KR101824282B1

KR101824282B1 - 글리콜산 생산에서의 유도성 프로모터의 용도

Info

Publication number: KR101824282B1
Application number: KR1020137000915A
Authority: KR
Inventors: 완다 디쉐르; 라이너 피게; 필립 수카일리
Original assignee: 메타볼릭 익스플로러
Priority date: 2010-06-15
Filing date: 2011-06-15
Publication date: 2018-01-31
Also published as: WO2011157728A8; CA2801823C; CN103221548B; JP5882310B2; US9121043B2; US20130089903A1; JP2013528390A; BR112012031965A2; KR20130114079A; EP2582828A1; WO2011157728A1; CN103221548A; EP2582828B1; BR112012031965A8; CA2801823A1

Abstract

본 발명은 발효에 의한 글리콜산 생산에서의 유도성 프로모터의 용도에 관한 것이다. 본 발명은
- 변형된 미생물을 탄소원을 포함하는 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계,
- 상기 미생물에서 표적 유전자의 발현을 외부 자극으로 조정하는 단계, 및
- 배양 배지로부터 글리콜산을 회수하는 단계
를 포함하고, 이때 상기 변형된 미생물에서, 글리콜산 생산에 관여하는 하나 이상의 유전자의 발현이, 상기 외부 자극으로 활성이 조정되는 이종성 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 것인, 발효 공정에서의 글리콜산 생산 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이러한 글리콜산 생산 방법에서 사용되는 변형된 미생물에 관한 것이다.

Description

글리콜산 생산에서의 유도성 프로모터의 용도{USE OF INDUCIBLE PROMOTERS IN THE PRODUCTION OF GLYCOLIC ACID}

발명의 분야

본 발명은 발효에 의한 글리콜산 생산에서의 유도성 프로모터의 용도에 관한 것이다. 유도성 프로모터의 이러한 용도는 더욱 안정적인 글리콜산 생산 균주에 이르게 한다.

발명의 배경

글리콜산 (HOCH₂COOH), 또는 글리콜레이트는 카르복실산의 알파-히드록시 산 패밀리의 가장 단순한 구성원이다. 글리콜산은 매우 작은 분자 상에 알콜 및 중등도 강산 관능기 양쪽 모두가 있어 이중 관능성을 갖는다. 이의 성질은 이를 우물 재건, 피혁 산업, 오일 및 가스 산업, 세탁 및 섬유 산업에서 사용하는 것 및 개인 관리 제품에서의 성분으로서 사용하는 것이 포함되는 광범위한 소비자 및 산업 용도에 이상적이게 한다.

글리콜산은 폴리글리콜산을 포함하는 열가소성 수지가 포함되는 다양한 중합체성 물질을 생산하는데 또한 사용될 수 있다. 폴리글리콜산을 포함하는 수지는 기체 장벽 성질이 우수하고, 폴리글리콜산을 포함하는 이같은 열가소성 수지는 동일한 성질을 갖는 포장재 (예를 들어, 음료수 용기 등)를 제조하는데 사용될 수 있다. 폴리에스테르 중합체는 수성 환경에서 제어가능한 속도로 점진적으로 가수분해된다. 이러한 성질은 이를 생체의학 용도 예컨대 용해성 봉합사 및 pH를 감소시키기 위해 산의 제어 방출이 필요한 용도에서 유용하게 한다. 현재, 미국에서 매년 15,000톤을 초과하는 글리콜산이 소비된다.

글리콜산은 사탕수수, 사탕무, 포도 및 과일에서 미량 성분으로서 천연적으로 발생하지만, 이는 주로 합성에 의해 생산된다. 글리콜산을 생산하는 기술이 문헌 또는 특허 출원에 기술되어 있다. 예를 들어, 미츠이 케미칼즈, 인크.(Mitsui Chemincals, Inc.)가 미생물을 사용하는 것에 의해 히드록실 기가 끝부분에 있는 지방족 다가 알콜로부터 상기 히드록시카르복실산을 생산하는 방법을 기술하였다 (EP 2 025 759 A1 및 EP 2 025 760 A1). 이러한 방법은 미키히코 카타오카(Michihiko Kataoka)가 에틸렌 글리콜-산화 미생물을 사용하는 글리콜산 생산에 관한 자신의 논문에서 기술한 것과 같은 생물전환(bioconversion)이다 (문헌 [Biosci. Biotechnol. Biochem., 2001]).

