CN103189517A - 用经修饰的微生物改善乙醇酸发酵产生 - Google Patents

用经修饰的微生物改善乙醇酸发酵产生 Download PDF

Info

Publication number
CN103189517A
CN103189517A CN2010800698723A CN201080069872A CN103189517A CN 103189517 A CN103189517 A CN 103189517A CN 2010800698723 A CN2010800698723 A CN 2010800698723A CN 201080069872 A CN201080069872 A CN 201080069872A CN 103189517 A CN103189517 A CN 103189517A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacterial strain
acid
oxyacetic acid
gene
pyre
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2010800698723A
Other languages
English (en)
Inventor
W.迪斯切特
C.科洛姆
G.贝斯特尔-科雷尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Metabolic Explorer SA
Original Assignee
Metabolic Explorer SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Metabolic Explorer SA filed Critical Metabolic Explorer SA
Publication of CN103189517A publication Critical patent/CN103189517A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及用于一种用于发酵产生乙醇酸，其衍生物或前体的方法，其包括在包含碳源的合适培养基中培养大肠杆菌菌株，并回收培养基中的乙醇酸，其中所述大肠杆菌菌株经过修饰以改善乳清酸至乳清苷5’-P的转化。本发明亦涉及经修饰的大肠杆菌菌株，其显示改善的乳清酸至乳清苷5’磷酸的转化，且任选地进一步经修饰以供改善的乙醇酸产生。

