ES2866674T3 - Conjugados de una fracción de IL-2 y un polímero - Google Patents
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Abstract
Conjugado que comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho polímeros de poli(etilenglicol) ramificados solubles en agua, unidos covalentemente mediante un enlace de carbamato liberable a un grupo amina de una fracción de interleuquina-2, presentando cada polímero ramificado soluble en agua de poli(etilenglicol) un peso molecular medio en peso total comprendido en un intervalo de entre 500 daltons y 100.000 daltons, en el que, tras la liberación, el polímero ramificado soluble en agua de poli(etilenglicol) se desprende de la fracción interleuquina-2 in vivo sin dejar un fragmento unido a la fracción interleuquina-2, presentando el conjugado la fórmula: **(Ver fórmula)** en el que POLY1 es un primer poli(etilenglicol); POLY2 es un segundo poli(etilenglicol); X1 es una primera fracción espaciadora; X2 es una segunda fracción espaciadora; Hα es un átomo de hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cero o uno, (b) es cero o uno; Re1, en caso de hallarse presente, es un primer grupo alterador de electrones; Re2, en caso de hallarse presente, es un segundo grupo alterador de electrones; Y1 es O; Y2 es O; n es un número entero entre 1 y 8, y (IL-2) es una fracción interleuquina-2 que presenta una secuencia de aminoácidos SEC ID nº 3 o que presenta una identidad de secuencia de 95% o superior respecto a la SEC ID nº 3.
Description
DESCRIPCIÓN
Conjugados de una fracción de IL-2 y un polímero
Campo de la invención
Entre otras cosas, una o más realizaciones de la presente invención se refieren a conjugados que comprenden una fracción de IL-2 (es decir, una fracción que presenta por lo menos alguna actividad similar a la IL-2 humana) y un polímero, tal como se define en los objetivos. Además, la invención se refiere (entre otras cosas) a composiciones que comprenden conjugados, a métodos para sintetizar conjugados y a composiciones farmacéuticas para la utilización en terapia, tal como se define en las reivindicaciones.
Antecedentes de la invención
En seres humanos sanos, el sistema inmunitario puede diferenciar entre células sanas y células cancerosas. Tras identificar una célula dada como cancerosa, el sistema inmunitario típicamente la elimina. De esta manera, cuando el sistema inmunitario falla o resulta superado, pueden desarrollarse cánceres que resultan de la incapacidad de un sistema inmunitario comprometido de diferenciar, y después eliminar, las células de cáncer. En un paciente que sufre de cáncer, la administración de una proteína inmunomoduladora en el paciente puede ayudar a devolver (por lo menos en parte) ese sistema inmunitario del paciente a la normalidad, de manera que vuelva la capacidad de su sistema inmunitario de eliminar células de cáncer. De esta manera, puede retrasarse el cáncer o incluso eliminarse.
Una de dichas proteínas inmunomoduladoras utilizadas en el tratamiento de los pacientes que sufren de determinados cánceres es la interleuquina-2. La interleuquina-2 (IL-2) es una citoquina natural que presenta actividad como estimulante de las células asesinas naturales (células NK) y como inductor de la proliferación de las células T. En forma no glucosilada, IL-2 presenta un peso molecular de aproximadamente 15.300 daltons (aunque se encuentra IL-2 in vivo en formas variablemente glucosiladas).
Un producto de IL-2 recombinante humano no glucosilado disponible comercialmente, la aldesleuquina (disponible como la marca PROLEUKIN® de des-alanil-1, serina-125 interleuquina-2 humana de Prometheus Laboratories, Inc., San Diego, CA) ha sido autorizada para la administración en pacientes que sufren de carcinoma de células renales metastásico y melanoma metastásico. IL-2 también ha sido propuesta para la administración en pacientes que sufre o están infectados por virus de la hepatitis C (VHC), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), leucemia mieloide aguda, linfoma no de Hodgkin, linfoma de células T cutáneo, artritis reumatoide juvenil, dermatitis atópica, cáncer de mama y cáncer de vejiga.
Sin embargo, incluso las dosis recomendadas de aldesleuquina pueden causar efectos secundarios graves, incluyendo el síndrome de fuga capilar (SFC) y el deterioro de la función de los neutrófilos. En vista del potencial de dichos efectos secundarios graves, y debido a que el ciclo de tratamiento recomendado implica la infusión intravenosa durante quince minutos cada ocho horas para catorce dosis, la administración de aldesleuquina se produce dentro de un contexto clínico. Además, la formulación comercial de aldesleuquina incluye la presencia de dodecilsulfato sódico, una sustancia que aparentemente resulta necesaria para mantener la actividad óptima mediante la estabilidad conformacional. Ver Arakawa et al., Int. J. Peptide Protein Res. 43:583-587, 1994.
Se han realizado intentos para resolver los problemas de toxicidad de IL-2. En un enfoque, se han intentado enfoques de formulación. Ver, por ejemplo, la patente US n° 6.706.289 y las solicitudes publicadas de patente internacional n° WO 02/00243 y n° WO 99/60128. En otros enfoques, se han propuesto determinados conjugados de IL-2. Ver, por ejemplo, las patentes US n° 4.766.106, n° 5.206.344, n° 5.089.261 y n° 4.902.502.
La solicitud publicada de patente china n° CN101104077 describe conjugados lineales de monometoxi(polietilenglicol) ("mPEG") de IL-2 en los que mPEG presenta un peso molecular de 5.000 a 40.000 daltons y está unido covalentemente a un grupo amino libre de IL-2 mediante un oligopéptido o conector de aminoácidos estable. La solicitud publicada de patente internacional n° WO 2010/033207 describe péptidos que se modifican químicamente mediante unión covalente de un oligómero soluble en agua. La solicitud publicada de patente US n° 2006/0293499 describe conjugados que presentan un enlace degradable y reactivos poliméricos útiles para la preparación de dichos conjugados.
Sin embargo, a pesar de dichos enfoques, sigue existiendo una necesidad de conjugados de IL-2. Entre otras cosas, por lo tanto, una o más realizaciones de la presente invención están referidas a dichos conjugados, así como a composiciones que comprenden los conjugados, y métodos relacionados, tal como se indica en la presente memoria. Descripción resumida de la invención
La invención se define mediante las reivindicaciones. Cualquier materia comprendida fuera del alcance según las reivindicaciones se proporciona con fines exclusivamente informativos. Cualesquiera referencias en la descripción a
métodos de tratamiento se refieren a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para la utilización en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
La presente invención proporciona un conjugado que comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho polímeros ramificados de poli(etilenglicol) solubles en agua, unidos covalentemente mediante un enlace carbamato liberable a un grupo amino de una fracción de interleuquina-2, en el que cada polímero ramificado de poli(etilenglicol) soluble en agua presenta un peso molecular medio en peso total comprendido en el intervalo de entre 500 daltons y 100.000 daltons,
en el que, tras la liberación, el polímero ramificado de poli(etilenglicol) soluble en agua se desprende de la fracción interleuquina-2 in vivo sin dejar un fragmento unido a la fracción interleuquina-2, en el que el conjugado presenta la fórmula:
en la que POLY1 es un primer poli(etilenglicol); POLY2 es un segundo poli(etilenglicol); X1 es una primera fracción espaciadora; X2 es una segunda fracción espaciadora; Ha es un átomo de hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cero o uno, (b) es cero o uno; Re1, en caso de hallarse presente, es un primer grupo alterador de electrones; Re2, en caso de hallarse presente, es un segundo grupo alterador de electrones; Y1 es O; Y2 es O; n es un número entero entre 1 y 8, y (IL-2) es una fracción interleuquina-2 que presenta una secuencia de aminoácidos SEC ID n° 3 o que presenta una identidad de secuencia de 95% o superior respecto a la SEC ID n° 3.
Según las reivindicaciones, la invención proporciona un conjugado que comprende un residuo de una fracción IL-2 unido covalentemente a un polímero soluble en agua.
Según las reivindicaciones, la invención proporciona un conjugado que comprende un residuo de una fracción IL-2 unido covalentemente a un polímero soluble en agua, en el que el residuo de la fracción IL-2 está unido covalentemente al polímero soluble en agua mediante un enlace liberable.
Según las reivindicaciones, la invención proporciona un conjugado que comprende un residuo de una fracción IL-2 unido covalentemente a un polímero soluble en agua, en el que la fracción IL-2 es una fracción IL-2 no precursora.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 proporciona la secuencia de ADN y secuencia de aminoácidos resultante de un gen descrito adicionalmente en el Ejemplo 1.
La FIG. 2.1 es una representación de un cromatograma típico tras la cromatografía de intercambio catiónico de [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] preparado siguiendo el procedimiento explicado en el Ejemplo 2.
La FIG. 2.2 es una representación de un cromatograma tras el análisis de HPLC de fase inversa de [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2], tal como se indica adicionalmente en el Ejemplo 2.
La FIG. 2.3 es un gráfico del perfil de liberación de diversos conjugados preparados de acuerdo con el procedimiento explicado en el Ejemplo 2.
La FIG. 3.1 es una representación de un cromatograma típico tras la cromatografía de intercambio catiónico de [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] preparado siguiendo el procedimiento explicado en el Ejemplo 3.
La FIG. 3.2 es una representación de un cromatograma tras el análisis de HPLC de fase inversa de [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2], tal como se indica adicionalmente en el Ejemplo 3.
La FIG. 3.3 es una representación de los resultados tras el análisis de MALDI-TOF de los diversos conjugados preparados de acuerdo con los procedimientos explicados en el Ejemplo 3.
La FIG. 4.1 es una representación de un cromatograma típico tras la cromatografía de intercambio catiónico de [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] preparado siguiendo los procedimientos explicados en el Ejemplo 4.
La FIG. 4.2 es una representación de un cromatograma tras el análisis de HPLC de fase inversa de [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2], tal como se indica adicionalmente en el Ejemplo 4.
La FIG. 5 es una representación de un cromatograma tras el análisis de cromatografía de intercambio catiónico de [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2], tal como se indica adicionalmente en el Ejemplo 5.
La FIG. 6 es una representación de un cromatograma tras el análisis de cromatografía de intercambio catiónico de [mPEG2-ru-4K]-[rIL-2], tal como se indica adicionalmente en el Ejemplo 6.
La FIG. 7 muestra un gráfico de la proliferación de las células CTLL-2 en respuesta a aldeslequina y [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] estable, tal como se indica adicionalmente en el Ejemplo 11. Los puntos de datos son medias de un experimento en determinaciones por triplicado. Las barras de error representan errores estándares de la media. La FIG. 8 muestra un gráfico de la proliferación de las células CTLL-2 en respuesta a aldeslequina [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] liberado y no liberado, y [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2], tal como se indica adicionalmente en el Ejemplo 11. Los puntos de datos son medias de un experimento en determinaciones por triplicado. Las barras de error representan errores estándares de la media.
La FIG. 9 muestra un gráfico de las curvas de concentración-tiempo tras una única inyección en ratones, tal como se indica adicionalmente en el Ejemplo 12.
La FIG. 10 muestra un gráfico de la superficie total de lesión (mm2) para varios compuestos de ensayo, tal como se indica adicionalmente en el Ejemplo 13.
La FIG. 11A y la FIG. 11B son gráficos que muestran curvas de tiempo hasta la progresión del tumor para artículos sometidos a ensayo en diversos programas de administración, tal como se indica adicionalmente en el Ejemplo 14.
Descripción detallada de la invención
Antes de describir una o más realizaciones de la presente invención en detalle, debe entenderse que la presente invención no se encuentra limitada al alcance según las reivindicaciones adjuntas.
Debe indicarse que, tal como se utiliza en la presente especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un" o "una" y "el" o "la" incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un polímero" incluye un único polímero además de dos o más del mismo polímero o de polímeros diferentes, y la referencia a "un excipiente opcional" se refiere a un único excipiente opcional, así como a dos o más del mismo excipiente opcional o de diferentes excipientes opcionales.
En la descripción y reivindicación de una o más realizaciones de la presente invención, se utiliza la terminología siguiente de acuerdo con las definiciones indicadas posteriormente.
"PEG", "polietilenglicol" y "poli(etilenglicol)" tal como se utilizan en la presente memoria son intercambiables y comprenden cualquier poli(óxido de etileno) soluble en agua no peptídico. Típicamente, los PEG para la utilización de acuerdo con la invención comprenden la estructura siguiente "-(OCH2CH2)n-", en la que (n) es 2 a 4.000. Tal como se utiliza en la presente memoria, PEG incluye además "-CH2CH2-O(CH2CH2O)n-CH2CH2-" y "-(OCH2CH2)nO-", dependiendo de si se han desplazado o no los oxígenos terminales, p.ej., durante una transformación sintética. En toda la especificación y reivindicaciones, debe recordarse que el término "PEG" incluye estructuras que presentan diversos grupos terminales o "de adición de caperuza terminal", etc. El término "PEG" también se refiere a un polímero que contiene una mayoría, es decir, más de 50% de unidades repetidas de -OCH2CH2-. Con respecto a formas específicas, el PEG puede adoptar cualquiera de entre una diversidad de pesos moleculares, así como estructuras o geometrías, tal como "ramificada", "lineal", "bifurcada" y "multifuncional", que se describen en mayor detalle posteriormente.
Las expresiones "con caperuza terminal" y "cubierto terminalmente" se utilizan intercambiablemente en la presente memoria para referirse a un punto final o terminal de un polímero que presenta una fracción de caperuza terminal. Típicamente, aunque no necesariamente, la fracción de caperuza terminal comprende un hidroxi o grupo alcoxi C1-20, más preferentemente un grupo alcoxi C1-10, y todavía más preferentemente, un grupo alcoxi C1-5. De esta manera, entre los ejemplos de fracciones de caperuza terminal se incluyen alcoxi (p.ej., metoxi, etoxi y benciloxi), así como arilo, heteroarilo, ciclo y heterociclo. Debe recordarse que la fracción de caperuza terminal puede incluir uno o más átomos del monómero terminal en el polímero [p.ej., la fracción de caperuza terminal "metoxi" en CH3O(CH2CH2O)ny CH3(OCH2CH2)n-]. Adicionalmente, se encuentran contempladas formas sustituidas y no sustituidas, saturadas e insaturadas de cada uno de los anteriores. Además, el grupo de caperuza terminal también puede ser un silano. El grupo de caperuza terminal también puede comprender ventajosamente un marcaje detectable. En el caso de que el polímero presente un grupo de caperuza terminal que comprende un marcaje detectable, la cantidad o localización del polímero y/o de la fracción (p.ej., el agente activo) con el que se acopla el polímero puede determinarse mediante la utilización de un detector adecuado. Entre dichos marcajes se incluyen, aunque sin limitación, compuestos fluorescentes, quimioluminiscentes, fracciones utilizadas en el marcaje enzimático, colorimétrico (p.ej., pigmentos), iones metálicos y fracciones radioactivas. Entre los detectores adecuados se incluyen fotómetros, películas y espectrómetros. El grupo de caperuza terminal también puede comprender ventajosamente un fosfolípido. En el caso de que el polímero presente un grupo de caperuza terminal que comprende un fosfolípido, se proporcionan propiedades únicas al polímero y conjugado resultante. Entre los fosfolípidos ejemplares se incluyen, aunque sin limitación, los seleccionados de la clase de fosfolípidos denominada fosfatidilcolinas. Entre los fosfolípidos específicos se incluyen, aunque sin limitación, los seleccionados del grupo que consiste en dilauroilfosfatidilcolina, dioleilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, diesteroilfosfatidilcolina, behenoilfosfatidilcolina, araquidoilfosfatidilcolina y lecitina. El grupo de caperuza terminal puede incluir además una fracción de direccionamiento, de manera que el polímero (así como cualquier grupo, p.ej., una fracción IL-2, unida al mismo) pueda localizarse preferentemente en una zona de interés.
La expresión "no natural" con respecto a un polímero tal como se indica en la presente memoria se refiere a un polímero que en su totalidad no se encuentra en la naturaleza. Sin embargo, un polímero no natural puede contener uno o más monómeros o segmentos de monómeros que son naturales, con la condición de que la estructura de polímero global no se encuentre en la naturaleza.
La expresión "soluble en agua", tal como en "polímero soluble en agua" es cualquier polímero que es soluble en agua a temperatura ambiente. Típicamente, un polímero soluble en agua transmitirá por lo menos aproximadamente 75%, más preferentemente por lo menos aproximadamente 95% de la luz transmitida por la misma solución después de la filtración. En peso, un polímero soluble en agua preferentemente será por lo menos aproximadamente 35% (en peso) soluble en agua, más preferentemente por lo menos aproximadamente 50% (en peso) soluble en agua, todavía más preferentemente aproximadamente 70% (en peso) soluble en agua, y todavía más preferentemente aproximadamente 85% (en peso) soluble en agua. Sin embargo, resulta más preferente que el polímero soluble en agua sea aproximadamente 95% (en peso) soluble en agua o completamente soluble en agua.
El peso molecular en el contexto de un polímero soluble en agua, tal como PEG, puede expresarse como un peso molecular medio en número o un peso molecular medio en peso. A menos que se indique lo contrario, todas las referencias a peso molecular en la presente memoria son al peso molecular en peso. Ambas determinaciones de peso molecular, medio en número y medio en peso, pueden medirse mediante cromatografía de permeación en gel u otras técnicas de cromatografía líquida. También pueden utilizarse otros métodos para medir los valores de peso molecular, tales como la utilización de análisis de grupos terminales o la medición de las propiedades coligativas (p.ej., la depresión del punto de congelación, la elevación del punto de ebullición o la presión osmótica) para determinar el peso molecular medio en número o la utilización de técnicas de dispersión lumínica, ultracentrifugación o viscosimetría para determinar el peso molecular medio en peso. Los polímeros de la invención típicamente son polidispersos (es decir, el peso molecular medio en número y el peso molecular medio en peso no son iguales), al poseer valores de polidispersividad bajos, preferentemente inferiores a aproximadamente 1,2, más preferentemente inferiores a aproximadamente 1,15, todavía más preferentemente inferiores a aproximadamente 1,10, aún todavía más preferentemente inferiores a aproximadamente 1,05, y lo más preferentemente inferiores a aproximadamente 1,03. Los términos "activo", "reactivo" o "activado", utilizados junto con un grupo funcional particular, se refieren a un grupo funcional reactivo que reacciona fácilmente con un electrófilo o un nucleófilo sobre otra molécula. Lo anterior contraste con aquellos grupos que requieren catalizadores fuertes o condiciones de reacción muy poco prácticas para reaccionar (es decir, un grupo "no reactivo" o "inerte").