글리콜산은 듀폰 드 네모아 앤드 컴패니(Dupont de Nemours and Co)가 WO2006/069110 및 US 7,445,917에서 개시한 바와 같이 니트릴라제(nitrilase) 활성이 개선된 돌연변이체 니트릴라제를 사용하여 글리콜로니트릴로부터의 생물전환에 의해 또한 생산된다. 이러한 문헌들은 포름알데히드 및 시안화수소를 글리콜로니트릴의 합성을 위한 전구체로서 사용하고 글리콜로니트릴로부터의 글리콜산 합성을 위해 니트릴라제 활성이 있는 효소 촉매를 사용하는 공정을 교시한다. 이러한 공정의 주요 단점은 글리콜로니트릴이 미량의 산 또는 염기의 영향 하에, 화재 또는 폭발 위험이 있으면서, 격렬하게 중합될 수 있는 화학 물질이라는 것이다. 이러한 물질은 가열 시 분해되어, 시안화수소 및 산화질소가 포함되는 독성 연기를 생산한다. 따라서, 이는 극도로 위험한 물질로 열거된다.

박테리아 균주를 사용하여 당, 특히 재생 자원으로부터 발효에 의해 글리콜산을 생산하는 방법이 메타볼릭 익스플로러(Metabolic Explorer)로부터의 특허 출원 (WO 2007/141316 및 WO 2010/108909)에 개시되어 있다.

글리콜산의 생물학적 생산은 박테리아의 중심 대사로부터의 중간체의 형성을 필요로 한다 (도 1 참조). 크렙스 사이클(Krebs cycle)과 글리옥실레이트 측로(shunt)의 접합점에 위치하는 이소시트레이트가 이들 중 하나이다 (문헌 [Tricarboxylic acid cycle and glyoxylate bypass, Neidhardt, F. C. (Ed. in Chief), R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, and H. E. Umbarger (eds). 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. American Society for Microbiology]). 이소시트레이트는 (1) 숙시네이트 및 글리옥실레이트로 절단되거나 (aceA 유전자에 의해 코딩되는 이소시트레이트 리아제(lyase)에 의해 촉매되는 반응), 또는 (2) icd 유전자에 의해 코딩되는 이소시트레이트 데히드로게나제에 의해 α-케토글루타레이트로 전환된다. 특허 출원 EP 2 027 277에 기술된 기존의 연구는 icd 유전자의 발현이 약화된 균주에 의한 글리콜산의 양호한 생산을 나타냈다. TCA 사이클에서의 흐름을 감소시켜 이를 글리옥실레이트 측로 쪽으로 강요하는 것이 글리콜산 생산 수율을 유의하게 증가시켰지만, 동시에 이는 균주를 약하게 하였다.

icd 유전자의 발현이 약화된 균주는 여러 세대 동안 성장되었을 때 안정적이지 않았고, 이는 산업 용도에 대한 강력한 단점이다. 저자들은 유도성 프로모터를 사용하는 것에 의해 문제에 대한 해법을 발견하였다.

생명공학 프로세스에서의 유도성 프로모터의 사용은 산업적 생명공학의 기술 내에 있다. 일반적으로 이러한 프로모터들은 프로피오네이트 (WO2007005837), 아연 (WO2004020640), 아라비노스 (WO1998011231), 온도 (문헌 ['Microbial conversion of glycerol to 1,3-propanediol by an engineered strain of Escherichia coli', Tang X, Tan Y, Zhu H, Zhao K, Shen W. Appl Environ Microbiol. 2009 Mar; 75(6):1628-34]) 및 광이 예시되는 화학적 또는 물리적 자극에 응답한다.

효율적인 글리콜산 생산은 경로의 미세한 조정을 요구한다. 최대의 글리콜산 생산 및 생산자 균주의 개선된 안정성을 위해, 공정 동안 특정 주요 유전자의 발현을 조정할 수 있는 것이 이로울 수 있다. 예를 들어, icd 유전자의 발현은 바이오매스(biomass) 생산에 절대적으로 요구되지만, 글리콜산 생산에 대해서는 그렇지 않고, aceA에 대해서는 반대이다. 따라서, 유도성 프로모터의 사용이 산업적인 수준에서 글리콜산 생산의 전체적인 수율을 개선하는 것에서 흥미로울 수 있다.

이러한 시점에, 글리콜산 생산에 관여하는 유전자들의 발현을 제어하기 위한 유도성 프로모터의 사용이 고려 또는 보고된 적이 없었다.

본 발명자들은 글리콜산 생합성과 같은 복합적인 대사 경로에서 수반되는 유전자들의 유전자 발현을 조절하는데 사용될 때 이종성 유도성 프로모터가 이로울 수 있다는 것을 발견하였다.

발명의 개요

본 발명은

- 변형된 미생물을 탄소원을 포함하는 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계,

- 상기 미생물에서 표적 유전자의 발현을 외부 자극으로 조정하는 단계, 및

- 배양 배지로부터 글리콜산을 회수하는 단계

를 포함하고, 이때 상기 변형된 미생물에서, 글리콜산 생산에 관여하는 하나 이상의 유전자의 발현이, 상기 외부 자극으로 활성이 조정되는 이종성 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 것인, 발효 공정에서의 글리콜산 생산 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 글리콜산 생합성에서 수반되는 하나 이상의 유전자의 발현이 이종성 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 것인, 글리콜산 생산을 위해 변형된 미생물에 관한 것이다.