Description

用经修饰的微生物改善乙醇酸发酵产生
发明目的
本发明涉及用于从廉价的碳底物如葡萄糖或其它糖生物产生乙醇酸的改善的方法。本发明涉及修饰大肠杆菌K-12基因组DNA，使得所述微生物包含增加的乳清酸磷酸核糖基转移酶(orotate phosphoribosyl transferase，OPRTase)活性，其目的是减少副产物乳清酸的产生和优化乙醇酸合成。
发明背景
乙醇酸(HOCH2COOH)(glycolic acid或glycolate)，是羧酸的α-羟基酸家族中最简单的成员。乙醇酸在非常小的分子上具有双官能性，即具有醇和中等强酸官能团。其性质使其非常适于广泛的消费和工业应用，包括用于水井再生(water well rehabilitation)，皮革工业，油气工业(oil and gas industry)，洗涤和纺织品工业，以及作为个人护理产品的成分。
乙醇酸亦可用于产生多种聚合材料，包括含聚乙醇酸的热塑性树脂。包含聚乙醇酸的树脂具有良好的阻气性质(gas barrier property)，且此类包含聚乙醇酸的热塑性树脂可用于制备具有相同性质的包装材料(例如饮料容器等)。聚酯聚合物在水性环境中以可控制的速率逐渐水解。该性质使其可用于生物医学应用如可溶解的缝线，以及用于其中需要酸的受控释放以减少pH的应用中。目前，在美国每年消费超过15,000吨的乙醇酸。
尽管乙醇酸作为痕量成分天然见于甘蔗、甜菜、葡萄和水果，但其主要是合成产生的。用于产生乙醇酸的其它技术描述于文献或专利申请中。例如，Mitsui Chemincals,Inc.描述了一种通过使用微生物从在末端具有羟基的脂族多元醇产生所述羟基羧酸的方法(EP2025759A1和EP2025760A1)。该方法是如Michihiko Kataoka在其关于使用乙二醇氧化微生物产生乙醇酸的论文中所述的生物转化(Biosci.Biotechnol.Biochem.,2001)。乙醇酸亦使用具有改善的腈水解酶活性的突变体腈水解酶从乙醇腈通过生物转化产生，且该技术由Dupont de Nemours and Co在WO2006/069110中公开。用于通过发酵从可再生资源使用其它细菌菌株产生乙醇酸的方法公开于来自Metabolic Explorer的专利申请(WO2007/141316和US61/162,712和EP09155971.6，其申请日为2009年3月24日)。
出于构建用于产生乙醇酸的更佳菌株的目的，本发明的发明人一直对一些特定大肠杆菌菌株感兴趣。
大肠杆菌为工业生物技术中使用的第一种生产微生物，且仍旧为最常用的一种。由于对大肠杆菌K-12菌株的多年研究，该菌株内的各种克隆对于操纵重组DNA和产生大量化学品是特别有吸引力的宿主。当前，用于研究和商业目的的大肠杆菌K-12菌株是在对该菌株的最早研究中构建和分离的克隆通过使用X射线辐照，之后用UV辐照以诱导随机突变所产生的衍生物(Bachmann,B.J.1987.Derivations and genotypes of some mutant derivatives of E.coli K-12,p.1191-1219.于J.L.Ingraham,K.B.Low,B.Magasanik,M.Schaechter和H.E.Humbarger(编),Escherichia coli and Salmonellatyphimurium:cellular and molecular biology)。一些突变体或衍生物已经经有目的的选择而演化，并因此具有充分表征的突变。然而，亦认识到许多当前的衍生物含有未检测的和/或，尚未表征的等位基因差异。因此，大肠杆菌K-12菌株的成员彼此通过在一个或多个基因中的点突变而不同。
许多大肠杆菌K-12菌株在rph基因中具有移码突变(Jensen K.F.1993,J.Bacteriol.175:3401-3707)。该点突变导致在最后15个密码子的翻译中的移码，并使得rph基因产物的大小减少了10个氨基酸残基。该截短的蛋白缺乏核糖核酸酶PH活性，且在rph顺反子中的提前翻译终止解释了大肠杆菌K-12中乳清酸磷酸核糖基转移酶的低水平，因为需要转录和翻译的紧密偶联以支持越过顺反子间pryE减弱子的转录的最优水平。
已显示该点突变影响下游pyrE基因的表达，该基因编码乳清酸磷酸核糖基转移酶(ORPTase)，其催化乳清酸至乳清苷5’磷酸的转化(Poulsen P等1984,EMBO3:1783-1790)。由于pyrE基因的表达减少，ORPTase的减少水平导致底物乳清酸在细胞生长过程中在细胞中和生长培养基中的蓄积(Womack J.E.和O’Donavan G.A.1978,J.Bacteriol,136:825-827)。
而且，专利US593243描述了在含有移码突变的大肠杆菌K-12菌株中野生型rph基因的回复增加了此类菌株中产生的异源蛋白的量。
乳清酸是不希望的，因为其代表碳的消耗，而该碳本可用于生成生物质或乙醇酸。而且，乳清酸是在乙醇酸纯化过程中难以消除的副产物，并因此增加纯化成本。此外，痕量乳清酸可使得终产物着色。
本发明解决的问题是减少从廉价的碳底物如葡萄糖或其它糖生物产生乙醇酸过程中的乳清酸蓄积。成本的减少可为显著的，因为乙醇酸产生属性得到改善。
发明内容
本发明涉及用于改善由大肠杆菌菌株进行的乙醇酸的发酵产生的工艺，其中所述菌株经修饰以改善乳清酸至乳清苷5’磷酸的转化。所述转化的增加对乙醇酸的产生具有改善作用。用于发酵产生乙醇酸，其衍生物或前体的方法包括在包含碳源的合适培养基中培养大肠杆菌菌株，并回收培养基中的乙醇酸，其中所述菌株经修饰以改善乳清酸至乳清苷5’磷酸的转化。
在本发明的第一个实施方案中，在经修饰的菌株中增加乳清酸磷酸核糖基转移酶(OPRTase)比活性。
在本发明的另一个实施方案中，修饰所述大肠杆菌菌株以增强磷酸核糖基焦磷酸(PRPP)，一种将乳清酸转化为乳清苷5’磷酸的反应的必需辅因子的产生。
这两种修饰，OPRTase活性的增加和PRPP产生的增加，都可导入同一大肠杆菌菌株。
在本发明的一个优选实施方案中，该菌株进一步经遗传工程改造以增强乙醇酸的产生。
本发明亦涉及用于制备乙醇酸的方法，其中将根据本发明的微生物在包含碳源的合适生长培养基中生长，并回收乙醇酸。
本发明亦涉及经修饰的大肠杆菌菌株，其呈现如上所述的修饰。
附图说明
图1：涉及酶PyrE(乳清酸磷酸核糖基转移酶)和PrsA(PRPP合成酶)的嘧啶生物合成和戊糖磷酸途径。
图2：显示三种不同生物合成途径：乙醇酸、戊糖磷酸和嘧啶途径的联系的示意图。
图3：质粒pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-TTs的图谱。
图4：质粒pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-prsA-TTs的图谱。
发明详述
本发明涉及用于发酵产生乙醇酸，其衍生物或前体的新方法，其包括在包含碳源的合适培养基中培养大肠杆菌菌株，并回收培养基中的乙醇酸，其中所述大肠杆菌菌株经修饰以改善乳清酸至乳清苷5’磷酸的转化。
在本发明的一个优选实施方案中，乙醇酸的产生亦通过修饰大肠杆菌菌株以改善乳清酸至乳清苷5’磷酸的转化而改善。
在本发明中，术语“乙醇酸(glycolate)”和“乙醇酸(glycolic acid)”可互换使用。
术语“乙醇酸，其衍生物或前体”指乙醇酸形成和降解代谢途径中所有的中间体化合物。乙醇酸的前体具体为：柠檬酸、异柠檬酸、乙醛酸，和一般而言所有乙醛酸循环的化合物。乙醇酸的衍生物具体为乙醇酸酯如乙醇酸乙酯，乙醇酸甲酯和含有乙醇酸的聚合物如聚乙醇酸。
根据本发明，术语“发酵产生”，“发酵”或“培养”可互换使用以表示细菌在包含碳源的合适的生长培养基上的生长，其中所述碳源兼用并同时用于菌株的生长和期望的产物乙醇酸的产生。
“合适的培养基”是适于微生物的培养和生长的培养基。此种培养基在微生物发酵领域中是公知的，取决于待培养的微生物。合适的培养基包含“碳源”，其指任何能由微生物代谢的碳源。
就本发明而言，“代谢”应理解为其通常含意，即允许微生物生长，或至少维持生命的能量和物质的转化。
在本发明的发酵工艺中，所述碳源用于：
-生物质产生——通过转化培养基的碳源等进行的微生物生长，和
-乙醇酸产生——由该生物质将该碳源转化为乙醇酸。
这两步同时进行，且生长的微生物对碳源的转化导致乙醇酸在培养基中分泌，因为微生物包含允许此种转化的代谢途径。
碳源选自下组：葡萄糖、蔗糖、单糖(如果糖、甘露糖、木糖、***糖)、寡糖(如半乳糖、纤维二糖…)、多糖(如纤维素)、淀粉或其衍生物、甘油和一碳底物。特别优选的碳源是葡萄糖。另一种特别优选的碳源是蔗糖。
术语“改善的”，“增加的”，“增加”或“改善”意指经修饰的微生物中乳清酸至乳清苷5’磷酸的转化的量与相应的未修饰的微生物相比更高。此种转化可通过多种手段来改善，特别是：
-增加起始底物(乳清酸)的数量，
-增加辅因子(PRPP)的可获得性，
-增加催化反应的酶(乳清酸磷酸核糖基转移酶)的活性。
在本发明的一个具体方面，所述菌株具有增加的乳清酸磷酸核糖基转移酶活性。乳清酸磷酸核糖基转移酶或“OPRTase”是催化乳清酸至乳清苷5’磷酸(OMP)的转化的酶。
具体而言，所述菌株呈现约30单位的增加的乳清酸磷酸核糖基转移酶比活性，优选至少50单位且最优选至少70单位。
在本发明的一个优选的方面，编码乳清酸磷酸核糖基转移酶的基因pyrE的表达增加。
术语“表达”指基因至蛋白(即基因产物)的转录和翻译。
基因表达可通过多种手段增加，如：
-在导入菌株的质粒上表达异源基因；
-过表达内源基因，通过用更强的启动子替代内源启动子，或通过增加染色体上基因的拷贝数来获得；
-通过位于染色体上另一个或其它位置的人工启动子来表达基因。
在本发明的一个更优选的方面，在具有在rph-pyrE操纵子中的移码突变的大肠杆菌K12菌株中，基因pyrE的表达得到回复。
含有移码突变的rph基因的核苷酸序列由Jensen,K.F.(1993)列出。此外，野生型rph-pyrE操纵子的核苷酸序列可从GenBank/EMBL数据库以登录号X00781和X01713获得，且顺反子间rph-pyrE区段以及侧翼区的序列可从EMBL数据库以登录号X72920获得。本领域技术人员亦理解，当提及野生型rph和pyrE DNA序列时，此类序列包括与那些公开或保藏的序列功能上等同的天然和合成序列。
术语“大肠杆菌K-12菌株”应理解为包括来自Stanford University的细菌学系的保藏的的培养物大肠杆菌，和所有Lederberg菌株W1485的衍生物，其在用UV光，X射线和/或其它化学或遗传处理之后，从原始的大肠杆菌K-12菌株产生(Bachmann,B.J.1987.Derivations and genotypes of some mutantderivatives of Escherichia coli K-12,p.1191-1219.于J.L.Ingraham,K.B.Low,B.Magasanik,M.Schaechter和H.E.Umbarger(编),Escherichia coli andSalmonella typhinurium:cellular and molecular biology.American Society forMicrobiology,Washington,D.C)。