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "grupo funcional" o cualquier sinónimo de la misma pretende comprender las formas protegidas del mismo, así como las formas no protegidas.
Las expresiones "fracción espadadora", "enlace" y "conector" tal como se utiliza en la presente memoria se refieren a un enlace o un átomo o una colección de átomos utilizados opcionalmente para unir fracciones interconectadas, tales como un extremo de un segmento de polímero y una fracción IL-2 o un electrófilo o nucleófilo de una fracción IL-2. La fracción de espaciador puede ser hidrolíticamente estable o puede incluir un enlace fisiológicamente hidrolizable o enzimáticamente degradable. A menos que el contexto indique claramente lo contrario, una fracción de espaciador opcionalmente existe entre cualesquiera dos elementos de un compuesto (p.ej., los conjugados proporcionados que comprenden un residuo de fracción IL-2 y polímeros solubles en agua pueden unirse directa o indirectamente mediante una fracción de espaciador).
El término "alquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo, típicamente de longitud comprendida entre aproximadamente 1 y 15 átomos. Dichas cadenas de hidrocarburo preferentemente, aunque no necesariamente, son saturadas y pueden ser de cadena ramificada o lineal, aunque típicamente resulta preferente la cadena lineal. Entre los grupos alquilo ejemplares se incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, 1 -metilbutilo, 1-etilpropilo y 3-metilpentilo. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "alquilo" incluye cicloalquilo, así como alquilo que contiene cicloalquileno.
La expresión "alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo que contiene 1 a 6 átomos de carbono y puede ser de cadena lineal o ramificada, tal como se ejemplifica mediante metilo, etilo, n-butilo, i-butilo y t-butilo.
El término "cicloalquilo" se refiere a una cadena hidrocarburo cíclica saturada o insaturada, incluyendo compuestos cíclicos puenteados, fusionados o espiro, preferentemente constituida de entre 3 y aproximadamente 12 átomos de carbono, más preferentemente de entre 3 y aproximadamente 8 átomos de carbono. El término "cicloalquileno" se refiere a un grupo cicloalquilo que se inserta en una cadena alquilo mediante la unión de la cadena en dos carbonos cualesquiera en el sistema anular cíclico.
El término "alcoxi" se refiere a un grupo -OR, en el que R es alquilo o alquilo sustituido, preferentemente alquilo C1-6 (p.ej., metoxi, etoxi, propiloxi, etc.).
El término "sustituido" tal como en, por ejemplo, "alquilo sustituido" se refiere a una fracción (p.ej., un grupo alquilo)
sustituido con uno o más sustituyentes no interfirientes, tales como, aunque sin limitación, alquilo, cicloalquilo C3-8, p.ej., ciclopropilo y ciclobutilo; halo, p.ej., flúor, cloro, bromo y yodo; ciano; alcoxi; alquilo inferior, y fenilo sustituido. La expresión "arilo sustituido" es arilo que presenta uno o más grupos no interfirientes como sustituyentes. Para las sustituciones en el anillo fenilo, los sustituyentes pueden encontrarse en cualquier orientación (es decir, orto, meta o para).
Los "sustituyentes no interfirientes" son aquellos grupos que, en caso de encontrarse presentes en una molécula, típicamente son no reactivos con otros grupos funcionales contenidos dentro de la molécula.
El término "arilo" se refiere a uno o más anillos aromáticos, cada uno de 5 o 6 átomos de carbono nucleares. Arilo incluye múltiples anillos arilo que pueden estar fusionados, tal como en naftilo, o no fusionados, tal como en bifenilo. Los anillos arilo también pueden estar fusionados o no fusionados con uno o más anillos cíclicos de hidrocarburo, heteroarilo o heterocíclico. Tal como se utiliza en la presente memoria, "arilo" incluye heteroarilo.
"Heteroarilo" es un grupo arilo que contiene uno a cuatro heteroátomos, preferentemente azufre, oxígeno o nitrógeno, o una combinación de los mismos. Los anillos heteroarilo también pueden estar fusionados con uno o más anillos cíclicos de hidrocarburo, heterocíclico, arilo o heteroarilo.
"Heterociclo" o "heterocíclico" se refiere a uno o más anillos de 5 a 12 átomos, preferentemente de 5 a 7 átomos, con o sin saturación o carácter aromático y que presentan por lo menos un átomo anular que no es un carbono. Entre los heteroátomos preferentes se incluyen azufre, oxígeno y nitrógeno.
La expresión "heteroarrilo sustituido" es heteroarrilo que presenta uno o más grupos no interfirientes como sustituyentes.
La expresión "heterociclo sustituido" es un heterociclo que presenta una o más cadenas laterales formadas de sustituyentes no interfirientes.
Un "radical orgánico" tal como se utiliza en la presente memoria incluye alquilo, alquilo sustituido, arilo y arilo sustituido. "Electrófilo" y "grupo electrofílico" se refiere a un ion o átomo o colección de átomos, que pueden ser iónicos, que presentan un centro electrofílico, es decir, un centro con afinidad para electrones, capaz de reaccionar con un nucleófilo.
"Nucleófilo" y "grupo nucleofílico" se refiere a un ion o átomo o colección de átomos que pueden ser iónicos, que presentan un centro nucleofílico, es decir, un centro con afinidad para un centro electrofílico o capaz de reaccionar con un electrófilo.
Un enlace "fisiológicamente cortable" o "hidrolizable" o "degradable" es un enlace que reacciona con el agua (es decir, resulta hidrolizado) bajo condiciones fisiológicas. La tendencia de un enlace a hidrolizarse en agua dependerá no sólo del tipo general de enlace que conecta dos átomos centrales, sino también de los sustituyentes unidos a dichos átomos centrales. Entre los enlaces hidrolíticamente inestables o débiles apropiados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, éster de carboxilato, éster de fosfato, anhídridos, acetales, cetales, éter de aciloxialquilo, iminas, ortoésteres, péptidos y oligonucleótidos.
Un "enlace enzimáticamente degradable" se refiere a un enlace que se somete a degradación por uno o más enzimas. Un enlace "hidrolíticamente estable" es un enlace químico, típicamente un enlace covalente, que es sustancialmente estable en agua, es decir, que no experimenta hidrólisis bajo condiciones fisiológicas en ninguna medida apreciable durante un periodo de tiempo prolongado. Entre los ejemplos de enlaces hidrolíticamente estables se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los siguientes: enlaces carbono-carbono (p.ej., en cadenas alifáticas), éteres, amidas y uretanos. Generalmente, un enlace hidrolíticamente estable es uno que muestra una tasa de hidrólisis inferior a aproximadamente 1-2% al día bajo condiciones fisiológicas. Las tasas de hidrólisis de enlaces químicos representativos pueden encontrarse en la mayoría de los libros de texto de química estándares.
"Excipiente o portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente que puede incluirse opcionalmente en las composiciones de la invención y que no causa efectos toxicológicos adversos significativos en el paciente. Las expresiones "cantidad farmacológicamente eficaz", "cantidad fisiológicamente eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" se utilizan intercambiablemente en la presente memoria para referirse a la cantidad de un conjugado de fracción de polímero (IL-2) que resulta necesaria para proporcionar el nivel deseado del conjugado (o fracción IL-2 no conjugada correspondiente) en el torrente sanguíneo o en el tejido diana. La cantidad precisa dependerá de numerosos factores, p.ej., de la fracción IL-2 particular, de los componentes y características físicas de la composición terapéutica, de la población de pacientes objetivo y de consideraciones del paciente individual, y puede ser fácilmente determinada por el experto en la materia basándose en la información proporcionada en la presente memoria.
El término "multifuncional" se refiere a un polímero que presenta tres o más grupos funcionales contenidos en el
mismo, en el que los grupos funcionales pueden ser iguales o diferentes. Los reactivos poliméricos multifuncionalmente típicamente contienen entre aproximadamente 3 y 100 grupos funcionales, o entre 3 y 50 grupos funcionales, o entre 3 y 25 grupos funcionales, o entre 3 y 15 grupos funcionales, o entre 3 y 10 grupos funcionales, o contienen 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 grupos funcionales dentro del esqueleto de polímero.
La expresión "fracción IL-2", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una fracción que presenta actividad de IL-2 humana. La fracción IL-2 también presenta por lo menos un grupo electrofílico o nucleofílico adecuado para la reacción con un reactivo polimérico. Además, la expresión "fracción IL-2" comprende tanto la fracción IL-2 antes de la conjugación como el residuo de fracción IL-2 después de la conjugación. Tal como se explica en mayor detalle posteriormente, el experto ordinario en la materia puede determinar si cualquier fracción dada presenta actividad de IL-2. Una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a cualquiera de las SEC ID n° 1 a 4 es una fracción IL-2, así como cualquier proteína o polipéptido sustancialmente homólogo a la misma. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "fracción IL-2 incluye dichas proteínas modificadas deliberadamente, tal como, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida a sitio, o accidentalmente mediante mutaciones. Dichos términos también incluyen análogos que presentan 1 a 6 sitios adicionales de glucosilación, análogos que presentan por lo menos un aminoácido adicional en el extremo carboxiterminal de la proteína, en donde el aminoácido o aminoácidos adicionales incluyen por lo menos un sitio de glucosilación, y análogos que presentan una secuencia de aminoácidos que incluye por lo menos un sitio de glucosilación. El término incluye tanto fracciones naturales como producidas recombinantemente.
La expresión "sustancialmente homólogo" se refiere a que una secuencia objeto particular, por ejemplo una secuencia mutante, varía respecto a una secuencia de referencia en una o más sustituciones, deleciones o adiciones, el efecto neto de las cuales no resulta en una diferencia funcional adversa entre las secuencias de referencia y objeto. Para los fines de la presente invención, las secuencias que presentan una homología superior a 80 por ciento (más preferentemente superior a 85 por ciento, todavía más preferentemente superior a 90 por ciento, resultando más preferente más de 95 por ciento), una actividad biológica equivalente (aunque no necesariamente una fuerza equivalente de la actividad biológica) y características de expresión equivalentes, se consideran sustancialmente homólogas. Para los fines de determinar la homología, debe descartarse el truncado de la secuencia madura. Entre las fracciones IL-2 ejemplares para la utilización en la presente memoria se incluyen aquellas secuencias que son sustancialmente homólogas a la SEC ID n° 2.
El término "fragmento" se refiere a cualquier proteína o polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de una parte o fragmento de una fracción IL-2 y que presenta la actividad biológica de IL-2. Entre los fragmentos se incluyen proteínas o polipéptidos producidos mediante degradación proteolítica de una fracción IL-2, así como proteínas o polipéptidos producidos mediante métodos de síntesis química rutinarios en la técnica.
El término "paciente" se refiere a un organismo vivo que sufre o presenta una tendencia a sufrir una condición que puede prevenirse o tratarse mediante la administración de un agente activo (p.ej., un conjugado) e incluye tanto seres humanos como animales.
El término “opcional” u “opcionalmente” se refiere a que el suceso o circunstancia seguidamente indicado puede producirse o no producirse, por lo que la descripción incluye casos en los que se produce la circunstancia y casos en los que no.
El término "sustancialmente" se refiere a prácticamente en su totalidad o completamente, por ejemplo que satisface una o más de las condiciones siguientes: más de 50%, 51% o superior, 75% o más, 80% o más, 90% o más, y 95% o más de la condición.
Tal como se utiliza en la presente memoria, "identidad de secuencia" se determina mediante comparación de la secuencia de ADN de referencia con aquellas partes de otra secuencia de ADN alineada de manera que maximiza el solapamiento entre las dos secuencias, minimizando simultáneamente los huecos de secuencia, en la que se ignoran cualesquiera secuencias protuberantes entre las dos secuencias. Con respecto a cualquier identidad de secuencia indicada en la presente memoria, resulta preferente una identidad de secuencia de por lo menos 80%, más preferentemente 85%, todavía más preferentemente 90%, aún todavía más preferentemente 95%, con 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencias resultando las más preferentes.
Los residuos aminoácidos en los péptidos se abrevia de la manera siguiente: fenilalanina es Phe o F; leucina es Leu o L; isoleucina es Ile o I; metionina es Met o M; Valina es Val o V; Serina es Ser o S; Prolina es Pro o P; treonina es Thr o T; alanina es Ala o A; tirosina es Tyr o Y; histidina es His o H; glutamina es Gln o Q; asparagina es Asn o N; lisina es Lys o K; ácido aspártico es Asp o D; ácido glutámico es Glu o E; cisteína es Cys o C; triptófano es Trp o W; arginina es Arg o R; y glicina es Gly o G.
En referencia a una o más realizaciones de la invención, se proporciona un conjugado según las reivindicaciones, en el que el conjugado comprende un residuo de una fracción IL-2 unido covalentemente mediante una fracción espaciadora a un polímero soluble en agua. Los conjugados de la invención presentan una o más de las propiedades siguientes:
La fracción IL-2
Tal como se ha indicado anteriormente, el conjugado genéricamente comprende un residuo de una fracción IL-2 unido covalentemente mediante una fracción espadadora a un polímero soluble en agua según se define en las reivindicaciones. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "fracción IL-2" se refiere a la fracción IL-2 antes de la conjugación, así como la fracción IL-2 después de la unión a un polímero soluble en agua no peptídico. Sin embargo, se entenderá que al unir la fracción IL-2 original a un polímero soluble en agua no peptídico, la fracción IL-2 se altera ligeramente debido a la presencia de uno o más enlaces covalentes asociados al enlace al polímero o polímeros. Con frecuencia, dicha forma ligeramente alterada de la fracción IL-2 unida a otra molécula se denomina "residuo" de la fracción IL-2.
La fracción IL-2 puede derivarse por métodos no recombinantes y por métodos recombinantes, y la invención no se encuentra limitada a este respecto. Además, la fracción IL-2 puede obtenerse de fuentes humanas, de fuentes animales y de fuentes vegetales.
La fracción IL-2 puede derivarse no recombinantemente. Por ejemplo, resulta posible aislar IL-2 a partir de sistemas biológicas y de otro modo obtener IL-2 a partir de medios de cultivo. Ver, por ejemplo, los procedimientos descritos en la patente US n° 4.401.756 y en Pauly et al., J. Immunol Methods 75(1):73-84, 1984.
La fracción IL-2 puede derivarse por métodos recombinantes. Ver, por ejemplo, la patente US n° 5.614.185, la exposición y la sección experimental proporcionadas en la presente memoria.
Cualquier fracción IL-2 obtenida mediante enfoques no recombinantes y recombinantes puede utilizarse como una fracción IL-2 en la preparación de los conjugados indicados en la presente memoria.
La fracción IL-2 puede expresarse en sistemas de expresión bacterianos [p.ej., E. coli; ver, por ejemplo, Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 21(3):295-311, 1995], de mamífero [ver, por ejemplo, Kronman et al. Gene 121:295-304, 1992], de levadura [p.ej., Pichia pastoris; ver, por ejemplo, Morel et al. Biochem. J. 328(1):121-129, 1997] y vegetales [ver, por ejemplo, Mor et al. Biotechnol. Bioeng. 75(3):259-266, 2001]. La expresión puede producirse mediante expresión exógena (en el caso de que la célula huésped contenga naturalmente la codificación genética deseada) o mediante expresión endógena.
Aunque los métodos basados en la recombinación para preparar proteínas pueden ser diferentes, los métodos recombinantes típicamente implican la construcción del ácido nucleico codificante del polipéptido o fragmento deseado, la clonación del ácido nucleico en un vector de expresión, la transformación de una célula huésped (p.ej., plantas, bacterias, levaduras, células animales transgénicas o células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino o células renales de hámster neonato) y la expresión del ácido nucleico para producir el polipéptido o fragmento deseado. Los métodos para producir y expresar polipéptidos recombinantes in vitro y en células huésped procarióticas y eucarióticas son conocidas por el experto ordinario en la materia.
Con el fin de facilitar la identificación y purificación del polipéptido recombinante, pueden insertarse o añadirse en el mismo marco de la secuencia codificante, secuencias de ácidos nucleicos que codifican una etiqueta de epítopo u otra secuencia de unión de afinidad, produciendo de esta manera una proteína de fusión que comprende el polipéptido deseado y un polipéptido adecuado para la unión. Pueden identificarse proteínas de fusión y purificarse haciendo pasar una mezcla que contiene la proteína de fusión por una columna de afinidad que porta las fracciones de unión (p.ej., los anticuerpos) dirigidos contra la etiqueta de epítopo u otra secuencia de unión en las proteínas de fusión, ligando de esta manera la proteína de fusión dentro de la columna. Después, la proteína de fusión puede recuperarse mediante lavado de la columna con la solución apropiada (p.ej., ácido) para liberar la proteína de fusión ligada. El polipéptido recombinante también puede purificarse mediante lisado de las células huésped, separando el polipéptido, p.ej. mediante cromatografía de intercambio iónico, enfoques de unión por afinidad, enfoques de interacción hidrofóbica, seguido de la identificación mediante MALDI o transferencia Western, y recolección del polipéptido. Estos métodos y otros para identificar y purificar polipéptidos recombinantes son conocidos por el experto ordinario en la materia. Sin embargo, en una o más realizaciones de la invención, la fracción IL-2 no se encuentra en forma de una proteína de fusión.
Según el sistema utilizado para expresar proteínas que presentan actividad de IL-2, la fracción IL-2 puede encontrarse no glucosilada o glucosilada, y puede utilizarse cualquiera de ellas. Es decir, la fracción IL-2 puede encontrarse no glucosilada o la fracción IL-2 puede encontrarse glucosilada. En una o más realizaciones de la invención, la fracción IL-2 se encuentra no glucosilada.
La fracción Il-2 puede ventajosamente modificarse para incluir y/o sustituir uno o más residuos aminoácidos, tales como, por ejemplo, lisina, cisteína y/o arginina, a fin de proporcionar una fácil unión del polímero a un átomo dentro de la cadena lateral del aminoácido. Se indica un ejemplo de sustitución de una fracción IL-2 en la patente US n° 5.206.344. Además, la fracción IL-2 puede modificarse para incluir un residuo aminoácido no natural. Las técnicas para añadir residuos aminoácidos y residuos aminoácidos no naturales son bien conocidas por el experto ordinario en
la materia. Se hace referencia a J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4a ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992).
Además, la fracción IL-2 puede modificarse ventajosamente para incluir la unión de un grupo funcional (diferente de la adición de un residuo aminoácido que contiene un grupo funcional). Por ejemplo, la fracción IL-2 puede modificarse para incluir un grupo tiol. Además, la fracción IL-2 puede modificarse para incluir un carbono alfa N-terminal. Además, la fracción IL-2 puede modificarse para incluir una o más fracciones carbohidrato. Además, la fracción IL-2 puede modificarse para incluir un grupo aldehído. Además, la fracción IL-2 puede modificarse para incluir un grupo cetona. En algunas realizaciones de la invención, resulta preferente que la fracción IL-2 no se modifique para incluir uno o más de entre un grupo tiol, un carbono alfa N-terminal, un carbohidrato, un grupo aldehído y un grupo cetona.
