JPWO2005054463A1 - レトロトランスポゾンを用いた哺乳動物のゲノム改変技術の開発 - Google Patents

レトロトランスポゾンを用いた哺乳動物のゲノム改変技術の開発 Download PDF

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Abstract

本発明は、ゲノムにおいて網羅的な改変を行うことができるように、より効率よいコピー＆ペースト型の転位系を開発することを課題とする。上記課題は、−部分的には、ＬＴＲ型レトロトランスポゾンが転位系において使用することができることを見出したことによって解決される。本発明は、トランスポゾンを用いて外来遺伝子を効率よく細胞に導入する技術に関する。より詳細には、完全なＩＡＰエレメントおよび機能するプロモーター配列を見出し、それらを組み合わせたことによって、初めてレトロトランスポゾンが機能することを検出することができたことによって解決される。

Description

本発明は、細胞に外来核酸分子を導入するためおよびゲノムを改変するためのシステム、キット、組成物に関する。本発明はさらに、トランスジェニック生物の作製およびそのための組成物、キット、システムなどに関する。以下に発明の詳細な説明を記載する。
トランスジェニック生物は、その応用の範囲の広さから、現在非常に注目されている技術である。しかし、効率よくトランスジェニック生物を作製する方法は、それほど開発されておらず、そのようなトランスジェニック生物の効率よい作製方法の開発は注目されている。
最近、トランスポゾンがトランスジェニック生物の作製に応用することが試みられている。トランスポゾン（または、転位可能（ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ）エレメントとも呼ばれる）は、反復配列が並んだ核酸分子または配列である。転位はカット＆ペースト形式により行われるとされるＤＮＡ型およびコピー＆ペースト型とされるＲＮＡ型（レトロトランスポゾンともいう）によって生じる。トランスポザーゼは、ある核酸分子への別の核酸の挿入を促進する酵素である。通常、トランスポザーゼは、トランスポゾンの中にある。
ＤＮＡ型トランスポゾンは、比較的広範な範囲の生物から見出されており、その現象は普遍的であると考えられている。転位はカット＆ペースト形式により行われるとされるＤＮＡ型およびコピー＆ペースト型とされるＲＮＡ型（レトロトランスポゾンともいう）によって生じる。脊椎動物でもトランスポゾンが発見されており（Ｒａｄｉｃｅ，Ａ．Ｄ．ら、１９９４．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４４，６０６−６１２）、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ、ｈＡＴ（ｈｏｂｏ／Ａｃ／Ｔａｍ）などのスーパーファミリーに属するＤＮＡ型トランスポゾンが種々の生物（例えば、魚類、両生類、哺乳動物を含む）（Ｏｏｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．、１９９５．Ｎａｔｕｒｅ ３７８，８７３；Ｉｖｉｃｓ ｅｔ ａｌ．、１９９５．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４７，３１２−３２２；Ｋｏｇａ ｅｔ ａｌ．、１９９６．Ｎａｔｕｒｅ ３８３，３０；Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．、１９９６．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５７，３５９−３６６、およびＬａｍ，Ｗ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３，１０８７０−１０８７５）および植物（Ｏｓｂｏｒｎｅ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ，１９９５ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７，４０６−４１３）から同定されている。トランスポザーゼは、ＤＮＡ型トランスポゾンのもとあった位置からの切除および再組み込みを触媒または促進する酵素であり、通常はＤＮＡ型トランスポゾンの中にあることが知られている（Ｐｌａｓｔｅｒｋ，ＲＨＡ．，１９９９、ＴＩＧ １５：３２６−３３２；Ｐｌａｓｔｅｒｋ ＲＨＡ．，１９９６ Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０４，１２５−１４３）。ＤＮＡ型トランスポゾンの自律メンバーは、トランス作用性因子である活性トランスポザーゼを発現することができることから、自分自身が転位可能であるという性質も有する。非自律エレメントは、シス作用性因子であり得、この場合逆方向末端反復配列とも呼ばれる。一部の逆方向反復配列は、１または複数の直列反復配列を含む。このような配列は、末端逆方向反復配列（ＩＲｓ）中に埋め込まれており、相補性トランスポザーセの存在下で別のエレメントからの移動に用いられ得る。
ＤＮＡを細胞に導入するための方法は知られており、例えば、ＤＮＡ凝縮試薬（例えばリン酸カルシウム、ポリエチレングリコール等）、脂質含有試薬（例えばリポソーム、多重層小胞体など）およびウィルス媒介法などがある。これらの方法は全てそれ自身の制約をもつ。例えば、ＤＮＡ凝縮試薬およびウィルス媒介法には、サイズが限定されるという欠点がある。核酸量もまた制約される。導入核酸の組み込みの促進もまた効率がよいというわけではない。
細胞にＤＮＡを導入するための新しい方法、特に細胞の核酸の中への様々なサイズの核酸フラグメントの効率的な組込み、特に細胞のゲノムへのＤＮＡの組込みを促進する方法のニーズが残っている。ＤＮＡ型のトランスポゾンでの転位系の開発もまた進められているが、この場合のトランスポゾン転位頻度は、該遺伝子が導入された肝臓細胞中わずか約５−６％であり、この方法では遺伝子導入の効率が悪く、系統的にトランスジェニック動物を得ることもできない。また、これまでの方法では、１動物個体の体内で数多くの遺伝子にランダムに変異を導入することが困難であり、その発現頻度も低いものであった。従って、遺伝子変異誘発のための一般的な方法を設計する必要があった。
しかし、上述のようなＤＮＡ型のトランスポゾンは、転位前の部位近傍に転位が集中する傾向があり、カット＆ペーストというメカニズムの特性上、各細胞において転位前のトランスポゾンのコピー数には転位を増加させることはできない。
他方で、ＲＮＡ型であるレトロトランスポゾンもまた注目されつつある。ＲＮＡ型は、転位前の部位に転位場所が依存せず、ゲノムの広範囲に転位することが理解される。したがって、ゲノムの網羅的な改変を目的とする場合には都合がよい。また、コピー＆ペーストというメカニズムの特性上、転位前の配列がコピーされて転位されることから、転位の数が転位前のコピー数以上に増加することも可能である。
これまでに、ＬＩＮＥ１を用いたベクターを用いて、レトロトランスポゾンでの転位系の開発が試みられている（非特許文献１、特許文献１および２）。しかし、ＬＩＮＥ１を用いた系では、ゲノムへの転位配列の挿入の際に、ベクターの欠失が高頻度に伴うことから、応用範囲に限界があるという問題がある。
レトロトランスポゾンには、ＬＴＲ型というカテゴリーがあり、その中でもｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ Ａ ｐａｒｔｉｃｌｅ（ＩＡＰ）と呼ばれる分類のレトロトランスポゾンある（非特許文献２）。従来用いられていたＩＡＰベクターは、転位に必要な遺伝子に欠失があり、完全なレトロトランスポゾンを含むベクターとして作製されたものがなく、したがって、転位頻度が低く、転位の制御が困難であるという欠点が存在した（非特許文献２）。
Ｏｓｔｅｒｔａｇ，Ｅ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．３２，６５５−６６０，２００２ Ｈｅｉｄｍａｎｎ Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６４，１５９−１７０，１９９１ 米国特許第６１５０１６０号 米国特許出願２００３−０１２１０６３号
本発明は、ゲノムにおいて網羅的な改変を行うことができるように、より効率よいコピー＆ペースト型の転位系を開発することを課題とする。本発明はさらに、レトロトランスポゾンの転位活性を容易に観察することができる系を開発することを課題とする。
上記課題は、上記状況にかんがみ、鋭意研究を重ねた結果、部分的には、ＬＴＲ型レトロトランスポゾンが転位系において使用することができることを見出したことによって解決される。本発明はまた、特定のプロモーターを挿入することによってＬＴＲ型トランスポゾンの転位活性を見ることができる系を開発したことによって上記課題の一部を解決した。
本発明は、トランスポゾンを用いて外来遺伝子を効率よく細胞に導入する技術に関する。より詳細には、完全なＩＡＰエレメントおよび機能するプロモーター配列を見出し、それらを組み合わせたことによって、初めてレトロトランスポゾンが機能することを検出することができたことによって解決される。

従って、本発明は、以下を提供する。
（１）ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、単離された核酸構築物。
（２）上記ＬＴＲ型レトロトランスポゾンは、Ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ Ａ ｐａｒｔｉｃｌｅ（ＩＡＰ）型レトロトランスポゾンを含む、項目１に記載の核酸構築物。
（３）上記レトロトランスポゾンは、完全長ＩＡＰエレメントを含む、項目１に記載の核酸構築物。
（４）上記レトロトランスポゾンは、コードするポリペプチドが機能性である、項目１に記載の核酸構築物。
（５）上記機能は、転写活性、逆転写活性およびインテグラーゼ活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を含む、項目１に記載の核酸構築物。
（６）上記レトロトランスポゾンは、ＩＡＰエレメントであり、ＬＴＲ、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｔＲＮＡ結合部位からなる群より選択される少なくとも１つのドメインが配列番号１に対して保存された、項目１に記載の核酸構築物。
（７）上記レトロトランスポゾンは、動物のものである、項目１に記載の核酸構築物。
（８）上記レトロトランスポゾンは、哺乳動物のものである、項目１に記載の核酸構築物。
（９）上記レトロトランスポゾンは、げっ歯類または霊長類のものである、項目１に記載の核酸構築物。
（１０）上記レトロトランスポゾンは、マウスのものである、項目１に記載の核酸構築物。
（１１）上記レトロトランスポゾンは、、ＩＡＰエレメントであり、その核酸配列において、５’側のＬＴＲ直下にあるｔＲＮＡ結合部位において、ｔｃｃｇｇｇａｃｇａｇａａａａの配列が反復していること、およびＲ領域のｔｔｇｃｔｔｃｔｔｇｃｔｃｔｃからなる反復配列を２以上含むことからなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する、項目１に記載の核酸構築物。
（１２）上記レトロトランスポゾンは、
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２または３および４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２または３および４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２または３および４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含む、項目１に記載の核酸構築物。
（１３）上記レトロトランスポゾンをコードする核酸配列は、配列番号１を含む、項目１に記載の核酸構築物。
（１４）さらに、プロモーター配列を含む、項目１に記載の核酸構築物。
（１５）上記プロモーター配列は、ルシフェラーゼアッセイ（インビトロ系）でみたときに、０．１ｒｌｕ以上の活性を有する、項目１４に記載の核酸構築物。
（１６）上記プロモーター配列は、ＣＭＶ、ＣＡおよびその改変体からなる群より選択される、項目１４に記載の核酸構築物。
（１７）上記プロモーター配列は、上記ＬＴＲ型レトロトランスポゾンにおける５’ＬＴＲの一部と置き換えられる、項目１４に記載の核酸構築物。
（１８）上記プロモーター配列は、上記ＬＴＲ型レトロトランスポゾンにおける上記５’ＬＴＲのうちＵ３領域の全部または一部と置き換えられる、項目１７に記載の核酸構築物。
（１９）上記プロモーター配列は、上記レトロトランスポゾンに作動可能に連結される、項目１４に記載の核酸構築物。
（２０）上記プロモーター配列は、その転写開始部位が上記レトロトランスポゾンの転写開始部位に一致するよう（インフレーム）に配置される、項目１４に記載の核酸構築物。
ここで、上記プロモーター配列は、配列番号５〜７のいずれか１つに示される核酸配列、またはその一部もしくは改変体であり得、好ましくは、配列番号６または７に示される核酸配列からなる。
（２１）さらに、外来遺伝子をコードする配列を含む、項目１に記載の核酸構築物。
（２２）上記外来遺伝子をコードする配列は、上記レトロトランスポゾン内に配置される、項目２１に記載の核酸構築物。
（２３）上記外来遺伝子は、識別可能な特性を宿主に付与する、項目２１に記載の核酸構築物。
（２４）上記識別可能な特性は、抗生物質耐性、栄養補充性、酵素活性および蛍光からなる群より選択される、項目２３に記載の核酸構築物。
（２５）上記外来遺伝子は、ｎｅｏ、ＧＦＰ、ｈｙｇ、ｐｕｒｏ、ｚｅｏ、ｂｓｒ、ｌａｉｔ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰおよびｈｒＧＦＰからなる群より選択される、項目２１に記載の核酸構築物。
（２６）上記外来遺伝子は、転写、逆転写およびゲノムへの挿入の過程を経ることによって初めて発現されるように構成される、項目２１に記載の核酸構築物。
（２７）上記外来遺伝子は、イントロン配列を含む、項目２１に記載の核酸構築物。
（２８）上記イントロン配列は、上記レトロトランスポゾンとは同一の転写方向（フォワード）に配置される、項目２７に記載の核酸構築物。
（２９）上記イントロン配列は、スプライスドナー配列およびスプライスアクセプター配列によって挟まれる、項目２７に記載の核酸構築物。
（３０）上記核酸構築物は、ゲノムの改変のためのものである、項目１に記載の核酸構築物。
（３１）上記核酸構築物は、上記レトロトランスポゾンが転位能力を有するか否かを確認するためのものである、項目１５に記載の核酸構築物。
（３２）上記核酸構築物は、上記外来遺伝子を転位させるためのものである、項目２１に記載の核酸構築物。
（３３）上記核酸構築物は、上記外来遺伝子を宿主内に導入するために使用される、項目２１に記載の核酸構築物。
（３４）上記宿主は、真核生物を含む、項目３３に記載の核酸構築物。
（３５）上記宿主は、哺乳動物を含む、項目３３に記載の核酸構築物。
（３６）上記宿主は、げっ歯類または霊長類を含む、項目３３に記載の核酸構築物。
（３７）上記宿主は、マウスである、項目３３に記載の核酸構築物。
（３８）項目１〜３７のいずれか１項に記載の核酸構築物を含む、ベクター。
（３９）項目１〜３７のいずれか１項に記載の核酸構築物、およびキャリアを含む、組成物。
（４０）項目１〜３７のいずれか１項に記載の核酸構築物を含む、細胞。
（４１）項目１〜３７のいずれか１項に記載の核酸構築物を含む、生物またはその一部。
（４２）細胞内のゲノムを改変するための方法であって、
Ａ）ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、核酸構築物を提供する工程；
Ｂ）上記細胞に、上記核酸構築物を導入する工程；
Ｃ）上記細胞を所定の期間培養する工程；
Ｄ）上記核酸構築物によりゲノムが改変された細胞を選択する工程、
を包含する、方法。
（４３）上記核酸構築物は、ルシフェラーゼアッセイ（インビトロ系）でみたときに、０．１ｒｌｕ以上の活性を有するプロモーターをさらに含み、上記所定の期間は転写、逆転写およびゲノムへの挿入が行われるに十分な期間である、項目４２に記載の方法。
（４４）上記プロモーター配列は、その転写開始部位が上記レトロトランスポゾンの転写開始部位に一致するよう（インフレーム）に配置される、項目４２に記載の方法。
（４５）上記核酸構築物は、上記レトロトランスポゾン内に作動可能に配置される外来遺伝子を含み、上記選択は、上記外来遺伝子の発現により行われる、項目４２に記載の方法。
（４６）上記外来遺伝子は、上記レトロトランスポゾンの転写方向とは逆方向（リバース）に配置され、スプライスドナー配列およびスプライスアクセプター配列ならびにそれらに挟まれシスに配置されるイントロン配列を含み、上記所定の期間は、転写、逆転写およびゲノムへの挿入が行われるに十分な期間であり、上記選択は、上記外来遺伝子の発現により行われる、項目４２に記載の方法。
（４７）上記外来遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子、栄養補充因子、酵素および蛍光物質からなる群より選択される因子をコードし、上記選択は、上記因子によって発現される上記細胞の特性によって行われる、項目４６に記載の方法。
（４８）上記ＬＴＲレトロトランスポゾンは、ＩＡＰエレメントを含む、項目４２に記載の方法。
（４９）上記ＬＴＲレトロトランスポゾンは、完全長ＩＡＰエレメントを含む、項目４２に記載の方法。
（５０）上記選択は、ライゲーション媒介ＰＣＲによって転位された配列を確認することによって行われる、項目４２に記載の方法。
（５１）上記導入は、トランスフェクション、形質転換および形質導入からなる群より選択される形態を含む、項目４２に記載の方法。
（５２）上記導入は、カチオン性脂質およびポリアミン系試薬からなる群より選択される少なくとも１種の物質の存在下で行われる、項目４２に記載の方法。
（５３）上記細胞は、真核生物を含む、項目４２に記載の方法。
（５４）上記細胞は、哺乳動物を含む、項目４２に記載の方法。
（５５）上記細胞は、げっ歯類または霊長類を含む、項目４２に記載の方法。
（５６）上記レトロトランスポゾンは、真核生物細胞に由来する、項目４２に記載の方法。
（５７）上記レトロトランスポゾンは、哺乳動物に由来する、項目４２に記載の方法。
（５８）上記レトロトランスポゾンは、げっ歯類または霊長類に由来する、項目４２に記載の方法。
（５９）上記細胞と、上記レトロトランスポゾンの天然の宿主は、同一種である、項目４２に記載の方法。
（６０）上記細胞と、上記レトロトランスポゾンの天然の宿主は、異種である、項目４２に記載の方法。
（６１）レトロトランスポゾンの転位活性を検定するための方法であって、
Ａ）検定すべきレトロトランスポゾンをコードする核酸配列、およびルシフェラーゼアッセイ（インビトロ系）でみたときに、０．１ｒｌｕ以上の活性を有するプロモーター配列を含む核酸構築物を提供する工程；
Ｂ）上記細胞に、上記核酸構築物を導入する工程；
Ｃ）上記細胞を所定の期間培養する工程；および
Ｄ）上記核酸構築物による転位を検出する工程、
を包含する、方法。
（６２）上記検出は、ライゲーション媒介ＰＣＲ工程を包含する、項目６１に記載の方法。
（６３）上記検出は、ゲノムデータベースとライゲーション媒介ＰＣＲによって得られた配列を比較する工程を包含する、項目６１に記載の方法。
（６４）トランスジェニック生物を作製するための方法であって、
Ａ）ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、核酸構築物を提供する工程；
Ｂ）上記核酸構築物を、所望の生物の生殖細胞に導入する工程；
Ｃ）上記生殖細胞においてゲノムが改変された生殖細胞を選択する工程；および
Ｄ）ゲノムが改変された上記生殖細胞を用いて生物を再生する工程、
を包含する、方法。
（６５）細胞内のゲノムを改変するためのキットであって、
Ａ）ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、核酸構築物；
Ｂ）細胞に核酸構築物を導入するための手段；および
Ｃ）核酸構築物によりゲノムが改変された細胞を選択する手段、
を備える、キット。
（６６）上記細胞に核酸構築物を導入するための手段は、トランスフェクション試薬を含む、項目６５に記載のキット。
（６７）上記トランスフェクション試薬は、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬およびリン酸カルシウムからなる群より選択される、項目６６に記載のキット。
（６８）上記トランスフェクション試薬は、カチオン性脂質およびポリアミン系試薬からなる群より選択される少なくとも１種の物質を含む、項目６６に記載のキット。
（６９）上記選択手段は、ＰＣＲプライマー、抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質、栄養補充因子、酵素基質および蛍光物質に対応する検知手段からなる群より選択される少なくとも１つの手段を含む、項目６５に記載のキット。
（７０）レトロトランスポゾンの転位活性を検定するためのキットであって、
Ａ）ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードする核酸配列、およびルシフェラーゼアッセイ（インビトロ系）でみたときに、０．１ｒｌｕ以上の活性を有するプロモーター配列を含む核酸構築物；
Ｂ）上記細胞に核酸構築物を導入する手段；および
Ｃ）上記核酸構築物による転位を検出する手段、
を備える、キット。
（７１）上記検出手段は、ＰＣＲプライマー、抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質、栄養補充因子、酵素基質および蛍光物質に対応する検知手段からなる群より選択される少なくとも１つの手段を含む、項目７０に記載のキット。
（７２）トランスジェニック生物を作製するためのキットであって、
Ａ）ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、核酸構築物；
Ｂ）上記核酸構築物を所望の生物の生殖細胞に導入する手段；
Ｃ）上記生殖細胞においてゲノムが改変された生殖細胞を選択する手段；および
Ｄ）ゲノムが改変された上記生殖細胞を用いて生物を再生する手段、
を備える、キット。
（７３）上記生物を再生する手段は、仮親となる生物体を含む、項目７２に記載のキット。
（７４）サイトメガロウイルスエンハンサーおよびトリβアクチンプロモーターを含み、上記サイトメガロウイルスエンハンサーおよび上記トリβアクチンプロモーターの少なくとも一方は、天然の全長配列よりも短い配列を含む、プロモーター。
（７５）上記短い配列は、転写開始部位より下流の配列が削られていることに起因する、項目７４に記載のプロモーター。
（７６）転写開始部位より下流の配列が全部削られている、項目７４に記載のプロモーター。
（７７）転写開始部位より下流の配列およびプロモーター領域の一部が削られている、項目７４に記載のプロモーター。
（７８）上記サイトメガロウイルスエンハンサーは、配列番号３６またはその改変体に示される配列を含む、項目７４に記載のプロモーター。
（７９）上記トリβアクチンプロモーターは、配列番号８またはその改変体に示される配列を含む、項目７４に記載のプロモーター。
（８０）配列番号６に示される配列を含む、項目７４に記載のプロモーター。このプロモーターは、好ましくは、配列番号６に示される配列からなる。
（８１）配列番号７に示される配列を含む、項目７４に記載のプロモーター。このプロモーターは、好ましくは、配列番号７に示される配列からなる。
（８２）ＬＴＲ型レトロトランスポゾンの、ゲノム改変のための、使用。
（８３）ルシフェラーゼアッセイ（インビトロ系）でみたときに、０．１ｒｌｕ以上の活性を有するプロモーターの、ゲノム改変のための、使用。
（８４）ルシフェラーゼアッセイ（インビトロ系）でみたときに、０．１ｒｌｕ以上の活性を有するプロモーターの、ＬＴＲ型レトロトランスポゾンの確認のための、使用。
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。
本発明は、予想外にも、ＬＴＲ型レトロトランスポゾンが転位を人為的に促進する系に使用することができた。したがって、このような系を用いて、細胞、生物などのゲノムの改変、遺伝子の導入、トランスジェニックマウスの作製などに応用することができ、その有用性は非常に多大かつ広く存在すると考えられる。本発明はまた、予想外にも、ＬＴＲ型レトロトランスポゾンの転位活性を容易に検出することができる系を提供することができた。したがって、このような系を用いて、ＬＴＲ型レトロトランスポゾンの転位活性を確認し、トランスジェニックマウスの作製に使用することができるＬＴＲレトロトランスポゾンを容易に同定することができるという効果を奏する。
図１は、ＤＮＡ型トランスポゾンとＲＮＡ型トランスポゾン（レトロトランスポゾン）の比較を示す。 図２Ａは、ＩＡＰの構造であり、図２Ｂは、ＩＡＰの生活環を示す。 図３Ａは、ベクターの構築を示す。図３Ｂは、ＩＡＰの活性の検定方法を示す。図３Ｃは、Ｇ４１８耐性コロニーの出現頻度の例を示す。 ＩＡＰのプロモーター領域の改変による転位の効率化の模式的例示を示す。（Ａ）実施例１において用いられるベクターの構造。（Ｂ）ＣＭＶプロモーターとＲ領域の接合部の配列。（Ｃ）転位の検出の原理。（Ｄ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞へのトランスフェクションによる転位の検出。 本発明において用いられ得るＩＡＰが完全な転位能を有することの証明例およびｇａｇ−ｐｏｌの発現ユニットを分離することにより転位を制御できることの証明例である。（Ａ）実施例１で用いた各種ベクターの構造を示す。（Ｂ）ＨｅＬａ細胞へのトランスフェクションによる、各々のベクターの活性の検定。 図６は、ＩＡＰベクターが遺伝子内へ挿入した例を示す。（Ａ） 図の３’ＬＴＲの下流の塩基配列を、ライゲーション媒介性（ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ）ＰＣＲにより決定した場所。（Ｂ）（Ａ）で決定した配列をＥｎｓｅｍｂｌデータベースにより、検索した結果を示す。 図７は、ＣＡプロモーターの効果を示す。（Ａ）２つのＣＡ含有ベクター（ｐＣＡ１ｇｐ−ｎｅｏ、ｐＣＡ２ｇｐ−ｎｅｏ）およびｐＣＭＶｇｐ−ｎｅｏの構造。（Ｂ）（Ａ）の２つのＣＡプロモーターとＲ領域の接合部の配列。（Ｃ）ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＭＶプロモーターの比較を示す。 図８は、ＧＦＰを用いた、転位の可視化例を示す。（Ａ） ベクターの構造。（Ｂ）転位に伴うＧＦＰの発現を示す。 図９はマウス個体での組換えの実施例を示す。図８のｐＣＡ２ｇｐ−ｈｒＧＦＰを有するトランスジェニックマウスを作製し、マウスの尻尾のＤＮＡを鋳型にして、図のｐｒｉｍｅｒでＰＣＲを行った。ＩＡＰの転位が起きると、ＧＦＰ内部のイントロンが無くなるので、０．４５ｋｂのバンドが出現すると予想される。図に示したように、１３系統のマウスのうち３系統において０．４５ｋｂのバンドが検出され、マウス生体内で転位が起きていることが証明された。 図１０は、ＧＡＧタンパク質のはじめの１５アミノ酸が転位に好ましいことの証明を示す。（Ａ） ベクターの構造。図８で自律的転位を示したｐＣＡ２ｇｐ−ｈｒＧＦＰに対して、ｇｐ− ｐＣＡ２ｈｒＧＦＰ−Ｍ１ではｇａｇ遺伝子の開始コドンに変異を導入しており、その結果、１５アミノ酸下流の２番目のＡＴＧから翻訳が始まると考えられる。（Ｂ） 転位効率の検討。（Ａ）のベクターを用いて、ここに示す３通りの組み合わせでＨｅＬａ細胞へトランスフェクトを行い、７日後にＧＦＰ陽性細胞の割合をＦＡＣＳで解析した。その結果、ｇａｇ遺伝子の本来の翻訳開始部位のＡＴＧに変異を導入したｐＣＡ２ｈｒＧＦＰ−Ｍ１では、転位能が消失した。しかし、同様のベクターを、ｇａｇ−ｐｏｌ完全長の発現ベクターであるｐＣＡ２ｇｐとともにトランスフェクトした際には転位能が回復した。これより、ＧＡＧタンパク質の翻訳開始部位からの１５アミノ酸が、転位に好ましいことが示された。 図１１は、非自律型ベクターの転位において、それ自身からＧＡＧタンパク質が翻訳されることが好ましいことを示す。（Ａ）ベクターの構造。はじめの３つのベクターおよびｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクターは図１０と同じ。ｐＣＡ２ｇｐ−ｈｒＧＦＰ−Ｍ２とｐＣＡ２ｇｐ−ｈｒＧＦＰ−Ｍ３では、ｇａｇの２番目のＡＴＧの直下に終止コドンを導入しており、ＧＡＧタンパク質は短い断片としてしか発現できない。ＧＡＧタンパク質に変異のある４つのベクターは、それ自体では転位できないので、非自律型ベクターと定義した。（Ｂ）転位効率の検討。（Ａ）のトランスファーベクターを、ｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクター（ｐＣＡ２ｇｐ）の存在下、または非存在下（代わりにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを使用）でＨｅＬａ細胞へトランスフェクトし、７日後にＧＦＰ陽性細胞の出現頻度をＦＡＣＳで解析した。その結果、ＧＡＧタンパク質の翻訳が阻害された３つの非自律型ベクターでは、ｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクターの存在下でも転位が著しく低下した。一方、はじめの１５アミノ酸以降で完全長の翻訳の起きるｐＣＡ２ｇｐ−ｈｒＧＦＰ−Ｍ１のみはｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクター存在下で高率に転位を認めた。これより、非自律型ベクターの転位には、それ自身からのｇａｇタンパク質が翻訳されることが好ましいことが示された。
（配列の説明）
配列番号１：実施例において例示的に実際に使用したＩＡＰ配列。
配列番号２：ＩＡＰ配列アミノ酸配列（ｇａｇ＃１）。
配列番号３：ＩＡＰ配列アミノ酸配列（ｇａｇ＃２）。
配列番号４：ＩＡＰ配列アミノ酸配列（ｐｏｌ）。
配列番号５：ＣＭＶプロモーター配列。
配列番号６：ＣＡ１プロモーター配列（Ｒ領域がなくさらにプロモーター領域が２塩基欠如するもの）。
配列番号７：ＣＡ２プロモーター配列（Ｒ領域がないもの）。
配列番号８：トリβアクチンプロモーター配列。
配列番号９：実施例１で使用したＩＡＰエレメントの単離のためのフォワードプライマー配列。
配列番号１０：実施例１で使用したＩＡＰエレメントの単離のためのリバースプライマー配列。
配列番号１１：実施例１で使用したＩＡＰエレメントの完全長単離のためのフォワードプライマー配列。
配列番号１２：実施例１で使用したＩＡＰエレメントの完全長単離のためのリバースプライマー配列。