术语“在rph-pyrE操纵子中具有移码突变的大肠杆菌K12菌株”指携带在rph基因上已知的点突变的Lederberg菌株W1485的大肠杆菌菌株衍生物。与那些携带未突变的野生型rph基因的菌株相比，从见于rph终止密码子上游43至47对碱基处的5个“GC”区段缺失一个“CG”碱基对的大肠杆菌菌株视为突变菌株(Jensen K,1993,J.Bacteriol.175:3401-3407)。
之前说明了大肠杆菌K-12菌株的rph基因中的移码突变对pyrE基因的表达具有极性作用，pyrE基因位于rph下游，在同一“操纵子”中。因此，在rph基因中的突变导致低水平的乳清酸磷酸核糖基转移酶，且其结果为乳清酸的蓄积。
具有突变的rph-pyrE操纵子的大肠杆菌K-12菌株产生具有约5至20个单位的比活性的乳清酸磷酸核糖基转移酶(PyrE)，而其它具有野生型rph-pyrE操纵子的大肠杆菌菌株，换言之，其具有野生型pyrE表达，则呈现约30至90单位的OPRTase比活性水平。
在rph上具有移码突变的菌株中乳清酸的蓄积可干扰乙醇酸的产生、分离和纯化。因此，通过显著地减少呈现野生型OPRT活性(至少30个单位的比活性)的大肠杆菌K-12中该乳清酸的蓄积，可显著改善乙醇酸的产生。
术语“回复”指用于重新构建野生型rph-pyrE操纵子的本领域技术人员已知的特定遗传改变或操作。
在此特定情况下，一种增加pyrE的转录的可能是通过校正对导致pyrE的不良转录的rph中的点突变来回复rph-pyrE操纵子的野生型序列。
具有野生型操纵子的大肠杆菌K-12菌株可通过测定乳清酸磷酸核糖基转移酶活性的水平和/或通过对其中包含的rph-pyrE区进行测序来鉴定。
当提及化学化合物的“收率”，“水平”或“量”时，这些术语应理解为意指基本上纯的产物的数量。可使用常规化学检测方法如GCMS、HPLC、分光光度技术和酶活性。
在本发明中，酶通过其比活性鉴别。该定义因此包括亦存在于其它生物，更具体而言其它微生物中的所有具有限定的比活性的多肽。具有类似活性的酶可通过与某些家族具有如PFAM或COG定义的同源性来鉴定。
PFAM(比对和隐藏的Markov模型的蛋白家族数据库http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)展示大量蛋白序列比对的收集。每个PFAM使得能够使多重比对可视化，观察蛋白域，评价多种生物间的分配，访问其他数据库，并使得已知蛋白结构可视化。
COG(蛋白同向进化同源组的簇；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)通过比较来自代表30个主要***发生系的43个全部测序的基因组的蛋白序列而获得。每个COG从至少三个系定义，这使得可以鉴定先前保守的域。
鉴定同源序列及其百分比同源性的方法对于本领域技术人员是公知的，并具体包括BLAST程序，其可从网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/以该网站指示的缺省参数进行使用。然后可使用例如程序CLUSTALW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)或MULTALIN(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)以这些网站指示的缺省参数来探查(例如比对)获得的序列。
使用GenBank中对于已知基因给出的参照，本领域技术人员能够确定其它生物、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中的等同基因。该常规工作有利地使用共同序列，并设计简并探针以克隆其它生物中的相应基因来进行，所述共同序列可通过与来源于其它微生物的基因进行序列比对来确定。这些分子生物学的常规方法对于本领域技术人员是公知的，并描述于，例如Sambrook等(1989Molecular Cloning:a Laboratory Manual.第2版,ColdSpring Harbor Lab.,Cold Spring Harbor,New York)。
在本发明的一个具体实施方案中，所述菌株呈现增加的5-磷酸核糖基1-焦磷酸(PRPP)可获得性。
术语“磷酸核糖基焦磷酸”，“5-磷酸核糖1-焦磷酸”和“PRPP”可互换使用。PRPP是一种通过由基因prsA编码的酶磷酸核糖基焦磷酸合成酶由核糖-5-磷酸和一个ATP形成的戊糖磷酸(参见图1)。
磷酸核糖基焦磷酸合成酶参与嘌呤、嘧啶和烟酰胺核苷酸的生物合成的第一步和组氨酸和色氨酸的生物合成(来自Ajinomoto的EP1529839A1和EP1700910A2)。
PRPP分子亦为由酶OPRTase催化的反应的必需的辅因子(见上)。事实上，该反应使用来自PRPP的戊糖磷酸模块。
术语“增加的可获得性”意指PRPP以与未经修饰的菌株相比更高的量存在：或者是PRPP的产生增加，或者是其消耗减少。
在本发明的一个具体方面，增加了编码磷酸核糖基焦磷酸合成酶的基因prsA的表达，因此PRPP的产生与未经修饰的菌株相比增加。
多种方法可用于增加基因的表达，且为本领域技术人员所知：
-从质粒DNA表达基因，
-在染色体上直接用强启动子替代基因的天然启动子，
-通过在染色体上的另一个或其它位置上的人工启动子表达基因。
在本发明的另一个实施方案中，对菌株进一步修饰以增强乙醇酸的产生。
具体而言，所述经修饰的微生物可包含至少一种下列修饰：
-减少乙醛酸至除乙醇酸之外其它产物的转化，具体通过减弱基因aceB，glcB，gcl，eda来获得，
-无法实质性代谢乙醇酸，具体通过减弱基因glcDEFG，aldA来获得，
-增加乙醛酸途径通量，具体通过减弱基因icd，aceK，pta，ackA，poxB，iclR或fadR，和/或通过过表达基因aceA来获得，
-增加乙醛酸至乙醇酸的转化，具体通过过表达基因ycdW或yiaE来获得，
-增加NADPH的可获得性，具体通过减弱基因pgi，udhA，edd来获得。
具体而言，微生物经修饰以具有除了产生乙醇酸之外，较低的乙醛酸转化能力，这是由于减弱了编码消耗乙醛酸(乙醇酸的一个关键前体)的酶的基因的表达：
-编码苹果酸合酶的aceB和gclB基因，
-编码乙醛酸聚醛酶的gcl和
-编码2-酮-3-脱氧葡糖酸-6-磷酸醛缩酶的eda。
多种方法可用于减弱基因的表达：
-将突变导入基因，减少该基因的表达水平，
-用弱启动子替代基因的天然启动子，导致较低的表达，
-缺失基因，若无需表达。
在本发明的进一步的实施方案中，对大肠杆菌K12菌株进行修饰使其无法实质性代谢乙醇酸。该结果可通过减弱至少一种编码消耗乙醇酸的酶的基因来取得：
-编码乙醇酸氧化酶的glcDEF，和
-编码乙醇醛脱氢酶的aldA。
基因的减弱可通过来用低强度启动子或使得相应的信使RNA或蛋白不稳定的元件替代天然启动子完成。若需要，基因的完全减弱亦可通过缺失相应的DNA序列来取得。
在另一个实施方案中，根据本发明的大肠杆菌K12菌株经转化以增加乙醛酸途径通量。
乙醛酸途径中的通量可通过不同手段来增加，且特别是：
i)减少由icd基因编码的酶异柠檬酸脱氢酶的活性，
ii)减少至少一种下列酶的活性：
-由pta基因编码的磷酸转乙酰酶
-由ack基因编码的乙酸激酶
-由poxB基因编码的丙酮酸氧化酶
-由aceK基因编码的Icd激酶-磷酸酶
iii)增加由aceA基因编码的酶异柠檬酸裂合酶的活性。
减少异柠檬酸脱氢酶的水平可通过导入驱动编码异柠檬酸脱氢酶的icd基因的表达的人工启动子，或通过将减少蛋白的酶活性的突变导入icd基因来实现。
因为蛋白Icd的活性通过磷酸化减少，其亦可通过导入相对于野生型AceK酶具有增加的激酶活性或减少的磷酸酶活性的突变体aceK基因来调控。
增加异柠檬酸裂合酶的活性可通过减弱编码乙醛酸途径抑制物的iclR或fadR基因的水平，或通过刺激aceA基因的表达，例如通过导入驱动该基因表达的人工启动子，或通过将增加编码蛋白的活性的突变导入aceA基因来实现。
在本发明的另一个实施方案中，所述大肠杆菌K12菌株含有至少一个编码催化乙醛酸至乙醇酸的转化的多肽的基因。在一个优选的方式中，增加所述基因的表达。
具体而言，该多肽是酶NADPH依存性乙醛酸还原酶，其将有毒的乙醛酸中间物转化为乙醇酸。
优选地，所述基因选自来自大肠杆菌MG1655的基因组的ycdW或yiaE基因。若需要的话，高水平的NADPH依存性乙醛酸还原酶活性可从染色体上编码的基因通过使用基因组上的一个或几个拷贝来获得，所述拷贝可通过本领域技术人员已知的重组方法导入。对于染色体外基因，可使用不同类型的质粒，这些质粒就其复制起点和因此其在细胞中的拷贝数而不同。它们可以以1至5个拷贝，约20个或多至500个拷贝存在，其分别对应于具有严紧复制的低拷贝数质粒(pSC101，RK2)，低拷贝数质粒(pACYC，pRSF1010)或高拷贝数质粒(pSK bluescript II)。所述ycdW或yiaE基因可使用具有不同强度，需要或不需要由诱导物分子诱导的启动子来表达。实例为启动子Ptrc，Ptac，Plac，lambda启动子cI或其它本领域技术人员已知的启动子。基因的表达亦可通过使相应的信使RNA(Carrier和Keasling(1998)Biotechnol.Prog.15,58-64)或蛋白(例如GST标签，Amersham Biosciences)稳定的元件来增强。
编码所述多肽的基因可为外源或内源的，并可在染色体上或染色体外表达。
在本发明的另一个实施方案中，所述大肠杆菌K12菌株对于NADPH依存性乙醛酸还原酶呈现增加的NADPH可获得性，其提供了更佳的乙醇酸产生的收率。对微生物的该修饰可通过减弱至少一种选自下组的基因来获得：
-编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi，
-编码可溶性转氢酶的udhA，和
-编码6-磷酸葡糖酸脱水酶活性的edd。
在这些遗传修饰存在下，所有的葡萄糖-6-磷酸将必须通过戊糖磷酸途径进入糖酵解，且对于每个代谢的葡萄糖-6-磷酸将产生2个NADPH。
在本发明的一个优选实施方案中，所述经修饰的微生物包含基因aceB，glcB，gcl，eda，glcDEFG，aldA，icd，aceK，pta，ackA，poxB，iclR的减弱和基因aceA和ycdW的过表达。任选地，所述经修饰的微生物亦可包含基因pgi，udhA，和edd的减弱。
在本发明的一个实施方案中，所述碳源选自下组：葡萄糖、蔗糖、单糖或寡糖、淀粉或其衍生物或甘油，及其组合。
之前描述的本发明亦涉及用于发酵制备乙醇酸的方法，其包括下列步骤：
a)发酵产生乙醇酸的微生物，
b)在细菌或在培养基中浓缩乙醇酸，和
c)从发酵液和/或任选地以部分或全部量(0至100%)遗留在终产物中的生物质分离乙醇酸。
在一个具体实施方案中，所述乙醇酸通过聚合至至少乙醇酸二聚体的步骤进行分离，并通过从乙醇酸二聚体、寡聚体和/多聚体解聚来回收。