Se describen fracciones IL-2 ejemplares en literatura y en, por ejemplo, las patentes US n° 5.116.943, n° 5.153.310, n° 5.635.597, n° 7.101.965 y n° 7.567.215 y en las solicitudes publicadas de patente US n° 2010/0036097 y n° 2004/0175337. Entre las fracciones IL-2 descritas se incluyen las que presentan una secuencia de aminoácidos que comprende secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las SEC ID n° 1 a n° 4, y secuencias sustancialmente homólogas a las mismas. Según las reivindicaciones, la fracción IL-2 presenta la secuencia de aminoácidos correspondiente a la SEC ID n° 3 o una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de 95% o superior respecto a la SEC ID n° 3.
En algunos casos, la fracción IL-2 se encontraba en una forma de "monómero", en la que una única expresión del péptido correspondiente se organiza en una unidad discreta. En otros casos, la fracción IL2- se encontrará en la forma de un "dímero" (p.ej., un dímero de IL-2 recombinante), en la que dos formas de monómero de la proteína están asociadas (p.ej., mediante enlace disulfuro) entre sí. Por ejemplo, en el contexto de un dímero de IL-2 humana recombinante, el dímero puede encontrarse en la forma de dos monómeros asociados entre sí mediante un enlace disulfuro formado por el residuo Cys125 de cada monómero.
Además, pueden utilizarse formas de precursor de IL-2 como la fracción IL-2. Una forma de precursor ejemplar de IL2-presenta la secuencia de SEC ID n° 1.
Las versiones truncadas, variantes híbridas y miméticos peptídicos de cualquiera de las secuencias anteriormente indicadas también pueden servir de fracción de IL-2. Los fragmentos biológicamente activos, variantes por deleción, variantes por sustitución o variantes por adición de cualquiera de los anteriores que mantenga por lo menos cierto grado de actividad de IL-2 también pueden servir de fracción de IL-2.
Para cualquier fracción péptido o proteína, resulta posible determinar si la fracción presenta actividad de IL-2. Se describen en la técnica diversos métodos para determinar la actividad de IL-2 vitro. Un enfoque ejemplar es el ensayo de proliferación celular de CTTL-2 descrito en la sección experimental, posteriormente. Se describe un enfoque ejemplar en Moreau et al., Mol. Immunol. 32:1047-1056, 1995. Brevemente, en un ensayo de unión no específica, se deja bajo incubación una fracción IL-2 propuesta durante una hora a 4°C en presencia de una línea celular portadora de un receptor de IL-2. Después, se deja que IL-2 marcado con 125I incube en el sistema durante tres horas a 4°C. Los datos se expresan como % de la capacidad inhibidora de la fracción IL-2 propuesta frente a la IL-2 de tipo salvaje. También pueden utilizarse otras metodologías conocidas de la técnica para evaluar la función de IL-2, incluyendo la electrometría, la espectrofotometría, la cromatografía y las metodologías radiométricas.
El polímero soluble en agua
Tal como se ha comentado anteriormente, cada conjugado comprende una fracción IL-2 unida a un polímero soluble en agua. Con respecto al polímero soluble en agua, el polímero soluble en agua es no peptídico, no tóxicos, natural y biocompatible. Con respecto a la biocompatibilidad, se considera que una sustancia es biocompatible en el caso de que los efectos beneficiosos asociados a la utilización de la sustancia sola o con otra sustancia (p.ej., un agente activo, tal como una fracción IL-2) en relación a tejidos vivos (p.ej., la administración en un paciente) supera cualesquiera efectos perjudiciales según evaluación de un profesional sanitario, p.ej., un médico. Con respecto a la no inmunogenicidad, se considera que una sustancia es no inmunogénica en el caso de que el uso pretendido de la sustancia in vivo no produzca una respuesta inmunitaria no deseada (p.ej., la formación de anticuerpos) o, en el caso de que se produzca una respuesta inmunitaria, o que dicha respuesta no se considere clínicamente significativa o importante según la evaluación de un médico. Resulta particularmente preferente que el polímero soluble en agua no peptídico sea biocompatible y no inmunogénico.
Además, el polímero se caracteriza típicamente porque presenta entre 2 y aproximadamente 300 extremos. Entre los conjugados de la invención, el polímero es un poli(etilenglicol) ("PEG"). Entre otros polímeros indicados se incluyen poli(propilenglicol) ("PPG"), copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, poli(poliol oxietilado), poli(alcohol olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacáridos), poli(a-hidroxiácido), poli(alcohol vinílico), polifosfaceno, polioxazolinas ("POZ") (que se describen en la solicitud publicada de patente internacional n° WO 2008/106186), poli(N-acriloilmorfolina) y combinaciones de cualquiera de los indicados.
Según la invención, el conjugado comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho polímeros de
poli(etilenglicol) solubles en agua ramificados. Un polímero soluble en agua indicado en la presente memoria puede ser lineal (p.ej., un polímero con caperuza terminal, p.ej., alcoxi-PEG o un PEG bifuncional), ramificado o multibrazo (p.ej., PEG bifurcado o PEG unido a un núcleo poliol), una arquitectura dendrítica (o de estrella), cada una de las cuales presenta uno o más enlaces degradables. Además, la estructura interna del polímero soluble en agua puede organizarse en cualquier de entre varios patrones de repetición diferentes y puede seleccionarse del grupo que consiste en homopolímero, copolímero alternante, copolímero aleatorio, copolímero en bloqueo, tripolímero alternante, tripolímero aleatorio o tripolímero en bloque.
Típicamente, PEG activado y otros polímeros solubles en agua activados (es decir, reactivos poliméricos) se activan con un grupo activador adecuado que resulte apropiado para el acoplamiento a un sitio deseado en la fracción IL-2. De esta manera, un reactivo polimérico poseerá un grupo reactivo para la reacción con la fracción IL-2. Los reactivos poliméricos y métodos representativos para conjugar dichos polímeros con una fracción activa son conocidos de la técnica y se describen adicionalmente en Zalipsky, S., et al., "Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides" in Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992), y en Zalipsky, Advanced Drug Reviews 16:157-182, 1995. Entre los grupos activadores ejemplares adecuados para el acoplamiento con una fracción IL-2 se incluyen hidroxilo, maleimida, éster, acetal, cetal, amina, carboxilo, aldehído, hidrato de aldehído, cetona, vinilcetona, tiona, tiol, vinilsulfona e hidrazina.
Preferentemente, el reactivo polimérico utilizado para preparar los conjugados indicados en la presente memoria se prepara sin utilización de fosgeno. Dicho enfoque contrasta con, por ejemplo, la exposición indicada en la patente US n° 4.902.502, que describe específicamente la formación de un cloroformato y posterior utilización para formar un éster activo de PEG, que a continuación se hace reaccionar con Il-2. La utilización de fosgeno conduce a la formación de cloruro de hidrógeno, que puede conducir al corte de la cadena del polímero, incrementando de esta manera las impurezas, que podrían no poderse eliminar mediante las técnicas convencionales. De esta manera, sin respaldo teórico, los conjugados de fracción IL-2 preparados a partir de reactivos poliméricos formados sin utilizar fosgeno proporcionan composiciones de calidad más alta que están sustancialmente limpios de productos de degradación de cadena de polímero.
Según las reivindicaciones, los PEG presentan un peso molecular medio en peso comprendido en el intervalo de entre 500 daltons y 100.000 daltons. Sin embargo, entre los intervalos ejemplares se incluyen pesos moleculares medios en peso comprendidos entre más de 5.000 daltons y aproximadamente 100.000 daltons, en el intervalo de entre aproximadamente 6.000 daltons y aproximadamente 90.000 daltons, en el intervalo de entre aproximadamente 10.000 daltons y aproximadamente 85.000 daltons, en el intervalo de más de 10.000 daltons y aproximadamente 85.000 daltons, en el intervalo de entre aproximadamente 20.000 daltons y aproximadamente 85.000 daltons, y en el intervalo de entre aproximadamente 53.000 daltons y aproximadamente 85.000 daltons.
Entre los pesos moleculares medios en peso ejemplares para el polímero soluble en agua se incluyen aproximadamente 500 daltons, aproximadamente 600 daltons, aproximadamente 700 daltons, aproximadamente 750 daltons, aproximadamente 800 daltons, aproximadamente 900 daltons, aproximadamente 1,000 daltons, aproximadamente 1,500 daltons, aproximadamente 2,000 daltons, aproximadamente 2,200 daltons, aproximadamente 2,500 daltons, aproximadamente 3,000 daltons, aproximadamente 4.000 daltons, aproximadamente 4.400 daltons, aproximadamente 4.500 daltons, aproximadamente 5.000 daltons, aproximadamente 5.500 daltons, aproximadamente 6.000 daltons, aproximadamente 7.000 daltons, aproximadamente 7.500 daltons, aproximadamente 8.000 daltons, aproximadamente 9.000 daltons, aproximadamente 10.000 daltons, aproximadamente 11.000 daltons, aproximadamente 12.000 daltons, aproximadamente 13.000 daltons, aproximadamente 14.000 daltons, aproximadamente 15.000 daltons, aproximadamente 20.000 daltons, aproximadamente 22.500 daltons, aproximadamente 25.000 daltons, aproximadamente 30.000 daltons, aproximadamente 35.000 daltons, aproximadamente 40.000 daltons, aproximadamente 45.000 daltons, aproximadamente 50.000 daltons, aproximadamente 55.000 daltons, aproximadamente 60.000 daltons, aproximadamente 65.000 daltons, aproximadamente 70.000 daltons y aproximadamente 75.000 daltons. También pueden utilizarse versiones ramificadas del polímero soluble en agua (p.ej., un polímero soluble en agua de 40.000 daltons ramificado que comprende dos polímeros de 20.000 daltons) con un peso molecular total de cualquiera de los anteriormente indicados. Los conjugados indicados en la presente memoria pueden no presentar ninguna fracción PEG unida, directa o indirectamente, con un PEG que presenta un peso molecular medio en peso inferior a aproximadamente 6.000 daltons.
En el caso de que se utilicen como el polímero, los PEG típicamente comprenderán un número de monómeros de (OCH2CH2) [o monómeros (CH2CH2O), dependiendo de cómo se defina el PEG]. Tal como se utiliza en toda la descripción, el número de unidades repetitivas se identifica mediante el superíndice "n" en "(OCH2CH2)n". De esta manera, el valor de (n) típicamente se encuentra comprendido dentro de uno o más de los intervalos siguientes: entre 2 y aproximadamente 3.400, entre aproximadamente 100 y aproximadamente 2.300, entre aproximadamente 100 y aproximadamente 2.270, entre aproximadamente 136 y aproximadamente 2.050, entre aproximadamente 225 y aproximadamente 1.930, entre aproximadamente 450 y aproximadamente 1.930, entre aproximadamente 1.200 y aproximadamente 1,.930, entre aproximadamente 568 y aproximadamente 2.727, entre aproximadamente 660 y aproximadamente 2.730, entre aproximadamente 795 y aproximadamente 2.730, entre aproximadamente 795 y aproximadamente 2.730, entre aproximadamente 909 y aproximadamente 2.730, y entre aproximadamente 1.200 y
aproximadamente 1.900. Para un polímero dado del que se conoce el peso molecular, resulta posible determinar el número de unidades repetitivas (es decir, "n") mediante la división del peso molecular medio en peso total del polímero por el peso molecular del monómero repetitivo.
Un polímero particularmente preferente para la utilización en la invención es un polímero de caperuza terminal, es decir, un polímero que presenta por lo menos un extremo con caperuza terminal con un grupo relativamente inerte, tal como un grupo alcoxi Ci -6 inferior, aunque también puede utilizarse un grupo hidroxilo. En el caso de que el polímero sea PEG, por ejemplo, resulta preferente utilizar un metoxi-PEG (comúnmente denominado mPEG), que es una forma lineal de PEG en la que un extremo del polímero es un grupo metoxi (-OCH3), mientras que el otro extremo es un grupo hidroxilo u otro grupo funcional que opcionalmente puede estar químicamente modificado.
En una forma útil en una o más realizaciones de la presente invención, PEG libre o no unido es un polímero lineal terminado en cada extremo en dos grupos hidroxilo:
HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH,
en el que (n) típicamente está comprendido entre cero y aproximadamente 4.000.
El polímero anterior, alfa-, omega-dihdiroxilpoli(etilenglicol), puede representarse en forma corta como HO-PEG-OH, en donde se entiende que el símbolo- PEG- puede representar la unidad estructural siguiente:
-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-,
en la que (n) es tal como se ha definido anteriormente.
Otro tipo de PEG útil en una o más realizaciones de la presente invención es metoxi-PEG-OH, o abreviadamente, mPEG, en el que un extremo es un grupo metoxi relativamente inerte, mientras que el otro extremo es un grupo hidroxilo. La estructura de mPEG se proporciona a continuación:
CH3O-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
en la que (n) es tal como se ha indicado anteriormente.
Las moléculas de PEG multi-brazo o ramificado, tales como las indicadas en la patente US n° 5.932.462, también pueden utilizarse como el polímero PEG. Por ejemplo, PEG puede presentar la estructura:
en la que:
polia y polib son esqueletos de PEG (iguales o diferentes), tal como metoxi poli(etilenglicol),
R" es una fracción no reactiva, tal como H, metilo o un esqueleto de PEG, y
P y Q son enlaces no reactivos. En una realización preferente, el polímero PEG ramificado es metoxi poli(etilenglicol) lisina disustituida. Según la fracción IL-2 específica utilizada, el grupo funcional éster reactivo de la lisina disustituida puede modificarse adicionalmente para formar un grupo funcional adecuado para la reacción con el grupo diana dentro de la fracción IL-2.
Además, el PEG puede comprender un PEG bifurcado. Un ejemplo de un PEG bifurcado se representa mediante la estructura a continuación:
en la que: X es una fracción espaciadora de uno o más átomos y cada Z es un grupo terminal activado unido a CH mediante una cadena de átomos de longitud definida. La solicitud publicada de patente internacional n° WO 99/45964 da a conocer diversas estructuras de PEG bifurcado que pueden utilizarse en una o más realizaciones de la presente invención. La cadena de átomos que une los grupos funcionales Z al átomo de carbono ramificado actúan de grupo de anclaje y puede comprender, por ejemplo, cadenas alquilo, cadenas éter, cadenas éster, cadenas amida y combinaciones de las mismas.
El polímero PEG puede comprender una molécula de PEG colgante que presenta grupos reactivos, tales como carboxilo, unidos covalentemente a lo largo de la longitud de PEG en lugar de en un extremo de la cadena de PEG. Los grupos reactivos colgantes pueden unirse a PEG directamente o mediante una fracción espaciadora, tal como un grupo alquileno.
Además de las formas anteriormente indicadas de PEG, el polímero también puede prepararse con uno o más enlaces débiles o degradables en el polímero, incluyendo cualquiera de los polímeros anteriormente indicados. Por ejemplo, puede prepararse PEG con enlaces éster en el polímero que se someten a hidrólisis. Tal como se muestra a continuación, dicha hidrólisis resulta en el corte del polímero en fragmentos de peso molecular más bajo.
-PEG-CO2-PEG- H2O ^ -PEG-CO2H HO-PEG-
Entre otros enlaces hidrolíticamente degradables, útiles como enlace degradable dentro de un esqueleto de polímero y/o como enlace degradable a una fracción IL-2, se incluyen: enlaces de carbonato, enlace de imina que resultan, por ejemplo, de la reacción de una amina y un aldehído (ver, p.ej., Ouchi et al., Polymer Preprints 38(1):582-3, 1997); enlaces éster de fosfato formado mediante, por ejemplo, la reacción de un alcohol con un grupo fosfato; enlaces de hidrazona, que se forman típicamente mediante reacción de una hidrazida y un aldehído; enlaces de acetal, que se forman típicamente mediante reacción entre un aldehído y un alcohol; enlaces de ortoéster, que se forman, por ejemplo, mediante reacción entre un formato y un alcohol; enlaces de amida, formados por un grupo amina, p.ej., en un extremo de un polímero tal como PEG y un grupo carboxilo de otra cadena de PEG; enlaces de uretano, formados mediante reacción de, p.ej., un PEG con un grupo isocianato terminal y un alcohol de PEG; enlaces peptídicos, formado por un grupo amina, p.ej., en un extremo de un polímero tal como PEG, y un grupo carboxilo de un péptido, y enlaces oligonucleótido, formados mediante, por ejemplo, un grupo fosforamidita, p.ej., en el extremo de un polímero y un grupo 5'-hidroxilo de un oligonucleótido.
Tal como se indica adicionalmente, la introducción de uno o más enlaces degradables en la cadena de polímero o en la fracción IL-2 puede proporcionar un control adicional sobre las propiedades farmacológicas deseadas del conjugado tras la administración. Por ejemplo, puede administrarse un conjugado grande y relativamente inerte (es decir, que presenta una o más cadenas de PEG de elevado peso molecular unidas al mismo, por ejemplo una o más cadenas de PEG que presenta un peso molecular superior a aproximadamente 10.000 daltons, en los que el conjugado esencialmente no posee bioactividad), que se libera para generar un conjugado bioactivo que posee una parte de la cadena de PEG original. De esta manera, las propiedades del conjugado pueden adaptarse más eficazmente para equilibrar la bioactividad del conjugado durante el tiempo.
Según las reivindicaciones, el polímero soluble en agua asociado al conjugado es "liberable". Es decir, se libera el polímero soluble en agua (mediante hidrólisis, procesos enzimáticos, procesos catalíticos o de otra manera), resultando de esta manera en la fracción IL-2 no conjugada. Según las reivindicaciones, los polímeros liberables se desprenden de la fracción IL-2 in vivo sin dejar ningún fragmento del polímero soluble en agua unido a la fracción IL-2. En otros casos indicados en la presente memoria, los polímeros liberables se desprenden de la fracción IL-2 in vivo dejando un fragmento relativamente pequeño (p.ej., una etiqueta succinato) del polímero soluble en agua. Un polímero cortable ejemplar incluye uno que se une a la fracción IL-2 mediante un enlace de carbonato. Según la invención, el enlace es un enlace carbamato liberable con un grupo amino de una fracción de interleuquina-2.
