CS378891A3 - Acid phosphatase gene, pichia pastoris - Google Patents

Description

Gen kyselé fosfatázy Pichia pastoris

Oblast vynálezu

Vynález se týká oblasti rekombinantní biotechnolo-gie, využívající kvasinkové hostitelské systémy a expres-ní vektory. V jednom aspektu se vynález týká nových DNAfragmentů, obsahujících část nebo celý gen kyselé fosfa-tázy kvasinky ^ichia pastoris / SSQ.id.č:1/. Jiný aspektvynálezu se týká nového vektoru, obsahujícího DNA frag-menty odvozené od genu kyselé fosfatázy Pichia pastorisSEQ.id.č: 1/. Další aspekt vyriálezu se týká hostitels-kých buněk transformovaných vektory, obsahujícími frag-menty odvozené od genu kyselé fosfatázy Pichia pastoris/SEQ id.S. 1/. V dalším aspektu se vynález týká po-užití výše popsaných DNA fragmentů k usnadnění expresea/nebo sekrece heterologních proteinů ve kvasince.

Podstata vynálezu

Jak byla rekombinantní technika v posledních letecrozvíjena, stala se možnou řízená produkce ohromnéhomnožství užitečných peptidů mikroorganismy, ^noho poly-peptidů, jako například lidský růstový hormon, leukocy-tové interferony, lidský inzulín a lidský proinsulin, by-lo už různými mikroorganismy produkováno. ud pokračováníaplikace této techniky je očekáváno umožnění produkcerůzných dalších užitečných produktů. Základní techniky užívané na poli rekombinantníDNA technologie jsou v oboru známé. Elementy nutné proprovedení rekombinantní DNA technologie zahrnují, alenejsou jimi omezeny: 1/ gen, kódující jeden nebo více polypeptidů a funkčněspojený s odpovídající kontrolní sekvencí, potřebnou pro expresi genu v hostitelském organismu, 2/ vektor, do kterého může být gen vložen, 3/ Vhodný hostitelský organismus, do kterého může být vektor, nesoucí gen transformován, 4/ jestliže je požadována sekrece heterologního protei- nu, signální sekvenci schopnou řízení heterologníhoproteinu do sekrečního procesu hostitele a tak venz buňky, 5/ transformační systém a 6/ metodu selekce transformantů.

Rekombinantní genové konstrukce mohou být označe-ny tak, že rekombinantní prochází hostitelovou sekrečnícestou a je secernován do růstového media. Sekrece jepožadovaný způsob rekombinantní exprese z několika důvodůZa prvé, některé heterologní proteiny mají toxický účinekna hostitelský organismus;. Jestliže jsou takové hetero-logní genové produkty secernovány spíše než akumuloványuvnitř hostitele, pak méně zasahují do normálních buněč-ných funkcí. Za druhé, některé proteiny, které jsouinaktivní jsou-li produkovány intracelulárně, jsou aktiv-ní, jsou-li secernovány. Za třetí, sekrece do media dovo-luje vyhnout se nezbytnému rozrušení hostitelských buněk,za účelem získání produktu. Čištění produktu je mnohemsnadnější a efektivnější, když je produkt přítomen vrůstovém mediu. A za čtvrté, jestliže je rekombinantníprodukt přítomen v živném mediu, požadovaný produkt můžebýt průběžně vyjmut a medium může být znovu použito.

Nejčastěji secernované proteiny jsou nejdřív expri-movány v buňce v prekurzorové nebo pre-proteinové for»mě, obsahující přitom připojené amino-koncové prodlouže-ní nazývané signální peptiď. Signální peptid hraje významnou úlohu v transportu připojeného polypeptidu do a/nebopřes limitující buněčné membrány. Signální peptid je pak -3- štěpen proteolyticky signální peptidázou během nebo posekreci k získání zralého proteinového produktu.

Sekrece heterologního nebo cizího proteinu můžebýt dosaženo navázáním kódující sekvence heterologníDNA na DNA kódující signální peptid. Je žádoucí izolacesignální sekvence:, kódující tento signální peptidl, cožusnadní sekreci.

Signální sekvence je zejména užitečná ve vytvářeníexpresních vektorů. Použití takových vektorů by měloumožnit transformovat kompatibilní hostitelské buňkytak, že produkují a secernují heterologní proteinovéprodukty. Příklady významných sekvencí, které jsou po-užívány k úspěšné sekreci rekombinantních proteinů z kva-sinkových hostitelů zahrnují sekvence; ze 2accharomycescerevisiae alfa mating faktor, a mating faktor, a "killer"toxinové geny. Izolace signální sekvence z methylotrof-ní kvasinky jako je Pichia pastoris nebyla popsána.

Obvykle promotor, který je použit v takových vek-torech k regulaci exprese heterologních genových produktůmůže být promotor přirozeně spojený se signální sekvencí.Zejména to může být výhodné tehdy, jestliže promotorpřirozeně spojený se signální sekvencí poskytuje vyso-kou hladinu DNA transkripce a je odpovědí na exogennístimuly prostředí. Příkladem takového promotoru je 5*-re-gulační oblast genu /Sekv.id.č.2/ kyselé fosfatázy /PHO1/Pichia pastoris, který je transkribován. ve vysoké úrovnijako odpověá na absenci fosfátu v mediu areprimován pří-tomností fosfátu v mediu.

Je často žádoucí transformovat hostitele Pichia 4- pastoris rekombinantním DNA konstruktem, který bude integ-rován do přesného místa v genomu Pichia pastoris. 5 a 3sekvence., které lemují gen PHO1 Pichia pastoris, takéznámé jako první a druhý inzertovatelný DNA fragmenty jsoupoužity v expresních vektorech k řízení integrace rekom-binantních sekvencí do PHO1 lokusu. Schopnost integro-vat rekombinantní DNA do PHO1 lokusu je výhodná nejméněze dvou důvodů: 1/ ve vývoji Pichia pastoris expresníchkmenů, majících mnhočetné kopie? stejných nebo odlišnýchexpresních kazet v PHO1 lokusu nebo v jiném lokusu Pi-chia, nebo 2/stabilní integrace- jedné nebo více expres-ních kazet pouze do PHO1 lokusu v hostitelském kmenipichia pastoris, kde rozrušení základního genu nebogenu metabolické cesty methanolu není žádoucí.

Buňky, ve kterých byl PH01 gen rozrušen, vykazujíprůvodní ztrátu aktivity enzymu kyselé fosfatázy. Pho”fenotyp, charakteristický pro rozrušení PHO1 genu, můžebýt secernován. plátováním buněk na nízkofosfátové indi-kátorové plotny a kultivací kolonií přes noc. Kolonieve kterých je PH01 gen rozrušen jsou bílé, zatímeo ko-lonie mající intaktní PH01 gen jsou zelené. Toto kolo-rimetrické prohledání poskytuje rychlou a snadnou meto-du pro detekci buněk, které mají integrované expresníkazety v lokusu PH01 a tak jej rozrušují.

Tak bude významným příspěvkem v oboru izolovánísignální sekvence, která usndní sekreci proteinů z hos-titelské buňky. Dále bude výhodné izolovat 5 regulační oblast, kterábude poskytovat vysokou hladinu DNA transkripce·, a je odpovědná na exogenní stimuly prostředí. Běžně není známa voboru žádná 5*regulační oblast, která je transkribovánave vysoké úrovni v odpověň na absenci fosfátu v mediu a -)- která může být použita ve vysoce produktivní fermentaciPichia pastoris. Dále je výhodné izolovat sstrukturální gen kyseléfosfatáz.y /&/.

Je také výhodné poskytnout nové vektory, obsahujícífragmenty genů kyselé fosfatázy. Dále je také výhodné izolovat 3* sekvenci terminacetranskripce.

Je také výhodné poskytnout integrativní vektory,které budou řízené integrovat do PH01 lokusu Pichiapastoris. Dále je výhodné poskytnout metodu identifikačepřerušení. Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout signál-ní sekvenci, která usnadní sekreci proteinů z buněk.

Je rovněž předmětem tohoto vynálezu poskytnutí 5*regulační oblasti transkribované v odpověď na absencifosfátu.

Jiným předmětem předloženého vynálezu je poskyt-nout DNA sekvenci strukturálního genu kyselé fosfatázyPichia pastoris /sekv.id.č.4/.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnutí nových vek-torů, obsahujících regulační oblast a/nebo signálnísekvenci operabilně připojenou k heterologní DNA sek-venci, která kóduje alespoň jeden polypeptid a znamená -6- indukci uvedené regulační oblasti k usnadnění expresezmíněné heterologní DNA sekvence.

Je ještě dalším předmětem předloženého vynálezuposkytnout 3*terminační sekvenci transkripce z genu ky-selé fosfatázy.

Ještě dalším předmětem vynálezu je poskytnout integ-rativní vektory, které budou řízeně integrovat do PH01 lokusu Pichia pastoris.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je poskytnoutmetodu identifikace přerušení.

Jiné aspekty, předměty a výhody předkládaného vy-nálezu budou zjevné z následujících upřesnění, příkladůa patentových nároků. V souladu s předkládaným vynálezem je zde poskyto-ván nový DNA fragment, obsahující signální sekvenci zPichia pastoris genu kyselé foafatázy /sekv.id.č.3/, kte-rá usnadňuje sekreci proteinů z buněk. V dalším aspektu tohoto vynálezu je poskytovánnový DNA fragment, obsahující regulační oblast kyselé,fosfatázy Pichia pastoris /sekv.id.č. 2/. V ještě dalším aspektu tohoto vynálezu je poskyto-ván nový DNA fragment, obsahující DNA sekvenci strukturálního genu /sekv.id.č.4/ kyselé fosfatázy /AP/ Pichiapastoris.

Ještě jiný aspekt vynálezu poskytuje nové vektory,obsahující regulační oblast a/nebo signální sekvencioperabilně připojenou k heterologní DNA sekvenci, která -7- koduje alespoň jeden pol.ypeptid a znamená indukci zmí-něné regulační oblasti pro usnadnění exprese zmíněnéheterologní DNA sekvence. V dalším aspektu vynálezu je poskytován nový DNAvektor, obsahující 3*terminační sekvenci transkripce zgenu kyselé fosfatázy Pichia pastoris /sekv.id.č.3/·

Další aspekt vynálezu poskytuje integrační vektory,které řízené integrují vektor do lokusu PH01 Pichia pas-toris.

Ještě dalším aspektem vynálezu je poskytnutí meto-dy identifikace přerušení.

Popis obrázku

Obrázek 1 poskytuje restrikční mapu genu kyseléfosfatázy /sekv.id.č. 1/ Pichia pastoris.

Podrobný.popis vynálezu Předkládaný vynález poskytuje nově izolovaný DNAfragment, obsahující gen kyselé fosfatázy,obsahující jehopromotor /nebo 5*regulační oblast/, signální, termináětorsekvence a postranní sekvence, odvozené od Pichia pas-toris .

Kyselá foafatáza / AP/ je extracelulární enzym, se-cernovaný Pichia pastoris a dalšími kvasinkami, za pod-mínek nedostatku anorganického fosfátu, Secernovaná kyse-lá fosfatáza katalyzuje získání fosfátu z organickýchsubstrátů a získává tak fosfát pro růst a přežití buněk. -8-

Gen, kódující kyselou fosfatázu, byl izolován astudován na několika druzích kvasinek a regulovatelnostgenové exprese kyselé fosfatázy byla lokalizována napromotorovy element kyselé fosfatázy. V podmínkách nízkékoncentrace anorganického fosfátu v mediu byl promotorkyselé fosfatázy /nebo 5 regulační oblasti/ nastavenna "on", gen kyselé fosfatázy byl transkribován a násled-ně translatován do enzymu kyselé fosfatázy. Nově synteti-zovaný enzym kyselé fosfatázy uvolní fosfát z organic-kých substrátů a učiní jej dostupným pro buňky. Poté sezvýší koncentrace fosfátu, modulující promotor kyseléfosfatázy a odrazí se ve snížení transkripce genu ky-selé fosfatázy, spojené se sníženou potřebou proteinukyselé fosfatázy. Tak může být promotor kyselé fosfatázyindukován nebo reprimován nízkou nebo vysokou koncentra-cí fosfátu. Identifikace a izolace promotoru kyseléfosfatázy Pichia pastoris je významná. Protože se lišíregulace, exprese kyselé fosfatázy mezi kvasinkovými dru-hy, pro které byla tato exprese analyzována očekává se,že přesná regulace sledovaná pro expresi kyselé fosfatázyv Pichia pastoris, závisí na dostupnosti a použití homo-logních promotorových sekvencí.

Identifikace a izolace genové signální sekvence/sekv.id.č. 3/ je významná tím, že reprezentuje signálnísekvenci izolovanou z methylotrofnich kvasinek a navícje první signální sekvencí izolovanou z genu Pichiapastoris. Bylo zjištěno, že je ekvivalentní nebo nadřaze-nou k nativním genovým signálním sekvencím, tj. signál-ní sekvence z tPA /tkáňový plasminogenní aktivátor/ neboinvertázovým genům, v řízení sekrece heterologních pro-teinů z Pichia pastoris, tj. tPA nebo invertázy.

Je často žádoucí integrovat rekombinantní expresnívektory do hostitelského genomu místo jejich udržováníjako autonomních replikačních elementů. Integrované -9- vektory jsou výrazně stabilnější než autonomní vektorya jsou preferovány pro provedení tohoto vynálezu. Přes-něji, lineární místně-specifické integrační vektory jsoupopsány v US patentu č. 4882279, který je zde pro úplnostcitován jako odkaz, jsou preferovány. Takové vektory ob-sahují sériově uspořádané sekvence alespoň 1/ prvníhoinzertovatelného DNA fragmentu, 2/ selertovatelného mar-kerového genu, 3/ druhého inzertovatelného DNA fragmentu.

První a druhý inzertovatelný DNA fragment mají každýnejméně 200 nukleotidů v řetězci, a mají nukleotidovésekvence, které jsou homologní k částem genomové DNAdruhů, které jsou transformovány. Různé komponenty integ-račních vektorů jsou sériově uspořádány a vytvářejí li-neární fragment DNA tak, že expresní kazeta a selekto-vatelný markerový gen jsou umístěny mezi 3'koncem prv-ního inzertovatelného DNA fragmentu a 5*koncem druhéhoinzertovatelného DNA fragmentu. První a druhý inzerto-vatelný fragment jsou vzájemně orientovány v sériově uspo·řádaném lineárním fragmentu s ohledem na to, jak jsouorientovány v rodičovském genomu.

Nukleotidové sekvence použité v prvním a druhéminzertovatelném fragmentu, jsou nukleotidové sekvence,které jsou homologní se separovanými částmi přirozenýchgenomových míst, ve kterých je genomová modifikace prove-dena. Tak například, jestliže je genomová modifikace pro-vedena v lokusu genu kyselé foafatázy, první a druhý in-zertovatelný DNA fragment zde použitý, musí být sekvencehomologní k odděleným částem lokusu genu kyselé fosfatázyPro provedení genové modifikace musí dva inzertovatelnéDNA fragmenty být navzájem orietnovány v lineárním frag-mentu ve stejné vzájemné orientaci, v jaké existují v ro-dičovském genomu. Příklady nukleotidových sekvencí, kterémohou být užity jako první a druhý inzertovatelný DNA -10- fraginent jsou nukleotidové sekvence vybrané ze skupiny,zahrnující gen kyselé fosfatázy PH01 , gen alkoholovéoxidázy ADX1 , gen histidinivé dehydrogenázy?aS|en dih.ydro-xyacetonové syntetázy DHA3.

První inzertovatelný DNA fragment může obsahovatoperabilní regulační oblast, která může zahrnovat re-gulační oblast užitou v expresní kazetě. Užití prvníhoinzertovatelného DNA fragmentu jako regulační oblasti proexpresní kazetu je preferovaným provedením tohoto vyná-lezu.Výhodně mohou být inzerční místo nebo místa a 3koncová sekvence umístěny přímo 3 k prvnímu inzertova-telnému DNA fragmentu, ^ato konformace lineárních místně-specifických integračních vektorů má navíc výhodu poskyt-nutí správného místa pro inzerci strukturálního genu beznutnosti přidávání kompatibilní 3* koncové sekvence.

Je také nezbytné, aby byl obsažen alespoň jedenselektovatelný markerový gen v DNA užité ke transformacihostitelské buňky. Toto usnadní selekci a izolaci těchotganismů, které inkorporovaly transformující DNA. Mar-kerový gen uděluje fenotypový rys transformovaným orga-nismům, který hostitelé neměli,tj. obnovuje schopnostprodukovat specifické aminokyseliny tam, kde netransfor-movaný hostitel má defekt v biosyntetické cestě speci-fické aminokyseliny nebo rezistenci na antibiotika a po-dobně. Příkladné selektovatelné markerové geny mohoubýt vybrány ze skupiny sestávající se z HIS4 genu aARG4 genu z Pichia pastoris a Saccharomyces cerevisiae,invertázový gen /SUC2/ze Saccharomyces cerevisiae aG418R gen rezistence na kanam.ycin z E.coli transponova-telných elementů Tn601 nebo Tn903·

Jestliže první inzertovatelný fragment neobsahujeregulační oblast, je nutné vhodnou regulační oblast navázatfunkční vazbou na strukturální gen, aby vznikla funkční -1 1- expresní kazeta. Obdobně, jestliže 3* koncová sekvence jeposkytnuta v inzerčním místě ke kompletování expresníkazety, 3 koncová sekvence musí být operabilně připoje-na ke strukturálnímu genu pro inzerci.

