BRPI0721171A2 - Produção de plantas com conteúdo alterado de óleos, proteínas ou fibras - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PRODUÇÃO DE PLANTAS COM CONTEÚDO ALTERADO DE ÓLEOS, PROTEÍNAS OU FIBRAS".

REFERÊNCIA CRUZADA AO(S) PEDIDO(S) DE PATENTE(S) RELACIO- NADO(S)

Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Pa- tente U.S. Provisório N- 60/870.355, depositado em 15 de dezembro de 2006, cuja totalidade é incorporada aqui como referência.

CAMPO DA DESCRIÇÃO A presente descriçã está relacionada a plantas modificadas com

conteúdo alterado de óleos, proteínas e/ou fibras, assim como a métodos de produção de plantas modificadas que possuem conteúdo alterado de óleos, proteínas e/ou fibras partindo de tais plantas.

ANTECEDENTES

A capacidade de manipular a composição de sementes de plantas de

cultivo, particularmente o conteúdo e a composição de óleo e de proteína das sementes, assim como a energia metabolizável disponível ("AME") na farinha de sementes no gado, possui aplicações importantes nas indústrias agrícolas, em relação tanto a óleos para alimentos processados quanto a 20 produtos alimentícios para animais. As sementes de plantas de cultivo agrí- colas contêm uma variedade de constituintes valiosos, incluindo óleo, proteí- na e amido. O processamento industrial pode separar ptécnica ou todos es- tes constituintes para venda individual em aplicações específicas. Por exem- plo, quase 60% da plantação de soja nos Estados Unidos da América são 25 triturados pela indústria de processamento da soja. O processamento da soja produz óleo purificado, que é vendido com alto valor, enquanto que o restante da farinha das sementes é vendido para a alimentação de gado (U.S. Soybean Board, 2001 Soy Stats). A semente de canola também é tritu- rada para produzir óleo e o coproduto farinha de canola (Canola Council of 30 Canada). A farinha de canola contém uma alta porcentagem de proteína e um bom equilíbrio de aminoácidos, mas devido ao fato de que possui um alto teor de fibras e fitato. não é facilmente diqerida pelo gado (Slominski. B.A. e outros, 1999 Proceedings of the 10th International Rapeseed Con- gress, Canberra, Austrália) e possui um valor inferior ao da farinha de soja.

Mais de 55% do milho produzido nos EUA são utilizados como produto alimentício para animais (lowa Corn Growers Association). O valor do milho está diretamente relacionado com sua capacidade de ser digerido pelo gado. Assim, é desejável maximizar tanto o conteúdo de óleo das se- mentes quanto a AME da farinha. Para as sementes oleosas processadas tais como soja e canola, o aumento do conteúdo absoluto de óleo da semen- te aumentará o valor de tais grãos, enquanto que o aumento da AME da fa- rinha aumentará seu valor. Para o milho processado, um aumento ou um decréscimo no conteúdo de óleo pode ser desejado, dependendo de como os outros constituintes principais serão utilizados. A diminuição de óleo pode aumentar a qualidade do amido isolado através da redução de sabores inde- sejados associados com a oxidação do óleo. Alternativamente, quando o amido é utilizado para a produção de etanol, quando o sabor não é importan- te, o aumento do conteúdo de óleo pode aumentar o valor geral.

Em muitos grãos para alimentação, tais como milho e trigo, é desejável aumentar o conteúdo de óleo das sementes, porque o óleo possui maior conteúdo de energia que os outros constituintes da semente tal como 20 o carboidrato. O processamento de sementes oleosas, como a maior ptécni- ca dos negócios de processamento de grãos, é um negócio de capital inten- sivo; assim pequenas alterações -na distribuição dos produtos dos compo- nentes de menor valor para o componente de óleo de alto valor podem ter impactos econômicos substanciais para os processadores de grãos. Em adi- 25 ção, o aumento da AME da farinha através do ajuste do conteúdo e da com- posição de proteínas e de fibras das sementes, sem diminuir o conteúdo de óleo das sementes, pode aumentar o valor do produto alimentício para ani- mais.

A manipulação biotecnológica de óleos tem mostrado fornecer altera- ção na composição e aumento do rendimento dos óleos. As alterações na composição incluem óleo de soja e de milho com alto conteúdo de ácido o- léico (Patentes U.S. N— 6.229.033 e 6.248.939) e sementes contendo Iaura- to (Patente U.S. N- 5.639.790), entre outros. O trabalho na alteração da composição se concentrou predominantemente em sementes oleosas pro- cessadas, mas pode ser facilmente estendido a plantas de cultivo sem ser semente oleosa, incluindo milho. Embora haja interesse considerável no 5 aumento do conteúdo de óleo, a única biotecnologia praticada atualmente nesta área é a tecnologia High-Oil Corn (HOC) (Dupont, Patente U.S. N2 5.704.160). HOC emprega polinizadores de alto conteúdo de óleo desenvol- vidos atravé do cruzamento por seleção clássico com fêmeas híbridas de elite (estéreis em relação ao sexo masculino) em um sistema de produção 10 referido como TopCross. O sistema TopCross High Oil aumenta o conteúdo de óleo no grão colhido no milho de aproximadamente 3,5% até aproxima- damente 7%, aumentando o conteúdo de energia do grão.

Embora este tenha sido produtivo, o sistema de produção HOC possui limitações inerentes. Em primeiro lugar, o sistema deve ter uma baixa 15 porcentagem de polinizadores responsáveis por um conjunto inteiro de se- mentes do campo contém riscos inerentes, particularmente em anos de se- ca. Em segundo lugar, o conteúdo de óleo nos campos de HOC atuais não foi capaz de atingir um conteúdo de óleo de semente acima de 9%. Final- mente, o milho com alto conteúdo de óleo não é primariamente uma altera- 20 ção bioquímica, mas ao invés disso um mutante anatômico (tamanho de embrião maior) que possui o resultado indireto de aumentar o conteúdo de óleo. Por estas razões, uma estratégia de alto conteúdo de óleo alternativa, particularmente uma que deriva de um produto bioquímico alterado, seria especialmente valiosa.

A manipulação da composição das sementes identificou vários

componentes que aumentam a qualidade nutritiva, a digestibilidade e a AME na farinha de semente. O aumento do conteúdo de Iisina na canola e na soja (Falco e outros, 1995 Bio/Technology 13:577-582) aumenta a disponibilidade deste aminoácido essencial e diminui a necessidade de suplementos nutri- 30 cionais. Foi mostrado que variedades de soja com maior proteína na semen- te contêm consideravelmente mais energia metabolizável que as variedades convencionais (Edwards e outros, 1999, Poultrv Sei. 79:525-527). Foi mos- trado que a diminuição do conteúdo de fitato da semente de milho aumenta a disponibilidade biológica de aminoácidos nos produtos alimentícios para animais (Douglas e outros, 2000, Poultry Sei. 79:1586-1591) e a diminuição do conteúdo de oligossacarídeos na farinha de soja aumenta a energia me- 5 tabolizável na farinha (Parsons e outros, 2000, Poultry Sei. 79:1127-1131).

A soja e a canola são as plantas de cultivo alvos mais óbvias para os mercados de óleo processado e de farinha de semente uma vez que ambas as plantas de cultivo são trituradas para óleo e a farinha remanescen- te é vendida para a alimentação de animais. Um grande grupo de trabalho 10 comercial (por exemplo, Patente U.S. N- 5.952.544; Pedido de Patente PCT Ns W09411516) demonstra que Arabidopsis é um modelo excelente para o metabolismo de óleo nestas plantas de cultivo. Verificações bioquímicas da composição do óleo das sementes identificaram genes de Arabidopsis para muitas enzimas biossintéticas críticas e levaram à identificação de ortólogos 15 de genes importantes para a agronomia. Por exemplo, verificações utilizando populações mutagenizadas quimicamente identificaram mutantes lipídicos cujas sementes exibem composição alterada de ácidos graxos (Lemieux e outros, 1990, Theor. Appl Genet. 80: 234-240; James e Dooner, 1990, The- or. AppL Genet. 80: 241-245). Verificações de mutagênese por T-DNA 20 (Feldmann e outros, 1989, Science 243: 1351-1354) que detectaram compo- sição alterada de ácidos graxos identificaram os genes da ômega 3 dessatu- rase (FAD3) e da delta-12 dessaturase (FAD2) (Patente U.S. N- 5952544; Yadav e outros, 1993, Plant Physiol. 103: 467-476; Okuley e outros, 1994, Plant Cell 6(1): 147-158). Uma verificação que se concentrou no conteúdo de 25 óleo ao invés de na qualidade do óleo, analisou mutantes induzidos quimi- camente em relação a sementes enrugadas ou à densidade alterada de se- mentes, cujo conteúdo alterado de óleo da semente foi inferido (Focks e Benning, 1998, Plant Physiol. 118:91-101).

Uma outra verificação, planejada para identificar enzimas envol- vidas na produção de ácidos graxos de cadeia muito longa, identificou uma mutação no gene que codifica uma diacilglicerol aciltransferase (DGAT) co- mo sendo responsável oelo acúmulo reduzido de triacil qlicerol nas semen- tes (Katavic V e outros, 1995, Plant Physiol. 108(1):399-409). Foi também mostrado que a superexpressão específica à semente do cDNA de DGAT estava associada com o maior conteúdo de óleo na semente (Jako e outros, 2001, Plant Physiol. 126(2):861-74). Arabidopsis é também um modelo para 5 o entendimento do acúmulo dos componentes da semente que afetam a qualidade da farinha. Por exemplo, Arabidopsis contém as proteínas de ar- mazenamento de semente albumina e globulina encontradas em muitas plantas dicotiledôneas incluindo canola e soja (Shewry 1995, Plant Cell 7:945-956). As vias bioquímicas para a síntese de componentes de fibra, tais 10 como celulose e lignina, são conservadas dentro das plantas vasculares e mutantes de Arabidopsis que afetam estes componentes foram isolados (re- visado em Chapei e Carpita 1998, Current Opinion in Plant Biology 1:179- 185).

A marcação por ativação em plantas refere-se a um método de produção de mutações aleatórias através da inserção de um constructo de ácido nucleico heterólogo que compreende seqüências reguladoras (por e- xemplo, um intensificador) no genoma de uma planta. As seqüências regula- doras podem atuar para aumentar a transcrição de um ou mais genes vege- tais nativos; consequentemente, a marcação por ativação é um método pro- dutivo para a produção de mutantes de ganho de função, geralmente domi- nantes (ver, por exemplo, Hayashi e outros, 1992, Science 258: 1350-1353; Weigel D e outros, 2000, Plant Physiology, 122:1003-1013). O constructo inserido fornece uma marcação molecular para a identificação rápida da planta nativa cuja expressão errada causa o fenótipo mutante. A marcação por ativação também pode causar fenótipos de perda de função. A inserção pode resultar na interrupção de um gene vegetal nativo, em cujo caso o fe- nótipo é geralmente recessivo.

A marcação por ativação foi utilizada em várias espécies, inclu- indo tabaco e Arabidopsis, para a identificação de muitos tipos diferentes de fenótipos mutantes e os genes associados com estes fenótipos (Wilson e outros, 1996, Plant Cell 8: 659-671; Schaffer e outros, 1998, Cell 93: 1219- 1229; Fridborg e outros, 1999. Plant Cell 11: 1019-1032; Kardailsky e outros. f

1999, Science 286: 1962-1965; e Christensen S e outros, 1998, 9th Internati-

i

ona! Conference on Arabidopsis Research, Univ. of Wisconsin-Madison, 24- 28 de junho, Resumo 165).

SUMÁRIO

São fornecidas aqui plantas modificadas que possuem um fenó-

tipo alterado. As plantas modificadas com um fenótipo alterado podem incluir um fenótipo de quantidade maior de óleo e/ou de melhor qualidade de fari- nha. O fenótipo alterado em uma planta modificada pode também incluir con- teúdo de óleos, proteínas e/ou fibras alterado em qualquer ptécnica da plan- 10 ta modificada, por exemplo, nas sementes. Em algumas modalidades de uma planta modificada, o fenótipo alterado é um aumento no conteúdo de óleo da semente (um fenótipo de alto conteúdo de óleo). Em outras modali- dades, o fenótipo alterado pode ser um aumento no conteúdo de proteínas na semente e/ou um decréscimo no conteúdo de fibras da semente. É tam- 15 bém fornecida uma farinha de semente derivada das sementes de plantas modificadas, em que as sementes possuem conteúdo alterado de proteínas e/ou conteúdo alterado de fibras. É também fornecido um óleo derivado das sementes de plantas modificadas, em que as sementes possuem conteúdo de óleo alterado. Qualquer uma destas alterações pode levar a um aumento 20 na AME da semente ou da farinha da semente das plantas modificadas, em relação às plantas de controle ou do tipo selvagem. É também fornecida aqui uma farinha, um produto alimentício ou um alimento produzido partindo de qualquer ptécnica da planta modificada com um fenótipo alterado.

Em certas modalidades, as plantas modificadas descrito incluem 25 plantas transgênicas que possuem um vetor de transformação que compre- ende uma seqüência de nucleotídeos de HIO (ou pseudônimo do gene HIO) que codifica ou é complementar a uma seqüência que codifica um polipeptí- deo "HIO". Em modalidades particulares, a expressão de um polipeptídeo de HIO em uma planta transgênica causa um conteúdo alterado de óleo, um 30 conteúdo alterado de proteínas e/ou um conteúdo alterado de fibras na plan- ta transgênica. Em modalidades preferidas, a planta transgênica é selecio- nada do grupo que consiste em plantas das espécies de Brassica, incluindo canola e semente de colza, soja, milho, girassol, algodão, cacau, açafroa, dendezeiro, coqueiro, linho, mamona, amendoim, trigo, aveia e arroz. É tam- bém fornecido um método de produção de óleo ou de farinha de semente, que compreende o cultivo da planta transgênica e a recuperação do óleo 5 e/ou da farinha da semente da dita planta. A descrição fornece ainda produto alimentício, farinha, grão ou semente que compreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de HIO. A descrição fornece a- inda produto alimentício, farinha, grão ou semente que compreende o poli- peptídeo de HIO ou um ortólogo ou um parálogo do mesmo.

Os exemplos da planta transgênica descrita são produzidos a-

través de um método que compreende a introdução nas células progenitoras da planta de um vetor de transformação de planta que compreende uma se- qüência de nucleotídeos de HIO que codifica, ou é complementar a uma se- qüência que codifica, um polipeptídeo de HIO e o crescimento das células 15 progenitoras transformadas para produzir uma planta transgênica, em que a seqüência de poiinucleotídeo de HIO é expressa, causando um fenótipo alte- rado na planta transgênica. Em alguns exemplos não-limitantes específicos, o método produz plantas transgênicas em que a expressão do polipeptídeo de HIO causa um fenótipo de alto conteúdo (maior) de óleos, de alto conteú- 20 do (maior) de proteínas e/ou de baixo conteúdo (menor) de fibras na planta transgênica, em relação às plantas não transgênicas ou do tipo selvagem de controle.

São descritos aqui métodos adicionais de produção de uma planta que possui um fenótipo alterado, em que é identificado que uma plan- 25 ta possui uma mutação ou um alelo em sua seqüência de ácido nucleico de HIO que resulta em um fenótipo alterado, comparada a plantas que não pos- suem a mutação ou o alelo. A planta mutada pode ser gerada utilizando um ou mais agentes mutagênicos, por exemplo, um agente mutagênico químico, radiação ou Iuz ultravioleta. Em algumas modalidades do método, a planta é 30 cruzada para gerar progênie que herda o alelo e expressa o fenótipo altera- do. Em modalidades particulares do método, o método emprega a metodo- logia de aene/QTL candidato ou a metodologia de TILLING. I

É também fornecida aqui uma céiula vegetal modificada que possui um fenótipo alterado. Em algumas modalidades, a célula vegetal mo- dificada inclui um vetor de transformação que compreende uma seqüência de nucleotídeos de HIO que codifica ou é complementar a uma seqüência 5 que codifica um polipeptídeo de HIO. Em modalidades preferidas, a célula vegetal transgênica é selecionada do grupo que consiste em plantas das espécies de Brassica, incluindo canola e semente de colza, soja, milho, gi- rassol, algodão, cacau, açafroa, dendezeiro, coqueiro, linho, mamona, a- mendoim, trigo, aveia e arroz. Em outras modalidades, a célula vegetal é 10 uma semente, um pólen, um propágulo ou uma célula embrionária. A descri- ção fornece ainda células vegetais provenientes de uma planta que é a pro- gênie direta ou a progênie indireta de uma planta crescida partindo das ditas células progenitoras.

DESCRIÇÃO DETALHADA Termos

A menos que seja indicado de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui possuem o mesmo significado que teri- am para um versado na técnica da presente descrição. Os profissionais se direcionam particularmente a Sambrook e outros (Molecular Cloning: A La- 20 boratory Manual (Segunda Edição), Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 1989) e Ausubel FM e outros (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova York, N.Y., 1993) para definições e termos da téc- nica. Deve ser entendido que esta descrição não está limitada à metodologi- a, aos protocolos e aos reagentes particulares descritos, uma vez que estes 25 podem variar.

Como utilizado aqui, o termo "fenótipo alterado" refere-se a plan- tas ou a qualquer ptécnica de uma planta (por exemplo, sementes ou farinha produzida partindo de sementes), com um conteúdo de óleos, proteínas e/ou fibras alterado (fenótipo). Como fornecido aqui, conteúdo de óleos, de prote- 30 ínas (por exemplo, proteína que pode ser digerida) e/ou de fibras alterado inclui um nível maior ou menor de conteúdo de óleos, de proteínas (por e- xemplo, proteína que pode ser digerida) e/ou de fibras nas plantas, nas se- mentes ou na farinha de sementes. Qualquer combinação destas alterações pode levar a um fenótipo alterado. Por exemplo, em um exemplo não- Iimitante específico, um fenótipo alterado pode se referir ao conteúdo maior de óleos e menor de fibras. Em um outro exemplo não-limitante específico, 5 um fenótipo alterado pode se referir ao conteúdo inalterado de proteínas e menor de fibras. Em um outro exemplo não-limitante específico, um fenótipo alterado pode se referir ao conteúdo maior de óleos e de proteínas e menor de fibras. Ainda em outros exemplos não-limitantes, um fenótipo alterado pode se referir ao conteúdo maior de óleos e de proteínas e inalterado de 10 fibras; ao conteúdo inalterado de óleos, maior de proteínas e menor de fi- bras; ou ao conteúdo maior de óleos, maior de proteínas e menor de fibras. É também fornecido que qualquer combinação destas alterações pode levar a um aumento na AME (energia metabolizável disponível) da semente ou farinha gerada partindo da semente. Um fenótipo alterado também inclui um 15 fenótipo de maior qualidade de semente (ISQ) ou um fenótipo de maior qua- lidade de farinha da semente.

Como utilizado aqui, o termo "energia metabolizável disponível" (AME) refere-se à quantidade de energia no produto alimentício que é capaz de ser extraída através da digestão em um animal e está correlacionada com 20 a quantidade de proteínas que podem ser digeridas e de óleo na farinha pa- ra animais. A AME é determinada através da estimativa da quantidade de energia no produto alimentício antes da alimentação e da medida da quanti- dade de energia nos excrementos do animal após o consumo do produto alimentício. Em um exemplo não-limitante específico, uma planta modificada 25 com um aumento na AME inclui plantas modificadas com conteúdo alterado de óleo da semente, de proteínas que podem ser digeridas, de proteína total e/ou de fibras, resultando em um aumento no valor do produto alimentício para animais derivado da semente.

Como utilizado aqui, o termo "conteúdo" refere-se ao tipo e à quantidade relativa de, por exemplo, de um componente da semente ou de farinha da semente. ι

Como utilizado aqui, o termo "óleo da semente" refere-se à

i

quantidade total de óleo dentro da semente.

Como utilizado aqui, o termo "fibra da semente" refere-se aos componentes que não podem ser digeridos da semente da planta incluindo componentes celulares tais como celulose, hemicelulose, pectina, Iignina e compostos fenólicos.

Como utilizado aqui, o termo "farinha" refere-se aos componen- tes da semente remanescentes após a extração de óleo da semente. Os exemplos de componentes de farinha incluem proteína e fibra.

Como utilizado aqui, o termo "proteína total da semente" refere-

se à quantidade total de proteína dentro da semente.

Como utilizado aqui, o termo "proteína que pode ser digerida da semente" refere-se à proteína da semente que é capaz de ser digerida por enzimas no trato digestivo de um animal. É um subconjunto do conteúdo de proteína total.

Como utilizado aqui, o termo "vetor" refere-se a um constructo de ácido nucleico planejado para a transferência entre células hospedeiras diferentes. Um "vetor de expressão" refere-se a um vetor que possui a capa- cidade de incorporar e expressar fragmentos de DNA heterólogos em uma 20 célula estranha. Muitos vetores de expressão procarióticos e eucarióticos estão disponíveis comercialmente. A seleção de vetores de expressão apro- priados está dentro do conhecimento dos versados na técnica.

Um constructo ou uma seqüência de ácido nucleico "heteróloga" possui uma ptécnica da seqüência que não é nativa à célula vegetal em que 25 é expressa. Heteróloga, em relação a uma seqüência de controle refere-se a uma seqüência de controle (isto é, promotor ou intensificador) que não fun- ciona na natureza para regular o mesmo gene cuja expressão é, no momen- to, de regulação. Geralmente, seqüências de ácidos nucleicos heterólogas não são endógenas à célula ou à ptécnica do genoma em que estão presen- 30 tes e foram adicionadas na célula por infecção, transfecção, microinjeção, eletroporação ou similar. Um constructo de ácido nucleico "heteróloga" pode conter uma combinação de seqüência de controle/seqüência codificadora de DNA que é a mesma que ou diferente de, uma combinação de seqüência de controle/seqüência codificadora de DNA encontrada na planta nativa. Os exemplos não-limitantes específicos de uma seqüência de ácido nucleico heteróloga incluem uma seqüência de ácido nucleico de HIO ou um frag- 5 mento, um derivado (variação) ou um ortólogo ou um parálogo da mesma.

