan XhoI/Smal-pi1kottua pAD810:ta. Tämä 1igaatioreaktio transformoitiin E. coli MCI061-soi ui hi n ja ampR-pesäkkeet valikoitiin. Positiiviset pesäkkeet tunnistettiin 420 bp:n, 620 bp:n, 2 40 104493 kb:n ja 6,3 kb:n kappaleista koostuvan kuvion perusteella PstI-entsyymillä pilkottaessa. Tuloksena saadusta vektorista käytettiin merkintää pTl. Sitten toteutettiin kohtaohjattu muta-geneesi noudattaen -f 1-repl i kaat i on aloituskohdan käsittäville vektoreille tavanomaisia toimenpiteitä kypsää tPArta koodaavan sekvenssin 5'-puolella sijaitsevien kahden ylimääräisen nukleotidin hävittämiseksi. Tällä mutagenoidul1 a oiigonukleotidi 11ä oli seuraava sekvenssi: 5' CAA TCT GTC TTC GCT TCT TAG CAA GTG ATC 3’

Asianmukainen plasmidi tunnistettiin seulomalla Sal I/Xbal-pi1-kottuja minipreparaatteja. Alkuperäisen vektorin pTl restrik-tiokuvio oli 1,2, 2,3 ja 6,6 kb. Oikealla tavalla mutagenoi-tuneen plasmidin kuvio oli 1,2 ja 9,8 kb ja siitä käytettiin merkintää pT2-3.

50 uq muodostetta pUC18#3 pilkottiin yhdistelmällä SmaI/Sau3A. kolme 72 ja 118 emäsparin välissä sijaitsevaa vyöhykettä (75, 9u ja 110 bp), joihin oli koodautunut tPA:n 3’—osa, puhdistettiin 8 7. pol yakryyi i amidiqeel i 11 ä ja ligatoitiin 0,5 ugraan Smal/BamHI-1 ei hattua plasmidia pT2-3. Tämä ligaatio transformoitiin E. coli MC1061—soluihin ja ampR-pesäkkeet valikoitiin. Positiiviset pesäkkeet tunnistettiin PvuII/Apal—pi 1kottuien minipreparaatti en avulla. Asianmukaisessa plasmidissa todettiin .· 421 bp:n kappale (epäasianmukaisessa todettiin 225 bp:n kap pale). Asianmukaisesta vektorista käytettiin merkintää pT37.

5?—mutageneesi todettiin sekvenssiltään oikeaksi, mutta kuitenkin sekvenssin määritys paljasti, että tämä plasmidi sisälsi pUCIB-sekvensse.iä koodaamattoman tPA 37 sekvenssin jälkeen: plasmidin pT37 todettiin käsittävän plasmidin pUClB asemista 1894-2004 peräisin oleva Sau3A—kappale välittömästi tPA—sekvenssin jälkeen.

lu ug plasmidia pT37 pilkottiin entsyymillä StuI ja sillä transformoitiin Pichia pastori s-kanta KM71 (a ο;-; 1, h i s4) . Trans— formantit valikoitiin hi stidiιniprototrofian perusteella.

: Erästä transf ormantti a, KM71: pT37, viljeltiin YNB + 27. q 1 y se— 41 104493 roli-alustassa rinnan kannan KM71:pT7 kanssa, Jonka kannan sisältämä plasmidi (pT7) oli lähes samanlainen kuin pT37 lukuunottamatta sitä, että PHOl-sionaalisekvenssi oli korvautunut luonnollisella ihmis-tPA:n signaalisekvenssi 11ä, ja että pUClS-sekvenssit olivat hävinneet 3’—päästä. Kuvaus pT7:stä on esitetty jäljempänä. 50 ml kummankin kannan viljelmää, joka oli saatu YNB +2% glyseroli-aiustal1 a kasvattaen, siirrostettiin yhden litran fermentoreihi n ja kasvatettiin joko jatkuvana kasvatuksena tai syöttöä hyväksikäyttävänä panoskasvatuksena. Tästä kokeeesta saadut tulokset on esitetty taulukossa III.

Taulukko III

*tPA, pg/1

Kasvatus- Sisäi- UI koi- Tehok- A jo Kanta_Signaali tapa_nen_nen_Yht. kuus» 1 KM71:pT7 tPA jatkuva 255 60 315 0,19 2 KM71:pT7 tPA panos 651 30 681 0,04 3 KM71:pT37 PH01 jatkuva 840 420 1260 0.33 4 KM71:pT37 PH01 panos 1856 1200 3056 0,39 * ELISA-menetelmäl1ä määritetty tPA käyttäen standardina ihmisen tPAita.

** tPA-erityksen tehokkuus = ulkoinen tPA/tPAsn kokonaistuotanto.

panos = syöttöä hyväksikäyttävä panoskasvatus.

Tämän kokeen tulokset osoittavat, että -f ermentoi nti tavasta riippumatta PH01-si onaali sekvenssi (SEQ ID N0:3) edisti tehokkaammin tPA-eritystä Pichia pastoris-hiivassa kuin luonnollinen si gnaai i sekvenssi.

Lisäksi mikro-Edman hajotusanalyysi varmisti sen, että FH01-signaaiisekvenssiä (SEQ ID NO:3) käytettäessä tämän yhdistelmä-DNA-teknisen, kannasta KM71:pT3 erittyneen tPA:n N-päätteen aminohapposekvenssi oli sama kuin luonnollisessa tPA—proteiinissa, joka oli puhdistettu viljellystä ihmiskudoksesta imela-noomakudoksesta).

♦ 42 104493 3. pT7: n <tPAss-tPA-no pUC) muodostaminen 5 pg muodosteesta pUC18#3 peräisin olevaa, noin 100 bp:n SmaI/Sau3A—kappalettä ligatoitiin 500 ng:aan Smal/BamHI-1ei -kattua muodostetta pTl. Tämä ligaatioseos trans-f ormoi ti i n E. coli MC1061—soi ui hi n ja ampR-pesäkkeet valikoitiin. Positiivi Ίpesäkkeet tunnistettiin siitä, että läsnä oli 360 bp:n vyöhyke 260 bp:n vyöhykkeen sijasta yhdistelmällä Apal/PvuII pilkottaessa. Muokatun 3’-pään sekvenssi määritettiin, ja sen todettiin olevan asianmukainen sekvenssi ilman ylimääräisiä pUC18-sekvenssejä. Tästä plasmidista käytettiin merkintää pT49.

Autenttista tPA-signaalisekvenssiä koodaavat oiigonukleotidit lisättiin plasmidin pT49 Xbal-kohtaan. minkä jälkeen toteutettiin kaksi mutageneesiä 1) tPA-signaalisekvenssin ja kypsää tF'A:ta koodaavan sekvenssin väliin jääneen sekvenssin 8 ylimääräisen nukleotidin hävittämiseksi, sekä 2) PHOl-signaali-sekvenssin hävittämiseksi. Nämä manipuloinnit toteutettiin seuraavasti.

