ES2573936T3 - Oligómeros para agentes terapéuticos - Google Patents

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Abstract

Un dúplex de ARN que comprende al menos un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria con un ARNm diana, en el que el oligonucleótido comprende un monómero de 2'-3'-seco- nucleótido acíclico, en el que el dúplex de ARN disminuye la expresión de un ARNm diana.

Description

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imagen3
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imagen5
invención. Esto se aplica por ejemplo cuando el objeto en particular es un efecto colateral reducido.
Por lo tanto, la región de doble hebra núcleo de un complejo de ARNip de la invención puede comprender un número de pares de bases seleccionado de entre el grupo de 10 pares de bases, 11 pares de bases, 12 pares de
5 bases, 13 pares de bases, 14 pares de bases, 15 pares de bases, 16 pares de bases, 17 pares de bases, 18 pares de bases, 19 pares de bases, 20 pares de bases, 21 pares de bases, 22 pares de bases, 23 pares de bases, 24 pares de bases and 25 pares de bases, 26 pares de bases, 27 pares de bases, 28 pares de bases, 29 pares de bases, 30 pares de bases, 35 pares de bases, 40 pares de bases, 42 pares de bases, 45 pares de bases, 50 pares de bases, 55 pares de bases, 60 pares de bases o 62 pares de bases.
En una realización, la región de doble hebra núcleo de un complejo de ARNip de la invención comprende de 15 a 40 pares de bases.
En otra realización preferente, la región de doble hebra núcleo de un complejo de ARNip de la invención comprende 15 18-22 pares de bases.
En una realización, la región de doble hebra núcleo de un complejo de ARNip de la invención tiene una longitud incluso superior a 40 pares de bases, aunque se sabe que en algunas células, la introducción de complejo de ADN de doble hebra de una longitud mayor puede inducir una respuesta no específica dependiente de interferón. En una realización de este tipo, se contempla que el complejo se procesa a complejos de ARN de doble hebra más cortos antes de conectarse con un RGPC. Una enzima de tipo RNasa III tal como DICER puede ejecutar el procesamiento. Dicer también procesa el ARN de doble hebra con una longitud inferior a 40 pares de bases y tales complejos de ARN (denominados sustratos Dicer) tienen diversas ventajas en comparación con el ARNip que entra en RISC sin procesamiento. Por lo tanto, en una realización, los complejos de ARNm de la invención son sustratos de Dicer.
25 En otra realización más, la región de doble hebra núcleo de un complejo de ARNip de la invención tiene una longitud inferior a 10 pares de bases y por lo tanto comprende de uno a nueve pares de bases.
En una realización de la invención, la región de doble hebra núcleo el complejo de ARN está formado por más de dos hebras de ARN.
En una realización de la invención, la región de doble hebra núcleo el complejo de ARN está formado por tres hebras de ARN.
35 En otra realización de la invención, la región de doble hebra núcleo el complejo de ARN está formado por cuatro o más hebras de ARN.
En una realización preferente de la invención, el complejo de ARNip de la invención comprende salientes. Como se usa en el presente contexto, un saliente se refiere a una región de doble hebra corta que sigue a una región de doble hebra.
En una realización, la cadena no codificante de un complejo de ARNip de la invención comprende un saliente en la posición 3’.
45 En otra realización, la hebra pasajera de un complejo de ARNip de la invención comprende un saliente en la posición 3’.
En otra realización más, la cadena no codificante de un complejo de ARNip de la invención comprende un saliente en la posición 5’.
Además, en otra realización, la hebra pasajera de un complejo de ARNip de la invención comprende un saliente en la posición 5’.
En una realización preferente, tanto la cadena no codificante como la hebra pasajera de un complejo de ARNip de 55 la invención comprenden un saliente en la posición 3’.
Los salientes de un complejo de ARNip de la invención pueden tener una longitud variable, sin interferir con la función básica del complejo. Por lo tanto, en una realización, los salientes se seleccionan entre el grupo de salientes con una longitud de 1 nucleótido, 2 nucleótidos, 3 nucleótidos, 4 nucleótidos, 5 nucleótidos, 6 nucleótidos, 7 nucleótidos y 8 nucleótidos.
Los salientes más preferentes de un complejo de ARNip de la invención son salientes con una longitud de 1, 2 y 3 nucleótidos, respectivamente.
65 En una realización, el saliente de la cadena no codificante de un complejo de ARNip de la invención tiene la misma longitud que el saliente de la hebra pasajera.
imagen6
fosforilación. Disponible para fosforilación se refiere a que el grupo hidroxi en la posición 5’ no se ha bloqueado por ejemplo mediante conjugación directa o mediante otra conjugación a otros grupos en la proximidad del grupo hidroxi en la posición 5’, que evitará que el grupo hidroxi en la posición 5’ se fosforile.
5 Por lo tanto, en una realización preferente de la invención, la molécula(s) de ARN del complejo de ARN comprende(n) un grupo fosfato en el extremo en la posición 5’ y un grupo hidroxi en la posición 3’.
En otra realización, la segunda molécula de ARN de un complejo de ARNip de la invención comprende un grupo fosfato en el extremo en la posición 5’ y un grupo hidroxi en la posición 3’.
En otra realización más, la cadena no codificante comprende un grupo fosfato en el extremo la posición 5’ y un grupo hidroxi en la posición 3’.
En algunas realizaciones de la invención, es preferente que el complejo de ARN comprenda análogos de nucleótido
15 distintos de los nucleótidos modificados con hidroximetilo. Tales análogos de nucleótido distintos de los nucleótidos modificados con hidroximetilo se denominan a continuación "nucleótidos modificados de forma alternativa".
El uso de nucleótidos modificados de forma alternativa se puede favorece por varias razones. Por ejemplo, se pueden usar para aumentar la temperatura de fusión de la región de doble hebra núcleo de un complejo de ARNip de la invención.
El uso de nucleótidos modificados de forma alternativa se puede favorecer para aumentar la temperatura de fusión de la estructura de doble hebra formada entre la cadena no codificante y el ácido nucleico diana.
25 Por consiguiente, en una realización, la cadena no codificante comprende nucleótidos modificados de forma alternativa.
En otra realización, la hebra pasajera de un complejo de ARNip de la invención comprende nucleótidos modificados de forma alternativa.
En otra realización más, cada una de una primera y una segunda moléculas de ADN de la hebra pasajera de un complejo de ARNip de la invención contiene nucleótidos modificados de forma alternativa.
En una realización de la invención, el número de nucleótidos modificados de forma alternativa en el complejo de
35 ARN es 10. En otras realizaciones de la invención, el número de análogos de nucleótido en el complejo de ARN es 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1, respectivamente.
En una realización de la invención, el número de nucleótidos modificados de forma alternativa en la cadena no codificante es 10. En otras realizaciones de la invención, el número de análogos de nucleótido en la cadena no codificante es 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1, respectivamente.
En otra realización, todos los nucleótidos de la cadena no codificante son nucleótidos modificados de forma alternativa o una combinación de nucleótidos modificados de forma alternativa y nucleótidos sustituidos con hidroximetilo.
45 De forma análoga, en otra realización de la invención, el número de análogos de nucleótido en la hebra pasajera de un complejo de ARNip de la invención es 10. En otras realizaciones de la invención, el número de análogos de nucleótido en la hebra pasajera es 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1, respectivamente.