Como utilizado aqui, o termo "gene" significa o segmento de DNA en- volvido na produção de uma cadeia de polipeptídeo, que pode ou não incluir regiões que precedem e que sucedem a região codificadora, por exemplo, seqüências não traduzidas a 5’ (5’ UTR) ou "líderes" e seqüências 3’ UTR ou 10 "trailers", assim como seqüências que se estendem (íntrons) entre segmen- tos codificadores individuais (éxons) e seqüências reguladoras não transcri- tas.

O termo "homólogo" refere-se a qualquer gene que está relacio- nado a um gene de referência por herança de uma seqüência de DNA an- cestral comum. O termo "ortólogo" refere-se a homólogos em espécies dife- rentes que evoluíram partindo de um gene ancestral comum através da es- peciação. Tipicamente, os ortólogos mantêm a mesma ou uma função simi- lar apesar das diferenças em sua estrutura primária (mutações). O termo "parálogo" refere-se a homólogos na mesma espécie que evoluíram através da duplicação genética de um gene ancestral comum. Em muitos casos, os parálogos exibem funções relacionadas (mas nem sempre idênticas). Como utilizado aqui, o termo homólogo abrange tanto ortólogos quanto parálogos. Até a extensão que uma espécie particular desenvolveu vários genes rela- cionados partindo de uma seqüência de DNA ancestral compartilhada com uma outra espécie, o termo ortólogo pode abranger o termo parálogo.

Como utilizado aqui, "recombinante" inclui referência a uma célu- la ou um vetor, que foi modificado através da introdução de uma seqüência de ácido nucleico heteróloga ou que a célula é derivada de uma célula modi- ficada dessa maneira. Assim, por exemplo, as células recombinantes ex- 30 pressam genes que não são encontrados na forma idêntica dentro da forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que são de outra maneira expressos de forma anormal, subexpressos ou não expressos t

de forma alguma como um resultado da intervenção humana deliberada.

í

Como utilizado aqui, o termo "expressão gênica" refere-se ao processo através do qual um polipeptídeo é produzido com base na seqüên- cia de ácido nucleico de um gene. O processo inclui tanto transcrição quanto 5 tradução; consequentemente, "expressão" pode se referir a uma seqüência de polinucleotídeos ou de polipeptídeos ou ambas. Algumas vezes, a ex- pressão de uma seqüência de polinucleotídeos não levará à tradução de proteínas. "Superexpressão" refere-se à maior expressão de uma seqüência de polinucleotídeos e/ou de polipeptídeos em relação a sua expressão em 10 uma planta do tipo selvagem (ou outra de referência [por exemplo, não transgênica]) e pode se referir a uma seqüência que ocorre naturalmente ou que não ocorre naturalmente. "Expressão ectópica" refere-se à expressão em um momento, local e/ou maior nível que não ocorre naturalmente na planta não modificada ou do tipo selvagem. "Subexpressão" refere-se à me- 15 nor expressão de uma seqüência de polinucleotídeos e/ou de polipeptídeos, geralmente de um gene endógeno, em relação a sua expressão em uma planta do tipo selvagem. Os termos "expressão errada" e "expressão altera- da" abrangem superexpressão, subexpressão e expressão ectópica.

O termo "introduzida" no contexto de inserir uma seqüência de 20 ácido nucleico em uma célula, inclui "transfecção", "transformação" e "trans- dução" e inclui referência à incorporação de uma seqüência de ácido nuclei- co em uma célula eucariótica ou procariótica em que a seqüência de ácido nucleico pode ser incorporada no genoma da célula (por exemplo, DNA cro- mossômico, plasmideal, de plastídeo ou mitocondrial), convertida em um 25 replicon autônomo ou expressa de forma transitória (por exemplo, mRNA transfectado).

Como utilizado aqui, uma "célula vegetal" refere-se a qualquer célula derivada de uma planta, incluindo células de tecido não diferenciado (por exemplo, calo), assim como de sementes, pólen, propágulos e embriões 30 de plantas.

Como utilizado aqui, os termos "nativa" e "do tipo selvagem" re- lativos a uma certa característica ou fenótipo da planta referem-se à forma em que tal característica ou fenótipo é encontrado na mesma variedade de planta na natureza. Em uma modalidade, uma planta do tipo selvagem ou nativa é também uma planta de controle. Em uma outra modalidade, uma planta do tipo selvagem ou nativa é uma planta não transgênica ou não mu- 5 tada. Ainda em uma outra modalidade, uma planta do tipo selvagem ou nati- va é uma planta não modificada.

Como utilizado aqui, o termo "modificada" em relação a uma planta, refere-se a uma planta com um fenótipo alterado (por exemplo, uma planta gerada através de métodos de engenharia genética, de mutagênese 10 ou de cruzamento). Uma planta engenheirada geneticamente também pode ser uma planta transgênica. Em modalidades particulares, as plantas modifi- cadas geradas através de métodos de cruzamento são primeiramente muta- genizadas utilizando qualquer um de uma variedade de agentes mutagêni- cos, tal como um agente mutagênico químico, radiação ou Iuz ultravioleta. 15 As plantas modificadas podem ter qualquer combinação de um conteúdo alterado de óleos, um conteúdo alterado de proteínas e/ou um conteúdo alte- rado de fibras em qualquer ptécnica da planta transgênica, por exemplo, nas sementes, em relação a uma planta não modificada similar.

Como utilizado aqui, o termo "alterada" refere-se a uma modifi- cação (um aumento ou um decréscimo) de uma característica ou de um fe- nótipo da planta (por exemplo, conteúdo de óleos, conteúdo de proteínas e/ou conteúdo de fibras) em uma planta modificada, em relação uma planta não modificada similar. Em um exemplo não-limitante específico, uma planta modificada com uma característica alterada inclui uma planta com um maior conteúdo de óleos, maior conteúdo de proteínas e/ou menor conteúdo de fibras em relação a uma planta não modificada similar. Em um outro exem- plo não-limitante específico, uma planta modificada com uma característica alterada inclui conteúdo de óleos inalterado, maior conteúdo de proteínas e/ou menor conteúdo de fibras em relação a uma planta não modificada si- milar. Ainda em um outro exemplo não-limitante específico, uma planta mo- dificada com uma característica alterada inclui um maior conteúdo de óleos, um maior conteúdo de proteínas e/ou um conteúdo inalterado de fibras em I

relação a uma planta não modificada similar.

Um "fenótipo interessante (característica)" com referência a uma planta modificada refere-se a um fenótipo que pode ser observado ou medi- do demonstrado por uma T1 e/ou uma planta de geração subsequente, que não é exibido pela planta não modificada correspondente (isto é, uma planta similar genotipicamente que foi crescida ou analisada sob condições simila- res). Um fenótipo interessante pode representar uma melhoria na planta (por exemplo, maior conteúdo de óleos, maior conteúdo de proteínas e/ou menor conteúdo de fibras nas sementes da planta) ou pode fornecer um meio para produzir melhorias em outras plantas. Uma "melhoria" é uma característica que pode aumentar a utilidade de uma espécie ou variedade de planta atra- vés do fornecimento à planta de um fenótipo ou uma qualidade exclusiva e/ou nova. Tais plantas modificadas podem ter um fenótipo melhorado, tal como um fenótipo de óleo, proteína e/ou fibra alterado. A farinha gerada par- tindo de sementes de uma planta modificada com um fenótipo melhorado pode ter melhor (maior) qualidade de farinha. Em um exemplo não-limitante específico de farinha com um fenótipo de melhor (maior) qualidade, a farinha é gerada partindo de uma semente de uma planta modificada, em que a se- mente possui maior conteúdo de proteínas e/ou menor conteúdo de fibras, em relação a uma planta não modificada similar.

A expressão "fenótipo de conteúdo alterado de óleos" refere-se a um fenótipo que pode ser medido de uma planta modificada, em que a planta exibe um aumento ou um decréscimo estatisticamente significativo no conteúdo total de óleos (isto é, a porcentagem de massa da semente que é 25 óleo), quando comparada à planta similar, mas não modificada (por exem- plo, uma não transgênica ou uma não mutada). Um fenótipo de alto conteú- do de óleos refere-se a um aumento no conteúdo total de óleos. Um aumen- to no conteúdo-de óleos inclui, em várias modalidades, um aumento de a- proximadamente 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 30 7,5%, 10% ou mais no conteúdo de óleos. Similarmente, um decréscimo no conteúdo de óleos inclui um decréscimo de aproximadamente 1,0%, 1,5%, 2.0%. 2.5%. 3.0%, 3.5%, 4,0%. 4,5%, 5,0%. 7,5%, 10% ou mais no conteúdo de óleos, em várias modalidades.

A expressão "fenótipo de conteúdo alterado de proteínas" refere- se ao fenótipo que pode ser medido de uma planta modificada, em que a planta exibe um aumento ou um decréscimo estatisticamente significativo no 5 conteúdo total de proteínas (isto é, a porcentagem de massa da semente que é proteína), quando comparada à planta similar, mas não modificada (por exemplo, não transgênica ou não mutada). Um fenótipo de alto conteú- do de proteínas refere-se a um aumento no conteúdo total de proteínas. Um aumento no conteúdo de proteínas inclui, em várias modalidades, um au- 10 mento de aproximadamente 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 7,5%, 10% ou mais no conteúdo total de proteínas. Similarmen- te, um aumento no conteúdo de proteínas que podem ser digeridas inclui, em várias modalidades, um aumento de aproximadamente 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 7,5%, 10% ou mais no conteúdo 15 de proteínas que podem ser digeridas. Um decréscimo no conteúdo de pro- teínas inclui um decréscimo de aproximadamente 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 7,5%, 10% ou mais no conteúdo total de pro- teínas, em várias modalidades. Similarmente, um decréscimo no conteúdo de proteínas que podem ser digeridas inclui, em várias modalidades, um de- 20 créscimo de aproximadamente 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 7,5%, 10% ou mais no conteúdo de proteínas que podem ser digeridas. A expressão "fenótipo de conteúdo alterado de fibras" refere-se ao fenótipo que pode ser medido de uma planta modificada, em que a planta exibe um aumento ou um decréscimo estatisticamente significativo no con- 25 teúdo total de fibras (isto é, a porcentagem de massa da semente que é fi- bra), quando comparada à planta similar, mas não modificada (por exemplo, não transgênica ou não mutada). Um fenótipo de baixo conteúdo de fibras refere-se à diminuição no conteúdo total de fibras. Um aumento no conteúdo de fibras inclui um aumento de aproximadamente 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 30 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 7,5%, 10% ou mais no conteúdo de fibras. Similarmente, um decréscimo no conteúdo de fibras inclui um decréscimo de aproximadamente 1.0%. 1,5%, 2.0%, 2.5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%. 4,5%, 5.0%. I

7,5%, 10% ou mais no conteúdo de fibras.

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Como utilizado aqui, uma seqüência de polinucleotídeos ou um gene "mutante" ou "mutado" difere da seqüência de polinucleotídeos ou do gene do tipo selvagem correspondente em termos de seqüência ou de ex- 5 pressão, em que a diferença contribui para um fenótipo ou uma característi- ca alterada da planta. Em relação a uma planta ou uma linhagem de planta, o termo "mutante" ou "mutada" refere-se a uma planta ou uma linhagem de planta que possui um fenótipo ou uma característica alterada da planta, em que o fenótipo ou a característica alterada está associada com a expressão 10 alterada de uma seqüência de polinucleotídeos ou um gene do tipo selva- gem. A seqüência de polinucleotídeos ou o gene mutado pode ser gerado através de métodos de engenharia genética (tal como marcação por ativa- ção ou transformação), através da utilização de um ou mais agentes muta- gênicos (por exemplo, agentes mutagênicos químicos, radiação ou Iuz ultra- 15 violeta) ou através da utilização de métodos para alterar uma seqüência de DNA (por exemplo, PCR propensa a erros, cruzamento molecular com em- baralhamento de DNA, mutagênese direcionada ao sítio ou introdução do gene em um organismo que induz mutagênese tal E. coli ou cepas de leve- duras que são deficientes em relação à atividade de reparo do DNA).

20 Como utilizado aqui, o termo "T1" refere-se à geração de plantas

V.'

partindo da semente de plantas TO. A geração T1 é o primeiro conjunto de plantas modificadas que pode ser selecionado através da aplicação de um agente de seleção, por exemplo, um antibiótico ou um herbicida, para o qual a planta modificada contém o gene de resistência correspondente. O termo 25 "T2" refere-se à geração de plantas através de autofertilização das flores de plantas T1, previamente selecionadas como sendo modificadas. As plantas T3 são geradas partindo de plantas T2 etc. Como utilizado aqui, a "progênie direta" de uma certa planta deriva da semente (ou, algumas vezes, outro tecido) de tal planta e está na geração imediatamente subsequente; por e- 30 xemplo, para uma certa linhagem, uma planta T2 é a progênie direta de uma planta T1. A "progênie indireta" de uma certa planta deriva da semente (ou outro tecido) da progênie direta de tal planta ou da semente (ou outro tecido) de gerações subsequentes em tal linhagem; por exemplo, uma planta T3 é a progênie indireta de uma planta T1.

Como utilizado aqui, o termo "ptécnica da planta" inclui qualquer órgão ou tecido da planta, incluindo, sem limitação, sementes, embriões, 5 regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen e microporos. As células vegetais podem ser obtidas par- tindo de qualquer órgão ou tecido da planta e culturas preparadas partindo do mesmo. É fornecida aqui uma célula vegetal modificada que possui um fenótipo alterado. Em modalidades particulares, a célula vegetal modificada 10 é uma célula vegetal transgênica. A célula vegetal transgênica inclui um ve- tor de transformação que compreende uma seqüência de nucleotídeos de HIO que codifica ou é complementar a uma seqüência que codifica um poli- peptídeo de HIO. Em modalidades preferidas, a célula vegetal transgênica é selecionada do grupo que consiste em plantas das espécies de Brassica, 15 incluindo canola e semente de colza, soja, milho, girassol, algodão, cacau, açafroa, dendezeiro, coqueiro, linho, mamona, amendoim, trigo, aveia e ar- roz. Em outras modalidades, a célula vegetal é uma semente, um pólen, um propágulo ou uma célula embrionária. A descrição fornece ainda células ve- getais de uma planta que é a progênie direta ou a progênie indireta de uma 20 planta crescida partindo das ditas células progenitoras. A classe de plantas que pode ser utilizada nos métodos da presente invenção é geralmente tão ampla quanto a classe de plantas superiores sensíveis às técnicas de trans- formação, incluindo tanto plantas monocotiledôneas quanto dicotiledôneas.

Como utilizado aqui, "planta transgênica" inclui uma planta que 25 compreende dentro de seu genoma um polinucleotídeo heterólogo. O poli- nucleotídeo heterólogo pode estar integrado de forma estável no genoma ou pode ser extracromossômico. Preferencialmente, o polinucleotídeo da pre- sente invenção está integrado de forma estável no genoma de forma que o polinucleotídeo é passado a diante para gerações sucessivas. Uma célula, 30 um tecido, um órgão vegetal ou uma planta na qual os polinucleotídeos hete- rólogos foram introduzidos é considerada "transformada", "transfectada" ou "transgênica". As progênies diretas e indiretas de plantas ou células vegetais transformadas que também contêm o polinucleotídeo heterólogo também são consideradas transgênicas.

São descritas aqui plantas modificadas que possuem um fenóti- po alterado. As plantas modificadas com um fenótipo alterado podem incluir uma quantidade melhorada (maior) de óleos e/ou uma qualidade melhor (maior) de farinha, quando comparadas à planta similar, mas não modificada (por exemplo, não transgênica ou não mutada). As plantas modificadas com um fenótipo alterado podem incluir conteúdo alterado de óleos, proteínas e/ou fibras em qualquer ptécnica da planta modificada, por exemplo, nas sementes, quando comparadas à planta similar, mas não modificada (por exemplo, não transgênica ou não mutada). Em algumas modalidades de uma planta modificada, por exemplo, em plantas com um fenótipo de conte- údo melhorado ou maior de óleos, o fenótipo alterado inclui um aumento no conteúdo de óleos da semente (um fenótipo de alto conteúdo de óleos) da planta, quando comparado ao da planta similar, mas não modificada (não

transgênica ou não mutada). Um aumento no conteúdo de óleos inclui, em

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várias modalidades, um aumento de aproximadamente 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 7,5%, 10% ou mais no conteúdo de óleos. O fenótipo alterado pode ser um aumento em um ou mais ácidos gra- xos, tal como ácido oléico, com um decréscimo concomitante em outros áci- dos graxos tais como os ácidos linoléicos ou linolínicos. Uma alteração no - conteúdo de ácidos graxos inclui um aumento de aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais em um ácido graxo específico. Em outras modalidades de uma planta modificada, por exemplo, em plantas com um fenótipo de qualidade melhorada ou maior de farinha, o fenótipo alterado pode ser um aumento no conteúdo de proteí- nas na semente e/ou um decréscimo no conteúdo de fibras da semente. Um aumento no conteúdo de proteínas inclui um aumento de aproximadamente 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 7,5%, 10% ou mais no conteúdo de proteínas, por exemplo, no conteúdo total de proteínas ou no conteúdo de proteínas que podem ser digeridas. Esta alteração no conteúdo de proteínas da semente oode ser o resultado de quantidades alteradas de proteínas de armazenamento da semente tais como albuminas, globulinas prolaminas e glutelinas. Um decréscimo no conteúdo de fibras inclui um de- créscimo de aproximadamente 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 7,5%, 10% ou mais no conteúdo de fibras. Esta alteração no 5 conteúdo de fibras pode ser o resultado de quantidades alteradas de com- ponentes fibrosos tais como celulose, hemicelulose, Iignina e pectinas.

É também fornecida farinha de semente derivada das sementes de plantas modificadas, em que as sementes possuem conteúdo alterado (por exemplo, maior) de proteínas (por exemplo, que pode ser digerida) e/ou conteúdo alterado (por exemplo, menor) de fibras. É adicionalmente forneci- do óleo derivado das sementes de plantas modificadas, em que as sementes possuem conteúdo alterado de óleos. Qualquer uma destas alterações pode levar a um aumento na AME da semente ou da farinha da semente de plan- tas modificadas, em relação a plantas de controle, não transgênicas ou do tipo selvagem. Um aumento na AME inclui um aumento de aproximadamen- te 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 7,5%, 10% ou mais na AME na semente ou na farinha da semente, em várias modalidades. É também fornecida aqui farinha, produto alimentício ou alimento produzido partindo de qualquer ptécnica da planta modificada com um fenótipo altera- do.

Em certas modalidades, as plantas transgênicas descritas com- preendem um vetor de transformação que compreende uma seqüência de nucleotídeos de HIO que codifica ou é complementar a uma seqüência que codifica um polipeptídeo de "HIO". Em modalidades particulares, a expres- 25 são de um polipeptídeo de HIO em uma planta transgênica causa um conte- údo alterado de óleos, um conteúdo alterado de proteínas e/ou um conteúdo alterado de fibras na planta transgênica. Em modalidades preferidas, a plan- ta transgênica é selecionada do grupo que consiste em plantas das espécies de Brassica, incluindo canola e semente de colza, soja, milho, girassol, algo- 30 dão, cacau, açafroa, dendezeiro, coqueiro, linho, mamona, amendoim, trigo, aveia e arroz. É também fornecido um método de produção de óleo ou fari- nha da semente, que compreende o cultivo da planta transgênica e a recu- i

peração do óleo e/ou da farinha da semente da dita planta. A descrição for- nece ainda produto alimentício, farinha, grão ou semente que compreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de HIO. A descrição fornece ainda produto alimentício, farinha, grão ou semente que 5 compreende o polipeptídeo de HIO ou um ortólogo ou um parálogo do mes- mo.

Vários métodos para a introdução de uma seqüência de polinu- cleotídeos desejada que codifica a proteína desejada nas células vegetais estão disponíveis e são conhecidos pelos versados na técnica e incluem, 10 mas não estão limitados a: (1) métodos físicos tais como microinjeção, ele- troporação e fornecimento mediado por microprojéteis (biolística ou tecnolo- gia de pistola gênica); (2) métodos de fornecimento mediado por vírus; e (3) métodos de transformação mediada por Agrobacterium.

Os métodos mais comumente utilizados para a transformação de 15 células vegetais são o processo de transferência de DNA mediada por Agro- bacterium e o processo de biolística ou mediado por bombardeio de micro- projéteis (isto é, a pistola gênica). Tipicamente, a transformação nuclear é desejada, mas quando é desejável transformar especificamente plastídeos, tais como cloroplastos ou amiloplastos, os plastídeos vegetais podem ser 20 transformados utilizando um fornecimento mediado por microprojéteis do polinucleotídeo desejado.

A transformação mediada por Agrobacterium é conseguida atra- vés do uso de uma bactéria do solo engenheirada geneticamente que per- tence ao gênero Agrobaeterium. Um número de cepas do tipo selvagem e 25 desarmadas de Agrobaeterium tumefaeiens e Agrobaeterium rhizogenes por- tando os plasmídeos Ti ou Ri pode ser utilizado para a transferência de ge- nes para as plantas. A transferência de genes é feita através da transferên- cia de um DNA específico conhecido como "T-DNA" que pode ser engenhei- rado geneticamente para carregar qualquer pedaço desejado de DNA para 30 dentro de muitas espécies de plantas.