Ensin syntetoitiin oiigonukleotidi, jolla oli seuraava sekvenssi (109 nukleotidiä):

5' CT A GAT GGA TGC AAT GAA GAG AGG GCT CTG CTG TGT GCT GCT

GCT GTG TGG AGC AGT CTT GCT TTC GCC CAG CCA GGA AAT CCA TGC

CCG ATT CAG AAG AGG AGC CAG A3’.

Toista juostetta varten välttämätön täydentävä vastinoligonuk- 1 eotidi syntetoitiin kolmena oiigonukl eotidinä, joiden pituudet olivat vastaavasti 33, 37 ja 39 nukleotidiä, ja joilla oli seuraavat sekvenssit: 5’ CTG GCT GGG C6A AAC GAA GAC TGC TCC ACA CAG 3’ 5’ CT A GTC TGG CTC CTC TTC TGA ATC GGG CAT GGA TTT C 3’ 5’ CAG CAG CAC ACA GCA GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT 3’ « « 43 104493 Täysi pituinen oiigonukleotidi ja nämä kolme täydentävää vastin-oli gonukleotidiä kinasoitiin ja liitettiin yhteen kuumentamalla kiehuvassa vesihauteessa 3 minuuttia ja jäähdyttämällä sitten hitaasti huoneen lämpötilaan. Yhdistetty oiiqonukleotidi erotettiin ja eristettiin 5 '/. pol yakryyl i ami di geel i 1 tä.

200 ng osittain Xbal-linearisoitua muodostetta pT49 ligatoitiin 1 pg:aan tätä yhdistettyä kaksijuosteista oiigonukleotidiä.

Tämä 1igaatioreaktio trans-f ormoi ti in E. col i MC1061—soluihin ja. ampR-pesäkkeet valikoitiin. Oikealla tavalla muuntuneen plasmidin sisältävät kloonit tunnistettiin ylimääräisestä 700 bp:n vyöhykkeestä AsuiI-entsyymi 11ä pilkottaessa. Tästä oikeasta plasmidista käytettiin merkintää pT544.

Ensimmäinen mutageneesi toteutettiin tavanomaisena f 1-perustuvana kohtaohjattuna mutageeneesinä käyttäen pT544 DNA:ta (5 pg> sekä oiigonukleotidiä <1 Mg), jolla oli seuraava sekvenssi : 5’ GA TTC AGA GGA GCC AGA TCT TAC CAA GTG ATC TGC AG 3’ .

Asianmukainen plasmidi seulottiin Bg2_I I-entsyymi 11 ä pilkkomalla. Oikea restriktiokuvio (1,1, 2,8 ja 5,3 kb) osoitti asianmukaisen plasmidin, josta käytettiin merkintää pT64. (Epäasianmukaisen plasmidin kuvio muodostui 2,8 ja 6,3 kb:n vyöhykkeistä. )

Toinen mutageneesi toteutettiin plasmidilla pT64 PHGl-siqnaaii-sekvenssin hävittämiseksi. Sekvenssiltään seuraavanlaista oii-gonuk leotidiä kävtetti in: 5' ACT AAT TAT TCG AAA CGA TGG ATG CAA TGA AGA GAG G 3’ 3 pc muodostetta pT64 ja 0,4 ug edellä kuvattua oiigonukleo— tidiä käytettiin mutageneesiin. Minipreparaatit seulottiin Bql 11: 1 1 a pilkkomalla. Asianmukainen plasmidi tunnistettiin kolmesta DNA-kappal eesta, joiden koko oli 1, 28 ja 5,3 kb (epäasi anmukai sessa plasmidissa todettiin pienimmäksi vyöhvk-: keeksi 1,1 kb 1 kb:n sijasta). Mutageneesi varmistettiin mää- 44 104493 rittämällä sekvenssi, ja asianmukaisesta plasmidista käytettiin merkintää pT7.

Esimerkki X

pAPBIOI: PHOl-promoottori-1 acZ-i1mentämi splasmi din muodosta-mi nen Tämä esimerkki osoittaa, että PHOl-promoottori -(tai 5?-säätelyalue) (SEQ ID NO:2) toimii, kun se on kytketty toimivasti he-terologisiin geeneihin. 1 pg 1acZ-sisältävää plasmidia pSAOHS (NRRL B-15862) pilkottiin entsyymeillä EcoRI ja BamHI. ja 10,1 kb:n vektori kappal e eristettiin 0,8 7. agaroosi geel i 11 ä. 5 ug plasmidia pLP2420 pilkottiin entsyymeillä EcoRI ja Bell ja 1 V. agaroosi geel i 1 tä eristettiin 1,6 kb:n kappale, joka sisälsi 375 emäsparia pBR322 DNA:ta, noin 1075 emäsparia PHOl 5' reunustavasta DNA:sta, PHOl-promoottori (SEQ ID NO:2) mukaan lukien, sekä 123 emäsparia FHOl-koodausketjusta. 100 ng pSA0H5:n EcoRI-BamHI-kappal että ja 60 ng pLP2420:stä saatua 1,6 kb:n EcoRI-BclI-kappaletta ligatoitiin 20 plzssa seosta, joka sisälsi 1igaasipuskurιa ja 1 mM ATP sekä 1U T4 DNA-ligaa-sia (saatavana yhtiöstä Boehringer Mannheim). Ligaatioseos tr ans-f or moi 11 i n E. col i JM103—kantaan ja nämä trans-f ormoi dut solut maljattiin LB Amp-maljoi 11 e, jotka sisälsivät 40 pg/ml X-gal. Sinisiksi värjäytyneet pesäkkeet valittiin, kasvatettiin LB Amp-alustal1 a ja plasmidi-DNA eristettiin. DNA pilkottiin entsyymeillä EcoRI ja Smal ja asianmukainen plasmidi tunnistettiin sen perusteella, että siitä vapautui 1450 kb:n kappale. Oikeasta plasmidista käytettiin merkintää pAPBIOI. Tämä plas-midin pAPBIOI sisältämä i1mentämiskasetti koostui E. coli lacZ-geenistä. joka oli Pichia pastoris PHOl-promoottorielement ι n (SEQ ID NO:2) säätelyn alaisuudessa.