En otra realización, todos los nucleótidos de la hebra pasajera de un complejo de ARNip de la invención son análogos de nucleótido o una combinación de nucleótidos modificados de forma alternativa y nucleótidos sustituidos con hidroximetilo.
En una realización, tanto la cadena no codificante como la hebra pasajera de un complejo de ARNip de la invención 55 contienen nucleótidos modificados de forma alternativa.
En una realización, los nucleótidos modificados de forma alternativa el complejo de ARN son idénticos, es decir, son todos por ejemplo LNA o todos 2’-O-Me-ARN. En otra realización, se usan diversos nucleótidos modificados de forma alternativa diferentes en el mismo complejo de ARN.
En una realización, el complejo de ARN comprende enlaces de fosforotioato.
En otra realización, el complejo de ARN comprende una mezcla de enlaces naturales de fosfodiéster y fosforotioato.
65 Algunos análogos de nucleótido preferentes de la invención son análogos de nucleótido seleccionados de entre el grupo de monómeros de 2’-O-alquil-ARN, monómeros de 2’-amino-ADN, monómeros de 2’-fluoro-ADN, monómeros
de LNA, monómeros de HNA, monómeros de ANA, monómero de FANA, monómeros de ADN, monómeros de PNA y monómeros de INA, pero también se pueden usar otros monómeros [Nawrot y Sipa, Curr. Topics Med. Chem. 2006, 6, 913-925].
5 En una realización, el sustituyente de hidroximetilo de los monómeros sustituidos con hidroximetilo de la invención está funcionalizado con un grupo de conjugación. Un grupo de conjugación es un grupo conocido por una persona experta en la materia que cambia, expande o mejorar las propiedades de un complejo de ARN de la invención. Tales grupos pueden ser útiles para modular la distribución celular, distribución de órgano, distribución del tejido, temperaturas de fusión híbridas, afinidad por diana, bioestabilidad, señalización de hibridación, etc.
En una realización, el sustituyente de hidroximetilo de los monómeros sustituidos con hidroximetilo de la invención está funcionalizado con un enlace éter entre un grupo conjugado y el grupo metileno del sustituyente de hidroximetilo. Véase la Figura 2 (Monómero F).
15 En una realización, el sustituyente de hidroximetilo de los monómeros sustituidos con hidroximetilo de la invención se convierte en una funcionalidad tioéter antes de la incorporación en el complejo de ARN de la invención usando métodos conocidos por una persona en la materia. Véase la Figura 2 (Monómero G).
En otra realización, el sustituyente de hidroximetilo de los monómeros sustituidos con hidroximetilo de la invención se convierte en una funcionalidad mercaptometilo antes de incorporación en el complejo de ARN de la invención usando métodos conocidos por una persona en la materia. Véase la Figura 2 (Monómero G, R = H). Esta función mercapto se protege de forma apropiada como por ejemplo su derivado de acetilo durante la síntesis de ARN usando métodos conocidos por una persona experta en la materia.
25 En una realización, el sustituyente de hidroximetilo de los monómeros sustituidos con hidroximetilo de la invención se convierte en una funcionalidad amina antes de incorporación en el complejo de ARN de la invención usando métodos conocidos por una persona en la materia. Véase la Figura 2 (Monómero I, R = H). Esta funcionalidad amina se protege de forma apropiada como por ejemplo su derivado de trifluoroacetilo o Fmoc durante la síntesis de ARN usando métodos conocidos por una persona experta en la materia.
En una realización, el sustituyente de hidroximetilo de los monómeros sustituidos con hidroximetilo de la invención actúa como un asa para unión de grupos de conjugación unidos a amida. Esto implica la conversión de la unidad hidroxilo del sustituyente de hidroximetilo en una unidad amino, por ejemplo como se ha descrito anteriormente, y derivatización adicional de este grupo amino por ejemplo con un grupo de conjugación mediante formación de
35 enlace amida usando métodos conocidos por una persona en la materia. Esto se puede producir antes de la síntesis de ARN o después de la síntesis de ARN usando métodos conocidos por una persona en la materia (Figura 2, Monómero H).
En una realización, el sustituyente de hidroximetilo de los monómeros sustituidos con hidroximetilo de la invención actúa como un asa para unión de grupos de conjugación unidos a amino. Esto implica la conversión de la unidad hidroxilo del sustituyente de hidroximetilo en unidad amino, por ejemplo como se ha descrito anteriormente, y derivatización adicional de este grupo amino por ejemplo con un grupo de conjugación mediante formación de enlace amino usando métodos conocidos por una persona en la materia. Esto se puede producir antes de la síntesis de ARN o después de la síntesis de ARN usando métodos conocidos por una persona en la materia (Figura
45 2, Monómero I).
En una realización más, el grupo de amina usado para conjugación es un grupo amino, un grupo piperazino o un grupo diamino alquilo. Tales monómeros se denominan monómeros derivatizados con amina. Cada uno de estos grupos se puede derivatizar o conjugar adicionalmente (Figura 2, Monómero J).
En una realización, el complejo de ARN de la invención tiene efectos colaterales reducidos en comparación con complejos de ARN nativos.
En una realización preferente, el complejo de ARN tiene al menos un monómero sustituido con hidroximetilo de la 55 invención en la cadena no codificante.
En otra realización preferente, el complejo de ARN tiene al menos un monómero sustituido con hidroximetilo de la invención incorporado en o alrededor de la denominada región semilla de la cadena no codificante, es decir, en al menos una de las posiciones n.º 1-12 del extremo en la posición 5’ de la cadena no codificante.
Además, en otra realización preferente, el complejo de ARN tiene al menos un monómero sustituido con hidroximetilo de la invención incorporado en al menos una de las posiciones n.º 2-10 del extremo en la posición 5’ de la cadena no codificante.
65 Además, en otra realización preferente, el complejo de ARN tiene un monómero sustituido con hidroximetilo de la invención incorporado en una de las posiciones n.º 3-8 del extremo en la posición 5’ de la cadena no codificante.
Además, en otra realización preferente, el complejo de ARN tiene un monómero sustituido con hidroximetilo de la invención incorporado en una de las posiciones n.º 7 o 8 del extremo en la posición 5’ de la cadena no codificante.
Además, en otra realización preferente, el complejo de ARN tiene un monómero sustituido con hidroximetilo de la 5 invención incorporado en la posición n.º 7 del extremo en la posición 5’ de la cadena no codificante.
Además, en otra realización preferente, el complejo de ARN tiene un monómero sustituido con hidroximetilo de la invención incorporado en las posiciones n.º 9-16 del extremo en la posición 5’ de la cadena no codificante.
10 Además, en otra realización preferente, el complejo de ARN tiene un monómero sustituido con hidroximetilo de la invención incorporado en las posiciones n.º 9-11 del extremo en la posición 5’ de la cadena no codificante.
Además, en otra realización preferente, el complejo de ARN tiene un monómero sustituido con hidroximetilo de la invención incorporado en las posiciones n.º 9-10 del extremo en la posición 5’ de la cadena no codificante.
15 En otra realización, el complejo de ARN de la invención produce una respuesta inmune reducida en comparación con complejos de ARN nativos.