A transformação genética de plantas mediada por Agrobaeterium envolve várias etapas. A primeira etapa, na qual o Agrobaeterium virulento e as células vegetais são primeiramente colocados em contato um com o ou- tro, é geralmente chamada de "inoculação". Após a inoculação, é permitido que o Agrobacterium e as células/tecidos vegetais sejam cultivados juntos durante um período de várias horas até vários dias ou mais sob condições 5 adequadas para crescimento e para transferência do T-DNA. Esta etapa é denominada de "cocultura". Após a cocultura e o fornecimento do T-DNA, as células vegetais são tratadas com agentes bactericidas ou bacteriostáticos para matar ou limitar o crescimento do Agrobacterium remanescente em contato com o explante e/ou no recipiente contendo o explante. Se isto for 10 realizado na ausência de quaisquer agentes seletivos para promover o cres- cimento preferencial de células vegetais transgênicas versus não transgêni- cas, então esta é tipicamente referida como a etapa de "retardo". Se for rea- lizada na presença de pressão seletiva favorecendo as células vegetais transgênicas, então é referida como uma etapa de "seleção". Quando um 15 "retardo" é utilizado, este é tipicamente seguido por uma ou mais etapas de "seleção".

Em relação ao bombardeio de microprojéteis (Patente U.S. N- 5.550.318; Patente U.S. N5 5.538.880. Patente U.S. N2 5.610.042; e Publi- cação PCT WO 95/06128; das quais cada uma é especificamente incorpora- 20 da aqui como referência em sua totalidade), as partículas são revestidas com ácidos nucleicos e fornecidas para dentro das células através de uma força de propulsão. Os exemplos de partículas incluem as compreendidas de tungstênio, platina e preferencialmente, ouro.

Uma modalidade ilustrativa de um método para o fornecimento 25 de DNA para dentro das células vegetais através da aceleração é o Biolistics Particle Delivery System (BioRad, Hercules, CA), que pode ser utilizado para empurrar partículas revestidas com DNA ou células através de uma tela, tal como uma tela de aço inoxidável ou uma tela Nytex, sobre uma superfície de filtro coberta com células de plantas monocotiledôneas cultivadas em sus- 30 pensão.

As técnicas de bombardeio de microprojéteis podem ser ampla- mente aplicadas e podem ser utilizadas para transformar virtualmente qual- »

quer espécie de planta. Os exemplos de espécies que foram transformadas

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através do bombardeio de microprojéteis incluem espécies de monocotiledô- neas tais como milho (Publicação PCT N-WO 95/06128), cevada, trigo (Pa- tente U.S. N- 5.563.055, incorporada aqui como referência em sua totalida- 5 de), arroz, aveia, centeio, cana de açúcar e sorgo, assim como um número de dicotiledôneas incluindo tabaco, soja (Patente U.S. N2 5.322.783, incorpo- rada aqui como referência em sua totalidade), girassol, amendoim, algodão, tomate e verduras em geral (Patente U.S. N2 5.563.055, incorporada aqui como referência em sua totalidade).

10 Para selecionar ou classificar as células vegetais independente-

mente da metodologia de transformação, o DNA introduzido na célula con- tém um gene que funciona em um tecido vegetal que pode ser regenerado para produzir um composto que confere ao tecido vegetal resistência a um composto que seria de outra maneira tóxico. Os genes de interesse para uso 15 como um marcador que pode ser selecionado, verificado ou classificado in- cluiriam, mas não estão limitados a GUS, proteína fluorescente verde (GFP), Iuciferase (LUX), genes de tolerância a antibióticos ou herbicidas. Os exem- plos de genes de resistência a antibióticos incluem penicilinas, canamicina, neomicina, G418, bleomicina, metotrexato (e trimetoprim), cloranfenicol e 20 tetraciclina. As moléculas de polinucleotídeos que codificam as proteínas

X.'

envolvidas na tolerância a herbicidas são conhecidas na técnica e incluem, mas não estão limitadas a uma molécula de polinucleotídeo que codifica a 5- enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSPS) descrita na Patente U.S. N2 5.627.061, na Patente U.S. Ns 5.633.435 e na Patente U.S. N2 6.040.497 e 25 aroA descrita na Patente U.S. N2 5.094.945 para tolerância ao glifosato; uma molécula de polinucleotídeo que codifica bromoxinil nitrilase (Bxn) descrita na Patente U.S. Ns 4.810.648 para tolerância ao Bromoxinil; uma molécula de polinucleotídeo que codifica fitoeno dessaturase (crtl) descrita em Misawa e outros, (Plant J. 4:833-840, 1993) e Misawa e outros, (Plant J. 6:481-489, 30 1994) para tolerância ao norflurazon; uma molécula de polinucleotídeo que codifica aceto-hidroxiácido sintase (AHAS, também conhecida como ALS) descrita em Sathasiivan e outros (Nucl. Acids Res. 18:2188-2193, 1990) pa- ra tolerância a herbicidas de sulfoniluréia; e o gene bar descrito em DeBIock e outros, (EMBO J. 6:2513-2519, 1987) para tolerância ao glufosinato e ao bialaphos.

A regeneração, o desenvolvimento e o cultivo de plantas partin- do de vários explantes transformados são bem documentados na técnica. Este processo de regeneração e crescimento inclui tipicamente as etapas de seleção de células transformadas e de cultivo de tais células individualizadas através dos estágios usuais de desenvolvimento embrionário até o estágio de planta jovem enraizada. Os embriões e as sementes transgênicos são similarmente regenerados. Os brotos enraizados transgênicos resultantes são depois disso plantados em um meio de cultivo de planta apropriado tal como solo. As células que sobrevivem à exposição ao agente seletivo ou as células que tiveram classificação positiva em um ensaio de verificação, po- dem ser cultivadas em meio que sustenta a regeneração de plantas. As plantas jovens em desenvolvimento são transferidas para o solo menos a mistura de crescimento de planta e estabilizadas, antes da transferência pa- ra uma estufa ou câmara de crescimento para maturação.

A presente invenção pode ser utilizada com qualquer célula ou tecido que pode ser transformado. Como utilizado aqui, o que pode ser 20 transformado é entendido como uma célula ou um tecido capaz de se pro- pagar adicionalmente para dar origem a uma planta. Os versados na técnica reconhecem que pode ser transformado um número de células ou tecidos vegetais em que após a inserção do DNA exógeno e de condições de cultura apropriadas as células ou os tecidos vegetais podem ser formar em uma 25 planta diferenciada. O tecido adequado para estas finalidades podem incluir, mas não estão limitados a embriões imaturos, tecido escutelar, culturas de células em suspensão, inflorescência imatura, meristema de broto, explantes nodais, tecido de calo, tecido de hipocotilédone, cotilédones, raízes e folhas.

Qualquer meio de cultura de planta adequado pode ser utilizado. Os exemplos de meios adequados incluiriam, mas não estão limitados a meios à base de MS (Murashige e Skoog, Physiol. Plant, 15:473-497, 1962) ou a meios à base de N6 (Chu e outros. Scientia Sinica 18:659. 1975) su- I

plementados com reguladores de crescimento vegetal adicionais incluindo, mas não limitados a auxinas, citocininas, ABA e giberelinas. Os versados na técnica estão familiarizados com a variedade de meios de cultura de tecidos, que quando suplementados apropriadamente, sustentam o crescimento e o

5 desenvolvimento do tecido vegetal e são adequados para a transformação e para a regeneração de plantas. Estes meios de cultura de tecidos podem ser obtidos na forma de uma preparação comercial ou preparados e modificados pelo usuário. Os versados na técnica estão a par dos meios e dos suplemen- tos de meios tais como nutrientes e reguladores do crescimento para uso na 10 transformação e na regeneração e outras condições de cultura tais como intensidade da Iuz durante a incubação, pH e temperaturas de incubação que podem ser otimizadas para a variedade particular de interesse.

Um versado comum na técnica considerará que, após um casse- te de expressão ser incorporado de forma estável em plantas transgênicas e 15 confirmado como sendo operacional, este pode ser introduzido em outras plantas através de cruzamento sexual. Qualquer uma de um número de téc- nicas de cruzamento padronizadas pode ser utilizada, dependendo da espé- cie que será cruzada.

Identificação de Plantas com um Fenótipo Alterado

Uma verificação de marcação por ativação com Arabidopsis

(ACTTAG) foi utilizada para identificar a associação entre 1) linhagens de plantas ACTTAG com um conteúdo alterado de óleos, proteínas e/ou fibras (ver as colunas 4, 5 e 6 respectivamente, da Tabela 1, a seguir) e 2) as se- qüências de ácidos nucleicos identificadas na coluna 3 das Tabelas 2 e 3, 25 em que cada seqüência de ácido nucleico é fornecida com um pseudônimo de gene ou uma denominação de HIO (HIO#; ver a coluna 1 nas Tabelas 1, 2 e 3). A denominação de HIO é arbitrária e não refere-se necessariamente a uma planta que possui um fenótipo de alto conteúdo de óleos (HIO).

Sucintamente e como descrito adicionalmente nos Exemplos, um grande número de plantas de Arabidopsis foi mutado com o vetor pS- KI015, que compreende um T-DNA do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumi- faciens. um elemento intensificador viral e um gene marcador que pode ser selecionado (Weigel e outros, 2000, Plant Physiology, 122:1003-1013). Quando o T-DNA se insere no genoma das plantas transformadas, o ele- mento intensificador pode causar a regulação para mais dos genes na vizi- nhança, geralmente dentro de aproximadamente nove kilobases (kb) dos intensificadores. As plantas T1 foram expostas ao agente seletivo com a fi- nalidade de recuperar especificamente as plantas transformadas que ex- pressavam o marcador que pode ser selecionado e, portanto, carregavam as inserções do T-DNA. Foi permitido que as plantas T1 crescessem até a ma- turidade, se autofertilizassem e produzissem semente. A semente T2 foi co- Ihida, rotulada e armazenada. Para a amplificação dos estoques de semen- tes, aproximadamente dezoito T2 foram plantadas no solo e, após a germi- nação, expostas ao agente seletivo para recuperar as plantas T2 transfor- madas. A semente T3 destas plantas foi colhida e agrupada. O conteúdo de óleos, proteínas e fibras da semente foi estimado utilizando Near Infrared Spectroscopy (NIR) como descrito nos Exemplos.

A associação de uma seqüência de ácido nucleico de HIO com um fenótipo alterado foi descoberta através da análise da seqüência de DNA genômico flanqueando a inserção do T-DNA na linhagem ACTTAG identifi- cada na coluna 3 da Tabela 1. Uma linhagem ACTTAG é uma família de 20 plantas derivada de uma única planta que foi transformada com um elemen- to de T-DNA contendo quatro cópias em tandem dos intensificadores do 35S do CaMV. Consequentemente, as seqüências de ácidos nucleicos e/ou de polipeptídeos de HIO descritas podem ser empregadas no desenvolvimento de plantas transgênicas que possuem um fenótipo alterado, por exemplo, 25 alto conteúdo de óleos. As seqüências de ácidos nucleicos de HIO podem ser utilizadas na produção de plantas transgênicas, tais como plantas de cultivo de sementes oleosas, que fornecem maior rendimento de óleo partin- . do do processamento das sementes oleosas e resultam em um aumento na quantidade de óleo recuperado das sementes da planta transgênica. As se- 30 quências de ácidos nucleicos de HIO também podem ser utilizadas na pro- dução de plantas transgênicas, tais como plantas de cultivo de grãos para produto alimentício, que fornecem um fenótipo alterado resultando em maior energia para a alimentação de animais, por exemplo, sementes ou farinha da semente com um conteúdo alterado de proteínas e/ou de fibras, resultan- do em um aumento na AME. As seqüências de ácidos nucleicos de HIO po- dem ser adicionalmente utilizadas para aumentar o conteúdo de óleos de 5 plantas de cultivo oleosas especiais, com a finalidade de aumentar o rendi- mento e/ou a recuperação de ácidos graxos não usuais desejados. Os e- xemplos não-limitantes específicos de ácidos graxos não usuais são ácido ricinoléico, ácido vernólico e os ácidos graxos poliinsaturados de cadeia mui- to longa ácido docosahexaenóico (DHA) e ácido eicosapentaenóico (EPA). 10 As plantas transgênicas que foram modificadas geneticamente para expres- sarem polipeptídeos de HIO podem ser utilizadas na produção de sementes, em que as plantas transgênicas são crescidas e o óleo e a farinha da se- mente são obtidos de ptécnicas da planta (por exemplo, semente) utilizando métodos padronizados.

Ácidos Nucleicos e Polipeptídeos de HIO

A denominação de HIO para cada uma das seqüências de áci- dos nucleicos de HIO descobertas na verificação com a marcação por ativa- ção descrita aqui está listada na coluna 1 das Tabelas 1-3, a seguir. Os poli- peptídeos de HIO descritos estão listados na coluna 4 das Tabelas 2 e 3, a 20 seguir. A denominação de HIO é arbitrária e não refere-se necessariamente a uma planta que possui um fenótipo de alto conteúdo de óleos (HIO). Como utilizado aqui, o pseudônimo de gene ou a denominação de HIO refere-se a qualquer seqüência de polipeptídeo (ou à seqüência de ácido nucleico que codifica a mesma) que quando expressa em uma planta causa um fenótipo 25 alterado em qualquer ptécnica da planta, por exemplo, nas sementes. Em uma modalidade, um polipeptídeo de HIO refere-se a uma proteína HIO de comprimento completo ou a um fragmento, um derivado (variação) ou um ortólogo ou um parálogo da mesma que é "funcionalmente ativo", de forma que o fragmento, o derivado ou o ortólogo ou o parálogo da proteína exibe 30 uma-ou mais ou as atividades funcionais associadas com um ou mais dos polipeptídeos de HIO de comprimento completo descritos, por exemplo, as seauências de aminoácidos fornecidas na entrada do GenBank referida na coluna 4 das Tabelas 2 e 3 que correspondem às seqüências de aminoáci- dos apresentadas como a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 ou um ortólogo ou um parálogo da mesma. Em uma modalidade preferida, um poli- 5 peptídeo de HIO funcionalmente ativo causa um fenótipo alterado em uma planta transgênica. Em uma outra modalidade, um polipeptídeo de HIO fun- cionalmente ativo causa um fenótipo de conteúdo alterado de óleos, proteí- nas e/ou fibras (por exemplo, um fenótipo de conteúdo alterado da farinha da semente) quando expresso de forma errada em uma planta. Em outras mo- 10 dalidades preferidas, a expressão errada do polipeptídeo de HIO causa um fenótipo de alto conteúdo de óleos (tal como, mais óleo), de alto conteúdo de proteínas (tal como, maior conteúdo de proteína total ou de proteínas que podem ser digeridas) e/ou de baixo conteúdo de fibras (tal como, menos fi- bra) em uma planta. Ainda em outras modalidades preferidas, a expressão 15 errada do polipeptídeo de HIO causa fenótipo inalterado de óleos, de alto conteúdo de proteínas (tal como, maior conteúdo de proteína total ou de pro- teínas que podem ser digeridas) e/ou de baixo conteúdo de fibras (tal como, menos fibra) em uma planta. Em uma outra modalidade, a expressão errada do polipeptídeo de HIO causa uma maior AME da farinha. Ainda em uma 20 outra modalidade, um polipeptídeo de HIO funcionalmente ativo pode recu- perar a atividade defeituosa do polipeptídeo de HIO endógeno (incluindo de- ficiente) quando expresso em uma planta ou em células vegetais; o polipep- tídeo de recuperação pode ser proveniente da mesma ou de uma espécie diferente da espécie com a atividade defeituosa do polipeptídeo. A descrição 25 fornece ainda produto alimentício, farinha, grão, alimento ou semente que compreende o polipeptídeo de HIO ou um fragmento, um derivado (variação) ou um ortólogo ou um parálogo do mesmo.

Em uma outra modalidade, um fragmento funcionalmente ativo de um polipeptídeo de HIO de comprimento completo (por exemplo, um fragmento funcionalmente ativo de um polipeptídeo nativo que possui a se- qüência de aminoácidos apresentada como a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6. SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10. SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID I 28

NO: 14 ou um ortólogo ou um parálogo que ocorre naturalmente da mesma) mantém uma ou mais das propriedades biológicas associadas com o poli- peptídeo de HIO de comprimento completo, tal como atividade de sinaliza- ção, atividade de ligação, atividade catalítica ou atividade de localização ce- 5 Iular ou extracelular. Um fragmento de HIO preferencialmente compreende um domínio de HIO, tal como um domínio C- ou N-terminal ou catalítico, en- tre outros e compreende preferencialmente pelo menos 10, preferencialmen- te pelo menos 20, mais preferencialmente pelo menos 25 e mais preferenci- almente pelo menos 50 aminoácidos contíguos de uma proteína HIO. Os 10 domínios funcionais dos genes HIO estão listados na coluna 6 da Tabela 2 e podem ser identificados utilizando o programa PFAM (Bateman A e outros, 1999, Nucleic Acids Res. 27:260-262) ou o programa INTERPRO (Mulder e outros, 2003, Nucleie Aeids Res. 31, 315-318). As variações funcionalmente ativas de polipeptídeos de HIO de comprimento completo ou fragmentos dos 15 mesmos, incluem polipeptídeos com inserções, deleções ou substituições de aminoácidos que mantêm uma ou mais das propriedades biológicas associ- adas com o polipeptídeo de HIO de comprimento completo. Em alguns ca- sos, são geradas variações que alteram o processamento pós-tradução de um polipeptídeo de HIO. Por exemplo, as variações podem ter característi- 20 cas alteradas de transporte de proteínas ou de localização de proteínas ou meia-vida alterada de proteínas, comparadas com o polipeptídeo nativo.

- Como utilizado aqui, o termo "ácido nucleico de HIO" refere-se a qualquer polinucleotídeo que quando expresso em uma planta causa um fenótipo alterado em qualquer ptécnica da planta, por exemplo, nas semen- 25 tes. Em uma modalidade, um polinucleotídeo de HIO abrange ácidos nuclei- cos com a seqüência fornecida na ou complementar à entrada do GenBank referida na coluna 3 das Tabelas 2 e 3, que correspondem às seqüências de ácidos nucleicos apresentadas como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 13, 30 assim como fragmentos, derivados ou ortólogos ou parálogos funcionalmen- te ativos das mesmas. Um ácido nucleico de HIO desta descrição pode ser DNA, derivado de DNA genômico ou cDNA ou RNA. Em uma modalidade, um ácido nucleico de HIO funcionalmente ativo codifica ou é complementar a um ácido nucleico que codifica um poli- peptídeo de HIO funcionalmente ativo. Um ácido nucleico de HIO funcional- mente ativo também inclui DNA genômico que serve como um molde para 5 um produto da transcrição primária de RNA (isto é, um precursor de mRNA) que requer processamento, tal como "splicing", antes de codificar o polipep- tídeo de HIO funcionalmente ativo. Um ácido nucleico de HIO pode incluir outras seqüências não codificadoras, que podem ou não ser transcritas; tais seqüências incluem 5’ e 3’ UTRs1 sinais de poliadenilação e seqüências re- 10 guladoras que controlam a expressão gênica, entre outros, que são conheci- dos na técnica. Alguns polipeptídeos requerem eventos de processamento, tais como clivagem proteolítica, modificação covalente etc., com a finalidade de se tornarem completamente ativos. Consequentemente, os ácidos nuclei- cos funcionalmente ativos podem codificar o polipeptídeo de HIO maduro ou 15 pré-processado ou uma forma intermediária. Um polinucleotídeo de HIO também pode incluir seqüências codificadoras heterólogas, por exempio, seqüências que codificam um marcador incluído para facilitar a purificação do polipeptídeo fundido ou um marcador de transformação. Em uma outra modalidade, um ácido nucleico de HIO funcionalmente ativo é capaz de ser 20 utilizado na produção de fenótipos de HIO de perda de função, por exemplo, através da supressão antissenso, da cossupressão etc. A descrição fornece ainda produto alimentício, farinha, grão, alimento ou semente que compre- ende uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de HIO.

Em uma modalidade preferida, um ácido nucleico de HIO utiliza- 25 do nos métodos descritos compreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica ou é complementar a uma seqüência que codifica, um polipeptídeo de HIO que possui pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência em relação a uma seqüência de polipeptídeo de HIO descrita, por exemplo, a seqüência de aminoácidos 30 apresentada como a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14. I

Em uma outra modalidade, um polipeptídeo de HIO compreende

i

uma seqüência de polipeptídeo com pelo menos 50% ou 60% de identidade em relação a uma seqüência de polipeptídeo de HIO descrita (por exemplo, a seqüência de aminoácidos apresentada como a SEQ ID NO: 2, SEQ ID 5 NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14) e pode ter pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência em relação a uma seqüência de polipeptídeo de HIO descrita. Em uma modalidade adicional, um polipeptí- deo de HIO compreende 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 10 ou 99% de identidade de seqüência em relação a uma seqüência de polipep- tídeo de HiO descrita e pode incluir um domínio de proteína conservado do polipeptídeo de HIO (tal como o(s) domínio(s) listado(s) na coluna 6 da Ta- bela 2). Em uma outra modalidade, um polipeptídeo de HIO compreende uma seqüência de polipeptídeo com pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 15 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência em relação a um fragmento funcionalmente ativo do polipeptídeo referido na coiuna 4 da Tabela 2. Ainda em uma outra modalidade, um polipeptídeo de HIO compre- ende uma seqüência de polipeptídeo com pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade em relação à seqüência de po- 20 lipeptídeo da entrada do GenBank referida na coluna 4 da Tabela 2 ao longo

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de todo seu comprimento e compreende um(ou mais) domínio(s) de proteína conservado(s) listado(s) na coluna 6 da Tabela 2.

Em um outro aspecto, uma seqüência de polinucleotídeo de HIO é pelo menos 50% até 60% idêntica ao longo de seu comprimento inteiro a 25 uma seqüência de ácido nucleico de HIO descrita, tal como a seqüência de ácido nucleico apresentada como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 13 ou as seqüências de ácidos nucleicos que são complementares a tal seqüência de HIO e pode compreender pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 30 98% ou 99% de identidade de seqüência em relação à seqüência de HIO descrita ou a um fragmento funcionalmente ativo da mesma ou seqüências complementares. Em uma outra modalidade, um ácido nucleico de HIO des- crito compreende uma seqüência de ácido nucleico que é mostrada na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 13 ou seqüências de ácidos nucleicos que são complementares a tal seqüência de HIO e seqüências de ácidos nucleicos 5 que possuem homologia de seqüência substancial a tais seqüências de HIO. Como utilizado aqui, a expressão "homologia de seqüência substancial" refe- re-se às seqüências de ácidos nucleicos que possuem variações de seqüên- cia pequenas ou sem importância partindo de tais seqüências de HIO, isto é, as seqüências funcionam substancialmente da mesma maneira e codificam 10 um polipeptídeo de HIO.