10 μς 1 ei kkaamatonta plasmidia pAPBIOI trans-f ormoi ti i n GS115-s-f eropl astei hi n ja hi st i di i ni prototro-f i t valikoitiin. 12 His·*-pesä.kettä valttiin, kantoja kasvatettiin runsaasti fosfaattia (HP) sisältävässä nestemäisessä alustassa ja LP-al Listassa, ja niistä määritettiin fl-gal aktosi daasi akti i vi suus. Positiiviset . transf ormantti kannat tunnistettiin (1-qal aktosi daasi n ilmentv- 4S 104493 mi sen perusteella LP-alustalla kasvattamisen jälkeen, sekä (1-galaktosidaasin puuttumisen perusteella HP-alustalla kasvattamisen jälkeen. (5-gal aktosi daasi analysoitiin menetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, NY, 1972. Sinisiä pesäkkeitä ilmaantui LP—X-gal-maljoi 11 e ja valkoisia pesäkkeitä ilmaantui HP-X-gal-maljoi 11 e.

Esimerkki XI

Seuraavat plasmidit muodostettiin tämän hakemuksen muissa esimerkeissä käyttöä varten.

1 - Plasmidin pA0810 muodostaminen M13mpl9äRI muodostettiin pilkkomalla 1 pg Iil3mpl9-f aagi a EcoRI -entsyymillä, täyttämällä K'lenow-reagenssi 11 a ja ligatoimalla täytetty kappale itsensä kanssa; tällä ligaatiolla transformoitiin E. col i JM103-soluja ja asianmukainen -faagi tunnistettiin eristämällä DNA ja pilkkomalla se entsyymillä EcoRI. EcoRI ei pilkkonut tätä asianmukaista -f aagi a, josta käytettiin nimitystä M13mpl9ARI. Plasmidi pA0804 (jonka muodostaminen on kuvattu patenttijulkaisussa W0S9/O432O, joka liitetään oheen tällä viittauksei1 a) pilkottiin entsyymeillä SstI ja EcoRI ja arvioita noin 1,2 kb: n kappale eristettiin 0,8 7. agaroosi geeliltä. (Tässä muodostuksessa kaikki kappaleet eristettiin 0,8-1,0 7. aqaroosi geelei 1 tä. ) 100 ng tätä kappaletta ligatoitiin 500 no:aan SstI- ja Smal-pi1kottua M13mpl9äRI—f aagia. Tällä ligaatiolla transformoitiin E. coli JM103-soluja, ja asianmukainen faagi tunnistettiin eristämällä DNA ja pilkkomalla se entsyymeillä Sst I ja Pvu 11. Asianmukainen -faagi tunnistettiin 950 emäsparin kappaleen läsnäolosta, ja siitä käytettiin mer— kintää pPSVIOl.

Yhdellä pikomoolilla faagia pPSVIOl toteutettiin in vitro oli— qonukieotidi 11 a ohjattu kohtaspesifinen mutageneesi käyttäen 20 pikomoolia oiigonukleotidia, jolla oli seuraava sekvenssi: ; 5’ CGA 6GA ATT CCC C6G GAT CCT TAG ACA T 3' 46 104493 Tällä reakt i oseoksel 1 a trans-f ormoi ti i n E. coli JM103-sol uja.

Asianmukainen -faagi tunnistettiin pilkkomalla mi ni -prep-DNA BqIII- ja BamHI-entsyymi11ä. mikä osoitti 1,4 kb:n ja 0,5 kb:n DNA-kappal ei den läsnäolon. Asi anmukai sest a -faagi st a käytettiin merkintää pPSV102.

Plasmidi pPSV102 pilkottiin EcoRI-entsyymi 11ä ja 500 nq 8,5 kb:n kappaletta ligatoitiin 50 ng:aan seuraavaa kaksijuosteista synteettistä DNA-kappalettä, johon oli koodautunut Pichia pastori s PHOi-signaalisekvenssi /SEQ ID N0:3), käyttäen seuraavia optimoituja Pi chi a-kodonei ta:

5’—AATTC ATG TTC TCT CCA ATT TTG TCC TTG GAA ATT ATT TTA GCT 37-6 TAC AA6 AGA GGT TAA AAC AGG AAC CTT TAA TAA AAT C6A

TTG GCT ACT TTG CAA TCT GTC TTC GCT CGA G-3’ AAC CGA TGA AAC GTT AGA CAG AAG CGA GCT C TTAA-5’ Tällä 1igaatιoseoksel1 a trans-f ormoi t i i n E. coli CJ236—soi uja, ja asi anmukai nen -faagi-DNA tunnistettiin pl akki nybri di saati oi 1 a hiivan signaalisekvenssi n yhden koodaavan juosteen kanssa, joka oli merkitty 32P-isotoopi11 a. ja pilkkomalla hybridi soi-tuva DNA entsyymeillä SstI ja BamHI 700 bp:n kappaleen paljastaen. Tästä plasmidista käytettiin merkintää dPSV103.

Yksi pikomooli plasmidia pPSV103 mutagenoitiin in vitro 20 ·' pikomooli 11a oiiqonukleotidiä, jonka sekvenssi oli: 5' CT AA ~TA TTC GAA ACG ATG TTC TCT CCA ATT 31-

Asi anmukai nen faagi-DNA tunnistettiin plakkihybrιdi saatioi 1 a saman, edellä käytetyn oiiqonukleotιdi n kanssa. Asianmukaisesta plasmidista käytettiin merkintää pPSV104.

Plasmidi pAOBlO valmistettiin pilkkomalla 10 pg plasmidia pPSV104 entsyymillä Hi ndI 11, ja eristämällä 400 bp:n DNA-kap-pale 1,2 V. agaroosi geel 11 tä. 50 ng tätä kappaletta ligatoitiin 250 nq:aan muodosteesta pA0807 saatua 7,9 kb:n Hind 111-pi 1 k- 47 104493 komistuotetta, joka eristettiin 0,8 7. agaroosigeeli 1 tä CpA0B07:n valmistus on kuvattu jäljempänä). Tämä ligaatio transformoiti in E. coli MC1061—soluihin ja ampR—pesäkkeet valikoitiin. Asianmukainen plasmidi tunnistettiin sen perusteella, että läsnä oli 450 bp:n vyöhyke entsyymeillä BamHI ja EcoRV pilkottaessa, ja siitä käytettiin merkintää pADBlO.

2. pA0BQ7;n muodostus a. fl-ori DNA: n valmistus fl bakteeri o-faagi-DNA (50 pg) pilkottiin 50 yksiköllä entsyymejä RsaI ja Drai (valmistajan ohjeiden mukaan), jolloin saatiin vapautumaan noin 458 bp:n DNA-kappale, joka sisälsi fl-replikaation alkamiskohdan (ori). Pi 1kkomisseos uutettiin yhtäsuur el la tilavuudella PCI-liuosta, mitä seurasi vesi kerroksen uuttaminen yhtä suurella tilavuudella Cl-liuosta ja lopuksi vesi f aasissa ollut DNA saostettiin asettamalla NaCl-pitoisuus arvoon 0,2M ja lisäämällä 2,5 tilavuutta absoluuttista etanolia. Seoksen annettiin seisoa jäissä (4 °C) 10 minuutin ajan, minkä jälkeen saostunut DNA otettiin talteen sentrifugoimal 1 a 30 minuuttia nopeudella 10000xg mikrofugissa, 4 °C:ssa.