配列番号１３：実施例１（ｃ）で使用したＣＭＶプロモーターに関するフォワードプライマー配列。
配列番号１４：実施例１（ｃ）で使用したＣＭＶプロモーターに関するリバースプライマー配列。
配列番号１５：実施例１（ｃ）で使用したＩＡＰのＲ領域に関するフォワードプライマー配列。
配列番号１６：実施例１（ｃ）で使用したＩＡＰのＲ領域に関するリバースプライマー配列。
配列番号１７：実施例３で使用したリンカーＤＮＡの接続配列。
配列番号１８：実施例３で使用したリンカーＤＮＡの接続配列。
配列番号１９：実施例３で使用した１回目のリンカー特異的プライマー（フォワード）。
配列番号２０：実施例３で使用した１回目のｎｅｏカセット特異的プライマー（リバース）。
配列番号２１：実施例３で使用した２回目のリンカー特異的プライマー（フォワード）。
配列番号２２：実施例３で使用した２回目のｎｅｏカセット特異的プライマー（リバース）。
配列番号２３：実施例３で使用した２回目のｎｅｏカセット特異的代替プライマー（リバース）。
配列番号２４：実施例４で使用したチキン・ベータ−アクチンプロモーター転写開始点までの５’側上流のプライマー。
配列番号２５：実施例４で使用したチキン・ベータ−アクチンプロモーターの３’側のプライマー。
配列番号２６：実施例４で使用したチキン・ベータ−アクチンプロモーターの３’側のプライマー（代替）。
配列番号２７：実施例４で使用したＩＡＰのＲ領域の５’側末端からＵ５領域の下流の５’側上流のプライマー。
配列番号２８：実施例４で使用したＩＡＰのＲ領域の５’側末端からＵ５領域の下流の３’側のプライマー。
配列番号２９：実施例４で使用したＩＡＰのＲ領域の５’側末端からＵ５領域の下流の３’側のプライマー（代替）。
配列番号３０：γグロビン イントロン配列。
配列番号３１：全長ＩＡＰのｔＲＮＡ結合部位の配列。
配列番号３２：全長ＩＡＰのＲ領域の反復配列。
配列番号３３：全長ＩＡＰに特異的な配列（ｔＲＮＡ結合部位）。
配列番号３４：全長ＩＡＰに特異的なタンデム反復配列。
配列番号３５：全長ＩＡＰにおいて見出されるＲ領域の反復配列。
配列番号３６：サイトメガロウイルスエンハンサー配列。
配列番号３７：実施例８において使用した１ｓｔプライマーのセンス方向の配列（agggctgcggcaagggcaacatcctgttcg）。
配列番号３８：実施例８において使用した１ｓｔプライマーのアンチセンス方向の配列（gccgccgtcctccacgtaggtcttctccag）。
配列番号３９：実施例８において使用した２ｎｄプライマーのセンス方向の配列（ggcaaccagctggtgcagatccgcgtgacc）。
配列番号４０：実施例８において使用した２ｎｄプライマーのアンチセンス方向の配列（gtccttcaccacgcccttgctcttcatcag）。
以下、発明の実施の形態を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、および他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
（用語の定義および説明）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において「トランスポゾン」とは、染色体上のある部位から別の部位に移動（転位）し得る核酸分子または核酸配列をいう。代表的には、トランスポゾンは、ＤＮＡセグメント（ＤＮＡ型トランスポゾン）である。ＤＮＡ型トランスポゾンは、トランスポザーゼにより活性化されて転位する。トランスポゾンとしては、例えば、ＳＢトランスポゾン（Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｌ４８６８５）（配列番号１）、配列番号１０〜１９に示す配列に含まれるものが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「ＤＮＡ型」トランスポゾンとは、ＤＮＡの転位を行うトランスポゾンをいう。通常のトランスポゾンは、ＤＮＡ型である。代表的な実施形態では、本発明は、ＤＮＡ型トランスポゾンを利用して実施される。
本明細書において「レトロポゾン」とは、ゲノム中のある位置におけるＤＮＡ配列がいったんＲＮＡに転写され，ＲＮＡが逆転写酵素の働きで相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写されてゲノム中の他の位置に再挿入される任意のＤＮＡを総称していう。このような現象をレトロポジション（ｒｅｔｒｏｐｏｓｉｔｉｏｎ）とよぶことがある。大きく分けて、レトロポゾンは、逆転写酵素保持群と非逆転写酵素保持群との２群に大別される。
レトロポゾンは、ある分類法では、三つのグループに分けることができる。一つ目のグループは、転位因子の配列が転写された後、自らのコードした逆転写酵素によって逆転写をうけ逆転写された遊離のＤＮＡがゲノムに組み込まれるタイプである。この転位の仕方はエイズなどのレトロウィルスがゲノムに組み込まれる様式と似ておりこのタイプの転位因子はレトロウィルスとの関連が深い。このグループは自らの配列の両末端に長い繰り返し（Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ）を持っているため、ＬＴＲ型のレトロポゾンと呼ばれる。このグループはヒトゲノム中で８％、４５万コピー程度、存在する。ショウジョウバエのコピア因子（ｃｏｐｉａ ｅｌｅｍｅｎｔ）、マウスのｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ Ａ ｐａｒｔｉｃｕｌｅ（ＩＡＰ）エレメントなどが挙げられる。ＬＴＲをもつものは、さらにｅｎｖ遺伝子をコードしているものとコードしていないもの（ショウジョウバエのコピア因子（ｃｏｐｉａ ｅｌｅｍｅｎｔ）、マウスのｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ Ａ ｐａｒｔｉｃｕｌｅ（ＩＡＰ）エレメントなどに細分化される。このような転位活性を有するものを、レトロトランスポゾン（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）またはＲＮＡ型トランスポゾンといい、その転位の現象をレトロトランスポジション（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）とよぶ。
二つ目のグループは一つ目のグループと同様に自らが逆転写酵素をコードしている点は同じであるが、逆転写産物が遊離のＤＮＡとなるのではなく、逆転写とゲノムへの組み込みが平行して行われる点で異なる。これらのグループは歴史的な理由からＬＩＮＥ（Ｌｏｎｇ ＩＮｔｅｒｓｐｅｒｅｓｅｄ Ｅｌｅｍｅｎｔ，長い散在性反復配列）と呼ばれる。このグループはヒトゲノム中で２０％、９０万コピー程度、存在する。例えば、ヒトのＬ１因子（Ｌ１ ｅｌｅｍｅｎｔ）などが挙げられるがそれらに限定されない。
三つ目のグループは前者二つが逆転写酵素を持っているのに対して自らの逆転写酵素を持たない点で大きく異なる。このグループはまた、翻訳産物を持たないばかりではなく転写機構においても、他のレトロポゾンと異なる。逆転写酵素をもったレトロポゾンが一般的なｍＲＮＡと同様にＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩによって転写するであろうと予想されているのに対しこのグループ（ＬＩＮＥとは逆に短い散在性反復配列ＳＩＮＥと呼ばれる）はｔＲＮＡなどと近く、ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩＩによって転写する。このグループはヒトゲノム中で１３％、１５０万コピー程度、存在するとされていてコピー数においては最も多く存在すると考えられる。このような逆転写酵素非保持群は、例えば、ＲＮＡポリメラーゼによりタンパク質をコードするＤＮＡ配列から転写されたｍＲＮＡから逆転写で生じた偽遺伝子、核内低分子ＲＮＡの偽遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるＳＩＮＥ（サイン）と総称されている分散型の短い反復配列などが挙げられる。ＳＩＮＥには，ヒトのゲノム中に存在するＡｌｕファミリーや，その他ｔＲＮＡを起原とする多くの例が知られる。
従って、本明細書において「ＲＮＡ型トランスポゾン」、または「レトロトランスポゾン」とは、交換可能に用いられ、レトロポゾンのうち、転位活性を有するものをさす。本明細書では、レトロトランスポゾンには、レトロウイルスは含まれないことが意図される。
ＤＮＡ型トランスポゾンとＲＮＡ型トランスポゾン（レトロトランスポゾン）の比較を図１に示す。ＤＮＡ型トランスポゾンでは、トランスポゾンがゲノムから切り出されて他の部位へ挿入されるので、導入できる変異の数は、転位前のトランスポゾンのコピー数を越えることができない。また、転位前の部位の近傍に転位しやすいという性質も持つ。一方、ＲＮＡ型では、転写されたＲＮＡが逆転写を介してゲノムへ挿入されるため、導入できる変異の数は転位前のレトロトランスポゾンのコピー数に依存せず、転位もゲノム全体に起きる。このように、レトロトランスポゾンでは、導入される変異の網羅性がより高まる可能性がある。
本明細書において「ＬＴＲ型」レトロトランスポゾンとは、レトロトランスポゾンのうち、その構造内にＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ＝末端反復配列）配列を含む。そのようなＬＴＲ型レトロトランスポゾンとしては、例えば、ＩＡＰエレメント、ｅａｒｌｙ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ（ＥＴｎ）、ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ３０Ｓ ＲＮＡ（ＶＬ３０）エレメントなどが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「ＬＴＲ」とは、レトロウイルス、レトロトランスポゾンなどのプロウイルスＤＮＡの両端に繰り返されている百〜１０００塩基対からなる配列をいう。ＬＴＲは、ウイルス遺伝子の転写、逆転写、宿主ＤＮＡへの組込みに関わるＵ３、ＲおよびＵ５の各領域から構成される。プロウイルス５’末端および３’末端にあるＩＲ配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ ｒｅｇｉｏｎ＝逆方向反復）は４〜２０塩基対の長さである。Ｕ３には転写のエンハンサー配列およびプロモーター配列が含まれる。
本明細書において「非ＬＴＲ型」レトロトランスポゾンとは、構造中にＬＴＲを有していないレトロトランスポゾンをいう。非ＬＴＲ型レトロトランスポゾンとしては、例えば、Ｌ１（ＬＩＮＥ １）などが挙げられるがそれらに限定されない。
「ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ Ａ ｐａｒｔｉｃｕｌｅ」または「ＩＡＰ」は、細胞嚢胞内にあることが電子顕微鏡で見出されたところのＡ型と分類された粒子として見出された粒子である。
本明細書において「ＩＡＰ」型レトロトランスポゾン、「ＩＡＰ ＤＮＡエレメント」、「ＩＡＰ ＲＮＡエレメント」、「ＩＡＰ配列」、「ＩＡＰエレメント」、「ＩＡＰヌクレオチド配列」は、交換可能に用いられ、ＩＡＰに見出されるレトロトランスポゾン活性を持つ分子をいう。ただし、本明細書では、特に言及しない限り、ＩＡＰは、ＩＡＰエレメントと交換可能に使用され得る。なお、特に言及する場合、遺伝子操作やその考案の際の記述については状況に応じて「ＩＡＰ配列」と記載する。従って、ＩＡＰレトロトランスポゾンは、マウスゲノムに見出されるＬＴＲ型レトロトランスポゾンの一種をいう。Ｃ３Ｈマウス由来の放射線誘発骨髄性白血病細胞から見出されたレトロトランスポゾンであり、数百から数千のクローンが存在する。そのようなクローンの例としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号：AB099818; AB099819; AB099820； AB099821； AB099822； AB099823； AB099824； AB099825； AB099826； AB099827； AB099828; AH012499; Z36947; AB026817; D63766; D63767; AH007468; AF097546; AF097545; U79727; U79726; S80638; M58326; M59201などがあり、当業者はこのような例示的な公知配列などから入手可能な配列情報をもとに適切なクローンを入手することができることが理解される。
ＩＡＰの概略を図２に示す。
（Ａ）ＩＡＰエレメントの構造。両端にｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ（ＬＴＲ）が有り、その間に、ｇａｇ遺伝子とｐｏｌ遺伝子が、異なったｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅで位置している。レトロウイルスとは異なり、機能的なｅｎｖ遺伝子は無い。ＬＴＲは通常のレトロウイルスと同様に、Ｕ３、Ｒ、Ｕ５領域からなる。５’ＬＴＲのＵ３領域がプロモーターとなり、３’ＬＴＲのＲ領域内の配列がｐｏｌｙ Ａ付加シグナルとして機能する。よって、転写は、５’ＬＴＲのＲ領域の５’側上端から、３’ＬＴＲのＲ領域の３’末端までの、図に示した領域で起きる。５’ＬＴＲのＵ３と３’ＬＴＲのＵ５は転写されないが、逆転写の過程で反対側のＬＴＲからコピーされるため、ゲノムへの挿入後は再び完全長のＩＡＰエレメントが再構築される。
（Ｂ）ＩＡＰの生活環。（Ａ）で述べた領域が転写されたのち、その一部はＧａｇ−Ｐｏｌ産生のためのｍＲＮＡとして（１）、残りの転写産物はＩＡＰゲノムＲＮＡとして（２）機能する。Ｇａｇ−ＰｏｌとＩＡＰゲノムＲＮＡが組み合わさって、粒子状のＩＡＰが産生される（３）。粒子形成はｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ（ＥＲ）の膜上で起き、産生されたＩＡＰの構造体はＥＲ内へ放出される。このＩＡＰの構造体は未知の機構により活性化され、ＩＡＰ ＲＮＡからＩＡＰ ＤＮＡに逆転写されて（４）、宿主細胞のゲノムＤＮＡへ挿入される（５）。
本明細書においてレトロトランスポゾンに関し、「完全長」とは、少なくともＬＴＲ（Ｒ領域を含む）、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｔＲＮＡ結合部位に対応する配列を有していることをいう。特に、ＩＡＰエレメントについては、数千あるといわれるクローンのうち完全長のものが従来Ｍｉｅｔｚ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１，３０２０−３０２９，１９８７によって報告されていたが、完全長のものが転位システムにおいて使用することができるか否かについては知られていなかった。また、好ましくは、ＩＡＰについて完全長には、ＧＡＧタンパク質のはじめの１５アミノ酸（配列番号１のうちＭｅｔ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ）を含むことが有利であることが本発明において実証されている。
本明細書においてレトロトランスポゾンに関し、「機能性」を有するとは、転位活性を有することをいう。
本明細書においてレトロトランスポゾンに関し、「コンセンサス配列」とは、機能性を有するに必要な最低限の配列をいう。ＩＡＰエレメントについては、コンセンサス配列としては、配列番号１に示す配列のうち、ＬＴＲ（５’側のＬＴＲ領域は、配列番号１の１〜４４３位；ここで、１位〜２２５位はＵ３領域であり、２２６位〜３８４位はＲ領域であり、３８５位〜４４３位はＵ５領域である。３’側のＬＴＲ領域は、配列番号１の６８７６位〜７３１８位であり、ここで、６８７６位〜７０８９位はＵ３領域であり、７０９０位〜７２５９位はＲ領域であり、７２６０位〜７３１８位はＵ５領域である）、ｇａｇ（配列番号１の６７０位〜２４２７位（ｇａｇ＃１）または２４３０位〜３２０３位（ｇａｇ＃２））、ｐｏｌ（配列番号１の３４４０位〜５８５４位）およびｔＲＮＡ結合部位（配列番号１の４４４位〜４６３位）からなる群より選択される少なくとも１つのドメインが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「転写活性」とはＤＮＡをＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）に転写する活性をいう。
本明細書において「逆転写活性」とはＲＮＡをＤＮＡに転写する活性をいう。従って、転写活性とは、「逆」の方向の活性にあたる。
本明細書において「プロモーター」活性とは、転写を活性化するレベルをいう。プロモーター活性は、本明細書において表現するとき、ルシフェラーゼアッセイ（インビトロの系）において活性を観察したときに、ｒｌｕ（＝相対単位）であらわすことができる。本明細書では、ＣＭＶプロモーターの活性を、上記インビトロの系で観察したときに、１ｒｌｕ（単位）の活性を有すると表現することができる。
本明細書において「サイトメガロウイルス」または「ＣＭＶ」とは、交換可能に用いられ、ククモウイルスグループに属する多粒子性ウイルスである。３種類のウイルス粒子から構成され、これらは、すべて球状の多面体であり、直径約２９ｎｍを有する。ゲノムは３本の一本鎖ＲＮＡからなる。キュウリ、トマトをはじめ多数の作物のウイルス病の主要な病原体として世界に広く分布する寄主範囲のきわめて広い植物ウイルスである。サイトメガロウイルスのプロモーターは、サイトメガロウイルスの上述のタンパク質をコードするＲＮＡに存在する転写促進活性を有する配列をいう。ＣＭＶプロモーターとしては、例えば、配列番号５に示される配列が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「ＣＡＧ」プロモーターとは、サイトメガロウイルスエンハンサー（好ましくは、サイトメガロウイルス即時初期エンハンサー）とトリ（ｃｈｉｃｋｉｎ）βアクチンプロモーターと関連するイントロン配列を含むプロモーターをいう。ＣＡＧプロモーターは、例えば、Ｋｏｓｕｇａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０００ Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；９（５）：６７５−６８０に記載されている。代表的なＣＡＧプロモーターとしては、配列番号３６および配列番号８を含むものが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「ＣＡ」プロモーターとは、ＣＡＧプロモーターからイントロン配列およびエキソン配列の一部を除いたものをいい、従来にはなかった型のプロモーターをいう。ＣＡプロモーターから削除され得る配列（イントロン配列が主である）は、例えば、転写開始位置を調節することを目的とする場合に好ましい。ＣＡプロモーターの例としては、例えば、配列番号６（ＣＡ１）、配列番号７（ＣＡ２）などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において、「サイトメガロウイルスエンハンサー」または「ＣＭＶエンハンサー」とは、ＣＭＶに見出されるエンハンサーをいい、代表例としては例えば、配列番号３６のものが挙げられる。このエンハンサーは、一般に、非常に活性が強いとされており、プロモーターと組み合わせて用いられ得る。特に、ＣＡＧを構成する要素としても用いられている。
本明細書において「トリβアクチンプロモーター」または「チキンβアクチンプロモーター」とは、交換可能に用いられ、トリ（ｃｈｉｃｋｅｎ）のβアクチン遺伝子において見出されるプロモーターをいい、代表例としては、例えば、配列番号８のものが挙げられる。このプロモーターは、一般に、非常に活性が強いとされており、エンハンサーと組み合わせて用いられ得る。特に、ＣＡＧを構成する要素としても用いられている。
本明細書において「インフレーム」とは、核酸配列同士の配置の仕方をいい、翻訳または転写の開始位置または翻訳フレームが適合していることをいう。転写位置の場合は、転写開始部位とプロモーター配列とが直接連結されることをいう。
本明細書において「リバース」（ｒｅｖｅｒｓｅ）とは、核酸配列同士の配置の仕方をいい、ある遺伝子をコードする核酸配列に対して、別の遺伝子をコードする核酸配列が翻訳または転写の方向が逆方向に配置されていることをいう。リバースに配置されている場合は、通常、あるプロモーターの影響下で１つの核酸配列が転写される場合に他方のリバースに配置された核酸配列は転写されない。
本明細書において「フォワード」（ｆｏｒｗａｒｄ）とは、核酸配列同士の配置の仕方をいい、ある遺伝子をコードする核酸配列に対して、別の遺伝子をコードする核酸配列が翻訳または転写の方向が同じ方向に配置されていることをいう。
本明細書において「識別可能な特性」とは、外来遺伝子に関して言及するとき、発現された遺伝子産物が任意の手段（例えば、物理学的手段、化学的手段、生物学的手段、生化学的手段など）を用いてその発現を確認することができる特性をいう。そのような識別可能な特性としては、例えば、抗生物質耐性、酵素活性、蛍光などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「イントロン配列」とは、遺伝子またはその転写物の内部にあって，その遺伝子からつくられる、機能をもつ最終ＲＮＡ産物に含まれない配列をいう。そのようなイントロン配列は、遺伝子配列において、ゲノムに存在するが、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに存在しない配列を同定することによって当業者が容易に同定することができる。代表的なイントロン配列としては、例えば、γグロビンのイントロン（配列番号３０など）が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「スプライスドナー」とは、遺伝子をコードする核酸配列が転写されてできたＲＮＡ分子中のイントロン部分が除去され，それに隣接したエキソンの配列が連結する一連の反応において、スプライスされる配列をアクセプターに授与する配列をいう。スプライスドナー配列は、一定の共通配列が知られており、そのような配列としては、例えば、ＧＴＲＡＧＴ（Ｒはプリン）が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「スプライスアクセプター」とは、遺伝子をコードする核酸配列が転写されてできたＲＮＡ分子中のイントロン部分が除去され，それに隣接したエキソンの配列が連結する一連の反応において、スプライスされる配列をドナーから受け取る配列をいう。スプライスアクセプター配列は、一定の共通配列が知られており、そのような配列としては、例えば、（Ｙ）ｎＮＣＡＧ（ｎ＞１１、Ｎは任意の塩基）が挙げられるがそれらに限定されない。
スプライスドナーとスプライスアクセプターとは、本発明の外来遺伝子をコードする配列においてイントロン配列を挿入する場合に、挿入位置として選択することが好ましい。
本明細書において「ゲノムの改変」とは、ゲノム中の核酸配列、特に機能する遺伝子を改変することをいう。
本明細書において「転位」（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）とは、ゲノムなどの核酸配列上のある部位から他の部位へ一定単位の配列が移転することをいう。
レトロトランスポゾンが完全な転位能力を有するか否かは、例えば、以下のようにして証明することができる。その模式図は図３に示される。
図３Ａおよび図３Ｂを用いて、上記例示的アッセイを説明する。（Ａ）ベクターの構築。種々の培養細胞でＩＡＰの転写が高まるように、ＩＡＰのプロモーターである５’ＬＴＲのＵ３をＣＭＶプロモーターで置き換える（１）。また、転写 −逆転写の過程を経ることで初めてｎｅｏ遺伝子が発現するように、ｎｅｏ遺伝子のｃｏｄｉｎｇ領域内にｎｅｏ遺伝子とは逆向きにイントロンを配置したｎｅｏカセットを、ＩＡＰ内へ挿入する（２）。挿入後のイントロンの向きはＩＡＰと同方向だが、ｎｅｏ遺伝子はＩＡＰに対して逆方向であり、図ではｎｅｏカセットの文字を反転させることでこれを示した。ＳＤ，スプライスドナー；ＳＡ，スプライスアクセプター。（Ｂ）ＩＡＰの活性の検定方法。ＩＡＰベクターを細胞へトランスフェクトすると、転写後のスプライシングによってｎｅｏ遺伝子内に挿入されたイントロンが切り出されて、ｎｅｏ遺伝子のｃｏｄｉｎｇ領域が再構成され、細胞はＧ４１８耐性になる。
本明細書において「導入」とは、核酸について言及するとき、核酸分子が細胞内に移されることをいう。
ライゲーション媒介ＰＣＲ（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ＰＣＲ）とは、特定の配列の周囲のゲノム領域をＰＣＲで増幅する反応をいい、ゲノムＤＮＡを制限酵素で切断後にリンカーＤＮＡを接続し、目的の配列内部に設定したプライマーとリンカー特異的なプライマーでＰＣＲを行うことによって実行することができる。
本発明において、トランスジェニック生物に用いられるレトロトランスポゾンは、内因性のものでも外来性のものでも制限なく使用することができるが、好ましくは外来性レトロトランスポゾンを用いることができる。
レトロトランスポゾンの標的配列としては、任意の配列が挙げられる。
レトロトランスポゾンには、主に自らの転位を触媒できる酵素、レトロトランスポゾンの粒子の構成タンパク質を内部にコードしている自己完結型と、これらを欠損した非自己完結型とがある。本発明において使用することが好ましいのは、自己完結型である。そのような自己完結型は、本発明のシステムによって初めて自己完結型であるかどうかを確認することができる。本発明は、そのような自己完結型であるかどうかを確認するシステムを初めて提供したことによって、ゲノムを改変するためのシステムを提供することができたということが説明可能である。
レトロトランスポゾン配列に挟まれる部分には、様々な核酸配列（例えば、マーカー遺伝子、遺伝子発現調節配列、所望の遺伝子など）を挿入することができ、レトロトランスポゾン配列の他に必要に応じて種々の構成要素を組み合わせたトランスポゾン構築物を構築することができる。本発明において、トランスポゾン構築物または転位の誘発に必要な遺伝子を導入する対象となる細胞には、例えば、生物（好ましくは非ヒト生物）の個体に分化し得るポテンシャルをもつ細胞があり、そのような細胞としては例えば幹細胞または受精卵がある。
本発明のトランスジェニック生物には、レトロトランスポゾンを含む核酸構築物を含む始祖（ｆｏｕｎｄｅｒ）（第１世代だけでなく、この始祖（ｆｏｕｎｄｅｒ）を基に確立されるトランスジェニック生物の系統も当然に本発明に包含される。さらに、本発明のトランスジェニック生物系統由来の臓器（器官）、組織、卵、***、および受精卵、トランスジェニック生物の系統から確立される株化細胞、トランスジェニック生物の系統から作出される生物クローン個体もまた本発明の範囲に含まれる。本発明のレトロトランスポゾンを含む核酸構築物は、レトロトランスポゾン配列の他に種々の構成要素を組み合わせて構築され、幹細胞または受精卵等に導入することができる。
ＤＮＡ型トランスポゾンはトランスポザーゼの存在下でＤＮＡ上の第一の位置から第二の位置へと移動できる（これを可動性ともいう）。任意の可動カット−アンド−ペースト型トランスポゾンには２つの基本的な成分があり、それは活性トランスポザーゼの起源と、トランスポザーゼにより認識され、かつ、移動するＤＮＡ配列である。ＤＮＡ配列の移動は認識されたＤＮＡ配列の間の介在核酸も移動することを可能にする。
これに対してレトロトランスポゾンは、転写、逆転写およびゲノムへの挿入を通じて、自己の配列を複製して遠いところに挿入することができることから、コピーアンドペースト型の転位ということができる。また、ゲノム改変を行う際においても、標的付近の改変のみならず、ゲノム全体において網羅的あるいは万遍なく改変を挿入することができるという効果をもたらす。従って、効率よいレトロトランスポゾン系を用いたゲノム改変ツールの登場は各種分野において多大な効果および有用性をもたらす。
本明細書において「外来遺伝子」とは、本発明の遺伝子転位によって導入されることが意図される遺伝子またはそれをコードする核酸分子をいう。そのような外来遺伝子は、導入が意図される宿主とは異なる起源のものであっても、その宿主由来であってもよい。また、導入が意図される限り、その外来遺伝子をコードする核酸配列は、どのようなタンパク質をコードするものであってもよい。そのような核酸配列によりコードされるタンパク質はマーカータンパク質、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子（ｎｅｏ）、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、成長ホルモン（例えば遺伝子導入動物の成長を促進するもの）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）などが挙げられるがそれらに限定されない。
トランスジェニック生物の一の実施形態において、タンパク質は細胞からの単離のための生成物である。バイオリアクターとしてのトランスジェニック生物公知である。タンパク質は、例えば、乳、尿、血液、体液、果実または卵の中で大量に生産され得る。乳、尿、血液、体液、果実または卵の中での発現を促進するプロモーターが知られている。そのようなものとしては、カゼインプロモーター、マウス尿性タンパク質プロモーター、β−グロビンプロモーターおよびオボアルブミンプロモーターが挙げられるがそれらに限定されない。組換タンパク質が細胞内でタンパク質を製造するためのその他の方法を利用して製造されており、本発明は、そのような組み換えタンパク質を製造する工場を生産するツールまたは技術として使用することができる。これらまたはその他のタンパク質をコードする核酸を本発明の核酸フラグメントの中に組込み、そして細胞に導入することができる。細胞のＤＮＡの核酸フラグメントの効率的な組込みは本発明の組成物が存在するときに起きる。細胞が遺伝子導入動物の組織または器官の一部であるとき、大量の組換タンパク質が得られ得る。
（細胞・生物学）
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本明細書において使用される細胞は、本発明の核酸分子を導入することができる限り、どのような由来であっても使用することができ、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、形質転換またはトランスフェクションが容易な細胞が使用される。本発明において使用される細胞は、核酸分子を導入することが容易な細胞であることが好ましい。生殖を目的とする場合は、生殖可能な細胞を用いることが好ましい。あるいは、ＥＳ細胞を用いることもできる。
