KR20090103209A - 사람 인터루킨-2 동종체 - Google Patents

사람 인터루킨-2 동종체

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KR20090103209A
KR20090103209A KR1020080028653A KR20080028653A KR20090103209A KR 20090103209 A KR20090103209 A KR 20090103209A KR 1020080028653 A KR1020080028653 A KR 1020080028653A KR 20080028653 A KR20080028653 A KR 20080028653A KR 20090103209 A KR20090103209 A KR 20090103209A
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송관규
이성희
우구
백영준
유대근
명현호
이혁준
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(주)한국비엠아이
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Abstract

본 발명은 사람 인터루킨-2의 체내 지속성을 증대시키기 위해 제작된 신규의 생리활성 단백질에 관한 것으로 폴리펩티드와 폴리펩티드 성분이 아닌 중합체인 폴리에틸렌글리콜(PEG)를 결합한 사람 인터루킨-2 동종체에 관한 것이다. 본 발명에서는 폴리펩티드의 특정 부위에 폴리에틸렌글리콜의 결합이 가능하도록 하면서 단백질의 활성에는 영향을 미치지 않는 부위를 선정하며, 이 부분에 대한 아미노산을 시스테인으로 변형을 수행하고, 이 변형된 위치에 폴리에틸렌 결합을 수행한 것을 특징으로 하고 있다. 또한, 본 발명은 상기 동종체를 포함하는 약제학적 조성물, 이들을 코딩하는 유전자, 아미노산 서열 변경을 위한 프라이머 등을 제공한다

Description

사람 인터루킨-2 동종체 {Human Interleukin-2 Isoforms}
본 발명은 사람 인터루킨-2 (rhIL-2) 변형체에 중합체를 결합하여 체내 지속성 등 생물학적 활용성을 증대시킨 새로운 사람 인터루킨-2의 동종체에 관한 것이다. 특히, 사람 인터루킨-2에 시스테인을 첨가한 동종체에 비단백질 부분인 폴리에틸렌글리콜을 공유결합시킨 동종체에 관한 것이다..
사람 IL-2는 153개의 아미노산 전구체로 생성된 후, 앞 부분이 절단되어 133개의 아미노산으로 구성된 천연형의 IL-2 단백질로 된다.
천연형의 IL-2 단백질에는 3개의 시스테인이 존재하는데, 이들 중에 2개의 시스테인은 이황화결합에 참여하고 있지만 125번째에 존재하는 시스테인은 자유로운 상태로 존재한다.
또한 생체 내에서 합성되는 천연형 사람 IL-2는 3번째 아미노산인 쓰레오닌에 O형 당쇄가 결합한 상태로 존재한다.
생체 내에서 사람 인터루킨-2의 생물학적 기능은 T-세포의 성장인자로 임파세포의 성장과 분화를 유도해서 성숙한 cytotoxic T-cell이 생성되도록 한다(Ezard. et. al., J. Immunol. 134, 1644-1652, 1985). 그 외에도 B 세포의 성장과 분화에 관여하며(Mingari, M. C., et. al., Nature(1984), 312, 641; Mittler, R., et. al., J. Immunol.(1985), 134, 2393-2399;Muraguchi, A. et. al., J. Exp. Med.(1985), 161, 181-197)), lymphokine-activated killer cell을 생성시키며, natural killer cell을 증가시키며, 특정 신생 세포(neoplastic cell)의 성장을 방해하는 등의 여러 가지 기능을 한다.
IL-2의 다양한 생물학적 기능은 다양한 종류의 세포에서 발현된 IL-2 수용체를 통하여 다양한 신호 전달계에 의해 이루어진다.
이러한 특성들 때문에 IL-2는 antigen-specific T cell clonal expansion 과정에서 IL-2의 작용 system을 조작하여 숙주의 면역체계를 활성화 또는 억제시킬 수 있어 immunotherapy의 적용에 대한 시도와 IL-2와 IL-2 수용체에 대한 항체 또는 이들의 기능을 억제할 수 있는 방법(IL-2 linked diphtheria toxin)을 이용하여 타가이식(allograft) 거부를 억제하는 연구가 진행되고 있다.
또한 IL-2는 tumor specific lymphocytes를 다량 생산할 수 있기 때문에 암 치료에도 활용되고 있으며, 면역반응을 증대시키는 성질을 이용하여 백신에서 adjuvant로 활용될 수 있어 의학적으로 많은 연구가 진행되고 있다(US patent 5,800,810 Sep. 1. 1998; Chiron Corp; Kawamura et. al., J. Exp. Med. .(1985), 162, 381-386; McFeeters and Nadler. Fed. Proc. 45(3), 633(presented Apr. 13-18, (1986)).
그러나 이러한 사용에 있어서 IL-2 단백질 간의 결합하는 소수성 특성에 따른 면역 반응에서의 문제를 일으킬 수 있으므로(R. Illig(1970) J. Clin Endrocr, 31, 679-688; W. Moore(1978) J. Clin Endrocrinol. Metab. 46, 20-27; W. Moore and P. Leppert (1980) J. Clin Endrocrinol. Metab. 51, 691-697) 그 사용은 극히 제한적일 수 밖에 없다.
이를 해결하기 위해 미국 특허 US 5,206,344(Apr. 27. 1993)에서는 IL-2 변이체에 PEG 중합체를 붙이는 것을 제안하고 있다. PEG 중합체의 결합이 면역반응을 경감시킬 수 있다는 보고가 미국 특허 US 4,261,973에 발표되었으며, 이러한 중합체는 다른 치료용 단백질들에서도, 특히 인슐린과 치료용 효소에 PEG 또는 PPG의 결합으로 고유의 활성은 유지하면서 면역성이 경감된 것을 보여주고 있다(USP 4,179,337).
사람 IL-2에 대한 변형체는 미국 특허 US4,518,584에 천연형의 125번째 아미노산인 시스테인을 세린 또는 알라닌으로 교체한 것이 보고되어 있다. 이 변형체는 천연형의 IL-2와 동등한 활성을 갖는 것이 확인되었다(Wang A., Lu S. -D., and Mark D.F.(1984) Science, 224, 1431-1433).
또 다른 IL-2 변형체는 미국특허 출원에 보고된 것으로서 천연형의 104번째 아미노산인 메치오닌을 알라닌으로 교체한 것이 있다(US application Ser. No.810,656 filed Dec. 17. 1985).
그 외에도 PEG 중합체를 형성하기 위한 변형체의 개발이 가능한 부분으로 IL-2 D helix 말단의 4개의 아미노산을 포함한 부위, A-B loop, B-C loop, C-D loop 아미노 말단의 5개 부위, 첫 번째 아미노산 위치인 알라닌 그리고 마지막 아미노산인 133번째의 쓰레오닌이 시스테인 치환 부위로 제안되고 있다.
미국특허 US 5,206,344에서는 IL-2의 아미노 말단에 있는 20개의 아미노산 위치에 존재하는 부위, 특히 3번 위치의 쓰레오닌을 시스테인으로 교체하여 PEG-중합체를 붙이는 것을 제시하고 있다.
Goodson과 Katre ((1990) Biotechnology, 8, 343-346)는 IL-2의 3번 위치에 O-당쇄화 위치의 아미노산인 쓰레오닌을 시스테인으로 교체하여도 완전한 활성을 나타내는 것을 확인하고, 이에 PEG 결합을 실험한 보고를 하고 있다.
IL-2의 체내 지속성을 증대시키는 방법으로는 polyethylene glycol(PEG) 또는 polyoxyethylated polyol과 같은 중합체를 붙이는 방법과(US patented application Ser. No. 866,459, filed May 21. 1986) succinated IL-2(US patent application Ser. No. 903,668 filed Sep. 4. 1986)로 제작하여 서서히 방출되도록 하는 방법이 제안되고 있다.
PEG를 E.coli에서 분리한 asparaginase에 결합시켜 체내 반감기의 증대와 항원성을 경감시킨 보고(Abuchowski et. al., Cancer Biochem Biophys(1984), 7, 175-186)가 발표된 이후 많은 치료용 의약품에 적용하여 기능이 증가된 의약품의 개발이 활발하게 이루어져 현재는 사람 인터페론 알파와 사람 과립구 콜로니 형성인자 등에 적용하여 판매되고 있다.