Como utilizado aqui, "porcentagem (%) de identidade de se- qüência" em relação a uma seqüência de objetivo especificada ou a uma ptécnica especificada da mesma, é definida como a porcentagem de nucleo- tídeos ou de aminoácidos em uma seqüência identificada idêntica aos nu- 15 cleotídeos ou aos aminoácidos na seqüência de objetivo (ou na ptécnica es- pecificada da mesma), após o alinhamento das seqüências e da introdução de espaços, se necessário, para atingir uma porcentagem de identidade de seqüência máxima, que é gerada através do programa WU-BLAST-2.0a19 (Altschul e outros, J. Mol. Biol., 1990, 215:403-410) com parâmetros de bus- 20 ca ajustados nos valores predeterminados. Os parâmetros HSP S e HSP S2 são valores dinâmicos e são estabelecidos pelo próprio programa depen- dendo da composição da seqüência particular e da composição do banco de dados particular contra o qual a seqüência de interesse será pesquisada. Um "valor de identidade percentual (%)" é determinado pelo número de 25 combinações de nucleotídeos ou aminoácidos idênticos dividido pelo com- primento da seqüência para a qual a porcentagem de identidade está sendo relatada. A "porcentagem (%) de similaridade de seqüência de aminoácidos" é determinada realizando o mesmo cálculo que para a determinação da % de identidade de seqüência de aminoácidos, mas incluindo substituições 30 conservativas de aminoácidos em adição a aminoácidos idênticos no cálcu- lo. Uma substituição conservativa de aminoácido é uma em que um aminoá- cido é substituído por um outro aminoácido que possui propriedades simila- ί

res de forma que o dobramento ou a atividade da proteína não seja significa- tivamente afetada. Os aminoácidos aromáticos que podem ser substituídos por cada outro são fenilalanina, triptofano e tirosina; os aminoácidos hidrofó- bicos intercambiáveis são leucina, isoleucina, metionina e valina; os aminoá- 5 cidos polares intercambiáveis são glutamina e asparagina; e os aminoácidos básicos intercambiáveis são arginina, Iisina e histidina; os aminoácidos inter- cambiáveis são ácido aspártico e ácido glutâmico; e os aminoácidos peque- nos intercambiáveis são alanina, serina, treonina, cisteína e glicina.

Moléculas de ácidos nucleicos derivadas das moléculas de áci- dos nucleicos de objetivo incluem seqüências que se hibridizam seletiva- mente às seqüências de ácidos nucleicos de HIO descritas (pór exemplo, a seqüência de ácido nucleico apresentada como a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 13). A estringência da hibridização pode ser controlada pela temperatura, pela força iônica, pelo pH e pela presença de agentes desnatu- rantes tais como formamida durante a hibridização e a lavagem. As condi- ções utilizadas rotineiramente são bem conhecidas (ver, por exemplo, Cur- rent Protocol in Molecular Biology, Vol. 1, Cap. 2.10, John Wiley & Sons, Pu- blishers (1994); Sambrook e outros, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Segunda Edição), Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.).

Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico da descrição é capaz de se hibridizar com uma molécula de ácido nucleico que contém a seqüência de nucleotídeos descrita sob condições de hibridização estringentes que são: pré-hibridização de filtros contendo ácido nucleico du- 25 rante 8 horas até durante a noite a 65° C em uma solução que compreende 6X citrato de concentração simples (SSC) (1X SSC é 0,15 M de NaCI, 0,015 M de de citrato de Na; pH 7,0), 5X solução de Denhardt, 0,05% de pirofosfa- to de sódio e 100 pg/mL de DNA de esperma de arenque; hibridização du- rante 18-20 horas a 65° C em uma solução contendo 6X SSC, 1X solução de 30 Denhardt, 100 pg/mL de tRNA de levedura e 0,05% de pirofosfato de sódio; e lavagem of filtros a 65° C durante 1 h em uma solução contendo 0,1 X SSC e 0,1% de SDS (dodecil sulfato de sódio). Em outras modalidades, são utili- zadas condições de hibridização de estringência moderada que são: pré- tratamento dos filtros contendo ácido nucleico durante 6 h a 40° C em uma solução contendo 35% de formamida, 5X SSC1 50 mM de Tris-HCI (pH 7,5), 5 mM de EDTA, 0,1% de PVP, 0,1% de Ficoll, 1% de BSA e 500 pg/mL de 5 DNA de esperma de salmão desnaturado; hibridização durante 18-20 h a 40° C em uma solução contendo 35% de formamida, 5X SSC, 50 mM de Tris-HCI (pH 7,5), 5 mM de EDTA, 0,02% de PVP, 0,02% de Ficoll, 0,2% de BSA, 100 pg/mL de DNA de esperma de salmão e 10% (p/vol) de sulfato de dextran; seguida pela lavagem duas vezes durante 1 hora a 55° C em uma 10 solução contendo 2X SSC e 0,1% de SDS. Alternativamente, podem ser uti- lizadas condições de baixa estringência que compreendem: incubação du- rante 8 horas até durante a noite a 37° C em uma solução que compreende 20% de formamida, 5 x SSC, 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6), 5X solu- ção de Denhardt, 10% de sulfato de dextran e 20 pg/mL de DNA de esperma 15 de salmão cisalhado desnaturado; hibridização no mesmo tampão durante 18 até 20 horas; e lavagem dos filtros em 1 x SSC a aproximadamente 37° C durante 1 hora. . _

Como um resultado da degeneração do código genético, pode ser produzido um número de seqüências de polinucleotídeos que codificam 20 um polipeptídeo de HIO. Por exemplo, os códons podem ser selecionados para aumentar a taxa em que a expressão do polipeptídeo ocorre em uma espécie hospedeira particular, de acordo com o uso ótimo de códons deter- minado pelo organismo hospedeiro particular (ver, por exemplo, Nakamura e outros, 1999, Nucleic Acids Res. 27:292). Tais variações de seqüências po- 25 dem ser utilizadas nos métodos descritos aqui.

Os métodos descritos podem utilizar ortólogos (e/ou parálogos) de uma seqüência de ácido nucleico de HIO de Arabidopsis descrita. Os su- postos ortólogos (e/ou parálogos) representantes de cada um dos genes HIO de Arabidopsis descritos são identificados na coluna 5 da Tabela 3, a 30 seguir. Os métodos de identificação dos ortólogos em outras espécies de plantas são conhecidos na técnica. Em geral, os ortólogos em espécies dife- rentes mantêm a mesma funcão, devido à presença de um ou mais motivos !

de proteína e/ou estruturas 3-dimensionais. Na evolução, quando um evento

i

de duplicação gênica sucede a especiação, um único gene em uma espécie, tal como Arabidopsis, pode corresponder a vários genes (parálogos) em uma outra. Quando os dados das seqüências estão disponíveis para uma espécie 5 de planta particular, os ortólogos são geralmente identificados através da análise de homologia de seqüência, tal como a análise de BLAST, geralmen- te utilizando seqüências de isca de proteínas. As seqüências são designa- das como um ortólogo potencial se a melhor coincidência de seqüência par- tindo do resultado de BLAST para frente recuperar a seqüência de busca 10 original no BLAST inverso (Huynen MA e Bork P, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci., 95:5849-5856; Huynen MA e outros, 2000, Genome Research, 10:1204-1210).

Programas para alinhamento de várias seqüências, tal como CLUSTAL (Thompson JD e outros, 1994, Nucieic Acids Res. 22:4673-4680) podem ser utilizados para destacar regiões e/ou resíduos conservados de proteínas homólogas (ortólogas e/ou parálogas) e para gerar árvores filoge- néticas. Em uma árvore filogenética que representa várias seqüências ho- mólogas provenientes de espécies distintas (por exemplo, recuperadas atra- vés da análise de BLAST), as seqüências ortólogas de duas espécies ge- ralmente aparecem mais próximas na árvore em relação a todas as outras seqüências destas duas espécies. O "rosqueamento" estrutural ou outras análises de dobramento das proteínas (por exemplo, utilizando o software da ProCeryon, Biosciences, Salzburg, Áustria) podem também identificar ortó- logos potenciais. Os métodos de hibridização de ácidos nucleicos também podem ser utilizados para encontrar genes ortólogos e são preferidos quan- do os dados das seqüências não estão disponíveis. A PCR degenerada e a verificação de bibliotecas de cDNA ou de DNA genômico são métodos co- muns para encontrar seqüências gênicas relacionadas e são bem conheci- das na técnica (ver, por exemplo, Sambrook, 1989, Molecular Cloning: A La- boratory Manual (Segunda Edição), Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.; Dieffenbach e Dveksler, 1995, PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY). Por exemplo, os métodos para gerar uma biblioteca de cDNA partindo da espécie de planta de interesse e sub- metendo a biblioteca a sondas com sondas de genes parcialmente homólo- gos são descritos em Sambrook e outros. Uma ptécnica altamente conser- vada da seqüência codificadora de HIO de Arabidopsis pode ser utilizada 5 como uma sonda. Os ácidos nucleicos ortólogos de HIO podem se hibridizar ao ácido nucleico da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 13 sob condições de estringência alta, moderada ou baixa. Após a amplificação ou o isolamento de um segmento de um suposto ortólogo, tal segmento pode ser clonado e 10 sequenciado através de técnicas padronizadas e utilizado como uma sonda para isolar um clone completo de cDNA ou de DNA genômico.

Alternativamente, é possível iniciar um projeto de EST para ge- rar um banco de dados de informação de seqüência para a espécie de plan- ta de interesse. Em uma outra abordagem, os anticorpos que se ligam espe- cificamente a polipeptídeos de HIO conhecidos são utilizados para o isola- mento de ortólogos (e/ou parálogos) (ver, por exemplo, Harlow e Lane, 1988, 1999, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York). A análise de Western blot pode determinar se um ortólo- go de HIO (isto é, um ortólogo de proteína para um polipeptídeo de HIO des- crito) está presente em um extrato bruto de uma espécie de planta particular. Quando a reatividade é observada, a seqüência que codifica o ortólogo can- didato pode ser isolada através da verificação de bibliotecas de expressão que representam a espécie de planta particular. As bibliotecas de expressão podem ser construídas em uma variedade de vetores disponíveis comerci- almente, incluindo Iambda gt11, como descrito em Sambrook e outros, 1989. Uma vez que o(s) ortólogo(s) candidato(s) é(são) identificado(s) através de qualquer um destes meios, as seqüências ortólogas candidatas são utiliza- das como isca (a "busca") para o BLAST inverso contra seqüências de Ara- bidopsis ou de outras espécies em que as seqüências de ácidos nucleicos e/ou de polipeptídeos de HIO foram identificadas.

Os ácidos nucleicos e os polipeptídeos de HIO podem ser obti- dos através da utilização de qualquer método disponível. Por exemplo, as I

técnicas para o isolamento de seqüências de cDNA ou de DNA genômico de interesse através da verificação de bibliotecas de DNA ou através da utiliza- ção da reação em cadeia da polimerase (PCR)1 como descrito anteriormen- te, são bem conhecidas na técnica. Alternativamente, a seqüência de ácido 5 nucleico pode ser sintetizada. Qualquer método conhecido, tal como a muta- gênese direcionada ao sitio (Kunkel TA e outros, 1991, Methods EnzymoL 204:125-39), pode ser utilizado para introduzir alterações desejadas em um ácido nucleico clonado.

Em geral, os métodos descritos aqui envolvem a incorporação 10 da forma desejada do ácido nucleico de HIO em um vetor de expressão de planta para a transformação de células vegetais e o polipeptídeo de HIO é expresso na planta hospedeira. As plantas e as células vegetais transforma- das que expressam um polipeptídeo de HIO expressam um fenótipo alterado e, em um exemplo não-limitante específico, podem ter conteúdo alto (maior) 15 de óleos, alto (maior) de proteínas e/ou baixo (menor) de fibras.

Uma molécula de ácido nucleico de HIO "isoiada" é outra que na forma ou no ambiente em que é encontrada na natureza e é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está comumente associada na fonte natural do ácido nucleico de HIO. 20 Entretanto, uma molécula de ácido nucleico de HIO isolada inclui moléculas de ácidos nucleicos de HIO contidas nas células que expressam comumente o polipeptídeo de HIO quando, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está em uma localização cromossômica diferente daquela das células natu- rais.

Produção de Plantas Modificadas Geneticamente com um Fenótipo Al- terado

Os ácidos nucleicos e os polipeptídeos de HIO descritos podem ser utilizados na produção de plantas transgênicas que possuem um fenótipo modificado ou alterado, por exemplo, um fenótipo de conteúdo alterado de 30 óleos, proteínas e/ou fibras. Como utilizado aqui, um "conteúdo (fenótipo) alterado de óleos" pode se referir ao conteúdo alterado de óleos em qual- quer ptécnica da planta. Em uma modalidade preferida, a expressão alterada do gene HIO em uma planta é utilizada para gerar plantas com um conteúdo (fenótipo) alto de óleos. Como utilizado aqui, um "conteúdo (fenótipo) altera- do de proteínas totais" ou um "conteúdo (fenótipo) alterado de proteínas que podem ser digeridas" pode se referir ao conteúdo alterado de proteínas (to- 5 tais ou que podem ser digeridas) em qualquer ptécnica da planta. Em uma modalidade preferida, a expressão alterada do gene HIO em uma planta é utilizada para gerar plantas com um conteúdo (fenótipo) alto (ou maior) de proteínas totais ou que podem ser digeridas. Como utilizado aqui, um "con- teúdo (fenótipo) alterado de fibras" pode se referir ao conteúdo alterado de 10 fibras em qualquer ptécnica da planta. Em uma modalidade preferida, a ex- pressão alterada do gene HIO em uma planta é utilizada para gerar plantas com um conteúdo (fenótipo) baixo (ou menor) de fibras. O conteúdo alterado de óleos, proteínas e/ou fibras é frequentemente observado nas sementes. Os exemplos de uma planta transgênica incluem plantas que compreendem 15 um vetor de transformação de planta com uma seqüência de nucleotídeos que codifica ou é complementar a uma seqüência que codifica um polipeptí- deo de HIO que possui a seqüência de aminoácidos que é apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:

10, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 ou um ortólogo ou um parálogo da mesma.

As plantas transgênicas, tais como milho, soja e canola que con- têm as seqüências de ácidos nucleicos descritas, podem ser utilizadas na produção de óleo e farinha vegetal. O óleo vegetal é utilizado em uma varie- dade de produtos alimentícios, enquanto que a farinha da semente é utiliza- 25 da como um produto alimentício para animais. Após a colheita da semente das plantas transgênicas, a semente é limpa para remover os talos da planta e outro material e então fendidas em lascas em moinhos de rolo para que- brar as cascas. A semente triturada é aquecida a 75-100° C para desnaturar as enzimas hidrolíticas, Iisar as células não rompidas que contêm óleo e 30 permitir que as pequenas gotículas de óleo se unam. A maior ptécnica do óleo é então removida (e pode ser recuperada) através da pressão do mate- rial da semente em uma prensa de rosca. O restante do óleo é removido da I

torta da prensa através da extração com e solventes orgânicos, tal como hexano. O solvente é removido da farinha através do aquecimento da mes- ma a aproximadamente 100° C. Após a secagem, a farinha é então granula- da em uma forma consistente. A farinha, contendo a proteína, o carboidrato 5 que pode ser digerido e a fibra da semente, pode ser misturada com outros materiais antes de ser utilizada como um produto alimentício para animais.

Os métodos descritos aqui para a produção de plantas transgê- nicas podem ser geralmente aplicados a todas as plantas. Embora a marca- ção por ativação e a identificação gênica sejam realizadas em Arabidopsis, a 10 seqüência de ácido nucleico de HIO (ou um ortólogo, um parálogo, uma va- riação ou um fragmento da mesma) pode ser expressa em qualquer tipo de planta. Em uma modalidade preferida, as plantas que produzem óleo produ- zem e armazenam triacilglicerol em órgãos específicos, primariamente nas sementes. Tais espécies incluem soja (Glicine max), semente de colza e 15 canola (incluindo Brassica napus, B. campestris), girassol (Helianthus an- nus), algodão (Gossypium hirsutum), milho (Zea mays), cacau (Theobroma cacao), açafroa (Carthamus tinctorius), dendezeiro (Elaeis guineensis), co- queiro (Cocos nucifera), linho (Linum usitatissimum), mamona (Ricinus communis) e amendoim (,Arachis hypogaea), assim como trigo, arroz e avei- 20 a. As plantas que carregam frutos e verduras, as plantas que produzem grãos, as plantas que produzem nozes, as espécies de Brassica de ciclo rápido, alfalfa (Medicago sativa), tabaco (Nicotiana), turfa (família Poaceae), outras plantas de cultivo de forragem e espécies selvagens também podem ser uma fonte de ácidos graxos exclusivos. Em outras modalidades, qual- 25 quer planta que expressa a seqüência de ácido nucleico de HIO também pode expressar conteúdo maior de proteínas e/ou menor de fibras em uma ptécnica ou um órgão específico da planta, tal como nas sementes.

O versado na técnica reconhecerá que existe uma ampla varie- dade de técnicas de transformação na técnica e novas técnicas estão conti- nuamente se tornando disponíveis. Qualquer técnica que seja adequada pa- ra a planta hospedeira alvo pode ser empregada dentro do âmbito da pre- sente invenção. Por exemplo, os constructos podem ser introduzidas em uma variedade de formas incluindo, mas não limitadas a, na forma de um filamento de DNA, em um plasmídeo ou em um cromossomo artificial. A in- trodução dos constructos nas células vegetais alvos pode ser realizada atra- vés de uma variedade de técnicas, incluindo, mas não limitadas a transfor- 5 mação mediada por Agrobacterium, eletroporação, microinjeção, bombar- deio de microprojéteis, co-precipitação de DNA com fosfato de cálcio ou transformação mediada por Iipossomos de um ácido nucleico heterólogo. A transformação da planta é preferencialmente permanente, isto é, através da integração dos constructos de expressão introduzidas no genoma da planta 10 hospedeira, de forma que os constructos introduzidas são passadas para gerações de plantas sucessivas. Dependendo do uso pretendido, um cons- tructo de ácido nucleico heteróloga que compreende um polinucleotídeo de HIO pode codificar a proteína inteira ou uma ptécnica biologicamente ativa da mesma.

Em uma modalidade, sistemas de vetores binários baseados em

Ti podem ser utilizados para transferir polinucleotídeos. Vetores binários pa- dronizados de Agrobacterium são conhecidos pelos versados na técnica e muitos estão disponíveis comercialmente (por exemplo, pBI121 Clontech Laboratories, Palo Alto, CA). Um constructo ou um vetor pode incluir um 20 promotor de planta para expressar a molécula de ácido nucleico de escolha. Em uma modalidade preferida, o promotor é um promotor de planta.

O procedimento ótimo para a transformação de plantas com ve- tores de Agrobaeterium variará com o tipo de planta que será transformado. Os exemplos de métodos para a transformação mediada por Agrobaeterium 25 incluem a transformação de explantes de hipocotilédone, de extremidade do broto, de tecido do caule ou foliar, derivado de mudas e/ou plantas jovens esterilizadas. Tais plantas transformadas podem ser reproduzidas sexual- mente ou através da cultura de células ou de tecido. A transformação com Agrobaeterium foi descrita anteriormente para um grande número de tipos 30 diferentes de plantas e os métodos para tal transformação podem ser encon- trados na literatura científica. São de relevância particular os métodos para a transformação de plantas de cultivo importantes comercialmente, tais como f

plantas das espécies de Brassica, incluindo canola e semente de colza, (De

i

Block e outros, 1989, Plant Physiol., 91:694-701), milho (Ishida e outros, 1996 Nature Biotechnoi 14:745-750, Zhang e outros, 2002 Plante Cell Rep. 21:263-270), girassol (Everett e outros, 1987, Bio/Technology, 5:1201), soja (Christou e outros, 1989, Proc. NatL Acad. Sci USA, 86:7500-7504; Kline e outros, 1987, Nature, 327:70), trigo, arroz e aveia.

A expressão (incluindo a transcrição e a tradução) de uma se- qüência de ácido nucleico de HIO pode ser regulada em relação ao nível de expressão, ao(s) tipo(s) de tecido(s) onde a expressão ocorre e/ou ao está- gio do desenvolvimento da expressão. Está disponível um número de se- qüências reguladoras heterólogas (por exemplo, promotores e intensificado- res) para o controle da expressão de um ácido nucleico de HIO. Estas inclu- em promotores constitutivos, que podem ser induzidos e que podem ser re- gulados, assim como promotores e intensificadores que controlam a expres- são de uma maneira específica ao tecido ou ao tempo. Os exemplos de promotores constitutivos incluem o promotor E4 da framboesa (Patentes U.S. N— 5.783.393 e-5.783.394), o promotor da nopalina sintase (NOS) (E- bert e outros, Proc. NatL Acad. Sei. (U.S.A.) 84:5745-5749, 1987), o promo- tor da octopina sintase (OCS) (que é carregado nos plasmídeos indutores de tumor de Agrobacterium tumefaciens), os promotores de caulimovírus tais como o promotor 19S do vírus mosaico da couve flor (CaMV) (Lawton e ou-

- tros, Plant MoL BioL 9:315-324, 1987) e o promotor 35S do CaMV (Odell e outros, Nature 313:810-812, 1985 e Jones JD e outros, 1992, Transgenic Res., 1:285-297), o promotor 35S do vírus mosaico da escrofulária (Patente 25 U.S. Ns 5.378.619), o promotor que pode ser induzido pela Iuz da subunida- de pequena da ribulose-1,5-bis-fosfato carboxilase (ssRUBISCO), o promo- tor Adh (Walker e outros, Proc. NatL Acad. Sei. (U.S.A.) 84:6624-6628, 1987), o promotor da sacarose sintase (Yang e outros, Proc. NatL Acad. Sei. (U.S.A.) 87:4144-4148, 1990), o promotor do complexo do gene R (Chandler 30 e outros, The Plant Cell 7:1175-1183, 1989), o promotor do gene da proteína de ligação à clorofila a/b, o promotor do CsVMV (Verdaguer B e outros,

1998, Plant Mol Biol., 37:1055-1067) e o promotor da actina do melão (Pedi- do de Patente PCT publicado W00056863). Os exemplos de promotores específicos ao tecido incluem os promotores E4 e E8 do tomate (Patente U.S. Ns 5.859.330) e o promotor do gene 2AII do tomate (Van Haaren MJJ e outros, 1993, PIantMoIBio., 21:625-640).