DNA—kasauma pestiin kahdesti 70 7. etanolin vesiliuosta. Pesty kasauma kuivattiin vakuumissa ja liuotettiin 25 μΐ:aan TE—puskuria. DNA käsiteltiin elektroforeettisesti 1,5 7. agaroosigee-.· lilllä ja se geeli osa, joka sisälsi tämän ~45S bp: n fl—ori— kappaleen, leikattiin erilleen ja tässä geeliosassa ollut DNA eluoitiin sähköisesti DEB1—paperi 11 e (Whatman) ja se eluoitiin paperilta IN NaCI—1iuokseen. DNA—liuos saostettiin edellä kuvatulla tavalla ja saostunut DNA liuotettiin 25 μΐ:aan TE-pus— kuria (f 1—ori—kappale).

b. fl-ori:n kloonaaminen plasmidin pBR322 Dral-kohti i n pBR322 (2 pg) pilkottiin osittain 2 yksiköllä entsyymiä Dral (valmistajan ohjeiden mukaan). Reaktio päätettiin PCI—uutolla, minkä jälkeen DNA-saostettiin edellisessä vaiheessa kuvatulla tavalla. DNA—kasauma liuotettiin 20 pl:aan TE—puskuria. Noin j 100 ng tätä DNA:ta ligatoitiin 100 ng:aan f1-ori-kappalettä 4β 104493 (vaihe a) 20 pl:ssa 1igaatiopuskuria inkuboimal1 a 14 °C:ssa yön yli yhdessä T4 DNA-ligaasin 1 yksikön kanssa. Ligaatio päätettiin kuumentamalla 70 °C:n lämpötilaan 10 minuutiksi, minkä jälkeen sillä transformoitiin E. coli~kanta JM103 pBRfl-ori:n saamiseksi, joka sisältää fl—ori:n kloonattuna plasmidin pBR322 Dral—kohti i n (nukleotidi asemat 3232 ja 3251).

c. pA0B07:n muodostus

Muodostetta pBRfl—ori (10 ug) pilkottiin 4 tunnin ajan 37 *C:ssa kulloinkin 10 yksiköllä entsyymejä PstI ja Ndel. Pilkottu DNA FCI-uutettiin, saostettiin ja liuotettiin 25 ul:lla TE—puskuria edellä, vaiheessa 1 esitetyllä tavalla. Tämä materiaali käsiteltiin el ektrof oreett i sest i 1,2 7. agaroosi geel i 11 ä ja fl-ori:n sisältävä Ndel—PstI—kappale (noin 0,8 kb) eristettiin ja liuotettiin 20 pilaan TE—puskuria edellä vaiheessa a kuvatulla tavalla. Noin 100 ng tätä DNA:ta sekoitettiin lOO ngzaan muodostetta pA0B04, joka oli pilkottu entsyymeillä PstI ja Ndel ja käsitelty fosfataasi11 a. pA0804 on kuvattu julkaisussa W089/O4320. Tämä seos ligatoitiin 20 μΐ:aan 1igaatiopuskuri a inkuboimalla yön yli 14 °C:n lämpötilassa siten, että läsnä oli 1 yksikkö T4 DNA-1igaasia. Ligaatioreaktio päätettiin kuumentamalla 70 °C:ssa 10 minuuttia. Tällä DNA:11a transfor— moiti in E. coli —kanta JM103, jolloin saatiin pA08o7.

Esimerkki XII

pPSV21B:n muodostus 200 ng pLP2420:sta saatua 1,6 kb:n EcoRI/BclI-kappalettä. 100 ng pPG2.5:stä saatua 0,3 kb:n BglII/Hindi II—kappalettä (katso ai 1 a oleva kuvaus) ja 100 ng pUC8:sta saatua 2,6 kb:n EcoRI/ —

Hi ndIII—kappa!että (New England Biolabs, Inc.) ligatoitiin koi miosaisena ligaationa 20 ui:n ti1avuudessa 1igaatiopuskuria, 1 mM ATP, IL) T4-ligaasia, ja transf ormoi t i i n E. col i-kantaan MCI 061 Amp-vastustuskvvyn aikaansaamiseksi. CPlasmidi pPG2.5 on pPG4.0:sta (NRRL B-15868) saatu 2,5 kb:n EcoRI-SalI-kappale sijoitettuna plasmidiin pBR322, joka sisältää aikoholioksi -daasipromoottorin.] Vastustuskykyiset kloonit analysoitiin ; sellaisten plasmidien löytämiseksi, jotka sisälsivät 2,4 kb:n 49 104493

EcoRI+HindlII-kappaleen; asianmukaisesta plasmidista käytettiin merkintää pPSV201. 50 ng pPSV201 pilkottiin entsyymillä BamHI. detosforyloi tiin ja ligatoitiin oiigonukleotidin, jolla on seuraava sekvenssi, 50-kertaisen molaarisen ylimäärän kanssa: 5’-5ATCAGATCT—3’ jolloin BamHI-kohta muuttuu BollI-kohdaksi . Positiiviset kloonit tunnistettiin tällä perusteella ja plasmidista käytettiin merkintää pPSV203. 10 ng plasmidia pPSV203 pilkottiin osittain rajoittavalla määrällä entsyymiä Hindlll ja päät tehtiin tylpiksi K1enow-reagenssi11 a. Lineaariset täysipituiset plasmidi-kappaieet geelipuhdistettiin ja ligatoitiin itsensä kanssa 100 μ1:η tilavuudessa. Asianmukaiset kloonit tunnistettiin 1350 bp:n BglII/Hi ndlII-kappaleen sisältävän plasmidi-DNA:n perusteella ja asianmukaisista plasmideista käytettiin nimitystä pPSV210.

60 ng plasmidista pLP2420 saatua 500 bp:n Bg_l_I I-BamHI-kappaletta ligatoitiin 100 ng:aan entsyymillä BamHI-pi1kottua plasmidia pUC8. Asianmukaiset plasmidit tunnistettiin niissä läsnäolevan 422 bp:n Ncol-BamHI-kappaleen perusteella; tuloksena saadusta plasmidista käytettiin merkintää pPSV202. 50 ng plasmidia pPSV202 pilkottiin entsyymillä BamHI. de-f osf oryl oi ti i n ja ligatoitiin oiigonukleotidin, jolla on seuraava sekvenssi, .· 50-kertaisen molaarisen ylimäärän kanssa: 5’-GATCAGATCT-3’ jolloin BamHI-kohta muuttui BallI-kohdaksi Asianmukainen plasmidi tunnistettiin läsnäolevan 422 bp:n Ncol/BglII-kappa-1een perusteella, ja siitä käytettiin merkintää pPSV204.