本発明で用いられる細胞は、どの生物由来の細胞（たとえば、任意の種類の単細胞生物（例えば、細菌、酵母）または多細胞生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など）など））でもよい。例えば、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来の細胞が用いられ、より詳細には、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来の細胞が用いられる。１つの実施形態では、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞、特にヒト由来の細胞が用いられるがそれに限定されない。本発明において用いられる細胞は、上記細胞は、幹細胞であってもよく体細胞であってもよい。また、そのような細胞は、付着細胞、浮遊細胞、組織形成細胞およびそれらの混合物などであり得る。
本発明において、臓器が対象とされる場合、そのような臓器はどのような臓器でもよく、また本発明が対象とする組織または細胞は、生物のどの臓器または器官に由来するものでもよい。本明細書において「臓器」または「器官」とは、互換可能に用いられ、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性をもっている構造体をいう。一般に多細胞生物（例えば、動物、植物）では器官は特定の空間的配置をもついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞からなる。そのような臓器または器官としては、血管系に関連する臓器または器官が挙げられる。１つの実施形態では、本発明が対象とする臓器は、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、脳、四肢末梢、網膜などが挙げられるがそれらに限定されない。植物の場合は、「器官」は、カルス、根、茎、幹、葉、花、種子、胚芽、胚、果実、胚乳などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「組織」（ｔｉｓｓｕｅ）とは、多細胞生物において、実質的に同一の機能および／または形態をもつ細胞集団をいう。通常「組織」は、同じ起源を有するが、異なる起源を持つ細胞集団であっても、同一の機能および／または形態を有するのであれば、組織と呼ばれ得る。従って、本発明の幹細胞を用いて組織を再生する場合、２以上の異なる起源を有する細胞集団が一つの組織を構成し得る。通常、組織は、臓器の一部を構成する。動物の組織は，形態的、機能的または発生的根拠に基づき、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などに区別される。植物では、構成細胞の発達段階によって***組織と永久組織とに大別され、また構成細胞の種類によって単一組織と複合組織とに分けるなど、いろいろな分類が行われている。
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞または組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得るがそれらに限定されない。従って、本発明では、幹細胞を直接使用することができる。
本明細書において「体細胞」とは、卵子、***などの生殖細胞以外の細胞であり、そのＤＮＡを次世代に直接引き渡さない全ての細胞をいう。体細胞は通常、多能性が限定されているかまたは消失している。本明細書において使用される体細胞は、天然に存在するものであってもよく、遺伝子改変されたものであってもよい。
本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないことをいう。従って、単離された生物学的因子（例えば、核酸構築物、細胞など）とは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。核酸配列またはアミノ酸配列についていう場合、「単離された」とは、たとえば、組換えＤＮＡ技術により作製された場合には細胞物質または培養培地を実質的に含まず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドを指す。単離された核酸は、好ましくは、その核酸が由来する生物において天然に該核酸に隣接している（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列（即ち、該核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。
本明細書において、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質（例えば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状態をいう。したがって、樹立された幹細胞は、多分化能を維持する。本発明では、１つの実施形態では、安定した結果を提供することができることから、このような樹立された細胞を用いることが好ましい。
本明細書において「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。
本明細書において「生物体」は、生命体として存在し得る１個の個体として存在し得る生物の一形態をいう。従って、植物の場合は、例えば、種子なども含まれ得る。
（生化学・分子生物学）
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、例えば、レトロトランスポゾン遺伝子というときは、通常、レトロトランスポゾンの構造遺伝子およびレトロトランスポゾンのプロモーターの両方を包含するが、本発明の目的を達成することができる限り、レトロトランスポゾンの構造遺伝子またはその改変体のみをさしてもよい。本明細書において通常、遺伝子とは、調節領域、コード領域、エキソン、イントロンを含む。
本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。したがって、通常、本明細書において、遺伝子は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含し、またその長さに何ら制限されるものではない。従って、本発明の遺伝子には、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、およびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）、ならびにそのセンス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）、およびそれらのフラグメントのいずれもが含まれる。
本明細書において配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。
本明細書では、特に言及しない限り、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴにおいてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、NCBIのBLAST 2.2.9 (2004.5.12 発行)を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記BLASTを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）を包含する。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。タンパク質の遺伝子産物は、通常ポリペプチド形態をとるが、同様の機能を有する限り、ポリペプチドの改変体であってもよい。特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、そのフラグメント、同族体、誘導体、改変体を含む。
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸分子」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。タンパク質などをコードする遺伝子は、通常、このポリヌクレオチド形態をとる。
本明細書において「ヌクレオチド」は、糖部分がリン酸エステルになっているヌクレオシドをいい、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを含み、天然のものでも非天然のものでもよい。ここで、ヌクレオシドは、塩基と糖とがＮ−グリコシド結合をした化合物をいう。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡを含む。
１つの実施形態において、改変体は、天然に存在する対立遺伝子変異体、天然に存在しない変異体、欠失、置換、付加、および／または挿入がなされた変異体；コードされるポリペプチドの機能を実質的に変更しないポリヌクレオチド配列を意味し得る。
１つの実施形態において、これらアミノ酸配列の改変（変異等）は、天然において、例えば変異、翻訳後の修飾等により生じることもあるが、天然由来の遺伝子（例えば本発明の具体例遺伝子）を利用して人為的にこれを行なうこともできる。
１つの実施形態において、上記ポリペプチドは、対立遺伝子変異体、ホモログ、天然の変異体で少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものを含む。
本明細書において、「対応する」アミノ酸または核酸とは、それぞれあるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、あるいは有することが予測されるアミノ酸または核酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、あるトランスポゾン配列であれば、そのトランスポゾン配列の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。
本明細書において、「対応する」遺伝子（例えば、核酸分子、ポリペプチドなど）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログあるいは種相同体であり得る。したがって、マウストランスポゾン、マウストランスポザーゼなどに対応する遺伝子は、他の動物においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、マウストランスポゾン、マウストランスポザーゼなど）の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット、イヌ、ネコ）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。このような対応する遺伝子は、ゲノムデータベースを利用すれば、当業者は容易に得ることができる。そのようなゲノム配列の入手方法は、当該分野において周知であり、本明細書において他の場所に記載される。本発明では、このような検索によって得られた配列も利用可能である。
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能（例えば、マウスＩＡＰなどの機能）を有する限り、上限または加減としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本発明では、マウスレトロトランスポゾンなどとして機能する、すなわち、転位活性（インテグラーゼ（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ＝ゲノムへの挿入活性酵素）活性、転写活性および逆転写活性）を有する限り、どのようなフラグメントであっても使用可能であることが理解される。インテグラーゼとは、溶原化ファージやウイルスが宿主に感染したときに示す，ゲノムDNAを宿主の染色体DNAに組み込む反応(integration)を触媒する酵素をいい、代表的なものにラムダファージのIntタンパク質(φ80,P1,P2,P4,P22,186などのIntが同グループ)とレトロウイルスのＩＮタンパク質などが挙げられる。プロファージの組み込み、またはバクテリアの染色体からの切り出しの促進を観察することによって、その活性を測定することができる。
本明細書において使用される用語「生体分子」とは、生体に関連する分子をいう。
本明細書において「生体」とは、生物学的な有機体をいい、動物、植物、菌類、ウイルスなどを含むがそれらに限定されない。従って、本明細書では生体分子は、生体から抽出される分子を包含するが、それに限定されず、生体に影響を与え得る分子であれば生体分子の定義に入る。したがって、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（たとえば、低分子リガンドなど）もまた生体への効果が意図され得るかぎり、生体分子の定義に入る。そのような生体分子には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカライド、オリゴサッカライド、脂質、低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子など）、これらの複合分子（糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質など）などが包含されるがそれらに限定されない。生体分子にはまた、細胞への導入が企図される限り、細胞自体、組織の一部も包含され得る。通常、生体分子は、核酸、タンパク質、脂質、糖、プロテオリピッド、リポプロテイン、糖タンパク質およびプロテオグリカンなどであり得る。好ましくは、生体分子は、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはタンパク質を含む。別の好ましい実施形態では、生体分子は、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ、あるいはＰＣＲなどによって合成されたＤＮＡ）である。他の好ましい実施形態では、生体分子はタンパク質であり得る。好ましくは、そのような生体分子は、ホルモンまたはサイトカインであり得る。
本明細書において「化学合成物」とは、通常の化学技術を用いて合成され得るすべての物質をいう。従って、化学合成物は、化学物質の範囲内にある。実質的には化学物質は、ほぼすべて合成することができる。そのような合成技術は、当該分野において周知であり、当業者は、適宜そのような技術を組み合わせて化学合成物を製造することができる。
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転位活性）を発揮する活性が包含される。ある因子がアンチセンス分子である場合、その生物学的活性は、対象となる核酸分子への結合、それによる発現抑制などを包含する。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドまたはレセプターである場合、そのリガンドまたはレセプターがそれぞれ対応するレセプターまたはリガンドへの結合が生物学的活性に包含される。その生物学的活性が転写調節活性である場合は、転写レベルまたはその変動を調節する活性をいう。例えば、ある因子がレトロトランスポゾンであるとき、その生物学的活性としては、転写活性、逆転写活性、転位活性およびインテグラーゼ活性などが挙げられる。転位活性を測定する例は、例えば、実施例に記載されるような技術が挙げられ、そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって決定することができる。そのような活性測定アッセイの例示としては、例えば、イントロンで分断されたｎｅｏ遺伝子が転位反応の過程で再構築されて、細胞がＧ４１８に対する耐性を獲得することなどが挙げられる。
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の対象となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。
本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよび ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本発明では、このような検索によって同定されたレトロトランスポゾン（例えば、ＩＡＰ）配列などもまた、使用され得る。
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および５０％ ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ），Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ***ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍ ナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍ ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ ＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。
レトロトランスポゾン（例えば、ＩＡＰエレメント、特に完全長のＩＡＰエレメント）またはその改変体もしくはフラグメントなどのタンパク質をコードする天然の核酸および本発明のプロモータ配列は、例えば、配列番号１、６、７などの核酸配列の一部またはその改変体を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。好ましいレトロトランスポザーゼまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ ＥＤＴＡ；４２℃の温度で ７％ ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ ＮａＣｌ；６０ｍＭ クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ ＥＤＴＡ； ７％ ＳＤＳ を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ ＮａＣｌ；３０ｍＭ クエン酸ナトリウム）；１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）；０．１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号１などに示される核酸配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の対象となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。このようなプローブを用いて本発明において使用され得るトランスポゾンを得ることができる。
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
遺伝子工学分野において通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。このようなプライマーを用いて本発明に用いるトランスポゾンを作製することができる。
本明細書において、「エピトープ」とは、抗原決定基を意味する。従って、エピトープには特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、または、Ｔ細胞の場合は、Ｔ細胞レセプタータンパク質および／もしくは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）レセプターによる認識について必要であるアミノ酸残基のセットが包含される。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用される。免疫系分野において、インビボまたはインビトロで、エピトープは、分子の特徴（例えば、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造または三次ペプチド構造および電荷）であり、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプターまたはＨＬＡ分子によって認識される部位を形成する。ペプチドを含むエピトープは、エピトープに独特な空間的コンフォメーション中に３つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、代表的には少なくとも６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のこのようなアミノ酸からなる。エピトープの長さは、より長いほど、もとのペプチドの抗原性に類似することから一般的に好ましいが、コンフォメーションを考慮すると、必ずしもそうでないことがある。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶学、および２次元核磁気共鳴分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８（１９８４）（所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；およびＧｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２３：７０９（１９８６）（所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技術）を参照されたい。同じエピトープを認識する抗体は、単純な免疫アッセイにおいて同定され得る。このように、ペプチドを含むエピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。
従って、ペプチドを含むエピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、より好ましくは５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。エピトープは、市販のキット（例えば、ＰｅｐＳｅｔＴＭ（クラボウ））を用いて当業者が容易に決定することができる。本発明では、あるシグナル伝達において役割を果たすタンパク質のエピトープを提示することによって、シグナル伝達を測定する系を利用してもよい。
本明細書においてある核酸分子またはポリペプチドに「特異的に結合する因子」とは、その核酸分子またはポリペプチドに対するその因子の結合レベルが、その核酸分子またはポリペプチド以外の核酸分子またはポリペプチドに対するその因子の結合レベルと同じかまたはそれよりも高い因子をいう。そのような因子としては、例えば、対象が核酸分子の場合、対象となる核酸分子に対して相補的な配列を有する核酸分子、対象となる核酸配列に対して結合するポリペプチド（例えば、転写因子など）などが挙げられ、対象がポリペプチドの場合、抗体、単鎖抗体、レセプター−リガンドの対のいずれか一方、酵素−基質のいずれか一方などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、このような特異的に結合する因子（例えば、カルシウムに特異的に結合する因子、特定の遺伝子産物に対する抗体など）は、シグナル伝達を測定する際に利用され得る。
本明細書において「因子」（ａｇｅｎｔ）としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書中で使用される「化合物」は、任意の識別可能な化学物質または分子を意味し、これらには、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、または核酸が挙げられるが、これらに限定されず、そしてこのような化合物は、天然物または合成物であり得る。
本明細書において「有機低分子」とは、有機分子であって、比較的分子量が小さなものをいう。通常有機低分子は、分子量が約１０００以下のものをいうが、それ以上のものであってもよい。有機低分子は、通常当該分野において公知の方法を用いるかそれらを組み合わせて合成することができる。そのような有機低分子は、生物に生産させてもよい。有機低分子としては、例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書中で使用される「接触（させる）」とは、化合物を、直接的または間接的のいずれかで、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して物理的に近接させることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在し得る。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリペプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ（例えば、遺伝子チップ）などに化合物を置くことが挙げられる。
（ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの改変）
本発明では、レトロトランスポゾン（例えば、ＩＡＰエレメント）などの機能的ポリペプチドを使用する場合、同様の機能（転位活性など）が達成することができる限り、その改変体を使用してもよい。
ここで、あるタンパク質分子において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。
親水性指数もまたアミノ酸配列の改変の際に考慮することができる。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
例えば、下記のＲＮＡコドン（それ故、対応のＤＮＡコドンではＴがＵに置き代わる）が各特定のアミノ酸をコードするのに交換可能に利用できることが当業界において周知である：フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）ＵＵＵまたはＵＵＣロイシン（ＬｅｕまたはＬ）ＵＵＡ，ＵＵＧ，ＣＵＵ，ＣＵＣ，ＣＵＡまたはＣＵＧイソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）ＡＵＵ，ＡＵＣまたはＡＵＡメチオニン（ＭｅｔまたはＭ）ＡＵＧバリン（ＶａｌまたはＶ）ＧＵＵ，ＧＵＣ，ＧＵＡ，ＧＵＧセリン（ＳｅｒまたはＳ）ＵＣＵ，ＵＣＣ，ＵＣＡ，ＵＣＧ，ＡＧＵ，ＡＧＣプロリン（ＰｒｏまたはＰ）ＣＣＵ，ＣＣＣ，ＣＣＡ，ＣＣＧスレオニン（ＴｈｒまたはＴ）ＡＣＵ，ＡＣＣ，ＡＣＡ，ＡＣＧアラニン（ＡｌａまたはＡ）ＧＣＵ，ＧＣＧ，ＧＣＡ，ＧＣＣチロシン（ＴｙｒまたはＹ）ＵＡＵまたはＵＡＣヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）ＣＡＵまたはＣＡＣグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）ＣＡＡまたはＣＡＧアスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）ＡＡＵまたはＡＡＣリジン（ＬｙｓまたはＫ）ＡＡＡまたはＡＡＧアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）ＧＡＵまたはＧＡＣグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）ＧＡＡまたはＧＡＧシステイン（ＣｙｓまたはＣ）ＵＧＵまたはＵＧＣアルギニン（ＡｒｇまたはＲ）ＣＧＵ，ＣＧＣ，ＣＧＡ，ＣＧＧ，ＡＧＡ，ＡＧＣグリシン（ＧｌｙまたはＧ）ＧＧＵまたはＧＧＣまたはＧＧＡまたはＧＧＧ終止コドン ＵＡＡ，ＵＡＧまたはＵＧＡ さらに、特定のＤＮＡ配列を修飾して特定の細胞タイプは好適なコドンを採用することができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのための好適なコドン用法は、動物およびヒトにとっての好適なコドン用法と同じように公知である。このような変更は当業者に周知であり、本発明の一部を構成する。
このようにして作製した改変体（たとえば、レトロトランスポゾン）もまた、本発明の範囲内にあり、任意のそのような改変体が本発明において利用され得る。
（抗原・抗体）
本明細書において用いられる用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらの断片、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂフラグメント、ならびにその他の組換えにより生産された結合体を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。
本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」は、同質な抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、それが作製される様式によって限定されない。この用語は、全免疫グロブリン分子ならびにＦａｂ分子、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、およびもとのモノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示す他の分子を含む。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は当該分野で公知であり、そして以下でより十分に記載される。
モノクローナル抗体は、当該分野で周知の標準的な技術（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５））またはその改変（例えば、Ｂｕｃｋら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ １８：３７７（１９８２））を使用して調製される。代表的には、マウスまたはラットを、タンパク質キャリアに結合したタンパク質で免疫化し、追加免疫し、そして脾臓（および必要に応じていくつかの大きなリンパ節）を取り出し、そして単一細胞を解離する。必要に応じて、この脾臓細胞は、非特異的接着細胞の除去後、抗原でコーティングされたプレートまたはウェルに細胞懸濁液を適用することにより、スクリーニングされ得る。抗原に特異的なイムノグロブリンを発現するＢ細胞がプレートに結合し、そして懸濁液の残渣でもリンス除去されない。次いで、得られたＢ細胞（すなわちすべての剥離した脾臓細胞）をミエローマ細胞と融合させて、ハイブリドーマを得、このハイブリドーマを用いてモノクローナル抗体を産生させることができる。