本领域技术人员能够定义对于根据本发明的微生物的培养条件。具体而言，大肠杆菌K12菌株在30至37℃的温度发酵。
发酵通常在含有无机培养基的发酵罐中进行，所述培养基具有调适于使用的细菌的已知的限定组成，含有至少一种简单碳源，且若需要含有产生代谢物必需的共底物。
本发明亦涉及具有增强的乳清酸至乳清苷5’-磷酸的转化的大肠杆菌K-12菌株。
具体而言，所述菌株呈现增加的乳清酸磷酸核糖基转移酶比活性。
在本发明的一个优选的方面，编码乳清酸磷酸核糖基转移酶的基因pyrE的表达在所述菌株中增加。
在本发明的一个具体方面，所述菌株经修饰使得基因pyrE的表达在具有rph-pyrE操纵子中的移码突变的大肠杆菌K12菌株中回复。
在本发明的另一个方面，所述菌株呈现增加的5-磷酸核糖基1-焦磷酸(PRPP)的可获得性。
具体而言，本发明涉及大肠杆菌菌株，其中增加了基因pyrE的表达和PRPP的产生。
更具体而言，本发明涉及大肠杆菌菌株，其中如上所述编码磷酸核糖基焦磷酸合酶的基因prsA过表达。
在本发明的另一个实施方案中，所述经修饰的大肠杆菌菌株进一步经修饰以产生具有高收率的乙醇酸。具体而言，所述大肠杆菌菌株包含至少一种下列修饰：
-减少乙醛酸至除乙醇酸之外其它产物的转化，具体通过减弱基因aceB，glcB，gcl，eda来获得，
-无法实质性代谢乙醇酸，具体通过减弱基因glcDEFG，aldA来获得，
-增加乙醛酸途径通量，具体通过减弱基因icd，aceK，pta，ackA，poxB，iclR或fadR，和/或通过过表达基因aceA来获得，
-增加乙醛酸至乙醇酸的转化，具体通过过表达基因ycdW或yiaE来获得，
-增加NADPH的可获得性，具体通过减弱基因pgi，udhA，edd来获得。
该微生物优选为大肠杆菌K-12菌株，具有rph移码突变[参见Machida,H.和Kuninaka,A.(1969)and“Escherichia coli and Salmonella typhimurium:Cellularand Molecular Biology1987]，首先校正为含有至少野生型的OPRT活性，然后经遗传工程改造，尤其是避免任何乙醛酸至除了乙醇酸之外的产物的转化。
此类菌株可通过本文中已经描述的不同方法鉴定：通过测量OPRT活性，通过对rph-pyrE操纵子的DNA序列分析，和/或通过检查乳清酸蓄积的水平。
实施例
使用了数种实验方案以构建后续实施例中描述的产生乙醇酸的菌株。这些方案如下文详述。
实验方案1：导入用于重组的PCR产物并选择重组体(Cre-LOX***)
使用选定的、在表1中给出的用于替代基因或基因间区域的寡核苷酸从质粒loxP-cm-loxP(Gene Bridges)扩增氯霉素抗性盒或从质粒loxP-PGK-gb2-neo-loxP(Gene Bridges)扩增新霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入携带质粒PKD46的受体株，其中表达的***λRed(γ，β，exo)极大地有利于同源重组。然后选择抗生素抗性转化体，并用表2中给出的合适的寡核苷酸通过PCR分析检查抗性盒的***。
实验方案2：用噬菌体P1进行基因缺失的转导
将DNA从一种大肠杆菌菌株转移至另一种是通过用噬菌体P1的转导技术进行的。该实验方案分两步进行，(i)对具有单一修饰基因的供体株制备噬菌体裂解液，和(ii)通过该噬菌体裂解液转导受体株。
噬菌体裂解液的制备
-用100μl具有单一修饰基因的株MG1655的过夜培养物接种10mlLB+Cm30μg/ml/Km50μg/ml+葡萄糖0.2%+CaCl25mM。
-在37℃振荡温育30分钟。
-添加100μl对于供体株MG1655制备的噬菌体裂解液P1(大约1x109个噬菌体/ml)。
-在37℃振荡3小时直至所有细胞裂解。
-添加200μl氯仿，并涡旋。
-以4500g离心10分钟以消除细胞碎片。
-将上清转移到灭菌管中，并添加200μl氯仿。
-将裂解液在4℃储藏。
转导
-以1500g将5ml的LB培养基中的大肠杆菌受体株的过夜培养物离心10分钟。
-将细胞沉淀悬浮于2.5ml的MgSO410mM，CaCl25mM中。
-对照管：100μl细胞
100μl具有单一基因缺失的株MG1655的噬菌体P1。
-管测试：100μl细胞+100μl具有单一修饰基因的株MG1655的噬菌体P1。
-在30℃温育30分钟，无振荡。
-在每个管中添加100μl柠檬酸钠1M，并涡旋。
-添加1ml的LB。
-在37℃振荡温育1小时
-在以7000rpm将试管离心3分钟之后铺板于平板LB+Cm30μg/ml/Km50μg/ml上。
-在37℃温育过夜。
然后选择抗生素抗性转化体，并用表2中给出的合适的寡核苷酸通过PCR分析检查缺失的***。
Figure BDA00003116857800131
表1：用于构建在后续实施例中所述的构建体的寡核苷酸
Figure BDA00003116857800141
表2：用于检查抗性盒的***或抗性盒的丧失的寡核苷酸
实施例1
rph-pyrE操纵子在通过发酵产生乙醇酸的大肠杆菌K-12菌株中的遗传重建：MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm rph+pyrErc ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)
菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)根据专利申请EP2027277和未公开的专利申请EP09155971中给出的描述来构建。
大肠杆菌野生型MG1655菌株在rph基因中具有移码突变。为了在细胞中回复乳清酸磷酸核糖基转移酶活性水平，已将功能性rph基因以若干步导入菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGBΔaldA ΔiclR Δedd+eda(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)中以给出大肠杆菌MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm Δrph+pyrE::Nm ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)。
缩写：
Rph-pyrErc指“用rph的野生型拷贝重建rph-pyrE操纵子”。pyrE的表达在此情况下增加。
Δrph+pyrE::Nm指“操纵子的缺失”。
当未提及基因型时，操纵子与MG1655大肠杆菌K-12菌株中相同，即在rph基因中具有突变。
1.菌株MG1655Δrph+pyrE::Nm的构建
为了缺失菌株大肠杆菌MG1655中的rph+pyrE区，使用由Datsenko &Wanner(2000)所述的同源重组策略。该构建根据实验方案1中所述的技术用表1中给出的相应的寡核苷酸Oag0119-DpyrE-loxP R和Oag0143_Drph-loxPF(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)进行。
Oag0119_DpyrE-loxP R(SEQ ID NO:1)
CGCCAAACTCTTCGCGATAGGCCTTAACCGCCGCCAGATGTTCCGCCATTTCCGGCTTCTCTTCCAGGTAAGCAATCAGGTAATACGACTCACTATAGGG
其中有
-同源于区pyrE(参照序列见网站http://ecogene.org/)的序列(3813155–3813234)的区(大写)，
-用于扩增新霉素抗性盒(参照序列Gene Bridges)的区(大写粗体)，
Oag0143_Drph-loxP F(SEQ ID NO:2)
GGTGCGTCCCGTTACCCTGACTCGTAACTATACAAAACATGCAGAAGGCTCGGTGCTGGTCGAATTTGGCGATACCAAAGTGAATTAACCCTCACTAAAGGG
其中有
-同源于区rph(参照序列见网站http://ecogene.org/)的序列(3814543–3814462)的区(大写)，
-用于扩增新霉素抗性盒(参照序列Gene Bridges)的区(大写粗体)，
将所得的PCR产物通过电穿孔导入菌株MG1655(pKD46)。然后选择新霉素抗性转化体，并且抗性盒的***通过用表2中限定的寡核苷酸Oag0144_rph-loxP F和Oag0122_DpyrE R(SEQ ID NO:7和8)的PCR分析进行验证。所得的菌株命名为MG1655Δrph+pyrE::Nm.
2.菌株大肠杆菌MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm rph+pyrErc ΔaceBΔgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)的构建
首先，菌株大肠杆菌MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::CmΔrph+pyrE::Nm.ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldAΔiclR Δedd+eda通过实验方案1中所述的用噬菌体P1的转导技术来构建。供体菌株为上述的菌株MG1655 Δrph+pyrE::Nm。受体菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::C
Figure BDA00003116857800151
ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclRΔedd+eda描述于前面在上文提到的专利申请。选择新霉素和氯霉素抗性转化体，且Δrph+pyrE::Nm区的***通过用寡核苷酸Oag0144_rph-loxP F和Oag0122_DpyrE R的PCR分析进行验证。所得菌株命名为MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm Δrph+pyrE::
Figure BDA00003116857800161
ΔgclΔglcDEFGBΔaldA ΔiclR Δedd+eda。
为了回复功能性rph基因，菌株大肠杆菌MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm rph+pyrErc.ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclRΔedd+eda通过实验方案1中所述的用噬菌体P1的转导技术来构建。供体菌株是CGSC#5073菌株(其可从"E.coli Genetic Stock Center",stock#5073,YaleUniversity,New Haven,Conn.获得)，具有野生型rph基因(在本文中记为rph+pyrErc)。然后对氯霉素抗性转化体就嘧啶原养型进行选择，且rph+pyrE区的***通过用上文限定的寡核苷酸Oag0144_rph-loxP F和Oag0122_DpyrER进行的PCR分析进行验证。所得的菌株通过测序证实。获得的菌株命名为MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm rph+pyrErc ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldAΔiclR Δedd+eda。