유럽 특허(EP 154,316 published Sep. 11. 1985 to Takeda Chemical Industries, Ltd.,)에서는 IL-2를 포함한 단백질에 적어도 하나의 아미노기에 PEG 결합을 시킨 것을 보고하고 있다. 또한 PCT W087/00056(published Jan 15. 1987(Cetus Corporation) ) 에서는 IL-2, IFN-β와 immunotoxins에 PEG 또는 polyoxyethylated polyols을 단백질의 라이신이나 시스테인에 결합시킨 것을 발표하고 있다. 이와 같은 변형은 IL-2의 생리학적으로 반감기의 증가와 항원성을 나타내는 부분을 가려줌으로써 항원성의 감소와 침전물(aggregation)의 생성을 억제하는 효과를 나타내었다.
최근에 미국 특허US 6,608,183 B1(Aug. 19. 2003; Bolder Biotechnology)에서는 천연형의 IL-2의 3번 위치에 존재하는(O-당쇄화 부위) 쓰레오닌을 시스테인으로 교체한 IL-2 변형체를 제작하여 여기에 PEG 결합을 시킨 것을 발표하고 있다.
사람 인터루킨-2의 아미노산 서열은 (Taniguchi T., Matsui H., Fujita T., Takaoka C., Kushima N., Yoshimoto R., and Hamuro J. (1983) Nature, 302, 305-310; Devos R., Plaetinck G., Cheroutre H., Simons G., Dcgrave W., Tavcrnicr J., Rcmaut E., and Ficrs W. (1983) Nucleic Acid Res. 11, 4307)에 의해 보고 되었다.
폴리펩티드 또는 그의 중합체의 체내에서 제거는 신장, 비장 혹은 간에서의 제거와 수용체 결합에 의한 단백질의 분해(receptor mediated degradation)로서 특정 단백질에 대해서 작용을 하는 기질 특이성을 갖거나 혹은 비 특이성을 갖는 단백질 분해효소의 작용에 의해 이루어진다. 일반적으로 체내에서 단백질의 제거는 크기, 즉 사구체(glomerular filtration)에서의 여과를 피할 수 있는 정도의 크기, 단백질 분자가 갖고 있는 전하를 띤 정도, 당쇄화 부착 정도, 단백질에 대한 세포 표면의 수용체 등에 의해 좌우된다.
특히, 신장에서 일어나는 제거는 단백질 또는 그의 중합체의 크기(물질의 지름), 대칭성, 형태/단단함의 정도(rigidity), 전하도(charge)등의 물리적 특성에 따라 좌우된다.
단백질의 혈액 내에서 반감기를 증가시키기 위한 방법은, 주요 요인으로 나타나고 있는 신장에서 일어나는 제거와 수용체 결합에 의한 단백질의 분해를 감소시켜야 한다. 이것은 외관상의 분자의 크기를 증대시킬 수 있는 중합물을 단백질에 결합시킴으로써 신장에서 일어나는 제거를 감소시키고, 생체 내에서 반감기의 증대를 달성할 수 있다.
게다가, 단백질에 중합물의 부착은 단백질 분해 효소를 효과적으로 차단할 수 있어 비특이적 단백질 분해효소의 작용에 대한 방지도 이룩할 수 있다.
이들 중합물 중에서 대표적인 것으로 폴리에틸렌글리콜(PEG)은 치료용 단백질 제품의 조제에 널리 사용되고 있는 중합물 중의 하나이다. 단백질 의약품을 합성 고분자와 결합시켜 단백질 분자의 표면 특성을 변화시키면 물 또는 유기용매에 대한 용해도를 증가시킬 수 있다. 또한, 이를 통해 생체 적합성을 증가시켜 면역 반응성을 감소시킬 수 있고, 생체 내에서의 안정성이 증가되며, 장관 시스템, 신장, 비장 또는 간에 의한 소실 (clearance)이 보다 천천히 이루어질 수 있다. 단백질의 분자량이 작을 경우 장관 시스템 또는 신장에서 여과되어 소실되는데, 고분자 PEG를 결합시키면 이를 방지하게 된다 (Knauf, M. J. et al, J. Biol. Chem. 263:15064, 1988). 따라서, 단백질 의약품에 고분자의 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 수식하는 것은 용액 내에서 단백질 분자의 안정성을 증가시킬 수 있다. 또한, 단백질의 내인성 (intrinsic) 표면 특성을 효과적으로 보호할 수 있어 비특이적 단백질 흡착을 방지할 수 있다. 이에 생물학적으로 활성이 있는 펩타이드 또는 단백질에 PEG를 결합시켜 체내 반감기를 연장하고 용해도를 증가시키며 체내에서의 면역 반응을 감소시키는 효과에 대한 연구가 진행되었으며, 이는 미국 특허 USP4,179,337호에서 처음 보고된 바 있다. 그러나, 단백질과 PEG가 결합되었을 때 상기와 같은 장점으로 인하여 부작용이 많이 감소하는 것은 사실이지만, 동시에 PEG와 결합한 후에는 그 단백질이 활성에 필요한 부위가 PEG에 의해 가려져 생체 활성도가 무척 감소한다는 단점을 나타낸다.
현재까지 많이 쓰이고 있는 PEG는 단백질 표면의 하나 이상의 자유 라이신 (lysine) 잔기와 공유결합을 하여 PEG가 단백질의 표면에 부착되는데, 이때 단백질의 표면 중 단백질의 활성과 직접적으로 관계가 있는 부위가 PEG와 결합하면 그 활성이 감소하게 된다. 또한, PEG와 라이신 잔기의 결합은 대개 무작위적으로 일어나므로 많은 종류의 PEG화된 단백질 결합체들이 혼합물로 존재하게 되고, 결과적으로 원하는 결합체를 순수하게 분리하는 과정이 복잡하고 어려워진다.
그러나, 상기에서 언급한 발명에는 폴리에틸렌글리콜 분자가 예측 가능한 특정 잔기에 결합하지 않으며, PEG가 라이신 잔기와 같은 단백질 내부에 위치해 있는 어떠한 반응기나 N-말단에 비선택적으로 결합하여 결과적으로 불균질한 집단이 생성된다. 단백질의 특정 부위만을 PEG와 결합시키기 위해 미국 특허 USP5,766,897호 및 국제 특허공개공보 제WO 00/42175호는 인간 성장 호르몬과 PEG를 결합시킴에 있어서 PEG가 인간 성장 호르몬의 활성부위와 반응하는 것을 피하기 위하여 PEG-말레이미드를 사용하여 PEG가 시스테인과 선택적으로 반응하도록 하였다. 그러나, 이러한 종류의 PEG를 사용하려면 인간 성장 호르몬에 이황화 결합에 관여하지 않은 자유 시스테인 잔기가 있어야 되지만 인간 성장 호르몬에 존재하는 4개의 시스테인 잔기는 모두 이황화 결합에 참여하고 있으므로 인간 성장 호르몬에 인위적으로 시스테인 잔기가 삽입된 인간 성장 호르몬 유도체를 사용하여 페길레이션 (pegylation) 반응을 수행하였다.
한편, 보웬 등(Experimental Hematology, 27, 425-432, 1999)은 폴리에틸렌 중합된 사람 과립구 형성인자에서 폴리에틸렌의 분자량과 지속성에 연관성을 밝혔다. 시험관 실험에서의 단백질의 약효와 단백질에 결합한 폴리에틸렌 부분의 분자량 사이에는 역의 관계가 나타남을 보여주었다. 그러나 생체 내에서의 활성은 분자량이 증가할수록 증가하였다. 이는 생리활성 단백질의 중합체가 수용체 결합에 의한 단백질의 분해에서 낮은 친화성이 반감기를 증가시키는 것으로 추정된다. 따라서 이들 사람 과립구 형성인자의 중합체는 생체 내에서 호중구의 회복을 이룩함에도 불구하고 시험관에서의 활성도에서는 중합체를 형성하지 않은 사람 과립구 형성인자 보다 열등한 것으로 나타나고 있다.
종래의 기술은 아미노산 서열이 변형된 사람 인터루킨-2의 활성이 떨어지거나 생체내 반감기가 기대에 미치지 못하거나, PEG을 사람 인터루킨-2에 결합할 때 균일한 생성물이 얻어지지 않는 등의 문제점이 여전히 남아 있다.