Je důležité, že integrace, vyskytující se v genomunezpůsobují deleční efekt na hostitelské buňce. Je přek-vapujícím objevem, že integrace rekombinantních expresníchkonstruktů do genového lokusu /PH01/ kyselé fosfatáza zPichia pastoris nebyla deleční pro hostitele /Pichia/ avedla ke stabilní integraci rekombinantních sekvencí.Šizená integrace do PHO1 lokusu je spojena s užitím 5*a 3*sekvencí, které jsou po stranách PHO1 genu Pichiapastoris / a které jsou také ve vztahu k prvnímu a druhémuinzertovatelnému DNA fragmentu/, v rekombinantních expres-ních vektorech.

Dalším objevem byla metoda pro screening transformo-vyných buněk k identifikaci těch, které integrovaly sek-venci expresního vektoru porušením PHO1 lokusu. Buňky, vekterých byl porušen PHO1 gen, vykazují průvodní sníženíenzymatické aktivity kyselé fosfatázy. Pho” fenotyp, indi-kující PH01 porušení, může být screenován plátováním bu-něk na nízkofosfátových indikátorových plotnách a kul-tivací buněk přes noc. Kolonie, ve kterých byl PHO1 gen porušen jsou bílé, zatímco kolonie, mající intaktní PH01gen jsou zelené. Kolorimetrický screening poskytuje rych-lou a snadnou metodu pro detekci buněk, které integrovalyexpresní kazetu správně v PH01 lokusu. částečná restrikční mapa genu kyselé fosfatázy/sekv.id.č.1/ Pichia pastoris je zobrazena na obr.1.

Tento gen je dále charakterizován nukleotidovou sekvencí,kterou poskytuje tabulka 1. -1 2- Předkládaný vynález také poskytuje nové DNA frag-menty, obsahující 5zregulační oblast kyselé fosfatázyPíchla pastoris /sekv.č. 2/, signální sekvenci /sekv.č.3/, strukturální gen /sekv.id.č.4/ a 3*koncovou sekvencitranskripce /sekv.id.č.5/. Následující tabulky popisují sekvence genu kyseléfosfatázy /sekv.id.č. 1/ Pichia pastoris a jeho fragmenty -i 3-

Tabulka 1

Gen kyselé fosfatáz.ysekv. i <3. č. 1

BamHI -390-· ------ -370 ------ -350 -

GGATCCCTATTGTTACTTTTGCTTAACATTCCAATATTCTTCAACGGTTAATTGATTAAC -330 -310 -290

ACTGTAAGCTCTGCCCATGTGCTTCATCCAAATCTGGTAATCTGCTTICTATITCTGCCA -270 -250 — -230

AAATAGTTAATCTATGAGACATGTGCCGTGAATTGCGGAGTAGATCGAGTGGAAGTCTTG -210 -190 - -170

TTTGCGTAACACTCAAAGTATATCCCTGTTAGTCTTTATTCACCTGTTGCTGCATTGGTG -150 -130 - -110

TCAGTTACCATTATTGTTTCCACTTGGAAAAGCTTGTTTTTTTTTGATAGCACAGAAACG -90 -70 -50

TGGGCTCCGATAAGCTAAACTTCAACGAGAATATAAAAGCTGAAAAGATTCTTGTCAAGA -30 -10 10

ACTTGTACAACGACCAATAAGTCTTTCAAGGCATCAGACATGTTTTCTCCTATTCTAAGT

MetPheSerProlleLeuSer -14- 30 50 70 CTGGAAATTATTCTCGCTTTGGCTACTCTCCAATCAGTCTTTGCGGTTGAGTTGCAGCACLeuGlul lei leLeuAlaLeuAlaThrLeuGlnSerValPheAlaValGluLeuGlnHis 90 110 Bell 130 GTTCTTGGAGTCAACGACAGACCCTATCCTCAGAGGACAGATGATCAGTACAACATTCTGValLeuGlyValAsnAspArgProTyrProGlnArgThrAspAspGlnTyrAsnlleLeu 150 170 190 AGACATCTGGGAGGCTTGGGCCCCTACATCGGTTACAATGGATGGGGAATTGCTGCTGAGArgHisLeuGlyGlyLeuGlyPRoTyrlleGlyTyrAsnGlyTrpGlylleAlaAlaGlu 210 230 250 TCTGAAATTGAATCCTGTACGATTGATCAGGCTCATCTGTTGATGAGACATGGAGAAAGASerGlulleGluSerCysThrlleAspGlnAlaHisLeuLeuMetArgHisGlyGluArg 270 - · 290 ' · 310 TACCCAAGTACCAATGTGGGGAAACAACTAGAAGCTTTGTACCAGAAACTACTAGATGCT - -Ty rProSerThrAsnVa 1G lyLysG lnLeuG luA laLeuTyrG lnLysLeuLeuAspA la 330 _ 350 370 2 . GATGTGGAAGTCCCTACAGGACCATTGTCTTTCTTTCAAGACTATGATTACTTCGTCTCTAspValGluValProThrGlyProLeuSerPhePheGlnAspTyrAspTyrPheValSer 390 410 430 GACGCCGCTTGGTACGAGCAAGAAACAACTAAGGGTITCTACTCGGGGTTAAACACCGCT ~. —AspAlaAlaTrpTyrGluGlnGluThrThrLysGlyPheTyrSěrGlyLěuAsnThrAla T- ' Ξ 450 470 490 TTCGATTTTGGTACCACTTTGAGAGAACGATATGAACATTTGATAAACAATAGCGAAGAAPheAspPheGlyThrThrLeuArgGluArgTyrGluHlsLeulleAsnAsnSerGluGlu - . 510 530 550 GGAAAGAAACTTTCTGTTTGGGCTGGCTCTCAAGAAAGAGTTGTTGACAACGCAAAGTACGlyLysLysLeuSerValTrpAlaGlySerGlnGluArgValValAspAsnAlaLysTyr 570 590 610 TTTGCTCAAGGATTTATGAAATCTAACTACACCGTTATGGTCGAAGTCGTTGCTCTAGAAPheAlaGlnGlyPheMetLysSerAsnTyrThrValMetValGluValValAlaLeuGlu - 630 650 670 GAGGAGAAATCCCAGGGACTCAACTCTCTAACGGCTCGAATTTCATGTCCAAACTATAACGluGluLysSerGlnGlyLeuAsnSerLeuThrAlaArglleSerCysProAsnTyrAsn 690 710 730 AGCCATATCTACAAAGATGGCGACTTGGGGAATGACATTGCTCAAAGAGAAGCTGACAGASerHlslleTyrLysAspGlyAspLeuGlyAsnAsplleAlaGinArgGluAlaAspArg 750 770 790 TTGAACACTCTTTCTCCAGGATTTAACATTACTGCAGATGATATTCCAACAATTGCCCTALeuAsnThrLeuSerProGlyPheAsnlleThrAlaAspAsplleProThrlleAlaLeu -15- 810 830 850 TACTGTGGCTTTGAACTAAATGTAAGAGGTGAGTCATCCTTCTGTGACGTCTTGTCAAGATyrCysGlyPheGluLeuAsnValArgGlyGluSerSerPheCysAspValLeuSerArg 870 890 910 GAGGCTCTACTGTACACTGCTTATCTTAGAGATTTGGGATGGTATTACAATGTTGGAAACGluAlaLeuLeuTyrThrAlaTyrLeuArgAspLeuGlyTrpTyrTyrAsnValGlyAsn 930 950 970 GGGAACCCACTTGGAAAGACAATCGGCTACGTCTATGCCAACGCCACAAGACAGCTGTTGGlyAsnProLeuGlyLys Thr11eGlyTyrValTyrAlaAsnAlaThrArgGinLeuLeu 990 1010 1030 GAAAACACAGAAGCTGATCCTAGAGATTATCCTTTGTACTTTTCCTTTAGTCATGATACCGluAsnThrGluAlaAspProArgAspTyrProLeuTyrPheSerPheSerHisAspThr 1050 1070 1090 GATCTGCTTCAAGTATTCACTTCACTCGGTCTTTTCAACGTGACAGATCTGCCATTAGAC - -

AspLeuLeuGinValPheThrSerLeuGlyLeuPheAsnValThrAspLeuProLeuAsp 1110 1130 Ncol CAGATTCAATTCCAGACCTCTTTCAAATCTACCGAAATAGTTCCCATGGGAGCAAGATTGGinlleGinPheGinThrSerPheLysSerThrGlulleValProMetGlyAlaArgLeu - 1170 1190 1210 CTTACCGAGAGATTATTGTGTACTGTTGAAGGTGAAGAAAAATACTACGTTAGAACTATG... 'LeuThrGluArgLeuLeuCysThrValGluGlyGluGluLysTyrTyrValArgThrlle — - 1230 1250 1270 CTCAACGATGCAGTCTTCCCACTGAGTGACTGTTCCTCTGGCCCTGGATTCTCTTGTCCGLeuAsnAspAlaValPheProLeuSerAspCysSerSerGlyProGlyPheSerCysPro 1290 1310 1330 TTGAACGATTATGTTTCTAGACTTGAGGCATTGAACGAGGACAGTGACTTTGCGGAAAACLeuAsnAspTyrValSerArgLeuGluAlaLeuAsnGluAspSerAspPheAlaGluAsn 1350 1370 1390 TGTGGAGTTCCTAAAAATGCTTCCTACCCACTTGAACTATCATTCTTCTGGGATGACTTGCysGlyValProLysAsnAlaSerTyrProLeuGluLeuSerPhePheTrpAspAspLeu 1410 1430 1450 TCATAAAAATGGTAAGGAATGTTTTGCATCAGATACGAGTTCAAAACGATTAAGAAGAGASerEnd 1470 1490 1510

ATGCTCTTTTTTTTGTTTCTATCCAATTGGACTATTTTCGTTTATTTTAAATAGCGTACA 1530 1550 1570

ACTTTAACTAGATGATATCTTCTTCTTCAAACGATACCACTTCTCTCATACTAGGTGGAG

BatnHI

GTTCAATGGATCC

Tabulka 2 5'regulační oblast sek.iá.č.2

BamHI -390 -370 -350

GGATCCCTATTGTTACTTTTGCTTAACATTCCAATATTCTTCAACGGTTAATTGATTAAC -330 -310 -290

ACTGTAACCTCTGCCCATGTGCTTCATCCAAATCTGGTAATCTGCTTTCTATTTCTGCCA -270 -250 -230

AAATAGTTAATCTATGAGACATGTGCCCTCAATTGCGCAGTAGATCGAGTGGAAGTCTTC -210 -190 -170

TTTGCGTAACACTCAAAGTATATCCCTGTTAGTCTTTATTCACCTGTTGCTGCATTGGTG -150 -130 -110

TCAGTTACCATTATTGTTTCCACTTGGAAAAGCTTGTTTTTTTTTGATAGCACAGAAACG . -90 -70 -50

TGGGCTCCGATAAGCTAAACTTCAACGAGAATATAAAAGCTGAAAAGATTCTTGTCAAGA -30 -10

ACTTGTACAACGACCAATAAGTCTTTCAAGGCATCAGAC

Tabulka 3Signální sekvencesekv.id.č., 3 PH01 signální sek- lo ATGTTTTCTCCTATTCTAAGT--> MetPheSerProlleLeuSer vence

CTGGAAATTATTCTCGCTTTGGCTACTCTCCAATCAGTCTTTGCG

LeuGlullelleLeuAlaLeuAlaThrLeuGlnSerValPheAla 30 50 -1 7-

Tsbulka 4

Strukturální gen -·- kyselé fosfatázy sekv.id.č. 4 _· - 70 GTTGAGTTGCAGCACVa1GluLeuGInHis 90 110 Bell 130 GTTCTTGGAGTCAACGACAGACCCTATCCTCAGAGGACAGATGATCAGTACAACATTCTGVaILeuGlyVa1AsnAspArgProTyrProGlnArgThrAspAspGInTyrAsn11eLeu 150 170 190 AGACATCTGGGAGGCTTGGGCCCCTACATCGGTTACAATGGATGGGGAATTGCTGCTGAG'ArgHisLeuGlyGlyLeuGlýPRoTyrlleGlyTýrAsnGlyTrpGlylleAlaAlaGlu =' 210 230 250 TCTGAAATTGAATCCTGTACGATTGATCAGGCTCATCTGTTGATGAGACATGGAGAAAGA —SerGlulleGluSerCysThrlleAspGlnAlaHísLeuLeuMetArgHisGlyGluArg — 270 290 310 TACCCAAGTACCAATGTGGGGAAACAACTAGAAGCTTTGTACCAGAAACTACTAGATGCTTyrProSerThrAsnValGlyLysGlnLeuGluAlaLeuTyrGlnLysLeúLéuAspAla 330 - 350 — 370 GATGTGGAAGTCCCTACAGGACCATTGTCTTTCTTTCAAGACTATGATTACTTCGTGTC-T-=^—‘AspValGluValProThrGlyProLeuSerPhePheGlnAspTyrAspTyrPheValSer 390 — 410 - __ 430 GACGCCGCTTGGTACGAGCAAGAAACAACTAAGGGTTTCTACTCGGGGTTAAACACCGCT ______

AspAlaAlaTrpTyrGluGlnGluThrThrLysGlyPlieTyrSerGlyLeuAsnThrAla _. 450 470 490 TTCGATTTTGGTACCACTTTGAGAGAACGATATGAACATTTGATAAACAATAGCGAAGAAPheAspPheGlyThrThrLeuArgGluArgTyrGluHlsLeulleAsnAsnSerGluGlu 510 530 550 GGAAAGAAACTTTGTGTTTGGGCTGGCTCTCAAGAAAGAGTTGTTGACAACGCAAAGTACGlyLysLysLeuSerValTrpAlaGlySerGlnGluArgValValAspAsnAlaLysTyr 570 590 610 TTTGCTCAAGGATTTATGAAATCTAACTACACCGTTATGGTCGAAGTCGTTGCTCTAGAAPheAlaGlnGlyPheMetLysSerAsnTyrThrValMetValGluValValAlaLeuGlu 630 650 670 GAGGAGAAATCCCAGGGACTCAACTCTCTAACGGCTCGAATTTCATGTCCAAACTATAACGluGluLysSerGlnGlyLeuAsnSerLeuThrAlaArglleSerCysProAsnTyrAsn 690 710 730 AGCCATATCTACAAAGATGGCGACTTGGGGAATGACATTGCTCAAAGAGAAGCTGACAGASerHlslleTyrLysAspGlyAspLeuGlyAsnAsplleAlaGinArgGluAlaAspArg -18- 750 770 790 TTGAACACTCTTTCTCCAGGATTTAACATTACTGCAGATGATATTCCAACAATTGCCCTALeuAsnThrLeuSerProGlyPheAsnlleThrAlaAspAsplleProThrlleAlaLeu 810 830 850 TACTGTGGCTTTGAACTAAATGTAAGAGGTGAGTCATCCTTCTGTGACGTCTTGTCAAGATyrCysGlyPheGluLeuAsnValArgGlyGluSerSerPheCysAspValLeuSerArg 870 890 910 GAGGCTCTACTGTACACTGCTTATCTTAGAGATTTGGGATGGTATTACAATGTTGGAAACGluAlaLeuLeuTyrThrAlaTyrLeuArgAspLeuGlyTrpTyrTyrAsnValGlyAsn 930 950 970 GGGAACCCACTTGGAAAGACAATCGGCTACGTCTATGCCAACGCCACAAGACAGCTGTTGGlyAsnProLeuGlyLysThrlleGlyTyrValTyrAlaAsnAlaThrArgGinLeuLeu 990 1010 _ 1030 GAAAACACAGAAGCTGATCCTAGAGATTATCCTTTGTACTTTTCCTTTAGTCATGATACCGluAsnThrGluAlaAspProArgAspTyrEroLeuTyrPheSerPheSerHisAspThr—......- 1050 1070 -- 1090 GATCTGCTTCAAGTATTCACTTCACTCGGTCTTTTCAACGTGACAGATCTGCCATTAGACAspLeuLeuGinValPheThrSerLeuGlyLeuPheAsnValThrAspLeuProLeuAsp - - 1110 Z 1130 Ncol ...... CAGATTCAATTCCAGACCTCTTTCAAATCTACCGAAATAGTTCCCATGGGAGCAAGATTG -GinlleGiiiPheGinThrSěřPKěLýsSeřThrGlulTěVálPřoMětGIyAlaArgLeu ------ 1170 1190 1210 CTTACCGAGAGATTATTGTGTACTGTTGAAGGTGAAGAAAAATACTACGTTAGAACTATCLeuThrGluArgLeuLeuCysThrValGluGlyGluGluLysTyrTyrValArgThrlle . . . 1230 1250 1270 CTCAACGATGCAGTCTTCCCACTGAGTGACTGTTCCTCTGGCCCTGGATTCTCTTGTCCGLeuAsnAspAlaValPheProLeuSerAspCysSerSerGlyProGlyPheSerCysPro 1290 1310 1330 TTGAACGATTATGTTTCTAGACTTGAGGCATTGAACGAGGACAGTGACTTTGCGGAAAAC "LeuAsnAspTyrValSerArgLeuGluAlaLeuAsnGluAspSerAspPheAlaGluAsn 1350 1370 1390 TGTGGAGTTCCTAAAAATGCTTCCTACCCACTTGÁACTATCATTCTTCTGGGATGACTTGCysGlyValProLysAsnAlaSerTyrProLeuGluLeuSerPhePheTrpAspAspLeu

TCATAA

SerEnd -15-

Tabulka 5 5*transkripční terminační sekvences ekv.id. č . 5 1410 1430 1450

AAATGGTAAGGAATGTTTTGCATCAGATACGAGTTCAAAACGATTAAGAAGAGA 1470 1490 1510

ATGCTCTTTTTTTTGTTTCTATCCAATTGGACTATTTTCGTTTATTTTAAATAGCGTACA 1530 1550 1570

ACTTTAACTAGATGATATCTTCTTCTTCAAACGATACCACTTCTCTCATACTAGGTGGAG

BamHI

GTTCAATGGATCC -20-

Gen kyselé fosfatázy je získán z kultur Pichia pas-toris jako je Pichia pastoris NRRL Y—11430 metodami, kte-ré jsou uvedeny v následujících příkladech. Obecná me-toda pro získání genu kyselé fosfatázy Pichia pastoris/sekv.id.č. 1/ se sestává z užití proby kyselé fosfatázyjako je nízkofosfátová proba, popsané v následujícíchpříkladech, ke screeningu knihovny DNA Pichia pastoris®Jiné proby mohou být vybrány nebo syntetizovány na zákla-dě sekvencí popsaných v tabulce 1. Hybridizaca prob můžebýt provedeny jakýmkoliv vhodným postupem známý v oboru,•knihovny Pichia pastoris mohou být připraveny technika-mi v oboru známými, které zahrnují, ale nejsou tak omeze-ny, metody popsané Creggem a spol./1985/,Mol.Cell.Bio.5,3376-3385.