然后将质粒pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01通过电穿孔导入命名为MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm rph+pyrErc ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGBΔaldA ΔiclR Δedd+eda的菌株。所得的菌株MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm rph+pyrErc ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclRΔedd+eda(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)命名为AG8043。
实施例2
质粒pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-TTs的构建
质粒pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-TTs从质粒pBBR1MCS5(参见M.E.Kovach,(1995),Gene166:175-176)和pPP1(参见P.Poulsen,(1984),The EMBOJournal3:1783-1790)构建。基因pyrE通过PCR从质粒pPP1用在其序列中含有Ptrc04启动子和RBS01*5的寡核苷酸Ptrc04/RBS01*5-pyrE F和pyrE R(表1，SEQ ID NO:3和4)进行扩增。将用KpnI/EcoRV消化的PCR片段克隆入用KpnI/SmaI切割的质粒pBBR1MCS5，得到质粒pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE(图3)。重组质粒的序列通过DNA测序检查。
实施例3
质粒pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-prsA-TTs的构建
质粒pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-prsA-TTs从上述的质粒pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-TTs构建。基因prsA通过PCR对MG1655基因组DNA用表1中给出的寡核苷酸Oag0371-prsA F KpnI和Oag0372–prsA R SmaI(SEQ ID NO:5和6)进行扩增。将PCR片段用SmaI/KpnI消化并克隆入通过SphI/Klenow/KpnI切割的质粒pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-TTs，得到质粒pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-prsA-TTs(图4)。重组质粒的序列通过DNA测序检查。
实施例4
产生乙醇酸且过表达pyrE、含或不含prsA的菌株：MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔuxaCA::RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02::Km ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxBΔackA+pta(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)(pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-TTs)和MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔuxaCA::RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02::Km ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldAΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)(pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-prsA-TTs)的构建
菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::CmΔuxaCA::RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02::Km ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)根据专利申请EP10305635.4中给出的描述构建。
将质粒pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-TTs和pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-prsA-TTs(描述于上文实施例2和3)分别导入菌株MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔuxaCA::RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02::Km ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxBΔackA+pta(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)。将所得的菌株MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔuxaCA::RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02::Km ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)(pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-TTs)和MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd::CmΔuxaCA::RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02::Km ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+edaΔpoxB ΔackA+pta(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)(pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-prsA-TTs)分别命名为AG1629和AG1630。
实施例5
产生乙醇酸并过表达pyrE、含或不含prsA的菌株：MG1655TTadcca/cI857/PR01/RBS01*2-icd::Km ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclRΔedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔaceK::Cm(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)(pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-TTs)和MG1655 TTadcca/cI857/PR01/RBS01*2-icd::Km ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+edaΔpoxB ΔackA+pta ΔaceK::Cm(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)(pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-prsA-TTs)的构建
菌株大肠杆菌MG1655 TTadcca/cI857/PR01/RBS01*2-icd::Km ΔaceBΔgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔaceK::Cm(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)根据专利申请EP10305635.4中给出的描述构建。
将质粒pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-TTs和pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-prsA-TTs独立地导入菌株MG1655 TTadcca/cI857/PR01/RBS01*2-icd::Km ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxBΔackA+pta ΔaceK::Cm(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)。所得的菌株MG1655 TTadcca/cI857/PR01/RBS01*2-icd::Km ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGBΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔaceK::Cm(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)(pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-TTs)和MG1655TTadcca/cI857/PR01/RBS01*2-icd::Km ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclRΔedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔaceK::Cm(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)(pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-prsA-TTs)分别命名为AG1869和AG1871。