도면의 간단한 설명
도 1: 글리콜산 생합성 경로.

발명의 상세한 설명

본 발명은

변형된 미생물을 탄소원을 포함하는 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계,

상기 미생물에서 표적 유전자의 발현을 외부 자극으로 조정하는 단계, 및

배양 배지로부터 글리콜산을 회수하는 단계

용어 "글리콜산" 또는 "글리콜레이트"는 상호교환가능하게 사용되고, 의미가 동일하다. 이들은 화학식 HOCH₂COOH의 분자를 가리키고, 이는 카르복실산의 알파-히드록시산 패밀리의 가장 단순한 구성원이다.

본 발명에 따르면, 용어 "발효 공정", "발효" 또는 "배양"은 적합한 성장 배지에서의 박테리아의 성장을 나타내도록 상호교환가능하게 사용된다.

발효 공정에서의 글리콜산 생산 방법은 당업자에게 주지되어 있다. 탄소원의 선택과 같이, 발효 공정의 여러 요인들이 공정 최적화를 위해 조정될 수 있다.

"적합한 배양 배지"는 미생물의 배양 및 성장에 적합한 배지이다. 배양될 미생물에 따라, 이같은 배지는 미생물 발효 업계에 주지되어 있다. 적합한 배양 배지는 탄소원을 포함한다. 용어 "탄소원"은 미생물에 의해 대사될 수 있는 임의의 탄소원을 지칭하고, 이때 기질은 하나 이상의 탄소 원자를 함유한다. 탄소원은 글루코스, 수크로스, 모노사카라이드 (예컨대 프룩토스, 만노스, 크실로스, 아라비노스), 올리고사카라이드 (예컨대 갈락토스, 셀로비오스 ...), 폴리사카라이드 (예컨대 셀룰로스), 전분 또는 이의 유도체, 글리세롤, 및 글리옥실산이 생산되는 단일 탄소 기질로 이루어진 군에서 선택된다. 특히 바람직한 탄소원은 글루코스이다. 또 다른 바람직한 탄소원은 수크로스이다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 탄소원은 재생가능한 공급 원료(feed-stock)로부터 유래된다. 재생가능한 공급 원료는 원하는 생성물로의 변환을 허용하도록 짧은 지연으로, 그리고 충분한 양으로 재생될 수 있는, 특정한 산업 공정에 요구되는 원료로 정의된다.

발효는 하나 이상의 단순 탄소원 및 대사산물의 생산을 위한 필요에 따른 공동-기질을 함유하는, 사용되는 미생물에 대해 개조된 적합한 배양 배지가 있는 발효기에서 일반적으로 수행된다 (특허 출원 EP 09171297.6에 기술된 바와 같음).

당업자는 본 발명에 따른 미생물에 대한 배양 조건을 규정할 수 있다. 특히, 20℃ 내지 55℃, 우선적으로는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 박테리아를 발효시키고, 이. 콜라이(E. coli)에 대해서는 더욱 구체적으로는 약 30℃ 내지 37℃의 온도에서 발효시킨다.

이. 콜라이에 대한 공지된 배양 배지의 예로서, 배양 배지는 M9 배지 (문헌 [Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128]), M63 배지 (문헌 [Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]) 또는 문헌 [Schaefer et al., 1999, Anal. Biochem. 270: 88-96]에 의해 정의된 것과 같은 배지와 조성이 동일하거나 유사할 수 있다.

용어 "미생물"은 박테리아, 효모 또는 진균을 가리킨다. 박테리아는 그람 양성 박테리아 또는 그람 음성 박테리아로부터 선택된다. 우선적으로, 미생물은 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae)와 같은 그람 음성 박테리아에서, 또는 바실라세아에(Bacillaceae), 스트렙토미세타세아에(Streptomycetaceae) 및 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae)와 같은 그람 양성 박테리아에서 선택된다. 더욱 우선적으로, 미생물은 에스케리키아(Escherichia), 클레브시엘라(Klebsiella), 판토에아(Pantoea), 살모넬라(Salmonella) 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 종이다. 더욱 더 우선적으로, 미생물은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 종이다.

용어 "변형된 미생물"은 개선된 글리콜산 생산을 나타내는 유전적으로 변형된 미생물을 가리킨다. "개선된 글리콜산 생산"은 미생물에 의해 생산되는 글리콜산의 양, 특히 글리콜산 수율 (탄소원 당 생산된 글리콜산의 비)이 상응하는 변형되지 않은 미생물과 비교하여 변형된 미생물에서 더 높다는 것을 의미한다.

본 발명의 방법에서 사용되는 변형된 미생물은 2가지 특성이 있다:

- 미생물이 개선된 글리콜산 생산을 위해 변형됨, 및

- 글리콜산 생산에 관여하는 하나 이상의 유전자의 발현이 유도성 프로모터의 제어 (직접적인 제어 또는 간접적인 제어) 하에 있음.