Alternativně, 5* regulační oblast kyselé fosfatázy/sekv.id.č.2/, signální sekvence /sekv.id.č.3/, truktu-rální gen /sekv.id.č. 4/ a 3*regulační oblast /sekv.ifl.č. 5/ mohou být získány syntézou vhodných sekvencí jakdefinuji tabulky 1 až 5, užitím známých enzymatickýchnebo chemických prostředků. Vhodné prostředky zahrnují,ale nejsou tím omezeny, chemické procesy založené nachemii fosfotriesteru, fosfitu nebo kyanoethylfosfořami-ditu.

Odborníci také vědí, že izolaci 5*regulační oblasti/sekv.id.č.2/,signální sekvence /sekv.id.č.3/» strukturál-ního genu/Sekv.id.č.4/ a 3*koncové sekvence transkripce/sekv.id.č.5/ předkládaného vynálezu ve srovnání s následněizolovanými 5*regulační oblastí kyselé fosfatázy Pichiapastoris, signální sekvencí, strukturálním genem a 3*transkripční koncovou sekvencí, může obsahovat de minimismnožství nukleotidů, příslušejících ke klonálním variacímnebo sekvenčním chybám, které se mohou vyskytnout· -21-

Modifikací 5* regulační oblasti kyselé fosfatázy Pi-chia pastoris /sek.id.č.2/, signální sekvence /sekv.id.č.3/, strukturálního genu /sekv.id.č.4/ a 3* transkripčníterminační sekvence /sekv.id.č.5/ může být také prove-dena a to jak přidáním linkeru DNA nebo provedením muta-geneze /například Ml3 mutageneze/ k poskytnutí nebonahrazení restrikčních míst a podobně.

Když gen kyselé fosfatázy Pichia pastoris je získán,může být udržen neb® replikován v eukaryotických neboprokuryotických plasmidových hostitelských systémech jakoje pBR322, udržovaný v E.coli, či jakýkoliv jiný vhodnýsystém známý v oboru.

Odborníci budou také vědět, že množství dalších DNAsekvencí může být také inkorporováno do využívaného vek-toru, jako je; bakteriální plasmidová DNA, různé marke-rové geny, bakteriofágová DNA, autonomní replikační sek-vence a centrometrická DNA, aby byly jmenovány pouzeněkteré reprezentativní příklady. 5*regulační oblast kyselé foafatázy /sekv.id.č.2/ jeobsažena uvnitř DNA fragmentu, rozkládajícího se od nuk-leotidu -399 do asi nukleotidu 0, jak ukazuje obr.1 atabulka 2. Tento fragmeat je schopen ovlivnění transkrip-ce DNA do RNA, jestliže je operabilně připojen a umístěnna 5* konec heterologní DNA sekvence, kódující alespoňjeden polypeptid. K Využití 5*regulační oblasti /sekv.id.č.2/ kyseléfosfatázy zde popsané, fragment popsaný na obr.1 a tabul-ka 2,může\být operativně připojen k heterologním DNAsekvencím, kódujícím alespoň jeden polypetid. Pro tentopopis jsou kombinovány DNA sekvence, které se přirozeněnevyskytují v hostiteli nebo ve spojení s uvedeným regu-lačním regionem a označují se jako heterologní DNA sekvence -22-

Vhodné heterologní DNA sekvence, kódující alespoň jedenpolypeptid, které mohou být operabilně spojeny s 5* re-gulační oblasté /sekv.id.č.2/ kyselé fosfatázy zahrnují,ale nejsou jimy omezeny, tkáňový plasminogenový aktivá-tor, lidský sérový albumin a invertázu. Heterologní DNAsekvence užité v tomto vynálezu by měly obsahovat 5*ATGstart kodon, 3*stop kodon a navíc mohou obsahovat nukleo-tidové sekvence,jejichž funkcí je stabilizovat mRNAnebo řídit polyadenylaci.

Kombinace 5*regulační oblasti kyselé fosfatázy /sekv.id.S.2/ funkčně navázané k heterologní DNA sekvenci můžebýt inzertována do vhodného vektoru. Množství kombinacívektor-hostitel je možné a v oboru známé. Další sekvencejako markerové geny či jiné sekvence, které činí vektorschopným růstové amplifikace a rychlé propagace v bakte-rii či kvasince, mohou také být přítomny.

Vhodné hostitelské buňky, které mohou být transfor-movány vektorem, obsahujícím 5*regulační oblast kyseléfosfatázy, zahrnují kvasinky z rodu Saccharomyces, Pi-chia a Hansenula, výhodněji Pichia a nejvýhodněji Pichiapastoris.

Transformace vhodných hostitelských buněk vektorem,obsahujícím 5* regulační oblast /sekv.id.č.2/ kyseléfosfatázy, může být provedena jakoukoliv vhodnou trans-formační technikou známou v oboru. jíregulační oblast /sekv.id.č.2/ kyselé fosfatázyje kontrolována koncentrací fosfátu v mediu. Přesněji, tatoregulační oblast je dereprimována nízkou koncentracífosfátu. Proto je 5*regulační oblast regulována změnou kon-centrace fosfátu přítomného v mediu. -23-

Signální sekvence /sekv.id.S. 3/ kyselé fosfatázyje obsažena uvnitř DNA fragmentu, rozprostírajícího seod nukleotidu 1 do asi nukleotidu 66, jak ukazuje obr.1a tabulka 3· využití signální sekvence /sekv.id.S.3/kyselé fosfatázy zde popsané, může fragment popsaný naobr.1 a v tabulce 3 být operabilně navázán na heterologníDNA sekvence kódující alespoň jeden polypeptid. Vhodnéheterologní DNA sekvence zahrnují, ale nejsou jimi ome-zeny, DNA sekvence, selektované ze skupiny zahrnující v tkáňový plasminogenní aktivátor, lidský sérový albumin ainvertázu.

Kombinace signální sekvence /sekv.id.S. 3/ kyseléfosfatázy operabilně připojené na heterologní DNA sekven-ce mohou pak být připojeny ke vhodnému promotoru. Obvykle,promotor, který je použit, může být promotor spojený sleadeir sekvencí. ALternativně, je možno nahradit přiro-zeně se vyskytující PHO1 promotor jinými heterolognímipromotory, které dovolí regulaci transkripce. Příkla-dem vhodného heterologního promotoru by mohlbýt promo-tor promotor alkoholové oxidázy /AOX1/ Pichia pastoris/nebo 5*regulační oblast/ popsaný v US patentu S. 4808537¼

Vhodné vektory, do kterých mohou být inzertovány ty-to DNA fragmenty, obsa ující signální sekvenci /sekv.id·č.3/ kyselé fosfatázy mohou být získány, jak je popsánovýše. Dále, vhodné hostitelské buňky, které mohou býttransformovány odpovídajícím vektorem, obsahující, DNAfragment, kódující signální sekvenci, zahrnují kvasinkyz rodu Saccharomyces, Hansenula a Pichia, kde preferovánje rod Pichia. transformace těchto hostitelských buněkmůže být provedena jakýmikoliv vhodnými prostředky zná- -24- mými v oboru. Signální sekvence, která je operabilně navá- zána na protein, který je produkován jedním z těchto systémů vektor/hostitel, může řídit sekreci uvedeného proteinu z hostitelské buňky.

Strukturální gen /sekv.id.S.4/ kyselé fosfatázy jeobsažen uvnitř DNA fragmentu, rozprostírajícího se od nuk-leotidu 67 do nukleotidu 1407 jak ukazuje obr. 1 a ta-bulka 4. Strukturální gen /sekv.id.č. 4/ kyselé foafatázymůže být využit v rekombinantní biotechnolmgiii prorůzné účely, zahrnující, ale neomezující se na: a/ DNAkonstrukty pro provádění disruptivní homologní rekom-binaci /procesy pro inzerci hefcerologních DNA sekvencído genomu Pichia pastoři® v lokusu kyselé fosfatázy atak narušení aktivity genu kyselé foafatázy a b/ pro-dukci proteinu kyselé fosfatázy pro použití v různýchbiostudiích. 3* transkripci končící sekvence kyselé fosfatázy/sekv.id.č.5/ ukončuje transkripci mRNA nebo stabilizujemRNA, je-li operabilně navázána na 3*konec DNA sekvence,která kóduje proc.ukci polypeptidu. Tato 3*transkripciterminující sekvence /sekv.id.č.5/ je obsažena uvnitřDNA fragmentu, rozprostírajícího se od nukleotidu 1408 doasi nukleotidu 1594, je uvedena na obr.1 a tabulce 5. 3*transkripci terminující sekvence /sekv.ic.č.5/ kyseléfosfatázy může být operabilně navázána k heterologní DNAsekvenci, kódující polypeptid a použita k ukončení trans-kripce, nebo ke stabilizaci mRNA v kvasinkách jako jsoukvasinky rodu Saccharomyces, Hansenula a Pichia, alezejména jewelmi vhodná pro použití v Pichia pastoris. Následující příklady slouží k ilustraci předloženéhovynálezu a nijak jej v žádném smyslu neomezují. -25- Příklady provedení vynálezu V příkladech byly použity následující kmeny:

Pichia

Pichia

Pichia

Pichia

Pichia

Pichia

Pichia

Pichia

Pichia

Pichia

Pichia

Pichia E«coli /buňky pastoris KM71 /AOX1, his4/ pastoris GS115 /his4/ NRRL X-15851pastoris G3190 /arg4/ NRRL Y-18014pastoris GS247 /Ale-/ pastoris KM71:GS102 /Mut”/ pastoris GS115:GS102 /Mui+/ pastoris MD100-20 /his4, Ale”/ pastoris MB102-26 /pho“.his4, ade”/pastoris MB102.28pastoris MB102-51pastoris KM71:pPSU215 /Mut”/pastoris GS115:pPSU216 /Mut+/ JM103 delta /lac pro/ thi rps1

/strA/ supE end A sbcB hsdR melanom tPA exprimující buněčné linie AFCCč lidského melanomu/ CRL9607

Media, pufry a roztoky

Media, pufry a roztoky používané v následujícíchpříkladech mají složení, které je uvedeno dále: LP media /nízkofosfátová/ biotin 2 /Ug/1 panthathenát vápenatý 400 /Ug/1 kyselina listová &amp; /Ug/1 kyselina nikotinová 400 /Ug/1 kyselina p-aminobenzoová 2 /Ug/1 hydrochlorid pyridoxinu 400 /ug/1 riboflavin 200 /ug/1 thiamin-HC1 400 /Ug/1 -26-

kyselina boritá 500 /Ug/1 síran měčínatý 40 /Ug/1 jodid draselný 100 /Ug/1 chlorid železitý 200 /ug/l síran manganatý 400 yUg/1 síran zinečnatý 400 /Ug/1 inositol 2 mg/1 molybdenát sodný 200 /Ug/1 síran amonný 6 g/1 jednosytný fosforečnan draselný 30 mg/1 chlorid draselný 1,5 g/1 chlorid sodný 1 ,7 mM chlorid vápenatý 0,68 mM síran; horečnatý 4,2 mM TE pufr Tris-HCl, pH 8,0 10 mM EDTA 1 mM S3PE /1X/ NaCl 1 80 mM Naý?O4, pH 7,7 1 0 mM EDTA 1 mM SEC /1X/ NaCl 150 mM Na citrát 15 mM

Denhardtův roztok /1X/ficoll polyvinylpyrrolidonhovězí sérový albumin 200 mg/1200 mg/1200 mg/1 -27-

RES

LiCl

Tris-HCl, pH 7,EDTA

PCI fenol chlorof ormi s o amylalkohol

Cl chloroformisoamylalkohol LP indikátorové1 litr

100 mlvl1 0 0 mM0,1 mM 500 ml/1480 ml/1 20 ml/1 SCE pufr YNB media 960 ml/140 ml/1 plotny, 1X LP media 22,5 mM kyselina citrónovápH 4,8 20 g dextroza 60 mg 5-brom,4-chlor, 3-indolylfosfát /Sigma/ 25 g Noble agar /Difco/ 9,1 g sorbitol1,47 g citrát sodný0,168 g EDTApH na 5,8 pomocí HC1 v 50 ml dH20 a autokláv 6,75 g kvasnicové dusí-katé báze bez aminokyse-lin /DIFCO/ v 1 1 vody -28- Příklad 1

Konstrukce pLP24 S cílem izolovat a charakterizovat gen kyselé fos-fatázy z Pichia pastoři /sekv.id.č. 1 / byly provedenynásledující experimenty.. Pichia pastoris GS115 /NRRL Y-15851/ byl kultivován jak v prostředí bohatém na fosfát/HP/ /složeném z kvasnicové dusíkaté báze. minus amino-kyseliny /DIFCO/, 2 % dextrozy a 20 mg/1 histidinu/ av prostředí s nízkým obsahem fosfátu /LP/ /složenémz LP media, 2 % dextrozy a 20 mg/1 histidinu/, vždy ve300 ml celkového objemu· Buňky byly peletovány, prom.ytyjednou 10 ml REB. a resuspendovány ve 4 ml REB ve 30 mlCorex zkumavce. 9 g skleněných perliček a 4 ml PCI pakbyly přidány. Suspenze se míchá na vířivém mixéru přivysoké rychlosti, osmkrát vždy 20 sekund, s chlazenímledem při 20 sekundách mezi mícháními. Suspenze se pakodstřeňuje při 10000 x g 10 minut. Vodná /horní/ vrstvase extrahuje dvakrát 4 ml PCI a 4 ml Cl. RNA se vysrážíz vodné fáze při -20 °C 0,1 objemu 3M octanu draselného,pH 5,3 a 2,5 objemy ethanolu. PolyA+ RNA se oddělí podle^aniatise a spol. /Molecůlar Cloning, A Laboratory Manual/s LiCl místo NaCl. Syntéza LP nebo HP mRNA-radioaktivněznačených cDNA prob, za použití 2 /Ug každého typu pólyA+ RNA, byla provedena podle Maniatise a spol. 60 ng čištěné Pichia pastoris plasmidové knihovnyv YEP13 /Broach a spol., Gene:8121 /1979// bylo použitopro transformování E.coli. MC1061 /Mandel a Higa, 1970,J.Mol.Biol. 53·154/. Vzniklo přibližně 8000 kolonií. Ko-lonie byly přeneseny na dvojité nitrocelulozové filtry,amplifikovány na LB plotny, obsahující 100 ^ug/ml ampici-linu a 170 ^ug/ml chloramfenikolu, lyžovány podle standard-ních protokolů /Grunstein a Wallis, 1979, Methods inEnzymology 68, 379-389/, zahřívány na 80 °C 90 minuta jednotlibé filtry byly hybridizovány buň s LP nebo HPcDNAprobami. Hybridizace byla provedena za použití 2X SSPE, -29- 1X ^enhardtova roztoku, 0,2% dodec.ylsulfátu sodného /SDS/a 2,5 x 10 cpm radioaktivně značených cDNA sond na mlh.ybridizačního roztoku. Hvbridizace se prováděla při 55 °Cpo 40 hodin ve 25 ml celkového roztoku. Po hybridizacibyly filtry promyty 2 x SSC, 0,1% SDS při teplotě míst-nosti a dvakrát 0,1 x SSS, 0,1% SDS při 65 °C, pak suše-ny a exponovány na rentgenový film.

Bylo identifikováno dvacet čtyři genomových klonyjako hybridizujících silněji s LP cDNA probou než s HPcDNA probou a jsou to možní kandidáti, kteří by mohliobsahovat inzerty kódující gen kyselé fosfatázy. Těchto24 klonů bylo rescreenováno jako výše LP a HP probami, 14rescreenovaných klonů opět hybridizuje silněji k LPcDNA probám. Z každého z těchto 14 klonů byh izolovánaplasmidová DNA, štěpena EcoRI, separovány elektroforé-zou na agarosovém gelu, blotována na dvojité nitrocelu-lozové filtry a každý filtr byl hybridizován buď s LPnebo HP cDNA za použití stejných podmínek jako výše. Genovéfragmenty se čtyř seperátních klonů habridizovaly sil-něji k LP cDNA probě a slaběji nebo vůbec ne, k HP cDNAprobě. Tyto, fragmenty pak byly restrikčně mapovány pomocíEcoRI + HindlII, EcoRI + Sa1I, a EcoRI + BamHI dvojitýmštěpením: a opět hybridizovány s LP cDNA probou. Fragmentykódují na fosfátu nezávislé-regulační genové segmenty jakbylo stanoveno rozdíly v jejich restrikčních mapách.