El experto ordinario en la materia reconocerá que el comentario anterior referente a polímeros no peptídicos y solubles en agua en modo alguno es exhaustivo y es meramente ilustrativo, y que todos los materiales poliméricos que presentan las cualidades indicadas anteriormente se encuentran contemplados. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "reactivo polimérico" se refiere generalmente a una molécula entera, que puede comprender un segmento de polímero soluble en agua y un grupo funcional.
Tal como se ha indicado anteriormente, un conjugado de la invención comprende un polímero soluble en agua unido covalentemente a una fracción IL-2 según se define en las reivindicaciones. Según las reivindicaciones, el conjugado presenta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8 polímeros de poli(etilenglicol) solubles en agua ramificados unidos covalentemente a una fracción IL-2. Cualquier polímero soluble en agua puede unirse covalentemente a un aminoácido de la fracción IL-2 o, en el caso de que la fracción IL-2 sea (por ejemplo) una glucoproteína, a un carbohidrato de la fracción IL-2. La unión a un carbohidrato puede llevarse a cabo, p.ej., utilizando la funcionalización metabólica utilizando química de ácido siálico-azida [Luchansky et al., Biochemistry 43(38):12358-12366, 2004] u otros enfoques adecuados, tales como la utilización de glicidol para facilitar la introducción de grupos aldehído [Heldt et al., European Journal of Organic Chemistry 32:5429-5433, 2007].
El enlace particular dentro de la fracción que presenta actividad de IL-2 y el polímero depende de varios factores. Entre dichos factores se incluyen, por ejemplo, la química de enlace particular utilizada, la fracción IL-2 particular, los grupos funcionales disponibles dentro de la fracción IL-2 (para la unión a un polímero o la conversión en un sitio de unión adecuado), y la presencia de grupos funcionales reactivos adicionales dentro de la fracción IL-2.
Los conjugados de la invención son profármacos, es decir, el enlace entre el polímero y la fracción IL-2 es liberable,
permitiendo la liberación de la fracción parental. Entre los enlaces liberables se incluyen éster de carboxilato, éster de fosfato, éster de tiol, anhídridos, acetales, cetales, éter de aciloxialquilo, iminas, ortoésteres, péptidos y oligonucleótidos. Dichos enlaces pueden prepararse fácilmente mediante modificación apropiada de la fracción IL-2 (p.ej., el extremo C de grupo carboxilo de la proteína, o el grupo hidroxilo de cadena lateral de un aminoácido, tal como serina o treonina contenida dentro de la proteína, o una funcionalidad similar dentro del carbohidrato) y/o el reactivo polimérico utilizando métodos de acoplamiento utilizados en la técnica. Sin embargo, resultan más preferentes enlaces liberables que se forman fácilmente mediante reacción de un polímero convenientemente activado con un grupo funcional no modificado contenido dentro de la fracción que presenta actividad de IL-2.
Alternativamente, un enlace hidrolíticamente estable, tal como un enlace amida, uretano (también conocido como carbamato), amina, tioéter (también conocido como sulfuro) o urea (también conocida como carbamida), también puede utilizarse como el enlace para el acoplamiento de la fracción IL-2. Nuevamente, un enlace hidrolíticamente estable preferente es una amida. En un enfoque, un polímero soluble en agua portador de un éster activado puede hacerse reaccionar con un grupo amina en la fracción IL-2, resultando de esta manera en un enlace amida.
Los conjugados (frente a una fracción IL-2 no conjugada) puede poseer o no un grado medible de actividad de IL-2. Es decir, un conjugado de polímero-fracción IL-2 según la invención poseerá entre aproximadamente 0,1% y aproximadamente 100% de la bioactividad de la fracción IL-2 parental no modificada. En algunos casos, los conjugados de polímero-fracción IL-2 pueden presentar más de 100% de bioactividad de la fracción IL-2 parental no modificada. Preferentemente, los conjugados que poseen poca o ninguna actividad de IL-2 contienen un enlace hidrolizable que conecta el polímero con la fracción, de manera que, con independencia de la falta (o falta relativa) de actividad en el conjugado, la molécula parental activa (o un derivado de la misma) resulta liberada con el corte inducido en medio acuoso del enlace hidrolizable. Dicha actividad puede determinarse utilizando un modelo in vivo o in vitro adecuado, según la actividad conocida de la fracción particular que presenta actividad de IL-2 que se ha utilizado.
Para conjugados que poseen un enlace hidrolíticamente estable que acopla la fracción con actividad de IL-2 al polímero, el conjugado típicamente poseerá un grado medible de bioactividad. Por ejemplo, dichos conjugados se caracterizan típicamente por presentar una bioactividad que satisface uno o más de los porcentajes siguientes respecto a la de la fracción IL-2 no conjugada: por lo menos aproximadamente 2%, por lo menos aproximadamente 5%, por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 15%, por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 97%, por lo menos aproximadamente 100%, y más de 105% (medido en un modelo adecuado, tales como aquellos bien conocidos de la técnica). Preferentemente, los conjugados que presentan un enlace hidrolíticamente estable (p.ej., un enlace amida) poseerán por lo menos cierto grado de bioactividad de la fracción parental no modificada que presenta actividad de IL-2.
A continuación, se describen conjugados ejemplares. Típicamente, dicha fracción IL-2 se espera que comparta (por lo menos en parte) una secuencia de aminoácidos similar a la secuencia proporcionada en por lo menos una de las SEC ID n° 1 a n° 4. De esta manera, aunque se hace referencia a localizaciones o átomos específicos dentro de las SEC ID n° 1 a n° 4, dicha referencia es por comodidad únicamente y el experto ordinario en la materia podrá determinar fácilmente la localización o átomo correspondiente en otras fracciones que presentan actividad de iL-2. En particular, la descripción proporcionada en la presente memoria de la IL-2 humana nativa con frecuencia es aplicable a fragmentos, variantes por deleción, variantes por sustitución o variantes por adición de cualquiera de los anteriores.
Los grupos amino en fracciones IL-2 proporcionan un punto de unión entre la fracción IL-2 y el polímero soluble en agua. Utilizando la secuencia de aminoácidos proporcionada en las SEC ID n° 1 a n° 4, resulta evidente que hay varios residuos de lisina en cada una que presenta un £-aminoácido que puede encontrarse disponible para la conjugación. Además, la amina N-terminal de cualquier proteína también puede servir de punto de unión.
Existen varios ejemplos de reactivos poliméricos adecuados que resultan útiles para formar enlaces covalentes con aminas disponibles de una fracción IL-2. Se proporcionan ejemplos específicos, junto con el conjugado correspondiente, en la Tabla 1, posteriormente. En la tabla, la variable (n) representa varias unidades monoméricas repetitivas y "-NH-(IL-2)" representa el residuo de la fracción IL-2 tras la conjugación con el reactivo polimérico. Aunque cada parte polimérica [p.ej., (OCH2CH2)n o (CH2CH2O)n] presentada en la Tabla 1 termina en un grupo "CH3", otros grupos pueden sustituirlo (tales como H y bencilo).
La conjugación de un reactivo polimérico con un grupo amino de una fracción IL-2 puede conseguirse mediante una diversidad de técnicas. En un enfoque, una fracción I L-2 puede conjugarse con un reactivo polimérico funcionalizado con un derivado succinimidilo (u otro grupo éster activado, en el que pueden utilizarse enfoques similares a los indicados para dichos reactivos poliméricos alternativos que contienen grupo éster activado). En dicho enfoque, el polímero que porta un derivado de succinimidilo puede unirse a la fracción IL-2 en un medio acuoso a un pH de entre 7 y 9,0, aunque utilizando condiciones de reacción diferentes (p.ej., un pH más bajo, tal como de entre 6 y 7, o temperaturas diferentes y/o inferiores a 15°C), resultando en la unión del polímero a una localización diferente en la fracción IL-2. Además, puede formarse un enlace amida mediante la reacción de un polímero soluble en agua no peptídico terminado en amina con una fracción IL-2 portadora de un grupo ácido carboxílico activado.
Los conjugados ejemplares están comprendidos dentro de la estructura siguiente:
en la que:
(n) es un número entero que presenta un valor de entre 2 y 4.000,
X es una fracción espaciadora,
R1 es un radical orgánico, y
IL-2 es un residuo de una fracción IL-2.
Los conjugados ejemplares están comprendidos dentro de la estructura siguiente:
en la que (n) es un número entero con un valor de entre 2 y 4.000 y IL-2 es un residuo de una fracción IL-2.
Resulta típico de otro enfoque útil para conjugar la fracción IL-2 a un reactivo polimérico la utilización de una aminación reductora para conjugar una amina primaria de una fracción IL-2 con un reactivo polimérico funcionalizado con una cetona, aldehído o una forma hidratada del mismo (p.ej., hidrato de cetona o hidrato de aldehído). En dicho enfoque, la amina primaria de la fracción IL-2 reaccionar con el grupo carbonilo del aldehído o cetona (o el grupo que contiene hidroxilo correspondiente de un aldehído o cetona hidratada), formando de esta manera una base de Schiff. La base de Schiff a continuación puede, a su vez, convertirse reductoramente en un conjugado estable mediante la utilización de un agente reductor, tal como borohidruro sódico. Resultan posibles las reacciones selectivas (p.ej., en el extremo N-terminal), particularmente con un polímero funcionalizado con una cetona o un aldehído ramificado en alfa-metilo y/o bajo condiciones de reacción específicas (p.ej., un pH reducido).
Entre los conjugados ejemplares en los que el polímero soluble en agua se encuentra en una forma ramificada se incluyen aquellos en los que el polímero soluble en agua se encuentra comprendido dentro de la estructura a continuación:
en la que cada (n) es, independientemente, un número entero que presenta un valor de entre 2 y 4.000.
Los conjugados ejemplares están comprendidos dentro de la estructura siguiente:
en la que:
cada (n) es, independientemente, un número entero que presenta un valor de entre 2 y 4.000, X es una fracción espadadora,
(b) es un número entero que presenta un valor de entre 2 y 6,
(c) es un número entero que presenta un valor de entre 2 y 6,
R2, en cada aparición es, independientemente, H o alquilo inferior, e
IL-2 es un residuo de una fracción IL-2.
Los conjugados ejemplares están comprendidos dentro de la estructura a continuación:
en la que:
cada (n) es, independientemente, un número entero que presenta un valor de entre 2 y 4.000, e
IL-2 es un residuo de una fracción IL-2.
Otros conjugados ejemplares se encuentran comprendidos dentro de la estructura a continuación:
en la que:
cada (n) es, independientemente, un número entero que presenta un valor de entre 2 y 4.000,
(a) es cero o uno,
X, en caso de hallarse presente, es una fracción espaciadora que comprende uno o más átomos,
(b') es un cero o un número entero que presenta un valor de entre uno y diez,
(c) es un número entero que presenta un valor de entre uno y diez,
R2, en cada aparición es, independientemente, H o un radical orgánico,
R3, en cada aparición es, independientemente, H o un radical orgánico, e
IL-2 es un residuo de una fracción IL-2.
Todavía otros conjugados ejemplares se encuentran comprendidos dentro de la estructura a continuación:
en la que:
cada (n) es, independientemente, un número entero que presenta un valor de entre 2 y 4.000, e
IL-2 es un residuo de una fracción IL-2.
Entre los conjugados ejemplares que incluyen un enlace liberable se incluyen aquellos en los que una fracción IL-2 se encuentra conjugada con un reactivo polimérico comprendido dentro de la fórmula a continuación:
en la que:
POLY1 es un primer polímero soluble en agua,
POLY2 es un segundo polímero soluble en agua,
X1 es una primera fracción espadadora,
X2 es una segunda fracción espadadora,
Ha es un átomo de hidrógeno ionizable,
R1 es H o un radical orgánico,
R2 es H o un radical orgánico,
(a) es cero o uno,
(b) es cero o uno,
Re1, en caso de hallarse presente, es un primer grupo alterador de electrones,
Re2, en caso de hallarse presente, es un segundo grupo alterador de electrones, y
(GF) es un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo amino de un agente activo para formar un enlace liberable, tal como un enlace de carbamato. Dentro de dicha fórmula, se encuentran contemplados reactivos poliméricos que presentan la estructura más definida:
en la que cada uno de POLY1, POLY2, X1, X2, R1, R2, Ha y (GF) es tal como se ha definido anteriormente; Re1 es un primer grupo alterador de electrones, y Re2 es un segundo grupo alterador de electrones.
Todavía otros reactivos poliméricos ejemplares se encuentran comprendidos dentro de las fórmulas a continuación:
en las que, para cada estructura y en cada caso, (n) es, independientemente, un número entero entre 4 y 1.500. Dichos reactivos poliméricos que proporcionan un enlace liberable pueden prepararse de acuerdo con los procedimientos indicados en la solicitud publicada de patente US n° 2006/0293499.
Entre los conjugados ejemplares formados utilizando los reactivos poliméricos que proporcionan enlace liberable se incluyen los que presentan las fórmulas a continuación:
en las que:
POLY1 es un primer polímero soluble en agua,
POLY2 es un segundo polímero soluble en agua,
X1 es una primera fracción espadadora,
X2 es una segunda fracción espadadora,
Ha es un átomo de hidrógeno ionizable,
R1 es H o un radical orgánico,
R2 es H o un radical orgánico,
(a) es cero o uno,
(b) es cero o uno,
Re1, en caso de hallarse presente, es un primer grupo alterador de electrones, Re2, en caso de hallarse presente, es un segundo grupo alterador de electrones, Y1 es O o S,
Y2 es O o S, e
(IL-2) es un residuo de una fracción IL-2.
Los conjugados ejemplares presentan las estructuras a continuación:
en las que, para cada estructura y en cada caso, (n) es, independientemente, un número entero entre 4 y 1.500 e (IL-2) es un residuo de una fracción IL-2.
Los grupos carboxilo representan otro grupo funcional que puede servir de punto de unión en la fracción IL-2. Estructuralmente, el conjugado comprenderá lo siguiente:
en donde (IL-2) y el grupo carbonilo contiguo corresponden a la fracción IL-2 que contiene carboxilo, X es un enlace, preferentemente un heteroátomo seleccionado de entre O, N(H) y S, y POLY es un polímero soluble en agua, tal como PEG, que opcionalmente termina en una fracción de caperuza terminal.
El enlace C(O)-X resulta de la reacción entre un derivado polimérico que porta un grupo funcional terminal y una fracción IL-2 que contiene carboxilo. Tal como se ha comentado anteriormente, el enlace específico dependerá del tipo de grupo funcional utilizado. En el caso de que el polímero presente un extremo funcionalizado o "activado" con un grupo hidroxilo, el enlace resultante será un éster de ácido carboxílico y X será O. En el caso de que el esqueleto de polímero esté funcionalizado con un grupo tiol, el enlace resultante será un tioéster y X será S. En el caso de que se utilicen determinados polímeros multibrazo, ramificados o bifurcados, la fracción C(O)X, y en particular la fracción X, serán relativamente más compleja y puede incluir una estructura de enlace más larga.
Los derivados solubles en agua que contienen una fracción hidrazida también resultan útiles para la conjugación en un carbonilo y ácido carboxílico. En la medida en que la fracción IL-2 no contiene una fracción carbonilo o un ácido carboxílico, puede añadirse una utilizando técnicas conocidas por el experto ordinario en la materia. Por ejemplo, puede introducirse una fracción carbonilo mediante la reducción de un ácido carboxílico (p.ej., el ácido carboxílico terminal) y/o mediante la provisión de versiones glucosiladas o glicadas (en las que los azúcares añadidos presentan una fracción carbonilo) de la fracción IL-2. Con respecto a las fracciones IL-2 que contienen un ácido carboxílico, un reactivo PEG-hidrazina puede, en presencia de un agente de acoplamiento (p.ej., DCC), unirse covalentemente a la fracción IL-2 (p.ej., mPEG-OCH2C(O)NHNH2 + HOC(O)-(IL-2) resulta en mPEG-OCH2C(O)NHNHC(O)-IL-2]. Se proporcionan ejemplos específicos de derivados solubles en agua que contienen una fracción hidrazida, junto con los conjugados correspondientes, en la Tabla 2, posteriormente. Además, cualquier derivado soluble en agua que contenga un éster activado (p.ej., un grupo succinimidilo) puede convertirse para contener una fracción hidrazida
mediante la reacción del derivado polímero soluble en agua que contiene el éster activado con hidrazina (NH2-NH2) o carbazato de terc-butilo [NH2NHCO2C(CH3)3]. En la tabla, la variable (n) representa el número de unidades monoméricas repetitivas y "-C(O)-(IL-2)" representa el residuo de la fracción IL-2 tras la conjugación con el reactivo polimérico. Opcionalmente, el enlace hidrazona puede reducirse utilizando un agente reductor adecuado. Aunque cada parte polimérica [p.ej., (OCH2CH2)n o (CH2CH2O)n] presentada en la Tabla 2 termina en un grupo "CH3", otros grupos pueden sustituirlo (tales como H y bencilo).
Tabla 2
Tabla 2 (continuación)
Los grupos tiol contenidos dentro de la fracción IL-2 puede servir de sitios efectivos de unión para el polímero soluble en agua. En particular, los residuos de cisteína proporcionan grupos tiol en el caso de que la fracción IL-2 sea una proteína. Los grupos tiol en dichos residuos de cisteína a continuación pueden hacerse reaccionar con un PEG activado que es específico para la reacción con grupos tiol, p.ej., un polímero N-maleimidilo u otro derivado tal como se indica en la patente US n° 5.739.208 y en la solicitud publicada de patente internacional n° WO 01/62827. Además, puede incorporarse un tiol protegido en una cadena lateral oligosacárido de una glucoproteína activada, seguido de la desprotección con un polímero soluble en agua reactivo con tiol.
Se proporcionan ejemplos específicos de reactivos, junto con el conjugado correspondiente, en la Tabla 3, posteriormente. En la tabla, la variable (n) representa varias unidades monoméricas repetitivas y "-S-(IL-2)" representa el residuo de la fracción IL-2 tras la conjugación con el polímero soluble en agua. Aunque cada parte polimérica [p.ej., (OCH2CH2)n o (CH2CH2O)n] presentada en la Tabla 3 termina en un grupo "CH3", otros grupos pueden sustituirlo (tales como H y bencilo).