"배양 배지로부터 글리콜산을 회수함"이라는 구절은 글리콜산을 회수하는 작용을 가리킨다. 글리콜산 회수는 박테리아 또는 배지 내의 글리콜레이트를 농축하고, 발효 배양물로부터의 최종 생성물 내에 부분적 또는 총량 (0-100％)으로 임의적으로 잔존하는 발효 브로스(broth) 및/또는 바이오매스로부터 글리콜산을 단리하는 단계에 의해 이루어진다. 임의적으로, 이러한 공정은 적어도 글리콜산 이량체로의 중합 단계를 통해 단계 (a)에서 생산된 글리콜산을 회수하는 단계, 및 (b) 글리콜산 이량체, 올리고머 및/또는 중합체로부터의 탈중합에 의해 글리콜산을 회수하는 단계를 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에 따르면, 회수 단계는 배양 배지 내에 존재하는 글리콜산의 유도체 및 전구체를 회수하는 것을 포함한다.

"표적 유전자의 발현을 조정함"이라는 구절은 유전자의 발현이 허용 또는 억제될 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 조정은 유도성 프로모터로 달성될 수 있다. 이러한 조정의 목적에 따라, 당업자는 어떤 종류의 유도성 시스템을 사용할지를 안다.

용어 "유도성 프로모터"는 외부 자극 시에 프로모터의 활성이 증가 또는 감소될 수 있는 프로모터를 나타낸다. 자극은 천연에서의 물리적 또는 화학적 자극, 예컨대 온도, 광, 화학물질 등일 수 있다.

표적 유전자의 유도는 자극의 직접적인 또는 간접적 전달을 통해 수득될 수 있다.

간접적인 전달은 유도성 프로모터의 제어 하에 있고 글리콜산 생합성에서 수반되는 표적 유전자의 발현을 구동시키는 특이적인 프로모터를 인식하는 이종성 RNA-폴리머라제를 사용하는 것에 의해 달성될 수 있다. 이러한 경우에, 유도성 프로모터는 표적 유전자의 프로모터에 직접적으로 연결되는 것이 아니라, 표적 유전자의 상기 프로모터를 전사하는 RNA 폴리머라제의 발현을 구동시킨다.

이러한 이종성 RNA 폴리머라제는, 예를 들어, T3 RNA 폴리머라제, T7 RNA 폴리머라제, 또는 당 분야의 전문가에게 공지되어 있는 기타 폴리머라제일 수 있다.

직접적인 전달은 한 표적 유전자의 발현이 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 때 달성된다.

"이종성 유도성 프로모터의 제어 하에 있는"이라는 구절은 유도성 프로모터가 유전자의 천연 프로모터가 아니고, 자신에게 작동가능하게 연결된 유전자의 발현 수준을, 적어도 부분적으로, 제어하는 방식으로 도입되었음을 가리킨다. 생물 인자 또는 비생물 인자의 존재 또는 부재에 의해 유도성 프로모터의 활성이 유도된다. 당업자의 필요에 따라, 유전자의 발현이 켜지거나 또는 꺼질 수 있다. 이러한 프로모터들은 화학적으로 조절될 수 있거나 (테트라사이클린, 호르몬 등의 존재 하에), 또는 물리적으로, 특히 열 또는 광에 의해, 조절될 수 있다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 글리콜산 생산에 관여하는 하나 이상의 유전자의 발현은 이종성 유도성 프로모터의 직접적인 제어 하에 있다.

이러한 유도성 프로모터는 물리적 자극에 의해 또는 화학적 자극에 의해 유도될 수 있다.

본 발명의 첫 번째 측면에서, 외부 자극은 온도 또는 광에서 선택되고, 즉, 유도성 프로모터가 온도-유도성 프로모터 또는 광-유도성 프로모터이다.

유도성 프로모터는 유리하게는 온도에 의해 유도되고, 하기에서 선택된다:

-

프로모터 PR 또는 상기 프로모터 PR의 유도체,

프로모터 PL 또는 상기 프로모터 PL의 유도체

와 같은, 파지 람다의 변형된 억제인자에 의해 조절되는 프로모터,

- 온도 민감성 Lac 억제인자에 의해 조절되는 변형된 lac 프로모터.

이러한 프로모터들에 대해, 참고문헌 목록은 하기와 같다:

문헌 [A genetic switch. Ptashne M. Blackwell Scientific, Cambridge, MA. 1986] ;

문헌 [A genetic switch: Phage lambda revisited. Ptashne M. Cold Spring Harbor Lab Press. Cold Spring Harbor, NY. 2004];

문헌 [The bacteriophages, Part II: Life of phages, 8. Gene regulatory circuitry of phage λ. Little J. 2^nd edition 2004. Richard Calendar.ed. Oxford University Press];

문헌 [Bukrinsky et al., Gene, 70 (1998) 415-417];

문헌 [Mandal & Lieb, 1976],

문헌 [Winstanley et al., 1989].