Oblasti, identifikované tímto postupem jako kódujícíLP -regulované geny se subklonují do pUC8 nebo p(JC19/New England Biolabs/. Výsledné plasmidy se radioaktivněznačí 32P nick translací /Maniatis/. Radioaktivně zna-čené plasmidy se použijí pro probu RNA blotů LP a HP RNA/5 yUg/blot/. Jeden z originálních 24 klonů, identifiko-vaný jako pLP24, byl zvolen pro další studium . -30- Příklad 2

Konstrukce pLP241 1

Plasmid pLP24 generovaný v příkladu 1 a považovanýza obsahující gen kyselé fosfatázy Pichia pastoris /sekv.id.č.1/ nebo jeho fragment byl dále charakterizován násle-dujícím způsobem. 10 /Ug pLP24 bylo štěpeno pomocí EcoRI/Sáli a na gelu byl purifikován 2,1 kb fragment. 10 ^ug pYL/125 /NRRL B-18015/ bylo štěpeno pomocíSphI/SalI a na gelu byl čištěn 3,1 kb fragment. 5 y-ugpUC19 bylo štěpeno· pomocí EcoRI/SalO, extrahováno PCI,

Cl extrahováno a vysráženo ethanolem. 100 ng pomocí EcoRI/Sáli linearizovaného pUC19 bylo ligováno s 200 ng 2,1 kbEcoRI/SalI fragmentu. pLP24 a 450 ng 3,1 kb. SphI/SalIfragmentu pYM25, ve třech částech ligaee, ve 20 ^ul ligač-ního pufru + 1 mm ΑΓΡ + 1U T4 DNA ligázy. E.coli kmenMC1Q61 byl transformován a správný plasmid byl identifi-kován přítomností 2,1 kb EcoRI/SalI fragmentu a 3,1 kbSp$jtl/Sall fragmentu. Správný plasmid byl nazván pLP2411. Příklad 3

Konstrukce pLP2412 PH01-disrupčního vektoru a vývojGS190:pLP2412

Plasmid pLP2411, odvozený z plasmidu pLP24 /vizpříklad 2/ byl štěpen Xbal, zpracován s Klenowovou DNApo-lymerázoz pro přípravu tupých konců, a ligován s 2,1 kbHpal fragmentem z plasmidu ρϊΜ25· Tento fragment obsa-huje; gen Sacharomyces cerevisiae 4RG4./Plasmid je dostupnýjako NRRL B-18015/. Výsledný plasmid byl označen pLP2412.pLP2412 byl pak štěpen EcoRI a BamHI. 3,3 kb fragmentbyl izolován a použit pro transformaci Pichia pastoris.GS190 /NRRL Y-18014/ k A?g+ prototropii /transformačnípostup je popsán v oříkladu 4/. Argininové prototrofy bylyidentifikovány jejich schopností růst v mediu postrádají- 31- cím arginin. Byly izolovány a screenovány na LP indi-kátorových plotnách na přítomnost kyselé fosfatázy. Ko-lonie byly opakovaně umístěny na LP indikátorové plotnya ponechány růst přes noc při 30 °C. Kolonie na LP indi-kátorových plotnách byly bu3 zelené /PH01/ nebo bílé/pho1/. Bílé kolonie byly transformanty, obsahující 3,3 kb expresní kazetu uvedenou výše, stabilně integro-vanou přerušením, při PHO1 lokusu genomu Pichia pastoris.

Genomové LNA ze stabilních Acg+ kmenů byly analyzo-vány Southern filtrovou hybridizací pro stanovení umístěníexpresní kazety. 3,3 kb EcoRI-BamHI fragment, obsahujícígen ARG4 Saccharomyces cerevisiae, byl specificky integro-ván a přerušoval genomovou sekvenci, která která bylaanalogická k DNA fragmentu obsaženému v pLP2411, což potvr-zuje, že; tento lokus kóduje kyselou fosfatázu /PHO1/.

Tento transformant byl označen GS190:pLP2412. Příklad 4

Transformace Pichia pastoris Při transformaci Pichia pastoris byl použit násle-dující protokol.

Kvasinkové buňky byly naočkovány do asi 10 ml YPD me-dia a za třepání kultivovány při 30 °C 16-20 hodin. Buňkypak byly zředěny na A&amp;qq asi 0,1 až 0,01 a udržoványv log fázi v YPD mediu při 30 °C po asi 6-8 hodin. 100 mlYPD media bylo inokulováno 0,5 ml očkovací kultury přiΑζθθ asi 0,1 a za třepání kultivováno; při 30 °C asi 16-20 hodin. Kultura pak byla sklizena s A^qq asi θ,2 až 0,3/po asi 16-20 hodinách/ odstředěním za použití DAMGN IECLPR-6000 odstředivky při 1500 g po 5 minut. -32-

Pro přípravu sféroplastů byly buňky jednou promytyv 10 ml sterilní vody /odstředění bylo prováděno vždypo každém promytí jak je popsáno výše/, jednou v 10 mlčerstvě připraveného SED, jednou v 10 ml sterilního 1M sor-bitolu a resuspendovány v 5 ml SCE pufru. 5 /Ul 4 mg/mlZymolyázy 60000 /dostupná od Miles Laboratories/ bylo v o přidáno a buňky byly inkubovány při 30 C po asi 30 mi-nut.

Tvorba sféroplastů byla sledována následujícím způ-sobem. 100 /ul podíly buněk byly přidány k 900 /Ul 1M sor-bitolu před nebo ihned po přídavku Zymolyázy a v různýchčasech během inkubační periody. Inkubace byla ukončena tehdy,když buňky budou lýzovat v SDS ale ne v sorbitolu. Po formo-vání byly sféroplasty promyty jednou v 10 ml sterilního1M sorbitolu odstředěním při 1000 g po 5-10 minut, promy-ty jednou v 10 ml sterilního CaS odstředěním a resuspendo-vány- v 0,6 ml v CaS.

Pro aktuální transformaci byly DNA vzorky- ve vodě neboTE pufru přidány /až do 20 /Ul celkového objemu/ do 1 2 x 75mm sterilních polypropylenových zkumavek./Pro malé množstvíDNA, maximální transformace se uskuteční za použití asi1 /ul 5 mg/ml ultrazvukem zpracované E.coli DNA v každémvzorku/. 100 /ul sféroplastů bylo přidáno ke každému DNAvzorku a inkubováno při teplotě místnosti asi 20 minut. 1 mlPEG byl přidán ke každému vzorku a inkubován při teplotěmístnosti asi 15 minut. Vzorky byly odstředěny při 1000 gpo 5-10 minut a supernatant byl odložen. Pelety byly re-suspendovány ve 150 /ul SOS a inkubovány při teplotě míst-nosti 30 minut. Ke každému bylo přidáno S50 /ul sterilního1M sorbitolu a vzorky byly umístěny na plotny jak bylo po-psáno výše. 10 ml regeneračního agaru bylo nalito na plotnu nejméně30 minut před připravenou transformací vzorku. 10 ml podíly- -33-

regeneračního agaru byly také rozděleny do zkumavek v lázni45-50 °C během doby, kdy transformační vzorky byly v SOS»Vzorky pak byly přidány do zkumavek, nality na plotny, obsa-hující pevnou spodní agarovou vrstvu a inkubovány při 30 °C 3-5 dnů.

Kvalita sféroplastů v různých bodech byla stanove-na následovně® 10 ^ul vzorek byl odebrán a zředěn 100 xpřídavkem ke 950 /ul 1M sorbitolu. 10 /ul tohoto ředěníbylo odebráno a byl přidán další 990 /ul podíl 1M sorbi-tolu. 100 /ul obou ředění bylo postřikem naneseno naplotnu YPD agarového media pro stanovení koncentracenesféroplastujících celých buněk, zbylých v preparaci. 100 /ul každého ředění bylo přidáno k 10 ml regenerač-ního agaru, který byl doplněn 40 ^ug/ml všech aminokyse-lin pyžadovaných hostitelem pro determinování, celého rege- nerovatelného sféroplastů. Dobré hodnoty pro transformačníγ pokus byly 1-3 x 10 celkových regenerovatelných sféroplastů/ml a asi 1 x 10^ celých buněk/ml. Příklad 5

Příprava kvasinkové DNA Následující protokol byl použit pro přípravu Pichiapastoris DNA.

Kvasinkové buňky byly kultivovány ve 100 ml YNBmedia plus 2 % dextrozy při 30 °C za Α^θθ rovné 1-2 apak peletovány za použití Damon IEC DPR-6000 odstředivkypři 2000 g 5 minut. Peleta byla promyta jednou v dí^O,jednou v SED, jednou v 1M sorbitolu a pak resuspendovánav 5 ml roztoku 0,1M tris-Cl, pH 7,0 a 1M sorbitolu. Buň-ky pak byly smíseny s 50 až 100 ^ul 4 mg/ml roztoku Z.ymo-lyázy 60000 /Miley Laboratories/ a inkubovány při 30 °C1 hodinu. Výsledné sferoplasty pak byly odstředěny při -34- 1000 g 5-10 minut a suspendovány v 5 ml pufru pro lýzy /0,1% SDS, 10 mži tris-Cl/pH 7,4/, 5 mM EDTA a 50 mlvi NaCl/,

Bylo přidáno po 100 /Ug/ml proteinázy K /Boehringer ivlann-Z v . o heim/ a RNázy A /sigma a roztok byl inkubován při 37 C30 minut. DNA byla zbavena proteinů šetrným míchánímpřípravku se stejným objemen Cl a fáze byly rozděleny od-střelováním při 1200 g po 20 minut. Horní /vodná/ fázebyla převedena do čerstvé zkumavky a extrahována stej-ným objemem; PCI. Fáze byly odděleny jako výše a vrchnífáze byla umístěna do zkumavky, obsahující 2-3 objemychladného 100% ethanolu. Vzorek byl šetrně míchán a DNAbyla shromážděna navinutím na tyčinku z plastické hmoty.DNA byla bezprostředně rozpuštěna v 1 ml TE pufru a dialy-zována přes noc při 4 °C proti 100 objemům TE pufru · Příkl ad 6>

Izolace^ celé délky PH01 genu

Pro izolování plasmidu, obsahujícího celý Pichiapastoris PH01 gen /sekv.id.č.1/, byla hybridizována ori-ginální Pichia pastoris genomická knihovna v MC1061 zadříve popsaných podmínek, s 600 bp BamHI fragmentu pLP24·Tento postup identifikoval pět pozitivnívh klonů. Plasmi-dová DNA byla připravena z těchto klonů, štěpena BamHI,blotována na nitrocelulozové filtry a hybridizována sestejnou 600 bp probou. ^aždý z pěti klonů měl 2,0 kbSamHI fragment, který obsahuje gen PH01 Pichia pastoris.Jeden z klonů byl zvolen pro další analýzu a označenPPL2420. 2,0 kb BamHI fragment pLP2420 byl sekvenován dideoxysekvenováním restrikčním enzymem štěpených fragmentů sub-klonovaných v M13 /dostupný od New England Biolabs/.Analýza sekvence představuje otevřený čtecí rámeček468 aminokyselin obsažený celý ve 2,0 kb BamHI fragmentu. -35- Příklad 7 Vývoj kmenů MB102-26 :pLP2430-T1 θM31 02-26:pLP2430-T3 2,0 kb BamHI fragment pLP2420, obsahující PHO1 genbyl ligován do BamHI místa pYM8, plasmidu, který obsa-huje gen HIS4 Saccharomyces cerevisiae a pBR322 sekvence.//pYM8 může být připraven následovně: deset ^ug pYA2/NRRL B-15374/ byl štěpen; pomocí SphI/Thal a 3,4 kbfragment byl čištěn na gelu. Deset ^ug p3R322 byloštěpeno pomocí 3phI/NruI a 3,95 kb fragment byl čištěnna gelu, Sto ng 3,95 kb pBR322 fragmentu bylo ligovános 250 ng 3,4 kb pY42 fragmentu za standardních podmínek.Správný plasmid byl identifikován, na bázi 3,1 kb Hhol/

Sphl fragmentu a nazván pYM8/. Výsledný plasmid byl ozna-čen pLP2430 a byl kompetentní replikovat/autonomně vPichia pastoris na základě štastné J5RS funkci /autonomníreplikační sekvence/ umístěné v sekvenci genu HIS4 Saccha-rom.yces cerevisiae. GS190:pLP2412 /Pho“/, kmen Pichia pastoris. postrádající aktivitu kyselé fosfatázy /viz příklad 3/ bylspojen s kmenem Pichia pastoris MD100-20 /his4, Aie“/.Protokol pro spojení byl použit takový, který je popsánv US patentu č. 4812405, citovaném zde jako odkaz. ^Qnen MD100-20 byl připraven následovně: buňky kmene Pi-chia pastoris GS115 /his4/ NRRL Y-15851 byly smíseny sbuňkami kmene GS247 /Ale-/ za podmínek známých pro pro-motování formace zygot a diploidizaci /protokol protento postup je uveden v US patentu č. 4812405, udedenémzde jako odkaz/ a plátován na YNB+ dextrozové plotnypro selekci prototrofních diploidů. Diploidní kmen bylnazván MD100. MD100 byl kultivován za podmínek známýchpro indukci sporulace diploidů Pichia pastoris /také po-psaných v US patentu č. 4812405/ a spory progeny kultivo-vány na plotnách YNB dextroza + adenin + histidin. -36-

Indivůduální kolonie byly testovány na schopnost růst za nepřítomností adeninového nebo histidinového doplňku.

Kmen schopný růst bez histidinového doplňku byl neschopný růst za doplňku adeninu, po identifikaci byl nazván MD100-20.

Diploidní kmen z tohoto křížení, MB102 Pho+/Pho~,HIS4/his4, Aie+/Aie“/ byl sporulován /US patent č. 4812405/ pro získání haploidního potomstva. Toto potomstvobylo prohlédnuto na LP indikátorové plotně a na YNB dex-trozové plotně, s nebo bez histidinového nebo adenino-vého doplňku, pro izolaci kmene MB102-26 /Pho“,His4,

Aier/.

Kmen MB102-26 byl transformován, plasmidem pLP2430jak je popsáno v příkladu 4. His+ transformanty bylyselektovány a screenovány na expresi kyselé fosfatázyna LP indikátorových plotnách /viz příklad 3/. Pěttransformantů bylo pozotovních na exoresi kyselé fosfatá-zy·

Dva z těchto transformantů, MB102-26:pL2430-T1 a MB102·26:pLP2430-T3, byly analyzovány na vhodnou regulaci ex-prese kyselé fosfatázy. Každý kmen byl kultivován v HPnebo LP mediu 24 hodin, při A^°° 2,0. Buňky z každé kul-tury byly studovány vzhledem k expresi kyselé fosfatázy/Bostian a spol., 1980, Proe.^atl. Acad.Sci. 77^4504-4508/,paralelně s netransformovanými HIS4 buňkami /MB102-28/nesoucími Pho~fenotyp a HIS4 buňkami /MB102-51/ nesoucímiPho+,fenotyp divokého typu /tabulka 1/. Hladina indukcepLP2430 transformantů byla prakticky stejná s kmenem divo-kého typu. Proto 2,0 kb BamHI fragment, obsahující PHO1 gen -37- inzertovaný v pLP2430, obsahující celou oblast, kódujícíkyselou fosfatázu jakož i sekvence dostačují ke vhodnéfosfáten regulované expresi kyselé fosfatázy.

Tabulka I

Kmen genotyp jednotky ΑΡ/ΟΡ^θθ násobek indukce MB102-26:pLP2430-T1 ade“,HIS4, PHO1 707 30,244 43 MB102-26:pLP2430-T3 áde“,HIS4, PHO1 852 28,198 33 M31 02-51 ade~,HIS4, PHO1 61 ,4 1,975 32 MB102-28 ade~,HIS4, pho1 0,02 0,03 1,5 Příklad 8

Sekrece invertázy

Tento příklad demonstruje, že PHO1 signální sekvence/sekv.id.č. 3/ funguje, je-li operabilně připojeny kheterologním genům. 2,2 kb Smal-PvuII fragment, obsahujícíSUC2 gen Saccharomyces cerevisiae byl izolován z pSEYC306/Johnson a spol., Cell 48, 875 /1987// a klonován do Smálmísta buá pA0810 nebo pPSV218 /viz příklady 11 a 12 popisutěchto rodičovských plasmidů/. Tento postup generuje plas-midy pAPINVI a pAPINV2.‘ Tyto využívají Pichia pastořiAOX1 promotor k regulaci transkripce otevřeného čtecího rá-mečku z PHO1 signální sekvence /sekv.id.č.3/ do SUC2strukturálního genu: PHO1 sekvence

...GTGTTCGCT linkerové sekvence z pSEYC306

CGA GAA TCC CCC GGG GAT CCG TCG

JCC TGC fflC CCA GCT TTG -38- SUC2 sekvence ACA AJC GAA. ..