10 ug plasmidia pPSV210 pilkottiin entsyymeillä Bgl11 ja SacI. ja 700 bp:n kappale geelipuhdistettiin. 25 ng tätä kappaletta ligatoitiin 100 ng:aan muodosteesta pAOBlO saatua, geelipuh-distettua 8200 bp:n Bgl11/SacI-kappalettä. Asianmukaiset plas-ί midit tunnistettiin läsnäolevan 700 bp:n BglII/SacI-kappaleen 104493 5υ perusteella, ja niistä käytettiin merkintää pF‘SV212. 10 pg plasmidia pPSV212 pilkottiin entsyymillä Sphl. päät tehtiin tylpiksi T4 DNA-polymeraasi11 a (katso julkaisu Maniatis et ai.), pilkottiin osittain entsyymillä BglII. ja 8000 bp:n kappale geel i puhdi stett i i n. 10 pg plasmidia pF'SV204 pilkottiin entsyymillä Ncol. päät tehtiin tylpiksi ΚΊ enow-reagenssi11a, pilkottiin entsyymillä Bgl.II, ja 440 bpsn kappale geelipuhdis-tettiin. 100 ng edellä kuvattua, pPSV212:sta saatua 8 kb:n kappaletta ligatoitiin 15 ng:aan pPSV204:stä saatua 440 bp:n kappaletta. Asianmukainen plasmidi tunnistettiin 5500 bp:n Bgl11-kappaleen läsnäolon perusteella, ja siitä käytettiin nimitystä pPSV218.

Esitettyjen esimerkkien tarkoituksena on pelkästään havainnollistaa oheisen keksinnön soveltamista käytäntöön, eikä niiden tarkoituksena ole rajoittaa keksintöä tai liitteenä olevia patenttivaatimuksia millään tavalla. Kohtuullisten muunnosten ja muokkausten, jotka eivät kuitenkaan poikkea keksinnön hengestä ja tavoitteista, katsotaan kuuluvan tavoitellun patenttisuojan piiriin.

LUETTELO SEKVENSSEISTÄ (1) YLEISTIETOA Sekvenssien lukumäärä: 5 51 104493

(2) SEQ ID NO:1—SEKVENSSIIN LIITTYVÄT TIEDOT

(i) SEKVENSSIN TUNNUSOMAISET PIIRTEET: (A) PITUUS: 1994 bp (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: perimän DNA

(;;i) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 1 GGATCCCTAT TGTTACTTTT GCTTAACATT CCAATATTCT TCAACGGTTA ATTGATTAAC 60 ACTGTAACCT CTGCCCATGT GCTTCATCCA AATCTGGTAA TCTGCTTTCT ATTTCTGCCA 120 AAATAGTTAA TCTATGAGAC ATGTGCCCTC AATTGCGCAG TAGATCGAGT GGAAGTCTTC 180 TTTGCGTAAC ACTCAAAGTA TATCCCTGTT AGTCTTTATT CACCTGTTGC TGCATTGGTG 240 TCAGTTACCA TTATTGTTTC CACTTGGAAA AGCTTGTTTT TTTTTGATAG CACAGAAACG 300 TGGGCTCCGA TAAGCTAAAC TTCAACGAGA ATATAAAAGC TGAAAAGATT CTTGTCAAGA 360 : ACTTGTACAA CGACCAATAA GTCTTTCAAG GCATCAGAC ATG TTT TCT CCT ATT CTA 417

Het Phe Ser Pro lie Leu -20 AGT CTG GAA ATT ATT CTC GCT TTG GCT ACT CTC CAA TCA GTC TTT GCG GTT 468

Ser Leu Glu lie lie Leu Ala Leu Ala Thr Leu Gin Ser Vai Phe Ala Vai -15 -10 -5 1 GAG TTG CAG CAC GTT CTT GGA GTC AAC GAC AGA CCC ΤΛΤ CCT CAG AGG ACA 519

Glu Leu Gin His Vai Leu Gly Vai Asn Asp Arg Pro Tyr Pro Gin Arg Thr 5 10 15 52 104493 GAT GAT CAG TAC AAC ATT CTG AGA CAT CTG GGA GGC TTG GGC CCC TAG ATC 570

Asp Asp Gin Tyr Asn lie Leu Arg His Leu Gly Gly Leu Gly Pro Tyr lie 20 25 30 35 GGT TAC AAT GGA TGG GGA ATT GCT GCT GAG TCT GAA ATT GAA TCC TGT ACG 621

Gly Tyr Asn Gly Trp Gly lie Ala Ala Glu Ser Glu lie Glu Ser Cys Thr 40 45 50 ATT GAT CAG GCT CAT CTG TTG ATG AGA CAT GGA GAA AGA TAC CCA AGT ACC 672 lie Asp Gin Ala His Leu Leu Met Arg His Gly Glu Arg Tyr Pro Ser Thr 55 60 65 ΑΛΤ GTG GGG AAA CAA CTA GAA GCT TTG TAC CAG AAA CTA CTA GAT GCT GAT 723

Asn Val Gly Lys Gin Leu Glu Ala Leu Tyr Gin Lys Leu Leu Asp Ala Asp 70 75 80 85 GTG GAA GTC CCT ACA GGA CCA TTG TCT TTC TTT CAA GAC TAT GAT TAC TTC 774

Val Glu Val Pro Thr Gly Pro Leu Ser Phe Phe Gin Asp Tyr Asp Tyr Phe 90 95 100 GTC TCT GAC GCC GCT TGG TAC GAG CAA GAA ACA ACT AAG GGT TTC TAC TCG 825

Val Ser Asp Ala Ala Trp Tyr Glu Gin Glu Thr Thr Lys Gly Phe Tyr Ser 105 110 115 120 GGG TTA AAC ACC GCT TTC GAT TTT GGT ACC ACT TTG AGA GAA CGA TAT GAA 876 *; Gly Leu Asn Thr Ala Phe Asp Phe Gly Thr Thr Leu Arg Glu Arg Tyr Glu 125 130 135 CAT TTG ΑΤΛ AAC AAT AGC GAA GAA GGA AAG AAA CTT TCT GTT TGG GCT GGC 927

His Leu lie Asn Asn Ser Glu Glu Gly Lys Lys Leu Ser Val Trp Ala Gly 140 145 150 TCT CAA GAA AGA GTT GTT GAC AAC GCA AAG TAC TTT GCT CAA GGA TTT ATG 978