따라서, 본 발명은 이와 같은 종래 기술의 문제점을 해결한 것으로서, 아미노산 서열이 변형된 사람 인터루킨-2에 폴리에틸렌글리콜을 결합함으로써 활성이 우수하면서 생체내 반감기가 종래에 비하여 대폭 증가된 사람 인터루킨-2 동종체에 관한 것으로서, 사람 인터루킨-2에 폴리에틸렌글리콜의 결합을 용이하게 하기 위하여 특정부위에서 아미노산 서열을 시스테인으로 치환 또는 첨가하여 변형하고 그 변형된 부위의 일부 폴리에틸렌글리콜이 결합된 사람 인터루킨-2 동종체를 제공한다. 종래에 사람 인터루킨-2는 보통 폴리펩티드 내부의 서열을 변형하고 특정부위의 적당한 아미노산에 페길레이션(pegylation)함으로써 생체내 활성이나 지속성을 증대시켜 왔었는데, 본 발명에서는 사람 인터루킨-2의 폴리펩티드 양 말단에 아미노산을 첨가하고 여기에 페길레이션함으로써 종래의 동종체보다 생체내 활성 또는 지속성이 더욱 증대됨을 발견하여 완성된 것이다.
특히, 아미노산 서열번호 1로 표시되는 사람 인터루킨-2의 N 말단 부위의 Ala 앞에 또는 C 말단 부위의 Thr 다음에 하나 이상의 아미노산을 첨가하고, 상기 첨가되는 아미노산 중 하나 이상은 시스테인이며, 상기 시스테인 중 어느 하나 이상에 폴리에틸렌글리콜을 결합한 사람 인터루킨-2 동종체를 제공한다.
상기 서열번호 1에서 N 말단에는 Met을 포함할 수 있는 것은 당업자에 공지된 사실이고, Met을 포함할 경우 첨가되는 시스테인은 상기 Met과, N 말단의 알라닌 사이에 첨가될 수 있고, 이들 동종체도 본 발명의 권리범위에 속하는 것은 당연하다.
상기 각각의 말단 부위에 첨가되는 상기 아미노산은 각각 1에서 12개까지 첨가될 수 있는데, 1개의 시스테인이 첨가되는 것이 바람직하며, 상기 시스테인은 C 말단에 첨가되는 134C인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 상기 폴리에틸렌글리콜은 사람 인터루킨-2에 첨가되는 시스테인에 공유적으로 결합하고, 그 분자량은 20kDa 내지 40kDa인 것이 바람직하고, 특히 측쇄가지를 가진 것이 더욱 바람직하다.
또한, 상기 사람 인터루킨-2는 폴리에틸렌글리콜이 결합하기 전에 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 사람 인터루킨-2 동종체들과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공된다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 N 말단 또는 C 말단에 시스테인이 첨가된 사람 인터루킨-2 동종체 단백질을 코딩하는 유전자을 제공된다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 사람 인터루킨-2 동종체로, 사람 인터루킨-2의 아미노산 서열을 변형하기 위한 프라이머로 사용되는 올리고데옥시뉴클레오타이드가 제공된다. 상기 프라이머는 서열번호 2 내지 7의 올리고데옥시뉴클레오타이드인 것이 바람직하다,
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
도 1은 사람 인터루킨-2 유전자 및 단백질의 서열을 나타낸 것이다. 아미노산 서열번호 1은 도 1에 도시된 아미노산 서열과 비교하여 -1 위치의 Met만 차이가 있고 다른 서열은 동일하다.
도 2는 사람 인터루킨-2의 N-말단부위에 아미노산 변형을 일으킨 동종체의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. AA는 아미노산들을 표시하며, n은 아미노산의 개수를 표시한다. n은 1 내지 12의 정수이다. 또한 여기에는 적어도 하나 이상의 시스테인을 포함한다.
도 3은 사람 인터루킨-2의 C-말단부위에 아미노산 변형을 일으킨 동종체의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. AA는 아미노산들을 표시하며, n은 아미노산의 개수를 표시한다. n은 1 내지 12의 정수이다. 또한 여기에는 적어도 하나 이상의 시스테인을 포함한다.
도 4는 사람 인터루킨-2 동종체를 발현하는 플라스미드 벡터의 구조를 나타낸 것이다. 프로모터는 박테리오 파지 T7을 사용하였다.
도 5는 사람 인터루킨-2 동종체의 렛트에서의 체내 지속성을 조사한 것이다. 시험물질은 대조물질로서 담체(PBS)와 PEG 공유결합이 없는 인터루킨-2 변형체, 천연형의 인터루킨-2를 각각 PBS로 희석하여 조제한 후 투여당일 측정된 체중을 기준으로 하여 100ug/kg 용량으로 Rat의 꼬리 미정맥에 투여하였다. 투여횟수 및 투여기간은 시험 개시일 단회 투여하였다.
본 발명자들은 사람 인터루킨-2의 단백질 구조 및 그를 구성하고 있는 아미노산들이 활성에 미치는 영향들을 종합하여 연구를 수행하였다. 본 발명을 위해 기본이 된 자료는 사람 인터루킨-2의 구조 및 구성 아미노산이 활성에 미치는 정보, 추가로 아미노산의 변형 후, 단백질 구조에 미치는 영향을 판단하기 위해 GOR4 단백질 2차구조 분석 예측법(http://us.expasy.org의 secondary structure prediction내에 GOR program)의 결과를 참고로 하였다.
본 발명에서 사용된 용어 사람 인터루킨-2의 동종체(isoform)는 천연형 사람 인터루킨-2의 고유 아미노산 서열 잔기에서 다른 아미노산 잔기로 변형이 이루어졌으나 그의 고유한 활성을 그대로 유지하는 유사체(analogs), 변이체(variants, muteins), 결합체(conjugates) 등을 의미한다.
본원 명세서에 사용된 아미노산의 삼문자(일문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다:
Ala(A): 알라닌; Asx(B): 아스파라긴 또는 아스파르트산; Cys(C): 시스테인;
Asp(D): 아스파르트산; Glu(E): 글루탐산; Phe(F): 페닐알라닌; Gly(G): 글라이신;
His(H): 히스티딘; IIe(I): 이소류신; Lys(K): 라이신; Leu(L): 류신; Met(M): 메티오닌; Asn(N): 아스파라긴; Pro(P): 프롤린; Gln(Q): 글루타민; Arg(R): 아르기닌; Ser(S): 세린; Thr(T): 쓰레오닌; Val(V): 발린; Trp(W): 트립토판; Tyr(Y): 티로신;
Glx(Z): 글루타민 또는 글루탐산.
본원 명세서에 표기되는 "(아미노산일문자)(아미노산위치)(아미노산일문자)"는 사람 인터루킨-2의 해당 아미노산 위치에서 선행 표기된 아미노산이 후행 표기된 아미노산으로 치환된다는 것을 의미한다. 예를 들면, C125S는 천연형 사람 인터루킨-2의 125번에 해당하는 시스테인이 세린으로 치환된다는 것을 가리킨다.
본원 명세서에 특정 부위의 아미노산 변형을 일으키기 위해서 프라이머는 "(아미노산일문자)(아미노산위치)(아미노산일문자)1 또는 2"로 표기되어 있는데 여기서 1은 이중 가닥 주형 중에서 5'→3'방향으로 진행되는 단일 가닥 주형을 위한 프라이머이고 2는 이중 가닥 중에서 3'→5'방향으로 진행되는 단일 가닥 주형을 위한 프라이머를 말한다.
상기 과정을 통해서 확보된 사람 인터루킨-2 유전자는 하나 이상 선택된 코돈에서 변형될 수 있다. 본 발명의 명세서에서 변형이란 사람 인터루킨-2를 암호화하는 유전자상의 하나 또는 그 이상의 코돈을 치환 또는 첨가함으로써 사람 인터루킨-2의 아미노산 서열상에서 변화를 일어나게 하는 것이라고 정의할 수 있다. 보다 구체적으로는, 사람 인터루킨-2 아미노산 서열상에 첫 번째 아미노산인 알라닌 앞에 시스테인을 첨가시킨 것, C-말단의 쓰레오닌 다음에 시스테인을 첨가시키는 것, 이들 말단부의 변경에 더 나아가 폴리펩티드 서열의 중간 부위에서의 서열 변형 등을 말한다.
본 발명의 한 실시예에서, 사람 인터루킨-2에서 목적한 아미노산 변형을 암호화하는 코돈(codon)을 포함하는 합성 올리고뉴클레오타이드를 제작한다. 일반적으로 길이면에서 약 27-36개 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드가 사용된다. 더 짧은 올리고뉴클레오타이드가 도입될 수도 있지만 최적의 올리고뉴클레오타이드는 변형을 암호화한 뉴클레오타이드의 양쪽으로 주형에 상보적인 12개 내지 15개의 뉴클레오타이드를 가지는 것이다. 이러한 올리고뉴클레오타이드가 주형 DNA에 충분히 혼성화될 수 있다. 본 발명에서 아미노산 변형의 생성을 위해서 사용한 합성 올리고뉴클레오타이드는 표 1에 기재되어 있다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 기술에 의해서 합성될 수 있다.