En otra realización más, los complejos de ARN de la invención tienen un efecto prolongado en comparación con 20 complejos de ARN nativos.
En otra realización más, los complejos de ARN de la invención tienen un aumento del efecto en comparación con complejos de ARN nativos. Por consiguiente, en una realización preferente, el complejo de ARN media el ARNi de forma más eficaz que el complejo de ARN nativo, por ejemplo mediante una degradación más eficaz del ARNm
25 diana o mediante una inhibición de la traducción más eficaz del ARNm diana.
En otra realización más, los complejos de ARN de la invención se administran de forma eficaz a órganos o tejidos específicos de un ser humano o un animal.
30 Aún en otra realización más, los complejos de ARN de la invención son capaces de penetrar la membrana celular de forma eficaz. Aún en otra realización más, los complejos de ARN de la invención a son capaces de penetrar la membrana celular de forma más eficaz que los complejos de ARN naturales.
35 En una realización, los complejos de ARN de la invención son capaces de unirse a proteína plasmática que a aumentar la retención de los complejos de ARN en el cuerpo humano.
Segundo aspecto, preparación de complejo de ARN
40 Otro aspecto de la invención es un método para preparar un complejo de ARN de dos hebras de la invención que comprende incubar la cadena no codificante con la hebra pasajera en condiciones en las que se forma un complejo de ARN que comprende una región de doble hebra núcleo, siendo capaz dicho complejo de ARN de mediar el ARN de interferencia de un ARN celular correspondiente.
45 En realizaciones alternativas de este aspecto, el complejo de ARN está sustituido con un dúplex de ARN de la invención (décimo aspecto).
Tercer aspecto, método para mediar la modificación del ácido nucleico
50 Además, otro aspecto de la invención es un método para mediar la modificación de ácido nucleico de un ácido nucleico diana en una célula o un organismo que comprende las etapas:
a. Poner en contacto una célula u organismo con el complejo de ARN de la invención en condiciones en las que
se puede producir la modificación de un ácido nucleico diana. 55
b. Mediar de ese modo la modificación de un ácido nucleico diana.
En realizaciones preferentes, el método para mediar la modificación de ácido nucleico de un ácido nucleico diana se realiza in vitro.
60 En realizaciones preferentes, el método para mediar la modificación de ácido nucleico de un ácido nucleico diana se realiza in vivo, es decir en animales, en seres humanos o en animales no humanos.
En realizaciones preferentes, el método para mediar la modificación de ácido nucleico de un ácido nucleico diana se 65 realiza en cultivos celulares.
imagen7
ácido nucleico es metilación de ADN.
En realizaciones preferentes del método para evaluar si un agente actúa en un producto genético, el método se realiza en cultivos celulares, in vitro o in vivo. 5 En otra realización más, el método se realiza en una célula aislada.
En realizaciones alternativas de este aspecto, el complejo de ARN está sustituido con cualquiera de un oligonucleótido de la invención (noveno aspecto) o un dúplex de ARN de la invención (décimo aspecto).
Sexto aspecto, composición farmacéutica
Además, otro aspecto de la invención es el complejo de ARN y un diluyente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Para la persona experta será evidente que los complejos de ARN de la invención se
15 pueden diseñar para dirigirse a genes y productos genéticos específicos. Se debe observar que los complejos de ARN se dirigirán a una secuencia de ADN o una secuencia de ARN, y no a una proteína. Sin embargo, the el nivel de un producto genético tal como una proteína se puede ver influido indirectamente, si su ARNm o un ARN no codificante se modifica, por ejemplo, mediante degradación de ARN o inhibición de la traducción. Además, la expresión del gen que codifica la proteína se puede ver influido, por ejemplo debido a la metilación del ADN.
En realizaciones alternativas de este aspecto, el complejo de ARN está sustituido con cualquiera de un oligonucleótido de la invención (noveno aspecto) o un dúplex de ARN de la invención (décimo aspecto).
Séptimo aspecto, uso de un medicamento
25 Por lo tanto, otro aspecto es el complejo de ARN de la invención para uso como un medicamento. Una vez que se ha validado una diana terapéutica, la persona experta puede diseñar complejos de ARN que influyen en el nivel y la actividad de la diana, dado que la especificidad de los complejos de ARN queda exclusivamente dentro de la secuencia de la cadena no codificante. Para complejos de ARN nativos con una hebra pasajera continua, sigue habiendo un problema con los efectos colaterales debido a la hebra pasajera que actúa como una secuencia guía.
En realizaciones alternativas de este aspecto, el complejo de ARN está sustituido con cualquiera de un oligonucleótido de la invención (noveno aspecto) o un dúplex de ARN de la invención (décimo aspecto).
35 Octavo aspecto, monómeros
La presente solicitud también desvela monómeros adecuados para incorporación de los monómeros sustituidos con hidroximetilo de la invención y métodos para su preparación a partir de materiales de partida fácilmente disponibles. Los derivados de timin-1-ilo de monómeros de hidroximetilo sustituidos de la invención se han incorporado en las hebras de ADN, y algunos procedimientos para la preparación de sus componentes básicos de fosforamidita a la síntesis de ADN/ARN automatizada se han informado [K. D. Nielsen et al., Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 1493; H. Thrane et al., Tetrahedron 1995, 51, 10389; P. Nielsen et al., Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 19].
De la manera más frecuente, los complejos de ARN de la invención se prepararán mediante síntesis de
45 oligonucleótido automatizada como losa de una persona experta en la materia. La incorporación de los monómeros sustituidos con hidroximetilo de la invención en los complejos de ARN de la invención sigue métodos convencionales para a) síntesis de ARN en un sintetizador de ARN automatizado, a) tratamiento de ARN, c) purificación de ARN y d) aislamiento de ARN [F. Eckstein, Oligonucleotides and Analogues, IRL Press, Oxford University Press, 1991]. Los oligonucleótidos de ARN sustituidos con hidroximetilo (= hebras de ARN) y complejos de ARN se pueden sintetizar usando derivados de fosforamidita usando las técnicas convencionales a la síntesis de ARN.
Por lo general, algunos métodos para la preparación de los derivados de fosforamidita de los monómeros sustituidos con hidroximetilo de la invención comienza a partir de un ribonucleósido, por ejemplo un derivado
55 protegido con O5’-DMT de un ribonucleósido que para las bases adenina, guanina, citosina y 5-metilcitosina contiene base grupos protectores como por ejemplo, benzoílo, isobutirilo, acetilo, fenoxiacetilo, tercbutilfenoxiacetilo u otros grupos protectores básicos convencionales conocidos por una persona experta en la materia.
También se desvelan métodos para preparar componentes básicos monoméricos adecuados para la incorporación de los Monómeros D y E que tienen un enlace de carbono-carbono escindido en las posiciones 2’,3’ (nomenclatura de ribonucleósidos).
También se desvelan métodos para preparar componentes básicos monoméricos adecuados para la incorporación
65 de los Monómeros como F-J que tienen un enlace de carbono-carbono escindido en las posiciones 2’,3’ y que además portan una funcionalidad o grupo por ejemplo en su átomo de carbono en la posición 2’ (nomenclatura de
ribonucleósidos) distintos de un grupo hidroxi.