本明細書において「抗原」（ａｎｔｉｇｅｎ）とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。したがって、種々のタンパク質および遺伝子産物は、抗原または免疫原として使用され、抗原抗体反応を利用して本発明のゲノム改変産物の選択に利用することができる。
（遺伝子操作）
本明細書において、「核酸構築物」または「遺伝子カセット」とは、交換可能に用いられ、遺伝子をコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）と、これに必要に応じて作動可能に（すなわち、その核酸の発現を制御し得るように）連結された制御配列（例えば、プロモーター）とを含む核酸配列、ならびに、必要に応じて制御配列（例えば、プロモーター）と、これに作動可能に（すなわち、インフレームに）連結された異種遺伝子とを含む核酸分子をいう。このカセットまたは構築物は、必要に応じて他の調節エレメントと組み合わせて使用することもまた、本発明の範囲に含まれる。好ましい発現カセットは、特定の制限酵素で切断され、容易に回収され得る遺伝子カセットまたは核酸構築物である。
本明細書において遺伝子操作について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載されている。
本明細書において「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
原核細胞に対する組換えベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋／−）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰ、ｐＨＡＴ、ｐＵＣ１８、ｐＦＴ−ＤＥＳＴＴＭ４２ＧＡＴＥＷＡＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが例示される。
動物細胞に対する組換えベクターとしては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシより市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）］、マウス幹細胞ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｖｉｒｕｓ）（ＭＳＣＶ）に基づいたレトロウイルス型発現ベクター、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰなどが例示される。
植物細胞に対する組換えベクターとしては、ｐＰＣＶＩＣＥｎ４ＨＰＴ、ｐＣＧＮ１５４８、ｐＣＧＮ１５４９、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「ターミネーター」とは、通常遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列をいう。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。
本明細書において「プロモーター」（またはプロモーター配列）とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、通常ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」という。プロモーターの領域は、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモーター領域を推定することができる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。
本明細書において「エンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
本明細書において「サイレンサー」とは、遺伝子発現を抑制し静止する機能を有する配列をいう。本発明では、サイレンサーとしてはその機能を有する限り、どのようなものを用いてもよく、サイレンサーを用いなくてもよい。
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。ただし、ＩＡＰでは、好ましくは、直接隣接して配置されることが有利である場合がある。
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。 そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法が挙げられる。
本明細書において「遺伝子導入試薬」とは、核酸（通常遺伝子をコードするが、それに限定されない）の導入方法において、導入効率を促進するために用いられる試薬をいう。そのような遺伝子導入試薬としては、例えば、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬、リン酸カルシウムなどが挙げられるがそれらに限定されない。トランスフェクションの際に利用される試薬の具体例としては、種々なソースから市販されている試薬が挙げられ、例えば、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｃａｔ．ｎｏ．３０１４２５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２４３１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ），ＴｆｘＴＭ−２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２３９１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ），ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１３０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＰｏｌｙＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１１０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（１１６６８−０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ），ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．（１０１−３０，Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＥｘＧｅｎ ５００（Ｒ０５１１，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｉｎｃ．，ＭＤ）などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明においては、本発明の核酸分子を細胞に導入する際にこのような遺伝子導入試薬が使用され得る。
遺伝子導入効率は、単位面積（例えば、１ｍｍ２など）あたりの導入外来物質（導入遺伝子）（例えば、レポーター遺伝子の産物、蛍光タンパク質ＧＦＰなど）の導入（発現）細胞数、または総信号（蛍光タンパク質の場合は、蛍光）量を測定することによって算定することができる。
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部（組織など）をいう。形質転換体としては、原核生物、酵母、動物、植物、昆虫などの細胞などの生命体の全部または一部（組織など）が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１が例示される。あるいは、本発明では、天然物から分離した細胞も使用することができる。
本明細書において遺伝子操作などにおいて使用され得る動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト結腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、ｐｓ２０、ＮＳＯなど、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０など、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）など、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１など、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト結腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−５Ｙ、マウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ２Ａなどが例示される。あるいは、本発明では、初代培養細胞も使用することができる。
本明細書において遺伝子操作などにおいて使用され得る植物細胞としては、カルスまたはその一部および懸濁培養細胞、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科などの植物の細胞が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２００２ Ｄｅｃ；３２ Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔 羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど遺伝子産物の「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一形態であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
本明細書において「発現量」とは、目的の細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」または「発現量」の「減少」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチドの発現量の減少を含む。本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」または「発現量」の「増加」とは、細胞内に遺伝子発現に関連する因子（例えば、発現されるべき遺伝子またはそれを調節する因子）を導入したときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、ポリペプチドの発現量の増加を含む。本明細書において遺伝子の「発現」の「誘導」とは、ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。したがって、発現の誘導は、まったくその遺伝子の発現が見られなかった場合にその遺伝子が発現するようにすること、およびすでにその遺伝子の発現が見られていた場合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。
本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位（特異的部位）にのみ発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発現するとは、ある部位においてのみ発現することをいう。本発明によって生物または細胞に導入される遺伝子は、特異的に発現するように改変されていてもよい。
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含される。例えば、コラーゲンがそのリガンドと相互作用する場合、その生物学的活性は、結合体の形成または他の生物学的変化を包含する。別の好ましい実施形態では、そのような生物学的活性は、遺伝子転位活性などであり得る。遺伝子転位活性は、その目的とする遺伝子をコードする配列の移動を任意の方法によって確認することによって判定され得る。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（本明細書において引用）などを参照）。
本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、試薬、粒子など）が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、試薬、粒子など）をどのように処理すべきかを記載する説明書を備えていることが有利である。このような説明書は、どのような媒体であってもよく、例えば、そのような媒体としては、紙媒体、伝送媒体、記録媒体などが挙げられるがそれらに限定されない。伝送媒体としては、例えば、インターネット、イントラネット、エクストラネット、ＬＡＮなどが挙げられるがそれらに限定されない。記録媒体としては、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、フレキシブルディスク、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＭＤ、ミニディスク、ＭＯ、メモリースティックなどが挙げられるがそれらに限定されない。
（トランスジェニック生物）
トランスジェニックマウスを作製するための一般的な技術は、国際公開ＷＯ０ｌ／１３１５０（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）に記載されている。米国特許第４，８７３，１９ｌ号（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａ１．）は、哺乳動物接合体へのＤＮＡのマイクロインジェクションによって得られた、外因性ＤＮＡを有する哺乳動物を教示している。さらに転位性遺伝因子（トランスポゾン）を内因性ＤＮＡに挿入あるいはさらに転位させることで、該ＤＮＡの構造変化を起こしてこれを不活性化させ、動植物等の変異体を効率的に作出する方法が研究されてきている。トランスポゾンを利用した、染色体への特定遺伝子の導入・付加等が可能となってきている。これらの技術は、基本的にレトロトランスポゾンにおいても使用することができる。
このほかにもまた、トランスジェニック生物を作り出すための様々な方法は、例えば、Ｍ．Ｍａｒｋｋｕｌａら、Ｒｅｖ．Ｒｅｐｒｏｄ．，１，９７−１０６（１９９６）；Ｒ．Ｔ．ＷａｌｌらＪ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，８０，２２１３−２２２４（１９９７）；Ｊ．Ｃ．Ｄａｌｔｏｎ、ら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，４１１，４１９−４２８（１９９７）；およびＨ．Ｌｕｂｏｎら、Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．，１０，１３１−１４３（１９９６）などが挙げられるがそれらに限定されない。これらの文献の各々は、本明細書において参考として援用される。
そのような中、最近１０年間ほどで、遺伝子機能の解析を目的として、胚性幹（ＥＳ）細胞の相同組換えを介したトランスジェニック（ノックアウト、ノックインを含む）動物の解析が重要な手段となってきている。
高等生物では、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を用いる陽性選択およびＨＳＶのチミジンキナーゼ遺伝子またはジフテリア毒素遺伝子を用いる陰性選択により組換え体の効率的な選別が行われている。ＰＣＲまたはサザンブロット法により相同組換え体の選択が行われる。すなわち、標的遺伝子の一部を陽性選択用のネオマイシン耐性遺伝子等で置換し、その末端に陰性選択用のＨＳＶＴＫ遺伝子等を連結したターゲティングベクターを作成し、エレクトロポレーションによりＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８およびガンシクロビルの存在下で選択して、生じたコロニーを単離し、さらにＰＣＲまたはサザンブロットにより相同組換え体を選択する。
このように、内在する標的遺伝子を置換または破壊して、機能が喪失したかまたは変更された変異を有するトランスジェニック（標的遺伝子組換え）マウスを作製する方法は、標的とした遺伝子だけに変異が導入されるので、その遺伝子機能の解析に有用である。
所望の相同組換え体を選択した後、得られた組換えＥＳ細胞を胚盤注入法または集合キメラ法により正常な胚と混合してＥＳ細胞と宿主胚とのキメラマウスを作製する。胚盤注入法では、ＥＳ細胞を胚盤胞にガラスピペットで注入する。集合キメラ法では、ＥＳ細胞の塊と透明帯を除去した８細胞期の胚とを接着させる。ＥＳ細胞を導入した胚盤胞を偽妊娠させた代理母の子宮に移植してキメラマウスを得る。ＥＳ細胞は、全能性を有するので、生体内では、生殖細胞を含め、あらゆる種類の細胞に分化することができる。ＥＳ細胞由来の生殖細胞を有するキメラマウスと正常マウスを交配させるとＥＳ細胞の染色体をヘテロに有するマウスが得られ、このマウス同士を交配するとＥＳ細胞の改変染色体をホモに有するトランスジェニックマウスが得られる。得られたキメラマウスから改変染色体をホモに有するトランスジェニックマウスを得るには、雄性キメラマウスと雌性野生型マウスとを交配して、Ｆ１世代のヘテロ接合体マウスを産出させ、生まれた雄性および雌性のヘテロ接合体マウスを交配して、Ｆ２世代のホモ接合体マウスを選択する。Ｆ１およびＦ２の各世代において所望の遺伝子変異が導入されているか否かは、組換えＥＳ細胞のアッセイと同様に、サザンブロッティング、ＰＣＲ、塩基配列の解読など当該分野において慣用される方法を用いて分析され得る。
しかし、現在行われているトランスジェニック動物の作製技術では、多様な遺伝子機能を選択的に解析することが困難であるという欠点を有する。また容易にトランスジェニック生物を作製できないという欠点も存在する。
また、現行のトランスジェニック動物の作製は、目的の遺伝子を同定した後に、上述のようにその目的の遺伝子を一から置換または破壊および置換することが必要であり、非常に労力および時間がかかる上、熟練した研究者でも必ずうまくいくとは限らない。従って、未だに労働集約的な作業を要する仕事である。
そのため、多様な遺伝子機能を選択的に解析することができないという問題を克服する次世代技術として、Ｃｒｅレコンビナーゼの細胞種特異的発現とＣｒｅ−ｌｏｘＰの部位特異的組み換えを併用する技術が注目されている。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰを用いるトランスジェニックマウスは、標的遺伝子の発現を阻害しない位置にネオマイシン耐性遺伝子を導入し、後に削除するエキソンをはさむようにしてｌｏｘＰ配列を挿入したターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入し、その後相同組換え体を単離する。この単離したクローンからキメラマウスを得、遺伝子改変マウスが作製される。次に、大腸菌のＰ１ファージ由来の部位特異的組換え酵素Ｃｒｅを組織特異的に発現するトランスジェニックマウスとこのマウスを交配させると、Ｃｒｅを発現する組織中でのみ遺伝子が破壊される（ここでは、Ｃｒｅは、ｌｏｘＰ配列（３４ｂｐ）を特異的に認識して、２つのｌｏｘＰ配列にはさまれた配列で組換えを起こさせ、これが破壊される）。臓器特異的なプロモータに連結したＣｒｅ遺伝子を有するトランスジェニックマウスと交配させるか、またはＣｒｅ遺伝子を有するウイルスベクターを使用して、成体でＣｒｅを発現させることができる。
特定の遺伝子を解析する方法としてジーントラップ（遺伝子トラップ）法が注目されている。ジーントラップ法では、プロモータを有しないレポーター遺伝子が細胞に導入され、その遺伝子が偶発的にゲノム上に挿入されると、レポーター遺伝子が発現することを利用して、新規な遺伝子を単離（トラップ）される。ジーントラップ法は、マウス初期胚操作法，胚性幹細胞培養法，相同組換えによる遺伝子ターゲティング法に基づく、効率的な挿入変異と未知遺伝子同定のための方法である（Ｓｔａｎｆｏｒｄ ＷＬ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２：７５６−７６８（２００１））。ジーントラップ法では、遺伝子の導入ならびに挿入変異体の選択およびその表現型解析が比較的に容易である。
ジーントラップ法では、例えば、スプライシング／アクセプター配列とポリＡ付加シグナルとの間にｌａｃＺとｎｅｏとの融合遺伝子であるβ−ｇｅｏを連結したジーントラップベクターをＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８で選択すると、ＥＳ細胞で発現している遺伝子を偶然にトラップしたクローンだけが選択される。
このようにして得られたクローンからキメラ胚を作製すると、トラップした遺伝子の発現パターンにより、さまざまなＸ−ｇａｌの染色パターンを示す。このようにして、ジーントラップ法では、未知の遺伝子が単離され、その遺伝子発現パターンが解析され、またその遺伝子が破壊される。
この「レトロトランスポゾン含有トランスジェニック生物」において、レトロトランスポゾンは転位可能な状態で含まれるため染色体上の任意の部位に転位可能であり、この転位により染色体上の任意部位の遺伝子機能を破壊、低下ないし活性化することが可能である。
１つの実施形態において、本発明のこのトランスジェニック生物はレトロトランスポゾンを有する動物幹細胞または受精卵から誘導されているので、本質的に全ての細胞においてレトロトランスポゾン遺伝子を有し、コピーされて挿入されるはずである。本明細書では、「ほぼ全細胞」は、例外的に転位を受けないようなこのような特別な細胞を除く全細胞を意味する。上記生物は、その各細胞においてレトロトランスポゾンがランダムに転位しており、そのため、レトロトランスポゾンにより導入された遺伝子変異に関して個体全体として統一的な変異が見いだされない。
本発明においては、所望のトランスジェニック生物をプレスクリーニングし得る。プレスクリーニングの方法としては、例えばジーントラップ法を用いることができる（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ ｅｔ ａ１．；Ｎａｔｕｒｅ，３９２：６０８・６１１（１９９８）；Ｇｏｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：４６３−４６５（１９８９）；Ｓｋａ１１ｎｅｓ，ＷＣ．ｅｔ ａｌ．；Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．６：９０３・９１８（１９９２）；Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．；Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：１５１３−１５２３（１９９１））。このように、プレスクリーニングを行うことにより遺伝子機能の解明に有望な．トランスジェニック生物を予め選抜してその後２世代以上の交配あるいはその他適宜の手段により、１対の染色体の両遺伝子が変異したトランスジェニック生物を得ることができる。
遺伝子破壊してその表現型を解析する手法は、遺伝子機能を解明するための有効な手段である。哺乳動物個体、特にマウスで網羅的に遺伝子破壊を起こし表現型を解析するためには、克服しなければいけない大きな問題点が二つある。一番目は、網羅的に遺伝子破壊を起こし表現型を目安に遺伝子機能を探る手法、いわゆるフォワードジェネティックスが整備されていないことである。二番目は、遺伝子が一対（両対立遺伝子）あるために片側の遺伝子を破壊しただけでは表現型が現れないことである。両対立遺伝子変異を導入するためには、現在のところ片側の遺伝子が破壊された個体同士の交配に依存している。つまり、両対立遺伝子変異導入個体を得るための交配に長時間をかける必要性がある。
一番目の問題点は、本発明において改良されたレトロトランスポゾンシステムでよりよく克服できる。二番目の問題点は、迅速な両対立遺伝子変異導入法により克服できる二番目の問題点を克服するための具体的手段として、両対立遺伝子変異を有する細胞が高頻度に現れるＢｌｏｏｍ遺伝子ノックアウトマウスを用いることができる（Ｇ．Ｌｕｏ ｅｔ ａ１．；Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２６：４２４・４２９（２０００））。Ｂｌｏｏｍ遺伝子を調節可能に発現させるための一例としてのテトラサイクリンレギュレータブルユニット（Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎ ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ ｕｎｉｔ）のような手段の導入は、レトロトランスポゾンシステムと組み合わせて行う。例えば、レトロトランスポゾンなどが導入される受精卵等に予めＢｌｏｏｍ遺伝子を調節可能に発現する手段を導入しておいて交配を行う。得られたレトロトランスポゾン転位部位が導入されたマウスに、ＢＩｏｏｍ遺伝子の発現を抑制する手段（例えばテトラサイクリンの投与）を実施することで、レトロトランスポゾンシステムにより得られた遺伝子の変異を両対立遺伝子に導入し、表現型の確認を迅速に行うことができる。本発明において選択マーカー遺伝子を用いない場合は、該トランスジェニック生物の細胞からＤＮＡを抽出し、サザンプロット法により転位の有無を調べることで、スクリーニングを行ない得る。本発明によれば、動物体内で、効率のよいレトロトランスポゾン配列の転位を達成することができる。レトロトランスポゾンを用いた変異の導入法によれば、他の方法に比べ、多種多様な表現型をもつ生物を効率よくかつランダムに得ることが可能となる。本発明のトランスジェニック生物は、遺伝子機能研究において、多様な遺伝子変異を導入することにより、複雑な生命現象を解明するためのツールとしてきわめて有用である。
本発明では、レトロトランスポゾン発現システムが動物またはその組織、器官などの細胞集合体となることでレトロトランスポゾンの転位効率が飛躍的に高めることが容易になったのは、本発明において初めて見出された知見である。
本発明の１実施態様によれば遺伝子機能を鮮明する手段として、ランダムにレトロトランスポゾン構築物を導入したトランスジェニック生物群の中から、マーカーあるいは他の手段によりランダムに導入された変異を有する個体を見出すことが可能である。遺伝子機能を網羅的に解析するには、レトロトランスポゾンがゲノムのより多くの部位へ転位する必要がある。
本発明によれば、異なる種マウスから変異マウスを作製することにより、約３万以上あるとされる遺伝子のほぼ全てについて網羅的に変異導入することも可能である。このように、変異を有する生物個体を解析する際、本発明では遺伝子変異の発現頻度が極めて高いので、複数の変異をもつ生物が１個体得られれば、多くの変異の機能変化を一度で分析することができ、遺伝子機能の解明を極めて効率的に行うことができる。トランスポゾン（ＤＮＡ型）であれば、転位が起こる部位が限定されていることから、網羅率は限定的なものであったが、本発明によって、レトロトランスポゾンが容易に利用することができるようになったことから、上記網羅的変異導入もまた可能となった。
本発明によれば、得られたトランスジェニック生物を交配することで、転位が固定された遺伝子解明上有用な生物を得ることが司能である。ここで「転位が固定された」とは、活性なレトロトランスポゾンを有さないためレトロトランスポゾンの転位によるゲノムの改変数が増加しないことを意味する。具体的には、レトロトランスポゾンがスイッチオフされているか、あるいはレトロトランスポゾンが破壊されていることなどを指す。このようなトランスジェニック哺乳動物個体が得られれば、１個体を調べることで、対応する１種の遺伝子機能をシンプルに解析することができる。
本発明では、レトロトランスポゾンにより変異を導入しているため、突然変異誘発物質などを用いて変異を導入するのと比較して、どこに変異が導入されたのかを外来遺伝子配列あるいはレトロトランスポゾン構築物由来の配列を利用してＰＣＲ等の適当な方法により、容易に検出することができる。また、本発明の実施態様においては、培養細胞でなく個体の生物で遺伝子変異を導入することにより、個体レベルでの遺伝子機能の解析が可能である。また、生物個体を生存させたままの状態では操作が困難な組織に対しても、外部から手を加えることなしに、個体体内で遺伝子変異を導入し得る。さらに、同じ組織内であっても転位部位が異なり、従って遺伝的に異なる一群の細胞が存在するので、血液系、免疫系などの任意の組織・臓器・器官で、増殖、分化等における細胞系譜を系統的に調べることができる。
本発明によれば、本発明の新規な生物、特にマウスは、遺伝子機能解明のための便利なモデルシステムを提供する。本発明のこの実施態様は、生きた動物モデルにおいて遺伝性疾患の研究のための疾患モデルシステムを提供し得る。該システムにおいて、動物モデルに導入される疾患遺伝子としては、ヒト疾患原因遺伝子、または生物におけるその相同遺伝子がｃＤＮＡの遺伝子全長、ｃＤＮＡの遺伝子断片、ゲノムＤＮＡの遺伝子全長、あるいはゲノムＤＮＡの遺伝子断片であるものが挙げられる。疾患原因遺伝子は、生物に導入して、得られたトランスジェニック生物をヒト疾患モデル動物として研究に供し得るものであればいずれでも良く、特に限定されないが、ヒト疾患原因遺伝子であるのが好適である。本発明によれば、種々のエンハンサーを含むレトロトランスポゾンが癌原遺伝子の近傍に転位した場合、これらを包含する細胞においては結果的に癌が発現するため、これにより癌原遺伝子をスクリーニングできる。特に、レトロトランスポゾン配列を含むトランスジェニック生物を用いた場合、癌原遺伝子の発現はクローナルであるため、癌は組織だけでなく全体に転位し得る。また同時に、各動物細胞内で転位による遺伝子機能の低下、破壊ないし活性化がランダムに進行しているので、複数の癌が同一個体内で発生することも予測され、癌に関与する遺伝子機能の解明を効率よく進めることができる。さらに、同一個体内で複数の癌を認めた場合、各々の癌細胞においてトランスポゾンベクターの挿入部位が同じかどうかを調べることによって、癌細胞が同一の細胞に由来しているかどうかを調べることができ、癌の転位のメカニズム研究に寄与し得る。
本発明では、本発明のトランスジェニック生物を臓器提供用ドナーとして使用することができる。例えば、ヒトヘの異種間臓器移植のドナーとして考えられる臓器として、具体的には神経細胞、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、角膜、皮膚などが挙げられる。この場合、導入される遺伝子は、例えば異種間での臓器移植に拒絶反応を低減する機能を有する遺伝子あるいは生着率の上昇を期待し得る機能を有する遺伝子が好ましい。