Ser Gin Glu Arg Val Val Asp Asn Ala Lys Tyr Phe Ala Gin Gly Phe Met 155 160 165 170 • 53 104493 AAA TCT AAC TAC ACC GTT ATG GTC GAA GTC GTT GCT CTA GAA GAG GAG AAA 1029

Lys Ser Asn Tyr Thr Val Met Vai Glu Vai Val Ala Leu Glu Glu Glu Lys 175 180 185 TCC CAG GGA CTC AAC TCT CTA ACG GCT CGA ATT TCA TGT CCA AAC TAT AAC 1080

Ser Gin Gly Leu Asn Ser Leu Thr Ala Arg lie Ser Cys Pro Asn Tyr Asn 190 195 200 205 AGC CAT ATC TAC AAA GAT GGC GAC TTG GGG AAT GAC ATT GCT CAA AGA GAA 1131

Ser His lie Tyr Lys Asp Gly Asp Leu Gly Asn Asp lie Ala Gin Arg Glu 210 215 220 GCT GAC AGA TTG AAC ACT CTT TCT CCA GGA TTT AAC ATT ACT GCA GAT GAT 1182

Ala Asp Arg Leu Asn Thr Leu Ser Pro Gly Phe Asn lie Thr Ala Asp Asp 225 230 235 ATT CCA ACA ATT GCC CTA TAC TGT GGC TTT GAA CTA AAT GTA AGA GGT GAG 1233 lie Pro Thr lie Ala Leu Tyr Cys Gly Phe Glu Leu Asn Val Arg Gly Glu 240 245 250 255 TCA TCC TTC TGT GAC GTC TTG TCA AGA GAG GCT CTA CTG TAC ACT GCT TAT 1284

Ser Ser Phe Cys Asp Val Leu Ser Arg Glu Ala Leu Leu Tyr Thr Ala Tyr 260 265 270 CTT AGA GAT TTG GGA TGG TAT TAC AAT GTT GGA AAC GGG AAC CCA CTT GGA 1335 • Leu Arg Asp Leu Gly Trp Tyr Tyr Asn Val Gly Asn Gly Asn Pro Leu Gly 275 280 285 290 AAG ACA ATC GGC TAC GTC TAT GCC AAC GCC ACA AGA CAG CTG TTG GAA AAC 1386

Lys Thr lie Gly Tyr Val Tyr Ala Asn Ala Thr Arg Gin Leu Leu Glu Asn 295 300 305 ACA GAA GCT GAT CCT AGA GAT TAT CCT TTG TAC TTT TCC TTT AGT CAT GAT 1437

Thr Glu Ala Asp Pro Arg Asp Tyr Pro Leu Tyr Phe Ser Phe Ser His Asp 310 315 320 54 104493 ACC GAT CTG CTT CAA GTA TTC ACT TCA CTC GGT CTT TTC AAC GTG ACA GAT 1488

Thr Asp Leu Leu Gin Val Phe Tbr Ser Leu Gly Leu Phe Asn Val Thr Asp 325 330 335 340 CTG CCA TTA GAC CAG ATT CAA TTC CAG ACC TCT TTC AAA TCT ACC GAA ATA 1539

Leu Pro Leu Asp Gin lie Gin Phe Gin Thr Ser Phe Lys Ser Thr Glu lie 345 350 355 GTT CCC ATG GGA GCA AGA TTG CTT ACC GAG AGA TTA TTG TGT ACT GTT GAA 1590

Val Pro Met Gly Ala Arg Leu Leu Thr Glu Arg Leu Leu Cys Thr Val Glu 360 365 370 GGT GAA GAA AAA TAC TAC GTT AGA ACT ATC CTC AAC GAT GCA GTC TTC CCA 1641

Gly Glu Glu Lys Tyr Tyr Val Arg Thr lie Leu Asn Asp Ala Val Phe Pro 375 380 385 390 CTG AGT GAC TGT TCC TCT GGC CCT GGA TTC TCT TGT CCG TTG AAC GAT TAT 1692

Leu Ser Asp Cys Ser Ser Gly Pro Gly Phe Ser Cys Pro Leu Asn Asp Tyr 395 400 405 GTT TCT AGA CTT GAG GCA TTG AAC GAG GAC AGT GAC TTT GCG GAA AAC TGT 1743

Val Ser Arg Leu Glu Ala Leu Asn Glu Asp Ser Asp Phe Ala Glu Asn Cys 410 415 420 425 GGA GTT CCT AAA AAT GCT TCC TAC CCA CTT GAA CTA TCA TTC TTC TGG GAT 1794

Gly Val Pro Lys Asn Ala Ser Tyr Pro Leu Glu Leu Ser Phe Phe Trp Asp 430 435 440 GAC TTG TCA TAAAAATGGT AAGGAATGTT TTGCATCAGA TACGAGTTCA AAACGATTAA 1853 Asp Leu Ser . 445 GAAGAGAATG CTCTTTTTTT TGTTTCTATC CAATTGGACT ATTTTCGTTT ΛΤΤΤΤΑΛΛΤΑ 1913 GCGTACAACT TTAACTAGAT GATATCTTCT TCTTCAAACG ATACCACTTC TCTCATACTA 1973 55 104493 GGTGGAGGTT CAATGGATCC 1993

(2) SEQ ID NO:2-SEKVENSSIIN LIITTYVÄT TIEDOT

(i) SEKVENSSIN TUNNUSOMAISET PIIRTEET: (A) PITUUS: 400 bp CEO TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(li) MOLEKYYLITYYPPI: perimän DNA

(>: i ) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 2 GGATCCCTAT TGTTACTTTT GCTTAACATT CCAATATTCT TCAACGGTTA ATTGATTAAC 60 ACTGTAACCT CTGCCCATGT GCTTCATCCA AATCTGGTAA TCTGCTTTCT ATTTCTGCCA 120 AAATAGTTAA TCTATGAGAC ATGTGCCCTC AATTGCGCAG TAGATCGAGT GGAAGTCTTC 180 TTTGCGTAAC ACTCAAAGTA TATCCCTGTT AGTCTTTATT CACCTGTTGC TGCATTGGTG 240 TCAGTTACCA TTATTGTTTC CACTTGGAAA AGCTTGTTTT TTTTTGATAG CACAGAAACG 300 : TGGGCTCCGA TAAGCTAAAC TTCAACGAGA ATATAAAAGC TGAAAAGATT CTTGTCAAGA 360 ACTTGTACAA CGACCAATAA GTCTTTCAAG GCATCAGAC 399 56 104493