억제인자는 프로모터 영역 내의 특이적 결합 부위에 결합하는 것에 의해 RNA 폴리머라제가 프로모터에 접근하는 것을 제한하고 전사 개시 또는 신장을 감소시킴으로써 동족(cognate) 프로모터로부터의 발현을 억제한다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 파지 람다의 변형된 억제인자는 람다 억제인자 cI의 온도 불안정성(labile) 대립유전자이다. 유리하게는, 상기 억제인자는 람다 억제인자 대립유전자 cI857이다 (문헌 [On a thermosensitive repression system in the Escherichia coli lambda bacteriophage. Sussman R, Jacob F. C. R. Hebd. Seances Acad. Sci. 1962, 254, p1517]). 수스만(Sussman) 등은 32℃에서 배양될 때 용원성 상태이지만, 배양이 1시간 동안 40℃의 온도에서 유지될 때 이의 용해가 유도되는, 박테리오파지의 신규 돌연변이체를 보고하였다.

본 발명의 특정 측면에서, 글리콜산 생산을 위한 변형된 미생물에서, 단백질 RecAhas를 코딩하는 유전자 recA가 결실되었다. 단백질 RecA는 cI 상에서 프로테아제로서 작용하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, RecA를 코딩하는 유전자의 결실은 람다 억제인자 cI의 단백질분해를 배제한다.

온도-유도성 프로모터는 유리하게는 프로모터 PR 또는 유도체와 프로모터 PL 또는 유도체 사이에서 선택될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 온도-유도성 프로모터는 온도 민감성 Lac 억제인자에 의해 조절되는 변형된 lac 프로모터이다.

본 발명의 두 번째 측면에서, 외부 자극은 화학적 자극이고, 즉, 유도성 프로모터가 화학적으로 조절된다. 특히, 프로모터 활성의 유도가 탄소 이화대사물의 억제에서의 변화와 연관된다. 탄소 이화대사물 억제에 의해 활성화되는 프로모터는 낮은 글루코스 농도에서 또는 글루코스의 부재 하에 활성화제 "cAMP 억제인자 단백질" (CRP: cAMP Repressor Protein)을 통해 양성적으로 조절된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 특정 탄소원 또는 당 알콜의 존재에 의해 유도성 프로모터가 유도된다. 탄소원 또는 당 알콜에 의해 유도되는 프로모터의 예로는 아라비노스 또는 라피노스 프로모터, 및 만니톨 프로모터 또는 글루시톨 프로모터가 각각 포함된다.

유도 원리는 단백질 입체형태를 기초로 한다. 특정 자극 (물리적 또는 화학적 자극)에 의해 활성화되는 프로모터에 대해, 동족 억제인자는 이의 천연 형태 하에 활성이다. 특정 자극의 존재가 이러한 억제인자의 입체형태의 변화를 유도하고, 억제인자는 프로모터에 결합할 수 없게 되며, 따라서 유전자 전사를 활성화시킬 수 없게 된다. 역으로, 특정 자극에 의해 억제되는 프로모터에 대해, 동족 억제인자는 이의 천연 형태 하에 불활성이고, 특정 자극의 존재가 이의 입체형태의 변화를 유도하며, 이는 활성 형태의 억제인자에 이르고, 이는 유전자 전사를 억제할 수 있다.

당업자는 사용되는 유기체, 배양 조건, 및 표적 유전자의 발현을 조정하는 목적에 따라 물리적 또는 화학적 자극에 의해 활성화 또는 억제되는 유도성 프로모터를 선택할 수 있다.

본 발명의 특정 측면에 따르면, 관심 유전자 ('표적 유전자')의 발현은 "간접적인 전달"에 의해 조절되고, 즉, 글리콜산 생산에 관여하는 하나 이상의 유전자가 폴리머라제의 발현이 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 이종성 RNA 폴리머라제에 의해 전사된다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 이종성 RNA 폴리머라제는 T7, T3 폴리머라제로부터 선택된다.

본 발명에 따르면, '표적 유전자'는 글리콜산 생산에서 또는 이의 전구체의 생산에서 수반되는 하나 이상의 유전자이다. 표적 유전자는 이종성 유도성 프로모터의 제어 (간접적 또는 직접적인 제어) 하에 있다; 앞서 설명된 바와 같이, 유전자가 유도성 프로모터의 직접적인 제어 하에 있거나, 또는 유전자가 유도성 RNA 폴리머라제에 의해 전사되거나, 또는 양쪽 모두의 조합이다.

미생물에서의 글리콜산 생산에 관여하는 유전자들이 당업계에 공지되어 있고, 글리콜산 특이적 생합성 경로에 관여하는 유전자, 뿐만 아니라 전구체-제공 경로에서 수반되는 유전자 및 글리콜산 소비 경로에서 수반되는 유전자를 포함한다.