5 Em uma modalidade preferida, a expressão da seqüência de

ácido nucleico de HIO está sob o controle de seqüências reguladoras dos genes cuja expressão está associada com o desenvolvimento inicial da se- mente e/ou do embrião. Na verdade, em uma modalidade preferida, o pro- motor utilizado é um promotor intensificado na semente. Os exemplos de tais 10 promotores incluem as regiões reguladoras a 5’ de genes tais como da napi- na (Kridl e outros, Seed Sei. Res. 1:209:219, 1991), da globulina (Belanger e Kriz, Genet., 129: 863-872, 1991, No. de Acesso de GenBank L22295), da gama zeína Z 27 (Lopes e outros, Mol Gen Genet., 247:603-613, 1995), do promotor da L3 oleosina (Patente U.S. N- 6,433,252), da faseolina (Bustos e 15 outros, Plant Cell, 1(9):839-853, 1989), da arcelina5 (Pedido de Patente U.S. N- 2003/0046727), de um promotor 7S da soja, de um promotor 7Sa (Pedido de Patente U.S. N2 2003/0093828), do promotor da 7Sa’ beta conglicinina da soja, de um promotor 7S a’ (Beachy e outros, EMBO J., 4:3047, 1985; Schu- Ier e outros, Nucleie Aeid Res., 10(24):8225-8244, 1982), inibidor da tripsina 20 da soja (Riggs e outros, Plant Cell 1(6):609-621, 1989), ACP (Baerson e ou- tros, Plant MoL Biol., 22(2):255-267, 1993), da estearoil-ACP dessaturase (Slocombe e outros, Plant Physiol. 104(4): 167-176, 1994), da subunidade a’ da β-conglicinina da soja (Chen e outros, Proc. NatL Acad. Sei. 83:8560- 8564, 1986), de USP de Vicia faba (P-Vf.Usp, SEQ ID NO: 1, 2 e 3 no (Pedi- 25 do de Patente U.S. N- 2003/229918) e do promotor da L3 oleosina de Zea mays (Hong e outros, Plant MoL Biol., 34(3):549-555, 1997). São também incluídas as zeínas, que são um grupo de proteínas de armazenamento en- contradas no endosperma do milho. Clones genômicos para os genes da zeína foram isolados (Pedersen e outros, Cell, 29:1015-1026, 1982; e Rus- 30 sell e outros, Transgenic Res. 6(2):157-168) e os promotores destes clones, incluindo 15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, 27 kD e os genes, podiam ser utiliza- dos. Outros promotores conhecidos como sendo funcionais, por exemplo, no milho incluem os promotores para os genes a seguir: waxy, Brittle, Shrunken 2, Enzimas de ramificação I e II, amido sintases, enzimas de desramificação, oleosinas, glutelinas e sacarose sintases. Os genes de verduras cujos pro- motores estão associados com o desenvolvimento inicial da semente e do 5 embrião incluem Iegumin de V. faba (Baumlein e outros, 1991, Mol. Gen. Genet. 225:121-8; Baumlein e outros, 1992, Plant J. 2:233-9), usp de V. faba (Fiedler e outros, 1993, Plant MoL BioL 22:669-79), convicilin da ervilha (Bown e outros, 1988, Biochem. J. 251:717-26), Iectin da ervilha (dePater e outros, 1993, Plant Cell 5:877-86), beta phaseolin de P. vulgaris (Bustos e 10 outros, 1991, EMBO J. 10:1469-79), DLEC2 e PHS de P. vulgaris [beta] (Bobb e outros, 1997, Nucleic Aeids Res. 25:641-7) e beta-Conglieinin da soja, proteína 7S de armazenamento (Chamberland e outros, 1992, Plant MoL BioL 19:937-49).

Os genes de cereais cujos promotores estão associados com o desenvolvimento inicial da semente e do embrião incluem glutelin do arroz ("GluA-3", Yoshihara e Takaiwa, 1996, Plant Cell Physiol. 37:107-11; "GIuB- 1", Takaiwa e outros, 1996, Plant Mol. Biol. 30:1207-21; Washida e outros,

1999, Plant Mol. Biol. 40:1-12; "Gt3", Leisy e outros, 1990, Plant Mol. Biol. 14:41-50), prolamin do arroz (Zhou & Fan, 1993, Transgenie Res. 2:141-6), prolamin do trigo (Hammond-Kosack e outros, 1993, EMBO J. 12:545-54), zein do milho (Z4, Matzke e outros, 1990, Plant Mol. Biol. 14:323-32) e B- hordeins da cevada (Entwistle e outros, 1991, Plant Mol. Biol. 17:1217-31).

Outros genes cujos promotores estão associados com o desen- volvimento inicial da semente e do embrião incluem GL07A do dendezeiro 25 (7S globulina, Morcillo e outros, 2001, Physiol. Plant 112:233-243), napin de Brassiea napus, proteína de armazenamento 2S e gene napA (Josefsson e outros, 1987, J. Biol. Chem. 262:12196-201; Stalberg e outros, 1993, Plant Mol. Biol. 1993 23:671-83; Ellerstrom e outros, 1996, Plant Mol. Biol. 32:1019-27), oleosin de Brassiea napus (Keddie e outros, 1994, Plant Mol. 30 Biol. 24:327-40), oleosin de Arabidopsis (Plant e outros, 1994, Plant Mol. Biol. 25:193-205), FAE1 de Arabidopsis (Rossak e outros, 2001, Plant Mol. Biol. 46:717-25), conA de Canavalia gladiata (Yamamoto e outros, 1995, Plant Mol. Biol. 27:729-41) e estrictosidina sintase de Catharanthus roseus (Str, Ouwerkerk e Memelink, 1999, Mol. Gen. Genet. 261:635-43). Em uma outra modalidade preferida, são utilizadas as seqüências reguladoras de ge- nes expressos durante a biossíntese de óleo (ver, por exemplo, a Patente 5 U.S. N- 5.952.544). Os promotores alternativos são de genes de proteínas de armazenamento de plantas (Bevan e outros, 1993, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sei. 342:209-15). Os promotores adicionais que podem ser utilizados são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N— 5.378.619; 5.391.725; 5.428.147; 5.447.858; 5.608.144; 5.608.144; 5.614.399; 10 5.633.441; 5.633.435; e 4.633.436.

Em uma outra modalidade, o gene HIO endógeno pode ser colo- cado sob o controle de um fator de transcrição transgênico ou utilizado para planejar sítios de ligação que modulam sua expressão. Uma tal classe de fatores de transcrição é constituída das proteínas de dedo de zinco Cys2- 15 His2 (ZFPs). As ZFPs são proteínas de ligação ao DNA comuns e podem ser planejadas para se ligarem especificamente a seqüências de DNA específi- cas (Beerli & Barbas, Nat Biotechnol., 2002, 20:135-141,; Gommans e ou- tros, J Mol Biol., 2005, 354:507-519). Os domínios de dedo de zinco indivi- duais são compostos de aproximadamente 30 aminoácidos, são estrutural- 20 mente conservados e podem interagir com 3-4 pb de DNA. Pode ser sinteti- zado um polipeptídeo que contém vários dedos de zinco planejados para se ligarem a uma seqüência de DNA específica no promotor de um gene HIO. Os princípios para o planejamento dos domínios de dedo de zinco para a interação com seqüências de DNA específicas foram descritos em Segal e 25 outros, (Segai e outros, Proc Natl Acad Sci U S A., 1999, 96:2758-2763), Dreier e outros (Dreier e outros, J Mol Biol., 2000, 303:489-502) e Beerli e Barbas (Beerli & Barbas, Nat Biotechnol., 2002, 20:135-141). Estes domínios de ligação ao DNA podem ser fundidos a domínios efetores para formar uma ZFP sintética que pode regular a transcrição de genes aos quais se liga. Os 30 domínios efetores que podem ativar a transcrição incluem, mas não estão limitados á ptécnica ácida da proteína VP16 do vírus herpes simplex (Sa- dowski e outros. Nature., 1988, 335:563-564) e da VP64 (Beerli e outros, I

Proc Natl Acad Sci U S A., 1998, 95:14628-14633) e o domínio ρ65 do fator de transcrição do NF-κΒ (Bae e outros, Nat Biotechnol., 2003, 21:275-280, Liu e outros, J Biol Chem., 2001, 276:11323-11334). Os domínios efetores que podem reprimir a transcrição incluem, mas não estão limitados a mSIN3 5 e KRAB (Ayer e outros, Mol Cell Biol., 1996, 16:5772-5781, Beerli & Barbas, Nat Biotechnol., 2002, 20:135-141, Beerli e outros, Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95:14628-14633, Margolin e outros, Proc Natl Acad Sci U S A., 1994, 91:4509-4513). Foi mostrado que estas abordagens funcionam em plantas (Guan e outros, Proc Natl Acad Sci U S A., 2002, 99:13296-13301, Stege e 10 outros, Plant J., 2002, 32:1077-1086, Van Eenennaam e outros, Metab Eng., 2004, 6:101-108).

Ainda em um outro aspecto, em alguns casos pode ser desejá- vel inibir a expressão da seqüência de ácido nucleico de HIO endógena em uma célula hospedeira. Os exemplos de métodos para a prática deste as- 15 pecto da invenção incluem, mas não estão limitados à supressão antissenso (Smith e outros, 1988, Nature, 334:724-726; van der Krol e outros, 1988, Bi- oTechniques, 6:958-976); co-supressão (Napoli e outros, 1990, Plant Cell, 2:279-289); ríbozimas (Publicação PCT WO 97/10328); e combinações de senso e antissenso (Waterhouse e outros, 1998, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 20 95:13959-13964). Os métodos para a supressão de seqüências endógenas em uma célula hospedeira empregam tipicamente a transcrição ou a trans- crição e a tradução de pelo menos uma ptécnica da seqüência que deve ser suprimida. Tais seqüências podem ser homólogas às regiões codificadoras assim como não codificadoras da seqüência endógena. A inibição antissen- 25 so pode utilizar a seqüência de cDNA inteira (Sheehy e outros, 1988, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 85:8805-8809), uma seqüência de cDNA parcial inclu- indo fragmentos da seqüência codificadora a 5’ (Cannon e outros, 1990, Plant Mol. Biol., 15:39-47) ou seqüências não codificadoras a 3’ (Ch'ng e outros, 1989, Proc. NatL Acad. Sei. USA, 86:10006-10010). As técnicas de 30 co-supressão podem utilizar a seqüência de cDNA inteira (Napoli e outros, 1990, Plant Cell, 2:279-289; van der Krol e outros, 1990, Plant Cell, 2:291- 299) ou uma seqüência de cDNA parcial (Smith e outros, 1990, Mol. Gen. Genetics, 224:477-481).

Os testes moleculares e genéticos padronizados podem ser rea- lizados para analisar adicionalmente a associação entre uma seqüência de ácido nucleico e um fenótipo observado. Os exemplos de técnicas são des- 5 critos a seguir.

1. Análise de DNA/RNA

Os padrões de expressão gênica específica ao estágio e ao te- cido em linhagens mutantes versus do tipo selvagem podem ser determina- dos, por exemplo, através da hibridização in situ. A análise da condição de 10 metilação do gene, especialmente das regiões reguladoras flanqueadoras, pode ser realizada. Outras técnicas adequadas incluem a superexpressão, a expressão ectópica, a expressão em outras espécies de plantas e o nocaute gênico (genética inversa, nocaute direcionado, silenciamento gênico induzi- do por vírus (VIGS; ver, Baulcombe D, 1999, Arch. Viroi Suppl. 15:189-201). 15 Em uma aplicação preferida, a obtenção de um perfil de expres-

são, geralmente através da análise de microarranjos, é utilizada para medir simultaneamente diferenças ou alterações induzidas na expressão de muitos genes diferentes. As técnicas para a análise de microarranjo são bem co- nhecidas na técnica (Schena M e outros, Science 1995 270:467-470; Bald- 20 win D e outros, 1999, Cur. Opin. Piant Biol. 2(2):96-103; Dangond F, Physiol Genomics (2000) 2:53-58; van Hal NL e outros, J Biotechnol. (2000) 78:271- 280; Richmond T e Somerville S, Curr. Opin. Plant Biol. 2000 3:108-116). Pode ser realizada a obtenção do perfil de expressão de linhagens marca- das individuais. Tal análise pode identificar outros genes que são coordena- 25 damente regulados como uma conseqüência da superexpressão do gene de interesse, que pode ajudar a colocar um gene desconhecido em uma via particular.

2. Análise dos Produtos Gênicos

A análise dos produtos gênicos pode incluir a expressão de pro- teínas recombinantes, a produção de antissoro, a imunolocalização, os en- saios bioquímicos para atividade catalítica ou outra, a análise da condição de fosforilacão e a análise da interação com outras proteínas através de en- saios de duplo híbrido de levedura.

3. Análise das Vias

A análise das vias pode incluir a colocação de um gene ou de um produto gênico dentro de uma via bioquímica, metabólica ou de sinaliza- 5 ção particular com base em seu fenótipo de expressão errada fenótipo ou através da homologia de seqüência com genes relacionados. Alternativa- mente, a análise pode compreender cruzamentos genéticos com linhagens do tipo selvagem e outras linhagens mutantes (criando duplos mutantes) para ordenar o gene em uma via ou determinar o efeito de uma mutação 10 sobre a expressão de genes "repórteres" a jusante em uma via.

Produção de Plantas Mutadas com um Fenótipo Alterado

São descritos aqui métodos adicionais de produção de uma planta que possui um fenótipo alterado, em que é identificada uma planta que possui uma mutação ou um alelo em sua seqüência de ácido nucleico 15 de HIO que resulta em um fenótipo alterado, comparada a plantas que não possuem a mutação ou o alelo. A planta mutada pode ser gerada utilizando um ou mais agentes mutagênicos, por exemplo, um agente mutagênico quí- mico (tal como sulfonato de etilmetano, sulfonato de metil metano, dietilsulfa- to e nitrosoguanidina ou 5-bromo-deoxiuridina), radiação ou Iuz ultravioleta. 20 Em algumas modalidades do método, a planta mutada pode ser cruzada para gerar progênie, que herda a mutação ou o alelo e possui um fenótipo alterado. Por exemplo, é fornecido aqui um método de identificação de plan- tas que possui uma ou mais mutações na seqüência de ácido nucleico de HIO endógena que confere um fenótipo alterado e de produção de progênie 25 destas plantas mutadas que possuem tal fenótipo que não são transgênicas. As plantas mutadas com um fenótipo alterado podem ter um conteúdo alte- rado de óleos, proteínas e/ou fibras ou um conteúdo alterado de farinha da semente.

Em uma modalidade específica do método, chamado de "TIL- LING" (para targeting induced local Iesions in genomes - direcionamento de lesões locais induzidas nos genomas), são induzidas mutações na semente de uma planta de interesse, por exemplo, utilizando tratamento com EMS (sulfonato de etilmetano). As plantas resultantes são crescidas e autofertili- zadas e a progênie é utilizada para preparar amostras de DNA. A amplifica- ção através da PCR e o sequenciamento da seqüência de ácido nucleico de HIO são utilizados para identificar se uma planta mutada possui uma muta- 5 ção na seqüência de ácido nucleico de HIO. As plantas que possuem muta- ções HIO podem ser então testadas em relação ao conteúdo alterado de óleos, proteínas e/ou fibras. Para confirmar se a mutação HIO causa o fenó- tipo modificado, podem ser realizados experimentos que correlacionam a presença do gene modificado e o fenótipo modificado através de cruzamen- 10 tos genéticos. O TILLING pode identificar mutações que alteram a expressão de genes específicos ou a atividade de proteínas codificadas por estes ge- nes (ver Colbert e outros, 2001, Plant Physiol. 126:480-484; McCaIIum e ou- tros, 2000, Nature Biotechnology 18:455-457).

Em uma outra modalidade específica do método, uma aborda- gem de gene/Lócus de Característica Quantitativa (QTLs) candidato pode ser utilizada em um programa de cruzamento auxiliado por marcadores para identificar alelos de ou mutações na seqüência de ácido nucleico de HIO ou ortólogos (e/ou parálogos) da seqüência de ácido nucleico de HIO que po- dem conferir conteúdo alterado de óleos, proteínas e/ou fibras (ver Bert e outros, Theor Appl Genet., 2003 Jun;107(1 ):181-9; e Lionneton e outros, Genome, 2002 Dez;45(6):1203-15). Assim, em um aspecto adicional da des- crição, um ácido nucleico de HIO é utilizado para identificar se uma planta que possui conteúdo alterado de óleos, proteínas e/ou fibras possui uma mutação em uma seqüência de ácido nucleico de HIO endógena ou possui um alelo particular que causa conteúdo alterado de óleos, proteínas e/ou fibras na planta.

Embora a descrição tenha sido descrita com referência a méto- dos e modalidades específicos, será considerado que várias modificações e alterações podem ser feitas sem divergir da descrição. Todas as publicações 30 citadas aqui são expressamente incorporadas aqui como referência com a finalidade de descrever e divulgar composições e metodologias que poderi- am ser utilizadas em associacão com a descricão. Todas as patentes, os I

pedidos de patentes e a informação de seqüências citados nos bancos de dados públicos referidos também são incorporados aqui como referência. EXEMPLOS EXEMPLO 1

5 Produção de Plantas com um Fenótipo HIO através da Transformação com um constructo de Marcação por Ativação

Este Exemplo descreve a produção de plantas transgênicas com con- teúdo alterado de óleos, proteínas e/ou fibras.

Os mutantes foram gerados utilizando o vetor "ACTTAG" de 10 marcação por ativação, pSKI015 (Gl#6537289; Weigel D e outros, 2000, Plant Physiology, 122:1003-1013). Métodos padronizados foram utilizados para a produção de plantas transgênicas de Arabidopsis e eram essencial- mente como descritos no pedido de patente publicado PCT W00183697. Sucintamente, plantas de Arabidopsis TO (Col-0) foram transformadas com 15 Agrobacterium carregando o vetor pSKI015, que compreende o T-DNA deri- vado do plasmídeo Ti de Agrobacterium, um gene marcador que pode ser selecionado de resistência a herbicida e o elemento intensificador 4X CaMV 35S. As plantas transgênicas foram selecionadas na geração T1 com base na resistência ao herbicida. A semente T2 (proveniente das plantas T1) foi 20 colhida e plantada no solo. As plantas T2 foram expostas ao herbicida para matar as plantas que não possuem o vetor ACTTAG. As plantas T2 foram crescidas até a maturidade, permitidas que fossem autofertilizadas e produ- zissem semente. A semente T3 (proveniente das plantas T2) foi colhida em grandes quantidades para cada linhagem.

A semente T3 foi analisada através de Near Infrared Spectros-

copy (NIR) no momento da colheita. Os espectros de NIR foram capturados utilizando um espectrômetro perto do infravermelho Bruker 22. O Software Bruker foi utilizado para estimar o conteúdo total de óleos da semente, o conteúdo total de proteínas da semente e o conteúdo total de fibras da se- 30 mente utilizando os dados provenientes da análise de NIR e métodos de re- ferência de acordo com as instruções do fabricante. As calibrações que pre- vêem o conteúdo de óleos foram desenvolvidas seguindo o método geral do AOCS Procedure Am1-92, Offieial Methods and Reeommended Praetiees of the American Oil Chemists Society1 5- Ed., AOCS1 Champaign1 III. Uma cali- bração que prevê o conteúdo total de proteínas por NIR foi desenvolvida uti- lizando dados do conteúdo de nitrogênio total de amostras de sementes se- 5 guindo o método geral do Dumas Procedure AOAC 968.06 (Official Methods of Analysis of AOAC International 17- Edição AOAC1 Gaithersburg, MD). Uma calibração que prevê o conteúdo de fibras por NIR foi desenvolvida uti- lizando os dados de conteúdo de fibras brutas de amostras de sementes seguindo o método geral do AOAC Official Method 962.09 (Official Methods 10 of Analysis of AOAC International 17- Edição AOAC1 Gaithersburg, MD). Uma calibração que prevê o conteúdo de ácido oléico por NIR foi desenvol- vida utilizando os dados do conteúdo de ácido oléico de amostras de semen- te determinados seguindo o método de Browse e outros (1986 Anal. Bio- chem. 152:141-145). Foi desenvolvida uma curva de calibração de NIR para 15 prever o conteúdo de proteínas que podem ser digeridas através da medida do conteúdo de proteínas que podem ser digeridas em um conjunto de a- mostras de sementes. O conteúdo total de proteínas em uma massa conhe- cida de semente foi determinado através da medida do conteúdo de nitrogê- nio total da semente utilizando o método de Dumas (AOAC Official Method 20 968.06). A fibra da semente é extraída de uma amostra de semente separa- da utilizando o método de Honig e Rackis, (1979, J. Agri. Food Chem., 27: 1262-1266). A proteína não digerida remanescente associada com a fibra é medida através do método de Dumas (AOAC Official Method 968.06). O conteúdo de proteínas que podem ser digeridas é determinado através da 25 subtração da quantidade de proteína não digerida associada com a fibra da quantidade total de proteína na semente.