Con respecto a las SEC ID n° 1 y n° 2 correspondientes a las fracciones IL-2 ejemplares, puede observarse que hay un residuo de cisteína en la posición 125. De esta manera, un sitio de unión de tiol ejemplar es la cisteína situada en la posición 125. Aunque resulta preferente no interrumpir ningún enlace disulfuro asociado a una fracción IL-2 dada, puede resultar posible unir un polímero dentro de la cadena lateral de uno o más de dichos residuos de cisteína y conservar cierta actividad. Además, resulta posible añadir un residuo de cisteína a la fracción IL-2 utilizando técnicas sintéticas convencionales. Ver, por ejemplo, el procedimiento descrito en la solicitud publicada de patente internacional n° WO 90/12874 para añadir residuos de cisteína, en la que dicho procedimiento puede adaptarse para una fracción IL-2. Además, también pueden utilizarse procedimientos convencionales de ingeniería genética para introducir un residuo de cisteína en la fracción IL-2. Sin embargo, en algunas realizaciones resulta preferente no introducir un residuo de cisteína y/o grupo tiol adicional.
Tabla 3
Tabla 3 (continuación)
Tabla 3 (continuación)
Con respecto a los conjugados formados a partir de polímeros solubles en agua portadores uno o más grupos funcionales maleimida (con independencia de si la maleimida reacciona con un grupo amina o tiol en la fracción IL-2), la forma o formas ácido maleámico correspondientes del polímero soluble en agua también puede reaccionar con la fracción IL-2. Bajo determinadas condiciones (p.ej., un pH de entre aproximadamente 7 y 9 y en presencia de agua), el anillo maleimida "se abrirá" para formar el ácido maleámico correspondiente. El ácido maleámico a su vez puede reaccionar con un grupo amina o tiol de una fracción IL-2. Las reacciones basadas en ácido maleámico ejemplares se muestran esquemáticamente después. POLI representa el polímero soluble en agua e (IL-2) representa la fracción IL-2.
Un conjugado representativo puede presentar la estructura a continuación:
POLY-Lq,1-C(C))Z-Y-S-S-(IL-2)
en la que POLI es un polímero soluble en agua, L es un conector opcional, Z es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O, NH y S, e Y se selecciona del grupo que consiste en alquilo C2-10, alquilo sustituido C2-10, arilo y arilo sustituido, e (IL-2) es una fracción IL-2. Los reactivos poliméricos que pueden hacerse reaccionar con una fracción IL-2 y resultan en dicho tipo de conjugado se describen en la solicitud publicada de patente US n° 2005/0014903.
Tal como se ha indicado anteriormente, los conjugados ejemplares en los que el polímero soluble en agua se encuentra en una forma ramificada, presentará la forma ramificada del polímero soluble en agua que comprende la estructura siguiente:
en la que cada (n) es, independientemente, un número entero que presenta un valor de entre 2 y 4.000.
Los conjugados ejemplares que presentan un polímero soluble en agua en forma ramificada se preparan utilizando el reactivo a continuación:
formando de esta manera un conjugado que presenta la estructura a continuación:
en la que:
(para cada estructura) cada (n) es, independientemente, un número entero que presenta un valor de entre 2 y 4.000, e
IL-2 es un residuo de una fracción IL-2.
Puede formarse un conjugado ejemplar adicional utilizando un reactivo:
formando de esta manera un conjugado que presenta la estructura a continuación:
en la que:
(para cada estructura) (n) es, independientemente, un número entero que presenta un valor de entre 2 y 4.000, e IL-2 es un residuo de una fracción IL-2.
Pueden formarse conjugados utilizando reactivos poliméricos selectivos de tiol, de varias maneras. Por ejemplo, la fracción IL-2 -- opcionalmente en un tampón adecuado (incluyendo tampones que contienen amina, si se desea) -- se
introduce en un medio acuoso a un pH de entre aproximadamente 7 y 8, y el reactivo polimérico selectivo de tiol se añade en un exceso molar. Se deja que la reacción continúe durante aproximadamente 0,5 a 2 horas, aunque los tiempos de reacción superiores a 2 horas (p.ej., 5 horas, 10 horas, 12 horas y 24 horas) pueden resultar útiles en el caso de que se determine que los rendimientos de PEGilación son relativamente bajos. Los reactivos poliméricos ejemplares que pueden utilizarse en este enfoque son reactivos poliméricos que portan un grupo reactivo seleccionado del grupo que consiste en maleimida, sulfona (p.ej., vinilsulfona) y tiol (p.ej., tioles funcionalizados, tales como un ortopiridinilo o "OPSS").
Con respecto a reactivos poliméricos, los indicados en la presente memoria y en otros sitios pueden adquirirse de proveedores comerciales o prepararse a partir de materiales de partida disponibles comercialmente. Además, los métodos para preparar los reactivos poliméricos se describen en la literatura.
Tal como se indica en las reivindicaciones, la unión entre la fracción IL-2 y el polímero soluble en agua no peptídico es indirecta, en la que uno o más átomos que forman un enlace de carbamato liberable están localizados entre la fracción IL-2 y el polímero. Con respecto a la unión indirecta, una "fracción espadadora" sirve como conector entre el residuo de la fracción IL-2 y el polímero soluble en agua. El átomo o átomos que constituyen la fracción espaciadora pueden incluir uno o más átomos de carbono, átomos de nitrógeno, átomos de azufre, átomos de oxígeno y combinaciones de los mismos. La fracción espaciadora puede comprender una amida, amina secundaria, carbamato, tioéter y/o grupo disulfuro. Entre los ejemplos no limitativos de fracciones espaciadoras específicas se incluyen las seleccionadas del grupo que consiste en -O-, -S-, -S-S-, -C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, -C(S)-, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -O-CH2-, -CH2-O-, -O-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-O-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-O-CH2-, -CH2-C(O)-O-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-O-CH2-, -C(O)-O-CH2-CH2-, -NH-C(O)-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-CH2-, -NH-CH2-, -NH-CH2-CH2-, -CH2-NH-CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2-, -C(O)-CH2-, -C(O)-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-[CH2]h-(OCH2CH2)j-, grupo cicloalquilo bivalente, -O-, -S-, un aminoácido, -N(R6)-, y combinaciones de dos o más de cualquiera de los anteriores, en el que R6 es H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido, (h) es cero a seis y (j) es cero a 20. Otras fracciones espaciadoras específicas presentan las estructuras a continuación: -C(O)-NH-(c H2)-i-6-NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-(CH2)-i-6-NH-C(O)- y -O-C(O)-Nh -(CH2)1-6-NH-C(O)-, en las que los valores de subíndice que siguen a cada metileno indican el número de metilenos contenidos en la estructura, p.ej., (CH2)-i_6 se refiere a que la estructura puede contener 1, 2, 3, 4, 5 o 6 metilenos. Adicionalmente, cualquiera de las fracciones espaciadoras anteriormente indicadas puede incluir además una cadena oligómero de óxido de etileno que comprende 1 a 20 unidades de monómero de óxido de etileno [es decir, -(CH2CH2O)1-20]. Es decir, la cadena de oligómero de óxido de etileno puede encontrarse antes o después de la fracción espaciadora, y opcionalmente entre dos átomos cualesquiera de una fracción espaciadora que comprende dos o más átomos. Además, la cadena de oligómero no se considera parte de la fracción espaciadora en el caso de que el oligómero sea contiguo a un segmento de polímero y meramente representa una extensión del segmento de polímero.
Composiciones
Los conjugados típicamente son parte de una composición. Generalmente, la composición comprende una pluralidad de conjugados, preferentemente, aunque no necesariamente, cada conjugado comprende la misma fracción IL-2 (es decir, dentro de la composición total, sólo se encuentra un tipo de fracción IL-2). Además, la composición puede comprender una pluralidad de conjugados, en la que cualquier conjugado dado comprende una fracción seleccionada del grupo que consiste en dos o más fracciones IL-2 diferentes (es decir, dentro de la composición total, se encuentran dos o más fracciones IL-2 diferentes). Sin embargo, óptimamente, sustancialmente la totalidad de los conjugados en la composición (p.ej., 85% o más de la pluralidad de conjugados en la composición) comprende, cada uno, la misma fracción IL-2.
La composición puede comprender una única especie de conjugado (p.ej., un conjugado monoPEGilado, en el que el polímero único está unido en el mismo sitio en sustancialmente la totalidad de conjugados en la composición) o una mezcla de especies de conjugado (p.ej., una mezcla de conjugados monoPEGilados en los que la unión del polímero se produce en diferentes sitios y/o una mezcla de conjugados monoPEGilados, diPEGilados y triPEGilados). Las composiciones pueden comprender además otros conjugados que presentan cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más polímeros unidos a cualquier fracción dada que presenta actividad de IL-2. Además, la invención incluye casos en los que la composición comprende una pluralidad de conjugados, en la que cada conjugado comprende un polímero soluble en agua unido covalentemente a una fracción IL-2, así como composiciones que comprenden dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más polímeros solubles en agua unidos covalentemente a una fracción IL-2.
Con respecto a los conjugados en la composición, la composición satisfará una o más de las características siguientes: por lo menos aproximadamente 85% de los conjugados en la composición presentará uno a cuatro polímeros unidos a la fracción IL-2; por lo menos aproximadamente 85% de los conjugados en la composición presentar uno a tres polímeros unidos a la fracción IL-2; por lo menos aproximadamente 85% de los conjugados en la composición presentar uno a dos polímeros unidos a la fracción IL-2; por lo menos aproximadamente 85% de los conjugados en la composición presentará un polímero unido a la fracción IL-2; por lo menos aproximadamente 95% de los conjugados en la composición presentar uno a cinco polímeros unidos a la fracción IL-2; por lo menos aproximadamente 95% de los conjugados en la composición presentará uno a cuatro polímeros unidos a la fracción IL-2; por lo menos aproximadamente 95% de los conjugados en la composición presentará uno a tres polímeros unidos a la fracción I-2; por lo menos aproximadamente 95% de los conjugados en la composición presentará uno a dos polímeros unidos a la fracción IL-2; por lo menos aproximadamente 95% de los conjugados en la composición presentará un polímero unido a la fracción IL-2; por lo menos aproximadamente 995 de los conjugados en la composición presentará uno a cinco polímeros unidos a la fracción IL-2; por lo menos aproximadamente 99% de los conjugados en la composición presentar uno a cuatro polímeros unidos a la fracción IL-2; por lo menos aproximadamente 99% de los conjugados en la composición presentar uno a tres polímeros unidos a la fracción IL-2, por lo menos aproximadamente 99% de los conjugados en la composición presentará uno a dos polímeros unidos a la fracción IL-2; y por lo menos aproximadamente 99% de los conjugados en la composición presentará un polímero unido a la fracción IL-2. Se entiende que una referencia a un abanico de polímeros, p.ej., "de x a y polímeros" contempla un número de polímeros x a y ambos inclusive (es decir, por ejemplo, "de uno a tres polímeros" contempla un polímero, dos polímeros y tres polímeros; "de uno a dos polímeros" contempla un polímero y dos polímeros, y de esta manera sucesivamente).
En una o más realizaciones, resulta preferente que la composición que contiene conjugado se encuentre libre o sustancialmente libre de albúmina. También resulta preferente que la composición se encuentre libre o sustancialmente libre de proteínas que no presentan actividad de IL-2. De esta manera, resulta preferente que la composición se encuentre 85%, más preferentemente 95%, y lo más preferentemente 99% libre de albúmina. Adicionalmente, resulta preferente que la composición se encuentre 85%, más preferentemente 95%, y lo más preferentemente 99% libre de cualquier proteína que no presente actividad de IL-2. En la medida en que se encuentra presente albúmina en la composición, las composiciones ejemplares de la invención se encuentran sustancialmente libres de conjugados que comprenden un polímero poli(etilenglicol) que une un residuo de una fracción IL-2 a albúmina.
En la marca PROLEUKIN® de aldesleuquina (disponible de Prometheus Laboratories Inc., San Diego CA), IL-2 se proporciona en combinación con dodecilsulfato sódico ("SDS"). En contraste, las composiciones de la presente invención ventajosamente pueden no requerir SDS y, por lo tanto, se encuentran libres (o sustancialmente libres) de SDS, así como detergentes generalmente (p.ej., Tween-20 y Tween-80). En consecuencia, las composiciones y conjugados de la presente invención pueden prepararse sin llevar a cabo una etapa de adición de SDS, Tween-20 y Tween-80. Además, las composiciones y conjugados de la presente invención pueden prepararse sin llevar a cabo la etapa de adición de un detergente u otro excipiente. Además, las composiciones de la presente invención se encuentran libres o sustancialmente libres (p.ej., presentan menos de aproximadamente 20%, más preferentemente menos de aproximadamente 15%, todavía más preferentemente menos de 10%, aún todavía más preferentemente menos de aproximadamente 9%, aún todavía más preferentemente menos de aproximadamente 8%, aún todavía más preferentemente menos de aproximadamente 7%, todavía más preferentemente menos de aproximadamente 6%, aún todavía más preferentemente menos de aproximadamente 5%, aún todavía más preferentemente menos de aproximadamente 4%, aún todavía más preferentemente menos de aproximadamente 3%, aún todavía más preferentemente menos de aproximadamente 2%, aún todavía más preferentemente menos de aproximadamente 1%, aún todavía más preferentemente menos de aproximadamente 0,5%, en donde menos de 0,001% resulta más preferente) de detergentes, tales como SDS, Tween-20 y Tween-80. Además, las composiciones y conjugados de la presente invención pueden prepararse sin llevar a cabo una etapa de eliminación (por ejemplo, mediante ultrafiltración) de detergentes, tales como s Ds , Tween-20 y Tween-80. Además, las composiciones y conjugados de la presente invención pueden prepararse sin llevar a cabo una etapa de eliminación (mediante, por ejemplo, ultrafiltración) de un detergente.
El control del número deseado de polímeros para una fracción dada puede conseguirse mediante la selección del reactivo polimérico apropiado, la proporción de reactivo polimérico a fracción IL-2, la temperatura, las condiciones de pH y otros aspectos de la reacción de conjugación. Además, la reducción o eliminación de los conjugados no deseados (p.ej., aquellos conjugados que presentan cuatro o más polímeros unidos) pueden llevarse a cabo mediante medios de purificación.
Por ejemplo, los conjugados de polímero-fracción IL-2 pueden purificarse para obtener/aislar diferentes especies conjugadas. Específicamente, la mezcla de producto puede purificarse para obtener una media de un, dos, tres, cuatro, cinco o más p Eg por cada fracción IL-2, típicamente un, dos o tres PEG por cada fracción IL-2. La estrategia de purificación de la mezcla de reacción de conjugado final dependerá de varios factores, entre ellos, por ejemplo, el peso molecular del reactivo polimérico utilizado, la fracción IL-2 particular, el régimen de administración deseado y la actividad residual y propiedades in vivo del conjugado o conjugados individuales.
Si se desea, pueden aislarse conjugados con diferentes pesos moleculares utilizando cromatografía de filtración por
gel y/o cromatografía de intercambio iónico. Es decir, se utiliza la cromatografía de filtración por gel para fraccionar diferentes proporciones de polímero a fracción IL-2 (p.ej., 1-mero, 2-mero, 3-mero y de esta manera sucesivamente, en donde "1-mero" indica 1 polímero a una fracción IL-2, "2-mero" indica dos polímeros por cada fracción IL-2, y así sucesivamente) basándose en sus diferentes pesos moleculares (donde la diferencia corresponde esencialmente al peso molecular medio de la parte polimérica soluble en agua). Por ejemplo, en una reacción ejemplar en la que una proteína de 35.000 daltons se conjuga aleatoriamente con un reactivo polimérico que presenta un peso molecular de aproximadamente 20.000 daltons, la mezcla de reacción resultante puede contener proteína no modificada (con un peso molecular de aproximadamente 35.000 daltons), proteína monoPEGilada (con un peso molecular de aproximadamente 55.000 daltons), proteína diPEGilada (con un peso molecular de aproximadamente 75.000 daltons), y de esta manera sucesivamente.
Aunque dicho enfoque puede utilizarse para separar PEG y otros conjugados de polímero-fracción IL-2 con diferentes pesos moleculares, dicho enfoque resulta generalmente ineficaz para separar isoformas posicionales con diferentes sitios de unión de polímero en la fracción IL-2. Por ejemplo, la cromatografía de filtración en gel puede utilizarse para separar mezclas de 1-meros, 2-meros, 3-meros, etc. de PEG, aunque cada una de las composiciones de conjugado recuperadas puede contener uno o más PEG unidos a diferentes grupos reactivos (p.ej., residuos de lisina) dentro de la fracción IL-2.
Entre las columnas de filtración por gel adecuadas para llevar a cabo este tipo se separación se incluye las columnas Superdex™ y Sephadex™ disponibles de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). La selección de una columna particular dependerá del intervalo de fraccionamiento deseado. La elución generalmente se lleva a cabo utilizando un tampón adecuado, tal como fosfato o acetato. Las fracciones recogidas pueden analizarse mediante varios métodos diferentes, por ejemplo: (i) absorbancia a 280 nm para el contenido de proteína, (ii) análisis de proteínas basado en pigmentos, utilizando la albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés) como patrón, (ii) los ensayos con yodo para el contenido de PEG (Sims et al., Anal. Biochem, 107:60-63, 1980), (iv) la electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico (SDS PAGE), seguido de la tinción con yoduro bárico, y (v) la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPCL).
La separación de las isoformas posicionales se lleva a cabo mediante cromatografía de fase inversa utilizando una cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) utilizando una columna adecuada (p.ej., una columna C18 o una columna C3, disponible comercialmente de compañías tales como Amersham Biosciences o Vydac) o mediante cromatografía de intercambio iónico utilizando una columna de intercambio iónico, p.ej., una columna de intercambio iónico Sepharose™, disponible de Amersham Biosciences. Cualquiera de los enfoques puede utilizarse para separar polímero-isómeros agentes activos que presentan el mismo peso molecular (es decir, isoformas posicionales).
Las composiciones se encuentran preferentemente libres de proteínas que no presentan actividad de IL-2. Además, las composiciones preferentemente se encuentran sustancialmente libres de cualesquiera otros polímeros solubles en agua unidos no covalentemente. Sin embargo, bajo algunas circunstancias, la composición puede contener una mezcla de conjugados de polímero-fracción IL-2 y fracción IL-2 no conjugada.
Opcionalmente, la composición de la invención comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable. Si se desea, el excipiente farmacéuticamente aceptable puede añadirse a un conjugado para formar una composición. Entre los excipientes ejemplares se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los seleccionados del grupo que consiste en carbohidratos, sales inorgánicas, agentes antimicrobianos, antioxidantes, surfactantes, tampones, ácidos, bases, aminoácidos y combinaciones de los mismos.
Un carbohidrato, tal como un azúcar, un azúcar derivatizado, tal como alditol, ácido aldónico, un azúcar esterificado y/o un polímero de azúcar, puede encontrarse presente en forma de un excipiente. Entre los excipientes carbohidrato específicos se incluyen, por ejemplo, monosacáridos, tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa y sorbosa; disacáridos, tales como lactosa, sacarosa, trehalosa y celobiosa; polisacáridos, tales como rafinosa, melezitosa, maltodextrinas, dextranos almidones, y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol), piranosil-sorbitol, mioinositol y ciclodextrinas.