본 발명의 실시예에서는, 하나의 아미노산이 변형된 사람 인터루킨-2 동종체 DNA를 제작한다. 이 경우, 사람 인터루킨-2 DNA(도 1)를 주형으로 하고, 변형을 암호화한 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머(primer)로 사용하여 PCR을 수행한다. PCR의 가열(heating) 단계에서 이중 가닥 주형이 분리되면 각각의 단일 가닥 주형에 상보적인 프라이머가 혼성화(hybridzation)된다. DNA 합성효소(DNA polymerase)는 변형을 암호화한 프라이머의 -OH기로부터 주형에 상보적인 뉴클레오타이드를 5′→ 3′ 방향으로 연결시켜 나간다. 결과적으로, 두 번째 가닥은 변형을 암호화한 프라이머를 포함하게 되므로 유전자 상에서 목적한 변형을 암호화하게 되는 것이다. 상기 두 번째 가닥은 PCR의 반복되는 복제 단계에서 주형 DNA로 작용하게 되므로 변형을 암호화한 유전자는 계속 증폭될 것이다.
사람 인터루킨-2의 폴리펩티드 중간에서의 아미노산 서열의 변형을 C125S를 예로 들어서 설명한다. C125S는 천연형 사람 인터루킨-2의 125번에 해당하는 시스테인이 세린으로 치환시키기 위해서 천연형의 인터루킨-2 DNA(도 1)를 주형으로 하여 프라이머 IL2 Nde과 C125S2 그리고 C125S1과 IL2 C-term을 각각 쌍으로 하여 PCR을 수행했다. 결과적으로 125번째 아미노산 위치에 쓰레오닌 대신 시스테인에 해당하는 코돈으로 변형된 두 개의 DNA 단편을 얻을 수 었다. 이렇게 하여 얻은 두 가지의 DNA 단편을 넣어주고 IL2 Nde, IL2 C-term을 프라이머 쌍으로 하여 두 번째 PCR을 수행하면 125번째 아미노산 위치에 시스테인 대신 세린으로 변형된 사람 인터루킨-2 동종체 C125S의 변형 유전자를 얻을 수 있다.
본 발명의 한 실시예에 따르면 N 말단 또는 C 말단에서의 아미노산이 첨가된다. 하나 이상의 아미노산이 변형된 사람 인터루킨-2의 제작은 N-말단과 C-말단에서 이루어질 수 있으며, 이 부위에 대한 변형은 도 2에서 도시된 바와 같이 N-말단에 대해서는 Met-(AA)n-Ala-와 같은 서열이 되며, C-말단에 대해서는 도 3에 도시된 바와 같이 -Gln-Thr-(AA)n의 서열을 갖게 된다. 여기서 AA는 임의의 아미노산을 표시하며, 여기에는 주로 분자량이 작으면서 특정한 기능을 나타내지 않는 아미노산으로 글라이신 세린 알라닌 등이 사용될 수 있다. 또한 AA에는 적어도 하나의 시스테인 아미노산을 포함한다. 또한 n은 아미노산의 개수를 나타내며 n은 1부터 12개 까지의 아미노산 갯수를 가질 수 있다. 이는 추가로 부가된 아미노산에 의해 생체 내에서 이종 단백질로 인식하여 항체를 형성하기 위해 인지하기에 필요한 최소한의 개수로서 아미노산의 수가 대략 12개 이상을 필요로 하기 때문에 이 범위를 피하기 위한 아미노산의 최대한 가능한 수를 의미한다.
그러므로 이러한 부가적인 아미노산을 갖는 사람 인터루킨-2의 유전자를 제작하기 위해서는 N-말단의 경우에는 Met-(AA)n-Ala-의 아미노산 서열을 가짐으로써 ATG-(NNN)n-GCA-의 DNA 염기서열을, C-말단의 경우에는 -Leu-Thr-(AA)n의 아미노산 서열을 가짐으로써, -CTG-ACT-(NNN)n-TAA의 DNA 염기서열을 포함하게 된다. 여기서 NNN은 해당 아미노산을 코딩하는 DNA 염기서열을 나타낸다.
이와 같이 제작된 DNA 염기서열을 포함하는 해당 프라이머를 도 1에 표시된 사람 인터루킨-2 유전자를 사용하여 하나 이상의 아미노산이 변형된 사람 인터루킨-2 유전자를 제작할 수 있다.
예를 들면 N-말단에 1개의 글라이신과 시스테인이 첨가된 경우를 보면 N-말단 부위의 아미노산 서열이 Met-(Gly-Cys-)Ala-가 될 수 있다. 이때에 사용될 프라이머의 고안은 GTAATAAATA CAT-ATG-(GGT-TGT-)GCA-로 할 수 있으며, 이를 도 1의 사람 인터루킨-2 유전자 주형을 이용하여, 표 1에 표시된 IL2 C-term 프라이머와 함께 사용하여 Met-(Gly-Cys-)Ala-의 서열을 갖는 변형된 사람 인터루킨-2 유전자를 제작할 수 있다.
상기에서 제작된 사람 인터루킨-2 유전자를 다시 IL2 Nde과 IL2 C-term 프라이머를 사용하여 다시 PCR을 수행한다.
또한, 본 발명의 상기 N 말단 또는 C 말단에 아미노산의 첨가하고 더 나아가 사람 인터루킨-2 폴리펩티드 중간부위의 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한 후 폴리에틸렌글리콜을 결합할 수 있다. 예컨대, N 말단에 시스테인을 첨가하고, 사람 인터루킨-2 폴리펩티드내의 125 위치의 시스테인을 세린으로 치환하는 예로서 -1C/C125S는, 이미 제작한 -1C 사람 인터루킨-2 동종체 DNA를 주형으로 하여 프라이머 IL2 Nde과 C125S2 그리고 C125S1과 IL2 C-term을 각각 쌍으로 하여 PCR을 수행한다. 결과적으로 125번째 아미노산 위치에 쓰레오닌 대신 시스테인에 해당하는 코돈으로 변형된 두 개의 DNA 단편을 얻을 수 있다. 이렇게 하여 얻은 두 가지의 DNA 단편을 넣어주고 IL2 Nde, IL2 C-term을 프라이머 쌍으로 하여 두 번째 PCR을 수행하면 125번째 아미노산 위치에 시스테인 대신 세린으로 변형되고, N 말단의 알라닌 앞에 시스테인이 첨가된 사람 인터루킨-2 동종체 -1C/C125S의 변형 유전자를 얻을 수 있다. 125 위치 이외의 동종체의 제작도 각각의 해당하는 DNA 프라이머를 사용하여 상기 -1C/C125S 동종체의 제작 방법과 동일한 방법을 사용하여 제작할 수 있다.
본 발명에 따라 N 말단 또는 C 말단에 적어도 하나 이상의 시스테인을 포함하는 아미노산이 첨가된 동종체의 폴리펩티드 중간 부위에서의 아미노산 변형 위치는 기존에 공지된 위치가 이용가능하다. 이와 같이 사람 인터루킨-2 폴리펩티드 중간부위의 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 종래기술로서는
미국특허 US 4,518,584에서 125번째 아미노산인 시스테인을 세린 또는 알라닌으로, 미국특허 US 5,206,344에서 3번째 아미노산인 쓰레오닌을 시스테인으로, 미국 특허 출원 US application Ser. 810,656에서 104번째 위치한 메치오닌을 알라닌으로, 역시 미국 특허 US 6,608,183B1에서 3번째 아미노산인 쓰레오닌을 시스테인으로 교체하는 것을 포함한, 사람 인터루킨-2 단백질의 아미노 말단의 알라닌 및 C-말단에 존재하는 쓰레오닌을 시스테인으로 교체하는 보고가 있다.
그러나 사람 인터루킨-2에서 아미노 말단 및 C-말단의 아미노산 서열에 추가로 시스테인을 첨가한 예는 없다.
이들 문헌에 기재된 내용은 본 발명의 참고문헌으로서 본 명세서에 포함된다. 또한, 이들에 기재된 사람 인터루킨-2 동종체의 제조방법, 페길레이션 방법 등도 본 발명의 참고문헌으로 본 명세서에 포함된다.