As previsões de óleos, proteínas e fibras partindo dos espectros de NIR foram comparadas para 82.274 linhagens ACTTAG individuais. Sub- sequente á análise da composição das sementes, a posição do elemento 30 ACTTAG no genoma em cada linhagem foi determinada através da PCR inversa e do sequenciamento. 37.995 linhagens com seqüências flanquea- doras recuperadas foram consideradas nesta análise. I

Os valores de óleos e de proteínas das sementes em 82.274

i

linhagens foram determinados através da espectroscopia por NIR e normali- zados para permitir a comparação dos valores dos componentes das semen- tes nas plantas crescidas em tempos diferentes. Os valores de óleos, proteí- 5 nas e fibras foram normalizados através do cálculo dos valores médios de óleos, proteínas e fibras na semente de todas as plantas plantadas no mes- mo dia (incluindo um grande número de outras plantas ACTTAG, incluindo plantas de controle, do tipo selvagem ou não transgênicas). Os componen- tes das sementes para cada linhagem foram expressos na forma de um "va- 10 Ior relativo percentual" que foi calculado através da divisão do valor do com- ponente para cada linhagem pelo valor médio do componente para todas as linhagens plantadas no mesmo dia (que deve se aproximar ao valor nas plantas de controle, do tipo selvagem ou não transgênicas). A "porcentagem relativa de proteínas" e a "porcentagem relativa de fibras" foram calculadas 15 similarmente.

A PCR inversa foi utilizada para recuperar o DNA genômico que flanqueia a inserção do T-DNA. O produto da PCR foi submetido à análise de seqüência e posicionado no genoma utilizando uma busca de BLASTN básica e/ou uma busca do banco de dados Information Resource (TAIR) de 20 Arabidopsis (disponível no website disponível ao público). Geralmente, pro-

v.*

motores dentro de 9 kb dos intensificadores no elemento ACTTAG são con- siderados como estando dentro do "espaço de ativação". Os genes com in- sertos de T-DNA dentro das seqüências codificadoras não foram considera- dos como estando dentro do "espaço de ativação". As linhagens ACTTAG 25 identificadas estão listadas na coluna 3 da Tabela 1. Em alguns casos, mais de uma linhagem ACTTAG está associada com um gene. Os valores relati- vos de óleos, proteínas, fibras e ácido oléico nas colunas 4, 5, 6 e 7, respec- tivamente, são determinados através da comparação do componente da semente na planta identificado na coluna 3 em relação a outras plantas 30 crescidas ao mesmo tempo e que não exibem a característica. TABELA 1 1. Pseudônimo 2. TAIR ID 3. ID da Planta 4. (%) Relativa de Óleo 5. (%) Relativa de Pro¬ 6. (%) Relativa 7. Ácido Oléico Re¬ teína de Fibra lativo HI02019 A At1g17920 IN081493 118,99 95,25 100,45 102,12 HI02019 A Atlg 17920 IN006312 109,05 95,89 108,83 109,05 H102046 A At5g59010 IN089660 128,91 142,4 46,44 HI02046 A At5g59010 IN047347 102,37 104,89 96,13 106,83 HI02079A At1g71410 IN083604 131,01 83,85 99,94 139,75 H102079 A At1g71410 IN007461 107,42 99,81 96,75 97,89 HI02080 C At1g73660 IN086720 127,93 86,29 117,27 HI02080 C . At1g73660 IN086720 127,93 86,29 117,27 HI02080 C At1g73660 IN068250 109,31 92,95 104,37 109,68 HI02091 D At1g09870 IN086447 139,97 124,86 65,1 HI02091 D At1g09870 IN037425 100,88 92,75 101,56 98,12 HI02097 A At5g43250 IN086712 123,39 107,47 98,3 HI02097 A At5g43250 IN086698 119,63 94,3 103,68 203,11 HI02105 A At3g07220 IN005625 109,85 91,2 154,61 101,54 TABELA 2 1. Lócus 2. TairID 3. Seq. de Ácido 4. Seq. de Poli¬ 5. Suposta função bioquími¬ 6. Domínio conservado Nucleico Gl# peptídeo Gl# ca/nome da proteína da proteína HIÜ2019 A Atlg 17920 gi|42562137 gi|42562138 proteína da família de zíper de IPR002913 START de Ieucina em homeobox/proteína ligação a lipídeo contendo domínio START de li¬ gação a lipídeo IPR001356 Homeobox IPR000047 Motivo héli- ce-volta-hélice, Iambda- Iike repressor HI02046 A At5g59010 gi|30697158 gi|22327962 relacionada à proteína quinase IPR000719 Domínio de proteína quinase IPR002290 Seri- na/treonina proteína qui¬ nase f ΗΙ02079 A At1çj71410 gi|30698795 gi| 15217467 proteína da família de proteína IPR000719 Domínio de quinase proteína quinase IPR002290 Seri- na/treonina proteína qui¬ nase IPR000357 HEAT ΗΙΘ2091 D At1g09870 gi|42561877 gi|18391081 proteína da família da histidina da IPR000560 Histidina da fosfatase ácida fosfatase ácida HIQ2097A At5g43250 gi|18422310 gi|15239815 suposto fator de transcrição IPR003958 Fator de transcrição CBF/NF- Y/histona de archaea IPR007124 Dobramento de histona/TFIID- TAF/NF-Y IPR007125 Núcleo de histona *

cn

oo I ΗΙ02080 C At1g73660 gi|30698956 gi|15219517 proteína da família de proteína IPR000719 Domínio de quinase proteína quinase IPR002290 Seri- na/treonina proteína qui¬ nase HIQ2105 A At3g07220 gi|42563574 gi|15231425 suposto ativador da transcrição IPR000253 domínio as¬ [Arabidopsis thaliana] sociado a Forkhead cn

-fc. TABELA 3 1. ILócus 2. TairID 3. Seq. de Áci¬ 4. Seq. de Poli 5. Ortólogos Ácido Nucleico Gl# Polipeptídeo Gl# Espécie HI02019 A At1g17920 gi|42562137 gi|42562138 gi|42563198 gi| 15219456 Arabidopsis thaliana gi|51872286 gi|51872287 Gossypium hirsu- tum gi|51091189 gi|51091201 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) H102046 A At5g59010 gi|30697158 gi|22327962 gi|30693983 gi|15232406 Arabidopsis thaliana gi|30678717 gi|22328189 Arabidopsis thaliana gi|42568239 gi|15237604 Arabidopsis thaliana HI02079 A At1g71410 gi|30698795 gi|15217467 gi|42562252 gi|42562253 Arabidopsis thaliana gi|34912663 gi|34912664 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) gi|13365563 gi|54290405 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) HIQ2091 D At1g09870 gi|42561877 gi|18391081 gi|50919436 gi|50919437 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) gi|55730597 gi|55730598 Pongo pygmaeus Gl:19923760 Gl:19923761 Homo sapiens ΗΙ02097 A At5g43250 gi|18422310 gi|15239815 gi|34906253 gi|34906254 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) gi|55770762 gi|55770763 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) gi|21313423 gi|21313424 Mus muscuius HIÜ2080 C At1g73660 gi|30698956 gi| 15219517 gi|32527768 gi|32527769 Brassica juncea gi|30685720 gi|22329643 Arabidopsis thaliana gi|42415350 gi|51535180 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) HIQ2105 A At3g07220 gi|42563574 gi| 15231425 Gl:50947858 gi|50947859 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) 01:51965035 gi|51965036 Oryza sativa (grupo do cultivar japonica) Gl:18397890 gi|15231433 Arabidopsis thaliana I

EXEMPLO 2

i

Análise da Seqüência de HIO de Arabidopsis

As análises de seqüência foram realizadas com BLAST (Altschul e ou- tros, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410), PFAM (Bateman e outros, 1999, Nu- 5 cleic Acids Res. 27:260-262), INTERPRO (Mulder e outros 2003 Nucleic A- eids Res. 31, 315-318), PSORT (Nakai K e Horton P, 1999, Trends Bioehem. Sei. 24:34-6) e/ou CLUSTAL (Thompson JD e outros, 1994, Nueleie Aeids Res. 22:4673-4680).

EXEMPLO 3 10 Experimentos de Resumo

Para testar se a superexpressão dos genes nas Tabelas 1 e 2 alteram

o fenótipo de composição das sementes, o conteúdo de proteínas, de prote- ínas que podem ser digeridas, de óleos e de fibras nas sementes das plan- tas transgênicas que expressam estes genes foi comparado com o conteúdo 15 de proteínas, de proteínas que podem ser digeridas, de óleos e de fibras nas sementes das plantas de controie não transgênicas. Para fazer isso, os ge- nes foram clonados nos vetores de transformação de plantas atrás do pro- motor de CsVMV constitutivo forte e do promotor PRU específico de semen- te. Estes constructos foram transformadas em plantas de Arabidopsis utili- 20 zando o método de imersão floral. O vetor de transformação de plantas con-

v.'·

têm um gene, que fornece resistência a um composto tóxico e serve como um marcador que pode ser selecionado. A semente das plantas transforma- das foram plantadas em meio com ágar contendo o composto tóxico. Após 7 dias, as plantas transgênicas foram identificadas como plantas verdes sau- 25 dáveis e foram transplantadas para o solo. As plantas de controle não trans- gênicas foram germinadas em meio com ágar, permitidas que crescessem durante 7 dias e então transplantadas para o solo. As mudas transgênicas e as plantas de controle não transgênicas foram transplantadas em vasos de 5,08 cm (duas polegadas) que foram colocados em posições aleatórias em 30 uma bandeja de 25,4 cm (10 polegadas) por 50,8 cm (20 polegadas). As plantas foram crescidas até a maturidade, permitidas que sofressem autofer- tilização e produzissem semente. A semente foi colhida de cada planta e seu conteúdo de óleos foi estimado através de Near Infrared (NIR) Spectroscopy utilizando métodos descritos anteriormente. O efeito de cado constructo so- bre a composição da semente foi verificado em pelo menos dois experimen- tos.

A Tabela 4 lista os constructos testadas por causarem um au-

mento significativo no conteúdo de óleos, proteínas, proteínas que podem ser digeridas ou um decréscimo significativo no conteúdo de fibras foi identi- ficado através do teste de Análise de Variância em duas vias (ANOVA) em um valor de p <0,05. Estes constructos estão listadas na Tabela 4. Os valo- 10 res de p de ANOVA para Proteína, Óleo, Proteína Que Pode Ser Digerida e Fibra estão listados nas colunas 4-7, respectivamente. Aqueles com valor de p significativo estão listados em negrito. Os valores médios para Proteína, Óleo, Proteína Que Pode Ser Digerida e Fibra estão listados nas colunas 8-

11, respectivamente e foram calculados através da média dos valores mé- dios determinados para as plantas transgênicas em cada experimento. HIQ2105 A I i HIÜ2097A HIÜ2097 A HIQ2091 D HIQ2091 D HI02080 C HIQ2080C HIQ2079 A I HI02079 A HIQ2046 A HIQ2046 A HIQ2019 A HIQ2019A I 1. Pseu¬ I <-> dônimo W NJ O cn > At3g07220 At3g07220 At5g43250 At5g43250 At1g09870 At1g09870 At1g73660 At1g73660 ξ > At5g59010 > Atlg 17920 At1g17920 2. Tair CQ CQ cn ---J -fc. CQ £ O cn O CD o o Pru::At3g07220 CsVMV::At3g07220 Pru::At5g43250 CsVMV::At5g43250 Pru::At1g09870 CsVMV::At1g09870 Pru::At1g73660 CsVMV::At1g73660 TI CsVMV::At1g71410 Pru::At5g59010 CsVMV::At5g59010 Pru::At1g17920 CsVMV::At1g 17920 3. Cons- C tructo i CQ O 0,655 0,225 o 0,185 0,320 0,685 0,012 0,755 |θ,852 I 0,297 0,757 0,596 o 0,070 4. Proteí¬ -t^ o na o CD CD 0,034 CD 0,056 o 0,103 0,042 0,166 0,173 o 0,033 0,165 0,258 0,712 o 5. Óleo CO o CO o OO CD ί¬ O CD o 0,280 0,353 0,108 1 o 0,006 0,062 o ο o 0,061 0,006 0 0,247 6. Prote¬ o o o O O ~sl ína Que M O 00 CO 00 01 Pode Ser CD O OJ Digerida CD 0,751 o 0,180 0,002 0,582 o 0,044 O 0,058 o 0,051 0,782 o 7. Fibra O CO o O o O O CD cn OJ NJ O O CO 00 σ> CO CD 100,7% 101,7% 103,6% 98,1% 1 101,3% 99,6% CO 100,5% CO CD 99,4% 100,7% 102,4% 97,9% 8. Proteí¬ I cn CD CD na CO oo O sP Ov Ov 102,1% CD CD 102,5% 102,0% 102,8% O O 1102,0% I 104,1% 101,9% 101,4% 99,5% O 9. Óleo CO 00 i C*) CD cn O CO O nP 00 Ov Vp nÇ Os Sr? Ov- Ov 101,5% O 102,1% 101,6% ' 102,0% o 102,6% 101,8% 1101,7% o 101,8% 102,4% 100,7% o 10. Prote¬ CD CO oo o ína Que OO -o vP 00 Pode Ser vÇ Os o- -O Digerida Ov 96,7% 99,6% 98,2% 98,2% 96,9% CO 97,5% 97,6% CD CD CD 97,4% CD 97,0% 11. Fibra oo --J cn 00 CO O vO cn "■Ç cn sÇ Os 69

TABELA 4 Listagem de seqüências

<110> Agrinomics LLC Davies, John p.

Ng1 Hein Tsoeng

<120> Produção de plantas com conteúdo alterado de óleos, proteínas ou fibras

<130> 6616-72632-33 <150> 60/870,355 <151> 2006-12-15 <160> 14

<170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 2755 <212> DNA 15 <213> Arabidopsis thaliana <400> 1

agtctagaag aaccataatt acggattttg aaatttgggg attctatgag attcttcttc 60 ctctttggtt aaaaacctgg agattatcgt tttccaattc tagccttttc ttctcccctt 120 aatatcttct ctctgattct cttccgtttc gttttctcta ttccccgaga tcttttggtt 180 aaaggaagat aaagtttgaa acttttttat tgtttcacta ggcttgcgtt aatggcgaca 240 gttgtgtgat ggtccagagt tagcaagttt tacttactcg tttggttaaa aggacagaga 300 gtagagggaa aaaggctttg ttactgtttt ttttcgtctg cacattacta tggagtttct 360 cggcgacagt caaaatcacg atagctctga aacagagaag aagaacaaga agaagaagcg 420 atttcaccgt cacacacctc accagatcca acggcttgaa tcaactttca atgagtgtca 480 acatccagat gagaaacaga ggaaccaact tagtagagag ttgggtttag ctccaagaca 540 gatcaagttc tggtttcaaa acagaagaac tcaaaagaag gcacaacacg aaagagctga 600 taattgtgca ttgaaagaag agaatgataa gattcgatgc gaaaacattg ctattagaga 660 agctattaaa cacgccattt gccccagctg tggtgattct cctgttaatg aagactctta 720 ctttgatgag caaaagcttc gcatcgaaaa tgcacagctt agagatgagc tcgaaagggt 780 ttcgagtatt gcagctaaat tcttaggaag accaatctcc catcttccac cattactaaa 840 tccgatgcat gtttcgccat tagagttatt ccataccgga ccttcacttg attttgatct 900 tctcccaaga agttgttctt caatatctgt tccaagttta ccatctcagc caaacttggt 960 1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2340

2400

2460

2520

2580

2640

2700

2755

61

tttatcagag

gcttaggctt

tctcaatctc

gaataacctt

acttgtggac

atcatctaaa

gcatttgatg

tgtgctaaga

tgagtttcct

ccaagatatg

gcaagaaccg

tgaacgttgg

tgcaacatca

aatgagactt

cactcgctca

gagcagacat

ttctccacaa

tctttcaaat

aaactgcata

tctacaagaa

tctaccagcg

ctcaggtttt

tgggtttcag

gacagtaaat

ttcaactgct

caatgagcag

taagaaatca

tgagtttctt

tttttttgta

attacaatga

<210> 2

<211> 687

atggataagt

cttcaaacaa

gaaaactatg

ggaatggaag

atgcttatga

acccttgcag

attgaagagc

tattgtcagc

cagtttatat

tccaatggct

atacatgaga

attgctactc

tcccttgatc

gctcacagaa

acggttgtct

gaaccaaatg

aacgtcttca

ggaaactctg

tctgttcttc

agctgcatag

ttgaacatag

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ataatggtga

aatctcatca

tgagacgtca

agaagtgaaa

ttattcttct

ttttaagctt

tggttcgggc

ccaaattact

ctcttatgac

atgagcctct

agaatatgtt

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tgatttcatc

ttcaagtgct

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ctcaatctcg

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tgtttaaaga

tccaaagaat

ttggaggagt

tggtaagcaa

cgggactgga

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atttcctcaa

ttcaagaagt

gtggattcaa

actcatcaag

caatgagtgg

cagacggaag

gtggtttgca

ataccactgt

ttaaaagcta

gttattatta

gggtatcact

agtgggaaag

attgacttct

atttcttctt

caacattgct

gtggatcaaa

tacaagatca

ttctggtgtt

attaacagag

gggattgcgt

ttcaccattg

tggaacttgg

gtcatataga

tacttgggtg

tatagttcat

gtgtgagaga

gattccatcg

cttctgcttg

tgaatttgga

atgtgcagcc

agatgagaga

tgctcatatc

tgcatcatca

tgcagcgctt

tcaagacaca

cagcaaagga

accggcaaaa

ccaccaaatt

tttccccatc

gtgttttgtc

ctctctctcc

tgggagtcaa

gtttgtttgt

ggtttaattt

gtgaccgcta

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agtactagtg

gttttcacta

ctttttccct

ggaaaccatg

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gcaatagtaa

tttccttctg

gaacatggtg

aaaggattag

ttcacgaatc

ccagaaggga

agtgttggca

atccgtgtga

acaagtttct

actcggcctc

acaaacggat

tcacaaaaca

gtgatctaca

tcttatattc

ggaggatcat

ctgaacatgg

aaaacgacct

tgatttctga

ttcaatgcct

tctttcttgt

gaacgcacca

tttttacttc

attccatagt

tggaagaatt

gcagagatgt

gtggaaagaa

atgctattac

cgatcgttgc

gagatgcatt

gtgagttctg

atgtctcata

gttgcttgat

aattcgagga

cttttggagc

tattggaacc

agagaagtat

catctaacaa

cttcgcataa

ggctccctat

agtgggacgt

caaatcctgg

acatgttgat

ctccagtgga

cgatattacc

tgataacggt

agtcaatgga

tgaattgtcc

gaagggtctt

gcaaagagtg

tctttatttt

tgcacaaatg

tttttgtcta

ttctc <212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana <400> 2

Met Glu Phe Leu Gly Asp Ser Gln Asn His Asp Ser Ser Glu Thr Glu I 5 10 15

Lys Lys Asn Lys Lys Lys Lys Arg Phe His Arg His Thr Pro His Gln 20 25 30

Ile Gln Arg Leu Glu Ser Thr Phe Asn Glu Cys Gln His Pro Asp Glu 35 40 45

Lys Gln Arg Asn Gln Leu Ser Arg Glu Leu Gly Leu Ala Pro Arg Gln 50 55 60

Ile Lys Phe Trp Phe Gln Asn Arg Arg Thr Gln Lys Lys Ala Gln His 65 70 75 80

Glu Arg Ala Asp Asn Cys Ala Leu Lys Glu Glu Asn Asp Lys Ile Arg 85 90 95

Cys Glu Asn Ile Ala Ile Arg Glu Ala Ile Lys His Ala ile Cys Pro 100 105 110

Ser Cys Gly Asp Ser Pro Val Asn Glu Asp Ser Tyr Phe Asp Glu Gln 115 120 125

Lys Leu Arg Ile Glu Asn Ala Gln Leu Arg Asp Glu Leu Glu Arg Val 130 135 140

Ser Ser Ile Ala Ala Lys Phe Leu Gly Arg Pro Ile Ser His Leu Pro 145 150 155 160

Pro Leu Leu Asn Pro Met His vai Ser Pro Leu Glu Leu Phe His Thr 165 170 175

Gly Pro Ser Leu Asp Phe Asp Leu Leu Pro Gly Ser Cys Ser Ser Met 180 185 190

Ser Val Pro Ser Leu Pro Ser Gln Pro Asn Leu Val Leu ser Glu Met 195 200 205

Asp Lys Ser Leu Met Thr Asn Ile Ala Val Thr Ala Met Glu Glu Leu 210 215 220

Leu Ara Leu Leu Gln Thr Asn Glu Pro Leu TrD Ile Lvs Thr Asd Glv 225 230 235 240

Cys Arg Asp Val Leu Asn Leu Glu Asn Tyr Glu Asn Met Phe Thr Arg 245 250 255

Ser Ser Thr Ser Gly Gly Lys Lys Asn Asn Leu Gly Met Glu Ala Ser 260 265 270

Arg Ser Ser Gly Val Val Phe Thr Asn Ala Ile Thr Leu Val Asp Met 275 280 285

Leu Met Asn Ser vai Lys Leu Thr Glu Leu Phe Pro Ser Ile vai Ala 290 295 300

Ser Ser Lys Thr Leu Ala Val Ile Ser Ser Gly Leu Arg Gly Asn His 305 310 315 320

Gly Asp Ala Leu His Leu Met Ile Glu Glu Leu Gln Val Leu Ser Pro 325 330 335

Leu vai Thr Thr Arg Glu Phe Cys Val Leu Arg Tyr Cys Gln Gln Ile 340 345 350

Glu His Gly Thr Trp Ala Ile vai Asn Val Ser Tyr Glu Phe Pro Gln 355 360 365

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Gln Asp Met Ser Asn Gly Tyr Ser Lys Val Thr Trp Val Glu His Gly 385 390 395 400