(2) SEQ ID NO:3-SEKVENSSIIN LIITTYVÄT TIEDOT

(i) SEKVENSSIN TUNNUSOMAISET PIIRTEET: (fi) PITUUS: 66 bp (B) TYYPPI: nukleiinihaooo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (i i) MOLEKYYLITYYPPI; per i män DNA (;-;i ) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 3 ATG TTT TCT CCT ATT CTA 18 Het Phe Ser Pro lie Leu -20 AGT CTG GAA ATT ATT CTC GCT TTG GCT ACT CTC CAA TCA GTC TTT GCG 66 Ser Leu Glu lie lie Leu Ala Leu Ala Thr Leu Gin Ser Vai Phe Ala -15 -10 -5 104493

<2) SEQ ID NO:4-SEKVENSSIIN LIITTYVÄT TIEDOT

(i) SEKVENSSIN TUNNUSOMAISET , PIIRTEET: (A) PITUUS: 1341 bp (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: perimän DNA

(;;i) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:4 • 1 58 104493 GTT 3 Vai 1 GAG TTG CAG CAC GTT CTT GGA GTC AAC GAC AGA CCC TAT CCT CAG AGG ACA 54

Glu Leu Gin His Val Leu Gly Val Asn Asp Arg Pro Tyr Pro Gin Arg Thr 5 10 15 GAT GAT CAG TAC AAC ATT CTG AGA CAT CTG GGA GGC TTG GGC CCC TAC ATC 105

Asp Asp Gin Tyr Asn lie Leu Arg His Leu Gly Gly Leu Gly Pro Tyr lie 20 25 30 35 GGT TAC AAT GGA TGG GGA ATT GCT GCT GAG TCT GAA ATT GAA TCC TGT ACG 156

Gly Tyr Asn Gly Trp Gly lie Ala Ala Glu Ser Glu lie Glu Ser Cys Thr 40 45 50 ATT GAT CAG GCT CAT CTG TTG ATG AGA CAT GGA GAA AGA TAC CCA AGT ACC 207 lie Asp Gin Ala His Leu Leu Met Arg His Gly Glu Arg Tyr Pro Ser Thr 55 60 65 AAT GTG GGG AAA CAA CTA GAA GCT TTG TAC CAG AAA CTA CTA GAT GCT GAT 258

Asn Val Gly Lys Gin Leu Glu Ala Leu Tyr Gin Lys Leu Leu Asp Ala Asp 70 75 80 85 GTG GAA GTC CCT ACA GGA CCA TTG TCT TTC TTT CAA GAC TAT GAT TAC TTC 309

Val Glu Val Pro Thr Gly Pro Leu Ser Phe Phe Gin Asp Tyr Asp Tyr Phe 90 95 100 GTC TCT GAC GCC GCT TGG TAC GAG CAA GAA ACA ACT AAG GGT TTC TAC TCG 360

Val Ser Asp Ala Ala Trp Tyr Glu Gin Glu Thr Thr Lys Gly Phe Tyr Ser 105 110 115 120 59 104493 GGG ΊΤΑ AAC ACC GCT TTC GAT TTT GGT ACC ACT TTG AGA GAA CGA TAT GAA 411

Gly Leu Asn Thr Ala Phe Asp Phe Gly Thr Thr Leu Arg Glu Arg Tyr Glu 12.5 130 135 CAT TTG ΛΤΛ AAC AAT AGC GAA GAA GGA AAG AAA CTT TCT GTT TGG GCT GGC 462

His Leu lie Asn Asn Sec Glu Glu Gly Lys Lys Leu Ser Val Trp Ala Gly 140 145 150 TCT CAA GAA AGA GTT GTT GAC AAC GCA AAG TAC TTT GCT CAA GGA TTT ATG 513

Ser Gin Glu Arg Val Val Asp Asn Ala Lys Tyr Phe Ala Gin Gly Phe Met 155 160 165 170 AAA TCT AAC TAC ACC GTT ATG GTC GAA GTC GTT GCT CTA GAA GAG GAG AAA 564

Lys Ser Asn Tyr Thr Val Met Val Glu Val Val Ala Leu Glu Glu Glu Lys 175 180 185 TCC CAG GGA CTC AAC TCT CTA ACG GCT CGA ATT TCA TGT CCA AAC TAT AAC 615

Ser Gin Gly Leu Asn Ser Leu Thr Ala Arg lie Ser Cys Pro Asn Tyr Asn 190 195 200 205 AGC CAT ATC TAC AAA GAT GGC GAC TTG GGG AAT GAC ATT GCT CAA AGA GAA 666

Ser His lie Tyr Lys Asp Gly Asp Leu Gly Asn Asp lie Ala Gin Arg Glu 210 215 220 GCT GAC AGA TTG AAC ACT CTT TCT CCA GGA TTT AAC ATT ACT GCA GAT GAT 717

Ala Asp Arg Leu Asn Thr Leu Ser Pro Gly Phe Asn lie Thr Ala Asp Asp 225 230 235 ATT CCA ACA ATT GCC CTA TAC TGT GGC TTT GAA CTA AAT GTA AGA GGT GAG 768 lie Pro Thr lie Ala Leu Tyr Cys Gly Phe Glu Leu Asn Val Arg Gly Glu : 240 245 250 255 TCA TCC TTC TGT GAC GTC TTG TCA AGA GAG GCT CTA CTG TAC ACT GCT TAT 819

Ser Ser Phe Cys Asp Val Leu Set Arg Glu Ala Leu Leu Tyr Thr Ala Tyr 260 265 270 60 104493 CTT AGA GAT TTG GGA TGG TAT TAC ΛΛΤ GTT GGA AAC GGG AAC CCA CTT GGA 870

Leu Arg Asp Leu Gly Trp Tyr Tyr Asn Val Gly Asn Gly Asn Pro Leu Gly 275 280 285 290 AAG ACA ATC GGC TAC GTC TAT GCC AAC GCC ACA AGA CAG CTG TTG GAA AAC 921

Lys Thr lie Gly Tyr Val Tyr Ala Asn Ala Thr Arg Gin Leu Leu Glu Asn 295 300 305 ACA GAA GCT GAT CCT AGA GAT TAT CCT TTG TAC TTT TCC TTT AGT CAT GAT 972

Thr Glu Ala Asp Pro Arg Asp Tyr Pro Leu Tyr Phe Ser Phe Ser His Asp 310 315 320 ACC GAT CTG CTT CAA GTA TTC ACT TCA CTC GGT CTT TTC AAC GTG ACA GAT 1023

Thr Asp Leu Leu Gin Val Phe Thr Ser Leu Gly Leu Phe Asn Val Thr Asp 325 330 335 340 CTG CCA TTA GAC CAG ATT CAA TTC CAG ACC TCT TTC AAA TCT ACC GAA ATA 1074