본 발명에 따른 사람 인터루킨-2 동종체를 암호화하는 DNA 서열은 본 분야에 공지된 표준방법에 의해, 예를 들면 자동 DNA 합성기(예, 바이오서치, 어플라이드 바이오시스템TM)를 사용하여 합성할 수도 있다.
연관된 관점으로서, 본 발명은 사람 인터루킨-2 동종체를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.
본원 명세서에 사용된 "폴리펩티드"란 용어는 단백질 또는 생리활성 단백질이란 용어로 사용될 수 있다.
본원 명세서에 사용된 "동종체"는 원래의 생리활성 단백질의 주요 기능은 갖고 있으나, 유전자 조작 또는 다른 조작을 통해 변형된 생리 활성 단백질을 의미한다. 여기서 변형이란 아미노산 서열의 치환, 첨가 및 결실을 의미하며, 이러한 변형 중에는 폴리에틸렌글리콜의 결합을 위하여 시스테인으로의 치환 또는 첨가를 포함한다. 또한, 더 나아가 상기 시스테인에 폴리에틸렌글리콜의 중합물이 화학 반응에 의해 공유결합적으로 결합된 것을 의미할 수 있다.
본원 명세서에 사용된 "체내 지속성"은 생리활성 단백질이 사람 혹은 동물에 투여되었을 때, 단백질 분해 효소 및 신장에서의 제거 등을 통해서 초기에 투여된 생리활성 단백질의 총량 및 활성이 감소됨으로 인하여, 그 기능을 상실하게 된다. 따라서 생리활성 단백질이 체내에서 기능을 할 수 있는 정도의 단백질의 잔류 시간을 의미하는 것으로써, 체내에서의 생리활성 단백질의 반감기로 나타낸다.
본원 명세서에 사용된 "벡터"란 용어는 외래 유전자를 숙주 세포 내로 안정적으로 운반할 수 있는 운반체로서의 DNA 분자를 말한다. 유용한 벡터가 되기 위해서는 복제될 수 있어야 하며, 숙주 세포 내로 유입할 수 있는 방안을 갖추어야 하고, 자신의 존재를 검출 할 수 있는 수단을 구비하여야 한다. 또한 "재조합 발현 벡터"라는 용어는 일반적으로 외래 유전자가 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 벡터에 작동적으로 연결되어 형성된 환상의 DNA 분자를 말한다.
재조합 발현 벡터는 사람 인터루킨-2가 삽입된 DNA 벡터가 생성될 수 있다. 재조합 발현 벡터의 제작에 있어서, 당업계에 주지된 바와 같이, 숙주 세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자를 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다.
사람 인터루킨-2 동종체를 암호화한 유전자뿐만 아니라 상기의 구성 성분들(즉, 조절서열)을 포함하는 적합한 벡터의 제작은 기본적인 재조합 DNA기술을 사용해서 제작할 수 있다. 목적한 벡터를 형성하기 위해서 분리된 각각의 DNA 단편들이 결합되려면 먼저 제한 효소로 절단한 다음 특정한 순서(order)와 방향(orientation)을 고려하여 연결되어야 한다.
DNA는 적절한 완충액(buffer)내에서 특정한 제한 효소를 사용해서 절단될 수 있다. 일반적으로 약 0.2∼1ug의 플라스미드 또는 DNA 단편은 대략 20μl의 버퍼용액에 해당 제한 효소 약 1∼2 단위와 함께 사용된다. 적절한 버퍼, DNA농도, 반응 시간과 온도는 제한 효소의 제조업체에 의해서 특정된다. 일반적으로, 37℃에서 약 한 두시간 정도 반응하는 것이 적당하지만 일부 효소들은 더 높은 온도를 필요로 한다. 반응 후에, 효소와 다른 불순물들은 페놀과 클로로포름의 혼합물로 상기 소화용액을 추출함에 의해서 제거되고 DNA는 에탄올로 침전시켜 수용액 층으로부터 회수할 수 있다. 이때 DNA 단편들이 기능성 벡터를 형성할 수 있도록 연결되기 위해서는 DNA 단편의 말단이 서로 상용성이 있어야만 한다.
절단된 DNA 단편들은 전기영동(electrophoresis)을 이용해서 크기별로 분류되고 선택되어야 한다. DNA는 아가로스나 폴리아크릴아미드 매트릭스(matrix)를 통해서 전기영동될 수 있다. 매트릭스의 선택은 분리될 DNA 단편의 크기에 따라 결정된다. 전기 영동 후에 DNA는 전기용출(electroelution)에 의해서 매트릭스로부터 추출되거나, 매트릭스로부터 추출되거나, 저용융 아가로스가 사용되었다면 아가로스를 용융시키고 그로부터 DNA를 추출한다.
연결되어야 할 DNA 단편들은 동일한 몰양으로 용액에 첨가되어야 한다. 그 용액은 ATP, 연결 효소(ligase) 완충액, DNA 0.5ug당 약 10 단위의 T4 연결효소(ligase)와 같은 연결효소를 포함하고 있다. DNA 단편이 벡터에 연결되려면, 먼저 벡터는 적합한 제한효소에 의해서 절단되어 선형화되어야 한다. 선형화된 벡터는 알칼리성 인산 가수분해 효소 또는 소 내장의 가수분해 효소로 처리하여 사용할 수 있다. 이러한 인산 가수분해 효소 처리는 연결 단계 동안에 벡터의 자가 연결(self-ligation)을 방지한다. 이와 같은 방법을 통해서 제작된 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킨다.
폴리뉴클레오타이드는 문헌(Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology(1986)) 및 문헌(Sambrook, J., et al. (1989) "Molecular Cloning" A Laboratory Manual 2nd edition)과 같은 기본적인 실험 지침서에 기술된 방법에 의해서 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포로 도입하는데 바람직한 방법은 칼슘클로라이드 형질전환(calcium chloride transformation), 전기천공(electroporation) 등을 포함한다.
본 발명의 생산 방법에서, 숙주 세포들은 공지된 기술을 이용해서 폴리펩타이드의 생산에 적합한 영양 배지에서 배양된다. 예를 들어서, 세포들은 적당한 배지와 폴리펩타이드가 발현 및/또는 분비되는 것을 허용하는 조건 하에, 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 또는 대규모 발효, 셰이크 플라스크 배양에 의해서 배양될 수 있다. 배양은 공지된 기술을 사용해서, 탄소, 질소 공급원 및 무기염을 포함하는 적절한 영양배지에서 일어난다. 배지는 당업자에게 잘 알려져 있으며 시판되고 있는 것을 사용하거나 직접 제조하여 사용할 수 있다. 폴리펩타이드가 영양배지로 직접 분비된다면 폴리펩타이드는 배지로부터 직접 분리될 수 있다. 폴리펩타이드가 분비되지 않는다면, 그것은 세포의 파쇄액(lysate)으로부터 분리될 수 있다.
폴리펩타이드는 당업계에 공지된 방법에 의해서 분리될 수 있다. 예를 들어서, 이로서 제한되는 것은 아니지만, 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발, 또는 침전을 포함하는 전통적인 방법에 의해서 영양 배지로부터 분리될 수 있다. 더 나아가 폴리펩타이드는 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별용해도(예를 들면, 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하여 일반에 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.
정제된 사람 인터루킨-2 동종체는 다음과 같은 방법으로 페길레이션된다.
페길레이션에 사용되는 본 발명에 적합한 "비단백질 부분"으로는, 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 바람직하며, 특히 측쇄가지를 가진(branched) 폴리에틸렌글리콜이 바람직하다. 다른 예로서는 이들에 한정되는 것은 아니지만, 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol, PPG), 폴리옥시에틸렌(polyoxyethylene, POE), 폴리트리메틸렌 글리콜(polytrimethylene glycol), 폴리락트산(polylactic acid) 및 그 유도체, 폴리아크릴산 및 그 유도체, 폴리(아미노산), 폴리(비닐 알코올), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리포스파진(polyphosphazenes), 폴리(L-라이신)[poly(L-lysine)], 폴리알킬렌 옥사이드(polyalkylene oxide, PAO), 폴리사카라이드(polysaccharide) 등의 수용성 고분자 및 덱스트란(dextran), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol, PVA), 폴리아크릴 아미드(polyacryl amide) 등의 비 면역성 고분자로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 또는 그 이상을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 고분자 유도체의 합성에 사용하는 생체적합성 고분자의 분자량은 약 2,000 내지 100,000인 것이 바람직하며, 20,000 내지 40,000인 것이 더욱 바람직하다.