Deset yUg každého plasmidu, pAPINV! nebo pAPIt4V2, byloštěpeno Bg1 II a použito pro transformaci GS11 5 jako vpříkladu 4· Transformanty, obsahující 8g1II fragmentpAPINVI, označený GS11 5:pAPINV1,byly selektovány na histi-dinovou prototrofii a screenovány na Mut” fenotyp, kterýukazuje správnou integraci a přerušení v A?X1 lokusu.

Mut screen byl proveden opakováním plátování kolonií zmedia, obsahujícího glukózu do media, obsahujícího metha-nol a hodnocením·, růstové rychlosti na methanolu. Pomalýrůst na methanolu indikuje Mut” fenotyp. Transformantys Bgl II fragmentem pAPINV2, označené GS1 15 :p^PINV2, bylytaké selektovány z pro histidinovou prototrofii, alebyly screenovány pro Pho1~ fenotyp, který znamená správnouintegraci a přerušení v PH01 lokusu /viz příklad 3/·

Transformanty z každé třídy byly identifikoványa kultivivány v Y3N+ 2% glycerolu, paralelně s Pichiapastoris kmeny KM71:GS102 /Mut”/ a GS11 5:GS1 02/Mut+/, kteréobsahují plasmidy identické s pAPINVI, s tím rozdílem, žeSUC2 gen obsahuje jeho nativní signální sekvenci a postrá-dá PH01 signální sekvenci. Tyto dva kmeny jsou popsányv EP 256421. Také byly paralelně kultivovány kmenyKM71:pPSV216/Bdut”/ a GS115:pPSV216/Mut+/, které obsahujíintegrované plasmidy identické s pAPIN72, s výjimkou,žechybí SUC2 sekvence.

Každá kultura byla kultivována v YNB+2% glycerolu přiΑ^θθ přibližně 3,0· Podíl každé kultury byl odebrán, pro-myt sterilní vodou a resuspendován v 10 ml YNB+0,5% MeOH.Mut+ kultury byly resuspendovány při A^°°=0,02 a Mut“ -39 kultury při A600=0,2 a kultivovány při 30 °C po 24 ho-din při přibližně A600=0,3-0,4. V téro době, přibližně 1,0mOD^OO bylo zkoumáno na invertázovou aktivitu. Výsledkyjsou uvedeny v tabulce II.

Sabulka II

Kultura MUT signální sekvence sekretovaná invertáza3 celková účinnostinvertáza*3 sekrece GS115: dAPINVI — PHO1 20,3 3,05 0,67 KM71 : GS102 - SUC2 12,5 18,9 0,66 KM71 : PPSV216 - PH01d 0 0 NA GS115:p APINV2 + PH01 6,1 6,7 0,91 G311 5 GS102 + SUC2 5,3 5,7 0,93 GS115:pPSV2l6 + PH01d 0 0 NA -sekretovaná invertáza - měřeno podle Goldstenina aLampena0. bez Tritonu, vyjádřena jako jednotky invertázy/Α^θθstudované kultury. 1 jednotka = 1 /umol glukózy uvol-něné/minutu, při 37 °C. -celková invertáza - měřeno, za přítomnosti 0,2 %

Tritonu X-100. c -účinnost sekrece- sekretovaná invertáza/celková inver-táza zkoušená. d -přítomen PH01 signál, žádné SUC2 sekvence 0 -Goldstein a Lampen, wethods in Enzymology 42:504-511,1975. -40- Výsledky jasně prokazují, že PH01 signální sekvencefunguje 9tejně účinně jako SUC2 signální sekvence k pro-motování sekrece invertázy z Pichia pastoris. Příklad 9

Sekrece tPA /tkáňového plasminogenního aktivátoru/ xento příklad demonstruje, že pHOl signální sekvence /sekv.id.č. 3/ funguje, je-li operabilitě připojena k he-terologním genům.

1. Izolace tPA-kodující cDNA

Buněčná linie. Bowesova melanomu, s> nadprodukcí tPA,ATCC č. CRL9607, byla zdrojem RNA použité pro konstrukcicDNA knihovny. Tato buněčná linie byla již použita proklonování tPA sekvencí /Penniea a spol., Nátuře 301:214,1983; Edlund a spol., PNAS 80:349, 1983; Lemontt a spol.,DNA 4:419, 1985/· Póly A*- SNA byla izolována a oligo dT-primována, obecně podle postupu Maniatise /Molecular Clo-ning:A Laboratory Manual; Cold Spring Barbor Laboratory,1982/. RNA byla použita pro přípravu cDNA za použití komerčního cDNA klonovacího kitu /dostupný od Auersham/ a inzer-tována do Τ'gt11 klonovacího vektoru. gt11 fág, obsahu-jící inzerty byl infektovan do hostitele E.coli Y1088 zapoužití obchodně dostupné směsi /od Btratagene/.

Knihovna byla trojnásobně plátována a sondována třemirůznými oligonukleotidy navrženými z publikované sekvencelidské tPA cDNA/Pennica a spol., supra/. Oligonukleoti-dy odpovídají 5*, střední, a 3*sekcím cDNA a měly násle-dující sekvence: 3* proba: GAC TGG ATT CGT GAC AA3 AEG CGA GCG TGA 3*střední proba: 5*TCA CAG TAC TCC CAC GTC AGC CTG CGG TTC 3'5* proba: 5*GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT GAT TGC T 3* -41-

Bylo identifikováno pět plaků, které h.ybridizujíse všemi třemi probami. ^estrikční štěpení inzertůtěchto klonů je identifikují jako kódující tPA na základěpublikovaných restrikčních diagramů /Pennica a spol.,supra/. Klony se liší pouze v rozsahu přítomné 5*neko-dující sekvence. Klony 4 a 5 byly zvoleny pro další charak-terizaci, protože obsahují DNA inzerty 0,8 kb /5*konec/, 0,47 kb /střed/ a 1,3 kb /3'konec/ po EcoRI štěpení,potvrzujících přítomnost celé délky t-PA kódujících sek-vencí. 3g1II fragment z klonu 4 byl subklonován BamHI-štěpeného pUC18 a ligace-; byla transformována do buněk E.coli MC1061. Pozitivní transformanty byly identifiko-vány EcoRI štěpením, Klon nesoucí inzert v/ negativníorientaci byl identifikován Pstl restrikčními diagramy420 bp, 624 bp, 760 bp a 2,7 kbp fragmentů a byl nazvánpUC18č.3· Klon nesoucí inzert pozitivní orientace bylidentifikován Pst restrikčními diagramy 420 bp, 624 bp, a 3,46 kb. a byl nazván pUC18č.2. Inzert kóduje dva nukleo-tidy před první aminokyselinou zralého tPA až do 1972nukleotidů 3* nekódující sekvence. 2. Konstrukce vektoru pT37 /PH01ss-tPA-pUC/ tPA inzert z pUC18č.2 byl klonován do Pichia pas- toris expresního plasmidu pA0810. Plasmid pAO810 zahrnujePichia pastoris ADX1 promotor, Pichia pastoris PHO1 sig-nální sekvenci, AOX1 transkripční termihátor, Pichiapastoris HIS4 gen pro selekci, f1 zdroj replikace a sekven-ce nezbytné pro replikaci a selekci v bakterii. Konstruk-ce pA08t0 je popsána v příkladu 11. /Ug 1600 bp Sall/Smal fragmentu pUC18č.2, předemčištěná na 1% agarozovém gelu, kódující 5'-podíl tPA byloligováno ke 300 ng Xhol/Smal štěpeného pA3810. Ligačníreakční směs byla transformována do buněk E.coli MC1061 a byly -42- selektovány. Pozitivní byly identifikovány typickými420 bp, 620 bp, 2 kb a 6,3 kb fragmenty po štěpení pomocíPstl. Výsledný vektor byl nazván pT1. Místně řízená mu-tageneze byla provedena následovaná stadardními postupypro f1 zdroj replikace vektorů, pro deleci dvou extranukleotidů 5* ke zralé tPA kódující sekvenci. Mutageno-vaný oligonukleotid měl sekvenci: 5*CAA TCT GTC TTC GCT TCT TJC CAA GTG ATC 3*

Správný plasmid byl identifikován; screeningem Sa1I/Xbal-štěpených mini-preparátů. Originální vektor pTI mělrestrikční typické 1,2, 2,3 a 6,6 kb. Správně mutagenovanýplasmid měl typické 1,2 a 9,8 kb a byl nazván pT2-3· 50 /Ug pUC18č.3 bylo štěpeno pomocí SmaI/Sau3A.

Tri pruhy mezi 72 a 118 bp /75, 90, 110 bp/ kódující3*podíl tPA byly čištěny na pólyakrylamidovém gelu abyly ligovány k 0,5 /Ug plasmidu pT2-»3 štěpeného Smál/BamHI. Ligace byla transformována do E.coli MC1061 buněka byly selektovány ampR kolonie. Pozitivní byly identi-fikovány PvuII/^pal štěpenými mini-preparáty. Správnýplasmid vykazuje 421 bp fragment /nesprávný vykazuje 225bp fragment/. Správný vektor byl nazván pT37. 5 mutagenezese ukáz&amp;ala být ve správné sekvenci, avšak sekvenováníukazuje, že- plasmid obsahuje pUC18 sekvence po koncitPA 3*nekodující sekvence; plasmid pT37 měl Sau3A frag-ment z pUC18, polohy 1894-2004, bezprostředně následujícít-PA sekvenci. 10 /Ug plasmidu pT37 bylo štěpeno pomocí Stul apoužito pro transformaci kmene Pichia pastoris XM71/sox1, His4/. Transformanty byly selektovány pro histi-dinovou protrofii. Transformant, XM71ipT37 byl kultivo-ván v YN3 + 2% glycerolu, paralelně s kmenem KM71rpT7,který obsahuje plasmid /pT7/ téměř identický s pT37 s tí, -43- rozdílem, že PH01 signální sekvence byla nahrazena nativ-ní lidskou tPA signální sekvencí a pUC18 sekvence na 3*konci byly odstraněny. Popis pT7 je uveden dále. 50 mlkultury každého kmenu kultivovaného v YN3 + 2 % glycerolubylo naočkováno do jednolitorvého fermentoru a kultivo-váno bučí kontinuálním nebo vsázkovým způsobem. Výsledkytěchto pokusů jsou uvedeny v tabulce III.

Tabulka III *tPA /ug/l

Pokus č. kmen sigiál způsob vnitřní vnější celkem účin-

.XX nost 1 KM71:pT7 tPA kontin. 255 60 315 .19 2 OT1:pT7 tPA vsádk. 651 30 681 .04 3 KM71:pT37 ?H01 kontin. 840 420 1260 .33 4 KM71:pT37 PH01 vsádk. 1856 1200 3056 .39 X tPA studována pomocí ELIS A za použití lidské tPA jako standardu účinnost sekrece tPA = vnější tPA/celková tPA produko-vaná Výsledky tohoto pokusu ukazují, že bez ihledu nazpůsob fermentace PH01 signální sekvence /sekv.id.č. 3/ byla účinnější při promotování tPA sekrece v Pichiapastoris, než nativní signální sekvence. Dále mikro-Edman degradační analýzy potvrzuje, žeN-terminální aminokyselinová sekvence rekombinantu, sekte-tující tPA z kmene XM71:pT3, užitím PH01 signální sek-vence /sekv.id.č.3/ byla identická s nativní tPA purifiko- -44- vanou z kultivovaného zdroje lidské tkáně /melsnom/. 3. Konstrukce pT? /tP.áss-tPA-ηθ pUC/ 5 /Ug přibližně 100 bp Smal/Sau3A fragmentu zpUC18S.3 bylo ligováno k 500 ng pT1 štěpeného Sma/BamHI.

Ligaění směs byla transformována do buněk E.coli MC1061a byly selektovány ampR kolonie. Pozitivní byly identi-fikovány přítomností 360 bp pruhu, spíše než 260 bp pruhupo štěpení pomocí J5paI/PvuII. Modifikovaný 3* konec bylsekvenován a ukázal se být správnou sekvencí se žádnýmiextra pUC18 sekvencemi. Tento plasmid byl nazván pT49.

Oligonukleotidy kódující autentickou t-PA signálnísekvenci byly přidány k Xbal místu plasmidu pT49 a pakbyly provedeny dvě mutageneze pro 1/ deleci extra 8 nuk-leotidů sekvence zbývající mezi t-PA signální sekvencí asekvencí kódující maturovanou t-PA, a 2/ pro deleci PHO1signální sekvence. Tyto manipulace byly provedeny násle-dovně.

Byl syntetizován oligonukleotid následující sekvence/109 nukleotidů/: 5*CTA GAT GGA TGC ΑΑΓ GAA GA5 A3G GCT CTG CTG TGT GCT GCT GCTGTG TGG A3C A3T CTT CGT TTC GCG CAI CCA GGA ΑΑΓ CCA TGC CCG ATTCA5 AAG AGGCAJ A3*

Komplementární oligonukleotid potřebný pro druhýřetězec byl syntetizován jako tři oligonukleotidy, odélce 33, 37 a 39 nukleotidů, které mají následující sek- vence: -45- 5* CffiG GCT GGG CGA AX GAA GJC TGC TCC A5A CA2 3* 5* CTA GTC TGG CTC CTC TTC TG A ATC GGG CAT GGA TTT C 3* 5* C4G C4G CJC J3CAGCA GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT 3*

Celá délka oligonukleotidu a tři doplňující oligo-nukleotidy byly kinázovány a pak spolu anelovány zahří-váním v lázni horké vody po 3 minuty a pak pomalu ochla-zeny na teplotu místnosti Hybridizovaný oligonukleotidbyl izolován, a oddělen z 5% póly akry 1 amidového gelu. 20 ng částečně Xbal-linearizovaného pT49 bylo li-gováno k 1 ^ug hybridizováného dvoujřetězcového oligo-nukleotidu. Ligační směs byla transformována do buněk E.coli MC1061 a ampR kolonie: byly selektovány. Klony,obsahující správně přeměněný plasmid byly identifikovány'dalším 700 bp pruhem po štěpení pomocí AsuII. Správnýplasmid byl nazván pT44.

První mutageneze byla provedena standardní na fl-založené místně řízené mutagenezi za použití pT544 DNA/5 /Ug/ a oligonukleotidu /1 /Ug/ s následující sekven-cí : 5*GA TTC AGA GGA GCC AS A TCT TAC CAA GTG 3TC TGC &amp; 3*

Správný plasmid byl screenován štěpením bglll. Správnétypické restrikční délky /1,1, 2,8 a 5,3 kb/ indikujísprávný plasmid, který byl nazván pT64·/nesprávný plasmidvykazoval typické 2,8 a 6,3 kb pruhy/.

Druhá mutageneze byla provedena s plamidem pT64pro deleci PHO1 signální sekvence. Byl použit oligo-nukleotid, mající následující sekvenci: -46- 5*Α3Τ ΑΑΓ ΤΑΓ TCG ΑΑΑ CGA TGG ATG CAATGA A3A GA3 G 3 3 /ug pT64 a 0,4 /Ug výše uvedeného oligonukleotidubyly použity pro mutagenezi. Mini-preparáty byly scree-novány štěpením pomocí BglII. Správný plasmid byl identi-fikován třemi LNA fragmenty 1, 2,8 a 5,3 kb /nesprávnýplasmid vykazuje nejmenší pruh 1,1 kb místo 1 kb/. Mu-tageneze byla potvrzena sekvenováním a správný plasmidbyl nazván pT7. Příklad 10

Konstrukce pAPB101:PH01 promotor-lacZ expresního plas-midu

Tento příklad demonstruje, že PHO1 promotor /nebo5'regulační sekvence//sekv.id.č.2/ fungují, jestližejsou operabilně připojeny k heterologním genům. 1 /UglacZ-obsahujícího plasmidu pSA3H5 /NRRL B-15862/ bylštěpen pomocí EcoRI a BamHI a 10,1 kb vektorový fragmentbyl izolován z 0,8% agarozového gelu. 5 yUg pLP2420 byloštěpeno s EcoRI a Bell a 1,6 kb fragment, obsahující375 bp pBR322 DNA, "1075 bp PHO1 5'lemující DNA, obsahu-jící PHO1 promotor /sekv.id.č.2/ a 123 bp PHO1 kódujícísekvence byl izolován z 1% agarozového gelu, 100 ngEcoRI-BamHI fragmentu pSAOH5 a 60 ng 1,6 kb EcoRI-Bc1I fragmentu pLP240 bylo ligováno ve 10 ^ul směsi ligázovéhopufru s 1 mM AFP a 1U T4 DNA ligázy /dostupná od Boeh-ringer Mannheim/. Ligační směs byla transformována do E.coli JM103 a ptransformované bnňky byly umístěny naplotny L3 Amp, které obsahují 40 ^ug/ml X-gal. Modřezbarvené kolonie byly zvoleny, kultivovány v LB Amp a bylaizolována plasmidová DNA. DNA byla štěpena pomocí EcoRI aSmál a správný plasmid byl identifikován uvolněním1450 bp fragmentu. Správný plasmid byl nazván pAPB101.Expresní kazeta, obsahující E.coli lacZ gen umístěnáza řízení Pichia pastoris PHO1 promotorového prvku/sekv.id.č.2/ byla obsažena v pAPB101. -47- 10 /Ug neštěpeného pAPB101 bylo transformováno doGS115 sféroplastů a byly selektovány histidinové proto-pí as ty. 12 His+ kolonií bylo zvoleno, kmeny byly kulti-vovány v kapalném prostředí s vysokým obsahem fosfátu /HP/a LP mediu a zkoušeny na /2-galaktosidázovou aktivitu.Pozitivně transformované kmeny byly identifikovány nabázi -galaktosidázové exprese po kultivaci v LP me-diu a ztrátu fy -galaktisodázy po kultivaci v HP mediu. fi) -galaktosidáz^ byla zkoušena podle J.H.Millera, Expe-rimente in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs,

Cold Spring Harbor, NY 1972. Bílé kolonie se objevují naHP-X-gal plotnách a modré kolonie na LP-X-gal plotnách. Příklad 11 Následující plasmidy byly konstruovány pro použitív dalších příkladech předloženého vynálezu. 1. Konstrukce plasmidu p40810 M13mp19&amp;RI byl konstruován štěpením 1 ^ug M13mp19 s EcoRI, plněním Klenowem a ligací plněného fragmentudo sebe samého., ligace byla použita pro transformaci buněk E.coli JM103 a správný plasmid byl identifikován izolacíDNA a štěpením pomocí EcoRI. Správný fág nebyl štěpen EcoRIa byl nazván M13mp19ARI. Plasnid pA0804 / jeho konstrukcebyla popsána v W089/04320,citovaném záe jako odkaz/ bylštěpen Sstl a EcoRV a byl izolován přibližně 1,2 kb frag-ment z Q,8&amp; agarozového gelu. /Všechny fragmenty v tétokonstrukci byly izolovány z 0,8-1,0$ agarozového gelu/. 100 ng fragmentu bylo ligováno k 500 ng Sstl- a Smal-štěpeného M13mp19ÁRI. Ligace byla použita pro transfor-maci buněk E.coli JM103, a správný fág byl identifikovánizolací DNA a štěpením s Sstl a PvuII. Správný fág byl identifikován přítomností 950 bp fragmentu a byl nazvánpPSV101. -48-

Jeden pikomol pSV101 byl podroben in vitro oligo-nukleotidem řízené, místně-specifické mutagenezi za po-užití 20 pmol oligonukleotidu následující sekvence: 5*CGA GGA ATT CCC CGG GAT CCT TAG ADA T 3*

Reakční směs byla použita pro transformaci buněkE.coli JM103· Správný plasmid byl identifikován štěpenímmini-prep DNA pomocí BglII a 3am HI, uvolňujícím fragmen-ty 1,4 kb a 0,5 kb DNA. Správný fág byl nazván pPSV102.