Por lo general, el método para la preparación de los derivados de fosforamidita del Monómero D comprende, entre las etapas fundamentales, escisión de glicol en las posiciones 2’,3’, reducción del compuesto intermedio resultante, 5 protección selectiva de O2’ y fosforilación de O3’.
Por lo general, la escisión de glicol en las posiciones 2’,3’ comienza usando escisión oxidativa por ejemplo con Peryodato sódico como reactivo.
Por lo general, con la reducción del compuesto intermedio, después de la escisión con Peryodato sódico, se reduce al correspondiente diol, realizada por ejemplo con borohidruro sódico.
Para la incorporación del Monómero D en los complejos de ARN de la invención es necesario proteger el grupo 2’hidroxi (nomenclatura de ribonucleósidos). En una realización preferente de la invención esto se realiza mediante
15 benzoilación. Puede ser beneficioso usar solamente poco más de un equivalente de reactivo de benzoilación (cloruro de benzoílo o por ejemplo anhídrido benzoílico) para optimizar la selectividad de la protección, es decir, la cantidad de benzoilación en O2’ con respecto a la benzoilación en O3’. En una realización preferente, la benzoilación se realiza a una temperatura inferior a la temperatura ambiente. En otra realización útil, la benzoilación se realiza a una temperatura inferior a 0 ºC o incluso inferior a -50 ºC.
Por lo general, la protección de O2’ se realiza mediante acetilación o realizando acilación usando un reactivo de acilación conocido por una persona experta en el campo de la síntesis orgánica.
Por lo general, la protección de O2’ se realiza mediante sililación usando un reactivo de sililación y método conocido
25 por una persona experta en el campo de la síntesis orgánica. Un grupo protector de sililación preferente es el tercbutildimetilsililo.
La reacción posterior de fosforilación se realiza por lo general usando cualquiera del reactivo denominado "PCl", [PCl(OCH2CH2CN)(N(iPr)2)], o del reactivo denominado "bis-amidita", [P(OCH2CH2CN)(N(iPr)2)2].
En los métodos para la preparación de los derivados de fosforamidita del Monómero D, el material de partida por lo general es un ribonucleósido, por ejemplo un derivado protegido con 05’-DMT de un ribonucleósido que para las bases adenina, guanina, citosina y 5-metilcitosina contiene grupos protectores básicos tales como por ejemplo, benzoílo, isobutirilo, acetilo, fenoxiacetilo, terc-butilfenoxiacetilo u otros grupos protectores básicos convencionales
35 conocidos por una persona experta en la materia.
Por lo general, la invención proporciona un método para la preparación de un derivado de fosforamidita del Monómero E.
Por lo general, el método para la preparación de los derivados de fosforamidita del Monómero E comprende, entre las etapas fundamentales, escisión de glicol en las posiciones 2’,3’, reducción del compuesto intermedio resultante, protección selectiva de O3’ y fosforilación en la posición O2’. La protección en la posición O3’ se puede realizar por ejemplo mediante sililación o acilación, o mediante una combinación tal como primero benzoilación en la posición O2’, a continuación sililación en la posición O3’, y a continuación desbenzoilación en la posición O2’. Otros grupos
45 protectores también se pueden aplicar como sería evidente para una persona experta en la materia.
Por lo general, el método para preparar componentes básicos monoméricos adecuados para la incorporación de los Monómeros como F-J, que tienen un enlace de carbono-carbono escindido en las posiciones 2’,3’ y que además portan una funcionalidad en su átomo de carbono en la posición 2’ (nomenclatura de ribonucleósidos) distinta de un grupo hidroxi, comprende entre las etapas fundamentales, comenzar a partir de un ribonucleósido (por ejemplo un ribonucleósido protegido con O5’-DMT), escisión de glicol en las posiciones 2’,3’, reducción del compuesto intermedio resultante, protección selectiva de O3’, conversión del grupo 2’-hidroxi, desprotección de O3’ y fosforilación de O3’. La protección de O3’ se puede realizar por ejemplo mediante sililación o acilación, o una combinación de la combinación de ambas tal como primero benzoilación en O2’, a continuación sililación en O3’, y a 55 continuación desbenzoilación en O2’. También se podrían aplicar otros grupos protectores como sería evidente para un experto en la materia. La conversión del grupo 2’-hidroxi en otro grupo tal como amino, amino acilado, amino alquilado, amino dialquilado, amino carbamoilado, piperazino, piperazino acilado, piperazino alquilado, piperazino carbamoilado, mercapto, mercapto acilado, mercapto alquilado, disulfuro, hidroxi acilado, hidroxi alquilado, hidroxi carbamoilado , etc., o con derivados sustituidos y/o protegidos de estos grupos, se puede realizar usando métodos y procedimientos conocidos por una persona experta en el campo de la síntesis orgánica. Tales métodos y procedimientos incluyen reacciones de sustitución en un derivado activador del grupo 2’-hidroxi o reacciones de acilación o carbamoilación. Tales métodos y procedimientos también incluyen reacciones de alquilación en O2’ y reacciones de alquilación después de inclusión de otros grupos unidos a C2’ tales como amino o mercapto. Además, otra posibilidad es la oxidación del grupo 2’-hidroxi para dar una funcionalidad aldehído, que se puede 65 modificar adicionalmente por ejemplo mediante reacción con nucleófilos, o para dar una funcionalidad carboxi, que se puede modificar adicionalmente por ejemplo mediante reacción con nucleófilos después de conversión de la
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Noveno aspecto, oligonucleótido que comprende oligonucleótidos acíclicos
5 También se desvela un oligonucleótido que comprende un monómero de nucleótido acíclico como se desvela en el presente documento. Como será evidente a partir de la descripción y la sección de ejemplos, tal oligonucleótido tiene diversos usos y ventajas. De forma sorprendente se ha encontrado que algunos oligonucleótidos que comprenden monómeros de nucleótido acíclico como se describe en el presente documento son enzimas celulares sustrato de la maquinaria de ARNi y, en algunos casos, estos oligonucleótido son incluso mejores sustratos que un
10 oligonucleótido idéntico sin monómeros de nucleótido acíclico.
Preferentemente, el monómero de nucleótido acíclico se selecciona entre el grupo que consiste en monómero E, F, G, H, I o J (véase la figura 1). Como será evidente para la persona experta, G, F, H, I y J todos se pueden preparar a partir de precursores sintéticos del monómero D. Como se indica en la figura 2, los monómeros acíclicos se
15 pueden transformar en derivados que portan grupos de conjugación tales como derivados de colesterilo, alquilo, fluoróforos, poliaminas, aminoácidos, sacáridos, polipéptidos, etc. Tales grupos de conjugación pueden ser útiles por ejemplo para mejor bioestabilidad y/o biodistribución cuando el oligonucleótido se usa para modular la actividad de los ARNm diana en células, órganos u organismos.
20 La longitud del oligonucleótido es preferentemente de 10 a 40 monómeros de nucleótido. Incluso más preferente es una longitud de 18 a 30 monómeros de nucleótido.