생체 적합성 고분자가 사람 인터루킨-2의 티올 기를 통하여 사라 인터루킨-2에 결합하기 위해서는 활성화되어야 하며, 이를 위해 반응성 작용기와 결합될 수 있다. "반응성 작용기"란 목적하는 생물학적 활성 물질과 결합하기 위해 생체 적합성 고분자를 활성화시키는 기(group) 또는 잔기(moiety)를 말한다. 생체적합성 고분자를 생물학적 활성 물질에 결합시키기 위해 말단 기 중 하나를 반응성 작용기로 전환시키는데 이 과정을 "활성화"라 한다. 예를 들면, 폴리(알킬렌 옥사이드)를 생물학적 활성 단백질에 결합시키기 위해 하이드록실 말단 기 중 하나를 카보네이트와 같은 반응성 작용기로 전환시킬 수 있으며, 이에 따라 얻어진 생성물은 활성화된 폴리(알킬렌 옥사이드)가 된다.
본 발명에서 생체적합성 비단백질 부분 고분자를 활성화시키기 위한 반응성 작용기는 말레이미드(maleimide), 아세트아미드(acetamide), 펜텐산 아미드(pentenoic amide), 부텐산 아미드(butenoic amide), 이소시아네이트(isocyanate), 이소티오시아네이트(isothiocyanate), 시아누르산 클로라이드(cyanuric chloride), 1,4-벤조퀴논(1,4-benzoquinone), 디설파이드(disulfides) 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
PEG를 단백질의 티올 기를 통하여 결합시키는 방법은 일반적으로 공지된 방법에 의하여 수행될 수 있다.
공지된 방법들의 예는 하기와 같다. 예를 들면, PEG-말레이미드(maleimide)를 사용하여 마이클 반응(Michael reaction)에 의해 활성화된 이중 결합에 티올 기가 결합하는 방법이 있다[Ishii et al., Biophys J. 1986, 50:75-80]. 또한, 단백질 화학에서 널리 공지된 바와 같이, PEG-요오도아세트아미드(iodoacetamide) 시약을 사용한 방법이 있다. 이 변형 방법은 강한 산성 가수분해에 의해, 표준 아미노산 분석에 의해 동정되고 정량될 수 있는 안정한 형태의 PEG가 결합된 시스테인 유도체인, 카르복시메틸시스테인을 만드는 이점이 있다[Gard FRN. Carboxymethylation. Method Enzymol 1972;B25:424-49]. 이외에도, PEG-오르토-피리미딜-디설파이드를 사용하여 안정한 대칭 이황화물을 얻는 방법[Woghiren et al. Bioconjgate Chem 1993, 50:75-80]; 활성화된 PEG인, 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트 활성-PEG를 시스테인의 티올 기에 반응시켜 공유 결합시키는 방법[USP5,166,322호]; 활성화된 PEG인 말레이미도-6-아미노카프로일 에스테르-활성화된 PEG4000을 특정 부위에 시스테인을 치환시킨 IL-2 변이체에 반응시켜 시스테인 잔기에 접합시키는 방법[USP5,206,344호]; 감마-말레이미도부틸산 및 베타-말레이미도프로피온산을 사용하여 단백질의 티올 기를 화학적으로 변형시키는 방법[Rich et al., J. med. Chem. 18, 1004, 1975] 등이 있다.
본 발명의 실시예에서 수행한 페길레이션법은 NOF사의 branched mPEG40,000와 SunBio사의 branched mPEG40,000을 사용하였으며, 사람 인터루킨-2에 대한 20배의 몰 비율로 사용하였으며, 반응은 0.1M 인산 완충용액(pH 7-8) 속에서 상온에서 2시간 동안 교반하여 수행하였다.
약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정제는 도입된 투여용량과 농도에서 투여자에게 독성이 없어야 하고 그 제제의 다른 구성성분들과 상용성이 있어야 한다. 예를 들어서 당해 제제는 폴리펩타이드에 해로운 것으로 알려진 산화제 또는 기타 물질들을 포함해서는 안된다.
적합한 담체는 인산, 시트르산, 및 그 외 유기산과 같은 버퍼; 아스코르브산(ascorbic acid)을 포함한 항산화제; 저분자량 폴리펩타이드; 혈장 알부민, 젤라틴, 및 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone)과 같은 친수성 폴리머; 글라이신, 글루타민, 아르기닌, 또는 라이신과 같은 아미노산; 글루코오스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함한 단당류, 이당류, 그 외 탄수화물; EDTA같은 킬레이트 인자; 아연, 코발트, 또는 구리와 같은 금속 이온; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당알코올; 나트륨과 같은 염-형성 카운터이온(counterion); 및/또는 트윈(Tween), 플루로닉(Pluronic), 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
당쇄화된 사람 인터루킨-2 동종체가 치료를 위한 투여용으로 사용되려면 멸균되어야만 한다. 멸균은 멸균 여과 막(sterile filtration membrane)을 통한 여과를 통해서 달성될 수 있다.
치료용 당쇄화된 사람 인터루킨-2 동종체 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트(sterile access port)를 가지고 있는 용기 예를 들면, 피하주사 바늘에 의해서 관통될 수 있는 마개를 가지고 있는 정맥 주사액 백(bag) 또는 바이알(vial)에 보관되어야 한다.
본 발명에 따른 사람 인터루킨-2 동종체는 비경구 투여를 포함한, 적절한 기술에 의해서 동물에게 직접적으로 투여되고, 국소적 또는 전신으로 투여될 수 있다. 특정적인 투여 경로는 예를 들어서, 사람 인터루킨-2를 이용해서 인지되었거나 예상되는 부작용을 포함한 환자의 병력에 따라서 결정될 것이다. 비경구 투여의 예는 피하조직, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 투여를 포함한다. 가장 바람직하게, 투여는 지속적인 주입 (예를 들면 삼투압 펌프와 같은 미니 펌프) 또는 주사 예를 들면, 정맥내 또는 피하조직내 경로를 통하는 것이다. 사람 인터루킨-2 동종체의 경우에 바람직한 투여 방식은 피하조직 내이다.
본 발명의 사람 인터루킨-2 동종체는 환자에게 치료에 효과적인 양으로 투여될 것이다. "치료에 효과적인"이란 주어진 상태와 투여 방식에서 목적한 치료 효과를 나타내는데 충분한 양이라고 정의할 수 있다. 치료에 사용될 사람 인터루킨-2 조성물은 치료될 특정한 상태, 개개 환자의 임상 조건(특히, 사람 인터루킨-2 단독 처리시의 부작용), 사람 인터루킨-2 동종체 조성물의 전달 장소, 투여 방법, 투여 스케줄, 당업자에게 숙지된 다른 요건들을 고려해서 바람직한 의료 업무(practice)와 일관되게 제조되고 복용되어야 한다. 사람 인터루킨-2 동종체의 치료에 효과적인 양이란 그러한 사항들의 고려에 의해서 결정된다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 보다 구체적으로 예시될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 단지 본 발명의 구현 예이며 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
이상에서와 같이 본 발명에 따른 사람 인터루킨-2의 동종체는 체내 활성 또는 체내 지속성이 크게 증가하여 임상에서 투여 횟수를 낮출 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에서 사용한 주형 사람 인터루킨-2 유전자 및 단백질의 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 사람 인터루킨-2의 N-말단부위에 아미노산 변형을 일으킨 동종체의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 사람 인터루킨-2의 C-말단부위에 아미노산 변형을 일으킨 동종체의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 4는 사람 인터루킨-2 동종체를 발현하는 플라스미드 벡터의 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 사람 인터루킨-2에 PEG 40을 결합시킨 동종체에 대한 SDS-PAGE 결과이다
<실시예 1> 사람 인터루킨-2 동종체의 제작
천연형 사람 인터루킨-2 동종체의 제작을 위해 주형으로 사용된 사람 인터루킨-2의 유전자를 cDNA library로부터 프라이머를(IL2-1와 IL2-2)를 사용하여 PCR로합성하였다. 합성 유전자의 염기서열은 표 1에 기재되어 있으며, 주형으로 사용된 사람 인터루킨-2의 DNA 서열 및 아미노산 서열은 도면 1에 표시되어 있다.