Plasmid; pPSV102 byl štěpen EcoRI a 500 ng 8,5 kbfragmentu bylo ligováno k 50 ng následujícího dvouřetěz-cového syntetického DNA fragmentu, kódujícího pro Pichiapastoris PHO1 signální sekvenci /sekv.id.č.3/ za použitínásledujících optimalizovaných Pichia kodonů:

5*AATTC ATG TTC TCT CCA ATT TTG TCC TTG GAA ATT ATT TTA GCT TTGGCT ADT

3*-G TAD AAD AGA GGT TAA ÁJC AGG AAC CTT TAA TAA AAT CGA AADCGA TGA TTG CAA TCT GTC TTC GCT CGA G-3* AAC GTT JCA CAG AAG CGA GCT C TTAA-5*

Ligační směs byla transformována do buněk E.coliCJ236 a správná fágová DNA byla identifikována hybridizacíplak a jedním kódujícím řetězcem kvasinkové signální sek-vence, která byla radioaktivně označena pomocí ^^P, aštěpením hybridizující DNA pomocí Sstl a BamHI, uvolňu-jícím 700 bp fragment. Plasmid byl nazván pPS7103.

Jeden pikomol pPSV103 byl mutagenizován in vitro se20 pmol oligonukleotidu sekvence: -49- 5*CTAA TTA TTC GAA /CG ATG TTC TCT CCA ATT 3*

Správná fágová DNA byla identifikována plakovou hybridiza-cí se stejným oligonukleotidem, jak je uveden výše. Správ-ný plasmid byl nazván pPSV104·

Plasmid pA0810 byl připraven štěpením 10 /Ug pPSV1Q4s HinďlII a izolací 400 bp DNA fragmentu z 1,2½ agarozo-vého gelu. 50 ng tohoto fragmentu bylo ligováno s 250 ng 7,9 kb HinďlII štěpného produktu pJ50807 /příprava je popsá-rna dále/ po izolaci z 0,8½ agarozového gelu. Ligace bylatransformována do buněk E.coli MC1061 a byly selektoványampR kolonieř. Správný plasmid byl identifikován přítom-ností 450 bp pruhu po štěpení pomocí BamHI a EcoRV a bylnazván pA0810. 2. Sestavení pA08O7

a. Příprava fl-ori DNA fl bakteriofágová DNA /50 ^ug/ byla štěpena 50 jed-notkami Rsal a Dral /podle návodu výrobce/ pro uvolnění“458 bp DNA fragmentu, obsahujícího fl oblast replikace/oři/. Směs po štěpení byla extrahována stejným objememPCI a vodná vrstva byla extrahována stejným objemem Cla nakonec byla DNA ve vodné fázi vysrážena úpravou kon-centrace NaCl na 0,2M a přidáním 2,5 objemů absolutníhoethanolu. Směs byla ponechána stát v ledu /4 °C/ po 10 v minut a vysrážená DNA byla oddělena odstředováním po30 minut při 10000 x g v mikrofuze při 4 °C. DNA peleta byla promyta 2krát 70% vodným ethanolem.Promytá peleta byla vakuově sušena a rozpuštěna ve 25 /UlTE pufru. DNA byla podrobena elektroforéze na 1,5% agaro-zovém gelu a gelová část, obsahující 458 bp fl-orifragment byla vyříznuta a DNA v gelu byla elektroeluována -50- na DE81 /Whatman/ papír a eluována z papíru v 1M NaCl.

DNA roztok byl srážen jak je popsáno výše a sraženina DNA byla rozpuštěna ve 25 /Ul TE pufru /Fl-ori fragment/. b. Klonování fl-ori do Dral míst pBR322: p3R322 /2 /Ug/ byl částečně štěpen 2 jednotkami Dral /podle instrukcí výrobce/. Reakce byla ukončena PCIextrakcí následovanou srážením DNA jak je detailně popsánove stupni a výše. DNA peleta byla štěpena ve 20 ^ul TEpufru. Asi 100 ng této DNA bylo ligováno se 100 ng fl-©rifragmentu /stupen a/ ve 20 /ul ligačního pufru inkubacípři 14 C přes noc s 1 jednotkou T4 DNA ligázy. Ligacebyla ukončena zahřátím na 70 °C na 10 minut a pak použi-ta ke transformaci kmene E.coli JM103 pro získánípBRfl-ori, který obsahuje fl-ori klonovaný do ^ral míst/poloha nukleotidu 3232 a 3251/ pBR322. σ. Sestavení pA0807: pBRfl-ori /10 /Ug/ byl štěpen 4 hodiny při 37 °C10 jednotkami každého z Pstl a Ndel. Štěpená DNA byla extrahována PCI, srážena a rozpuštěna ve 25 /Ul TE pufru jakje detailně popsáno ve stupni 1 výše. Tento materiál bylzpracován elektroforézou na 1,2&amp; agarozovém gelu a Ndel-Pstl fragment /přibližně 0,8 kb/, obsahující fl-ori bylizolován a rozpuštěn ve 20 ^ul TE pufru jak je detailněpopsáno ve stupni a výše. Asi 100 ng této DNA bylo smísenose 100 ng pA0804, který byl štěpen Pstl a Ndel a zpracovánfosfatázou. Popis; je uveden pro pA0804 ve W089/04320. Tatosměs byla ligována ve 20 ^ul ligačního pufru inkubací přesnoc při 14 °C s 1 jednotkou T4 DNA ligázy. Ligační reakcebyla ukončena zahřátím na 70 °C na 10 minut, '^ato DNAbyla použita pro transformaci E.coli kmene JMI03 pro zís-kání pAD807· -51- Příklad 12 konstrukce pPSV218 200 ng 1,6 kb EcoRI/BclI fragmentu z pLP2420, 100 ng0,8 kb BglII/HindlII fragmentu pPG.2.5 /popis dále/ a100 ng 2,6 kb EcoRI/HindlII fragmentu pUC8 /New EnglandBiolabs,lne./ bylo ligováno třídílnou ligací ve 20 /u!objemu ligačního pufru, 1 mm ΑΓΡ, 1U T4 ligázy a transfor-mováno do E.coli kmene MC1061 pro Anp rezistenci. /Plas-mid pPG2.5 je 2,5 kb EcoRI-SalI fragment pPG4.0 /NRRL-B-15868/ umístěný v pBR322, který obsahuje promotor alko-hol oxidázy/. Rezistentní klony byly analyzovány na plas-midy, které obsahují 2,4 kb EcoRI + HindlII fragment; správný plasmid byl nazván pPSV201. 50 ng pPSV201 bylo štěpenoBamHI, defosforylováno a ligováno s 50-ti násobným molár-ním přebytkem oligonukleotidu následující sekvence: 5 *-GATC A3ATCT-3 * který konvertuje BamHI místo na BglII místo. Pozitivníklony byly identifikovány a plasmid byl nazván pPSV203· 10 ng pPSV203 bylo částečně štěpeno s limitujícím množstvímHindlII a tupě ukončeny Klenowem. Lineární celá délkaplasmidových fragmentů byla čištěna na gelu a samoligo-vána ve 100 ^ul objemu. Správné klony byly identifikoványna bázi plasmidové DNA, obsahující 1350 bp BglII/HindlIIfragment, a správné plasmidy byly nazvány pPSV210. 60 ng 500 bp BglII-aamHI fragmentu pLP2420 bylo li-gováno se 100 ng BamHI-štěpeného pUC8. Správné plasmidybyly identifikovány podle 422 bp NcoI-BamHI fragmentu,výsledný plasmid byl nazván pPSV202. 50 ng pPSV202 byloštěpeno BamHI, defosforylováno a ligováno s 50násobnýmmolárním přebytkem oligonukleotidu se sekvencí: -52- 5*-GATC ASATCT-3* který konvertuje BamHI místo na BglII místo. Správnýplasmid byl identifikován podle 422 bp Ncál/BglII frag-mentu a nazván p?SV204. 10 /Ug pPSV210 bylo štěpeno BglII a Sací a 700 bpfragment byl čištěn na gelu. 25 ng tohoto fragmentu byloligovéno ke 100 ng na gelu čištěného, 8000 bp BglII/SacIfragmentu pA0810. Správné plasmidy byly identifikoványpřítomností 700 bp bglII/SacI fregmentu a byly nazványpPSV212. 10 /Ug pPSV212 bylo štěpeno pomocí Sphl, zarov-náno na tupo T4 DNA polymerázou /podle Maniatise a spol./,částečně štěpeno BglII a 800 bp fragment byl čištěn nagelu. 10 /Ug pPSV204 bylo štěpeno pomocí Ncol, zarovnánoKlenowem, štěpeno BglII a 440 bp fragment byl čištěn nagelu. 100 ng výše popsaného 8 kb fragmentu z pPSV212 byloligováno k 15 ng 440 bp fragmentu z pPSV204. Správný plas-mid: byl identifikován, podle 5500 bp BglII fragmentua byl nazván pPSV218. Příklady slouží k ilustraci praktického provedenívynálezu a v žádném případě jej nikterak neomezují. Různévariace a modifikace, které nevybočují z podstaty a duchavynálezu, rovněž spadají do jeho rozsahu a tím do rozsahuochrany.

Seznam sekvencí 1/ Obecná informace:

Dočet sekvencí: 5 -53-

Informace oro sekv.id.č.1: i/ Charakteristiky sekvence: /A/ Délka: 1994 bp /3/ Typ: nukleová kyselina /C/ Řetězec: jeden /D/ Topologie: lineární

ii/ Typ molekuly: genomová DNA /xi/ Označení sekvence: Sekv.id.č.1 GGATCCCTAT TGTTACTTTT GCTTAACATT CCAATATTCT TCAACGGTTA ATTGATTAAC 60 ACTGTAACCT CTGCCCATGT GCTTCATCCA AATCTGGTAA TCTGCTTTCT ATTTCTGCCA 120 AAATAGTTAA TCTATGAGAC ATGTGCCCTC AATTGCGCAG TAGATCGAGT GGAAGTCTTC 180 TTTGCGTAAC ACTCAAAGTA TATCCCTGTT AGTCTTTATT CACCTGTTGC TGCATTGGTG 240 TCAGTTACCA TTATTGTTTC CACTTGGAAA AGCTTGTTTT TTTTTGATAG CACAGAAACG 300 TGGGCTCCGA TAAGCTAAAC TTCAACGAGA ATATAAAAGC TGAAAAGATT CTTGTCAAGA 360 ACTTGTACAA CGACCAATAA GTCTTTCAAG GCATCAGAC ATG TTT TCT Met Phe Ser CCT ATT CTA Pro lle Leu 417 -20 AGT CTG Ser Leu -15 GAA ATT ATT CTC GCT TTG GCT ACT CTC CAA TCA GTC TTT GCG GTT Val 1 468 Glu lle lle Leu Ala -10 Leu Ala Thr Leu Gin -5 Ser Val Phe Ala GAG TTG CAG CAC GTT CTT GGA GTC AAC GAC AGA CCC ΤΛΤ CCT CAG AGG ACA 519 Glu Leu Gin His Val Leu Gly Val Asn Asp Arg Pro Tyr Pro Gin Arg Thr 5 10 15 -54- GAT GAT CAG TAC AAC ATT CTG AGA CAT CTG GGA GGC TTG GGC CCC TAC ATC 570 Asp Asp Gin Tyr Asn lle Leu 25 Arg His Leu Gly Gly 30 Leu Gly Pro Tyr lle 35 20 GGT TAC AAT GGA TGG GGA ATT GCT GCT GAG TCT GAA ATT GAA TCC TGT ACG 621 Gly Tyr Asn Gly Trp Gly lle Ala Ala Glu Ser Glu lle Glu Ser Cys Thr 40 45 50 ATT GAT CAG GCT CAT CTG TTG ATG AGA CAT GGA GAA AGA TAC CCA AGT ACC 672 lle Asp Gin Ala His Leu Leu Met Arg His Gly Glu Arg Tyr Pro Ser Thr 55 60 65 AAT GTG GGG AAA CAA CTA GAA GCT TTG TAC CAG AAA CTA CTA GAT GCT GAT 723 Asn Val Gly Lys Gin Leu Glu Ala Leu Tyr Gin Lys Leu Leu Asp Ala Asp 70 75 80 85 GTG GAA GTC CCT ACA GGA CCA TTG TCT TTC TTT CAA GAC ΤΛΤ GAT TAC TTC 774 Val Glu Val Pro Thr Gly Pro Leu Ser Phe Phe Gin Asp Tyr Asp Tyr Phe 90 95 100 GTC TCT GAC GCC GCT TGG TAC GAG CAA GAA ACA ACT AAG GGT TTC TAC TCG 825 Val Ser Asp Ala Ala Trp Tyr Glu Gin Glu Thr Thr Lys Gly Phe Tyr Ser 105 110 115 120 GGG ΤΤΛ AAC ACC GCT TTC GAT TTT GGT ACC ACT TTG AGA GAA CGA ΤΛΤ GAA 876 Gly Leu Asn Thr Ala Phe Asp Phe Gly Thr Thr Leu Arg Glu Arg Tyr Glu 125 130 135 CAT TTG ΑΤΛ AAC AAT AGC GAA GAA GGA AAG ΛΛΛ CTT TCT GTT TGG GCT GGC 927 His Leu lle Asn Asn Ser Glu Glu Gly Lys Lys Leu Ser Val Trp Ala Gly 140 145 150 TCT CAA GAA AGA GTT GTT GAC AAC GCA AAG TAC TTT GCT CAA GGA TTT ATG 978 Ser Gin Glu Arg Val Val Asp Asn Ala Lys Tyr Phe Ala Gin Gly Phe Met 155 160 165 170 -55 ΛΛΛ TCT AAC TAC ACC GTT ATG GTC GAA GTC GTT GCT CTA GAA GAG GAG ΛΛΑ 1029 Lys Ser Asn Tyr Thr Val Met Val Glu Val Val Ala Leu Glu 185 Glu Glu Lys 175 180 TCC CAG GGA CTC AAC TCT CTA ACG GCT CGA ATT TCA TGT CCA AAC TAT AAC 1080 Ser Gin Gly Leu Asn Ser Leu Thr Ala Arg lle Ser Cys Pro Asn Tyr Asn 190 195 200 205 AGC CAT ATC TAC ΑΑΛ GAT GGC GAC TTG GGG AAT GAC ATT GCT CAA AGA GAA 1131 Ser His lle Tyr Lys Asp Gly Asp Leu Gly Asn Asp lle Ala Gin Arg Glu 210 215 220 GCT GAC AGA TTG AAC ACT CTT TCT CCA GGA TTT AAC ATT ACT GCA GAT GAT 1182 Ala Asp Arg Leu Asn Thr Leu Ser Pro Gly Phe Asn lle Thr Ala Asp Asp 225 230 235 ATT CCA ACA ATT GCC CTA TAC TGT GGC TTT GAA CTA AAT GTA AGA GGT GAG 1233 lle Pro Thr lle Ala Leu Tyr Cys Gly Phe Glu Leu Asn Val Arg Gly Glu 240 245 250 255 TCA TCC TTC TGT GAC GTC TTG TCA AGA GAG GCT CTA CTG TAC ACT GCT TAT 1284 Ser Ser Phe Cys Asp Val Leu Ser Arg Glu Ala Leu Leu Tyr Thr Ala Tyr 260 265 270 CTT AGA GAT TTG GGA TGG TAT TAC ΛΑΤ GTT GGA AAC GGG AAC CCA CTT GGA 1335 Leu Arg Asp Leu Gly Trp Tyr Tyr Asn Val Gly Asn Gly Asn Pro Leu Gly 275 280 285 290 AAG ACA ATC GGC TAC GTC TAT GCC AAC GCC ACA AGA CAG CTG TTG GAA AAC 1386 Lys Thr lle Gly Tyr Val Tyr Ala Asn Ala Thr Arg Gin Leu Leu Glu Asn 295 300 305 ACA GAA GCT GAT CCT AGA GAT TAT CCT TTG TAC TTT TCC TTT AGT CAT GAT 1437 Thr Glu Ala Asp Pro Arg Asp Tyr Pro Leu Tyr Phe Ser Phe Ser His Asp 310 315 320 -5ó- ACC GAT CTG CTT CAA Thr Asp Leu Leu Gin GTA TTC ACT TCA CTC GGT CTT TTC AAC GTG AGA GAT 1488 Val Phe 330 Thr Ser Leu Gly Leu Phe Asn Val Thr Asp 325 335 340 CTG CCA ΤΤΛ GAC CAG λττ CAA TTC CAG ACC TCT TTC AAA TCT ACC GAA ATA 1539 Leu Pro Leu Asp Gin 345 lle Gin Phe Gin Thr Ser 350 Phe Lys Ser Thr Glu lle 355 GTT CCC ATG GGA GCA AGA TTG CTT ACC GAG AGA TTA TTG TGT ACT GTT GAA 1590 Val Pro Met Gly Ala 360 Arg Leu Leu Thr Glu Arg 365 Leu Leu Cys Thr Val Glu 370 GGT GAA GAA AAA TAC TAC GTT AGA ACT ATC CTC AAC GAT GCA GTC TTC CCA 1641 Gly 375 Glu Glu Lys Tyr Tyr 380 Val Arg Thr lle Leu 385 Asn Asp Ala Val Phe Pro 390 CTG AGT GAC TGT TCC TCT GGC CCT GGA TTC TCT TGT CCG TTG AAC GAT TAT 1692 Leu Ser Asp Cys Ser 395 Ser Gly Pro Gly Phe Ser 400 Cys Pro Leu Asn Asp Tyr 405 GTT TCT AGA CTT GAG GCA TTG AAC GAG GAC AGT GAC TTT GCG GAA AAC TGT 1743 Val Ser Arg Leu Glu 410 Ala Leu 415 Asn Glu Asp Ser Asp 420 Phe Ala Glu Asn Cys 425 GGA GTT CCT AAA AAT GCT TCC TAC CCA CTT GAA CTA TCA TTC TTC TGG GAT 1794 Gly Val Pro Lys Asn 430 Ala Ser Tyr Pro Leu Glu 435 Leu Ser Phe Phe Trp Asp 440 GAC TTG TCA TAAAAATGGT AAGGAATGTT TTGCATCAGA TACGAGTTCA AAACGATTAA 1853