Por lo general, el oligonucleótido comprende menos de 5 monómeros de nucleótido acíclico. En otra realización preferente, el oligonucleótido comprende no más de 1 monómero de nucleótido acíclico por 5 monómeros de
25 nucleótido distintos de monómeros de nucleótido acíclicos. Es incluso más preferente no más de 1 monómero acíclico por 8 monómeros de nucleótido distintos de monómeros de nucleótido acíclicos. Si el número de monómero de nucleótido acíclico tiende a aumentar, la afinidad de unión del oligonucleótido de la invención con respecto a un ácido nucleico complementario se ve comprometida.
30 Por lo general, el oligonucleótido comprende de 1 a 5 monómeros de nucleótido acíclico.
Por lo general, algunos monómeros de nucleótido acíclico están solamente presentes en una o más de las posiciones 1-8 y más preferentemente en las posiciones 2-7 del oligonucleótido. Las posiciones se cuentan desde el extremo en la posición 5’ del oligonucleótido. Los monómeros de nucleótido acíclicos en estas regiones reducirán o evitarán que el oligonucleótido actúe como un microARN, ya que estas posiciones corresponden a la denominada
5 región semilla de un microARN. Esto es relevante por ejemplo cuando se pretende que el oligonucleótido funcione como la hebra guía de un ARNip.
Por lo general, todos los monómeros de nucleótido modificado con hidroximetilo en la cadena no codificante están presentes en las posiciones 9-16, en los que las posiciones se encuentran desde el extremo en la posición 5’. Incluso más preferentemente, los monómeros de nucleótido modificado con hidroximetilo en la cadena no codificante están presentes en la posición 9-11. Por lo tanto, la presencia de monómeros de nucleótido modificado con hidroximetilo en las regiones mencionadas anteriormente provocará que la cadena no codificante actúe como un microARN, es decir, asegurará que el efecto del ARNip sea mínimo y el efecto del microARN mucho más elevado. Probablemente este efecto surge de la tendencia disminución de la tendencia hacia la unión de longitud
15 completa debido a la reducción de la afinidad causada por la presencia de un monómero sustituido con hidroximetilo acíclico, por ejemplo el monómero D.
Por lo general, el oligonucleótido no comprende secuencias de ADN de más de 8 monómeros de ADN consecutivos. Una disposición más habitual es no más de 6 monómeros de ADN consecutivos o no más de 4 monómeros de ADN consecutivos. Por lo general, los monómeros de ADN consecutivos permitirán que el oligonucleótido active la RNasa H cuando se una a un ARN complementario, que conduce a degradación del ARN. En algunas circunstancias, esto no es deseable. Por lo tanto, también se desvela una realización adicional, en la que el oligonucleótido no contiene ningún monómero de ADN en absoluto.
25 En otras circunstancias, la activación de la RNasa H es deseable y es preferente que el oligonucleótido comprenda más de 4 monómeros de ADN consecutivos, más preferentemente más de 6 monómeros de ADN y lo más preferentemente más de 8 monómeros de ADN.
Por lo general, el oligonucleótido comprende más de un 50 % de monómeros de ARN. Un grado elevado de monómeros de ARN facilitará la interacción con proteínas que interactúan con ARN, por ejemplo mediante el funcionamiento como un sustrato o guía (o cofactor) para una enzima celular tal como RISC.
Por lo tanto, también se desvela una realización, en la que más de un 80 % de los monómeros del oligonucleótido son monómeros de ARN. En otra realización más, es preferente que más de un 90 % de los monómeros del
35 oligonucleótido sea monómeros de ARN.
Como será evidente, el oligonucleótido también puede comprender análogos de monómero de nucleótido. También se desvela una realización similar, en la que monómeros de nucleótido acíclico y monómeros de ARN constituyen más de un 80 % de todos los monómeros de nucleótido. En otra realización, monómeros acíclicos y monómeros de ARN constituyen más de un 90 % de todos los monómeros de nucleótido.
Cuando el oligonucleótido comprende análogos de monómero de nucleótido, es preferente que se seleccionen entre el grupo que consiste en monómeros de 2’-O-alquil-ARN, monómeros de 2’-amino-ADN, monómeros de 2’-fluoro-ADN, monómeros de LNA, monómeros de PNA, monómeros de HNA, monómeros de ANA, FANA monómeros,
45 CeNA monómeros, ENA monómeros, monómeros de ADN y monómeros de INA. Algunos análogos de nucleótido se usa normalmente para modular la afinidad de unión, aumentar la bioestabilidad y en general dar al oligonucleótido más propiedades similares a las de los fármacos.
Por lo general, el oligonucleótido comprende al menos 2 análogos de nucleótido de LNA. Los monómeros de nucleótido acíclicos por lo general disminuye la temperatura de fusión (es decir, afinidad de unión) del oligonucleótido de la invención con base emparejada con un ácido nucleico complementario y los monómeros de nucleótido de LNA se pueden usar para contrarrestar esta disminución de la temperatura de fusión. Es decir, en una realización, el número de monómeros de nucleótido acíclico es idéntico al número de LNA monómeros de nucleótido.
55 Por lo general, el oligonucleótido comprende solamente monómeros acíclicos y monómeros de ARN.
Por lo general, el oligonucleótido comprende solamente monómeros de nucleótido acíclico, monómeros de ARN, y análogos de nucleótido de LNA.
En una realización preferente, el oligonucleótido desvelado en el presente documento comprende uno o más enlace(s) seleccionados de entre el grupo que consiste en enlace de fosforotioato, enlace de boranofosfato, enlace de etilfosfonato, enlace de fosforamidata y enlace de fosfortriésteres. Los más preferentes son un enlace de fosforotioato y/o un enlace de boranofosfato. Estos enlaces aumentan la bioestabilidad del oligonucleótido iraníes se 65 ha mostrado que tienen un efecto positivo en la biodistribución del oligonucleótido. En una realización preferente, el oligonucleótido comprende más de un 50 % de los enlaces internucleótido mencionados anteriormente e incluso
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M. Petersen y J. Wengel, Trends Biotechnol. 2003, 21, 74-81
Pfundheller, Sørensen, Lomholt, Johansen, Koch y Wengel, J. "Locked Nucleic Acid Synthesis", Methods Mol. Biol. 2004, vol. 288 (Oligonucleotide Synthesis), 127-145., P. Herdewijn, Ed., Humana Press Inc. 5 Furniss, Hannaford, Smith y Tatchell, Vogel’s Textbook of Organic Chemistry, 1989, John Wiley & Sons
Bryld, Højland y Wengel, Chem. Commun. 2004, 1064
10 Mokhir, Tetzlaff, Herzberger, Mosbacher y Richart, J. Comb. Chem. 2001, 3, 374
Mangos MM, Min KL, Viazovkina E, Galarneau A, Elzagheid MI, Parniak MA, Damha MJ., J Am Chem Soc. 2003 Jan 22; 125 (3): 654-61.
15 Procedimientos experimentales y Ejemplos
Ejemplo 1. Síntesis de los complejos de ARN de la invención.
Se ha informado de procedimientos para la preparación de los componentes básicos de fosforamidita para síntesis
20 de ADN/ARN automatizada de los monómeros sustituidos con hidroximetilo de los complejos de ARN de la invención [derivados de timina; K. D. Nielsen et al., Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 1493; H. Thrane et al., Tetrahedron 1995, 51, 10389; P. Nielsen et al., Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 19]. Por favor, véase el Ejemplo 11 para divulgación de procedimientos para preparación de derivados de fosforamidita a modo de ejemplo de adenina, guanina, citosina y uracilo.