トランスジェニック生物の作製についてはまた、米国特許第５，４６４，７６４号公報；米国特許第５，４８７，９９２号公報；米国特許第５，６２７，０５９号公報；特開２００１−５４３３７号公報；Ｇｏｓｓｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，４６３−４６５；Ｗｕｒｓｔ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３９，８８９−８９９；Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ、Ｂ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ ３９２，６０８−６１１Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，８９３２−８９３５，１９８９；Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４２，４３５−４３８，１９８９；村松正實、山本雅編集、『実験医学別冊 新訂 遺伝子工学ハンドブック 改訂第３版』（１９９９年、羊土社発行）中特に２３９から２５６頁；相沢慎一（１９９５）実験医学別冊「ジーンターゲティング−ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において、「ノックアウト」とは、遺伝子について言及されるとき、その遺伝子を破壊（欠損）または機能不全にさせることをいう。従って、ノックアウトの概念は、トランスジェニックの中に含まれる。
本明細書において、「ノックアウト生物」とは、ある遺伝子がノックアウトされた生物（例えば、マウス）をいう。従って、ノックアウト生物の概念は、トランスジェニック生物の中に含まれる。
本明細書においてトランスジェニックの対象とされる「生物」は、トランスポゾンが作用し、そのような系が機能し得る任意の生物が含まれる。このような生物には、動物、植物、細菌などが含まれるがそれらに限定されない。
本明細書において、「動物」は、核酸配列（好ましくは遺伝子をコードする外来配列）の導入を目的とすることができるものであればどのような動物であってもよい。従って、動物には、脊椎動物および無脊椎動物が包含される。動物としては、哺乳動物（例えば、マウス、イヌ、ネコ、ラット、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、イルカ、クジラ、ヤギ、ウマなど）、鳥類（例えば、ニワトリ、ウズラなど）、両生類（例えば、カエルなど）、爬虫類、昆虫（例えば、ショウジョウバエなど）などが挙げられる。好ましくは、動物は、哺乳動物であり得、より好ましくは、ノックアウトを作製することが容易な動物（例えば、マウス）であり得る。別の好ましい形態では、動物は、ヒトのモデル動物として適切であることが判明している動物（例えば、サル）であり得る。ある実施形態では、動物は、非ヒト動物または非ヒト哺乳動物であり得るが、それに限定されない。例えば、ブタ、サル・ウシ・ウマ・ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、またはハムスター等であり、より好ましくは、マウスまたはラットである。ここで本発明の生物には、特に言及しない限り、哺乳動物個体だけでなく個体の一部および個体の有する臓器、器官も包含される。これらはヒト疾患モデルとして、また臓器移植用ドナーとして有用である。
本明細書において用いられる「植物」とは、植物界に属する生物の総称であり、クロロフィル、かたい細胞壁、豊富な永続性の胚的組織の存在，および運動する能力がない生物により特徴付けられる。代表的には、植物は、細胞壁の形成・クロロフィルによる同化作用をもつ顕花植物をいう。「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。好ましい植物としては、例えば、イネ、コムギ、トウモロコシ、オオムギ、ソルガムなどのイネ科に属する単子葉植物が挙げられる。より好ましくは、植物は、イネであり得る。イネとしては、ジャポニカ種、インディカ種のものが挙げられるがそれらに限定されない。より好ましくは、イネは、ジャポニカ種のものであり得る。本明細書において、イネの品種としては、例えば日本晴、ニホンマサリ、コシヒカリ、あきたこまち、どんとこい、ヒノヒカリなどが挙げられるがそれらに限定されない。インディカ種の品種としては、Ｔｅｔｅｐ、Ｂａｓｍａｔｉ、ＩＲ８、湖南早などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましい植物は作物に限られず、花、樹木、芝生、雑草なども含まれる。特に他で示さない限り、植物は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいずれをも意味する。植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。
イネ科の植物の例としては、Ｏｒｙｚａ、Ｈｏｒｄｅｎｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｃｃｃｈａｒｕｍ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ、またはＺｅａに属する植物が挙げられ、例えば、イネ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、モロコシ、トウモロコシなどを含む。
本発明の生産方法に用いられる植物は、好ましくは単子葉植物であり、より好ましくは、イネ科植物である。さらに好ましくは、イネであり得る。
上述の生物において、遺伝子の導入技術はマイクロインジェクション、核酸フラグメントと陽イオン脂質小胞体またはＤＮＡ凝縮試薬との組合せ；ならびに核酸フラグメントをウィルスベクターに導入し、そしてこのウィルスベクターを細胞と接触させること、ならびに粒子ボンバードメントおよびエレクトロポレーションから成る群より選ばれる方法を含む。
本明細書において使用され得るウィルスベクターはレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、ヘルペスウィルスまたはアデノ関連ウィルスベクターからなる群より選ばれるものが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「レトロウイルス」とは、ＲＮＡの形で遺伝情報を有し、逆転写酵素によってＲＮＡの情報からＤＮＡを合成するウイルスをいう。したがって、「レトロウイルスベクター」とは、レトロウイルスを遺伝子の担い手（ベクター）として使用した形態をいう。本発明において使用される「レトロウイルスベクター」としては、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ（ＭＭＬＶ）、Ｍｕｒｉｎｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｖｉｒｕｓ（ＭＳＣＶ）にもとづいたレトロウイルス型発現ベクターなどが挙げられるがそれらに限定されない。
好ましくは、レトロウイルスベクターとしては、ｐＧｅｎ−、ｐＭＳＣＶなどが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において使用される場合「ジーントラップ（法）」とは、目的の細胞に、例えば、プロモーターを欠いたレポーター遺伝子を導入し、染色体上で活性化されているプロモーターの下流に挿入された場合にのみレポーター活性が検出できること利用した遺伝子の同定方法をいう。このようなジーントラップは、「ジーントラップベクター」を、真核生物の宿主染色体中に導入して、宿主遺伝子を破壊することにより達成される。レポーター遺伝子が挿入された遺伝子は、レポーターとの複合タンパク質を発現するため、そのタンパク質をモニターすることによって遺伝子を同定することが可能である。したがって、相同組換えと同様に本来の遺伝子座にレポーター遺伝子が組み込まれるため、転写調節が完全なレポーター系を作ることができる。この手法を用いることによって、遺伝子破壊によって変異体を単離する手法では、得られなかった遺伝子の同定を行うことができる。したがって、本発明では、このようなジーントラップ法もまた利用することができる。
本明細書において「ジーントラップベクター」とは、真核生物遺伝子のｍＲＮＡが成熟ｍＲＮＡとなる過程においてスプライシングを受ける現象を利用して、遺伝子中へ挿入されたベクターを選択するためのベクターである。ジーントラップベクターとしては、（１）プロモーターを有さないレポーター遺伝子のコード領域、およびスプライスアクセプター部位を含むＤＮＡ配列を含むベクター、または（２）プロモーターを有するレポーター遺伝子のコード領域、およびスプライスドナー部位を含むＤＮＡ配列を含むベクター、ならびに（３）これら（１）および（２）の両方のＤＮＡ配列を含むベクターが挙げられるがこれらに限定されない。
上述のようなスプライスアクセプター配列を含むジーントラップベクターは、必要に応じて、ポリＡ付加シグナルを含んでもよい。スプライスドナー配列を含むジーントラップベクターは、必要に応じて、エンハンサー領域、および／またはｍＲＮＡ不安定化領域を含んでもよい。ポリＡ付加シグナルとしては、「ＡＡＴＡＡＡ」が挙げられるが、これに限定されない。
本発明において使用するプロモーターとしては、ＭＣ１プロモーター、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターなどが挙げられるがそれらに限定されない。
本発明において使用されるエンハンサーとしては、ポリオーマウイルスエンハンサー（ＰＹＦ４４１）などが挙げられるがそれらに限定されない。
本発明において使用されるスプライスドナー配列としては、マウスｈｐｒｔ遺伝子エキソン８スプライスドナーが挙げられるがそれらに限定されない。
本発明において使用されるスプライスアクセプター配列としては、ヒトｂｃｌ−２遺伝子エキソン３スプライスアクセプターが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において使用される「レポーター」分子または「レポーター」遺伝子とは、細胞内において遺伝子発現の指標として使用することのできる分子（例えば、ポリペプチド）または遺伝子をいう。そのような分子としては、公知のレポータータンパク質を用いることができ、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはエクオリンなどが挙げられる。ここで、遺伝子の導入方法自体は、当該分野において公知の技術をもちいて所望の材料を用いて行うことができる。そのような場合、例えば、目的とする胚性幹細胞に、例えば、プロモーターを欠いたレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、アルカリホスファターゼ遺伝子、Ｃｒｅレコンビナーゼ遺伝子など）を導入し、染色体上で活性化されているプロモーターの下流に挿入された場合にのみレポーター活性が検出する。使用されるベクターはこのレポーター遺伝子のほか、選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、レスキューマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子＋コリシンＥ１複製開始起点）などを含んでいてもよい。ここで、選択マーカー遺伝子は、ベクターが入った宿主を選択するために使用される。レスキューマーカー遺伝子は、ベクターをレスキューするために使用される （Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．ｅｄ．”Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ”（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）を参照のこと）。上述のような技術を用いることによって、胚性幹細胞が生成される。この改変胚性幹細胞は、遺伝子がトラップされている。ここで、トラップされているとは、ゲノムへのトラップベクターの挿入により内在性遺伝子が破壊され、同時にそのベクターによって破壊された遺伝子がマーキングされた状態をいう。
特定の配列を有するオリゴヌクレオチドの調製は、当該分野において周知の技術を用いて行うことができ、例えば、Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．ｅｄ．”Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ”（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）に記載される方法で行うことができる。オリゴヌクレオチドは、必要に応じて、蛍光、放射能などで標識することができる。そのような標識方法は当該分野において周知であり、本明細書において引用される文献に記載されている。
（スクリーニング）
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の方法または生物を使用することができる。本発明では、種々のトランスジェニック生物が作製されることから、任意の核酸分子およびその機能調節因子をスクリーニングすることができる。
本発明では、任意の核酸分子を本発明の核酸分子、方法またはシステムを利用することによってスクリーニングすることができる。本発明はまた、そのようなスクリーニングによって同定された化学物質またはその組み合わせを包含することが企図される。
本発明のトランスポゾンシステムは種々の分野に応用できる。例えば、１）本発明の方法を利用して生物の染色体への遺伝子材料を効率的に挿入することができる；２）挿入変異因子としてのトランスポゾンの利用により、生命体の成長、維持、調節および発育に関わる遺伝子の同定、単離および特性を決定することができる（例えば、Ｋａｉｓｅｒら、１９９５「Ｅｕｋｅｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ，ｅｌｅｍｅｎｔｓ ａｓ ｔｏｏｌｓ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｇｅｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ」 Ｍｏｂｉｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．６９−１００）；３）生命体の成長、維持、調節および発育を調節する転写調節配列の同定、単離およびをの同定することができる（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９６，Ｍｏｌ．Ｍａｒ．Ｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，５，１０５−１１３）。一例において、本発明の方法およびシステムは無菌遺伝子導入マウスを作るために利用できる。活性化遺伝子を有する同腹群を交配させ、生物的封じ込めまたは養殖魚の成長率を最大にするために無菌子孫を作ることができる。
（遺伝子治療）
本発明の用途としては、核酸フラグメントを修飾して細胞に遺伝子治療を施す遺伝子を組込むことが挙げられる。遺伝子は組織特異的プロモーターのコントロール下、または汎存プロモーター、またはその遺伝子を必要とする細胞における遺伝子の発現のための１もしくは複数のその他の発現コントロール領域のコントロール下に置く。遺伝子治療に使用される遺伝子としては、例えば、嚢胞性線維症のためのＣＦＴＲ遺伝子、肺疾患のためのα−１−アンチトリプシン、免疫系疾患のためのアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、血液細胞疾患のための１×因子およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）、ならびに癌治療のための腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などが挙げられるがそれらに限定されない。
遺伝子治療に使用することが可能な遺伝子配列は公知のデーターベース、例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ等において検索し、入手できる。
さらに、本発明は、ライブラリーで作業するまたはそれをスクリーニングするための工程の一部として、配列の機能を評価するため、またはタンパク質発現をスクリーニングするため、または特定の細胞タイプに対する特定のタンパク質または特定の発現コントロール領域に対する効果を評価するために利用することができる。１つの実施形態において、組換え配列のライブラリー、例えばコンビナトリアルライブラリーまたは遺伝子シャフリングの生成物を本発明の核酸フラグメントの中に組込んで、種々の核酸配列を有する核酸フラグメントのライブラリーを作る。次いでこのライブラリーを前述の通りレトロトランスポゾンと一緒に細胞の中に導入する。
（発明を実施するための最良の形態）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。
（ＬＴＲ型レトロトランスポゾンの核酸構築物）
１つの局面において、本発明は、ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、単離された核酸構築物を提供する。従来ＬＴＲ型レトロトランスポゾンが、ゲノム異常に関連することは知られていたが、従来は、ゲノム上の未知の部位に存在する活性型のＬＴＲ型トランスポゾン由来の別の因子が必要であると考えられていた。従って、実際に単離されたＬＴＲ型レトロトランスポゾンがそれ単独で使用することによって、ゲノムの改変、遺伝子の転位、外来遺伝子の導入などに適用することができることが示されたことはなく、本発明は、単独このような用途を実施することを示したという意味で予想外の効果を示すといえる。
ＬＴＲ型レトロトランスポゾンは、ＬＴＲを有する任意のレトロトランスポゾンを使用することができ、そのような配列を有する核酸構築物を当該分野において周知の遺伝子操作方法を用いて構築することができる。このような核酸構築物は、ゲノムの改変など、上述の種々の有用性を有することが当業者が理解することができる。
好ましい実施形態において、上記ＬＴＲ型レトロトランスポゾンは、Ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ Ａ ｐａｒｔｉｃｌｅ（ＩＡＰ）型レトロトランスポゾン、ｅａｒｌｙ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ（ＥＴｎ）、ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ３０Ｓ ＲＮＡ（ＶＬ３０）レトロトランスポゾンなどを含む。
好ましい実施形態において、上記レトロトランスポゾンは、完全長ＩＡＰを含む。従来完全長ＩＡＰエレメントというものが提唱されているが、本発明では、実際に転写、逆転写およびゲノムへの挿入活性を有するＩＡＰエレメントを完全長ＩＡＰエレメントという。従って、従来完全長ＩＡＰエレメントと言われているものの中には、本発明の定義では完全長ＩＡＰエレメントに該当しないこともあり得る。しかし、本発明の核酸構築物を用いなければ、このようなレトロトランスポゾン（特にＬＴＲ型）の活性を確認することができなかったことから、すでに配列が知られたものにおいて本発明のＩＡＰ配列に該当するものが包含されることが理解されるべきであり、そのような配列もまた、本発明の目的において使用することが理解され得る。また、好ましくは、ＩＡＰについて完全長には、ＧＡＧタンパク質のはじめの１５アミノ酸（配列番号１のうち、Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ）を含むことが有利であることが本発明において実証されている。
好ましい実施形態において、上記レトロトランスポゾンは、コードするポリペプチドが機能性である。ここで、機能性であるかどうかを検定する方法は、転写、逆転写およびゲノムへの挿入活性を調べることによって確認することができ、そのような例示として以下の実施例に例示される。従って、機能としては、例えば、転写活性、逆転写活性およびインテグラーゼ活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性好ましくは２以上より好ましくはすべてが含まれることが理解される。
好ましい実施形態において、本発明のレトロトランスポゾンは、ＬＴＲ（特にＲ領域）、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｔＲＮＡ結合部位に対応する少なくとも１つの配列（このような配列をコンセンサス配列ということがある）を含む。ここで、このコンセンサス配列は、ＩＡＰに関する機能性に関するコンセンサス配列であることが好ましい。
本明細書において、レトロトランスポゾン（たとえば、ＩＡＰエレメント）は、動物のものであることが好ましく、より好ましくは、哺乳動物のものであり、さらに好ましくは、げっ歯類または霊長類のものであり、もっとも好ましくはマウスのものであるがそれらに限定されない。
１つの好ましい実施形態において、本発明において使用されるレトロトランスポゾンは、その核酸配列において、５’側のＬＴＲ直下にあるｔＲＮＡ結合部位において、ｔｃｃｇｇｇａｃｇａｇａａａａ（配列番号３１）の配列が反復していること、およびＲ領域のｔｔｇｃｔｔｃｔｔｇｃｔｃｔｃ（配列番号３２）からなる反復配列を２以上含むことからなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する。ここで、この共通配列は、機能性ＩＡＰをコードする。より好ましくは、今回用いたＩＡＰ配列の特徴として、５’側のＬＴＲ直下にあるｔＲＮＡ結合部位において、ｔｃｃｇｇｇａｃｇａｇａａａａ（配列番号３１）の配列が反復していること（ａ）、および、Ｒ領域のｔｔｇｃｔｔｃｔｔｇｃｔｃｔｃ（配列番号３２）からなる反復配列が５つと多いこと（ｂ）が挙げられる。理論に束縛されないが、ａについては、Ｑ１４等の白血病細胞に特異的な配列は、５’−ＬＴＲ直下にあるｔＲＮＡ結合部位である−ｔｇｇｔｇｃｃｇａａｔｔｃｃｇｇｇ−（配列番号３３）の後半から−ＡＡＴＣＣＧＧＧＡＣＧＡＧＡＡ配列（配列番号３４）がタンデムに反復していることが本発明のＩＡＰにおいて見出されたからである。これは、逆転写の最初にｔＲＮＡ−Ｐｈｅがプライマーとして結合する部位であるが、生殖系列（ｇｅｒｍ ｌｉｎｅ）ＩＡＰエレメントには反復の保持されているものが少なく、腫瘍で同定された特異ＩＡＰエレメント挿入部位では全て保持されていることから、逆転写の最初の過程で影響している可能性があると考えるからである。理論に束縛されないが、ｂについては、Ｒ領域にはＴＴＧＣＴＴＣＴＴＧＣ（配列番号３５）とＴＣＴＣからなる反復配列があり、その反復数が多いことによって、初期逆転写物が二次逆転写を開始する分子間スイッチの部分に相当することから、逆転写の中間過程で影響すると考えられる。
いずれも、ＭＩＡ１４等のＢａｌｂ／ｃ系で分離されたＩＡＰエレメントには見られない特徴であり、本発明が機能的であることの一つの特徴であると考えられるが、それらが必須というわけではない。
特定の好ましい実施形態において、本発明において使用されるレトロトランスポゾンは、
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２または３および４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２または３および４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２または３および４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含み得る。
さらに好ましくは、本発明のレトロトランスポゾンは、配列番号１に示される配列を含み得る。あるいは、本発明のレトロトランスポゾンをコードする核酸配列を含む核酸分子は、配列番号１に示される配列を含み得る。
１つの好ましい実施形態において、上記（ｃ）における置換、付加および欠失の数は、限定され、例えば、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１５以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下であることが好ましい。より少ない数の置換、付加および欠失が好ましいが、生物学的活性を保持する（好ましくは、配列番号２または３および４に示されるアミノ酸配列を含むレトロトランスポゾンと類似するかまたは実質的に同一の活性を有する）限り、多い数であってもよい。
別の好ましい実施形態において、上記改変体ポリペプチドが有する生物学的活性としては、例えば、配列番号２または３および４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体との相互作用、未分化性維持、細胞外マトリクスとの相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、そのような生物学的活性は、未分化性維持を含む。この活性を測定するためには、遺伝子導入実験、遺伝子欠損実験、ＲＮＡｉ実験、抗体によるタンパク質機能阻害実験等が考えられる。
別の好ましい実施形態において、対立遺伝子変異体は、配列番号１に示す核酸配列と少なくとも９０％の相同性を有することが好ましい。同一系統内のものなどでは、例えば、そのような対立遺伝子変異体は少なくとも９９％の相同性を有することが好ましい。
上記種相同体は、その種の遺伝子配列データベースが存在する場合、そのデータベースに対して、本発明の配列番号２または３および４に示されるアミノ酸配列を含むレトロトランスポゾンポリペプチドの全部または一部のアミノ酸配列、または配列番号１に示される核酸配列を含む、レトロトランスポゾンをコードする核酸分子の全部または一部の核酸配列をクエリ配列として検索することによって同定することができる。あるいは、本発明のレトロトランスポゾンの核酸配列の全部または一部をプローブまたはプライマーとして、その種の遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。そのような同定方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載される文献にも記載されている。種相同体は、例えば、配列番号１に示す核酸配列と少なくとも約３０％の相同性を有することが好ましい。種相同性は、好ましくは、配列番号１に示す核酸配列と少なくとも約５０％の相同性を有する。
好ましい実施形態において、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性は、少なくとも約８０％であり得、より好ましくは少なくとも約９０％であり得、さらに好ましくは少なくとも約９８％であり得、もっとも好ましくは少なくとも約９９％であり得る。
好ましい実施形態において、本発明の核酸分子は、少なくとも８の連続するヌクレオチドであり得る。本発明の核酸分子は、本発明の使用目的によってその適切なヌクレオチド長が変動し得る。より好ましくは、本発明の核酸分子は、少なくとも１０の連続するヌクレオチド長であり得、さらに好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチド長であり得、なお好ましくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であり得る。これらのヌクレオチド長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、９、１１、１２、１３、１４、１６など）あるいは、それ以上の数（例えば、２１、２２、．．．３０、など）であってもよい。本発明の核酸分子は、目的とする用途（例えば、マーカー）として使用することができる限り、その上限の長さは、配列番号１に示す配列の全長であってもよく、それを超える長さであってもよい。あるいは、プライマーとして使用する場合は、通常少なくとも約８のヌクレオチド長であり得、好ましくは約１０ヌクレオチド長であり得る。プローブとして使用する場合は、通常少なくとも約１５ヌクレオチド長であり得、好ましくは約１７ヌクレオチド長であり得る。
より好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；または（ｂ）配列番号２または３および４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドであり得る。
ある好ましい実施形態において、本発明の核酸分子は、その核酸配列において、ＬＴＲ、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｔＲＮＡ結合部位からなる群より選択される少なくとも１つのドメインを含むか、あるいは、５’側のＬＴＲ直下にあるｔＲＮＡ結合部位において、ｔｃｃｇｇｇａｃｇａｇａａａａの配列が反復していること、およびＲ領域のｔｔｇｃｔｔｃｔｔｇｃｔｃｔｃからなる反復配列を２以上含むことからなる群より選択される少なくとも１つの特徴の対応する位置のものがあるがそれらに限定されない。
ここで、より好ましい実施形態では、上記（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性は、少なくとも約８０％であり得、より好ましくは少なくとも約９０％であり得、さらに好ましくは少なくとも約９８％であり得、もっとも好ましくは少なくとも約９９％であり得る。
好ましい実施形態において、本発明のレトロトランスポゾンをコードする核酸分子またはそのフラグメントおよび改変体は、少なくとも８の連続するヌクレオチド長であり得る。本発明の核酸分子は、本発明の使用目的によってその適切なヌクレオチド長が変動し得る。より好ましくは、本発明の核酸分子は、少なくとも１０の連続するヌクレオチド長であり得、さらに好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチド長であり得、なお好ましくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であり得る。これらのヌクレオチド長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、９、１１、１２、１３、１４、１６など）あるいは、それ以上の数（例えば、２１、２２、．．．３０、など）であってもよい。本発明の核酸分子は、目的とする用途（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉ、マーカー、プライマー、プローブ、所定の因子と相互作用し得ること）として使用することができる限り、その上限の長さは、配列番号１に示す配列の全長であってもよく、それを超える長さであってもよい。あるいは、プライマーとして使用する場合は、通常少なくとも約８のヌクレオチド長であり得、好ましくは約１０ヌクレオチド長であり得る。プローブとして使用する場合は、通常少なくとも約１５ヌクレオチド長であり得、好ましくは約１７ヌクレオチド長であり得る。