효율적인 글리콜산 생산은 글리콜산 특이적 경로 및 여러 전구체-제공 경로의 최적화를 필요로 한다. 글리콜산 생산 균주들이 특허 출원 EP 2 027 227 및 WO 2010/108909에 기술되어 있고, 이들은 본 출원에 참고로 포함된다.

특히, 상기 글리콜산 생산 균주는 하기의 변형 중 하나 이상을 포함한다:

- 글리옥실레이트가 글리콜레이트 이외의 생성물로 전환되는 것의 약화 (aceB, glcB, gcl , eda의 약화)

- 실질적으로 글리콜레이트를 대사할 수 없음 (glcDEFG, aldA의 약화)

- 글리옥실레이트 경로 흐름의 증가 (icd, aceK, pta, ackA, poxB, iclR 또는 fadR의 약화, 및/또는 aceA의 과발현)

- 글리옥실레이트가 글리콜레이트로 전환되는 것의 증가 (ycdW의 과발현)

- NADPH의 입수가능성의 증가 (pgi, udhA, edd의 약화).

상기 글리콜산 생산 균주는 하기의 변형 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다:

- 유전자 ldhA 및 mgsA의 약화

- 유전자 arcA의 약화

- 유전자 glcA, lldP, 및 yjcG 중 하나 이상의 약화.

본 발명에 따르면, 글리콜산 생산을 위해 이미 변형된 균주에서 글리콜산 생산을 증가시키기 위해, 글리콜산 생산에 관여하는 하기 유전자 중 하나 이상이 프로모터의 활성이 외부 자극으로 조정되는 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다:

a) TCA 사이클과 글리옥실레이트 측로의 교차로에서 수반되는 효소를 코딩하는 유전자:

b) 글리콜산 생합성에서 직접적으로 수반되는 효소를 코딩하는 유전자:

c) 보조인자 NADPH의 생산 및 세포의 산화환원 상태의 조절에서 직접적으로 또는 간접적으로 수반되는 효소를 코딩하는 유전자:

d) 보전 경로에서 수반되는 유전자:

e) 아세테이트 대사에서 수반되는 효소를 코딩하는 유전자:

f) 막을 통한 글리콜레이트 수송에서 수반되는 효소를 코딩하는 유전자:

g) 부산물로서의 락테이트의 생산에서 수반되는 효소를 코딩하는 유전자:

본 발명에 따르면, 언급된 상기 유전자들 중 2개 이상의 유전자 및 이러한 유전자들의 임의의 조합이 글리콜산 생산을 증가시키기 위해 유도성 프로모터의 제어 하에 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 유전자 icd의 발현이 직접적으로 또는 간접적으로 이종성 유도성 프로모터의 제어 하에 있다.

이소시트레이트 데히드로게나제 효소는 TCA 사이클에 속하고, 이소시트레이트가 α-케토글루타레이트로 변환되는 것을 촉매한다. 이소시트레이트는 바이오매스에 이르는 TCA 사이클과 글리콜산에 이르는 글리옥실릭 측로의 접합점에 있기 때문에, 이러한 경로들에서의 이의 분배는 글리콜산의 생산에 막대한 영향을 미친다.

특정 실시양태에서, 유전자 icd는 37℃ 내지 42℃에서 icd 유전자의 발현을 허용하고 28℃ 내지 32℃에서 icd 유전자의 발현을 억제하는 유도성 프로모터의 제어 하에 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 변형된 미생물은 37℃ 내지 42℃ (icd가 발현되는 조건)에서는 바이오매스를 생산하도록 성장되고, 28℃ 내지 30℃ (icd가 억제되는 조건)에서는 글리콜산을 생산하도록 성장된다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 배양 배지 내의 생산된 글리콜산을 회수하는 단계는 배양 배지 내에 존재하는 글리콜산의 유도체 및 전구체를 회수하는 것을 포함한다. 글리콜산의 "유도체 또는 전구체"는 글리콜산 형성 및 분해의 대사 경로 내의 모든 중간체 화합물을 가리킨다. 글리콜산의 전구체는 특히 시트레이트, 이소시트레이트, 글리옥실레이트이고, 일반적으로는 글리옥실레이트 사이클의 모든 화합물이다. 글리콜산의 유도체는 특히 글리콜레이트 에스테르 예컨대 에틸 글리콜레이트 에스테르, 메틸 글리콜레이트 에스테르, 및 글리콜레이트를 함유하는 중합체 예컨대 폴리글리콜산이다.

유도성 프로모터에 의해 제어되는 유전자는 염색체 상의 이의 천연 위치에 있을 수 있거나, 또는 비-천연 위치에서 통합될 수 있다. 유도성 프로모터에 의해 제어되는 유전자의 1번 또는 여러 번의 통합이 최적의 글리콜산 생산에 요구될 수 있다. 유사하게, 조절 인자 유전자의 카피(copy) 하나 또는 여러 개가 최적의 발현에 요구될 수 있다. 상이한 비의 억제인자 유전자 카피 및 프로모터가 발현을 미세-조정하는데 사용될 수 있다.