实施例6
通过用不产生乳清酸作为副产物的菌株的发酵产生乙醇酸
菌株AG1385：MG1655 DuxaCA::RN/TTadcca-CI857-PR/RBS01*2-icd-TT02 Ptrc50/RBS05/TTG-icd DaceB Dgcl DglcDEFGB DaldA DiclR Dedd+edaDpoxB DackA+pta(pME101-ycdW*(M)-TT07-PaceA-aceA-TT01)。
菌株AG1629：MG1655 DuxaCA::RN/TTadcca-CI857-PR/RBS01*2-icd-TT02 Ptrc50/RBS05/TTG-icd DaceB Dgcl DglcDEFGB DaldA DiclR Dedd+edaDpoxB DackA+pta (pME101-ycdW*(M)-TT07-PaceA-aceA-TT01)(pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-TTs)。
菌株AG1630：MG1655 DuxaCA::RN/TTadcca-CI857-PR/RBS01*2-icd-TT02 Ptrc50/RBS05/TTG-icd DaceB Dgcl DglcDEFGB DaldA DiclR Dedd+edaDpoxB DackA+pta (pME101-ycdW*(M)-TT07-PaceA-aceA-TT01)(pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-prsA-TTs)。
菌株AG1413：MG1655 DPicd-CI857-PlambdaR*(-35)/RBS01-icd::KmDaceB Dgcl DglcDEFGB DaldA DiclR Dedd+eda DpoxB DackA+ptaDaceK::Cm (pME101-ycdW*(M)-TT07-PaceA-aceA-TT01)。
菌株AG1869：MG1655 DPicd-CI857-PlambdaR*(-35)/RBS01-icd::KmDaceB Dgcl DglcDEFGB DaldA DiclR Dedd+eda DpoxB DackA+pta DaceK(pME101-ycdW*(M)-TT07-PaceA-aceA-TT01)(pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-TTs)。
菌株AG1871：MG1655 DPicd-CI857-PlambdaR*(-35)/RBS01-icd::KmDaceB Dgcl DglcDEFGB DaldA DiclR Dedd+eda DpoxB DackA+ptaDaceK::Cm (pME101-ycdW*(M)-TT07-PaceA-aceA-TT01) (pBBR1MCS5-Ptrc04/RBS01*5-pyrE-prsA-TTs)。
发酵工艺
用于这些菌株的工艺描述于专利申请US61/245,716和EP10305635.4。
预培养在注以55ml补充了40g/l的MOPS和10g/l的葡萄糖的合成培养基MML8AG1_100(组成见表3)的三个500ml带挡板的Erlenmeyer烧瓶中在37℃在2日期间进行(最终吸光度为7至10)。使用20ml的该预培养物接种亚培养。
Figure BDA00003116857800191
Figure BDA00003116857800201
表3：基本培养基MML8AG1 100的组成
将亚培养物在安装在Multifors Multiple Fermentor System(Infors)上的700mL工作体积的容器中生长。将每个容器注以200ml补充20g/l的葡萄糖和50mg/l的壮观霉素的合成培养基MML11AG1_100(组成见表3)，并以约1的起始吸光度接种。
Figure BDA00003116857800202
Figure BDA00003116857800211
表4：基本培养基MML11AG1100的组成
培养在30℃以0.2lpm通气进行，且溶解氧通过控制搅拌(起始：300rpm；最大：1200rpm)和氧气供给(0至40ml/min)保持在30%饱和以上。pH通过添加碱(NH4OH7.5%w/w和NaOH2.5%w/w的混合物)调整至pH6.8±0.1。发酵以不连续批次补料模式进行，给料储液有700g/l葡萄糖(组成见下表5)。
成分 浓度(g/l)
葡萄糖 700.00
MgSO47H2O 2.00
CoCl26H2O 0.0256
MnSO4H2O 0.0640
CuCl22H2O 0.0064
H3BO3 0.0032
Na2MoO42H2O 0.0013
ZnSO47H2O 0.0128
FeSO47H2O 0.08
硫胺素 0.01
表5：给料储液的组成
当培养基中葡萄糖耗尽时，脉冲给料回复20g/l的葡萄糖浓度。
在第五次脉冲给料(消耗了100g/L葡萄糖)之后，将pH调整至pH7.4直至培养终止。pH的迁移在约2小时完成。
在这些条件下生长的菌株AG1385，AG1629，AG1630，AG1413，AG1869和AG1871的乙醇酸产生和乳清酸蓄积的性能在下表6中给出。
表6：菌株AG1385，AG1629，AG1630，AG1413，AG1869和AG1871的乙醇酸(效价、收率和产量)和乳清酸产生。呈现每种菌株2份培养的均值。
如可见于表6，在菌株AG1629，AG1630，AG1869和AG1871中pyrE基因的过表达抑制乳清酸蓄积。
在菌株AG1869和AG1871中亦允许增强乙醇酸产生的收率。当pyrE基因的过产生与prsA过表达组合时性能更佳。
实施例7
乳清酸磷酸核糖基转移酶(OPRT)活性的测量
为了确定乳清酸磷酸核糖基转移酶(OPRT)活性，将来***瓶培养(25mg干重量)的细胞悬于磷酸钾缓冲液，并转移至含有玻璃珠的管以供使用Precellys(在6500rpm进行30秒,Bertin Technologies)裂解。细胞碎片通过在12000g(4℃)离心30分钟来去除。使用Bradford蛋白测定法来测量蛋白浓度。在粗提取物中存在的乳清酸磷酸核糖基转移酶(OPRT)活性通过在295nm处的分光光度法进行检测(Jasco)。由OPRT催化的反应包括在AMP存在下将乳清酸转化为乳清苷单磷酸(OMP)和PPi。该测定法基于在295nm测量乳清酸消耗。
将含有80mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.8)，6mM MgCl2，0.32mM的乳清酸和0.1至0.5μg/μL的粗提取物的反应混合物(1mL)在37℃温育10分钟。然后，添加0.8mM的5-磷酸-D-核糖基-1-二磷酸(PRPP)以起始反应。活性使用对于乳清苷在295nm处为3.67M-1cm-1的消光系数来计算。
磷酸核糖基焦磷酸合成酶(PRSA)活性的测量
为了确定PRSA活性，将来***瓶培养的细胞(25mg干重量)悬于磷酸钾缓冲液，并转移至含有玻璃珠的管以供使用Precellys(在6500rpm进行30秒,Bertin Technologies)裂解。细胞碎片通过在12000g(4℃)离心30分钟来去除。使用Bradford蛋白法测定来测量蛋白浓度。PRSA(PRPP合成酶)对核糖-5-磷酸的活性通过IC-MS/MS(DIONEX/API2000)通过追踪PRPP的产生来检测。将含有50mM的TEA-HCl缓冲液(pH7.5)，10mM MgCl2，2mM的ATP和2mM的核糖-5-磷酸的反应混合物(1mL)在37℃温育10分钟。然后，添加50ng粗提取物以起始反应。在30分钟之后，通过超滤(Amicon ultra10K)终止反应，然后对产生的PRPP的量进行定量。
Figure BDA00003116857800231
Figure BDA00003116857800241
表7：在前述实施例中所述的每种菌株的OPRT和PRSA活性
ND：未测定
参考文献
专利
-EP2025759A1
-EP2025760A1
-WO2006/069110
-WO2007/141316
-US61/162,712
-EP09155971.6
-PCT/EP2006/063046
-EP1529839A1
-EP1700910A2
公开文献
-Michihiko Kataoka(2001),Biosci.Biotechnol.Biochem.
-Machida,H.和Kuninaka,A.(1969).
-Escherichia coli and salmonella typhimurium:cellular and molecularbiology”,(1987)Neidhardt,F.C.等(编).American Society for Microbiology,volume2,chapter72.
-Bachmann,B.J.(1987).Derivations and genotypes of some mutantderivatives of E.coli K-12,p.1191-1219.于J.L.Ingraham,K.B.Low,B.Magasanik,M.Schaechter和H.E.Humbarger(编),Escherichia coli andsalmonella typhimurium:cellular and molecular biology.
-Jensen K.F.1993,J.Bacteriol.175:3401-3707.
-Poulsen P.等1984,EMBO3:1783-1790.
-Womack J.E.和O’Donavan G.A.1978,J.Bacteriol,136:825-827.
-Tsui,H.-C.T.等1991,J.Bacteriol.173:7395-7400.
-Schwartz,M.和Neuhard,J.,(1975),J.bacteriol.121:814-822.
-Sambrook等(1989)Molecular Cloning:a Laboratory Manual.第2版Cold Spring Harbor Lab.,Cold Spring Harbor,New York.
-Carrier和Keasling(1998),Biotechnol.Prog.15,58-64.
Figure IDA00003116858400011