特定のより好ましい実施形態において、本発明のレトロトランスポゾンは、配列番号１（効果のあった種の配列）を含む。
（ＬＴＲ型レトロトランスポゾンの核酸構築物−プロモーター含有形態）
本発明の好ましい実施形態において、本発明の核酸構築物は、レトロトランスポゾン配列の他に、プロモーター配列を含む。プロモーターは、レトロトランスポゾンの転写、逆転写およびゲノムへの挿入において駆動することができるかぎりどのようなプロモーターでも用いることができる。そのようなプロモーターは、いったん配列情報が与えられると、有機合成または生物学的に調製することができる。
好ましい実施形態において、本発明において使用されるプロモーター配列は、ルシフェラーゼ遺伝子上流にそのプロモーター配列を配置して、動物細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）に遺伝子導入した際に得られる値をＣＭＶプロモーターを用いて得られた値で割った数値が０．１ｒｌｕ（相対光単位＝ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）以上の活性を示す。すなわち、ＣＭＶプロモーターの少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、さらにより好ましくは同等以上の活性を有することが有利である。このように強力なプロモーター活性を有することによって、ＩＡＰが自己完結型かどうかを観察することが初めて可能となった。
このような強力なプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＣＡプロモーターなどが挙げられるがそれらに限定されない。具体的な配列としては、例えば、配列番号５、６および７からなる群より選択される、１以上の核酸配列、あるいはこれに対して１または数個の付加、欠失および置換からなる群より選択される変異を含むこれらの改変体などが挙げられるがそれらに限定されない。そのような改変体は、ＣＭＶプロモーターと少なくとも約１０％の活性を有している限り本発明の範囲内にあることが理解される。
より好ましい実施形態において、本発明において使用されるプロモーター配列は、レトロトランスポゾンにおける５’ＬＴＲの一部と置き換えられる。この置き換えは、プロモーター活性が保持されるように行われることが好ましい。このように置き換えた配列は、当該分野において周知の方法によって作製することができる。
１つの好ましい実施形態において、本発明において使用されるプロモーター配列は、前記レトロトランスポゾンにおける前記５’ＬＴＲのうちＵ３領域の全部または一部と置き換えられる。Ｕ３領域の置き換えは、プロモーター配列が発揮される（好ましくは０．１ｒｌｕ以上）ように行われる限り、どのように置換されていてもよい。
好ましい実施形態において、本発明の核酸構築物において使用されるプロモーター配列は、レトロトランスポゾンに作動可能に連結される。ここで、作動可能に連結されているかどうかは、プロモーター活性が発揮されたかどうかを、例えば、転写活性、逆転写活性およびインテグラーゼ活性の有無によって確認することができる。
より好ましい実施形態では、このプロモーター配列は、その転写開始部位がレトロトランスポゾンの転写開始部位にインフレームで配置されることが有利である。この形態は、特に、ＩＡＰが用いられる場合に好ましい。理論に束縛されることを好まないが、ＩＡＰでは、レトロトランスポゾンの転写開始部位が重要であるということがより高い活性に好ましいとされており、より効果的な転位を促進するためには、このようなインフレームな配置が好ましい。インフレームな配置は、プロモーター配列と、転写されるレトロトランスポゾンの転写開始位置とを直接間に介在配列を介させることなく連結させることによって達成することができる。
（ＬＴＲ型レトロトランスポゾンの核酸構築物−外来遺伝子の転位のための核酸構築物）
別の好ましい実施形態において、本発明の核酸構築物は、外来遺伝子をコードする配列をさらに含む。外来遺伝子をコードする核酸は、どのような遺伝子産物をコードするものであってもよく、どのような位置に配置されていてもよいが、好ましくは、レトロトランスポゾン内に配置される。
好ましい実施形態において、本発明の外来遺伝子は、識別可能な特性を宿主に付与するものであることが好ましい。そのような識別可能な特性は、抗生物質耐性、栄養補充性、酵素、蛍光タンパク質、化学発光タンパク質、色素などが挙げられるがそれらに限定されない。ここで、具体的な外来遺伝子としては、ｎｅｏ、ＧＦＰ、ｈｙｇ、ｐｕｒｏ、ｚｅｏ、ｂｓｒ、ｌａｃＺ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰおよびｈｒＧＦＰなどが挙げられるがそれらに限定されない。
好ましい実施形態において、本発明の核酸構築物に含まれる外来遺伝子は、転写、逆転写およびゲノムへの挿入の過程を経ることによって初めて発現されるように構成される。そのような構成は、当業者であれば、どのように構築することができるかは理解することができるが、一例として、例えば、外来遺伝子がリバースに配置されていたり、あるいは、イントロン配列を介在させることなどが方法として考慮することができる。
従って、本発明の核酸構築物において使用される場合、外来遺伝子は、イントロン配列を含んでいることが好ましいがそれに限定されない。イントロン配列としては、任意のものを使用することができるが、具体的には、例えば、ヒトγグロビン由来イントロンはｇ配列を使用することができるがそれに限定されない。
好ましい実施形態では、本発明の構築物において用いられるイントロン配列は、レトロトランスポゾンとは、フォワードに、外来遺伝子に対してはリバースに配置することが有利である。レトロトランスポゾンのプロモーターからの転写、スプライシングにより、イントロンが除かれ、その後のゲノムへの挿入により、初めて外来遺伝子が発現されるからである。
好ましい実施形態では、本発明の核酸構築物において用いられるイントロン配列は、レトロトランスポゾンとはトランスに配置されることが有利である。トランスに配置されることによって、同じプロモーターの影響は受けにくくなるからであり、レトロトランスポゾンがコードするタンパク質の発現とは独立して外来遺伝子が発現されるようにさせることができるからである。このようにトランスに配置することによって、外来遺伝子が導入されたかどうかを、レトロトランスポゾンの動きとは無関係に確認することも可能である。
好ましくは、イントロン配列は、スプライスドナー配列およびスプライスアクセプター配列によって挟まれることが有利である。ここで、挟まれ方としては、スプライスドナーとスプライスアクセプターとが作動可能になっていることが好ましい。
本発明の核酸構築物は、種々の用途において有用であり、例えば、ゲノムの改変のため、レトロトランスポゾンが転位能力を有するか否かを確認するため、外来遺伝子を転位させるため、外来遺伝子を宿主内に導入するためなどに用いることができる。これらの用途は具体的であり、かつ、実現可能なものである。ゲノムの改変は、細胞レベルあるいは生物個体レベルであり得る。個体レベルでのゲノム改変を達成するには、トランスジェニック生物を生産する必要がある。このようなトランスジェニック生物は、本発明の核酸構築物を用いて生殖細胞系の細胞ゲノムを改変した後、その細胞を用いてｆｏｕｎｄｅｒ細胞を生産することができれば、その後は当該分野において周知のトランスジェニック生物の生産方法を用いてトランスジェニック生物とすることができる。
あるいは、レトロトランスポゾン（特に、ＬＴＲ型）が転位能力を有するかどうかは、転写、逆転写およびゲノムへの挿入が検出可能な程度に行われることが必要である。理論に束縛されることを望まないが、従来、プロモーター活性およびＬＴＲレトロトランスポゾンの少なくとも一方の活性が不十分であったことから、ＬＴＲレトロトランスポゾンの転位活性を確認するシステムは提供されていなかった。本発明では、少なくともＬＴＲレトロトランスポゾンの活性を確認できる程度に強力なプロモーター活性を提供することによって、ＬＴＲレトロトランスポゾンが活性かどうかを確認することができるという予想外の効果を達成する。このことは、別の側面からみると、本発明によって初めて機能的ＬＴＲ型レトロトランスポゾンの活性を検出し、そのような機能的ＬＴＲ型レトロトランスポゾンが提供されたといえる。これら２つの構成要件が本発明者らの努力により予想外に成功する組み合わせを見出したことによって完成にいたったものである。ただし、いったん完成したこのような本発明は、本明細書の記載に基づいて、任意の等価な形態で実施することが可能であることを当業者は理解することができる。
好ましい実施形態において、本発明の核酸構築物の外来遺伝子導入の対象となる宿主は、どのような生物のものであってもよいが、好ましくは、真核生物であり、より好ましくは、哺乳動物を含み、さらに好ましくは、げっ歯類または霊長類を含み、もっとも好ましくはマウスであるがそれに限定されないことが理解される。
（ベクター、組成物、細胞）
別の局面において、本発明は、本発明の核酸構築物を含むベクターを提供する。このようなベクターにおいて含まれる核酸構築物は、上述の任意の核酸構築物の形態をとることができる。このようなベクターは、本発明の核酸構築物の他に、他のエレメントを含んでいてもよい。そのようなエレメントとしては、調節配列（例えばプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、複製起点など）、制限酵素消化部位、イントロン配列などを含ませることができるがそれらに限定されない。
他の局面において、本発明は、本発明の核酸構築物、および必要に応じてキャリアを含む、組成物を提供する。このような組成物は、薬学的組成物、農薬組成物などであり得るがそれらに限定されない。このようなキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または農学的もしくは薬学的アジュバントなど挙げられるがそれらに限定されない。
別の局面において、本発明は、本発明の核酸構築物を含む細胞、組織、生物体またはその一部を提供する。このような細胞は、どのような細胞であってもよいが、好ましくはトランスジェニック生物を作製する際に使用可能な生殖細胞などであることが有利であるがそれに限定されない。あるいは、レトロトランスポゾンの活性を確認することができるのに適切な細胞であることが好ましく、例えば、そのような細胞としては、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅＬａ細胞、Ｆ９細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などが挙げられるがそれらに限定されない。上記組織もまた、任意の組織またはその一部を用いることができる。上記生物体またはその一部もまた、任意の生物体またはその一部を用いることができる。当業者は、本明細書の開示にかんがみ、容易に上記細胞、組織、生物体またはその一部を作製し、使用することができることが理解される。
（ゲノム改変方法およびキット）
１つの局面において、本発明は、細胞内のゲノムを改変するための方法を提供する。この方法は、Ａ）ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、核酸構築物を提供する工程；Ｂ）該細胞に、該核酸構築物を導入する工程；Ｃ）該細胞を所定の期間培養する工程；Ｄ）該核酸構築物によりゲノムが改変された細胞を選択する工程、を包含する。本発明は、従来制御不可能であると考えられ、ゲノム改変には使用することができないと考えられていたＬＴＲ型レトロトランスポゾンを用いることによって、予想外にゲノムを改変することができる。また、従来達成が報告されていた非ＬＴＲ型レトロトランスポゾンで達成できていたゲノム改変効率よりも予想外に顕著に高い効率で改変を行うことができるようになった。
本発明のゲノム改変方法において使用されるＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、核酸構築物は、本明細書において、上記（ＬＴＲ型レトロトランスポゾンの核酸構築物）において詳述されているように、任意の形態をゲノム改変に用いることができる。
本発明のゲノム改変方法において、細胞に、核酸構築物を導入する技術としては、当該分野において周知の技術を用いることができる。核酸構築物またはベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）、リポフェクション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法などが挙げられる。核酸構築物またはベクターの導入の条件は、細胞および導入される物質の性質によって変動するが、そのような変動は、当業者に周知であり、当業者であれば、与えられた条件に基づいて適宜適切な核酸導入条件を特定することができる。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。好ましくは、トランスフェクションが用いられるがそれに限定されない。トランスフェクションを使用する場合、遺伝子導入剤を用いることが好ましい。遺伝子導入剤としては、例えば、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬、リン酸カルシウムなどが挙げられるがそれらに限定されない。トランスフェクションの際に利用される試薬の具体例としては、種々なソースから市販されている試薬が挙げられ、例えば、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｃａｔ．ｎｏ．３０１４２５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２４３１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ），ＴｆｘＴＭ−２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２３９１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ），ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１３０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＰｏｌｙＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１１０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（１１６６８−０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ），ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．（１０１−３０，Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＥｘＧｅｎ ５００（Ｒ０５１１，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｉｎｃ．，ＭＤ）などが挙げられるがそれらに限定されない。
好ましい実施形態において、導入は、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬などの存在かで行われ、より詳細には、カチオン性脂質、ポリアミン系脂質を用いて、１〜４μｇのＤＮＡを６ウェルプレートの各ウェルに培養した細胞に導入するという条件下で行われる。
本発明のゲノム改変方法において細胞を所定の期間培養する技術は、当該分野において周知の任意の培養方法を用いることができる。そのような培養法としては、例えば、適切な培地中で、適切な温度、湿度などの条件（例えば、３７℃、１００％、ＣＯ２５％など）の下で行う培養法があるがそれに限定されない。従って、培養方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、本発明の生物が資化し得る炭素源（例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類など）、窒素源（例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸または有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等など）、無機塩類（例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等など）等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ＤＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］またはこれら培地にウシ胎児血清等を添加した培地等）のいずれを用いてもよい。培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましいがそれに限定されない。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間であるがそれに限定されない。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンまたはテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明のゲノム改変方法において用いられる核酸構築物によりゲノムが改変された細胞を選択する技術としては、当該分野において用いられる任意の方法を用いることができる。選択は、好ましくは、導入された核酸の発現によって変化する宿主細胞の形質に基づいて行われる。例えば、導入された核酸が増殖因子をコードする場合、その所望の機能的性質は、特定の細胞または任意の細胞の増殖の促進である。導入された核酸が抗生物質耐性因子をコードする場合、選択は、抗生物質の存在下でその物質を培養することによって行うことができる。
好ましい実施形態において、本発明のゲノム改変方法において使用される核酸構築物は、ルシフェラーゼアッセイ（インビトロ系）でみたときに、０．１ｒｌｕ以上の活性を有するプロモーターをさらに含み、培養にかかる所定の期間は転写、逆転写およびゲノムへの挿入が行われるに十分な期間であることが有利である。ゲノムの改変には転写、逆転写およびゲノムへの挿入が実行されることが必要であるからである。そのような転写、逆転写およびゲノムへの挿入が行われるに十分な条件は、当業者が任意に決定することができるが、そのような期間としては例えば、数時間（２−３時間）〜数日（５−１０日）までであり得、好ましくは３〜７日（たとえば、７２時間程度）であり得、もっとも好ましくは、約５日間（１２０時間）であり得る。
好ましくは、本発明のゲノム改変方法において用いられるプロモーター配列は、レトロトランスポゾンの転写開始部位にインフレームで配置されていることが有利である。理論に束縛されることを望まないが、このようにインフレームに配置されていることによって、逆転写に影響しない部位からの転写開始が飛躍的に上がり、その結果、転位活性が顕著に上昇するからである。
本発明のゲノム改変方法において用いられる核酸構築物は、前記レトロトランスポゾン内に作動可能に配置される外来遺伝子を含み、選択は、外来遺伝子の発現により行われる。このような外来遺伝子としては、上述の（外来遺伝子の転位のための核酸構築物）において説明されるような外来遺伝子を用いることができる。上記選択のために使用される技術は、外来遺伝子に応じて適宜選択することができる。
好ましい実施形態において、本発明のゲノム改変方法において用いられる外来遺伝子は、レトロトランスポゾンの転写方向とはリバースに配置され、スプライスドナー配列およびスプライスアクセプター配列ならびにそれらに挟まれシスに配置されるイントロン配列を含み、所定の期間は、転写、逆転写およびゲノムへの挿入が行われるに十分な期間であり、選択は、該外来遺伝子の発現により行われる。ここで、リバースの配置は、当該分野において周知の技法によって実施することができる。具体的には、外来遺伝子またはそれを含む発現カセットの転写方向を確認した後に、適切な制限酵素部位などを利用してレトロトランスポゾン構築物の適切な部位に連結することなどが挙げられるがそれらに限定されない。また、スプライスドナー配列およびスプライスアクセプター配列は、当該分野において周知であり、当業者は任意の配列を用いることができる。そのような配列例としては、例えば、スプライスドナー配列としては、ＧＴＲＡＧＴ（Ｒはプリン）、好ましくはＧＴＡＡＧＴ、スプライスアクセプター配列としては、例えば、（Ｙ）ｎＮＣＡＧ（ｎ＞１１、Ｎは任意の塩基）、好ましくは（Ｔ／Ｃ）１５ＡＣＡＧなどが挙げられるがそれらに限定されない。
好ましい実施形態において、本発明において使用される外来遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子、栄養補充因子、酵素遺伝子および蛍光物質をコードする遺伝子（例えば、ｎｅｏ、ｈｙｇ、ｐｕｒｏ、ｚｅｏ、ｂｓｒ、ｈｉｓＤなど）からなる群より選択される因子をコードし、選択は、因子によって発現される前記細胞の特性によって行われる。栄養補充因子では、該当する栄養の有無によって選択することができる。抗生物質耐性遺伝子では、該当する抗生物質の有無によって選択することができる。そのような栄養（例えば、特定のアミノ酸、ビタミンなど）または抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシンなど）は、その有効濃度の下限付近で用いることができるが、有効濃度よりはるかに高い濃度で用いてもよく、濃度は限定されない。
好ましい実施形態において、本発明のゲノム改変方法において用いられるＬＴＲレトロトランスポゾンは、ＩＡＰエレメントの配列を含む。このようなＩＡＰエレメントの配列は、完全長ＩＡＰエレメントの配列であることが望ましく、従って、機能性であることが好ましい。ＩＡＰエレメントは、ｇａｇおよびｐｏｌを含む。ｇａｇ、ｐｏｌはそれぞれウイルスタンパク質の構造タンパク質、転位に必要な酵素群をコードする。従って、本発明のＩＡＰエレメントの配列は、完全な構造タンパク質および完全な逆転写酵素群をコードしていることがゲノム改変方法において用いるのに好ましい。
本発明のゲノム改変方法における選択では、特定の実施形態では、選択は、ライゲーション媒介ＰＣＲによって転位された配列を確認することによって行われ得る。
本発明のゲノム改変方法がターゲットとしている細胞は、任意の細胞を対象とすることができるが、通常、原核生物、酵母、動物、植物、昆虫などの細胞が用いられ、好ましくは、真核生物の細胞であり、より好ましくは哺乳動物の細胞であり、さらに好ましくは、げっ歯類（例えば、マウス、ラットなど）または霊長類（ヒト、ゴリラ、チンパンジー、サル）の細胞であることが有利である。
なお、本発明の細胞は、どのような種類の細胞であってもよいが、好ましくは、真核生物細胞を含み、より好ましくは、哺乳動物細胞を含み、さらに好ましくは、げっ歯類細胞を含むがそれらに限定されない。より好ましくは、マウス、ラットなどのモデル動物のものが有用である。むしろ、本発明の細胞は、導入する核酸分子の性質、目的、核酸分子が導入されるべき宿主との関係で決定されるべきである。本発明の細胞に含まれる核酸分子は、本発明のベクターであってもよい。
本発明の組織は、どのような種類の組織であってもよいが、好ましくは、真核生物組織を含み、より好ましくは、哺乳動物組織を含み、さらに好ましくは、げっ歯類組織を含むがそれらに限定されない。より好ましくは、マウス、ラットなどのモデル動物のものが有用である。むしろ、本発明の組織は、導入する核酸分子の性質、目的、核酸分子が導入されるべき宿主との関係で決定されるべきである。本発明の組織に含まれる核酸分子は、本発明のベクターであってもよい。
本発明の生物は、どのような種類の生物であってもよいが、好ましくは、真核生物生物を含み、より好ましくは、哺乳動物生物を含み、さらに好ましくは、げっ歯類生物を含むがそれらに限定されない。より好ましくは、マウス、ラットなどのモデル動物のものが有用である。むしろ、本発明の生物は、導入する核酸分子の性質、目的、核酸分子が導入されるべき宿主との関係で決定されるべきである。本発明の生物に含まれる核酸分子は、本発明のベクターであってもよい。
本発明のゲノム改変方法において用いられるレトロトランスポゾンは、任意の細胞を対象とすることができるが、通常、原核生物、酵母、動物、植物、昆虫などに由来するレトロトランスポゾンが用いられ、好ましくは、真核生物細胞に由来し、より好ましくは、哺乳動物に由来し、さらに好ましくは、げっ歯類（例えば、マウス、ラットなど）または霊長類（ヒト、ゴリラ、チンパンジー、サル）の細胞に由来するレトロトランスポゾンであることが有利である。
特定の実施形態において、本発明のゲノム改変方法において用いられるレトロトランスポゾン（の天然の宿主）と、対象とする細胞とは、同一種に由来してもよく異なる種に由来してもよく、同一種に由来することが好ましいが、それに限定されない。そのような組み合わせ例としては、例えば、マウス由来のレトロトランスポゾンおよびマウス細胞（同一種）、マウス由来のレトロトランスポゾンおよびヒト細胞（異種）が挙げられるがそれらに限定されない。
別の局面において、本発明は、細胞内のゲノムを改変するためのキットを提供する。このようなキットは、Ａ）ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、核酸構築物；Ｂ）細胞に核酸構築物を導入するための手段；およびＣ）核酸構築物によりゲノムが改変された細胞を選択する手段を備える。
ここで、ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、核酸構築物は、上述の節（ＬＴＲ型レトロトランスポゾンの核酸構築物）に記載されるような任意の形態のものを利用することができる。
細胞に核酸構築物を導入するための手段もまた、任意のものを使用することができ、例えば、トランスフェクション試薬を用いることが好ましい。このトランスフェクション試薬は、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬およびリン酸カルシウムからなる群より選択される。このようなトランスフェクション試薬としては、例えば、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｃａｔ．ｎｏ．３０１４２５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２４３１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ），ＴｆｘＴＭ−２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２３９１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ），ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１３０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＰｏｌｙＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１１０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（１１６６８−０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ），ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．（１０１−３０，Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＥｘＧｅｎ ５００（Ｒ０５１１，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｉｎｃ．，ＭＤ）などを挙げることができるがそれらに限定されない。
好ましい実施形態において、選択手段は、外来遺伝子の発現を検出する手段（例えば、抗生物質耐性であれば、その抗生物質、栄養補充性であれば、その栄養などであり、あるいは、外来遺伝子の発現を検出する手段（例えば、抗生物質耐性であれば、その抗生物質、栄養補充性であれば、その栄養などであり、あるいは、ＰＣＲを行うための手段（例えば、外来遺伝子をコードする配列とレトロトランスポゾンをコードする配列とのネスティドＰＣＲのためのＰＣＲプライマー）などが用いられ得るがそれに限定されない。
キットには、必要に応じて、実験手順を記載した指示書が添付されていることが好ましい。あるいは、本発明のキットには、核酸分子およびレトロトランスポゾンの使用法を記載する説明書が備えられる。この説明書は、紙媒体であってもよいが、伝送媒体（例えば、ネットワーク上の情報）であってもよい。この説明書には、核酸分子の扱い、形質転換法、培養法、再生法、トランスポゾンのインキュベーション法など、トランスジェニック生物に関する種々のプロトコルが記載されている。記載は、単言語であってもよいが、二言語以上の言語が併記されていてもよい。
（レトロトランスポゾンの転位活性の検定およびそのキット）
別の局面において、本発明は、レトロトランスポゾンの転位活性を検定するための方法を提供する。この方法は、Ａ）検定すべきレトロトランスポゾンをコードする核酸配列、およびルシフェラーゼアッセイ（インビトロ系）でみたときに、０．１ｒｌｕ以上の活性を有するプロモーター配列を含む核酸構築物を提供する工程；Ｂ）該細胞に、該核酸構築物を導入する工程；Ｃ）該細胞を所定の期間培養する工程；およびＤ）該核酸構築物による転位を検出する工程、を包含する。本発明は、従来制御不可能であると考えられ、転位活性は観察することができないと考えられていたＬＴＲ型レトロトランスポゾンが、特定のプロモーター配列の下で組み込まれて細胞に導入されることによって、予想外に、その転位活性を観察することができるという効果が奏される。
本発明のレトロトランスポゾンの転位活性の検定において使用されるＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、核酸構築物は、本明細書において、上記（ＬＴＲ型レトロトランスポゾンの核酸構築物）において詳述されているように、任意の形態をゲノム改変に用いることができる。
本発明のレトロトランスポゾンの転位活性の検定において、細胞に、核酸構築物を導入する技術としては、当該分野において周知の技術を用いることができる。そのような核酸構築物の導入技術は、本明細書において（ゲノム改変法）の節で詳述した。