유도성 프로모터의 제어 하의 유전자는, 우선적으로, 유전자좌의 변형이 글리콜산 생산에 대한 음성적인 영향이 없는 유전자좌 내로 통합되어야 한다. 하기는 유전자가 통합될 수 있는 유전자좌의 예이다:

본 발명은 글리콜산 생산에 관여하는 하나 이상의 유전자의 발현이 상기 정의된 바와 같은 이종성 유도성 프로모터의 제어 (직접적 또는 간접적인 제어) 하에 있는, 개선된 글리콜산 생산을 위해 변형된 미생물에 또한 관련된다.

여러 변형, 특히 하기의 대사 변화를 허용하는 변형이 상기 미생물에 사전에 도입되었다:

i) 말레이트 신타제 (aceB 및 glcB), 글리옥실레이트 카르보리가제(carboligase) (gcl) 및 2-케토-3-데옥시글루코네이트 6-포스페이트 알돌라제(aldolase) (eda)를 코딩하는 유전자들을 불활성화시키는 것에 의해, 미생물이 글리옥실레이트를 글리콜레이트 이외의 다른 화합물로 대사할 수 없음,

ii) glcDEF 및 aldA 유전자를 약화시키는 것에 의해 미생물이 글리콜레이트를 대사할 수 없음,

iii) icd, acek, pta, ack, poxB, iclR 또는 fadR의 약화에 의해, 및/또는 aceA의 과발현에 의해 글리옥실레이트 경로 흐름이 증가됨,

iv) ycdW와 같은 내인성 코딩 유전자를 과발현시키는 것에 의해 글리옥실레이트가 글리콜레이트로 전환되는 것이 증가됨,

v) pgi, udhA 및 edd 유전자의 발현을 약화시키는 것에 의해 NADPH의 입수가능성이 증가됨.

본원에 참고로 포함된 특허 출원 EP 2 027 227 및 WO 2010/108909에서 변형들이 기술되었다.

본 발명의 설명에서, 유전자 및 단백질은 이. 콜라이에서의 상응하는 유전자의 명칭을 사용하여 확인된다. 그러나, 달리 명시되지 않는 한, 이러한 명칭의 사용은 본 발명에 따라 더욱 일반적인 의미를 지니고, 다른 생물, 더욱 특히 미생물에서의 모든 상응하는 유전자 및 단백질을 포괄한다.

공지된 유전자에 대해 진뱅크(GenBank)에서 제공되는 레퍼런스를 사용하여, 당업자는 다른 생물, 박테리아 균주, 효모, 진균, 포유동물, 식물 등에서의 등가의 유전자를 결정할 수 있다. 다른 미생물들로부터 유래된 유전자들과의 서열 정렬을 수행함으로써 결정될 수 있는 컨센서스(consensus) 서열을 사용하여, 그리고 또 다른 생물 내의 상응하는 유전자를 클로닝하기 위해 축퇴성 프로브를 디자인하여, 이러한 일상적인 작업이 유리하게 수행된다. 분자 생물학의 이러한 일상적인 방법이 당업자에게 주지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. 1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York]에서 주장된다.

PFAM (정렬 및 은닉 마르코프(hidden Markov) 모델의 단백질 패밀리 데이터베이스; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)은 단백질 서열 정렬의 대형 선집을 나타낸다. 각각의 PFAM은 다중 정렬을 가시화하는 것, 단백질 도메인을 확인하는 것, 생물들에서 분포를 평가하는 것, 다른 데이터베이스에 접근하는 것 및 공지된 단백질 구조를 가시화하는 것을 가능하게 한다.

주요 계통발생학적 계통을 나타내는 완전히 서열분석된 게놈들로부터의 단백질 서열들을 비교함으로써 COG (오르토로그성(orthologous) 단백질 군의 클러스터; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)가 수득된다. 각각의 COG는 3개 이상의 계통으로부터 정의되고, 이는 이전의 보존된 도메인의 확인을 허용한다.

상동성 서열 및 이들의 백분율 상동성을 확인하는 수단이 당업자에게 주지되어 있고, 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/로부터 이러한 웹사이트에 지시된 디폴트 파라미터와 함께 사용될 수 있는 BLAST 프로그램이 특히 이에 포함된다. 그 후, 예를 들어, 프로그램 CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) 또는 MULTALIN (http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html)을 이러한 웹사이트들에 지시된 디폴트 파라미터와 함께 사용하여, 수득된 서열을 활용 (예를 들어, 정렬)할 수 있다.