Leu Pro Leu Asp Gin lie Gin Phe Gin Thr Ser Phe Lys Ser Thr Glu lie 345 350 355 GTT CCC ATG GGA GCA AGA TTG CTT ACC GAG AGA TTA TTG TGT ACT GTT GAA 1125

Val Pro Met Gly Ala Arg Leu Leu Thr Glu Arg Leu Leu Cys Thr Val Glu 360 365 370 GGT GAA GAA AAA TAC TAC GTT AGA ACT ATC CTC AAC GAT GCA GTC TTC CCA 1176

Gly Glu Glu Lys Tyr Tyr Val Arg Thr lie Leu Asn Asp Ala Val Phe Pro 375 380 385 390 CTG AGT GAC TGT TCC TCT GGC CCT GGA TTC TCT TGT CCG TTG AAC GAT TAT 1227

Leu Ser Asp Cys Ser Ser Gly Pro Gly Phe Ser Cys Pro Leu Asn Asp Tyr 395 400 405 GTT TCT AGA CTT GAG GCA TTG AAC GAG GAC AGT GAC TTT GCG GAA AAC TGT 1278

Val Ser Arg Leu Glu Ala Leu Asn Glu Asp Ser Asp Phe Ala Glu Asn Cys 410 415 420 425 104493 GGA GTT CCT AAA AAT GCT TCC TAC CCA CTT GAA CTA TCA TTC TTC TGG GAT 1329 Gly Val Pro Lys Asn Ala Ser Tyr Pro Leu Glu Leu Ser Phe Phe Trp Asp 430 435 440 GAC TTG TCA TAA 1341 Asp Leu Ser 445 104493

(2) SEQ ID NO:5—SEKVENSSIIN LIITTYVÄT TIEDOT

Ci) SEKVENSSIN TUNNUSOMAISET PIIRTEET: (A) PITUUS: 187 bp (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen CD) TOPOLOGIA: lineaarinen

Cii) MOLEKYYLITYYPPI: perimän DNA

(>:i ) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO: 5 AAATGGTAAG GAATGTTTTG CATCAGATAC GAGTTCAAAA CGATTAAGAA GAGAATGCTC 60 TTTTTTTTGT TTCTATCCAA TTGGACTATT TTCGTTTATT TTAAATAGCG TACAACTTTA 120 ACTAGATGAT ATCTTCTTCT TCAAACGATA CCACTTCTCT CATACTAGGT GGAGGTTCAA 180 TGGATCC 187

Claims (15)

63 1 0 4 4 9 3

1. Eristetty DNA-kappale, tunnettu siitä, että se käsittää Pichia pastoris -hiivan happaman fosfataasin geenin, jonka nuk-leotidisekvenssinä on SEQ ID NO 1.

2. Eristetty DNA-kappale, tunnettu siitä, että se käsittää Pichia pastoris -hiivan happaman fosfataasin 5'-säätelyalueen, jonka nukleotidisekvenssinä on SEQ ID NO 2.

3. Eristetty DNA-kappale, tunnettu siitä, että se käsittää Pichia pastoris -hiivan happaman fosfataasin signaalisekvens-sin, jonka nukleotidisekvenssinä on SEQ ID NO 3.

4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen DNA-kappale, tunnettu siitä, että mainittu DNA-kappale on kytkeytynyt toimivasti vähintään invertaasia tai kudosplasminogeeniaktivaattoria (tPA) koodaavaan heterologiseen DNA-sekvenssiin.

5. Menetelmä vähintään invertaasin tai tPA:n erittämiseksi Pichia pastoris -solusta, tunnettu siitä, että tätä erittymistä ohjaa Pichia pastoris -hiivan happaman fosfataasin geenistä peräisin olevan signaalisekvenssin (SEQ ID NO 3) läsnäolo.

6. Eristetty DNA-kappale, tunnettu siitä, että se käsittää . Pichia pastoris -hiivan happaman fosfataasin rakennegeenin, jonka nukleotidisekvenssinä on SEQ ID NO 4.

7. Eristetty DNA-kappale, tunnettu siitä, että se käsittää Pichia pastoris -hiivan happaman fosfataasin 3' kopioitumisen päättäjäsekvenssin, jonka nukleotidisekvenssinä on SEQ ID NO 5.

8. Plasmidi pLP24, kuten on kuvattu esimerkissä I.

9. Plasmidi pT37, kuten on kuvattu esimerkissä IX, 2.

10. Menetelmä Pichia pastoris -hiivan happaman fosfataasin geenistä peräisin olevan happaman fosfataasin säätelyalueen akti 64 104493 voimiseksi helpottamaan vähintään yhtä polypeptidiä koodaavan heterologisen DNA-sekvenssin ilmentymistä, tunnetta siitä, että Pirhia pastoris,. joka on transformoitu heterologiseen DNA-sekvenssiin toiminnallisesti kytkeytyneellä happaman fosfataasin 5'-säätelyalueella (SEQ ID NO 2), saatetaan kosketukseen sellaisen alustan kanssa, jonka fosfaattipitoisuus saa aikaan ilmentymisen.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu heterologinen DNA sisältää lisäksi siihen toimivasti kytkeytyneen signaalisekvenssin, erityisesti Pirhia pastoris -hiivan happaman fosfataasin signaalisekvenssin (SEQ ID NO 3) .

12. Eristetty DNA-kappale, tunnettu siitä, että se käsittää pj rhia pastoria -hiivan happaman fosfataasin signaalisekvenssin (SEQ ID NO 3) kytkeytyneenä toimivasti 5'-säätelyalueeseen, erityisesti Pirhla pastoria -hiivan happaman fosfataasin 5'-säätelyalueeseen (SEQ ID NO 2) tai Pirhla pastori s -hiivan al-koholioksidaasin (A0X1) 5'-säätelyalueeseen.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen DNA-kappale, tunnettu siitä, että mainittu DNA-kappale on kytkeytynyt toimivasti heterologiseen DNA-sekvenssiin, joka koodaa vähintään invertaasia tai tPA:ta.

14. Menetelmä yhdentymisen ohjaamiseksi Pirhia pastoris PHOl-sijaintikohtaan käyttäen hyväksi yhdentävää vektoria, joka käsittää Pirhia pastoris PHOl -geeniä reunustavat 5'- ja 3'-sekvenssit .

/ 15. Menetelmä PHOl-sijaintikohtaan yhdentyneitä ilmentämisvek- toreita sisältävien Pirhia pastoria -transformanttien tunnistamiseksi, tunnettu siitä, että transformoitu Pirhia pastoria maljataan indikaattorimaljoille, joilla fosfaattipitoisuus on pieni, ja pesäkkeiden annetaan kasvaa yön yli, minkä jälkeen pesäkkeistä seulotaan väriltään valkoiset pesäkkeet. 65 1 0 4 4 9 3