Glu Phe Glu Glu Gln Glu Pro Ile His Glu Met Phe Lys Asp Ile Val 405 410 415

His Lys Gly Leu Ala Phe Gly Ala Glu Arg Trp Ile Ala Thr Leu Gln 420 425 430

Arg Met Cys Glu Arg Phe Thr Asn Leu Leu Glu Pro Ala Thr Ser Ser 435 440 445

Leu Asp Leu Gly Gly vai Ile Pro Ser Pro Glu Gly Lys Arg ser Ile 450 455 460

Met Arg Leu Ala His Arg Met Val Ser Asn Phe Cys Leu Ser vai Gly 465 470 475 480

Thr Ser Asn Asn Thr Ara Ser Thr Val vai Ser Glv Leu Asd Glu Phe 485

Gly Ile Arg Val Thr 500

Val Leu Cys Ala Ala 515

Val Phe Asn Phe Leu 530

Leu Ser Asn Gly Asn 545

Ser Asn Pro Gly Asn

565

Ser Ser Gln Asn Asn 580

Ser Ser Ala Ala Leu 595

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645

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490

Ser His Lys Ser Arg His 505

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Ser Val Gln Glu vai Ala 550 555

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Met Leu Ile Leu Gln Glu 585

vai Ile Tyr Thr Pro Val 600

Gly Gln Asp Thr Ser Tyr 615

Ser Pro Asp Gly Ser ser 630 635

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495

Glu Pro Asn Gly Met 510

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Gly Phe Asn Ala Ser 575

Ser Cys Ile Asp Ser 590

Asp Leu Pro Ala Leu 605

Ile Pro Ile Leu Pro 620

Lys Gly Gly Gly Ser 640

Gly Leu Gln Pro Ala 655

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Pro Ser Thr Ala 685

tcttggcttc tctttagaaa tttaactaaa aaaaatcttt

<210> 3 <211> 1831 <212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana <400> 3

cctcgagaac aaaaaaaact tctttttttt tctctttctc gtaactcacc aaaaaaaaaa aaagattttt gcttttcgaa

60

120 240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1831

65

caatcttcct

ctgttggtgg

aacggacgat

tggattctct

taaaggcaga

gcctgatact

gttggcgaat

tatgcctttt

gtctatgagg

aggtcgcgcc

cccgagatta

aaatttggct

ggtctacagc

ccatgcgctt

tggccatttc

gtatgaagct

gaaagaaact

aaaggaaaca

aatacatgaa

ctcgttccaa

tgctgcgttc

agatggcaca

caatatgcct

gccaacggct

ctgtgaaacc

aaaacttcaa

tgagaaagcc

ttgaagagat

ccaagatcct

<210> 4

<211> 489

<212> PRT

taaatctttc

ccgacccatc

ttgccgtcgt

acagacagta

cttgaagatg

cgtcaatttc

ttgattggat

gaaactctct

ttgagagtgg

ttgtaccacg

tcttgctttg

ttcacacctc

ttcggaacgc

gatctgattc

tcaaacgatg

cgtgaaaggc

gatattccgt

acttcgctta

attctcgaaa

gtgtggaccg

aaaggcaaag

atggtatcgc

caagaggctc

ttctatcttc

ctaaaagatg

gtgtataggt

tcattgtctc

gattcaaatc

tatatgagat

aaaaccccaa

tcaaatcaac

ttacggagtt

ttgtctccga

accgatggat

ttgaagaagc

tctgttgtga

cgaagcatct

ctttgtatct

atcttaatgc

gtcttatgaa

ctgaatacct

tgttgctaga

gtgggaagaa

atggaaccga

caaatgtgaa

ctcatgtttt

cccctcttgg

aggttggata

accagattca

actttgtcac

caacagtttt

ttggtgatgc

aggccgctgc

gaacttcctt

ttcttctctc

tgtcttcttt

acatttgaat

ttgttcaaac

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tcacaacgaa

tagtttcgac

acatggtgtt

cgctgttaaa

aaaagctgtg

aggagacgag

ctttcactgg

tgcacaagca

ttacaggatc

gaatagtagg

aagaacaggg

tcttctcagc

tttcctgatg

tttggttcgt

atctctcgtg

aatggggatt

tgacgcttgt

caaagatgac

ggagactcta

tgctgttgaa

tgcaaggagg

aatgcaggcg

tctcttcagc

ggaagccaag

ttccgccttc

aagcattatc

caagaaaaga

t

cgttgctcta

gcttctgatc

caactacgag

aaagctccta

cgattcaata

gggcagttga

agattgctcg

gatagtcagc

cttgagtatt

ttgtttgacc

gatgggaaga

agagtgattc

ggcaaacaca

ctgatggact

ttagcttccc

tcctcactcg

ccacatggag

tcacgacatg

gagggtgtag

aactccaaga

tgttacacgc

tgtttgtgtt

caagtagtgt

cttggaatgg

aaacataaca

ttcgttttgt

ttaaatttgt

aggatctttc

agctctctct

tagataacgg

ctgctacttg

atgttgtgta

gatccgcttg

ggaatgagag

ttgctgagtt

caatgaagtg

gtagcagcaa

aggatggtaa

gttacagtac

cggagagtgt

taccaccaag

cgtgtctaga

gttgtttgca

ctcctcttca

ctgcttctcc

atctcacagc

caaatgagct

aacaaggaga

agttcatcga

atctgatgag

ctcctgaatg

ataaagacgc

acagaaactg

gattggattc

ggtttccaat

tcatttaagt <213> Arabidopsis thaliana <400> 4

Met Gly Pro Arg Cys Ser Lys Leu Ser Leu Cys Trp Trp Pro Thr His 15 10 15

Leu Lys Ser Thr His Asn Glu Ala Ser Asp Leu Asp Asn Gly Thr Asp 20 25 30

Asp Leu Pro Ser Phe Thr Glu Phe Ser Phe Asp Gln Leu Arg Ala Ala 35 40 45

Thr Cys Gly Phe Ser Thr Asp Ser Ile vai Ser Glu His Gly vai Lys 50 55 60

Ala Pro Asn Val Val Tyr Lys Gly Arg Leu Glu Asp Asp Arg Trp Ile 65 70 75 80

Ala vai Lys Arg Phe Asn Arg Ser Ala Trp Pro Asp Thr Arg Gln Phe 85 90 95

Leu Glu Glu Ala Lys Ala vai Gly Gln Leu Arg Asn Glu Arg Leu Ala 100 105 110

Asn Leu Ile Gly Phe Cys Cys Glu Gly Asp Glu Arg Leu Leu vai Ala 115 120 125

Glu Phe Met Pro Phe Glu Thr Leu Ser Lys His Leu Phe His Trp Asp 130 135 140

Ser Gln Pro Met Lys Trp Ser Met Arg Leu Arg vai Ala Leu Tyr Leu 145 150 155 160

Ala Gln Ala Leu Glu Tyr Cys Ser Ser Lys Gly Arg Ala Leu Tyr His 165 170 175

Asp Leu Asn Ala Tyr Arg Ile Leu Phe Asp Gln Asp Gly Asn Pro Arg 180 185 190

Leu ser Cys Phe Gly Leu Met Lys Asn Ser Arg Asp Gly Lys Ser Tyr 195 200 205

Ser Thr Asn Leu Ala Phe Thr Pro Pro Glu Tyr Leu Arg Thr Gly Arg 210 215 220

Val Ile Pro Glu Ser Val vai Tyr Ser Phe Gly Thr Leu Leu Leu Asp 225 230 235 240 I

Leu Leu Ser Gly Lys His Ile Pro Pro Ser His Ala Leu 245 250

Arg Gly Lys Asn Phe Leu Met Leu Met Asp Ser Cys Leu 260 265

Phe Ser Asn Asp Asp Gly Thr Asp Leu Val Arg Leu Ala 275 280 285

Leu Gln Tyr Glu Ala Arg Glu Arg Pro Asn Val Lys Ser 290 295 300

Ser Leu Ala Pro Leu Gln Lys Glu Thr Asp Ile Pro Ser 305 310 315

Met Gly Ile Pro His Gly Ala Ala Ser Pro Lys Glu Thr 325 330

Thr Pro Leu Gly Asp Ala Cys Ser Arg His Asp Leu Thr 340 345

Glu Ile Leu Glu Lys Val Gly Tyr Lys Asp Asp Glu Gly 355 360 365

Glu Leu Ser Phe Gln Val Trp Thr Asp Gln Ile Gln Glu 370 375 380

Ser Lys Lys Gln Gly Asp Ala Ala Phe Lys Gly Lys Asp 385 390 395

Ala Val Glu Cys Tyr Thr Gln Phe Ile Glu Asp Gly Thr 405 410

Pro Thr Val Phe Ala Arg Arg Cys Leu Cys Tyr Leu Met 420 425

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Glu Trp Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Gln Ala Ala Ala Leu 450 455 460

Gly Met Asp Lys Asp Ala Cys Glu Thr Leu Lys Asp Gly 465 470 475

Glu Ala Lys Lys His Asn Asn Arg Asn 485

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Ser Arg Cys

Leu Val Ser

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Val Ala Asn

Thr Leu Asn

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Val Ser Pro

Phe Ser Leu

Thr Ser Leu 480 <210> 5 <211> 3201 <212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana 5 <400> 5

acgatcttcg atccagagtt gagcttctct caattacgca ttctctgatc tgatttgtga cgtcgccgac aacacttagg agtaattgga atttactcaa gctctagcta gaacggctgc 10 acaggaagtt acgggaccaa aggctcttca cgctggtcct ggtctagctt ggaagctata acagcagtac ccgacggtct gtgtatggat tgtacgagcg aatttgtcta aggcagctga tgcggggaag ctggtgaggt tgaggcatcc 15 tgagaataag aatgctatgg ctttagttac gcttggtaat gttgagaatg tgggtaatgt cttgttggag gtgaagcatg gtctgctcca taacgcaaat ctcatccatc gagccatttc ttcttggaag cttgccgggt ttggttttgc 20 taacatgcaa tcgttccact attctgaata gccatctcta aattacactg cacctgaact ttcgtcggac atttttagtt ttggatgcct gtttgactgc aataataatg tcaagatgta atctttctca tctataccct cggaattggt 25 cgagtccttt agaccaacag cattagattt taggttacgt gctctccgct tccttgatca cgagttctta aaagcattat cagatatgtg taaggtgctt ccacctcttt gtgcggaact gccaatggtt ctaactatag cacagtctca 30 tccggctctt gttcctgttc tgagtactgc acatgcagat cttattacta acaagactga tttgcttctg caaacctaca ataataacga

tctgccatcg tcttcttcct cgatctcggt 60 gatctctcgt cggatcaccg ttttttacat 120 tccagcagaa atgtcgataa acatgaaaac 180 tgtgattgag aagacggttc ataccacagt 240 ggattacgag ctacttgatc agatcggttc 300 cgcagctaag gcgcgtgatt ccacgaggcc 360 gcttgataag cgtgctttgt cggaggctcg 420 agatgcgttt cttgatctga ttcgagctga 480 tggtgtggtt catgtggtgc aagcgcttga 540 ggagccgctt tttgcttctg tggctaatgc 600 gccgaaagat ctgaaatcaa tggagatgag 660 gatttctgag acactgaact tcttacacaa 720 tccagagaat gttcttatta cttcagctgg 780 tatttcagca gcacaggctg ggaatttgga 840 cgacgtcgag gattcaatac tgccagtcca 900 gatgcgcagc aaaagtcctt cagctggagc 960 tgcctatcat ttagttgctc ggaaaccgtt 1020 catgaacacg ttgaactata taacaaatga 1080 atctgatttg caaaggatgc tatcaacgaa 1140 cacaggatcg aattttttcc gaagtgacgc 1200 tttgcttgaa agagataaca tgcaaaagtc .1260 gaaagatttt gattcccgtg tattacggta 1320 taggaattta gttttgcaac caataatctt 1380 ggatagaact gactttgagc tgataacact 1440 ttcaggagat acattactgc tgcttgtgaa 1500 tagtgagcat cttgtatcgc acgtcctccc 1560 tatccacatt caggaaaaaa ttcttaaaaa 1620 1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

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2280

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2400

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2760

2820

2880

2940

3000

3060

3120

3180

3201

69

atccacatct tgttcatggc cttagctgag tcaacggtgt aaacgcaatc gatgccgctt tgtcaaggat agtcccagag aatacctgag ctccccgagc tcagtttaac gacaacagcg aagcctcact ttcgggtttc ttctgttgct aggcggcacc gtcttcgcta actcaactct atacaacaac gtccgcaatg tagaggtggt tctattatga gtgattaaga actgttcaga ataaacttta atgttttctc ttttcatgta <210> 6 <211>

<212>

<213>

<400>

gtggctaagc

ttggctctca

ttggtgcaaa

actgccgtag

ctcaaacagt

ctcactgccc

attctcagga

gtgaaaccgc

aaggttgctt

aaagattctg

aaatccacag

ccaacaacat

gctccagcaa

gatgagttag

tctactggtc

cattttcaga

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ttcggtgtac

cagaagccag

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actggcacat

ccacagttct

gaagcatata

aaaatggaga

ctacagcttc

accattgctt

aactcgatgg

aaactacagt

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atggagttga

aacaactgaa

aaatagagga

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ctgcagccaa

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atcagtcaca

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ctgataatca

atccgtttgc

tcaagaatgg

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caccaccttc

ctacctcaaa

tggtgttgaa

cacatggaga

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t

tcaggttgtg

tgctgcggtc

gcctgccgct

accaacccta

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cgtccaacag

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ggacatcgag

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cgctgcatcc

tgacaactgg

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ccaaggaatg

ttccatattc

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gcccagtggt

cctcttggtg

ttgcgctccg

acatcttctg

atgtctttct

acataatatt

aggcaagcaa

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atcgaaattc

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gaacatgtgc

tttgccaaat

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cagtttcagt

gcatgggatg

tctcgtcata

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tggcctccaa

aacacaggaa

ccacgtccca

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tctgcaaata

ccatctttca

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tggtgttggt

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caaattgtac

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ttgctgtggc

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atatgctatt

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catcaaccca

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ggcaatcttc

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gttttgtcgt

tgcagagaaa

cttccactat

aaattttgtt

ggctacgcta

tactttttct

909 PRT

Arabidopsis thaliana 6 Met Ser Ile Asn Met Lys Thr Phe Thr Gln Ala Leu Ala Arg Thr Ala 15 10 15

Ala vai Ile Glu Lys Thr Val His Thr Thr vai Gln Glu Val Thr Gly 20 25 30

Pro Lys Ala Leu Gln Asp Tyr Glu Leu Leu Asp Gln Ile Gly Ser Ala 35 40 45

Gly Pro Gly Leu Ala Trp Lys Leu Tyr Ala Ala Lys Ala Arg Asp Ser 50 55 60

Thr Arg Pro Gln Gln Tyr Pro Thr Val Cys vai Trp Met Leu Asp Lys 65 70 75 80

Arg Ala Leu Ser Glu Ala Arg Val Arg Ala Asn Leu Ser Lys Ala Ala 85 90 95

Glu Asp Ala Phe Leu Asp Leu Ile Arg Ala Asp Ala Gly Lys Leu Val 100 105 110

Arg Leu Arg His Pro Gly Val Val His Val Val Gln Ala Leu Asp Glu 115 120 125

Asn Lys Asn Ala Met Ala Leu Val Thr Glu Pro Leu Phe Ala Ser vai 130 135 140

Ala Asn Ala Leu Gly Asn vai Glu Asn vai Gly Asn Val Pro Lys Asp 145 150 155 160

Leu Lys Ser Met Glu Met Ser Leu Leu Glu Val Lys His Gly Leu Leu 165 170 175

Gln Ile Ser Glu Thr Leu Asn Phe Leu His Asn Asn Ala Asn Leu Ile 180 185 190

His Arg Ala Ile Ser Pro Glu Asn vai Leu Ile Thr Ser Ala Gly Ser 195 200 205

Trp Lys Leu Ala Gly Phe Gly Phe Ala Ile ser Ala Ala Gln Ala Gly 210 215 220

Asn Leu Asp Asn Met Gln Ser Phe His Tyr Ser Glu Tyr Asp Val Glu 225 230 235 240

Asp Ser Ile Leu Pro vai Gln Pro Ser Leu Asn Tyr Thr Ala Pro Glu 245 250 255 Leu Met Arg Ser Lys Ser Pro Ser Ala Gly Ala Ser Ser Asp Ile Phe 260 265 270

Ser Phe Gly Cys Leu Ala Tyr His Leu Val Ala Arg Lys Pro Leu Phe 275 280 285

Asp Cys Asn Asn Asn Val Lys Met Tyr Met Asn Thr Leu Asn Tyr Ile 290 295 300

Thr Asn Glu Ser Phe Ser Ser Ile Pro Ser Glu Leu Val Ser Asp Leu 305 310 315 320

Gln Arg Met Leu Ser Thr Asn Glu Ser Phe Arg Pro Thr Ala Leu Asp 325 330 335

Phe Thr Gly Ser Asn Phe Phe Arg Ser Asp Ala Arg Leu Arg Ala Leu 340 345 350

Arg Phe Leu Asp His Leu Leu Glu Arg Asp Asn Met Gln Lys Ser Glu 355 360 365

Phe Leu Lys Ala Leu ser Asp Met Trp Lys Asp Phe Asp Ser Arg vai 370 375 380

Leu Arg Tyr Lys Val Leu Pro Pro Leu Cys Ala Glu Leu Arg Asn Leu 385 390 395 400

Val Leu Gln Pro Ile Ile Leu Pro Met Val Leu Thr Ile Ala Gln Ser 405 410 415

Gln Asp Arg Thr Asp Phe Glu Leu Ile Thr Leu Pro Ala Leu vai Pro 420 425 430

Val Leu Ser Thr Ala Ser Gly Asp Thr Leu Leu Leu Leu Val Lys His 435 440 445

Ala Asp Leu Ile Thr Asn Lys Thr Asp Ser Glu His Leu Val Ser His 450 455 460

Val Leu Pro Leu Leu Leu Arg Ala Tyr Asn Asp Asn Asp Val Arg Ile 465 470 475 480

Gln Glu Glu vai Leu Lys Arg Ser Thr Ser vai Ala Lys Gln Leu Asp 485 490 495

Gly Gln vai Val Arg Gln Ala Ile Leu Pro Arg vai His Gly Leu Ala 500 505 510 Leu Lys Thr Thr Val Ala Ala Val Arg Val Asn Ala Leu Leu Cys Leu 515 520 525

Ala Glu Leu vai Gln Thr Leu Asp Lys Pro Ala Ala Ile Glu Ile Leu 530 535 540

Glu Thr Ile Gln Arg cys Thr Ala vai Asp Arg Ser Ala Pro Thr Leu 545 550 555 560

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Ala Gln Gln Leu Asn Val Gln Gln Phe Ala Lys Tyr Met Leu Phe Val 595 600 605

Lys Asp Ile Leu Arg Lys Ile Glu Glu Lys Arg Gly vai Thr Val Asn 610 615 620

Asp Ser Gly vai Pro Glu Val Lys Pro His Ser Ala Ala Asn Gly Leu 625 630 635 640

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Gln Thr Gln Leu Asn Thr Gly Thr Ser Phe Ala Ser Gly Phe Asp Glu 740 745 750

Leu Asp Pro Phe Ala Asn Trp Pro Pro Arg Pro Asn Asn Gly Ala Ser 755 760 765 Val Ala Ser

i

770 Asn Leu Pro 785

Ala Phe Ser

Asn Gln Gly

Val Pro Lys 835

Asn Asn Gln 850 Thr Glu Pro 865

Gly Arg Gly

Lys Pro Ser

<210> 7 <211> 1694

f..'