El excipiente puede incluir además una sal inorgánica o tampón, tal como ácido cítrico, cloruro sódico, cloruro potásico, sulfato sódico, nitrato potásico, fosfato sódico monobásico, fosfato sódico dibásico y combinaciones de los mismos. La composición puede incluir además un agente antimicrobiano para la prevención o bloqueo del crecimiento microbiano. Entre los ejemplos no limitativos de agentes antimicrobianos adecuados para una o más realizaciones de la presente invención se incluyen cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, cloruro de cetilpiridinio, clorobutanol, fenol, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, timerosal y combinaciones de los mismos. También puede encontrarse presente un antioxidante en la composición. Se utilizan antioxidantes para evitar la oxidación, bloqueando de esta manera el deterioro del conjugado u otros componentes de la preparación. Entre los antioxidantes adecuados para la utilización en una o más realizaciones de la presente invención se incluyen, por
ejemplo, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido hipofosforoso, monotioglicerol, galato de propilo, bisulfito sódico, sulfoxilato de formaldehído sódico, metabisulfito sódico y combinaciones de los mismos.
Puede encontrarse presente un surfactante como excipiente. Entre los surfactantes ejemplares se incluyen: polisorbatos, tales como TWEEN-20 y TWEEN-80, y Pluronics, tales como F68 y F88 (ambos disponibles de BASF, Mount Olive, New Jersey), ésteres de sorbitano; lípidos, tales como fosfolípidos, tales como lecitina y otras fofatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas (aunque preferentemente no en forma liposómica), ácidos grasos y ésteres grasos; esteroides, tales como colesterol, y agentes quelantes, tales como EDTA, cinc y otros cationes adecuados similares.
Pueden encontrarse presentes ácidos o bases como excipientes en la composición. Entre los ejemplos no limitativos de ácidos que pueden utilizarse se incluyen ácidos seleccionados del grupo que consiste en ácido clorhídrico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido tricloroacético, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido fumárico y combinaciones de los mismos. Entre los ejemplos de bases adecuadas se incluyen, aunque sin limitación, bases seleccionadas del grupo que consiste en hidróxido sódico, acetato sódico, hidróxido amónico, hidróxido potásico, acetato amónico, acetato potásico, fosfato sódico, fosfato potásico, citrato sódico, formato sódico, sulfato sódico, sulfato potásico, fumarato potásico y combinaciones de los mismos.
Pueden encontrarse presentes uno o más aminoácidos como excipientes en las composiciones indicadas en la presente memoria. Entre los aminoácidos ejemplares a este respecto se incluyen arginina, lisina y glicina.
La cantidad del conjugado (es decir, el conjugado formado entre el agente activo y el reactivo polimérico) en la composición variará dependiendo de varios factores, aunque óptimamente será una dosis terapéuticamente eficaz en el caso de que la composición se almacene en un recipiente de dosis unitaria (p.ej., un vial). Además, la preparación farmacéutica puede alojarse en una jeringa. Una dosis terapéuticamente eficaz puede determinarse experimentalmente mediante la administración repetida de cantidades crecientes del conjugado a fin de determinar qué cantidad produce un resultado clínicamente deseado.
La cantidad de cualquier excipiente individual en la composición variará dependiendo de la actividad del excipiente y de las necesidades particulares de la composición. Típicamente, la cantidad óptima de cualquier excipiente individual se determina mediante experimentación rutinaria, es decir, mediante la preparación de composiciones que contienen cantidades variables del excipiente (comprendidas entre bajas y altas), examinando la estabilidad y otros parámetros, seguido de la determinación del intervalo en el que se consigue un rendimiento óptimo sin efectos adversos significativos.
Sin embargo, generalmente el excipiente se encontrará presente en la composición en una cantidad de entre aproximadamente 1% y aproximadamente 99% en peso, preferentemente de entre aproximadamente 5% y aproximadamente 98% en peso, más preferentemente de entre aproximadamente 15% y aproximadamente 95% en peso del excipiente, resultando más preferentes las concentraciones inferiores a 30% en peso.
Dichos excipientes farmacéuticos, junto con otros excipientes, se describen en Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19a ed., Williams & Williams, (1995), la obra "Physician's Desk Reference", 52a ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), y Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a edición, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000.
Las composiciones comprenden todos los tipos de formulaciones y en particular las que resultan adecuadas para la inyección, p.ej., polvos o liofilizados que pueden reconstituirse, así como líquidos. Entre los ejemplos de diluyentes adecuados para reconstituir composiciones sólidas antes de la inyección se incluyen agua bacteriostática para inyección, dextrosa al 5% en agua, solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer, solución salina, agua estéril, agua desionizada y combinaciones de los mismos. Con respecto a las composiciones farmacéuticas líquidas, se encuentran contempladas las soluciones y suspensiones.
Las composiciones de una o más realizaciones de la presente invención típicamente, aunque no necesariamente, se administran mediante inyección y, por lo tanto, generalmente son soluciones o suspensiones líquidas inmediatamente antes de la administración. La preparación farmacéutica también puede adoptar otras formas, tales como jarabes, cremas, pomadas, tabletas y polvos. Otros modos de administración también se encuentran incluidos, tales como pulmonar, rectal, transdérmica, transmucosal, oral, intratecal, intratumoral, peritumoral, intraperitoneal, subcutánea e intraarterial.
La invención proporciona además una composición farmacéutica para la utilización en terapia, que puede implicar la administración de un conjugado en un paciente que sufre de una condición que responde al tratamiento con el conjugado. El método puede comprender la administración en un paciente, generalmente mediante inyección, de una cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado. Tal como se ha indicado anteriormente, los conjugados pueden inyectarse (p.ej., por vía intramuscular, subcutánea y parenteral). Entre los tipos de formulación adecuados para la
administración parenteral se incluyen soluciones listas para la inyección, polvos secos para la combinación con un solvente antes de la utilización, suspensiones listas para la inyección, composiciones insolubles secas para la combinación con un vehículo antes de la utilización, y emulsiones y concentrados líquidos para la dilución antes de la administración.
El método puede comprender la administración del conjugado (preferentemente proporcionado como parte de una composición farmacéutica) y puede llevarse a cabo opcionalmente para localizar el conjugado en una zona específica. Por ejemplo, las formulaciones líquidas, de gel y sólidas que comprenden el conjugado podrían implantarse quirúrgicamente en una zona enfermedad (tal como en un tumor, próximo a un tumor, en una zona inflamada y próximo a una zona inflamada). Convenientemente, también pueden obtenerse imágenes de órganos y tejidos a fin de garantizar la localización deseada está mejor expuesta al conjugado.
La composición farmacéutica para la utilización en terapia puede utilizarse para tratar cualquier condición que pueda remediarse o prevenirse mediante la administración del conjugado. El experto ordinario en la materia apreciará qué condiciones puede tratar eficazmente un conjugado específico. Por ejemplo, los conjugados pueden utilizarse solos o en combinación con otra farmacoterapia para tratar pacientes que sufren de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en carcinoma de células renales, melanoma metastásico, virus de la hepatitis C (VHC), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), leucemia mieloide aguda, linfoma no de Hodgkin, linfoma cutáneo de células T, artritis reumatoide juvenil, dermatitis atópica, cáncer de mama y cáncer de vejiga. Ventajosamente, el conjugado puede administrarse en el paciente antes, simultáneamente o después de la administración de otro agente activo.
La dosis real que debe administrarse variará según la edad, peso y condición general del sujeto, así como de la gravedad de la condición bajo tratamiento, el criterio del profesional sanitario y el conjugado que se administre. Las cantidades terapéuticamente eficaces son conocidas por el experto en la materia y/o se describen en los textos de referencia y literatura pertinente. Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz se encontrará comprendida entre aproximadamente 0,001 mg y 100 mg, preferentemente en dosis de entre 0,01 mg/día y 75 mg/día, y más preferentemente en dosis de entre 0,10 mg/día y 50 mg/día. Una dosis dada puede administrarse periódicamente hasta que, por ejemplo, los síntomas de envenenamiento por organofosfatos se reduzcan y/o se eliminen por completo. La dosis unitaria de cualquier conjugado dado (nuevamente, preferentemente proporcionada como parte de una preparación farmacéutica) puede administrarse en una diversidad de programas de administración según el criterio médico, las necesidades del paciente, etc. El programa de administración específico será conocido por el experto ordinario en la materia o podrá determinarse experimentalmente mediante métodos rutinarios. Entre los programas de administración ejemplares se incluyen, sin limitación, la administración una vez al día, tres veces a la semana, dos veces a la semana, una vez a la semana, dos veces al mes, una vez al mes y cualquier combinación de los mismos. Una vez se ha conseguido el resultado clínico, se detiene la administración de la composición.
PARTE EXPERIMENTAL
La práctica de la invención utilizará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de síntesis orgánica, bioquímica y purificación de proteínas, que se encuentra comprendida dentro de los conocimientos del experto en la materia. Dichas técnicas se explican por completo en la literatura. Ver, por ejemplo, J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4a ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992), supra.
En los ejemplos siguientes, se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (p.ej., cantidades, temperaturas, etc.), aunque debe considerarse cierto error y desviación experimental. A menos que se indique lo contrario, la temperatura se expresa en grados centígrados y la presión es igual o próxima a la presión atmosférica al nivel del mar. Cada uno de los ejemplos siguientes se considera instructivo para el experto ordinario en la materia para llevar a cabo una o más realizaciones indicadas en la presente memoria.
Se obtuvo una solución acuosa ("solución madre") que comprendía IL-2 recombinante ("rIL-2") correspondiente a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 3, la secuencia de proteína madura, de Myoderm (Norristown, PA) para la utilización en los ejemplos o se preparó de acuerdo con el Ejemplo 1. La concentración de la solución madre variaba entre 1 y 100 mg/ml.
Análisis de SDS-PAGE
Las muestras se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) utilizando el sistema NuPAGE de Invitrogen y geles premoldeados Noves de Bis-Tril al 4-10% (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las muestras se prepararon, se cargaron en el gel y se sometieron a electroforesis tal como indicaba el fabricante. Cromatografía de intercambio catiónico
Se preparó una columna de intercambio catiónico SP-HP Sepharose (GE Healthcare) con un volumen de lecho de aproximadamente 100 ml utilizando métodos estándares. La columna se conectó a un AKTA Explorer100 de GE
Healthcare (Chalfont St. Giles, Reino Unido) para purificar los conjugados de PEG-rIL-2 preparados. Los detalles del procedimiento de purificación se describen posteriormente.
Análisis de RP-HPLC
Se llevó a cabo un análisis de cromatografía de fase inversa (RP-HPLC) en un sistema de HPLC 1100 de Agilent (Santa Clara, CA). Las muestras se analizaron utilizando una columna WP-RP Intrada de Silverton (Japón) (tamaño de partícula: 3 pm, 2,1 x 150 mm). El caudal de la columna era de 0,5 ml/min. Las fases móviles eran TFA al 0,09% en agua (solvente A) y TFA al 0,04% en acetonitrilo (solvente B).
Ejemplo 1
Clonación del gen de IL-2 y expresión de rIL-2.
La secuencia de ADNc de IL-2 humana puede no expresarse óptimamente en procariotas como E. coli debido a diferencias significativas en el uso de los codones de los diferentes organismos. En lugar de realizar muchas mutaciones puntuales en la secuencia de ADNc de origen humano existente a fin de maximizar el uso de codones de E. coli, se utilizó una técnica de PCR para sintetizar por completo el gen.
El método para sintetizar el gen a partir de cebadores solapantes era esencialmente una combinación de dos métodos con modificaciones menores. Se proporciona un comentario básico de cada método individual en Young et al., Nucleic Acids Research 32(7):e59, 2004 y Devlin et al. Gene 65:13-22, 1988. Brevemente, se dividió la secuencia de ADN en oligonucleótidos directo e inverso de menos de 35 pb con unas pocas excepciones y sin huecos entre los oligonucleótidos. Cada oligonucleótido se solapaba con los dos contiguos en la cadena contrario en por lo menos 10 nucleótidos en los extremos 3' y en por lo menos 15 nucleótidos en los extremos 5'. Se utilizó una PCR asimétrica dual para ensamblar subfragmentos del gen y estos se agruparon para ensamblar el gen entero utilizando PCR por extensión de solapamientos. A continuación, se utilizó una etapa de selección con endonucleasa I de T7 para eliminar los dúplex erróneamente apareados, tal como describen Young et al. Ver Young et al. Nucleic Acids Research 32(7):e59, 2004. Se incluyeron sitios de enzimas de restricción en los extremos del gen y el fragmento génico final se clonó en un vector de expresión disponible comercialmente para E. coli. Se utilizó el análisis de la secuencia de ADN para confirmar la secuencia obtenida, tal como se muestra en la FIG. 1 y en la SEC ID n° 5.
Utilizando dicho enfoque, la secuencia de aminoácidos excluía la posición aminoácida n° 1 (alanina) en comparación con la secuencia humana madura nativa e incluía una mutación de aminoácido C ^ S en la posición aminoácida n° 125 para la secuencia, tal como se muestra. El primer aminoácido en dicha secuencia es una metionina, para la expresión bacteriana directa (no hay péptido de señal codificado). Sin embargo, con la expresión, se eliminó la metionina inicial con la metionina aminopeptidasa del huésped.
El gen se clonó en uno de los vectores de expresión pET (T7). La proteína se expresó en la cepa de E. coli BL21(DE3), una de las cepas utilizadas típicamente para el sistema de expresión de T7. Dicho sistema de expresión se encuentra disponible comercialmente y los métodos de expresión se encuentran disponibles de EMD Biosciences, Merck KGaA, Darmstadt, Alemania. La utilización de dicho sistema se llevó a cabo bajo una licencia de investigación de Brookhaven National Laboratory. El vector resultó en que la proteína se expresó en forma de cuerpos inclusión en E. coli. Las recetas típicas utilizadas para la expresión pueden encontrarse en la literatura y en Protein Production by Auto-Induction in High-Density Shaking Cultures, de F. William Studier, Biology Department, Brookhaven National Laboratory, Upton, NY 11973 (20 de diciembre, 2007).
Tras la fermentación, las células se recolectaron mediante centrifugación. El pellet con la masa celular se almacenó a -80°C para la homogeneización posterior. El pellet de masa celular congelado se resuspendió en tampón de lavado celular (Tris 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8,0) hasta una concentración de 10% (p/v) y se centrifugó a 13860 x g durante 30 minutos. Se descartó el sobrenadante. El pellet lavado se resuspendió en tampón de homogeneización (Tris 50 mM, EDTA 5 mM, PMSF 1 mM, pH 8,0) y se homogeneizó mediante un microfluidificador (M-110P from Microfluidics, Newton, Massachusetts, EE.UU.) a 4-15°C en un pase. El homogenado se diluyó en un factor de 2 con tampón de lavado celular (Tris 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8,0) y se centrifugó a 13860 x g durante 60 minutos. Se descartó el sobrenadante. El pellet de cuerpos de inclusión se lavó en tres etapas utilizando tampones secuencialmente: Tris 50 mM, EDTA 5 mM, Triton X-100 al 2%, pH 8,0; Tris 50 mM, EDTA 5 mM, desoxicolato sódico al 1%, pH 8,0; y Tris 50 mM, EDTA 5 mM, NaCl 1 M, pH 8,0. Tras el lavado, se obtuvieron los cuerpos de inclusión de IL-2 en bruto.
Los cuerpos de inclusión de IL-2 en bruto se disolvieron en tampón de guanidina 6 M, Tris 100 mM, pH 8. Se añadió EDTA hasta una concentración final de 2 mM. A continuación, se añadió ditiotreitol (DTT) hasta una concentración final de 50 mM. La mezcla se incubó a 50°C durante 30 minutos. Tras la reducción, se añadió agua a la mezcla para reducir la concentración de guanidina a 4,8 M. Tras una hora de centrifugación a 13860 x g, el pellet similar a un gel resultante se descartó. La concentración de guanidina en el sobrenadante se redujo adicionalmente a 3,5 mediante la adición de agua. Se ajustó el pH a 5 con titulación de ácido acético al 100%. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 60 minutos y se centrifugó a 13860 x g durante una hora. El pellet resultante se resuspendió en
tampón de guanidina 3,5 M, acetato 20 mM, DTT 5 mM, pH 5 y se centrifugó a 13860 x g durante una hora. Se repitió dicha etapa de lavado una vez más.
Los cuerpos de inclusión de IL-2 lavados y reducidos se disolvieron en tampón de guanidina 6 M, Tris 100 mM, pH 8. Se añadió solución madre de CuCh 100 mM hasta alcanzar una concentración final de Cu2+ de 0,1 mM. La mezcla se incubó a 4°C durante la noche.
En la presente memoria también se describe un método mejorado para proporcionar proteínas con estructura terciaria. A este respecto, los métodos anteriores con frecuencia se basan en la dilución escalonada, que con frecuencia resulta perjudicial para las proteínas. De esta manera, en un enfoque mejorado para proporcionar plegamiento a las proteínas bajo condiciones más suaves, se describe un método en el que el método comprende la etapa de introducción de una proteína expresada (p.ej., una fracción IL-2, tal como IL-2 preparada de acuerdo con el presente ejemplo) en una bolsa de diálisis con un tamaño de poro inferior al tamaño de la proteína expresada y la adición (preferentemente durante varias horas, p.ej., durante 6 horas, más preferentemente durante 10 horas, y todavía más preferentemente durante 15 horas) de una solución sin desnaturalizante de proteínas (p.ej., agua). Las soluciones sin desnaturalizantes de proteínas ejemplares son conocidas por el experto ordinario en la materia y entre ellas se incluyen, por ejemplo, soluciones (p.ej., tampones y agua) que no presentan (o que sustancialmente no presentan) guanidina, urea, perclorato de litio, 2-mercaptoetanol, ditiotreitol y detergentes. De esta manera, según el presente método, la solución de IL-2 expresada se introdujo en bolsas de diálisis (con un tamaño de poro de peso molecular de 3,5 kilodaltons). Las bolsas de diálisis se introdujeron en un reservorio que contenía tampón de guanidina 4,8 M, Tris 0,1 M, pH 8. Tras tres horas de equilibrado, la concentración de guanidina en el reservorio se redujo lentamente a 2 M mediante bombeo de agua en el reservorio durante un periodo de 15 horas. El procedimiento de replegamiento entero se completó a 4°C. La IL-2 replegada se comprobó mediante SEC-HPLC.