T7 promoter 5'TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG3
T7 term 5'GCT AGT TAT TGC TCA GCG G3
IL2-1 5'ATG GCA CCT ACT TCA AGT TCT ACA3
IL2-2 5'TCA AGT CAG TGT TGA GAT GAT GCT3
IL2 Nde 5'AGA TAT ACA TAT GGC ACC TAC TTC3
IL2 Nde(-1C) 5'AGATAT ACA TAT GTG TGC ACC TAC3
mIL2 Nde 5'AGA TAT ACA TAT GCC TAC TTC AAG TTC3
IL2 C+ 5'TTC GGA TCC TCA ACA AGT CAG TGT TGA3
C125S1 5'AGA TGG ATT ACC TTT TCT CAG AGC ATC ATC3
C125S2 5'GAT GCT CTG AGA AAA GGT AAT CCA TCT GTT3
IL2 C-term 5'TTC GGA TCC TCA AGT CAG TGT TGA3
1. C125S 사람 인터루킨-2 동종체의 제작
본 발명에서 종래에 공지된 동종체로서 대조로 사용되거나 또는 사람 인터루킨-2 폴리펩티드의 중간 부위에서의 아미노산 변형의 예로서 C125S를 제작한다. C125S는 천연형 사람 인터루킨-2의 125번에 해당하는 시스테인을 세린으로 치환시키기 위해서 천연형의 인터루킨-2 DNA를 주형으로 하여 프라이머 IL2 Nde와 C125S2 그리고 C125S1과 IL2 C-term을 각각 쌍으로 하여 PCR을 수행했다. 결과적으로 125번째 아미노산 위치에 시스테인 대신 세린에 해당하는 코돈으로 변형된 두 개의 DNA 단편을 얻을 수 있었다. 이렇게 하여 얻은 두 가지의 DNA 단편을 넣어주고 IL2 Nde, IL2 C-term을 프라이머 쌍으로 하여 두 번째 PCR을 수행하면 125번째 아미노산 위치에 시스테인 대신 세린으로 변형된 사람 인터루킨-2 동종체 C125S의 변형 유전자를 얻을 수 있었다.
2. -1C 사람 인터루킨-2 동종체의 제작
-1C는, 천연형 사람 인터루킨-2의 DNA를 주형으로 하여 N-말단의 알라닌 앞에 시스테인 아미노산을 첨가한 동종체를 제작하기 위해서 프라이머 IL2 Nde(-1C) 프라이머와 IL2 C-term 프라이머를 쌍으로 하여 PCR을 수행했다. 증폭된 DNA 단편을 제한 효소로 절단하여(Nde I과 BamH I), 동일한 제한 효소로 절단된 발현 벡터(pET12a)에 도입함으로써 N-말단의 알라닌 앞에 시스테인 아미노산이 첨가된 사람 인터루킨-2 동종체 유전자를 얻을 수 있었다.
N-말단의 아미노산 서열은 메티오닌-시스테인-알라닌-프롤린-쓰레오닌-세린의 순서가 된다.
여기에서 발현 벡터로 pET12a는 플라스미드 벡터 내에 lac repressor에 의해 발현을 조절하는 작동자(operator)와 충분한 lac repressor의 공급을 위해서(숙주 세포의 염색체에 존재하는 lac repressor로는 한계가 있기 때문에) 목적 단백질의 정밀한 조절을 위해 필요한 두 가지 요소가 없다. 그러므로 pET12a에 도입된 유전자를 다시 Xba I과 BamH I으로 절단하여, 동일한 제한 효소로 절단된 pET28a(+) 벡터에 도입하였다.
여기서 pET28a(+) 벡터의 Nde I과 BamH I 절단부위를 사용할 경우에는 목적 단백질인 사람 인터루킨-2에 His-Tag과 트롬빈 절단부위도 같이 포함되기 때문에 pET12a에서 도입된 사람 인터루킨-2 유전자를 Xba I과 BamH I 제한 효소로 절단하여 pET28a(+)에 도입한다.
3. -1C/C125S 사람 인터루킨-2 동종체의 제작
N 말단에 첨가된 아미노산과 사람 인터루킨-2 폴리펩티드내의 아미노산의 변형의 예로서 -1C/ C125S 는 제작된 -1C 사람 인터루킨-2 동종체에 125번에 해당하는 시스테인을 쓰레오닌으로 추가로 치환시키기 위해서, 이미 제작한 C125S 사람 인터루킨-2 동종체 DNA를 주형으로 하여 프라이머 IL2 Nde(-1C)과 IL2 C-term을 사용하여 PCR을 수행했다. 결과적으로 125번째 아미노산 위치에 시스테인 대신 쓰레오닌에 해당하는 코돈으로 변형되고 N-말단에 메치오닌과 알라닌 사이에 시스테인이 도입된 DNA 단편으로 사람 인터루킨-2 동종체 -1C/ C125S의 변형 유전자를 얻을 수 있었다.
발현 벡터에 도입하는 과정은 상기의 -1C 사람 인터루킨-2 동종체의 제작과 동일하다.
4. 134C 사람 인터루킨-2 동종체의 제작
134C는 C125S 사람 인터루킨-2의 DNA를 주형으로 하여 IL2 Nde 프라이머와 IL2 C+ 프라이머를 쌍으로 하여 PCR을 수행했다. 증폭된 DNA 단편을 제한 효소로 절단하여(Nde I과 BamH I), 동일한 제한 효소로 절단된 pET28a(+)에 도입하여 발현 벡터에 도입함으로써 C-말단에 시스테인 아미노산이 첨가된 사람 인터루킨-2 동종체 유전자를 얻을 수 있었다.
발현 벡터에 도입하는 과정은 상기의 -1C 사람 인터루킨-2 동종체의 제작과 동일하다.
C-말단의 아미노산 서열은 -알라닌-글루타민-프롤린-시스테인의 순서가 된다.
5. 134C/ C125S 사람 인터루킨-2 동종체의 제작
134C/ C125S는 제작된 C125S 사람 인터루킨-2 동종체에 IL2 Nde 프라이머와 IL2 C+ 프라이머를 쌍으로 하여 PCR을 수행했다.
발현 벡터에 도입하는 과정은 상기의 -1C 사람 인터루킨-2 동종체의 제작과 동일하다.
이와 같이 제작된 사람 인터루킨-2 동종체의 유전자를 T7 프로모터에 의해 발현이 될 수 있도록 발현 벡터에 삽입하였다.
6. des1Ala/134C/ C125S 사람 인터루킨-2 동종체의 제작
앞에서 제작된 134C/ C125S 사람 인터루킨-2 동종체를 주형으로 하여 mIL2 Nde 프라이머와 IL2 C+ 프라이머를 쌍으로 하여 PCR을 수행했다.
발현 벡터에 도입하는 과정은 상기의 -1C 사람 인터루킨-2 동종체의 제작과 동일하다.
이와 같이 제작된 사람 인터루킨-2 동종체의 유전자를 T7 프로모터에 의해 발현이 될 수 있도록 발현 벡터에 삽입하였다.
7. 메치오닌 아미노펩티데이즈의 도입
대장균 K12로부터 메치오닌 아미노펩티데이즈 유전자를 주형으로 하여 순방향 프라이머 ECOR1MAPf( 5'-GGA ATT CAC GTA TCC CAT ATT ACC GAC CCC AAA GG-3') 이고, 역방향 프라이머 MAPrBAMH1(5'-CGG GAT CCA TCT TAT TCG TCG TGC GAG ATT GC-3')을 쌍으로 PCR을 수행하였다.
이와 같이 제작된 대장균 메치오닌 아미노펩티데이즈 유전자를 발현벡터 pSTV29(TAKARA, Cat. No. 3332)에 제한 효소 EcoR1과 BamH1으로 절단하여, 삽입하였다.
8. des1Ala/134C/ C125S 사람 인터루킨-2 동종체 발현 균주 제작
앞에서 제작된 des1Ala/134C/ C125S 사람 인터루킨-2 동종체 발현벡터와, 대장균 메치오닌 아미노펩티데이즈 발현벡터를 순차적으로 대장균 BL21에 형질전환시켜서 des1Ala/134C/ C125S 사람 인터루킨-2 동종체를 생산하는 균주를 제작하였다.
<실시예 2> 사람 인터루킨-2 동종체의 발현 및 정제
사람 인터루킨-2 동종체의 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터를 대장균에 형질 전환을 수행하여 사람 인터루킨-2 동종체 단백질을 생산하는 균주를 제작한다.
형질 전환의 방법은 일반적으로 사용되는 공지된 칼슘 클로라이드법을 사용하였으며, 숙주 세포로 사용되는 대장균 역시 일반적으로 사용되는 대장균(BL21(DE3), HMS174(DE3) 계통의 숙주 세포의 염색체 내에 T7 RNA 중합효소를 포함하고 있는 균주 등)을 사용할 수 있다.