25 La incorporación de estos monómeros sustituidos con hidroximetilo en los complejos de ARN de la invención sigue procedimientos convencionales para a) síntesis de ARNm en un sintetizador de ARN automatizado, a) tratamiento de ARN, c) purificación de ARN y d) aislamiento de ARN [F. Eckstein, Oligonucleotides and Analogues, IRL Press, Oxford University Press, 1991]. Esto demuestra que los oligonucleótidos de ARN sustituidos con hidroximetilo (=
30 hebras de ARN) y complejos de ARN se pueden sintetizar usando derivados de fosforamidita conocidos usando las técnicas convencionales para síntesis de ARN.
El LNA es un oligonucleótido que contiene uno o más ribonucleótidos unidos a 2’-O,4’-C-metileno (nucleótidos de LNA) [M. Petersen y J. Wengel, Trends Biotechnol. 2003, 21, 74-81]. El ARNip modificado con LNA es una
35 construcción de ARNip que contiene uno o más monómeros de LNA. Se han usado algunos métodos conocidos para incorporar nucleótidos de LNA en los complejos de ARN de la invención mediante el uso de las fosforamiditas de LNA disponibles en el mercado [Pfundheller, Sørensen, Lomholt, Johansen, Koch y Wengel, J. "Locked Nucleic Acid Synthesis", Methods Mol. Biol. 2004, vol. 288 (Oligonucleotide Synthesis), 127-145., P. Herdewijn, Ed., Humana Press Inc.]
40 El ARNip sustituido con hidroximetilo ("ARN de interferencia pequeño sustituido con hidroximetilo) es una construcción de ARNip que contiene uno o más monómeros de nucleótido sustituido con hidroximetilo (véase la Figura 1 para estructuras del monómero de nucleótido sustituido con hidroximetilo). Los monómeros usados a modo de ejemplo se muestran a continuación:
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Monómero C (C, T) Monómero D (X) Oligonucleótidos -Cadenas no codificantes seleccionadas en construcciones
de ARNip:
ARN nativo
5’-ACU UGU GGC CGU UUA CGU CGC U
JW1103
5’-ACU UGU GGC CGU UUA CGU CGLCMeL U
JW1186
5’-ACU UGT GGC CGU UUA CGU CGLCMeL U
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completo por pocillo. Las cadenas codificante y no codificante se mezclaron en tampón de hibridación (Tris-HCl 10 mM, pH 7,3, NaCl 50 mM) a concentración 20 µM de cada una y se incubaron a 95 ºC durante 1 min y a 1 h a 37 ºC. Por pocillo en una placa de 6 pocillos, se preparó la siguiente solución: 4 µl de TransIT-TKO en 150 µl de medio de RPMI sin suero. El complejo de ARNip hibridado se añadió, se mezcló con cuidado, se incubó durante
5 20 min a TA, y se vertió sobre las células. La concentración final del complejo de ARN era 50 nM. Después de 24 h de incubación a 37 ºC, el medio se cambió y las células se incubaron durante otro periodo de 24 h a 37 ºC. Las células se retiraron mediante tripsinación y se separaron en mitades para análisis de ARN y de flujo posterior.
A medida que se consigue el silenciamiento genético (véase a continuación), se demuestra que los complejos de
10 ARN de la invención que contienen monómeros sustituidos con hidroximetilo pueden penetrar una membrana celular en condiciones convencionales de transfección.
Ejemplo 3. Silenciamiento genético
15 Procedimiento para cuantificación de ARNm y proteína. La expresión de la proteína eGFP se analizó mediante análisis de citometría de flujo. La transferencia de Western se realizó como sigue a continuación: las células se lavaron dos veces en PBS y una cantidad igual de células se lisó en tampón de muestra 2 x SDS [Dodecil-Sulfato Sódico al 4 % (SDS), glicerol al 20 %, Tris/HCl 125 mM a pH 6,8, 0,01 mg/ml de Azul de Bromofenol, 2mercaptoetanol al 10 %] a 90 ºC durante 2 x 10 min separado mediante pipeteo suave. Las proteínas se separaron
20 en un gel de SDS al 8 %-acrilamida, y se hizo una electro-transferencia durante una noche en una membrana de PVDF (Immobilon). El filtro se bloqueó durante 1 h con PBS que contenía leche al 10 % en p/v. La proteína EGFP se detectó usando una dilución a 1:1000 de un anticuerpo EGFP policlonal de conejo (Santa Cruz Biotechnology). El anticuerpo hnRNP C1 de ratón fue un obsequio de Seraphin Pinol-Roma. Un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (hrp) (DAKO) se usó con el reactivo de ECL (Amersham Biosciences) para
25 visualización. El ARNm de eGFP se analizó mediante transferencia de Northern de acuerdo con procedimientos convencionales.
El siguiente es un listado con resultados de experimentos de silenciamiento genéticos realizados a una concentración de complejo de ARNip de 50 mM. Los resultados se proporcionan en porcentajes relativos al nivel de
30 expresión genética obtenida con un control dúplex de ARNip de control con falta de coincidencias (establecido en un 100 %):
Entrada Codificante / No codificante GFP Medio ARNm de EGFP
1 ARN/ ARN 13% 16%
2 JW1104 / JW1103 13 % 28 %
3 JW1188 / JW1103 7 % 13 %
4 JW1189 / JW1103 6 % 15 %
5 W043 / JW1103 ~13 %
6 W044 / JW1103 ~19 %
7 JW1104 / JW1186 22 % 31 %
8 JW1104 / JW1187 62 % 90 %
9 W131 / W127 27 %
10 W132 / W128 86%
11 W131 / W128 68%
12 W132 / W127 47%
13 W129 / JW1103 36 %
14 W130 / JW1103 39 %
15 JW1106 / W123 24 %
16 JW1106 / W127 51 %
17 JW1106 / W125 34 %
18 JW1106 / W126 22 %
La entrada 1 muestra que el complejo de ARNip sin modificar está silenciando de forma eficaz del gen GFP.
35 La entrada 2 muestra que un complejo de ARNip modificado con LNA está silenciando de forma eficaz del gen GFP.
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conversión del grupo hidroxi del sustituyente de hidroximetilo en un buen grupo saliente por ejemplo mediante mesilación o transformación en un haluro, y posterior unión nucleófila mediante un derivado alquiltiol o tioalcóxido. Si el nucleófilo alternativo es SH-, la protección por ejemplo mediante acetilación conduce a un derivado de fosforamidita que es útil a la introducción de grupos mercapto (SH) en los complejos de ARN de la invención. Como
5 un procedimiento alternativo para introducir una funcionalidad mercapto en los complejos de ARN se puede usar la conjugación con un resto que contiene disulfuro. Después de reducción del complejo de ARN contiene disulfuro se obtiene el complejo de ARN funcionalizado con el grupo mercapto.