Claims (19)

1.一种用于发酵产生乙醇酸，其衍生物或前体的方法，其包括在包含碳源的合适培养基中培养大肠杆菌(Escherichia coli)菌株，并回收所述培养基中的乙醇酸，其中所述菌株经过修饰以改善乳清酸至乳清苷5’-磷酸的转化。
2.权利要求1的方法，其中所述菌株呈现增加的乳清酸磷酸核糖基转移酶比活性(specific activity)。
3.权利要求2的方法，其中编码所述乳清酸磷酸核糖基转移酶的基因pyrE的表达增加。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中在具有在rph-pyrE操纵子中的移码突变的大肠杆菌K12菌株中，基因pyrE的表达得到回复。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述菌株呈现增加的5-磷酸核糖基1-焦磷酸(PRPP)可获得性。
6.权利要求5的方法，其中编码磷酸核糖基焦磷酸合酶的基因prsA的表达增加。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述菌株经进一步修饰以增强乙醇酸的产生。
8.权利要求7的方法，其中所述经修饰的微生物包含至少一种下列修饰：
-减少乙醛酸至除乙醇酸之外其它产物的转化，具体通过减弱基因aceB，glcB，gcl，eda来获得，
-无法实质性代谢乙醇酸，具体通过减弱基因glcDEFG，aldA来获得，
-增加乙醛酸途径通量，具体通过减弱基因icd，aceK，pta，ackA，poxB，iclR或fadR，和/或通过过表达基因aceA来获得，
-增加乙醛酸至乙醇酸的转化，具体通过过表达基因ycdW或yiaE来获得，
-增加NADPH的可获得性，具体通过减弱基因pgi，udhA，edd来获得。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述碳源选自下组：葡萄糖、蔗糖、单糖或寡糖、淀粉或其衍生物或甘油，及其组合。
10.一种如权利要求1至9中任一项所要求保护的用于发酵制备乙醇酸的方法，其包括下列步骤：
a)发酵产生乙醇酸的微生物，
b)在细菌或在培养基中浓缩乙醇酸，和
c)从发酵液和/或任选地以部分或全部量(0至100%)遗留在终产物中的生物质分离乙醇酸。
11.权利要求10中所述的方法，其中所述乙醇酸通过聚合至至少乙醇酸二聚体的步骤进行分离，并通过从乙醇酸二聚体、寡聚体和/多聚体解聚来回收。
12.一种大肠杆菌菌株，其中所述菌株经过修饰以改善乳清酸至乳清苷5’-磷酸的转化。
13.权利要求12的菌株，其中所述菌株呈现增加的乳清酸磷酸核糖基转移酶比活性。
14.权利要求13的菌株，其中编码所述乳清酸磷酸核糖基转移酶的基因pyrE的表达增加。
15.权利要求12至14中任一项的菌株，其中在具有在rph-pyrE操纵子中的移码突变的大肠杆菌K12菌株中，基因pyrE的表达得到回复。
16.权利要求12至15中任一项的菌株，其中所述菌株呈现增加的5-磷酸核糖基1-焦磷酸(PRPP)可获得性。
17.权利要求16的菌株，其中编码磷酸核糖基焦磷酸合酶的基因prsA的表达增加。
18.权利要求12至17中任一项的菌株，其中所述菌株经进一步修饰以增强乙醇酸的产生。
19.权利要求18的菌株，其中所述经修饰的微生物包含至少一种下列修饰：
-减少乙醛酸至除乙醇酸之外其它产物的转化，具体通过减弱基因aceB，glcB，gcl，eda来获得，
-无法实质性代谢乙醇酸，具体通过减弱基因glcDEFG，aldA来获得，
-增加乙醛酸途径通量，具体通过减弱基因icd，aceK，pta，ackA，poxB，iclR或fadR，和/或通过过表达基因aceA来获得，
-增加乙醛酸至乙醇酸的转化，具体通过过表达基因ycdW或yiaE来获得，
-增加NADPH的可获得性，具体通过减弱基因pgi，udhA，edd来获得。
CN2010800698723A 2010-08-27 2010-08-27 用经修饰的微生物改善乙醇酸发酵产生 Pending CN103189517A (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IB2010/002545 WO2012025780A1 (en) 2010-08-27 2010-08-27 Improved glycolic acid fermentative production with a modified microorganism