転位活性の検出は、ライゲーション媒介ＰＣＲを用いることが好ましい。転位活性を数値化することができるからである。本発明においてライゲーション媒介ＰＣＲを用いる場合は、以下のような手順を用いることができる：
適切な量のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｃＩＩ、ＭｓｃＩ、ＳｃａＩ、ＳｍａＩ等の制限酵素で切断し、熱処理によって酵素を失活させたのちに、適切なリンカーＤＮＡを接続する。リンカーの接続されたゲノムＤＮＡ断片を鋳型として、リンカーに特異的なプライマーと標的（ＩＡＰなど）内部のｎｅｏカセットに特異的なプライマーとでｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行う。１回目のＰＣＲで用いたプライマーは、リンカー特異的プライマーおよび外来遺伝子（ｎｅｏなど）カセット特異的プライマーであり、２回目のＰＣＲで用いたプライマーは、リンカー特異的プライマーおよび外来遺伝子（ｎｅｏなど）カセット特異的プライマーまたは外来遺伝子（ｎｅｏなど）カセット特異的プライマーである。
ＰＣＲの条件は、適宜決定することができるが、例えば、１回目、２回目ともに、９４℃×５分、（９４℃×１分−５５℃×１分−６８℃×２分）を３０サイクル、６８℃×７分などを用いることができる。例えば、エキスパンドハイファイＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）を用いることができる。増幅されたバンドの塩基配列は例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００などの配列分析装置により解析し、Ｅｎｓｅｍｂｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／）などのデータベースによってゲノム上の位置とそこに存在する遺伝子を決定することができる。
上述のように本発明のレトロトランスポゾンによる転位活性検出は、ゲノムデータベースとライゲーション媒介ＰＣＲによって得られた配列を比較することによって行うことができる。このようなゲノムデータベースとしては、上述のＥｎｓｅｍｂｌの他、ＧｅｎＢａｎｋ、ＤＤＢＩなどの他のデータベースを用いることもできる。比較は、任意のツールを用いて行うことができ、例えば、Ｅｎｓｅｍｂｌに付属のツールを用いてもよい。
別の局面において、本発明は、レトロトランスポゾンの転位活性を検定するためのキットを提供する。この方法は、Ａ）検定すべきレトロトランスポゾンをコードする核酸配列、およびルシフェラーゼアッセイ（インビトロ系）でみたときに、０．１ｒｌｕ以上の活性を有するプロモーター配列を含む核酸構築物；Ｂ）該細胞に核酸構築物を導入する手段；およびＣ）該核酸構築物による転位を検出する手段、を備える。ここで、個々の核酸構築物、導入手段および転位を検出する手段は、「ゲノム改変方法」において記載される任意の手段を用いることができる。キットには、必要に応じて、実験手順を記載した指示書が添付されていることが好ましい。
好ましい実施形態において、選択手段は、ＰＣＲを行うための手段であり、そのような手段は、外来遺伝子をコードする配列とレトロトランスポゾンをコードする配列とのネスティドＰＣＲのためのＰＣＲプライマーを含み得るがそれに限定されない。
（トランスジェニック生物作製法およびキット）
別の局面において、本発明は、トランスジェニック生物を作製するための方法を提供する。このような方法は、Ａ）ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、核酸構築物を提供する工程；Ｂ）該核酸構築物を、所望の生物の生殖細胞に導入する工程；Ｃ）該生殖細胞においてゲノムが改変された生殖細胞を選択する工程；およびＤ）ゲノムが改変された該生殖細胞を用いて生物を再生する工程、を包含する。
ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、核酸構築物は、本発明の上述の節において説明されるような任意の形態を用いることができる。該核酸分子で、所望の生物の生殖細胞に導入することもまた、当該分野における周知技術（例えば、本明細書において記載されるような遺伝子組み換え技術）を用いて行うことができ、上述の遺伝子導入技術のうち任意のものを利用することができる。選択もまた、上述の任意の選択技術を用いることができ、そのような技術は、導入される核酸構築物に応じて変動する。
形質転換された生殖細胞を用いて生物を再生するもまた、生物に応じて適宜適切な方法を当業者は選択することができる。
ゲノムが改変された哺乳動物は、例えば相同組換えを応用したポジティブネガティブセレクション法を用いて作製することができる（米国特許第５，４６４，７６４号公報、米国特許第５，４８７，９９２号公報、米国特許第５，６２７，０５９号公報、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，８９３２−８９３５，１９８９、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４２，４３５−４３８，１９８９など）。ジーンターゲティングの概説に関しては、例えば、村松正實、山本雅編集、『実験医学別冊 新訂 遺伝子工学ハンドブック 改訂第３版』（１９９９年、羊土社発行）中特に２３９から２５６頁、相沢慎一（１９９５）実験医学別冊「ジーンターゲティング−ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」などに記載され、本明細書において使用することができる。
高等生物では、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を用いる陽性選択とＨＳＶのチミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素遺伝子を用いる陰性選択により組換え体の効率的な選別が行われている。ノックアウトＰＣＲまたはサザンブロット法により相同組換え体の選択が行われる。すなわち、標的遺伝子の一部を陽性選択用のネオマイシン耐性遺伝子等で置換し、その末端に陰性選択用のＨＳＶＴＫ遺伝子等を連結したターゲティングベクターを作成し、エレクトロポレーションによりＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８およびガンシクロビルの存在下で選択して、生じたコロニーを単離し、さらにＰＣＲまたはサザンブロットにより相同組換え体を選択することができる。
このように、機能が改変した変異を有するゲノム改変（標的遺伝子組換え、遺伝子破壊）マウスを作製すると方法は、標的とした遺伝子だけに変異が導入されるので、その遺伝子機能の解析に有用である。
所望の相同組換え体を選択した後、得られた組換えＥＳ細胞を胚盤注入法または集合キメラ法により正常な胚と混合してＥＳ細胞と宿主胚とのキメラマウスを作製する。胚盤注入法では、ＥＳ細胞を胚盤胞にガラスピペットで注入する。集合キメラ法では、ＥＳ細胞の塊と透明帯を除去した８細胞期の胚とを接着させる。ＥＳ細胞を導入した胚盤胞を偽妊娠させた代理母の子宮に移植してキメラマウスを得る。ＥＳ細胞は、全能性を有するので、生体内では、生殖細胞を含め、あらゆる種類の細胞に分化することができる。ＥＳ細胞由来の生殖細胞を有するキメラマウスと正常マウスを交配させるとＥＳ細胞の染色体をヘテロに有するマウスが得られ、このマウス同士を交配するとＥＳ細胞の改変染色体をホモに有するノックアウトマウスが得られる。得られたキメラマウスから改変染色体をホモに有するノックアウトマウスを得るには、雄性キメラマウスと雌性野生型マウスとを交配して、Ｆ１世代のヘテロ接合体マウスを産出させ、生まれた雄性および雌性のヘテロ接合体マウスを交配して、Ｆ２世代のホモ接合体マウスを選択する。Ｆ１およびＦ２の各世代において所望の遺伝子変異が導入されているか否かは、組換えＥＳ細胞のアッセイと同様に、サザンブロッティング、ＰＣＲ、塩基配列の解読など当該分野において慣用される方法を用いて分析され得る。
好ましい実施形態において、本発明のトランスジェニック生物が対象とする生物は、真核生物である。本発明におけるレトロトランスポゾンの効果がより発揮されやすいからである。
別の好ましい実施形態において、本発明のトランスジェニック生物が対象とする生物は、哺乳動物を含む。本発明におけるレトロトランスポゾンの効果がより発揮されやすいからである。ここで、より好ましくは、この哺乳動物は、げっ歯類動物であり、より好ましくは、マウス、ラットなどのモデル動物である。
別の局面において、本発明は、トランスジェニック生物を作製するためのキットを提供する。この方法は、Ａ）ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、核酸構築物；Ｂ）該核酸構築物を所望の生物の生殖細胞に導入する手段；Ｃ）該生殖細胞においてゲノムが改変された生殖細胞を選択する手段；およびＤ）ゲノムが改変された該生殖細胞を用いて生物を再生する手段、を備える。
ここで、ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、核酸構築物は、上述の節（ＬＴＲ型レトロトランスポゾンの核酸構築物）に記載されるような任意の形態のものを利用することができる。
核酸構築物の生殖細胞への導入手段は、上述の「ゲノム改変方法」に記載される方法のうち、生殖細胞に適切である任意の技術を用いることができる。
また、選択および再生については、本節において記載される任意の方法のための手段を用いることができる。ここで、再生のための手段には、仮親となる生物体を含み得る。このような仮親は、偽妊娠状態になり得る任意の生物（例えば、マウスなど）を用いることができる。
（新規プロモーター）
本発明は、さらに、新規プロモーターを提供する。このプロモーターは、サイトメガロウイルスエンハンサーおよびトリβアクチンプロモーターを含み、該サイトメガロウイルスエンハンサーおよび該トリβアクチンプロモーターの少なくとも一方は、天然の全長配列よりも短い配列を含む。このように天然の全長配列よりも短い配列を有するは、ＣＡプロモーター配列とも称する。従来は、ＣＡＧプロモーター配列の全長がないと、転写活性を発揮しないと考えられていたことから、その一部の配列によってほぼＣＡＧプロモーターに匹敵する活性が得られたことは驚くべき効果であるといえる。
１つの好ましい実施形態において、本発明のプロモーターにおいて全長より短縮される配列は、転写開始部位より下流の配列が削られていることに起因する。従来、転写開始部位以降の配列が不要であることは明らかとなっておらず、従って、本発明は、新規のプロモーター配列を提供するといえる。
より好ましい実施形態では、本発明のプロモーターでは、転写開始部位より下流の配列が全部削られている。このような配列でも削られる前と同程度のプロモーター活性を有することが実証されることは予想外であった。また、転写開始部位より下流の配列がないことによって、転写開始部位に直接連結されるべき配列にも使用することができるプロモーター配列が提供されたことになる。このようなプロモーター配列で、強力なプロモーター活性（例えば、レトロトランスポゾンの転位活性を観察できるようなレベル）を有するものが従来知られておらず、本発明の新規プロモーターは、従来のプロモーターでは発揮することができなかった格別の効果をもたらす。
別の実施形態において、本発明のプロモーターは、さらに、転写開始部位より下流の配列およびプロモーター領域の一部が削られている。転写開始部位に加えて、プロモーター領域（例えば、転写開始部位の上流１塩基、２塩基、３塩基など）が削られていてもプロモーター活性が保持されていることが見出された。従って、この形態の場合、本発明は、プロモーター配列の一部を削る必要がある構成が必要な場合に特に有用である。
このプロモーター配列は、具体的には、例えば、サイトメガロウイルスエンハンサーとして、配列番号３６に示される配列を含む。さらに、トリβアクチンプロモーターは、配列番号８に示される配列を含む。
本発明の新規プロモーターとしては、例えば、配列番号５、６または７などが挙げられるがそれらに限定されない。もっとも好ましくは、本発明の新規プロモーターは配列番号７（Ｒ領域がないもの）に示される配列を含むか、またはその配列からなる。
別の実施形態において、本発明の新規プロモーターは、配列番号６（Ｒ領域がなくさらにプロモーター領域の一部が欠如するもの）に示される配列を含む、またはその配列からなる。
（ＬＴＲ型レトロトランスポゾンの種々の使用）
別の局面において、本発明は、ＬＴＲ型レトロトランスポゾンの、ゲノム改変のための、使用を提供する。ゲノム改変のために使用するための種々のＬＴＲ型レトロトランスポゾンの形態は、本明細書において詳述されている。
別の局面において、本発明は、ルシフェラーゼアッセイ（インビトロ系）でみたときに、０．１ｒｌｕ以上の活性を有するプロモーターの、ゲノム改変のための、使用を提供する。ゲノム改変のために使用するための種々のプロモーターの形態は、本明細書において詳述されている。
他の局面において、本発明は、ルシフェラーゼアッセイ（インビトロ系）でみたときに、０．１ｒｌｕ以上の活性を有するプロモーターの、ＬＴＲ型レトロトランスポゾンの確認のための、使用を提供する。ＬＴＲ型レトロトランスポゾンの確認のために使用するための種々のプロモーターの形態は、本明細書において詳述されている。
本発明は、従来不可能または効率が悪かった、網羅的なゲノム改変を簡便に行うことができるようになったという点で従来に比して予想外の効果を達成する。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、請求の範囲によってのみ限定される。
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。以下の実施例において用いられる試薬などは、例外を除き、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）、和光純薬（大阪、日本）、などから市販されるものを用いた。動物の取り扱いは、大阪大学医学部において規定される規準を遵守して行った。本発明で用いる発現ベクターの作製方法を具体例を挙げて説明する。なお、このような例で用いられる出発プラスミド、プロモーター等の構成要素を同等のもので置き換えて実施することは当業者にとって容易である。
以下、本発明の内容を実施例を用いてより具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
（実施例１：ＩＡＰの構築）
１．ＩＡＰベクターの作製
（ａ）ゲノムからの完全長ＩＡＰ配列の単離
Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスへの放射線照射により誘発された白血病細胞の中で、塩基配列から完全長と考えられるＩＡＰの転位を認めた細胞（Ｌ８０６５−ＡＭＬ細胞、Ｉｓｈｉｈａｒａ ＆ Ｔａｎａｋａ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４１８，２０５−２０９，１９９７）より、ＰＣＲによって、このＩＡＰを単離した。まず、このＩＡＰ配列の外側のゲノム領域に、以下に記す２つのプライマーを設定した： ５’−ＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＴＧＧＴＧＧＣＡＣＡＣＡＣＴＴＴＴＡＧＴＣＣＣＣＧＣＡＧ−３’（配列番号９）および５’−ＧＧＣＧＣＡＣＴＡＧＴＧＡＴＧＣＣＣＴＣＴＣＡＧＧＣＣＴＣＣＡＣＴＣＡＧＧＣＡＣＴ−３’（配列番号１０）。各々、５’末端部に、ＰＣＲ産物には存在しない制限酵素部位であるＮｏｔＩおよびＳｐｅＩが導入されている。ＰＣＲの条件は、９４℃×２分、（９４℃×１５秒 −６５℃×３０秒 −６８℃×６分）を１０サイクル、（９４℃×１５秒 −６５℃×３０秒 −６８℃×（（６分＋５秒／サイクル）））を２０サイクル、７２℃×７分であり、エキスパンドハイファイＰＣＲシステム（ロッシュダイアグノスティックス）を用いた。
増幅したバンドをＮｏｔＩとＳｐｅＩで切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ベクターのＮｏｔＩ−ＳｐｅＩ部位へクローニングした。得られた１０個のクローンについて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００（アプライドバイオシステムズ）により塩基配列を決定し、て、クローニング前のＰＣＲ産物のダイレクトシークエンシングの結果と比較したところ、１０個のクローンのいずれについても、ＰＣＲによる塩基配列置換が起きていた。そこで、塩基配列置換がＩＡＰ中心部の２．５ ｋｂ ＢｓｔＥＩＩ−ＸｂａＩ領域のみに認めたクローンを選び、以下の方法で、よりフィデリティーの高いＰｆｘポリメラーゼ（インビトロジェン）によるＰＣＲ産物に由来する２．５ ｋｂ ＢｓｔＥＩＩ−ＸｂａＩ領域と置き換えた。まず、前出のＬ８０６５−ＡＭＬ細胞ゲノムを鋳型として、以下のプライマーによりＰＣＲを行った：５’−ＡＴＧＣＣＣＡＧＡＴＴＴＣＴＴＣＣＡＣＧＧＣＴＡＴＴＡＧＧＧ−３’（配列番号１１）および５’−ＧＡＴＧＣＣＣＴＣＴＣＡＧＧＣＣＴＣＣＡＣＴＣＡＧＧＣＡＣＴ−３’（配列番号１２）。ＰＣＲの条件は、９４℃×２分、（９４℃×１５秒 −６５℃×３０秒 −６８℃×５分）を２５サイクル、６８℃×２分であり、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニングキット（インビトロジェン）によってクローニングした。２．５ ｋｂ ＢｓｔＥＩＩ−ＸｂａＩ領域に塩基配列置換が導入されていないクローンを同定し、上記のクローンの同領域と置き換えることにより、完全長のＩＡＰベクターを得、ｐＵ３ｇｐと命名した。
（ｂ）ｎｅｏカセットのＩＡＰベクターヘの挿入
ガンマグロビンのイントロンがｎｅｏ遺伝子に対して逆向きになる方向でｎｅｏ遺伝子内部へ挿入されたカセットを、ｐＪＭ１０１／Ｌ１．３（Ｋｉｍｂｅｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ８；１５５７−１５６０，１９９９）のＡｐａＬＩ−ＡｃｃＩ断片として単離し、前出のｐＵ３ｇｐのｐｏｌ遺伝子下流に位置するＮｄｅＩ認識部位へ挿入した。その際、ｐＵ３ｇｐに対して、ガンマグロビンのイントロンが順向きになったクローンを選び、ｐＵ３ｇｐ−ｎｅｏと命名した（図４Ａ）。
（ｃ）５’のＵ３領域のＣＭＶプロモーターでの置換
ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン）由来のＣＭＶプロモーター配列を鋳型として、以下のプライマーでＰＣＲを行った：ｈＣＭＶ−Ｕ３，５’−ＣＣＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＡＴＴＧＣＡＴＡＣＧＴＴＧＴＡＴＣＣＡＴＡＴＣ−３’（配列番号１３）；ｈＣＭＶ−Ｌ３，５’−ＧＣＧＡＧＡＡＡＡＡＣＧＧＴＴＣＡＣＴＡＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＴＡＴＡＴＡＧ−３’（配列番号１４）。ＩＡＰのＲ領域の５’側末端からＵ５領域の下流までの約０．３ ｋｂを、以下のＰＣＲプライマーで増幅した：Ｒ−Ｕ１，５’−ＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＴＴＴＴＣＴＣＧＣＴＣＴＣＴＴＧＣＴ−３’（配列番号１５）；Ｒ−Ｌ１，５’−ＴＣＴＧＡＡＡＴＧＡＡＧＴＡＴＣＣＣＴＣＣＴＧＣＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号１６）。いずれも、Ｐｆｘポリメラーゼを用い、以下のＰＣＲの条件で行った：９４℃×２分、（９４℃×１５秒 −５５℃×３０秒 −６８℃×１分）を２０サイクル、６８℃×２分。ｈＣＭＶ−Ｌ３とＲ−Ｕ１の５’側が相補的な配列になっているため、両方のＰＣＲ産物を混ぜたものを鋳型としてｈＣＭＶ−Ｕ３とＲ−Ｌ１でＰＣＲを行うと、ＣＭＶプロモーターとＲ領域が融合したＰＣＲ産物が得られた。その際のＰＣＲ条件は以下の通り：９４℃×２分、（９４℃×１５秒 −５５℃×３０秒 −６８℃×１分）を１５サイクル、６８℃×２分。このＰＣＲ産物をＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニングキットによってクローニングし、ＰＣＲによる塩基配列置換の起きていないクローンを同定した。このクローンのＮｏｔＩ−ＢｓｔＥＩ断片はＣＭＶプロモーター領域 −Ｒ領域 −Ｕ５領域を含むので、これを、前出のｐＵ３ｇｐおよびｐＵ３ｇｐ−ｎｅｏのＮｏｔＩ−ＢｓｔＥＩ領域と置き換えることにより、５‘側ＬＴＲのＵ３領域がＣＭＶプロモーターで置き換えられた構造のベクターが得られ、各々、ｐＣＭＶｇｐ、ｐＣＭＶｇｐ−ｎｅｏと命名した（図４Ａ）。
（ｄ）ｐｏｌまたはｇａｇ−ｐｏｌに欠失を伴うＩＡＰべクターの作製（図５Ａ）
ｐＣＭＶｇｐ−ｎｅｏから、ＩＡＰのｐｏｌ遺伝子領域内のＢｇｌＩＩ認識部位からｐｏｌ遺伝子下流のＮｄｅＩ認識部位までを欠失させたベクターを作製し、ｐＣＭＶｇｐ−ｎｅｏ−ｄ１とした（図５Ａ）。同様に、ｐＣＭＶｇｐ−ｎｅｏから、ＩＡＰのｇａｇ領域内のＢｓｔＥＩＩ認識部位からｐｏｌ遺伝子下流のＮｄｅＩ認識部位までを欠失させたベクターを作製し、ｐＣＭＶｇｐ−ｎｅｏ−ｄ２とした（図５Ａ）。
（結果）
本実施例のベクター作製のスキームを図４および５に示す。図４Ａは、実施例１において用いられるベクターの構造を示す。ｐＵ３ｇｐ−ｎｅｏは、マウス白血病細胞由来の、完全長と予想されるＩＡＰエレメントに対して、転位を検出するためのｎｅｏカセットを挿入したもの。ｐＣＭＶｇｐ−ｎｅｏは、ＩＡＰエレメントのプロモーター領域（Ｕ３領域）をＣＭＶプロモーターで置き換えたものである。
ＣＭＶプロモーターとＲ領域の接合部の配列を図４Ｂに示す。図４Ｂから明らかなように、本実施例では、ＣＭＶプロモーターの転写開始点が、ＩＡＰの本来の転写開始点（Ｒ領域の５’末端部）と一致するように構築した。
図５Ａに、本実施例で作製した各種ベクターの構造を示す。ｐＣＭＶｇｐ−ｎｅｏは、図４（Ａ）で説明したものと同じものを比較の対象として示している。これに対し、ｐＣＭＶｇｐ−ｎｅｏ−ｄ１とｐＣＭＶｇｐ−ｎｅｏ−ｄ２は、各々、ｐｏｌ遺伝子のＢｇｌＩＩ切断部位より３’側、ｇａｇ遺伝子のＢｓｔＥＩＩ切断部位より３’側を欠失させたもの。ｐＣＭＶｇｐは、ｎｅｏカセットを持たない完全長のＩＡＰであり、かつ、Ｕ３領域をＣＭＶプロモーターで置き換えたもの。よって、ｇａｇ−ｐｏｌを発現する。
このベクターを以下の実施例で用いた。
（実施例２：トランスフェクション（ベクターの細胞内への導入）および薬剤選択）
トランスフェクション前日に、２５万個の細胞を６穴培養プレートへ播種した。トランスフェクションは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対しては１．５ μｇのＤＮＡをエフェクテン試薬（キアゲン）を用いて、ＨｅＬａ細胞に対しては４ μｇのＤＮＡをリポフェクタミン２０００（インビトロジェン）を用いて行った。Ｇ４１８による選択は、トランスフェクション後に細胞を４〜７日間継代したのちに開始した。Ｇ４１８の濃度は、ＮＩＨ３Ｔ３に対しては５００ μｇ／ｍｌを、ＨｅＬａに対しては６００ μｇ／ｍｌを用いた。１２〜１４日経過した時点で、Ｇ４１８耐性コロニー数を算定した。ＧＦＰの蛍光は、トランスフェクションから３日後から、顕微鏡下で検出できた。
（結果）
本実施例の結果を図３Ｃ、４および５に示す。
図４Ｃに転位の検出の原理を示す。転写とスプライシングにより、ｎｅｏカセット内のイントロンが除かれて、ｎｅｏ遺伝子が再構成される。この時点では、転写産物とｎｅｏ遺伝子が逆方向であるために、ｎｅｏ遺伝子は発現しないが、逆転写とゲノムへの挿入が起きると、ｎｅｏ遺伝子が有するプロモーターから転写が起きてｎｅｏ遺伝子が発現し、細胞がＧ４１８耐性になり、転位の起きたことが示される。
結果例を図３Ｃに示す。図３Ｃには、Ｇ４１８耐性コロニーの出現頻度が示される。ＮＩＨ３Ｔ３細胞へベクターをトランスフェクトし、４日後よりＧ４１８選択を開始し、１２日後に染色した。ＩＡＰ（ｉ）では数多くのコロニーが出現した一方で、ｇａｇ−ｐｏｌに変異を導入したベクター（ｉｉ）からはコロニーが出現しなかった。よって、今回用いたＩＡＰは、それ自身がコードするＧａｇ−Ｐｏｌを用いて転位を起こしていることが証明された。コントロールとして、ＩＡＰと同様にＣＭＶプロモーターにより転写され、かつ、同じイントロン入りのｎｅｏカセットを持つ非ＬＴＲ型のＬＩＮＥ１（ｉｉｉ） （ｇｉｆｔ ｆｒｏｍ Ｊｏｈｎ Ｍｏｒａｎ， Ｃｅｌｌ １１０，３１５，２００２）を用いたが、ＩＡＰの方がより多くのＧ４１８耐性コロニーが出現し、今回用いたＩＡＰの活性の高さが証明された。この結果を、以下に別の側面から記載する。
図４Ｄに本実施例によるＮＩＨ３Ｔ３細胞へのトランスフェクションによる転位の検出結果を、５×１０５の細胞に由来するＧ４１８耐性コロニー数で示す。ｐＪＭ１０１／Ｌ１．３は、他のレトロトランスポゾンであるＬＩＮＥ１を用いたベクター。示される結果から明らかなように、ＩＡＰ本来のプロモーターであるＵ３領域を用いた場合ではＧ４１８耐性コロニーが出現しなかったのに対し、ＣＭＶプロモーターを用いた際には、多数のコロニーが得られ、プロモーターを改変した効果が明らかとなった。また、改変型ＩＡＰベクターは、ＬＩＮＥ１ベクターと同等以上の転位能を有すことがわかった。
図５に、本発明において用いられ得るＩＡＰが完全な転位能を有すことの証明ができること、およびｇａｇ−ｐｏｌの発現ユニットを分離することにより転位を制御できることの証明ができることを示す。
図５Ｂに、本実施例におけるＨｅＬａ細胞へのトランスフェクションによる、各々のベクターの活性の検定を示す。５×１０５の細胞に由来するＧ４１８耐性コロニー数を示す。ｐＣＭＶｇｐ−ｎｅｏでは多数のＧ４１８耐性コロニーを認めたのに対し、ｐＣＭＶｇｐ−ｐｏｌ−ｄ１およびＣＭＶｇｐ−ｐｏｌ−ｄ２ではＧ４１８耐性コロニーを認めなかったことより、今回のＩＡＰのｇａｇ−ｐｏｌが転位に必須であることが明らかとなった。即ち、本発明のＩＡＰは、自立的に転位を起こす能力があるといえる。また、ｇａｇ−ｐｏｌを発現するｐＣＭＶｇｐを同時にトランスフェクションすることで、ｐＣＭＶｇｐ−ｐｏｌ−ｄ１およびｐＣＭＶｇｐ−ｐｏｌ−ｄ２による転位が検出できた。このことから、ＩＡＰベクターを、ｇａｇ−ｐｏｌ欠損型のＩＡＰベクターとｇａｇ−ｐｏｌの発現ベクターの２つに分離することにより、転位を制御できると考えられる。
（実施例３：ライゲーション媒介性（Ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）ＰＣＲによる、ＩＡＰベクターのゲノムへの挿入部位の決定法）
１００ ｎｇのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｃＩＩ、ＭｓｃＩ、ＳｃａＩ、ＳｍａＩ等の制限酵素で切断し、熱処理によって酵素を失活させたのちに、リンカーＤＮＡを接続した。リンカー ＤＮＡは、５’−ＣＧＡＡＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴＴＣＧＴＡＣＧＡＧＡＡＴＴＣＧＴＡＣＧＡＧＡＡＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣＡＡＣＧＡＧＣＣＡＡＧＧ−３’（配列番号１７）および５’−ＣＣＴＴＧＧＣＴＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡ−３’（配列番号１８）を相補させることにより作製した。リンカーの接続されたゲノムＤＮＡ断片を鋳型として、リンカーに特異的なプライマーとＩＡＰ内部のｎｅｏカセットに特異的なプライマーとでｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。１回目のＰＣＲで用いたプライマーは、５’−ＣＧＡＡＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴＴＣＧＴＡＣＧＡＧＡＡ−３’（配列番号１９）（リンカー特異的プライマー）と５’−ＧＡＧＡＴＧＣＡＴＧＣＴＴＴＧＣＡＴＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＧＣ−３’（配列番号２０）（ｎｅｏカセット特異的プライマー）であり、２回目のＰＣＲで用いたプライマーは、５’−ＴＣＧＴＡＣＧＡＧＡＡＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣ−３’（配列番号２１）（リンカー特異的プライマー）と５’−ＧＧＡＧＣＣＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＣＡＣＣＴＧＧＴＴＧＣ−３’（配列番号２２）（ｎｅｏカセット特異的プライマー）または５’−ＧＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＣＡＣＣＣＴＡＡＣ−３’ （配列番号２３）（ｎｅｏカセット特異的プライマー）である。ＰＣＲの条件は、１回目、２回目ともに、９４℃×５分、（９４℃×１分−５５℃×１分−６８℃×２分）を３０サイクル、６８℃×７分であり、エキスパンドハイファイＰＣＲシステムを用いた。増幅されたバンドの塩基配列はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００により解析し、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／）によってゲノム上の位置とそこに存在する遺伝子を決定した（図６ＡおよびＢ）。
図６に、本実施例によりＩＡＰベクターが遺伝子内へ挿入した例を示す。図６Ａには、ライゲーション媒介性ＰＣＲによって決定された領域を示し、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースによって決定された結果を図６Ｂに示す。決定した配列をＥｎｓｅｍｂｌデータベースにより、検索した結果、サイトグロビン（ｃｙｔｏｇｌｏｂｉｎ）遺伝子内に挿入していることが明らかになり、ＩＡＰベクターにより遺伝子へ変異を導入できることが示された。
以上より、本実施例において転位された場所は、染色体１１のＡＬ６０７０３９にあるサイトグロビン遺伝子であることが明らかになった。従って、本発明は、実際にゲノムに網羅的に転位し得る活性を有することが実証された。
（実施例４：Ｕ３領域のＣＡプロモーターでの置換）
次に、別のプロモータ配列を用いた場合のレトロトランスポゾンの転位活性を観察した。