Asp Leu Ser445 GAAGAGAATG CTCTTTTTTT TGTTTCTATC CAATTGGACT ATTTTCGTTT ΛΤΤΤΤΑΛΛΤΑ 1913 GCGTACAACT TTAACTAGAT GATATCTTCT TCTTCAAACG ATACCACTTC TCTCATACTA 1973 -57- GGTGGAGGTT CAATGGATCC 1993 2/ Informace oro sokv.id.č.2:i/ Charakteristiky sekvence: /A/ délka: 400 bp /3/ tvp: nukleová kyselina /C/ řetězec: jeden /D/ tooologie: lineární ii/ typ molekuly: genomová DMAXi/ označení sekvence: sekv.id.č.2: GGATCCCTAT TGTTACTTTT GCTTAACATT CCAATATTCT TCAACGGTTA ATTGATTAAC 60 ACTGTAACCT CTGCCCATGT GCTTCATCCA AATCTGGTAA TCTGCTTTCT ATTTCTGCCA 120 AAATAGTTAA TCTATGAGAC ATGTGCCCTC AATTGCGCAG TAGATCGAGT GGAAGTCTTC 180 TTTGCGTAAC ACTCAAAGTA TATCCCTGTT AGTCTTTATT CACCTGTTGC TGCATTGGTG 240 TCAGTTACCA TTATTGTTTC CACTTGGAAA AGCTTGTTTT TTTTTGATAG CACAGAAACG 300 TGGGCTCCGA TAAGCTAAAC TTCAACGAGA ATATAAAAGC TGAAAAGATT CTTGTCAAGA 360 ACTTGTACAA CGACCAATAA GTCTTTCAAG GCATCAGAC 399 -58- 2/ Informace pro sekv.id.č.3 ’ i/ Charakteristiky sekvence: /A/ délko: 65 bp /3/ typ: nukleovó kyselina /€/ řetězec: jeden /Ώ/ topologie: lineární

ii/ tvp molekuly: genomová DNA xi/ označení sekvence: sekv.id.č.3: ATG TTT TCT CCT ATT CTA 18Met Phe Ser Pro lle Leu -20 AGT CTG GAA ATT ATT CTC GCT TTG GCT ACT CTC CAA TCA GTC TTT GCGSer Leu Glu lle lle Leu Ala Leu Ala Thr Leu Gin Ser Val Phe Ala 66 -15 -10 -5 v 2/ Informace pro sekvenci id.č.4. i/ Charakteristiky sekvence:/A/ délka·* 1341 bp/3/ typ: nukleová kyselina/C/ řetězec: jeden/D/ topologie: lineární

ii/ typ molekulv: genomová DNA -60- xi/ označení sekvence: sekv.id.č.4: GTT 3Val1 GAG TTG CAG CAC GTT CTT GGA GTC AAC GAC AGA CCC TAT CCT CAG AGG ACA 54 Glu Leu Gin His Val Leu Gly Val Asn 10 Asp Arg Pro Tyr Pro Gin 15 Arg Thr 5 GAT GAT CAG TAC AAC ATT CTG AGA CAT CTG GGA GGC TTG GGC CCC TAC ATC 105 Asp Asp Gin Tyr Asn lle Leu Arg His Leu Gly Gly Leu Gly Pro Tyr lle 20 25 30 35 GGT TAC AAT GGA TGG GGA ATT GCT GCT GAG TCT GAA ATT GAA TCC TGT ACG 156 Gly Tyr Asn Gly Trp Gly lle Ala Ala Glu Ser Glu lle Glu Ser Cys Thr 40 45 50 ATT GAT CAG GCT CAT CTG TTG ATG AGA CAT GGA GAA AGA TAC CCA AGT ACC 207 lle Asp Gin Ala His Leu Leu Met Arg His Gly Glu Arg Tyr Pro Ser Thr 55 60 65 AAT GTG GGG AAA CAA CTA GAA GCT TTG TAC CAG AAA CTA CTA GAT GCT GAT 258 Asn Val Gly Lys Gin Leu Glu Ala Leu Tyr Gin Lys Leu Leu Asp Ala Asp 70 75 80 85 GTG GAA GTC CCT ACA GGA CCA TTG TCT TTC TTT CAA GAC TAT GAT TAC TTC 309 Val Glu Val Pro Thr Gly Pro Leu Ser Phe Phe Gin Asp Tyr Asp Tyr Phe 90 95 100 GTC TCT GAC GCC GCT TGG TAC GAG CAA GAA ACA ACT AAG GGT TTC TAC TCG 360 Val Ser Asp Ala Ala Trp Tyr Glu Gin Glu Thr Thr Lys Gly Phe Tyr Ser 105 110 115 120 -61- GGG Gly TTA AAC ACC Thr GCT TTC GAT TTT GGT ACC ACT TTG AGA GAA CGA TAT GAA Glu 411 Leu Asn Ala 125 Phe Asp Phe Gly Thr 130 Thr Leu Arg Glu Arg Tyr 135 CAT TTG ATA AAC AAT AGC GAA GAA GGA AAG AAA CTT TCT GTT TGG GCT GGC 462 His Leu lle Asn Asn Ser Glu Glu Gly Lys Lys Leu Ser Val Trp Ala Gly 140 145 150 TCT CAA GAA AGA GTT GTT GAC AAC GCA AAG TAC TTT GCT CAA GGA TTT ATG 513 Ser Gin Glu Arg Val Val Asp Asn Ala Lys Tyr Phe Ala Gin Gly Phe Met 155 160 165 170 AAA TCT AAC TAC ACC GTT ATG GTC GAA GTC GTT GCT CTA GAA GAG GAG AAA 564 Lys Ser Asn Tyr Thr Val Met Val Glu Val Val Ala Leu Glu Glu Glu Lys 175 180 185 TCC CAG GGA CTC AAC TCT CTA ACG GCT CGA ATT TCA TGT CCA AAC TAT AAC 615 Ser Gin Gly Leu Asn Ser Leu Thr Ala Arg lle Ser Cys Pro Asn Tyr Asn 190 195 200 205 AGC CAT ATC TAC AAA GAT GGC GAC TTG GGG AAT GAC ATT GCT CAA AGA GAA 666 Ser His lle Tyr Lys Asp Gly Asp Leu Gly Asn Asp lle Ala Gin Arg Glu 210 215 220 GCT GAC AGA TTG AAC ACT CTT TCT CCA GGA TTT AAC ATT ACT GCA GAT GAT 717 Ala Asp Arg Leu Asn Thr Leu Ser Pro Gly Phe Asn lle Thr Ala Asp Asp 225 230 235 ATT CCA ACA ATT GCC CTA TAC TGT GGC TTT GAA CTA AAT GTA AGA GGT GAG 768 lle Pro Thr lle Ala Leu Tyr Cys Gly Phe Glu Leu Asn Val Arg Gly Glu 240 245 250 255 TCA TCC TTC TGT GAC GTC TTG TCA AGA GAG GCT CTA CTG TAC ACT GCT TAT 819 Ser Ser Phe Cys Asp Val Leu Ser Arg Glu Ala Leu Leu Tyr Thr Ala Tyr 260 265 270 -62- CTT AGA GAT TTG GGA TGG TAT TAC ΛΛΤ GTT GGA AAC GGG AAC CCA CTT GGA 870 Leu Arg Asp Leu Gly Trp Tyr 280 Tyr Asn Val Gly Asn 285 Gly Asn Pro Leu Gly 290 275 AAG ACA ATC GGC TAC GTC TAT GCC AAC GCC ACA AGA CAG CTG TTG GAA AAC 921 Lys Thr lle Gly Tyr Val Tyr Ala Asn Ala Thr Arg Gin Leu Leu Glu Asn 295 300 305 ACA GAA GCT GAT CCT AGA GAT TAT CCT TTG TAC TTT TCC TTT AGT CAT GAT 972 Thr Glu Ala Asp Pro Arg Asp Tyr Pro Leu Tyr Phe Ser Phe Ser His Asp 310 315 320 ACC GAT CTG CTT CAA GTA TTC ACT TCA CTC GGT CTT TTC AAC GTG ACA GAT 1023 Thr Asp Leu Leu Gin Val Phe Thr Ser Leu Gly Leu Phe Asn Val Thr Asp 325 330 335 340 CTG CCA TTA GAC CAG ATT CAA TTC CAG ACC TCT TTC AAA TCT ACC GAA ATA 1074 Leu Pro Leu Asp Gin lle Gin Phe Gin Thr Ser Phe Lys Ser Thr Glu lle 345 350 355 GTT CCC ATG GGA GCA AGA TTG CTT ACC GAG AGA TTA TTG TGT ACT GTT GAA 1125 Val Pro Met Gly Ala Arg Leu Leu Thr Glu Arg Leu Leu Cys Thr Val Glu 360 365 370 GGT GAA GAA AAA TAC TAC GTT AGA ACT ATC CTC AAC GAT GCA GTC TTC CCA 1176 Gly Glu Glu Lys Tyt Tyr Val Arg Thr lle Leu Asn Asp Ala Val Phe Pro 375 380 385 390 CTG AGT GAC TGT TCC TCT GGC CCT GGA TTC TCT TGT CCG TTG AAC GAT TAT 1227 Leu Ser Asp Cys Ser Ser Gly Pro Gly Phe Ser Cys Pro Leu Asn Asp Tyt 395 400 405 GTT TCT AGA CTT GAG GCA TTG AAC GAG GAC AGT GAC TTT GCG GAA AAC TGT 1278 Val Ser Arg Leu Glu Ala Leu Asn Glu Asp Ser Asp Phe Ala Glu Asn Cys 410 415 420 425 -63- GGA GTT CCT AAA AAT GCT TCC TAC CCA CTT GAA CTA TCA TTC TTC TGG GAT 1329 Gly Val Pro Lys Asn Ala Ser Tyr Pro Leu Glu Leu Ser Phe Phe Trp Asp 430 435 440 GAC TTG TCA TAA 1341 Asp Leu Ser 445 -64- 2/ Informace pro sekvenci id.č.5:i/ Charakteristiky sekvence: /A/ délka: 1 37 bp /3/ typ: nukleová kyselina /C/ řetězec : jeden /Ώ/ topologie: lineární

ii/ typ molekuly: genomová DNA xi/ označení sekvence: sekv.id.č. 5: AAATGGTAAG GAATGTTTTG CATCAGATAC GAGTTCAAAA CGATTAAGAA GAGAATGCTC 60 TTTTTTTTGT TTCTATCCAA TTGGACTATT TTCGTTTATT TTAAATAGCG TACAACTTTA 120 ACTAGATGAT ATCTTCTTCT TCAAACGATA CCACTTCTCT CATACTAGGT GGAGGTTCAA 180 TGGATCC 187

Claims (35)

PATENTOVÉ NÁROKY

1 . Izolovaný DNA fragment, obsahující gen kyselé fosfatázy Pichia pastoris /sekv.id.č.:!/.