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103189517A true CN103189517A (zh) 2013-07-03

Family

ID=43216247

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800698723A Pending CN103189517A (zh) 2010-08-27 2010-08-27 用经修饰的微生物改善乙醇酸发酵产生

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20130210097A1 (zh)
EP (1) EP2609208A1 (zh)
JP (1) JP2013537429A (zh)
KR (1) KR20130101030A (zh)
CN (1) CN103189517A (zh)
BR (1) BR112013004379A2 (zh)
CA (1) CA2808140A1 (zh)
WO (1) WO2012025780A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106011185A (zh) * 2016-06-27 2016-10-12 江南大学 一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3068887B1 (en) 2013-11-14 2019-10-30 Scarab Genomics LLC Bacteria with improved metabolic capacity
WO2017059236A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 Massachusetts Institute Of Technology Microbial production of renewable glycolate
US20190276859A1 (en) 2016-07-08 2019-09-12 Evonik Degussa Gmbh Method for the fermentative production of methionine or its hydroxy analog form by microorganisms comprising genes coding sugar phosphotransferase system (pts)
EP3354742A1 (en) 2017-01-26 2018-08-01 Metabolic Explorer Methods and microorganisms for the production of glycolic acid and/or glyoxylic acid
BR112020006001A2 (pt) 2017-10-02 2020-10-13 Metabolic Explorer método para produção de sais de ácido orgânico a partir de caldo de fermentação
WO2020163935A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Braskem S.A. Microorganisms and methods for the production of glycolic acid and glycine via reverse glyoxylate shunt
CN113122489B (zh) * 2020-01-15 2022-06-14 中国科学院微生物研究所 一种产乙醇酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5932439A (en) * 1995-11-13 1999-08-03 Monsanto Comapny Escherichia coli K-12 strains for production of recombinant proteins
CN101466841A (zh) * 2006-06-09 2009-06-24 代谢探索者公司 通过发酵从可再生资源产生乙醇酸

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US593243A (en) 1897-11-09 schneider
TR200002113T2 (tr) 1997-11-10 2001-01-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Lisofosfatidiletanolamin (18:1) ve lisofosfatidilinositolün yaşlanmayı geçiktirmek ve meyve olgunlaşmasını artırmak için kullanımı.
RU2282660C2 (ru) 2003-11-10 2006-08-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная фосфорибозилпирофосфатсинтетаза, фрагмент днк, бактерия рода escherichia - продуцент l-гистидина и способ продукции l-гистидина
CN102796769B (zh) 2004-12-22 2014-06-04 纳幕尔杜邦公司 乙醇酸的酶促生产
US7326546B2 (en) 2005-03-10 2008-02-05 Ajinomoto Co., Inc. Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance
JP2009165355A (ja) * 2006-04-28 2009-07-30 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
CN101437949B (zh) 2006-05-09 2012-08-22 三井化学株式会社 利用辅酶再生进行的羟基羧酸类的生产方法
CN101535489B (zh) 2006-05-09 2014-06-11 三井化学株式会社 利用辅酶合成强化进行的羟基羧酸类的生产方法
EP2027277B1 (en) 2006-06-09 2018-07-18 Metabolic Explorer Glycolic acid production by fermentation from renewable resources
EP2233562A1 (en) * 2009-03-24 2010-09-29 Metabolic Explorer Method for producing high amount of glycolic acid by fermentation

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5932439A (en) * 1995-11-13 1999-08-03 Monsanto Comapny Escherichia coli K-12 strains for production of recombinant proteins
CN101466841A (zh) * 2006-06-09 2009-06-24 代谢探索者公司 通过发酵从可再生资源产生乙醇酸

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIARNE HOVE JENSEN: "Cloning and characterization of the prs gene encoding phosphoribosylpyrophosphate synthetase of Escherichia coli", 《MOLECULAR AND GENERAL GENETICS》 *
BIRYUKOVA I V ET AL: "Construction of the new Escherichia coli K-12 MG 1655 novel strain with improved growth characteristics for application in metabolic engineering", 《RUSSIAN JOURNAL OF GENETICS》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106011185A (zh) * 2016-06-27 2016-10-12 江南大学 一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法
CN106011185B (zh) * 2016-06-27 2019-12-17 江南大学 一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2609208A1 (en) 2013-07-03
KR20130101030A (ko) 2013-09-12
CA2808140A1 (en) 2012-03-01
JP2013537429A (ja) 2013-10-03
US20130210097A1 (en) 2013-08-15
WO2012025780A1 (en) 2012-03-01
BR112013004379A2 (pt) 2016-05-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103189517A (zh) 用经修饰的微生物改善乙醇酸发酵产生
US10633676B2 (en) Reverse beta oxidation pathway
JP4613177B2 (ja) １，２−プロパンジオールの産生のための発展型微生物
CN103502435B (zh) 重组微生物及其用途
CN101466841B (zh) 通过发酵从可再生资源产生乙醇酸
Hao et al. Role of malic enzyme during fatty acid synthesis in the oleaginous fungus Mortierella alpina
ES2593084T3 (es) Procedimiento para la producción de una cantidad elevada de ácido glicólico mediante fermentación
US20120244588A1 (en) Method of producing 3-hydroxypropionic acid using malonic semialdehyde reducing pathway
AU2011373671B2 (en) Fermentation of glycerol to organic acids
KR20040071157A (ko) 단일 미생물에 의한 발효가능한 탄소원의1,3-프로판디올로의 생물전환
CN103097514B (zh) 一种用于从蔗糖制备1,3-丙二醇的方法
CN102203267A (zh) 2-羟基异丁酸(2-hiba)的酶法产生
US20220145336A1 (en) Means and methods for producing isobutene from acetyl-coa
AU2012214255A1 (en) Cells and methods for producing isobutyric acid
BR112021011629A2 (pt) Via de coprodução de derivados de 3-hp e acetil-coa a partir de malonato semialdeído
CN103221548A (zh) 诱导型启动子在乙醇酸的产生中的用途
CN103667163B (zh) 生产异丁醇的重组微生物及方法
Pérez-García et al. From brown seaweed to a sustainable microbial feedstock for the production of riboflavin
CN110869488A (zh) 增强型代谢物生产酵母
US8715977B2 (en) Ethanol production from ocean biomass
CN110234768A (zh) 用于产生乙醇酸和/或乙醛酸的方法和微生物
Skorokhodova et al. Effect of extra-and intracellular sources of CO 2 on anaerobic utilization of glucose by Escherichia coli strains deficient in carboxylation-independent fermentation pathways
Smirnova Energy-coupled isopropanol biosynthesis by engineered E. coli W from acetate
Seo Production of 1-butanol and butanol isomers by metabolically engineered Clostridium beijerinckii and Saccharomyces cerevisiae
JP2014161252A (ja) 組換え細胞

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20130703