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana <400> 7

gtggaacagt ggcttgtggc ttgattaatc

ttagaaagcg tgagagatgg cgacgaagac

tgtttcccag gcagatcagg gtttcgatgt

ctctacttcg aaagatgtta cccaaaattt

tacacctatc caccttaacc ttgtggctag

attgcgggaa ttggaaagtt tggctggtag

taggaaattg ccttcagaca aaattcctgg

aggaaaagtg aaaggtgggg agctgatcag

aattcgggtt cggaaacagt ttcctaattt

Asn Gly Ala Ala Ser Asn Phe Ser Asn 780

Phe Gln Thr Ala Asn Asn Asp Asn Trp 795 800

Ser Ser Leu Lys Pro Pro Gln Gln Gly 810 815

Asn Gln Asp Pro Leu Asn Ser Phe Gly 825 830

Met Pro Ser Phe Thr Ser Gly Ser Tyr 840 845

Ile Ser Ser Ile Phe Gly Ser Ser Lys 860

Leu Ala Pro Pro Pro Ser Ile Ala Met 875 880

Arg Gly Gly Thr Gly Thr Ser Thr Ser 890 895

Ser Leu Leu Asp Leu Leu 905

ggaaacttga aagcttcctc ctgaaggaat 60 tgtttggatc atactgttgt gtctatttgt 120 tcgtcatcac ctctccaccg tcaccagata 180 gattgaaggg tcgaatgttc ctagtgagtg 240 gcatggaact cgttctccga ccaagaaacg 300 gtttaaggaa ctggtaagag atgcagaagc 360 atggttggga caatggaaat ctccttggga 420 gcaaggggag gatgagttat accaactggg 480 gtttgaagag aattaccatc ctaatatcta 540 Thr Gly Leu Lys 775

Gly Gly Thr His 790

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Gln ser Gln Gly

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Arg Gly Arg Gly 885

Gly Ser Gln Pro 900 tacaataaga gctacgcaga ttcctagggc atctgcaagt gctgtagcat ttggaatggg 600 gttattcagt gagaaaggaa atctgggacc aggccgtaat agagcattcg ctgtcactag 660 cgaaaaccgt gccagtgata caaagttgag attttttgaa tgttgtcaaa actacaagag 720 ctatagaaaa gctaaagagc ctgctgtgga taagctcaag gaacctgttc tgaataaaat 780 tacagcttcc gttgcaaaga gatatgattt aaaattcacg aaacaggaca tttcttctct 840 ctggtttctg tgcaagcagg aagcatcatt gcttaatgta actaatcaaa gttgtgaact 900 tttcacgcca tcagaggttg ctttgctgga atggacagat gatttggaag tgtttctcct 960 caaaggttat ggaaattcct tgaattacaa aatgggagtt ccacttctag aagatgtttt 1020 gcattcaatg gaagaagcta tcaaggcccg ggaagaaaag ctcccacctg gaagttacga 1080 aaaagcaagg cttaggtttg cacatgccga aacaatagtt cccttttctt gtcttcttgg 1140 gcttttcctt gatggatctg agtttgagaa aatacagaag gagaaacctt tggaactccc 1200 tccacagcct cccaaaacca gggattttag aggcagcacc atggctcctt ttggtgggaa 1260 caacattctt gtcctataca gttgtcccgc agaatcctct cccaaatact tcgttcaggt 1320 tctgcacaat gagcatccta ttgcagtgcc aggttgtgat ggaaaagatt tctgtcctct 1380 tgaagatttc aaggccaaag tggtaactcc tcatctaaag catgcttttg acaacctttg 1440 caatgctgat ctaaatgacc tgaaacagaa gcctgcatca agtaagttat ctatactgtc 1500 aagttggctg tttgggtcaa gccacgatac cgagctctag ttactacaca gctcttctta 1560 catactggct gattacagtt tgaacctgaa atcacacaga gcattgttgt ctgttttttt 1620 ttttgtcccc ttgccacatt tgtgttctag ttagttcaat ccgctaatct gaaatatttt 1680 gattttgatc tctg 1694 <210> 8 <211> 487 <212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana <400> 8

Met Ala Thr Lys Thr Val Trp 1 5

Ser Gln Ala Asp Gln Gly Phe 20

Thr Arg Tyr Ser Thr Ser Lys 35

Ser Asn Val Pro Ser Glu Cvs

Ile Ile Leu Leu Cys Leu Phe Val Val 10 15

Asp Val Arg His His Leu Ser Thr vai

30

Asp val Thr Gln Asn Leu Ile Glu Gly 40 45

Thr Pro Ile His Leu Asn Leu val Ala I

50 55 60

Arg His Gly Thr Arg Ser Pro Thr Lys Lys Arg Leu Arg Glu 65 70 75

Ser Leu Ala Gly Arg Phe Lys Glu Leu Val Arg Asp Ala Glu 85 90

Lys Leu Pro Ser Asp Lys Ile Pro Gly Trp Leu Gly Gln Trp 100 105 HO

Pro Trp Glu Gly Lys Val Lys Gly Gly Glu Leu Ile Arg Gln 115 120 125

Asp Glu Leu Tyr Gln Leu Gly Ile Arg vai Arg Glu Arg Phe 130 135 140

Leu Phe Glu Glu Asp Tyr His Pro Asp vai Tyr Thr ile Arg 145 150 155

Gln Ile Pro Arg Ala Ser Ala Ser Ala Val Ala Phe Gly Met 165 170

Phe Ser Glu Lys Gly Asn Leu Gly Pro Gly Arg Asn Arg Ala 180 185 190

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Cys Cys Gln Asn Tyr Lys Ser Tyr Arg Lys Ala Lys Glu Pro 210 215 220

Asp Lys Leu Lys Glu Pro Val Leu Asn Lys Ile Thr Ala Ser 225 230 235

Lys Arg Tyr Asp Leu Lys Phe Thr Lys Gln Asp Ile Ser Ser 245 250

Phe Leu Cys Lys Gln Glu Ala Ser Leu Leu Asn Val Thr Asn 260 265 270

Cys Glu Leu Phe Thr Pro Ser Glu Val Ala Leu Leu Glu Trp 275 280 285

Asp Leu Glu Val Phe Leu Leu Lys Gly Tyr Gly Asn Ser Leu 290 295 300

Lvs Met Glv Val Pro Leu Leu Glu Asp vai Leu His Ser Met

Leu Glu 80 Ala Arg 95

Lys Ser

Gly Glu

Pro Ser

Ala Thr 160 Gly Leu 175

Phe Ala

Phe Glu

Ala vai

Val Ala 240 Leu Trp 255

Gln Ser Thr Asp Asn Tyr Glu Glu 305 310 315 320

Ala Ile Lys Ala Arg Glu Glu Lys Leu Pro Pro Gly Ser Tyr Glu Lys 325 330 335

Ala Arg Leu Arg Phe Ala His Ala Glu Thr Ile Val Pro Phe Ser Cys 340 345 350

Leu Leu Gly Leu Phe Leu Asp Gly Ser Glu Phe Glu Lys Ile Gln Lys 355 360 365

Glu Lys Pro Leu Glu Leu Pro Pro Gln Pro Pro Lys Thr Arg Asp Phe 370 375 380

Arg Gly Ser Thr Met Ala Pro Phe Gly Gly Asn Asn Ile Leu Val Leu 385 390 395 400

Tyr Ser Cys Pro Ala Glu Ser Ser Pro Lys Tyr Phe Val Gln vai Leu 405 410 415

His Asn Glu His Pro Ile Ala Val Pro Gly Cys Asp Gly Lys Asp Phe 420 425 430

Cys Pro Leu Glu Asp Phe Lys Ala Lys Val vai Thr Pro His Leu Lys 435 440 445

His Ala Phe Asp Asn Leu Cys Asn Ala Asp Leu Asn Asp Leu Lys Gln 450 455 460

Lys Pro Ala Ser Ser Lys Leu Ser Ile Leu Ser Ser Trp Leu Phe Gly 465 470 475 480

Ser Ser His Asp Thr Glu Leu 485

<210> 9 <211> 393 <212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana <400> 9

atggaggaag aagaaggatc aatccgacca gagtttccaa tcggaagagt aaagaagata 60 atgaaactgg acaaagacat caacaaaatc aactcagaag ctcttcacgt catcacttac 120 tccaccgaac tcttcctcca cttcctcgcc gagaaatctg ctgttgttac ggcggagaag 180 aagcgtaaga ctgttaatct cgatcattta agaatcgccg tgaaaaaaca ccaacctact 240 agtgatttcc tcttagactc gcttccgttg ccggctcagc ctgtcaaaca taccaaatcg 300

ί

gtttccgaca agaagattcc ggcgccgcca attgggactc gtcgtatcga tgatttcttc 360 agtaaaggga aagcaaagac tgattcagcc taa 393

<210> 10 <211> 130 <212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana <400> 10

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Val Lys Lys Ile Met Lys Leu Asp Lys Asp lle Asn Lys Ile Asn Ser 20 25 30

Glu Ala Leu His Val Ile Thr Tyr Ser Thr Glu Leu Phe Leu His Phe 35 40 45

Leu Ala Glu Lys Ser Ala Val Val Thr Ala Glu Lys Lys Arg Lys Thr 50 55 60

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Ser Asp Phe Leu Leu Asp Ser Leu Pro Leu Pro Ala Gln Pro Val Lys 85 90 95

His Thr Lys Ser Val Ser Asp Lys Lys Ile Pro Ala Pro Pro Ile Gly 100 105 110

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Ser Ala 130 <210> 11 <211> 3939 <212> DNA 30 <213> Arabidopsis thaliana <400> 11

aaaagatacg ccttttttct tattctgttt tattttgcat atcacaataa gtaactctcc 60 tcctcaatta tcaaaaatgc aaactttaat

ttctttcttt gtccaacttt ttagacagag

catattcaag ttggttgaag gaggagaatt

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5 ttggtgattt atcaaaaaaa aaaaaaaaat

aattttgctg tctcaagttt ttgccttttg

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5

10

15

20

25

30

2040

2100

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3000

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3900

79

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Met Lys Val Lys Glu Glu Thr Leu Lys Asn Leu Gly Asp Gly Val Val 15 10 15

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Met Lys Asn Phe Leu Lys Lys Leu His Ile Ser Pro Asn Gln Ser Asp 35 40 45

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Ile Asp Val Ser Ser Ser Ser Ser Pro Arg Ser His His Ser Asn Ser 65 70 75 80

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245 250 255

Ile Ala Ala Lys Ser Arg ser vai Ser Ser Ser Gly Phe Val Asn Ser 260 265 270

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Leu Thr Ile Gly Leu Ala Arg His Arg Ala Leu Leu Phe Lys Val Leu

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Ala Asp Ala Ala Gly Leu Gln Ile Asp Tyr Asp Glu ser Ala Tyr Ser 385 390 395 400

Ala Ser Pro Gly Asp Asn Asp Ser Ile His Val Ala Ser Ser Ser Asn

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Gly Ile Glu Ser Ser Tyr Glu Glu Asn Thr Glu Phe Arg Thr Gly Glu 420 425 430

His Arg Ser Ser Thr Lys Ser ser Gly Glu Arg Asn Gln Ser Gly Gly 435 440 445

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Pro Ile His Ser Phe Thr His Met Arg Ser Pro Ser Trp Thr Glu Gly 485 490 495

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His Asp Val Leu Leu Glu Ser Gly vai Val Ala Pro Pro Asn Leu Phe 530 535 540

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Gln Gly Ser Gly Asp Ser Asn His Gly Pro Asn Ser Gly Gly Glu Arg 705 710 715 720 Ile Ser Asp Lys Ser Ile Gly Asn Glu Ser Ser Lys Ser Asp Cys Asp 725 730 735

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Arg His Pro Asn Ile Val Leu Phe Met Gly Ala Val Thr Arg Pro Pro 805 810 815

Asn Leu Ser Ile Val Thr Glu Phe Leu Pro Arg Gly Ser Leu Tyr Arg 820 825 830

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Lys Asn Trp Val vai Lys vai Cys Asp Phe Gly Leu Ser Arg Met Lys 885 890 895

His Ser Thr Tyr Leu Ser Ser Lys Ser Thr Ala Gly Thr Ala Glu Trp 900 905 910

Met Ala Pro Glu vai Leu Arg Asn Glu Pro Ala Asp Glu Lys Cys Asp 915 920 925

Val Tyr Ser Tyr Gly Val Ile Leu Trp Glu Leu Phe Thr Leu Gln Gln 930 935 940

Pro Trp Gly Lys Met Asn Pro Met Gln Val Val Gly Ala Val Gly Phe 945 950 955 960

Gln His Arg Arg Leu Asp Ile Pro Asp Phe vai Asp Pro Ala Ile Ala 965 970 975 Asp Leu Ile Ser Lys Cys Trp Gln Thr Asp Ser Lys Leu Arg Pro Ser 980 985 990

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Gly Ser Asn Ile Pro Arg Pro Val Pro Ser Ser Ser Ser Leu Pro 1010 1015 1020

Thr Glu His Glu Gln Lys Asp 1025 1030

<210> 13 <211> 1185 <212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana <400> 13

tcgattcaca aattattacg attgcaatcc ctaatttgga agtcccggtt cctctttcga 60 tcaaatcgga gaatttcacg gcatggctac ggctgttggt ggcggaagcg atgtggaggt 120 tggatttgcg aagcttcaag gtgaggattt cgagtactat atgcagtctt actccattat 180 actcggccgg aattctaaga aagccaccgt cgacgttgat ctctcatccc tcggcggtgg 240 gatgaacatc tcgcgcaacc acgctcggat cttctatgac ttcactagac gacgcttctc 300 tctcgaggtc cttggcaaaa atggctgcct cgttgaaggt gttcttcatc tccctgggaa 360 tcctaacgtc aagctcgatt cacaagacct tttgcagatc ggagacaaag agttctactt 420 tctcctaccg gttcggagca tcttaggcgg gccgttggga cctaggcacc acgtctctgg 480 gcaaacaagt gttgttccat accataatta tcagtcgggt ccaggttctg ggtcgggtaa 540 gaagggcgtc aggagtagag agttgtatga gtacgatgat gaagatgatg atgacgacga 600 cgatgaggag gacgatatga gaggaagtgg aaagaaaaca aggagagatg gacatgaagt 660 agtatatgct tccggagaga agaagagaga gggaagatca aaggtagatc gtgaagctga 720 tgatcaacaa tttttgcagc tggaggaaaa agatgttgta tcgtctgttg ccactgtgct 780 ttccgatttg tgtggtccgg gagagtggat gcctatggaa aaacttcatt cggtgatatt 840 aaaggagtat ggaaacgtat ggcatcacag tcgagtaaga agatacctat cacaagaaga 900 ctgggctatc cctgaagcaa aaggtaaacc atggtacggt ttgctgatgc tgctgagaaa 960 atacccggag catttcgtca tcaacacgag atcaaaggga agagttaccc ttgaattcgt 1020 ttccctcgtt accctactct catgagaact ttaccttagt gactcggatt aagatttaag 1080 aaacttttct ctcttttctt tgtttcatat gtaaaatatt ttagcattaa ttagtaacac 1140 I

gctgtgtcgt ttttctgcac ccaaaaacgc caacttcttg gtcct <210> 14 <211> 320 <212> PRT 5 <213> Arabidopsis thaliana <400> 14

Met Ala Thr Ala Val Gly Gly Gly Ser Asp Val Glu Val Gly Phe Ala 15 10 15

Lys Leu Gln Gly Glu Asp Phe Glu Tyr Tyr Met Gln Ser Tyr Ser Ile 20 25 30

Ile Leu Gly Arg Asn Ser Lys Lys Ala Thr Val Asp Val Asp Leu Ser 35 40 45

Ser Leu Gly Gly Gly Met Asn Ile Ser Arg Asn His Ala Arg Ile Phe 50 55 60

Tyr Asp Phe Thr Arg Arg Arg Phe Ser Leu Glu Val Leu Gly Lys Asn 65 70 75 80

Gly Cys Leu Val Glu Gly Val Leu His Leu Pro Gly Asn Pro Asn Val 85 90 95

Lys Leu Asp ser Gln Asp Leu Leu Gln Ile Gly Asp Lys Glu Phe Tyr 100 105 110

Phe Leu Leu Pro Val Arg Ser Ile Leu Gly Gly Pro Leu Gly Pro Arg 115 120 125

His His Val ser Gly Gln Thr Ser Val Val Pro Tyr His Asn Tyr Gln 130 135 140

Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Gly Lys Lys Gly Val Arg Ser Arg Glu 145 150 155 160

Leu Tyr Glu Tyr Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Glu Glu 165 170 175

Asp Asp Met Arg Gly Ser Gly Lys Lys Thr Arg Arg Asp Gly His Glu 180 185 190

Val Val Tyr Ala Ser Gly Glu Lys Lys Arg Glu Gly Arg Ser Lys Val 195 200 205

1185 Asp Arg Glu Ala Asp Asp Gln Gln Phe Leu Gln Leu Glu Glu Lys Asp 210 215 220

Val Val Ser Ser Val Ala Thr Val Leu Ser Asp Leu Cys Gly Pro Gly 225 230 235 240

Glu Trp Met Pro Met Glu Lys Leu His Ser Val lle Leu Lys Glu Tyr

245 250 255

Gly Asn Val Trp His His Ser Arg Val Arg Arg Tyr Leu Ser Gln Glu 260 265 270

Asp Trp Ala Ile Pro Glu Ala Lys Gly Lys Pro Trp Tyr Gly Leu Leu 275 280 285

Met Leu Leu Arg Lys Tyr Pro Glu His Phe Val Ile Asn Thr Arg Ser 290 295 300

Lys Gly Arg vai Thr Leu Glu Phe Val Ser Leu vai Thr Leu Leu Ser 305 310 315 320

Claims (29)

1. Planta transgênica, que compreende um vetor de transforma- ção de plantas que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifi- ca ou é complementar a uma seqüência que codifica um polipeptídeo HIO que compreende a seqüência de aminoácidos que é apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 ou um ortólogo ou um parálogo da mesma, através do que a planta transgênica possui um fenótipo de maior conteúdo de óleo ou um fenótipo de maior qualidade de farinha, em relação às plantas de controle.

2. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 1, que é se- lecionada do grupo que consiste em plantas das espécies de Brassica, inclu- indo canola e semente de colza, soja, milho, girassol, algodão, cacau, aça- froa, dendezeiro, coqueiro, linho, mamona, amendoim, trigo, aveia e arroz.

3. Ptécnica da planta obtida da planta como definido na reivindi- cação 1.

4. Ptécnica da planta de acordo com a reivindicação 3, que é uma semente.

5. Farinha, produto alimentício ou alimento produzido partindo da semente da reivindicação 4.

6. Processo de produção de óleo que compreende o cultivo da planta transgênica como definido na reivindicação 1, e a recuperação do ó- Ieo da dita planta.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, em que o óleo é recuperado de uma semente da planta.

8. Processo de produção de maior conteúdo de óleo em uma planta, o dito processo compreendendo: a introdução nas células progenitoras da planta de um vetor de transformação de plantas que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica ou é complementar a uma seqüência que codifica um polipeptí- deo HIO que compreende a seqüência de aminoácidos que é apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 6. SEQ ID NO: 8. SEQ ID NO: .10, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 ou um ortólogo ou um parálogo da mesma e o cultivo das células progenitoras transformadas para produzir uma planta transgênica, em que a dita seqüência de polinucleotídeo é ex- pressa e a dita planta transgênica exibe um fenótipo de maior conteúdo de óleo em relação às plantas de controle.

9. Planta obtida através de um processo como definido na rei- vindicação 8.

10. Planta de acordo com a reivindicação 9, que é selecionada do grupo que consiste em plantas das espécies de Brassica, incluindo cano- Ia e semente de colza, soja, milho, girassol, algodão, cacau, açafroa, dende- zeiro, coqueiro, linho, mamona, amendoim, trigo, aveia e arroz.

11. Planta de acordo com a reivindicação 9, em que a planta é selecionada do grupo que consiste em uma planta crescida partindo das di- tas células progenitoras, uma planta que é a progênie direta de uma planta crescida partindo das ditas células progenitoras e uma planta que é a progê- nie indireta de uma planta crescida partindo das ditas células progenitoras.

12. Processo de produção de uma planta que possui um maior conteúdo de óleo, que compreende a identificação de uma planta que possui um alelo em seu gene HIO que resulta no maior conteúdo de óleo compara- da a plantas que não possuem o alelo e a produção de progênie da dita planta identificada, em que a progênie gerada herda o alelo e possui o fenó- tipo de alto conteúdo de óleo.

13. Processo de acordo com a reivindicação 12 que emprega metodologia de gene/QTL candidato.

14. Processo de acordo com a reivindicação 12 que emprega a metodologia de TILLING.

15. Produto alimentício, farinha, grão, alimento ou semente que compreende um poiipeptídeo codificado pela seqüência de ácido nucleico que é apresentada na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 13.

16. Produto alimentício, farinha, arão, alimento ou semente aue compreende um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoáci- dos que é apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 ou um ortólogo ou um parálogo da mesma.

17. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 1, em que um fenótipo de maior qualidade de farinha compreende um aumento na e- nergia que pode ser metabolizada disponível na farinha produzida partindo das sementes da planta transgênica, em relação às plantas de controle.

18. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 17, em que um aumento na energia que pode ser metabolizada disponível compre- ende um conteúdo alterado de proteínas e/ou de fibras nas sementes da planta transgênica.

19. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 18, em que o conteúdo de proteínas é aumentado e/ou o conteúdo de fibras é dimi- nuído.

20. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 17, em que um aumento na energia que pode ser metabolizada disponível compre- ende um menor conteúdo de fibras nas sementes da planta transgênica.

21. Processo de produção de farinha, que compreende o cultivo da Planta transgênica de acordo com a reivindicação 1 e a recuperação da farinha da planta, produzindo assim a farinha.

22. Processo de acordo com a reivindicação 21, em que a fari- nha é produzida partindo de sementes da planta.

23. Processo de produção de um fenótipo de maior qualidade de farinha em uma planta, o dito processo compreendendo: a) a introdução nas células progenitoras da planta de um vetor de transformação de plantas que compreende uma seqüência de nucleotí- deos que codifica ou é complementar a uma seqüência que codifica um poli- peptídeo HIO que compreende a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 ou um ortólogo ou um parálogo da mesma e b) o cultivo das células progenitoras transformadas para produ- zir uma planta transgênica, em que a seqüência de nucleotídeos é expressa e a planta transgênica exibe um fenótipo de maior qualidade de farinha em relação às plantas de controle, produzindo assim o fenótipo de maior qualidade de farinha na planta.

24. Planta obtida através de um processo de acordo com a rei- vindicação 23.

25. Planta de acordo com a reivindicação 24, que é selecionada do grupo que consiste em plantas das espécies de Brassica, incluindo cano- Ia e semente de colza, soja, milho, girassol, algodão, cacau, açafroa, dende- zeiro, coqueiro, linho, mamona, amendoim, trigo, aveia e arroz.

26. Planta de acordo com a reivindicação 24, em que a planta é selecionada do grupo que consiste em uma planta crescida partindo das di- tas células progenitoras, uma planta que é a progênie direta de uma pianta crescida partindo das ditas células progenitoras e uma planta que é a progê- nie indireta de uma planta crescida partindo das ditas células progenitoras.

27. Processo de produção de uma planta que possui um fenóti- po de maior qualidade de farinha que compreende a identificação de uma planta que possui um alelo em seu gene HIO que resulta na melhor qualida- de de farinha, comparada a plantas que não possuem o alelo e a produção da progênie da dita planta identificada, em que a progênie gerada herda o alelo e possui a qualidade de farinha melhorada, gerando assim uma planta que possui um fenótipo de maior qualidade de farinha.

28. Processo de acordo com a reivindicação 27, que emprega a metodologia de gene/QTL candidato.

29. Processo de acordo com a reivindicação 27, que emprega a metodoiogia de TILLING.