Derivatización en un grupo aminometilo. El sustituyente hidroximetilo de los monómeros sustituidos con hidroximetilo de la invención se puede convertir en un grupo aminometilo. Esta reacción implica la conversión del grupo hidroxi del sustituyente de hidroximetilo en un buen grupo saliente por ejemplo mediante mesilación o transformación en un haluro, y posterior unión nucleófila con amoniaco o un derivado de amina protegida (como por ejemplo ftalimida) que posteriormente se desprotege (por ejemplo después de síntesis de ARN) para dar el derivado amino deseado. Un grupo protector de trifluoroacetilo o Fmoc son otras opciones para protección de amino durante
15 la síntesis de ARN automatizada, con liberación de un grupo amino libre después de desprotección convencional de oligonucleótido.
Conjugación a través de una enlace amida. El sustituyente hidroximetilo de los monómeros sustituidos con hidroximetilo de la invención actúa como un asa para unión de grupos de conjugación unidos a amida. Esto implica la conversión de la unidad hidroxi del sustituyente de hidroximetilo en una unidad de amina, por ejemplo como se ha descrito anteriormente, y posterior derivatización de este grupo amino por ejemplo con un grupo de conjugación a través de formación de enlace amida usando métodos conocidos. Esto se puede producir antes de la síntesis de ARN o después de la síntesis de ARN usando métodos conocidos por una persona experta en la materia [Bryld, Højland y Wengel, Chem. Commun. 2004, 1064; Mokhir, Tetzlaff, Herzberger, Mosbacher y Richart, J. Comb.
25 Chem. 2001, 3, 374].
Conjugación a través de un enlace amino. El sustituyente hidroximetilo de los monómeros sustituidos con hidroximetilo de la invención también está actuando como un asa para unión de grupos de conjugación unidos a amino. Esto implica la conversión de la unidad hidroxi del sustituyente de hidroximetilo en una unidad de amina, por ejemplo como se ha descrito anteriormente, y posterior derivatización de este grupo amino con un grupo de conjugación que contiene por ejemplo una funcionalidad aldehído mediante una reacción de aminación reductora que es una reacción conocida [Furniss, Hannaford, Smith y Tatchell, Textbook of Organic Chemistry de Vogel, 1989, John Wiley & Sons]. Esto se puede producir antes de la síntesis de ARN o después de la síntesis de ARN.
35 Conjugación a través de un grupo piperazino o un grupo diamino alquilo lineal. Un grupo piperazino o un grupo diamino alquilo lineal también se usa para derivatización mediante realización de reacciones como se describe [Bryld, Højland y Wengel, Chem. Commun. 2004, 1064-5]. Estos grupos serán útiles, ya que otros grupos de conjugación se pueden unir por ejemplo en el átomo de nitrógeno distal de un grupo piperazino (véase la Figura 2, Monómero J) por ejemplo mediante formación de enlace amida o mediante una reacción de aminación reductora, ya sea antes o después de la síntesis de oligonucleótido de ARN [Bryld, Højland y Wengel, Chem. Commun. 2004, 1064; Mokhir, Tetzlaff, Herzberger, Mosbacher y Richart, J. Comb. Chem. 2001, 3, 374]. Por ejemplo, de este modo algunas unidades de colesterol o ácido graso se pueden unir a los complejos de ARN de la invención a través de un sustituyente de piperazino-metilo.
45 Usando estos procedimientos, se pueden preparar los complejos de ARN de la invención que contienen por ejemplo unidades de colesterilo, unidades de alquilo, unidades de ácido graso, derivados de poliamina, derivados tio, aminoácidos, polipéptidos, derivados de monosacárido, derivados de polisacárido o fluoróforos, todos conectados a los complejos de ARN de la invención a través del grupo metileno del sustituyente de hidroximetilo. Los grupos enumerados en esta parte son solamente ejemplos de grupos que se pueden unir usando los procedimientos usados anteriormente a modo de ejemplo. Véase la Figura 2 para ejemplos estructurales de los monómeros conjugados.
Ejemplo 7. Silenciamiento genético con los complejos de ARN de la invención que contienen monómeros de hidroximetilo funcionalizados y conjugados.
55 El silenciamiento genético es eficaz con los complejos de ARN de la invención que contienen los monómeros de hidroximetilo funcionalizados y conjugados (véase por ejemplo la Figura 2 o el Ejemplo 6).
El silenciamiento genético eficaz se consigue cuando estos monómeros de hidroximetilo funcionalizados y conjugados se colocan en o cerca de los extremos en la posición 3’ de las dos hebras de un complejo de ARNip.
El silenciamiento genético eficaz se consigue adicionalmente cuando estos monómeros de hidroximetilo funcionalizados y conjugados se colocan en o cerca del extremo en la posición 3’ y el extremo en la posición 5’ de la cadena codificante de un complejo de ARNip.
65 El silenciamiento genético eficaz se consigue en particular cuando estos monómeros de hidroximetilo
funcionalizados y conjugados se colocan en o cerca del extremo en la posición 3’ de la cadena codificante de un complejo de ARNip.
El silenciamiento genético eficaz se consigue adicionalmente cuando estos monómeros de hidroximetilo
5 funcionalizados y conjugados se colocan en un oligonucleótido de ARN de cadena no codificante de una sola hebra. La modulación de las propiedades farmacocinéticas se consigue junto con silenciamiento genético eficaz cuando el grupo (R en la Figura 2) de un complejo de ARN de la invención es un derivado de colesterilo. Esto conduce por ejemplo a la mejora de la distribución tisular y absorción celular, y también al aumento de la bioestabilidad.
La modulación de las propiedades farmacocinéticas se consigue junto con silenciamiento genético eficaz cuando el grupo (R en la Figura 2) de un complejo de ARN de la invención es un derivado tio. Esto conduce a un aumento del tiempo de circulación en un cuerpo humano, es decir, reducción de la eliminación a través de los riñones.
La modulación de las propiedades farmacocinéticas se consigue junto con silenciamiento genético eficaz cuando el
15 grupo (R en la Figura 2) de un complejo de ARN de la invención contiene un grupo amino. Esto conduce a mejora de la distribución tisular.
Ejemplo 8. Bioestabilidad de los complejos de ARN sustituidos con hidroximetilo.
Procedimiento experimental para el ensayo de estabilidad. Los complejos de ARN sustituidos con hidroximetilo se incubaron a 37 ºC en suero bovino fetal al 10 % (Gibco) diluido en D-MEM (Gibco). Las muestras de 5 µl se recogieron en los puntos temporales indicados y se congelaron inmediatamente en hielo seco en 15 µl de 1,33 x TBE/tampón de carga de glicerol al 10 % y se sometieron a PAGE no desnaturalizante en un gel al 15 %. Los ARN se visualizaron con oro SYBR (Invitrogen).
25 Tales experimentos muestran que la estabilidad de los complejos de ARN sustituidos con hidroximetilo presentan mejora de la estabilidad en medios biológicos con respecto a los complejos de ARN de control nativos (o "no modificados"). Por lo tanto, los ARNip sustituidos con hidroximetilo son significativamente más estables en suero al 10 % que el ARNip habitual. Por lo tanto, se puede prever que solamente se observe una disminución muy pequeña del tamaño del ARNip sustituido con hidroximetilo durante un periodo de incubación de más de una hora de duración. Los inventores concluyen que los complejos de ARN de la invención que contienen monómeros sustituidos con hidroximetilo son muy estables en células, en animales y en seres humanos, y que esta característica está contribuyendo a sus propiedades de silenciamiento genético muy eficaces. Debido a esta bioestabilidad pronunciada, los complejos de ARN de la invención que contienen monómeros sustituidos con
35 hidroximetilo presentan silenciamiento genético durante un periodo de tiempo mayor que homólogos sin modificar.