La IL-2 replegada se centrifugó a 13860 x g durante 60 minutos para eliminar los precipitados. El sobrenadante se concentró con el sistema de membrana TFF Pellicon XL (Millipore Corporation, EE.UU.).
La IL-2 replegada y concentrada se cargó en una columna BPG (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suecia) empaquetada con resina Sephacryl S-100 HR. El tampón de migración era guanidina 2 M, Tris 20 mM, pH 8, y el caudal era de 25 ml/min. Las fracciones bajo el pico de monómero de IL-2 se agruparon. Debe indicarse que también pueden utilizarse otros métodos de purificación adecuados, tales como la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía de interacción hidrofóbica (cromatografía HIC).
El pool de fracciones de monómero de IL-2 se concentró a aproximadamente 1-2 mg/ml utilizando el sistema de membranas TFF Pellicon XL (Millipore Corporation, EE.UU.) a 4°C y 30 a 40 psi de presión operativa. La solución concentrada de monómero de Il-2 se dializó en el tampón de formulación final (acetato de Na 10 mM, trehalosa al 5%, pH 4,5), rebajando la concentración de guanidina a menos de 0,1 mM mediante el cambio del tampón de formulación varias veces (4 a 5 veces en normal). Se esterilizó la solución de IL-2 formulada mediante el paso a través de un filtro de 0,22 |jm y se almacenó a -80°C para el uso posterior.
Ejemplo 2
PEGilación de rIL-2 con mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS
El derivado mPEG2-C2-fmoc-20K-N-hidroxisuccinimida, 20 kDa ("mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS")
mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS, almacenado a -80°C bajo argón, se calentó hasta la temperatura ambiente bajo purga de nitrógeno. Se preparó una solución madre (200 mg/ml) de mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS en HCl 2 mM y se añadió mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS a rIL-2 en una cantidad suficiente para alcanzar una proporción molar de mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS a rIL-2 de 100:1. La concentración final de rIL-2 en la mezcla era de 0,5 mg/ml (0,035 mM). Se añadió tampón de bicarbonato sódico (1 M, pH 9,0) a la mezcla hasta alcanzar una concentración final de 20 mM y se dejó que transcurriese la conjugación durante treinta minutos, proporcionando conjugados [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]. Tras treinta minutos, se llevó a cabo la desactivación mediante la adición de glicina 1 M (pH 6,0) a la mezcla de reacción hasta alcanzar una concentración final de 100 mM. A continuación, la mezcla de reacción desactivada se diluyó con H2O, proporcionando una conductividad inferior a 0,5 mS/cm (25°C). Se ajustó el pH a 4,0 utilizando ácido acético glacial antes de la purificación mediante cromatografía de columna.
Se proporciona un perfil de purificación de cromatografía de intercambio catiónico típico de [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] en la FIG. 2.1. Se indican [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] y PEG no reaccionado y las líneas corresponden a la absorbancia a diversas longitudes de onda (p.ej., 280 nm y 225 nm). El análisis de la pureza de [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] mediante HPLC de fase inversa detectó una pureza del conjugado purificado de 100% a 280 nm. Ver la FIG. 2.2. La pureza no era inferior a 95% según determinación mediante gel SDS-PAGE NuPage Bis-Tris al 4-12% con tinción de azul de Coomassie (gel no mostrado) con 20 |jg de [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] purificado. El gran peso molecular aparente del conjugado, superior a 200 kDa, se cree que es el resultado de la lenta movilidad del conjugado por el gel debido al elevado grado de hidratación de PEG y el resultante radio hidrodinámico relativamente grande. Mediante dichos ensayos, se confirmó que se habían producido cuatro conjugados: un 4-mero, 3-mero, 2-mero y 1-mero, es decir, un [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] en el que se unen cuatro "[mPEG2-C2-fmoc-20K]" a un único "[rIL-2]" para un 4-mero, se unen tres "[mPEG2-C2-fmoc-20K]" a "[rIL-2]" único para un 3-mero, se unen dos "[mPEG2-c2-fmoc-20K]" a un único [rIL-2] para un 2-mero, y se unió un "[mPEG2-C2-fmoc-20K]" a un único [rIL-2] para un 1-mero.
Se mostró la naturaleza liberable de [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] para liberar rIL-2 mediante la detección del cambio de especie con HPLC de fase inversa. Brevemente, se incubó [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] purificado en solución de NaHCO3100 mM, a pH 9,0, a 37°C durante varias horas. Periódicamente, se obtuvieron alícuotas del sistema y se sometieron a ensayo para detectar la desaparición del conjugado [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] y la presencia de rIL-2 liberado. La aparición de rIL-2 alcanzó una meseta en torno a las diez horas de incubación, con una reducción gradual posiblemente debida a precipitación. Se proporcionan datos en la FIG. 2.3.
Ejemplo 3
PEGilación de rIL-2 con mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS
Se calentó derivado mPEG2-CAC-fmoc-20K-N-hidroxisuccinimida, 20 kDa, ("mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS")
mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS, almacenado a -80°C bajo argón, hasta la temperatura ambiente bajo purga de nitrógeno. Se preparó una solución madre (200 mg/ml) de mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS en HCl 2 mM y se añadió mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS a rIL-2 en una cantidad suficiente para alcanzar una proporción molar de mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS a rIL-2 de 100:1. La concentración final de rIL-2 en la mezcla era de 0,5 mg/ml (0,035 mM). Se añadió tampón de bicarbonato sódico (1 M, pH 9,0) a la mezcla hasta alcanzar una concentración final de 20 mM y se dejó que transcurriese la conjugación durante treinta minutos, proporcionando conjugados [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]. Tras treinta minutos, se llevó a cabo la desactivación mediante la adición de glicina 1 M (pH 6,0) a la mezcla de reacción hasta alcanzar una concentración final de 100 mM. A continuación, la mezcla de reacción desactivada se diluyó con H2O, proporcionando una conductividad inferior a 0,5 mS/cm (25°C). Se ajustó el pH a 4,0 utilizando ácido acético glacial antes de la purificación mediante cromatografía de columna.
Se proporciona un perfil de purificación de cromatografía de intercambio catiónico típico de [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] en la FIG. 3.1. Se indica [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] y las líneas corresponden a la absorbancia a diversas longitudes de onda. El análisis de la pureza de [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] mediante HPLC de fase inversa detectó una pureza del conjugado purificado de 98,5% a 280 nm. El pico a 19,6 minutos representa mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS no reaccionado (que constituía <0,1%). Ver la FIG. 3.2. La pureza no era inferior a 95% según determinación mediante gel SDS-PAGE NuPage Bis-Tris al 4-12% con tinción de azul de Coomassie (gel no mostrado) con 20 jg de [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] purificado. El gran peso molecular aparente del conjugado, superior a 200 kDa, se cree que es el resultado de la lenta movilidad del conjugado por el gel debido al elevado grado de hidratación de PEG. También se determinó el peso molecular de conjugados [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] purificados mediante espectrofotometría MALDI-TOF. Tal como se observa en la FIG. 3., el pico principal a 79,6 kDa se encuentra dentro del intervalo esperado de peso molecular del conjugado 3-mero [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2], El pico principal en 100,8 kDa se encuentra dentro del intervalo esperado de peso molecular del 4-mero [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]. Los picos con PM 40 kDa y 58,7 kDa puede representar los doblemente cargados conjugado 3-mero de IL-2 y 4-mero de IL-2.
Ejemplo 4 (de referencia)
PEGilación de rIL-2 con derivado ramificado de mPEG-N-hidroxisuccinimidilo, 20 kDa
Se calentó el derivado mPEG2-ru-20K-N-hidroxisuccinimidilo, 20 kDa ("mPEG2-ru-20K-NHS")
mPEG2-ru-20K-NHS, almacenado a -80°C bajo argón, hasta la temperatura ambiente bajo purga de nitrógeno. Se preparó una solución madre (200 mg/ml) de mPEG2-ru-20K-NHS en HCl 2 mM y se añadió mPEG2-ru-20K-NHS a rIL-2 en una cantidad suficiente para alcanzar una proporción molar de mPEG2-ru-20K-NHS a rIL-2 de 100:1. La concentración final de rIL-2 en la mezcla era de 0,5 mg/ml (0,035 mM). Se añadió tampón de bicarbonato sódico (1 M, pH 9,0) a la mezcla hasta alcanzar una concentración final de 20 mM y se dejó que transcurriese la conjugación durante treinta minutos, proporcionando conjugados [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]. Tras treinta minutos, se llevó a cabo la desactivación mediante la adición de glicina 1 M (pH 6,0) a la mezcla de reacción hasta alcanzar una concentración final de 100 mM. A continuación, la mezcla de reacción desactivada se diluyó con H2O, proporcionando una conductividad inferior a 0,5 mS/cm (25°C). Se ajustó el pH a 4,0 utilizando ácido acético glacial antes de la purificación mediante cromatografía de columna.
Se proporciona un perfil de purificación de cromatografía de intercambio catiónico típico de [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] en la FIG. 4.1. Se indican [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] y mPEG2-ru-20K-NHS no reaccionado y las líneas corresponden a la absorbancia a diversas longitudes de onda (p.ej., 280 nm y 225 nm). El análisis de la pureza de [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] mediante HPLC de fase inversa detectó una pureza del conjugado purificado de 100% a 280 nm. Ver la FIG. 4.2. La pureza no era inferior a 95% según determinación mediante gel SDS-PAGE NuPage Bis-Tris al 4-12% con tinción de azul de Coomassie (gel no mostrado) con 20 |jg de [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] purificado. El gran peso molecular aparente del conjugado, superior a 200 kDa, era el resultado de la lenta movilidad del conjugado por el gel debido al elevado grado de hidratación de PEG.
Ejemplo 5 (de referencia)
PEGilación de rIL-2 con derivado ramificado de mPEG-N-hidroxisuccinimidilo, 40 kDa
Se calentó el derivado mPEG2-ru-40K-N-hidroxisuccinimidilo, 40 kDa ("mPEG2-ru-40K-NHS")
mPEG2-ru-40K-NHS, almacenado a -80 °C bajo argón, hasta la temperatura ambiente bajo purga de nitrógeno. Se preparó una solución madre (200 mg/ml) de mPEG2-ru-40K-NHS en HCl 2 mM y se añadió mPEG2-ru-40K-NHS a rIL-2 en una cantidad suficiente para alcanzar una proporción molar de mPEG2-ru-40K-NHS a rIL-2 de 100:1. La concentración final de rIL-2 en la mezcla era de 0,5 mg/ml (0,035 mM). Se añadió tampón de bicarbonato sódico (1 M, pH 9,0) a la mezcla hasta alcanzar una concentración final de 20 mM y se dejó que transcurriese la conjugación durante treinta minutos, proporcionando conjugados [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2]. Tras treinta minutos, se llevó a cabo la desactivación mediante la adición de glicina 1 M (pH 4,0) a la mezcla de reacción hasta alcanzar una concentración final de 100 mM. A continuación, la mezcla de reacción desactivada se diluyó con H2O, proporcionando una conductividad inferior a 0,5 mS/cm (25°C). Se ajustó el pH a 4,0 utilizando ácido acético glacial antes de la purificación mediante cromatografía de columna.
Se proporciona un perfil de purificación de cromatografía de intercambio catiónico típico de [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2] en la FIG. 5. Se indican [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2] y PEG no reaccionado y las líneas corresponden a la absorbancia a 280 nm. El análisis de la pureza de [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2] mediante HPLC de fase inversa detectó una pureza del conjugado purificado de 100% a 280 nm. La pureza no era inferior a 95% según determinación mediante gel SDS-PAGe NuPage Bis-Tris al 4-12% con tinción de azul de Coomassie (gel no mostrado) con 20 jg de [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2] purificado. El gran peso molecular aparente del conjugado (probablemente una versión 3-mero de [mPEG2-ru-40k]-[rIL-2], superior a 200 kDa, era el resultado de la lenta movilidad del conjugado por el gel debido al elevado grado de hidratación de PEG. mPEG2-ru-40K-NHS no reaccionado eluido inicialmente por la columna seguido de conjugados [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2].
Ejemplo 6 (de referencia)
PEGilación de rIL-2 con derivado ramificado de mPEG-N-hidroxisuccinimidilo, 4 kDa
Se calentó el derivado mPEG2-ru-20K-N-hidroxisuccinimidilo, 4 kDa ("mPEG2-m-4K-NHS")
mPEG2-ru-4K-NHS, almacenado a -80°C bajo argón, hasta la temperatura ambiente bajo purga de nitrógeno. Se preparó una solución madre (200 mg/ml) de mPEG2-ru-4K-NHS en HCl 2 mM y se añadió mPEG2-ru-4K-NHS a rIL-2 en una cantidad suficiente para alcanzar una proporción molar de mPEG2-ru-4K-NHS a rIL-2 de 100:1. La concentración final de rIL-2 en la mezcla era de 0,5 mg/ml (0,035 mM) solubilizado con SDS al 0,015%. Se añadió tampón de bicarbonato sódico (1 M, pH 9,0) a la mezcla hasta alcanzar una concentración final de 100 mM y se dejó que transcurriese la conjugación durante treinta minutos, proporcionando conjugados [mPEG2-ru-4K]-[rIL-2]. Tras treinta minutos, se llevó a cabo la desactivación mediante la adición de glicina 1 M (pH 4,0) a la mezcla de reacción hasta alcanzar una concentración final de 100 mM. A continuación, la mezcla de reacción desactivada se diluyó con H2O, proporcionando una conductividad inferior a 0,5 mS/cm (25°C). Se ajustó el pH a 4,0 utilizando ácido acético glacial antes de la purificación mediante cromatografía de columna.
Se proporciona un perfil de purificación de cromatografía de intercambio catiónico típico de [mPEG2-ru-4K]-[rIL-2] en la FIG. 6. Los conjugados [mPEG2-ru-4K]-[rIL-2] eluidos mostraban una mezcla de conjugados 3-meros, 2-merosy 1-mero de [mPEG2-ru-4K]-[rIL-2] en las fracciones de elución. Las fracciones que contenían una mezcla de 3-/2-mero [mPEG2-ru-4K]-[rIL-2], así como las fracciones que contenían la mezcla de 2-/1-mero [mPEG2-ru-4K]-[rIL2] se agruparon por separado, tal como se muestra en la FIG. 6.
Ejemplo 7 (de referencia)
PEGilación de rIL-2 con derivado lineal de mPEG-butiraldehído, 30 kDa
Derivado de mPEG lineal-butiraldehído, 30 kDa ("mPEG-butirALD").
Se diseñaron las reacciones de PEGilación de manera que, tras la adición de todos los componentes de reacción y tampones, la concentración final de rIL-2 era de 2,5 mg/ml, mPEG-butirALD, 30 kDa, almacenado a -20°C bajo argón, y se calentó hasta la temperatura ambiente. Se pesó una cantidad del reactivo PEG igual a 10 a 50 equivalentes molares de la rIL-2 que debía PEGilarse y se disolvió en tampón de fosfato sódico 20 mM (pH 7,5) y EDTA 1 mM para formar una solución de reactivo al 12%. La solución de reactivo PEG al 12% se añadió a la alícuota de solución madre de rIL-2 y se sometió a agitación durante 15 a 30 minutos. A continuación, se añadió un agente reductor, cianobrohidruro sódico (NaCNBHa), en un exceso de 10 a 100 molar respecto al reactivo PEG y la reacción se sometió a agitación durante 5 a 18 horas a temperatura ambiente para garantizar el acoplamiento mediante un enlace de amina secundaria, formando d eesta manera una solución de conjugado.
El grupo aldehído de mPEG-butirALD se encontró que reaccionaba con las aminas primarias asociadas a rIL-2 y se unía covalentemente a ellas mediante amina secundaria tras la reducción con un reactivo reductor, tal como cianoborohidruro sódico. La selectividad con la que la amina o aminas se unen al polímero puede modularse mediante ajuste del pH de las condiciones de conjugación. Las condiciones de pH relativamente bajo (p.ej., aproximadamente 5,5) dirigirá la conjugación hacia el extremo N-terminal. Bajo condiciones de pH relativamente neutro (p.ej., aproximadamente 7,5 y ligeramente superior), la unión covalente se vuelve más frecuente en otros sitios (es decir, en las cadenas laterales amina de los residuos de lisina contenidos dentro de la proteína). El ajuste del pH de las condiciones de conjugación permitirá cierto grado de control de las localizaciones en que se produce la conjugación, presentando de esta manera una mejor capacidad de llegar a los isómeros posicionales deseados.
Utilizando este mismo enfoque, se prepararon otros conjugados utilizando mPEG-butirALD que presentaban otros pesos moleculares medios en peso.
Ejemplo 8 (de referencia)
PEGilación de rIL-2 con derivado ramificado de mPEG-butiraldehído, 40 kDa
derivado de mPEG ramificado-butiraldehído, 40 kDa ("mPEG2-butirALD").
Se diseñaron las reacciones de PEGilación de manera que, tras la adición de todos los componentes de reacción y tampones, la concentración final de rIL-2 era de 2,5 mg/ml, mPEG-butirALD, 40 kDa, almacenado a -20°C bajo argón, y se calentó hasta la temperatura ambiente. Se pesó una cantidad del reactivo PEG igual a 10 a 50 equivalentes molares de la rIL-2 que debía PEGilarse y se disolvió en tampón de fosfato sódico 20 mM (pH 7,5) y EDTA 1 mM para formar una solución de reactivo al 12%. La solución de reactivo PEG al 12% se añadió a la alícuota de solución madre de rIL-2 y se sometió a agitación durante 15 a 30 minutos. A continuación, se añadió un agente reductor, cianobrohidruro sódico (NaCNBHa), en un exceso de 10 a 100 molar respecto al reactivo PEG y la reacción se sometió a agitación durante 5 a 18 horas a temperatura ambiente para garantizar el acoplamiento mediante un enlace de amina secundaria, formando de esta manera una solución de conjugado.
El grupo aldehido de mPEG2-butirALD se encontró que reaccionaba con las aminas primarias asociadas a rIL-2 y se unía covalentemente a ellas mediante amina secundaria tras la reducción con un reactivo reductor, tal como cianoborohidruro sódico.
Utilizando este mismo enfoque, se prepararon otros conjugados utilizando mPEG2-butirALD que presentaban otros pesos moleculares medios en peso.
Ejemplo 9 (de referencia)
PEGilación de rIL-2 con derivado a-metilbutanoato de mPEG lineal-succinimidilo, 30 kDa
Derivado a-metilbutanoato de mPEG lineal-succinimidilo, 30 kDa ("mPEG-SMB").