형질전환된 대장균을 15 ml 튜브에서 5 ml의 Luria Broth (LB) 배지에 접종하여 30℃ 배양기에서 밤샘 배양하였다. 이 종배양균을 3,000 ml 삼각 플라스크에서 500 ml의 Luria Broth (LB) 배지에 접종하여 30℃에서 배양하였다. 600 nm에서의 흡광도가 0.8 - 1.2에 도달하면 IPTG를 최종적으로 1mM 되게 첨가한 후, 다시 4시간 동안 배양하면서 사람 인터루킨-2 동종체의 발현을 유도하였다.
배양이 완료된 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고 증류수로 세척하였다. 세척한 균체는 Microfluidizer (Microfluidics사)로 12,000 psi 에서 4회 파쇄하고 원심분리로 봉입체(inclusion body)를 회수하고 증류수로 3회 세척하였다.
모아진 봉입체 덩어리는 0.01% Tween80, 10mM Phosphate buffer, pH 7.5로 풀어준 다음, 6,000rpm, 4℃, 20분간 고속원심분리하여 봉입체 덩어리를 다시 모은다. 모아진 봉입체를 50mM Phosphate buffer, 5mM EDTA, pH 7.5로 단백량이 약 50mg/mL이 되게 풀어준다. 최종 단백농도가 12mg/mL이 되게 동일한 용해액으로 희석하고 5시간 동안 봉입체를 용해 시킨다. 용해된 봉입체액을 4000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액 만을 모은다. 모아진 봉입체 용해액에 최종 농도가 100mM이 되게 DTT를 첨가한 다음, 봉입체 용해액을 서서히 교반하며 IL-2 단백질을 환원 시킨다. 환원된 IL-2 액을 Sephacryl S-200 Gel chomatography를 통과시켜 IL-2 단백질을 모은다. 환원 IL-2를 부피 기준으로 총 수지 부피의 2%를 탑재한다. 이 공정에서 DNA 및 분자량이 큰 이종 단백을 제거한다. 1차 Gel Chromatography에서 모아진 IL-2 환원 단백에 CuCl2를 첨가하고, 상온에서 교반한다. 산화된 IL-2 단백을 역상 HPLC (Reverse Phase HPLC)로 정제한다. 이때 사용되는 컬럼은 C4 column이며, 정제는 두 이동상의 직선구배에 의해 분리하여, IL-2 단백 만을 모은다. 이 공정에서는 IL-2와 분자량이 유사한 단백 제거 및 발열성 물질 제거를 목적으로 한다. 역상 HPLC Chromatography에서 수집된 IL-2 액을 Sephacryl S-200 Gel chomatography를 통과시켜 IL-2 단백질을 모은다. 부피 기준으로 총 수지 부피의 2%에 해당하는 IL-2를 탑재한다. 이 공정에서는 순도 98%이상의 IL-2 단백을 모으며, IL-2 중합체 및 IL-2 보다 작은 분자량의 제거한다. 모아진 IL-2 단백은 10mM Phosphate, pH 7.5로, 10Kda의 Ultramembrane을 사용하여 Diafiltration을 한다. 이렇게 얻어진 인터루킨-2의 순수 단량체만을 이용하여 폴리에틸렌글리콜 부가 반응에 사용하였다.
<실시예 3> 사람 인터루킨-2 동종체의 폴리에틸렌글리콜의 결합
1. Branched mPEG(40,000)-말레이미드-IL-2 동종체 제조
실시예 2에서 제조된 사람 인터루킨-2 동종체 각각 10 mg을 0.1 M 인산완충용액 (pH 7.0 - 8.0)에 넣고 branched mPEG(40,000)-말레이미드 (NOF사제) 400 mg을 첨가하였다. 반응은 상온에서 2 시간 동안 교반하면서 수행하였고 1 N 염산용액으로 pH를 3.0 으로 낮추어서 반응을 정지하였다.
<실시예 4> 사람 인터루킨-2 동종체와 폴리에틸렌글리콜의 중합체의 정제
실시예 3에서 제조된 PEG-IL-2 중합체는 다음의 과정으로 순수 분리 정제하였다.
1. CM Sepharose FF 크로마토그래피
반응이 완료된 각각의 mPEG- IL-2 중합체를 pH를 3.0으로 적정하고 증류수로 10배 이상 희석한 후 미리 3배의 컬럼 부피 이상의 2 mM HCl로 평형화된 CM Sepharose FF (Amersham Biosciences사) 10 ml을 충진한 컬럼에 로딩하였다. 로딩이 완료된 컬럼은 3 컬럼 부피 이상의 2 mM HCl로 평형한 후, 3 컬럼 부피의 50 mM 초산염화나트륨 완충용액 (pH 5.0)로 세척하였다. mPEG(20,000)-말레이미드- IL-2 동종체 및 branched mPEG(20,000)-말레이미드- IL-2 동종체의 경우 12 컬럼 부피 이상의 40 mM 염화나트륨이 포함된 50 mM 초산염화나트륨 완충용액 (pH 5.4)로 mPEG- IL-2 중합체를 용출하였다. branched mPEG(40,000)-말레이미드- IL-2 동종체의 경우 12 컬럼 부피 이상의 20 mM 염화나트륨이 포함된 50 mM 초산염화나트륨 완충용액 (pH 5.4)로 mPEG- IL-2 중합체를 용출하였다. 용출액은 5 ml 씩 분획하였고 용출된 분획은 HPLC로 분석 후 모았다.
2. Gel Permeation Chromatography
CM Sepharose FF로 정제된 mPEG- IL-2 중합체를 10,000 Da 분자량의 Centricon Plus-80로 3000 rpm, 25 min 씩 수행하여 최종 농축액의 단백질 농도가 5 mg/ml 정도까지 농축하였다.
농축된 단백질은 3 컬럼 부피 이상 10 mM 초산염화나트륨 완충용액 (pH 5.4)로 평형된 Sephacryl S-200 (Amersham Biosciences사) 300 ml을 충진한 컬럼에 로딩하였다. 완충용액을 분당 1 ml의 속도로 전개하여 단백질 용액에 포함된 mPEG- IL-2 중합체를 순수분리하였다. 이때 단백질은 IL-2 응집체(multimer), PEG- IL-2, IL-2 dimmer, IL-2 monomer 순으로 용출되었다.

Claims (10)

  1. 아미노산 서열번호 1로 표시되는 사람 인터루킨-2의 N 말단 부위의 Ala 앞에 또는 C 말단 부위의 Thr다음에 하나 이상의 아미노산을 첨가하고, 상기 첨가되는 아미노산 중 하나 이상은 시스테인이며, 상기 시스테인 중 어느 하나 이상에 폴리에틸렌글리콜을 결합한 사람 인터루킨-2 동종체.
  2. 청구항 1항에 있어서, 사람 인터루킨-2의 상기 각각의 말단 부위에 첨가되는 아미노산은 각각 1 내지 12개가 첨가되는 것을 특징으로 하는 사람 인터루킨-2 동종체.
  3. 청구항 1항에 있어서, 상기 첨가되는 아미노산은 시스테인 1개인 것을 특징으로 하는 사람 인터루킨-2 동종체.
  4. 청구항 3항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 측쇄가지를 가지며 분자량은 20kDa 내지 40kDa인 것을 특징으로 하는 사람 인터루킨-2 동종체.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 시스테인은 C 말단에 첨가되는 134C인 것을 특징으로 하는 사람 인터루킨-2 동종체.
  6. 청구항 1항에 있어서, 상기 사람 인터루킨-2은 폴리에틸렌글리콜이 결합하기 전에 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되는 것을 특징으로 하는 사람 인터루킨-2 동종체.
  7. 청구항 1항 내지 청구항 6항 중 어느 한 항에 기재된 사람 인터루킨-2 동종체와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  8. 청구항 1항 내지 청구항 6항 중 어느 한 항에 기재된, N 말단 또는 C 말단에 시스테인이 첨가된 사람 인터루킨-2 동종체 단백질을 코딩하는 유전자.
  9. 청구항 1항 내지 청구항 6항 중 어느 한 항에 기재된 사람 인터루킨-2 동종체로, 사람 인터루킨-2의 아미노산 서열을 변형하기 위한 프라이머로 사용되는 올리고데옥시뉴클레오타이드.
  10. 청구항 9항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 2 내지 7의 올리고데옥시뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 올리고데옥시뉴클레오타이드.
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