2. DNA fragment podle nároku 1, kde tento DNA frag-ment má restrikční mapu uvedenou na obr.1 /sekv.id.č.: 1/.

3. DNA fragment podle nároku 1, kde tento DNA fragmentmá následující nukleotidovou sekvenci /sekv.id.č.:!/: BamHI -390 -370 -350 GGATCCCTATTGTTACTTTTGCTTAACATTCCAATATTCTTCAACGGTTAATTGATTAAC -330 -310 -290 ACTGTAACCTCTGCCCATGTGCTTCATCCAAATCTGGTAATCTGCTTTCTATTTCTGCCA -270 -250 -230 AAATAGTTAATCTATGAGACATGTGCCCTCAATTGCGCAGTAGATCGAGTGGAAGTCTTC -210 -190 -170 TTTGCGTAACACTCAAAGTATATCCCTGTTAGTCTTTATTCACCTGTTGCTGCATTGGTG -150 -130 -110 TCAGTTACCATTATTGTTTCCACTTGGAAAAGCTTGTTTTTTTTTGATAGCACAGAAACG -90 -70 -50 TGGGCTCCGATAAGCTAAACTTCAACGAGAATATAAAAGCTGAAAAGATTCTTGTCAAGA -30 -10 10 ACTTGTACAACGACCAATAAGTCTTTCAAGGCATCAGACATGTTTTCTCCTATTCTAAGT MetPheSerProlleLeuSer 30 50 70 CTGGAAATTATTCTCGCTTTGGCTACTCTCCAATCAGTCTTTGCGGTTGAGTTGCAGCACLeuGlullelleLeuAlaLeuAlaThrLeuGlnSerValPheAlaValGluLeuGlnHis 90 110 Bell 130 GTTCTTGGAGTCAACGACAGACCCTATCCTCAGAGGACAGATGATCAGTACAACATTCTGValLeuGlyValAsnAspArgProTyrProGlnArgThrAspAspGlnTyrAsnlleLeu 150 . 170 190 AGACATCTGGGAGGCTTGGGCCCCTACATCGGTTACAATGGATGGGGAATTGCTGCTGAGArgHísLeuGlyGlyLeuGlyPRoTyrlleGlyTyrAsnGlyTrpGlyIleAlaAlaGlu -66- 210 230 250 TCTGAAATTGAATCCTGTACGATTGATCAGGCTCATCTGTTGATGAGACATGGAGAAAGA 'SerGlulleGluSerCysThrlleAspGlnAlaHisLeuLeuMetArgHisGlyGluArg 270 290 310 TACCCAAGTACCAATGTGGGGAAACAACTAGAAGCTTTGTACCAGAAACTACTAGATGCTTyrProSerThrAsnValGlyLysGlnLeuGluAlaLeuTyrGlnLysLeuLeuAspAla 330 350 370 GATGTGGAAGTCCCTACAGGACCATTGTCTTTCTTTCAAGACTATGATTACTTCGTCTCTAspValGluValProThrGlyProLeuSerPhePheGlnAspTyrAspTyrPheValSer 390 410 430 GACGCCGCTTGGTACGAGCAAGAAACAACTAAGGGTTTCTACTCGGGGTTAAACACCGCTAspAlaAlaTrpTyrGluGInGluThrThrLysGlyPheTyrSerGlyLeuAsnThrAla 450 470 490 TTCGATTTTGGTACCACTTTGAGAGAACGATATGAACATTTGATAAACAATAGCGAAGAAPheAspPheGlyThrThrLeuArgGluArgTyrGluHlsLeulleAsnAsnSerGluGlu 510 530 550 GGAAAGAAAČTTTCTGTTTGGGCTGGCTCTCAAGAAAGAGTTGTTGACAACGCAAAGTACGlyLysLysLeuSerValTrpAlaGlySerGlnGluArgValValAspAsnAlaLysTyr 570 590 610 TTTGCTCAAGGATTTATGAAATCTAACTACACCGTTATGGTCGAAGTCGTTGCTCTAGAAPheAlaGlnGlyPheMetLysSerAsnTyrThrValMetValGluValValAlaLeuGlu 630 650 670 GAGGAGAAATCCCAGGGACTCAACTCTCTAACGGCTCGAATTTCATGTCCAAACTATAACGluGluLysSerGlnGlyLeuAsnSerLeuThrAlaArglleSerCysProAsnTyrAsn 690 710 730 AGCCATATCTACAAAGATGGCGACTTGGGGAATGACATTGCTCAAAGAGAAGCTGACAGASerHlslleTyrLysAspGlyAspLeuGlyAsnAsplleAlaGinArgGluAlaAspArg 750 770 790 TTGAACACTCTTTCTCCAGGATTTAACATTACTGCAGATGATATTCCAACAATTGCCCTALeuAsnThrLeuSerProGlyPheAsnlleThrAlaAspAsplleProThrlleAlaLeu 810 830 850 TACTGTGGCTTTGAACTAAATGTAAGAGGTGAGTCATCCTTCTGTGACGTCTTGTCAAGATyrCysGlyPheGluLeuAsnValArgGlyGluSerSerPheCysAspValLeuSerArg 870 890 910 GAGGCTCTACTGTACACTGCTTATCTTAGAGATTTGGGATGGTATTACAATGTTGGAAACGluAlaLeuLeuTyrThrAlaTyrLeuArgAspLeuGlyTrpTyrTyrAsnValGlyAsn 930 950 970 GGGAACCCACTTGGAAAGACAATCGGCTACGTCTATGCCAACGCCACAAGACAGCTGTTGGlyAsnProLeuGlyLysThrlleGlyTyrValTyrAlaAsnAlaThrArgGinLeuLeu -67- 990 1010 1030 GAAAACACAGAAGCTGATCCTAGAGATTATCCTTTGTACTTTTCCTTTAGTCATGATACCGluAsnTh rGluAlaAspProArgAspTyrProLeuTyrPheSerPheSerHisAspThr 1050 1070 1090 GATCTGCTTCAAGTATTCACTTCACTCGGTCTTTTCAACGTGACAGATCTGCCATTAGACAspLeuLeuGinValPheThrSerLeuGlyLeuPheAsnValThrAspLeuProLeuAsp 1110 1130 Ncol CAGATTCAATTCCAGACCTCTTTCAAATCTACCGAAATAGTTCCCATGGGAGCAAGATTGGinlleGinPheGinThrSerPheLysSerThrGlulleValProMetGlyAlaArgLeu 1170 1190 1210 CTTACCGAGAGATTATTGTGTACTGTTGAAGGTGAAGAAAAATACTACGTTAGAACTATCLeuThrGluArgLeuLeuCysThrValGluGlyGluGluLysTyrTyrValArgThrlle 1230 1250 1270 CTCAACGATGCAGTCTTCCCACTGAGTGACTGTTCCTCTGGCCCTGGATTCTCTTGTCCGLeuAsnAspAlaValPheProLeuSerAspCysSerSerGlyProGlyPheSerCysPro ' 1290 1310 1330 TTGAACGATTATGTTTCTAGACTTGAGGCATTGAACGAGGACAGTGACTTTGCGGAAAACLeuAsnAspTyrValSerArgLeuGluAlaLeuAsnGluAspSerAspPheAlaGluAsn 1350 1370 1390 TGTGGAGTTCCTAAAAATGCTTCCTACCCACTTGAACTATCATTCTTCTGGGATGACTTGCysGlyValProLysAsnAlaSerTyrProLeuGluLeuSerPhePheTrpAspAspLeu 1410 1430 1450 TCATAAAAATGGTAAGGAATGTTTTGCATCAGATACGAGTTCAAAACGATTAAGAAGAGASerEnd 1470 1490 1510 ATGCTCTTTTTTTTGTTTCTATCCAATTGGACTATTTTCGTTTATTTTAAATAGCGTACA 1530 1550 1570 ACTTTAACTAGATGATATCTTCTTCTTCAAACGATACCACTTCTCTCATACTAGGTGGAG BamHI GTTCAATGGATCC Ol

4. Izolovaný DNA fragment, obsahující 5'regulační oblast /sekv.id.č . :2/ kyselé fosfatázy Pichia psstoris.

DNA fragment podle nároku 4, kde tento fragment má restrikční mapu uvedenou na obr.1 /sekv.id.č.:2/.

6. DNA fragment podle nároku 4, kde tento DNA frag-ment má následující nukleotidovou sekvenci /sekv.id.č.2/: -68- BamHI -390 -370 -350 ggatccctattgttacttttgcttaacattccaatattcttcaacggttaattgattaac -330 -310 -290 ACTGTAACCTCTGCCCATGTGCTTCATCCAAATCTGGTAATCTGCTTTCTATTTCTGCCA -270 -250 -230 AAATAGTTAATCTATGAGACATGTGCCCTCAATTGCGCAGTAGATCGAGTGGAAGTCTTC -210 -190 -170 TTTGCGTAACACTCAAAGTATATCCCTGTTAGTCTTTATTCACCTGTTGCTGCATTGGTG -150 -130 -110 TCAGTTACCATTATTGTTTCCACTTGGAAAAGCTTGTTTTTTTTTGATAGCACAGAAACG -90 -70 -50 TGGGCTCCGATAAGCTAAACTTCAACGAGAATATAAAAGCTGAAAAGATTCTTGTCAAGA -30 -10 ACTTGTACAACGACCAATAAGTCTTTCAAGGCATCAGAC -69-

7. DNA fragment podle nároku 4, kde tento DNA frag-ment je operabilně připojen k heterologní DNA sekvenci,která kóduje ptlespoň jeden polypeptid.

8. DNA fragment podle nároku 7, kde tento hetero-logní DNA sekvence kóduje aktivátor tkáňového plasminogenu.

S. Izolovaný DNA fragment, obsahující signální sek- venci kyselé fosfatázy Pichia pastoris /sekv.id.č.3/·

10. DNA fragment podle nároku 9, kde tento DNA frag-ment má restrikční mapu uvedenou na obr.1 /sek.id.č.3/·

11. DNA fragment podle nároku 9, kde tento DNA frag-ment má následující nukleotidovou sekvenci /sekv.id.č.3/í 10 ATGTTTTCTCCT ATTCT AAGTPHO1 signální sekvenee— MetPheSerProIleLeuSer 30 50 CTGGAAATTATTCTGGCTTTGGCT JCTCTCG AATG A3TCTTTGCG LeuGluIleIIeLeu AL aLeu AI aThrLeuGlnSerValPhe AI a

12. DN3. fragment podle nároku 9, kde tento DNAfragment je operabilně připojen k heterologní DNA sekvenci,která kóduje alespoň jéden polypeptid.

13* DNA fragment podle nároku 12, kde uvedená heterolog-ní DNA sekvence kóduje aktivátor tkáňového plasminogenu.

14. Způsob sekrece proteinu z eukaryotické buňky,vyznačující se tím, že tato sekrece jeřízena přítomností signální sekvence z genu kyselé fos-fatázy Pichia pastoris /sekv.id.č.3/. -70-

15. Způsob podle nároku 14,v yznačujícíse t í m, že uvedenou eukaryotickou buňkou je kvasin-ková buňka.

16. Způsob podle nároku 15, vyznačujícíse tím, že uvedenou kvasinkou je Pichia pa;storis.

17. Způsob podle nároku 16,vyznačujícíse t í m, že uvedeným proteinem je aktivátor tkáňové-ho plasminogenu.

18. Izolovaný DNA fragment, obsahující strukturálnígen kyselé fosfatázy Pichia pastoris /sekv.id.č.4/.

19. DNA fragment podle nároku 18, kde uvedený DNAfragment má restrikční mapu uvedenou na obr.1 /sekv.id.č.4/. -71-

20. DNA fragment podle nároku 18, kde tento DNA frag- ment má následující nukleotidovou sekvenci /sekv.id.δ.:4/: 70 GTTGAGTTGCAGCAC ValGluLeuGlnHis 90 110 Bell 130 GTTCTTGGAGTCAACGACAGACCCTATCCTCAGAGGACAGATGATCAGTACAACATTCTGValLeuGlyValAsnAspArgProTyrProGlnArgThrAspAspGlnTyrAsnlleLeu 150 170 190 AGACATCTGGGAGGCTTGGGCCCCTACATCGGTTACAATGGATGGGGAATTGCTGCTGAGArgHisLeuGlyGlyLeuGlyPRoTyrlleGlyTyrAsnGlyTrpGlylleAlaAlaGlu 210 230 250 TCTGAAATTGAATCCTGTACGATTGATCAGGCTCATCTGTTGATGAGACATGGAGAAAGASerGlulleGluSerCysThrlleAspGlnAlaHisLeuLeuMetArgHisGlyGluArg 270 290 310 TACCCAAGTACCAATGTGGGGAAACAACTAGAAGCTTTGTACCAGAAACTACTAGATGCTTyrProSerThrAsnVa1G lyLysG lnLeuG luA laLeuTy rG lnLy sLeuLeuAspA la 330 350 370 GATGTGGAAGTCCCTACAGGACCATTGTCTTTCTTTCAAGACTATGATTACTTCGTCTCTAspValGluValProThrGlyProLeuSerPhePheGlnAspTyrAspTyrPheValSer 390 410 430 GACGCCGCTTGGTACGAGCAAGAAACAACTAAGGGTTTCTACTCGGGGTTAAACACCGCTAspAlaAlaTrpTyrGluGlnGluThrThrLysGlyPheTyrSerGlyLeuAsnThrAla 450 470 490 TTCGATTTTGGTACCAGTTTGAGAGAACGATATGAACATTTGATAAACAATAGCGAAGAAPheAspPheGlyThrThrLeuArgGluArgTyrGluHlsLeulleAsnAsnSerGluGlu 510 '530 550 GGAAAGAAACTTTCTGTTTGGGCTGGCTCTCAAGAAAGAGTTGTTGACAACGCAAAGTACGlyLysLysLeuSerValTrpAlaGlySerGlnGluArgValValAspAsnAlaLysTyr 570 590 610 TTTGCTCAAGGATTTATGAAATCTAACTACACCGTTATGGTCGAAGTCGTTGCTCTAGAAPheAlaGlnGlyPheMetLysSerAsnTyrThrValMetVaIGluValValAlaLeuGlu 630 650 670 GAGGAGAAATCCCAGGGACTCAACTCTCTAACGGCTCGAATTTCATGTCCAAACTATAACGluGluLysSerGlnGlyLeuAsnSerLeuThrAlaArglleSerCysProAsnTyrAsn -72- 690 710 730 AGCCATATCTACAAAGATGGCGACTTGGGGAATGACATTGCTCAAAGAGAAGCTGACAGASerHlslleTyrLysAspGlyAspLeuGlyAsnAsplleAlaGinArgGluAlaAspArg 750 770 790 TTGAACACTCTTTCTCCAGGATTTAACATTACTGCAGATGATATTCCAACAATTGCCCTALeuAsnThrLeuSerProGlyPheAsnlleThrAlaAspAsplleProThrlleAlaLeu 810 830 850 TACTGTGGCTTTGAACTAAATGTAAGAGGTGAGTCATCCTTCTGTGACGTCTTGTCAAGATyrCysGlyPheGluLeuAsnValArgGlyGluSerSerPheCysAspValLeuSerArg 870 890 910 GAGGCTCTACTGTACACTGCTTATCTTAGAGATTTGGGATGGTATTACAATGTTGGAAACGluAlaLeuLeuTyrThrAlaTyrLeuArgAspLeuGlyTrpTyrTyrAsnValGlyAsn 930 950 970 GGGAACCCACTTGGAAAGACAATCGGCTACGTCTATGCCAACGCCACAAGACAGCTGTTGGlyAsnProLeuGlyLysThrlleGlyTyrValTyrAlaAsnAlaThrArgGinLeuLeu 990 1010 1030 GAAAACACAGAAGCTGATCCTAGAGATTATCCTTTGTACTTTTCCTTTAGTCATGATACCGluAsnThrGluAlaAspProArgAspTyrProLeuTyrPheSerPheSerHisAspThr 1050 1070 1090 GATCTGCTTCAAGTATTCAGTTCACTCGGTCTTTTCAACGTGACAGATCTGCCATTAGACAspLeuLeuGínValPheThrSerLeuGlyLeuPheAsnValThrAspLeuProLeuAsp 1110 1130 Ncol CAGATTCAATTCCAGACCTCTTTCAAATCTACCGAAATAGTTCCCATGGGAGCAAGATTGGinlleGinPheGinThrSerPheLysSerThrGlulleValProMetGlyAlaArgLeu 1170 1190 1210 CTTACCGAGAGATTATTGTGTACTGTTGAAGGTGAAGAAAAATACTACGTTAGAACTATCLeuThrGluArgLeuLeuCysThrValGluGlyGluGluLysTyrTyrValArgThrlle 1230 1250 1270 CTCAACGATGCAGTCTTCCCACTGAGTGACTGTTCCTCTGGCCCTGGATTCTCTTGTCCGLeuAsnAspAlaValPheProLeuSerAspCysŠerSerGlyProGlyPheSerCysPro 1290 1310 1330 TTGAACGATTATGTTTCTAGACTTGAGGCATTGAACGAGGACAGTGACTTTGCGGAAAACLeuAsnAspTyrValSerArgLeuGluAlaLeuAsnGluAspSerAspPheAlaGluAsn 1350 1370 1390 TGTGGAGTTCCTAAAAATGCTTCCTACCCACTTGAACTATCATTCTTCTGGGATGACTTGCysGlyValProLysAsnAlaSerTyrProLeuGluLeuSerPhePheTrpAspAspLeu TCATAA SerEnd -73-

21. Izolovaný DNA fragment, obsahující 3*$ranskripč-ní terminační sekvenci kyselé fosfatázy Pichia pastoris/sekv.id.č.5/.

22. DNA fragment podle nároku 21, kde uvedený DNAfragment má restrikční mapu uvedenou na obr.1 /sekv.id.č.5/.

23· DNA fragment podle nároku 21, kde uvedený DNAfragment má následující nukleotidovou sekvenci /sekv.id.č.5/: 1410 1430 1450 AAATGGT AADG AATGTTTGC ATC AI ATACG AGTTC AAAA2G ATT AAG AAG AG A 1470 1490 1510 ATGCTCTTTTTTTTGTTTCT ATCC AATTGG ATT AFTTTCGTTT ΑΓΤΤΤ ΑΑΑΓ AGCGT AT A 1530 1550 1570 ACTTT A ATT AG ATG AI ATCTTCTTCTTC AAATG AT JCC AT TTCTCTC AT ATT AGGTGG AG BamHI GTTCAATGGATCC

24. Plasmid pLP24.

25. PÍ Plasmid pT37.

26. Způsob aktivace regulační oblasti kyselé fosfatá-zy získané z genu kyselé foafatázy Pichia pastoris prousnadnění exprese heterologní DNA sekvence, která kódujealespoň jeden polypeptud, vyznačující se v t í m, že zahrnuje kontakt vhodné hostitelské buňky,která má být transformována, s 5*regulační oblastí kyse-lé fosfatázy, operabilně připojenou k heterologní DNAsekvenci, s mediem, ve kterém bude na expresi působitkoncentrace fosfátu. -74-

27. Způsob podle nároku 26,vyznačující se t í m, že uvedenou hostitelskou buňkou je Pichia pastoris.

28. Způsob podle nároku 26,v yznačující se t í m, že uvedená heterologní DNA dále obsahuje operabilněk ní připojenou signální sekvenci.

29. Způsob podle nároku 28, vyznačující se t í m, že uvedená signální sekvence je signální sekvence kyselé fosfatázy Pichia pastoris /sekv.id.č.3/·

30. Izolovaný DNA fragment, obsahující signální sekvenci kyselé fosfatázy Pichia pastoris /sekv.id.č.3/operabilně připojenou k 5 regulační oblasti.

31. DNA fragment podle nároku 30, kde uvedená 5* regulační oblast je 5'regulační oblast kyselé fosfatázyPichia pastoris /sek.id.č.2/.

32. DNA fragment podle nároku 30, kde; uvedenou 5*regulační oblastí je 5'regulační oblast alkohol oxidázy/AOX1/ Pichia pastoris.

33« DNA fragment podle nároku 30, kde tento DNA fragment je operabilně připojen k heterologní SNA sekvenci, v která kóduje alespoň jeden polypeptid.

34. DNA fragment podle nároku 33, kde uvedená hete-rologní DNA kóduje aktivátor tkáňového plasminogenu.

35. Způsob řízení integrace v lokusu Pichia pasto-ris PHO1,vyznačující se tím, že využíváintegrační vektor, který obsahuje 5'a 3'lemující sek-vence genu PH01 Pichia pastoris. -75- 36t Způsob identifikace transformantů Pichia pastoris,obsahujících expresní vektory integrované v PHO1 lokusu,vyznačující se t í m, ža Pichia pastoris,který byl transformován, se umístí na nízkofosfátovéindikátorové plotny, nechá se růst přes noc a provede sescreening výsledných kolonií na bílou barvu.