Ejemplo 9. Una serie de experimentos de silenciamiento genético demuestran el fuerte potencial de losmonómeros de estructura D para silenciamiento genético.
Usando procedimientos descritos en los experimentos anteriores, se desarrollan estudios de silenciamiento genético usando dúplex de ARNip de las secuencias descritas anteriormente así como de secuencias adicionales (véanse las Figuras 4-9 para las secuencias incluidas en los estudios de este ejemplo). Estos experimentos incluían secuencias que contienen una o más incorporaciones del monómero X (véase el Ejemplo 1 para descripción del monómero X). El Monómero X se usa en el presente documento solamente como una estructura a modo de ejemplo
45 y resultados similares se predicen para derivados tales como por ejemplo el monómero E, monómero F, monómero G, monómero I y monómero J (véase la Figura 1 y la Figura 2). Los monómeros con letra en negrita y subrayada
CMeL
con un superíndice L son monómeros de LNA. En este ejemplo, en las Figuras 4-9 están incluidos CL = = monómero de LNA de 5-metilcitosin-1-ilo.
Todos los experimentos para los que se representan los resultados en la Figura 4 implican a la cadena codificante que tiene dos incorporaciones de monómero X (W130). Se muestra que:
-es posible diseñar un dúplex de ARNip formado por hebras que contienen monómeros tanto sustituidos con hidroximetilo como de LNA que presenta funcionalidad de silenciamiento genético; 55 -es posible diseñar un dúplex de ARNip formado por una hebra que tiene un monómero X con falta de coincidencias en la cadena codificante que presenta funcionalidad de silenciamiento genético; -la cadena no codificante de ARN completo (excepto para dos monómeros de LNA hacia el extremo en la
posición 3’) se tolera bien; -un solo monómero X se tolera bien en la cadena no codificante (W123, W125 o W126); -varios monómeros X se toleran pero se observa un silenciamiento genético menos eficaz con W186 y W187
que con W123, W125 o W126 como cadena no codificante;
-se observa actividad significativa de silenciamiento genético con W188 aunque esta cadena no codificante contiene seis monómeros de LNA que muestra que un monómero X colocado centralmente en una cadena no codificante es capaz de mejorar el silenciamiento genético con respecto a la situación en la que el monómero X
65 está sustituido con el monómero de ARN correspondiente.
Todos los experimentos para los que se representan los resultados en la Figura 5 implican a la cadena codificante que tiene un monómero X situado hacia el extremo en la posición 3’ de la hebra (W131). Se muestra que:
-la cadena no codificante de ARN completo (excepto para dos monómeros de LNA hacia el extremo en la
5 posición 3’) se tolera bien; -un solo monómero X se puede tolerar bien en la cadena no codificante (W123); -un solo monómero X podría conducir a un silenciamiento genético tan bueno o incluso mejorado con respecto al
del control sin modificar (ARNip-EGFP) (W125 o W126); -varios monómeros X se toleran bastante bien (W186, W187 o W281 como cadena no codificante); -se observa actividad significativa de silenciamiento genético con W188 aunque esta cadena no codificante
contiene seis monómeros de LNA que muestra que un monómero X colocado centralmente en una cadena no codificante es capaz de mejorar el silenciamiento genético con respecto a la situación en la que el monómero X está sustituido con el monómero de ARN correspondiente;
-se observa silenciamiento genético significativo con varias sustituciones del monómero X en la cadena no 15 codificante en una situación sin la copresencia de monómeros de LNA (W281).
Todos los experimentos para los que se representan los resultados en la Figura 6 implican a la cadena codificante que tiene tres monómeros X dispersos a lo largo de la cadena codificante (W282). Se muestra que:
-la cadena no codificante de ARN completo (excepto para dos monómeros de LNA hacia el extremo en la posición 3’) se tolera bien;
-un solo monómero X se puede tolerar bien en la cadena no codificante, lo más aparentemente hacia el extremo en la posición 3’ por lo que se observó un silenciamiento genético bueno o incluso mejorado con respecto al del control sin modificar (ARNip-EGFP) (W123, W125, W126);
25 - varios monómeros X se toleran bastante bien (W186, W187 o W281 como cadena no codificante);
-se observa actividad significativa de silenciamiento genético con W188 aunque esta cadena no codificante contiene seis monómeros de LNA que muestra que un monómero X colocado centralmente en una cadena no codificante es capaz de mejorar el silenciamiento genético con respecto a la situación en la que el monómero X está sustituido con el monómero de ARN correspondiente, y que también cuando la cadena codificante contiene varios monómeros X;
-también se observa silenciamiento genético con varias sustituciones del monómero X en la cadena no codificante en una situación sin la copresencia de monómeros de LNA (W281).
Todos los experimentos para los que se representan los resultados en la Figura 7 implican a la cadena codificante 35 sin el monómero X (W194). Se muestra que:
-un solo monómero X se puede tolerar bien en la cadena no codificante (W123); -un solo monómero X podría conducir a un silenciamiento genético tan bueno o incluso mejorado con respecto al
del control sin modificar (ARNip-EGFP) (W125 o W126); -varios monómeros X se toleran bastante bien (W186, W187 o W281 como cadena no codificante); -se observa actividad significativa de silenciamiento genético con W188 aunque esta cadena no codificante
contiene seis monómeros de LNA que muestra que un monómero X colocado centralmente en una cadena no codificante es capaz de mejorar el silenciamiento genético con respecto a la situación en la que el monómero X está sustituido con el monómero de ARN correspondiente;
45 -también se observa silenciamiento genético significativo con varias sustituciones del monómero X en la cadena no codificante en una situación sin la copresencia de monómeros de LNA (W281).
Todos los experimentos para los que se representan los resultados en la Figura 8 implican a la cadena codificante sin el monómero X (W181) pero con cuatro monómeros de LNA incorporados en el segmento que forma dúplex (más dos monómeros de LNA en el extremo la posición 3’). Se muestra que:
-un solo monómero X se tolera bien en la cadena no codificante (W123, W125 o W126); -varios monómeros X se toleran bastante bien (W186, W187 o W281 como cadena no codificante); -se observa actividad significativa de silenciamiento genético con W188 aunque esta cadena no codificante
55 contiene seis monómeros de LNA que muestra que un monómero X colocado centralmente en una cadena no codificante es capaz de mejorar el silenciamiento genético con respecto a la situación en la que el monómero X está sustituido con el monómero de ARN correspondiente;
-se observa silenciamiento genético significativo con varias sustituciones del monómero X en la cadena no codificante también en una situación sin la copresencia de monómeros de LNA (W281).
Todos los experimentos para los que se representan los resultados en la Figura 9 implican a la cadena codificante que tiene un monómero X situado hacia el extremo la posición 5’ de la hebra (W129). Se muestra que:
-la cadena no codificante de ARN completo (excepto para dos monómeros de LNA hacia el extremo en la 65 posición 3’) se tolera bien; -un solo monómero X se puede tolerar bien en la cadena no codificante y podría conducir a una mejora del
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