Se diseñaron las reacciones de PEGilación de manera que, tras la adición de todos los componentes de reacción y tampones, la concentración final de rIL-2 era de 2,5 mg/ml, mPEG-SMB, 30 kDa, almacenado a -20°C bajo argón, y se calentó hasta la temperatura ambiente. Se pesó una cantidad del reactivo PEG igual a 10 a 50 equivalentes molares de la rIL-2 que debía PEGilarse y se disolvió en tampón de fosfato sódico 20 mM (pH 7,5) y EDTA 1 mM para formar una solución de reactivo al 12%. Se añadió la solución de reactivo PEG al 12% a la alícuota de solución madre de rIL-2 y se sometió a agitación durante 5 a 18 horas a temperatura ambiente, resultando de esta manera en una solución de conjugado. La solución de conjugado se desactivó con una solución de lisina (pH 7,5) de manera que la concentración molar de lisina final era 10 a 100 veces la concentración molar de reactivo PEG.
Se encontró que el derivado mPEG-SMB proporcionaba un éster de NHS estéricamente impedido, que reacciona selectivamente con lisina y aminas terminales.
Utilizando este mismo enfoque, se prepararon otros conjugados utilizando mPEG-SMB que presentaban otros pesos moleculares medios en peso.
Ejemplo 10 (de referencia)
PEGilación de rIL-2 con mPEG-PIP, 20 kDa
La estructura básica del reactivo polimérico se proporciona a continuación:
Se diseñaron las reacciones de PEGilación de manera que, tras la adición de todos los componentes de reacción y tampones, la concentración final de rIL-2 era de 2,5 mg/ml, mPEG-PIP, 30 kDa, almacenado a -20°C bajo argón, y se calentó hasta la temperatura ambiente. Se pesó una cantidad del reactivo PEG igual a 10 a 50 equivalentes molares de la rIL-2 que debía PEGilarse y se disolvió en tampón de fosfato sódico 20 mM (pH 7,5) y EDTA 1 mM para formar una solución de reactivo al 12%. La solución de reactivo PEG al 12% se añadió a la alícuota de solución madre de rIL-2 y se sometió a agitación durante 15 a 30 minutos. A continuación, se añadió un agente reductor, cianobrohidruro sódico (NaCNBHa), en un exceso de 10 a 100 molar respecto al reactivo PEG y la reacción se sometió a agitación durante 5 a 18 horas a temperatura ambiente para garantizar el acoplamiento mediante un enlace de amina secundaria (a un carbono secundario), formando de esta manera una solución de conjugado. La solución de conjugado se desactivó con una solución de lisina (pH 7,5) de manera que la concentración molar de lisina final era 10 a 100 veces la concentración molar de reactivo PEG.
El grupo aldehído de mPEG-PIP se encontró que reaccionaba con las aminas primarias asociadas a rIL-2 y se unía covalentemente a ellas mediante amina secundaria tras la reducción con un reactivo reductor, tal como cianoborohidruro sódico.
Utilizando este mismo enfoque, se prepararon otros conjugados utilizando mPEG-PIP que presentaban otros pesos moleculares medios en peso.
Ejemplo 11
Actividad de conjugados de (rIL-2)-PEG ejemplares
Se evaluó la actividad de la aldesleuquina (control), [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] del Ejemplo 2, [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] del Ejemplo 3 y [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] del Ejemplo 4 (referencia) en un ensayo de proliferación celular utilizando células CTLL-2.
Las células CTLL-2 (línea celular de linfocitos T citotóxicos de ratón) se mantuvieron en medio RPMI 1640 completo complementado con L-glutamina 2 mM, piruvato sódico 1 mM, suero de feto bovino al 10% y complemento de cultivo de iL-2 al 10% (T-STIM™ con ConA (concanavalina-A)) a 37°C bajo una atmósfera con 5% de CO2. Las células se cultivaron en suspensión hasta alcanzar una densidad celular de 2-3 x 105 células/ml antes de dividirlas.
Para el ensayo de actividad, 3 a 4 días después de la última división, las células se lavaron tres veces en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco. A continuación, las células se resuspendieron en medio complementado sin T-STIM™ a una densidad celular de ~2 x 105 células/ml y se sembraron en microplacas de fondo transparente de paredes blancas de 96 pocillos a razón de 90 pl/pocillo. También se llevaron a cabo experimentos utilizando medio complementado (sin T-STIM™) ajustado a pH 6,7-7 a fin de minimizar la liberación de conjugados durante el curso de la incubación. A continuación, se añadieron 10 pl de concentraciones 10X de compuesto de ensayo, diluidas en medio complementado sin T-STIM™. Las células se incubaron a 37°C en atmósfera de 5% de CO2 durante 24 h. Tras la incubación durante 24 horas, se añadieron a cada pocillo 100 pl de reactivo CellTiter-Glo® de Promega. Las placas se mezclaron durante dos minutos en un agitador orbital y después se incubaron a temperatura ambiente durante diez minutos. Seguidamente, se registró la luminiscencia utilizando el instrumento TopCount® de Perkin Elmer en un tiempo de integración de un segundo/pocillo.
Para los conjugados liberables [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] del Ejemplo 2y los conjugados liberables [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] del Ejemplo 3, se sometió a ensayo la actividad de tanto IL-2 liberado como conjugados sin liberación. Los compuestos de ensayo se almacenaron bajo condiciones ácidas (tampón de acetato sódico 10 mM, pH 4) para estabilizar la conjugación. Con el fin de someter a ensayo la actividad de los conjugados, la muestra se diluyó a partir del tampón de almacenamiento en medio complementado - una hora antes del ensayo. Para someter a ensayo la actividad de IL-2 liberado, los conjugados liberados {es decir, conjugados [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] del Ejemplo 2 y conjugados [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] del Ejemplo 3} se diluyeron diez veces en tampón de bicarbonato sódico 100 mM (concentración final), pH 9, y se preincubaron a 37°C durante ocho horas antes del inicio del ensayo.
Los valores de EC50 (concentración de compuesto de ensayo requerido para mostrar una respuesta máxima al 50%) de proliferación celular se obtuvieron a partir del análisis de regresión no lineal de curvas de dosis-respuesta, utilizando el software Prism 5.01 de GraphPad.
Las actividades de aldesleuquina y de los conjugados se midieron utilizando un ensayo de proliferación celular y se muestra un resumen de los resultados en la Tabla 4. Todos los artículos de ensayo indujeron crecimiento de las células CTLL-2 de una manera dependiente de la dosis. Debido a que los conjugados liberables se habían preincubado bajo condiciones que forzaban la liberación de la proteína, también se preincubó aldesleuquina como control para someter
a ensayo la estabilidad de la proteína misma bajo las condiciones de tratamiento de liberación forzada. Tal como se muestra en la Tabla 4, la aldesleuquina se mantuvo estable tras la preincubación bajo condiciones de liberación (8 horas a 37°C, pH 9) y mostró una potencia relativa a aldesleuquina almacenada bajo las condiciones recomendadas. Tras la preincubación de [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] del Ejemplo 2 y [mPEG2-cAc-fmoc-20K]-[rIL-2] del Ejemplo 3 bajo condiciones de inducción de liberación de lL-2, se recuperó la actividad, tal como se muestra en la FlG. 8; IL-2 liberado de dichos conjugados mostró una potencia relativa respecto a la aldesleuquina de control, mientras que parte de los conjugados no liberados era menos potente que la aldesleuquina. Los conjugados 3-meros [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] estables mostraron la menor potencia (FIG. 7) y mostraron una potencia de 0,04% respecto a la aldesleuquina, aunque el 1-mero [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] mostró una potencia equivalente a la aldesleuquina en vista de la desviación estándar conocida del ensayo.
Tabla 4
Ejemplo 12
Farmacocinética de conjugados de (rIL-2)-PEG ejemplares
Se evaluaron los perfiles farmacocinéticos de aldesleuquina (control), [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] del Ejemplo 2, [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] del Ejemplo 3 y [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] del Ejemplo 4 (referencia) en un ELISA tras una única inyección en ratones.
Se midieron las concentraciones de aldesleuquina mediante un ELISA de tipo sándwich heterogéneo. Brevemente, se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos con anticuerpo monoclonal de ratón de IL-2 y se bloquearon. Las muestras y estándar se prepararon en plasma puro y después se diluyeron hasta 10% de plasma con tampón que contenía anticuerpos policlonales de conejo biotinilados de IL-2 antes de la incubación en las placas de ensayo. Se utilizó estreptavidina-peroxidasa de rábano picante seguido del sustrato colorimétrico, 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) para detectar la IL-2. Se añadió solución de parada y se leyó la absorbancia a 450 nm con resta del fondo a 650 nm. La curva patrón se generó con un algoritmo de 4 parámetros ponderado, y se determinaron las concentraciones de las muestras mediante interpolación en la curva patrón. El límite inferior de cuantificación era de 0,05 ng/ml.
Se midieron las concentraciones de [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] 1-mero/2-mero agrupado mediante un ensayo HTRF® homogéneo (Cisbio US, Bedford, MA). La mezcla de reacción (15 pl, anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con cromato de europio de IL-2, estreptavidina-d2 y anticuerpo monoclonal de conejo biotinilado de PEG) se añadió a placas de microtitulación de 384 pocilllos de volumen reducido blancas. Se añadieron las muestras y los patrones (5 pl) diluidos en plasma puro y se incubaron las placas. Las placas se leyeron en un lector de fluorescencia a 615 y 665 nm y se calculó la Delta F. La curva patrón se generó con un algoritmo de 5 parámetros ponderado, y se determinaron las concentraciones de las muestras mediante interpolación en la curva patrón. El límite inferior de cuantificación era de 0,5 ng/ml.
Se midieron el 3-mero [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] y el 3-mero [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] en un ensayo de IL-2 total. Debido a que los conjugados [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] y [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] son conjugados liberables, se encontrarán presentes diferentes especies de la molécula en la muestra, dificultando la cuantificación individual; por lo tanto, se midieron los niveles totales de IL-2. El componente que contiene el polímero de los conjugados se liberó forzadamente de los conjugados mediante dilución de las muestras y solución madre patrón, preparada en plasma puro, 1:1 con tampón de liberación (HEPES 100 mM/Tris-HCl 100 mM, pH 9) y se incubaron a 37°C durante 30 a 36 horas. Tras Las incubaciones, se añadió un volumen de 25% de ácido acético 0,1 M para neutralizar el elevado pH. La IL-2 liberada se midió mediante el ELISA indicado anteriormente.
La FIG. 9 muestra un gráfico de concentración-tiempo de los artículos sometidos a ensayo en ratones C57BL/6 tras una única inyección intramuscular (1 mg/kg). Se recogieron muestras de plasma con heparina sodio a los diez minutos, y a las 1, 6, 24, 48, 72, 96, 120, 168 y 336 horas. Se calcularon las medias geométricas de las concentraciones a partir de 3 ratones en cada punto temporal. Tal como se muestra en la FIG. 9, la aldesleuquina mostraba una semivida corta y no pudo detectarse tras 6 horas (<0,05 ng/ml), mientras que los conjugados presentaban una semivida prolongada y todavía se detectaron a las 336 horas.
Ejemplo 13
Estudios de eficacia de melanoma metastásico pulmonar
Con el fin de evaluar la eficacia de compuestos que presentaban una supuesta actividad de IL-2, el modelo pulmonar de melanoma metastásico se ha utilizado ampliamente y se ha desarrollado en ratones C57BL/6. En dicho modelo, los ratones en primer lugar reciben una inyección intravenosa de células de melanoma B16F10, que causa el desarrollo de nódulos pulmonares de diferente número y tamaño. El número de nódulos pulmonares, así como la superficie total de dichas lesiones, varía según las concentraciones celulares implantadas. A continuación, se administra un compuesto de ensayo de interés en el grupo de tratamiento de ratones y otro grupo de ratones se deja sin tratar para servir como control. La eficacia del compuesto de ensayo puede determinarse, como porcentaje de reducción del número y tamaño de los nódulos pulmonares y la superficie total de lesión para cada pulmón entre grupos tratados y no tratados.
En el presente estudio, se implantaron 100.000 células B16F10 (pase no superior a P8) mediante inyecciones en la vena de la cola. El tercer día desde la fecha de implantación celular, se administraron compuestos de ensayo de interés (o vehículo) tal como se indica en la Tabla 5, tras las vías de administración IP (intraperitoneal) o IV (intravenosa). El compuesto de ensayo en el grupo E es según la invención.
Tabla 5
El día 14 desde el día de la implantación celular, se sacrificaron los ratones, aislando y fijando los pulmones en solución de Bowen que contenía formaldehído durante un día o dos. Los pulmones (que se habían fijado en la solución de Bowen) se examinaron bajo el estereomicroscopio y se determinó el número y tamaño de las lesiones de cada pulmón. Tal como se muestra en la FIG. 10, el día 14 desde el día de la implantación celular, se sacrificaron los ratones y los pulmones aislados se fijaron en solución de Bowen. Los nódulos tumorales y sus tamaños se contaron para cada uno de aldesleuquina (Prometheus Laboratories Inc., San Diego, CA), la fracción IL-2 del Ejemplo 1, 3-mero/4-mero agrupados [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2], 3-mero/4-mero agrupados [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] (referencia) y 1-mero/2-mero agrupados [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] (referencia).
Ejemplo 14
Estudios de eficacia de melanoma B16F10 subcutáneo
Con el fin de evaluar la eficacia de compuestos con supuesta actividad de IL-2, se ha estudiado el modelo de melanoma subcutáneo altamente robusto en ratones singénicos, es decir, ratones C57BL/6. Brevemente, se implantaron por vía subcutánea un millón de células B16F10 para cada ratón C57BL/6 de 5-6 semanas de edad en la zona mediodorsal. Se dejó que los tumores creciesen hasta tamaño palpable, es decir, 70 a 120 mm3 antes de la aleatorización y asignación de grupos, tal como se muestra en la Tabla 6. Se administraron los compuestos de ensayo
Claims (15)
- REIVINDICACIONESi. Conjugado que comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho polímeros de poli(etilenglicol) ramificados solubles en agua, unidos covalentemente mediante un enlace de carbamato liberable a un grupo amina de una fracción de interleuquina-2, presentando cada polímero ramificado soluble en agua de poli(etilenglicol) un peso molecular medio en peso total comprendido en un intervalo de entre 500 daltons y 100.000 daltons, en el que, tras la liberación, el polímero ramificado soluble en agua de poli(etilenglicol) se desprende de la fracción interleuquina-2 in vivo sin dejar un fragmento unido a la fracción interleuquina-2, presentando el conjugado la fórmula:en el que POLY1 es un primer poli(etilenglicol); POLY2 es un segundo poli(etilenglicol); X1 es una primera fracción espaciadora; X2 es una segunda fracción espaciadora; Ha es un átomo de hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cero o uno, (b) es cero o uno; Re1, en caso de hallarse presente, es un primer grupo alterador de electrones; Re2, en caso de hallarse presente, es un segundo grupo alterador de electrones; Y1 es O; Y2 es O; n es un número entero entre 1 y 8, y (IL-2) es una fracción interleuquina-2 que presenta una secuencia de aminoácidos SEC ID n° 3 o que presenta una identidad de secuencia de 95% o superior respecto a la SEC ID n° 3.
- 2. Conjugado según la reivindicación 1, en el que POLY1 y POLY2 presentan ambos una fracción alcoxi de caperuza terminal.
- 3. Conjugado según la reivindicación 2, en el que la fracción alcoxi de caperuza terminal es un grupo alcoxi C1-6.
- 4. Conjugado según la reivindicación 1, en el que cada polímero ramificado soluble en agua de poli(etilenglicol9 presenta un peso molecular medio en peso comprendido en un intervalo de entre 20.000 daltons y 85.000 daltons.
- 5. Conjugado según la reivindicación 1 o 2, en el que uno, dos, tres o cuatro polímeros ramificados solubles en agua de poli(etilenglicol) están unidos covalentemente a la fracción interleuquina-2.
- 6. Composición farmacéutica que comprende un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
- 7. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, para la utilización en terapia.
- 8. Método para preparar un conjugado de interleuquina-2, en el que el método comprender poner en contacto, bajo condiciones de conjugación, una fracción interleuquina-2 que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 3 o que presenta una identidad de secuencia de 95% respecto a la SEC ID n° 3 y que comprende grupos amino disponibles para la unión covalente a un polímero, con un polímero de poli(etilenglicol) soluble en agua ramificado y activado por éster de succinimidilo, que presenta la fórmula:en la que POLY1 es un primer poli(etilenglicol); POLY2 es un segundo poli(etilenglicol); X1 es una primera fracción espadadora; X2 es una segunda fracción espadadora; Ha es un átomo de hidrógeno ionizable; R1 es H o un radical orgánico; R2 es H o un radical orgánico; (a) es cero o uno; (b) es cero o uno; Re1, en caso de hallarse presente, es un primer grupo alterador de electrones; Re2, en caso de hallarse presente, es un segundo grupo alterador de electrones, y (GF) es un éster de succinimidilo, eficaces para formar un enlace de carbamato liberable al unirse covalentemente a un grupo amino de la fracción interleuquina-2, en el que dichas condiciones de conjugación comprenden un medio acuoso que presenta un pH de entre 7 y 9,0.
- 9. Conjugado según la reivindicación 1, en el que cada polímero ramificado soluble en agua de poli(etilenglicol) presenta un peso molecular medio en peso de aproximadamente 20.000 daltons.
- 10. Composición que comprende una mezcla de conjugados según la reivindicación 1.
- 11. Composición farmacéutica para la utilización según la reivindicación 7, en la que la composición posee poca o ninguna actividad de interleuquina-2.
- 12. Composición farmacéutica para la utilización según la reivindicación 7, en la que la composición está destinada a la utilización en el tratamiento de una condición seleccionada del grupo que consiste en carcinoma de células renales, melanoma metastásico, virus de la hepatitis C (VHC), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), leucemia mieloide aguda, linfoma no de Hodgkin, linfoma cutáneo de células T, artritis reumatoide juvenil, dermatitis atópica, cáncer de mama y cáncer de vejiga.
- 13. Composición farmacéutica para la utilización según la reivindicación 7, en una forma adecuada para la administración parenteral.
- Composición según la reivindicación 10, en la que los conjugados comprendidos en la composición presentan cuatro, cinco, seis, siete u ocho polímeros de poli(etilenglicol) solubles en agua ramificados, unidos covalentemente a la fracción interleuquina-2.
- 15. Composición según la reivindicación 10, en la que los conjugados comprendidos en la composición presentan una media de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho polímeros de poli(etilenglicol) solubles en agua ramificados por cada fracción interleuquina-2.
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