ｐＣＸ−ＥＧＦＰ（Ｏｋａｂｅ ｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４０７；３１３−３１９，１９９７）を鋳型として、ＣＡＧプロモーター配列（Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ １０８；１９３−１９９，１９９１）の中のヒト・サイトメガロウイルスエンハンサー領域からチキン・ベータ−アクチンプロモーター転写開始点までを、ＰＣＲにより増幅した。５’側上流のプライマーにはＣＡ−Ｕ１（５’−ＧＣＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧ−３’（配列番号２４））を用いた。チキン・ベータ−アクチンプロモーターの転写開始点は２箇所報告されているので（Ｋｏｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １１：８２８７−８３０１，１９８３）、３’側のプライマーには、各々に対応する以下の２つのプライマーを用いた：ＣＡ−Ｌ１，５’−ＣＧＡＧＡＡＡＡＡＣＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＴＴＣＧＣＴＴＴＴＴＡＴＡＧＧ−３’（配列番号２５）およびＣＡ−Ｌ２，５’−ＣＧＡＧＡＡＡＡＡＣＣＣＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＴＴＣＧＣＴＴＴＴＴＡＴＡＧ−３’（配列番号２６）。この結果増幅される領域を、各々、１型ＣＡプロモーター（ＣＡ１）および２型ＣＡプロモーター（ＣＡ２）と命名した。ＰＣＲにはＰｆｘポリメラーゼを用い、かつ、同ポリメラーゼに添付のエンハンサー試薬を１×の濃度で用いた。ＰＣＲの条件は、９４℃×２分、（９４℃×１５秒 −５５℃×３０秒 −６８℃×１分）を３０サイクル、６８℃×２分である。ＩＡＰのＲ領域の５’側末端からＵ５領域の下流までの約０．３ ｋｂを、以下のＰＣＲプライマーで増幅した：Ｒ−Ｕ３，５’−ＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＴＴＴＴＴＣＴＣＧＣＴＣＴＣＴＴＧＣＴＴＣＴＴＧ−３’（配列番号２７）とＲ−Ｌ１，５’−ＴＣＴＧＡＡＡＴＧＡＡＧＴＡＴＣＣＣＴＣＣＴＧＣＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号２８）、または、Ｒ−Ｕ４，５’−ＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴＴＴＴＣＴＣＧＣＴＣＴＣＴＴＧＣＴＴＣＴＴＧ−３’（配列番号２９）とＲ−Ｌ１。ＰＣＲにはＰｆｘポリメラーゼを用い（エンハンサー試薬は使用せず）、ＰＣＲの条件は、９４℃×２分、（９４℃×１５秒 −５５℃×３０秒 −６８℃×１分）を１５サイクル、６８℃×２分である。ＣＡ−Ｕ１とＣＡ−Ｌ１によるＰＣＲ産物と、Ｒ−Ｕ３とＲ−Ｌ１によるＰＣＲ産物を混合し、ＣＡ−Ｕ１とＲ−Ｌ１を用いてＰＣＲを行った。同様に、ＣＡ−Ｕ１とＣＡ−Ｌ２によるＰＣＲ産物と、Ｒ−Ｕ４とＲ−Ｌ１によるＰＣＲ産物を混合し、同じくＣＡ−Ｕ１とＲ−Ｌ１を用いてＰＣＲを行った。ＣＡ−Ｌ１、ＣＡ−Ｌ２とＲ−Ｕ３、Ｒ−Ｕ４の５’側が相補的な配列になるようにデザインされているため、このＰＣＲによって、ベータ−アクチンプロモーターの転写開始点とＲ領域の５’末端が融合する。ＰＣＲにはＰｆｘポリメラーゼを用い、同ポリメラーゼに添付のエンハンサー試薬を１×の濃度で使用し、以下の条件で増幅した：９４℃×２分、（９４℃×１５秒 −５５℃×３０秒 −６８℃×１分）を３０サイクル、６８℃×２分。ＰＣＲ産物をＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニングキットによってクローニングし、ＰＣＲによる塩基配列置換の起きていないクローンを同定したのち、ＮｏｔＩ−ＢｓｐＥＩで切断後、ｐＣＭＶｇｐ−ｎｅｏのＮｏｔＩ−ＢｓｐＩ領域と置換した。得られたベクターを、ｐＣＡ１ｇｐ−ｎｅｏおよびｐＣＡ２ｇｐ−ｎｅｏと命名した（図７Ａ）。
（結果）
図７に、ＣＡプロモーターの効果を示す。（Ａ）ＩＡＰのプロモーターであるＵ３領域を、サイトメガロウイルスエンハンサーとチキン・ベータ−アクチンプロモーターで置き換えた２つのベクター（ｐＣＡ１ｇｐ−ｎｅｏ、ｐＣＡ２ｇｐ−ｎｅｏ）を作製した。各々のベクターのプロモーターを、１型ＣＡプロモーター（ＣＡ１）、２型ＣＡプロモーター（ＣＡ２）と呼ぶ。詳細は（Ｂ）を参照。ｐＣＭＶｇｐ−ｎｅｏは、図１に同じ。（Ｂ）（Ａ）の２つのＣＡプロモーターとＲ領域の接合部の配列。チキン・ベータ−アクチンプロモーターの転写開始点は、２箇所報告されている（前出の（（方法））の項を参照）。そこで、各々の場合に対応して、転写がＲ領域の５’末端から始まるようにデザインし、１型および２型のＣＡプロモーター（ＣＡ１、ＣＡ２）と命名した。（Ｃ）ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＭＶプロモーターの比較。トランスフェクション後、５×１０５のＮＩＨ３Ｔ３およびＨｅＬａに由来するＧ４１８耐性コロニー数を検定した。ＣＡ２プロモーターにより、最も多くのコロニーを得た。
図７Ｂには、１型ＣＡプロモーターおよび２型ＣＡプロモーターを示す。このように、２型ＣＡプロモーターは、１型ＣＡプロモーターよりも２塩基長い。チキン・ベータ−アクチンプロモーターの転写開始点は、２箇所報告されている（上記実施例を参照）。そこで、各々の場合に対応して、転写がＲ領域の５’末端から始まるようにデザインし、１型および２型のＣＡプロモーター（ＣＡ１、ＣＡ２）と命名した。
これらを用いてＧ４１８耐性コロニー数を見た結果を図７Ｃに示す。トランスフェクション後、５×１０５のＮＩＨ３Ｔ３およびＨｅＬａに由来するＧ４１８耐性コロニー数を検定した。ＣＡ２プロモーターにより、最も多くのコロニーを得た。示されるように、２型ＣＡプロモーターによってもたらされる転位活性はＣＭＶなどよりも高い。これは、ＣＡＧが通常もっている活性に匹敵またはそれ以上であると見積もられることから、本発明のＣＡプロモーターの強力なプロモーター活性が実証されたことになる。
（実施例５：ｈｒＧＦＰカセットの作製と、ＩＡＰベクターへの挿入）
次に、外来遺伝子として、ＧＦＰ遺伝子を用いた実証例を提示する。
ｈｒＧＦＰ遺伝子（ストラタジーン）の１９２番目の塩基と１９３番目の塩基（翻訳開始部位のＡＴＧのＡを１番目の塩基と定義する）との間に、前出のｐＪＭ１０１／Ｌ１．３のｎｅｏカセット内のγグロビン−イントロンを、ｈｒＧＦＰ遺伝子とは逆方向に挿入した。さらに、このｈｒＧＦＰカセットを前出のｐＣＭＶｇｐのｐｏｌ遺伝子下流のＮｄｅＩ部位へ挿入し、ＩＡＰとガンマ・グロビン−イントロンが順方向になるものを同定し、ｐＣＭＶｇｐ−ｈｒＧＦＰと命名した（図８）。
ＧＦＰ発現の測定は、ＧＦＰ・ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ Ｆｉｌｔｅｒ（オリンパス、東京、日本）およびオリンパス蛍光倒立顕微鏡を用いて×１００〜×４００の倍率で行った。
図８に、ＧＦＰを用いた、転位の可視化例を示す。（Ａ）ベクターの構造：ｈｒＧＦＰ内部にイントロンを配置したＧＦＰカセットを作製し、これを、ＣＡ２プロモーターを有すＩＡＰベクターに挿入した。（Ｂ）転位に伴うＧＦＰの発現：ＨｅＬａ細胞へ上記のベクターをトランスフェクトしたところ、ＧＦＰの蛍光を発する細胞を同定した。これより、ＩＡＰの転位を可視化でき、マウス等のモデル動物での転位の検出に有効と考えられる。
このように、ＧＦＰで光る細胞は、実際にレトロトランスポゾンを含むベクターが導入された細胞に限定されていた。外来遺伝子はどのようなものであっても、実施例２、４のｎｅｏ遺伝子に加えて、ＧＦＰ遺伝子でも転位が認められることから、転位され得ることが証明された。
（実施例６：レトロトランスポゾンのゲノムへの改変における生物レベルの実証）
この実施例では、本発明者らは、レトロトランスポゾンが実際のトランスジェニック動物において使用することができるかどうか確認する。レトロトランスポゾンベクターをマウス受精卵に注入する。あるいは、レトロトランスポゾンベクターをＥＳ細胞へトランスフェクトして、ベクターＤＮＡが転位反応を介さずにゲノムへ挿入されたＥＳ細胞を同定する。
（実施例７：トランスジェニックマウスの作製）
実施例６に示されるような系を用いて、トランスジェニックマウスを作製する。手短に述べると、実施例６で得たＥＳ細胞を胚盤胞に打ち込んだものを偽妊娠マウスの卵管または子宮に戻してマウスを誕生させる。変異を調べることによって、レトロトランスポゾンのゲノム改変ゲノム効果がトランスジェニック動物においても確認される。
（実施例８：マウス個体でのＩＡＰエレメントの転位の検定）
本実施例では、図８ＡのベクターのＤＮＡ断片をマウス受精卵へ注入し、偽妊娠マウスの卵管へ移植した。得られたマウスを、ｈｒＧＦＰに特異的なプライマーを用いたＰＣＲでスクリーニングすることにより、ｆｏｕｎｄｅｒマウスを同定し、野生型マウスと交配することにより、マウスの系統を樹立した。具体的には、図８のpCA2gp-hrGFPを有するトランスジェニックマウスを作製し、マウスの尻尾のDNAを鋳型にして、図８に示される位置に相当するプライマーでPCRを行った。プライマーの配列は以下の通りである。

配列番号37 AGGGCTGCGGCAAGGGCAACATCCTGTTCG（1stセンス）
配列番号38 GCCGCCGTCCTCCACGTAGGTCTTCTCCAG（1stアンチセンス）
配列番号39 GGCAACCAGCTGGTGCAGATCCGCGTGACC（2ndセンス）
配列番号40 GTCCTTCACCACGCCCTTGCTCTTCATCAG（2ndアンチセンス）

ＩＡＰの転位が起きると、ＧＦＰ内部のイントロンが無くなるので、０．４５ｋｂのバンドが出現すると予想される。図８に示したように、１３系統のマウスのうち３系統において０．４５ｋｂのバンドが検出され、マウス生体内で転位が起きていることが証明された。
このとき、仔マウスをＧＦＰ用フィルターの付随した蛍光実体顕微鏡（ライカ、ＷＩＬＤ Ｍ１０など）で観察し、ＧＦＰシグナルは無いが、ベクター配列は有するマウスを同定することができる。得られたマウスを野生型マウスと交配し、仔マウスを、同様の蛍光実体顕微鏡で観察する。全身で蛍光を発するマウスは、親マウスの生殖細胞形成過程で転位が起きたものと推測され、次世代において変異マウスが作製されたとみなすことができる。
図８Ａのベクターでは、１つのベクター内に転位に必要なすべての構成要素が存在しているために、転位の制御が困難である。そこで、転位の制御を可能とするために、以下の実験を行う。まず、ｇａｇ遺伝子の開始コドンに変異を導入したベクター（次項の実施例９のｐＣＡ２ｇｐ−ｈｒＧＦＰ−Ｍ１に相当）を作製し、受精卵へのＤＮＡ断片のインジェクションと、その後の偽妊娠マウスへの卵管移植により、マウスの系統を樹立した。このマウスに導入されたＩＡＰエレメントは、ｐｏｌ遺伝子に欠失があるために、自律的には転位できない（非自律型）と考えられる。一方、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子断片をＩＡＰエレメントから切り出して強力なプロモーター（例えばＣＡＧ プロモーター）の下流に配置したｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクターを作製し、このベクターを有するマウスを、同様の手法で樹立した。得られたマウスを、上記の非自律型ベクターを有するマウスと交配した。得られた仔マウスより、両方のベクターを持つマウスを同定し、これを野生型マウスと交配した。得られた仔マウスを、蛍光実体顕微鏡で観察する。全身で蛍光を発するマウスは、親マウスの生殖細胞形成過程で転位が起きたものと推測され、次世代において変異マウスが作製されたものとみなすことができる。得られた変異マウスを野生型マウスと交配して、非自律型のＩＡＰベクターを持つがｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクターを失ったマウスを同定する。このマウスでは、非自律型のＩＡＰベクターが転位能を失ったと考えられる。以上のように、マウス個体内での転位を制御できることを確認することができる。
（実施例９：ＧＡＧタンパク質のはじめの１５アミノ酸が転位のために好ましい）
次に、ＧＡＧタンパク質のはじめの１５アミノ酸が転位のために好ましいことを実証した。その具体的な様子は図１０に示す。
使用した、ベクターの構造は、図１０Ａに示す。示されるように、図８で自律的転位を示したｐＣＡ２ｇｐ−ｈｒＧＦＰに対して、ｐＣＡ２ｇｐ−ｈｒＧＦＰ−Ｍ１ではｇａｇ遺伝子の開始コドンに変異を導入しており、その結果、１５アミノ酸下流の２番目のＡＴＧ（配列番号２の１６番目の残基）から翻訳が始まると考えられる。
次に、図１０Ｂに示すように、転位効率を検討した。図１０Ａのベクターを用いて、ここに示す３通りの組み合わせでＨｅＬａ細胞へトランスフェクトを行い、７日後にＧＦＰ陽性細胞の割合をＦＡＣＳで解析した。その結果、ｇａｇ遺伝子の本来の翻訳開始部位のＡＴＧに変異を導入したｐＣＡ２ｇｐ−ｈｒＧＦＰ−Ｍ１では、転位能が消失した。しかし、同様のベクターを、ｇａｇ−ｐｏｌ完全長の発現ベクターであるｐＣＡ２ｇｐとともにトランスフェクトした際には転位能が回復した。これより、ＧＡＧタンパク質の翻訳開始部位からの１５アミノ酸が、転位活性を発揮するのに重要であることが示された。このように、ゲノム改変効果を達成するに好ましいと考えられるＩＡＰの完全配列に、ＧＡＧタンパク質のはじめの１５アミノ酸を有することが重要であることが明らかになった。
（実施例１０：非自律型ベクターの転位において、それ自身からＧＡＧタンパク質が翻訳されることが好ましい）
次に、非自律型ベクターの転位において、それ自身からＧＡＧタンパク質が翻訳されることが好ましいことを実証するために、図１０に示されるように実験を行った。
使用したベクターの構造は図１１Ａに示す。はじめの３つのベクターおよびｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクターは図１０と同じであった。ｐＣＡ２ｇｐ−ｈｒＧＦＰ−Ｍ２とｐＣＡ２ｇｐ−ｈｒＧＦＰ−Ｍ３では、ｇａｇの２番目のＡＴＧの直下に終止コドンを導入しており、ＧＡＧタンパク質は短い断片としてしか発現できない。ＧＡＧタンパク質に変異のある４つのベクターは、それ自体では転位できないので、非自律型ベクターと定義した。
次に、図１１Ｂに示すように転位効率を検討した。図１１Ａのトランスファーベクターを、ｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクター（ｐＣＡ２ｇｐ）の存在下、または非存在下（代わりにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを使用）でＨｅＬａ細胞へトランスフェクトし、７日後にＧＦＰ陽性細胞の出現頻度をＦＡＣＳで解析した。その結果、ＧＡＧタンパク質の翻訳が阻害された３つの非自律型ベクターでは、ｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクターの存在下でも転位が著しく低下した。一方、はじめの１５アミノ酸以降で完全長の翻訳の起きるｐＣＡ２ｇｐ−ｈｒＧＦＰ−Ｍ１のみはｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクター存在下で高率に転位を認めた。これより、非自律型ベクターの転位には、それ自身からのｇａｇタンパク質の翻訳が好ましいことが示された。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
本発明を用いれば、ゲノム改変を目的場所から離れた場所でも効率よく行うことができるようになった。このような生物は、モデル動物、スクリーニング、薬理試験などで非常に有用である。

Claims (70)

  1. ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、単離された核酸構築物。
  2. 前記ＬＴＲ型レトロトランスポゾンは、Ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ Ａ ｐａｒｔｉｃｌｅ（ＩＡＰ）型レトロトランスポゾンを含む、請求項１に記載の核酸構築物。
  3. 前記レトロトランスポゾンは、完全長ＩＡＰエレメントを含む、請求項１に記載の核酸構築物。
  4. 前記レトロトランスポゾンは、コードするポリペプチドが機能性である、請求項１に記載の核酸構築物。
  5. 前記機能は、転写活性、逆転写活性およびインテグラーゼ活性からなる群より選択される少なくとも１つの活性を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
  6. 前記レトロトランスポゾンは、ＩＡＰエレメントであり、ＬＴＲ、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｔＲＮＡ結合部位からなる群より選択される少なくとも１つのドメインが配列番号１に対して保存された、請求項１に記載の核酸構築物。
  7. 前記レトロトランスポゾンは、ＩＡＰエレメントであり、その核酸配列において、５’側のＬＴＲ直下にあるｔＲＮＡ結合部位において、ｔｃｃｇｇｇａｃｇａｇａａａａの配列が反復していること、およびＲ領域のｔｔｇｃｔｔｃｔｔｇｃｔｃｔｃからなる反復配列を２以上含むことからなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する、請求項１に記載の核酸構築物。
  8. 前記レトロトランスポゾンは、
    （ａ）配列番号１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
    （ｂ）配列番号２または３および４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
    （ｃ）配列番号２または３および４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
    （ｄ）配列番号１に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
    （ｅ）配列番号２または３および４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
    （ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
    （ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
    を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
  9. 前記レトロトランスポゾンをコードする核酸配列は、配列番号１を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
  10. さらに、プロモーター配列を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
  11. 前記プロモーター配列は、ルシフェラーゼアッセイ（インビトロ系）でみたときに、０．１ｒｌｕ以上の活性を有する、請求項１０に記載の核酸構築物。
  12. 前記プロモーター配列は、ＣＭＶ、ＣＡおよびその改変体からなる群より選択される、請求項１０に記載の核酸構築物。
  13. 前記プロモーター配列は、前記ＬＴＲ型レトロトランスポゾンにおける５’ＬＴＲの一部と置き換えられる、請求項１０に記載の核酸構築物。
  14. 前記プロモーター配列は、前記ＬＴＲ型レトロトランスポゾンにおける前記５’ＬＴＲのうちＵ３領域の全部または一部と置き換えられる、請求項１３に記載の核酸構築物。
  15. 前記プロモーター配列は、前記レトロトランスポゾンに作動可能に連結される、請求項１０に記載の核酸構築物。
  16. 前記プロモーター配列は、その転写開始部位が前記レトロトランスポゾンの転写開始部位に一致するよう（インフレーム）に配置される、請求項１０に記載の核酸構築物。
  17. 前記プロモーター配列は、配列番号５〜７のいずれか１つに示される核酸配列、またはその一部もしくは改変体であって、プロモーター活性を有する核酸配列を含む、請求項１０に記載の核酸構築物。
  18. 前記プロモーター配列は、配列番号６または７に示される核酸配列からなる、請求項１０に記載の核酸構築物。
  19. さらに、外来遺伝子をコードする配列を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
  20. 前記外来遺伝子をコードする配列は、前記レトロトランスポゾン内に配置される、請求項１９に記載の核酸構築物。
  21. 前記外来遺伝子は、識別可能な特性を宿主に付与する、請求項１９に記載の核酸構築物。
  22. 前記識別可能な特性は、抗生物質耐性、栄養補充性、酵素活性および蛍光からなる群より選択される、請求項２１に記載の核酸構築物。
  23. 前記外来遺伝子は、ｎｅｏ、ＧＦＰ、ｈｙｇ、ｐｕｒｏ、ｚｅｏ、ｂｓｒ、ｌａｃＺ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰおよびｈｒＧＦＰからなる群より選択される、請求項１９に記載の核酸構築物。
  24. 前記外来遺伝子は、転写、逆転写およびゲノムへの挿入の過程を経ることによって初めて発現されるように構成される、請求項１９に記載の核酸構築物。
  25. 前記外来遺伝子は、イントロン配列を含む、請求項１９に記載の核酸構築物。
  26. 前記イントロン配列は、前記レトロトランスポゾンとは同一の転写方向（フォワード）に配置される、請求項２５に記載の核酸構築物。
  27. 前記イントロン配列は、スプライスドナー配列およびスプライスアクセプター配列によって挟まれる、請求項２５に記載の核酸構築物。
  28. 前記核酸構築物は、ゲノムの改変のためのものである、請求項１に記載の核酸構築物。
  29. 前記核酸構築物は、前記レトロトランスポゾンが転位能力を有するか否かを確認するためのものである、請求項１１に記載の核酸構築物。
  30. 前記核酸構築物は、前記外来遺伝子を転位させるためのものである、請求項１９に記載の核酸構築物。
  31. 前記核酸構築物は、前記外来遺伝子を宿主内に導入するために使用される、請求項１９に記載の核酸構築物。
  32. 細胞内のゲノムを改変するための方法であって、
    Ａ）ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、核酸構築物を提供する工程；
    Ｂ）該細胞に、該核酸構築物を導入する工程；
    Ｃ）該細胞を所定の期間培養する工程；
    Ｄ）該核酸構築物によりゲノムが改変された細胞を選択する工程、
    を包含する、方法。
  33. 前記核酸構築物は、ルシフェラーゼアッセイ（インビトロ系）でみたときに、０．１ｒｌｕ以上の活性を有するプロモーターをさらに含み、前記所定の期間は転写、逆転写およびゲノムへの挿入が行われるに十分な期間である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記プロモーター配列は、その転写開始部位が前記レトロトランスポゾンの転写開始部位に一致するよう（インフレーム）に配置される、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記核酸構築物は、前記レトロトランスポゾン内に作動可能に配置される外来遺伝子を含み、前記選択は、該外来遺伝子の発現により行われる、請求項３２に記載の方法。
  36. 前記外来遺伝子は、前記レトロトランスポゾンの転写方向とは逆方向（リバース）に配置され、スプライスドナー配列およびスプライスアクセプター配列ならびにそれらに挟まれシスに配置されるイントロン配列を含み、前記所定の期間は、転写、逆転写およびゲノムへの挿入が行われるに十分な期間であり、前記選択は、該外来遺伝子の発現により行われる、請求項３２に記載の方法。
  37. 前記外来遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子、栄養補充因子、酵素および蛍光物質からなる群より選択される因子をコードし、前記選択は、該因子によって発現される前記細胞の特性によって行われる、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記ＬＴＲレトロトランスポゾンは、ＩＡＰエレメントを含む、請求項３２に記載の方法。
  39. 前記ＬＴＲレトロトランスポゾンは、完全長ＩＡＰエレメントを含む、請求項３２に記載の方法。
  40. 前記選択は、ライゲーション媒介ＰＣＲによって転位された配列を確認することによって行われる、請求項３２に記載の方法。
  41. 前記導入は、トランスフェクション、形質転換および形質導入からなる群より選択される形態を含む、請求項３２に記載の方法。
  42. 前記導入は、カチオン性脂質およびポリアミン系試薬からなる群より選択される少なくとも１種の物質の存在下で行われる、請求項３２に記載の方法。
  43. 前記細胞と、前記レトロトランスポゾンの天然の宿主は、同一種である、請求項３２に記載の方法。
  44. 前記細胞と、前記レトロトランスポゾンの天然の宿主は、異種である、請求項３２に記載の方法。
  45. レトロトランスポゾンの転位活性を検定するための方法であって、
    Ａ）検定すべきレトロトランスポゾンをコードする核酸配列、およびルシフェラーゼアッセイ（インビトロ系）でみたときに、０．１ｒｌｕ以上の活性を有するプロモーター配列を含む核酸構築物を提供する工程；
    Ｂ）該細胞に、該核酸構築物を導入する工程；
    Ｃ）該細胞を所定の期間培養する工程；および
    Ｄ）該核酸構築物による転位を検出する工程、
    を包含する、方法。
  46. 前記検出は、ライゲーション媒介ＰＣＲ工程を包含する、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記検出は、ゲノムデータベースとライゲーション媒介ＰＣＲによって得られた配列とを比較する工程を包含する、請求項４５に記載の方法。
  48. トランスジェニック生物を作製するための方法であって、
    Ａ）ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、核酸構築物を提供する工程；
    Ｂ）該核酸構築物を、所望の生物の生殖細胞に導入する工程；
    Ｃ）該生殖細胞においてゲノムが改変された生殖細胞を選択する工程；および
    Ｄ）ゲノムが改変された該生殖細胞を用いて生物を再生する工程、
    を包含する、方法。
  49. 細胞内のゲノムを改変するためのキットであって、
    Ａ）ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、核酸構築物；
    Ｂ）細胞に核酸構築物を導入するための手段；および
    Ｃ）核酸構築物によりゲノムが改変された細胞を選択する手段、
    を備える、キット。
  50. 前記細胞に核酸構築物を導入するための手段は、トランスフェクション試薬を含む、請求項４９に記載のキット。
  51. 前記トランスフェクション試薬は、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬およびリン酸カルシウムからなる群より選択される、請求項４８に記載のキット。
  52. 前記トランスフェクション試薬は、カチオン性脂質およびポリアミン系試薬からなる群より選択される少なくとも１種の物質を含む、請求項５０に記載のキット。
  53. 前記選択手段は、ＰＣＲプライマー、抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質、栄養補充因子、酵素基質および蛍光物質に対応する検知手段からなる群より選択される少なくとも１つの手段を含む、請求項４９に記載のキット。
  54. レトロトランスポゾンの転位活性を検定するためのキットであって、
    Ａ）ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードする核酸配列、およびルシフェラーゼアッセイ（インビトロ系）でみたときに、０．１ｒｌｕ以上の活性を有するプロモーター配列を含む核酸構築物；
    Ｂ）該細胞に核酸構築物を導入する手段；および
    Ｃ）該核酸構築物による転位を検出する手段、
    を備える、キット。
  55. 前記検出手段は、ＰＣＲプライマー、抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質、栄養補充因子、酵素基質および蛍光物質に対応する検知手段からなる群より選択される少なくとも１つの手段を含む、請求項５４に記載のキット。
  56. トランスジェニック生物を作製するためのキットであって、
    Ａ）ＬＴＲ型レトロトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、核酸構築物；
    Ｂ）該核酸構築物を所望の生物の生殖細胞に導入する手段；
    Ｃ）該生殖細胞においてゲノムが改変された生殖細胞を選択する手段；および
    Ｄ）ゲノムが改変された該生殖細胞を用いて生物を再生する手段、
    を備える、キット。
  57. 前記生物を再生する手段は、仮親となる生物体を含む、請求項５６に記載のキット。
  58. サイトメガロウイルスエンハンサーおよびトリβアクチンプロモーターを含み、該サイトメガロウイルスエンハンサーおよび該トリβアクチンプロモーターの少なくとも一方は、天然の全長配列よりも短い配列を含む、プロモーター。
  59. 前記短い配列は、転写開始部位より下流の配列が削られていることに起因する、請求項５８に記載のプロモーター。
  60. 転写開始部位より下流の配列が全部削られている、請求項５８に記載のプロモーター。
  61. 転写開始部位より下流の配列およびプロモーター領域の一部が削られている、請求項５８に記載のプロモーター。
  62. 前記サイトメガロウイルスエンハンサーは、配列番号３６またはその改変体に示される配列を含む、請求項５８に記載のプロモーター。
  63. 前記トリβアクチンプロモーターは、配列番号８またはその改変体に示される配列を含む、請求項５８に記載のプロモーター。
  64. 配列番号６に示される配列を含む、請求項５８に記載のプロモーター。
  65. 配列番号７に示される配列を含む、請求項５８に記載のプロモーター。
  66. 配列番号６に示される配列からなる、請求項５８に記載のプロモーター。
  67. 配列番号７に示される配列からなる、請求項５８に記載のプロモーター。
  68. ＬＴＲ型レトロトランスポゾンの、ゲノム改変のための、使用。
  69. ルシフェラーゼアッセイ（インビトロ系）でみたときに、０．１ｒｌｕ以上の活性を有するプロモーターの、ゲノム改変のための、使用。
  70. ルシフェラーゼアッセイ（インビトロ系）でみたときに、０．１ｒｌｕ以上の活性を有するプロモーターの、ＬＴＲ型レトロトランスポゾンの確認のための、使用。
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