본 발명의 특정 측면에서, 글리콜산을 생산하도록 사전에 유전적으로 변형된 미생물은 icd, aceA, ycdW, pgi, pntAB, udhA, arcA, maeA, maeB, mdh, pck, ppc, ackA, pta, poxB, lldP, glcA, yjcG, ldhA 및 mgsA에서 선택된, 유전자의 발현이 이종성 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 하나 이상의 유전자를 함유한다. 더욱 바람직하게는, 이종성 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 유전자는 icd이다.

본 발명의 바람직한 측면에서, 변형된 미생물에서, 유도성 프로모터의 사용은 37℃ 내지 42℃에서는 icd 유전자의 발현을 허용하고, 28℃ 내지 32℃에서는 icd 유전자의 발현을 억제한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 미생물은 30세대 후 초기 생산의 50％ 이상, 우선적으로는 30세대 후 초기 생산의 70％ 이상, 가장 바람직하게는 30세대 후 초기 생산의 90％ 이상의 글리콜산 생산을 나타낸다.

상기 미생물은 산업 규모에서 여러 세대에 대해 발효 배양 동안 더욱 더 안정적인 글리콜산 생산을 나타낸다.

당업자는 발효 공정에서 특정 미생물에 대해 세대 횟수를 결정할 수 있다. 박테리아 집단은 세대 마다 배가된다. 배양물 내의 세포의 개수를 결정하기 위해, 당업자는 이. 콜라이에 대해 하기의 식을 사용한다; 0.4 OD 단위 = 2.10⁸개의 세포/㎖ (OD 단위는 광학 밀도 단위 또는 흡광도를 의미한다).

실시예

하기 실시예에 기술된 글리콜산을 생산하는 균주를 만드는데 사용된 일반적인 프로토콜

프로토콜 1: 재조합을 위한 PCR 산물의 도입 및 재조합체의 선별 (FRT 시스템)

유전자 또는 유전자간 영역의 교체를 위해 표 1에서 제공되고 선택된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 플라스미드 pKD3으로부터의 클로람페니콜 저항성 카세트 또는 플라스미드 pKD4로부터의 카나마이신 저항성 카세트를 증폭시켰다 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000)]). 그 후, 수득된 PCR 산물을 전기천공에 의해 플라스미드 pKD46을 보유하는 수용자 균주 내로 도입하였고, 이때 발현된 시스템 λ 레드(Red) (γ, β, 엑소(exo))는 상동성 재조합에 매우 유리하다. 그 후, 항생제-저항성 형질전환체를 선별하였고, 저항성 카세트의 삽입을 표 2에서 제공된 적합한 올리고뉴클레오티드로 PCR 분석에 의해 점검하였다.

프로토콜 2: 유전자 결실을 위한 파지 P1으로의 형질도입

하나의 이. 콜라이 균주로부터 또 다른 이. 콜라이 균주로의 DNA 전달을 파지 P1으로의 형질도입 기술에 의해 수행하였다. 이러한 프로토콜은 2개의 단계였다: (i) 단일 유전자가 변형된 공여자 균주 상에서의 파지 용해물의 제조 및 (ii) 이러한 파지 용해물에 의한 수용자 균주의 형질도입.

파지 용해물의 제조

- 단일 유전자가 변형된 균주 MG1655를 밤새 배양한 배양물 100 ㎕를 10 ㎖의 LB + Cm 50 ㎍/㎖ / Km 50 ㎍/㎖ + 글루코스 0.2％ + CaCl₂ 5 mM에 시딩(seeding)함.

- 진탕하면서 30분 동안 37℃에서 인큐베이션함.

- 제조된 파지 용해물 P1 100 ㎕를 공여자 균주 MG1655 상에 첨가함 (약 1 × 10⁹개의 파지/㎖).

- 모든 세포가 용해될 때까지 3시간 동안 37℃에서 진탕함.

- 클로로포름 200 ㎕를 첨가하고, 와동시킴.

- 10분 동안 4500 g에서 원심분리하여 세포 잔해물을 제거함.

- 상청액을 멸균 튜브로 옮기고, 클로로포름 200 ㎕를 첨가함.

- 용해물을 4℃에서 보관함.

형질도입

- LB 배지 내에서 이. 콜라이 수용자 균주를 밤새 배양한 배양물 5 ㎖를 10분 동안 1500 g에서 원심분리함.

- 세포 펠릿을 2.5 ㎖의 MgSO₄ 10 mM, CaCl₂ 5 mM에 현탁시킴.

- 대조군 튜브: 세포 100 ㎕

단일 유전자가 변형된 균주 MG1655의 파지 P1 100 ㎕

- 시험 튜브: 세포 100 ㎕ + 단일 유전자가 변형된 균주 MG1655의 파지 P1 100 ㎕

- 진탕하지 않으면서 30분 동안 30℃에서 인큐베이션함.

- 각각의 튜브에 1 M 시트르산나트륨 100 ㎕를 첨가하고, 와동시킴.

- LB 1 ㎖를 첨가함.

- 진탕하면서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션함.

- 튜브를 3분 동안 7000 rpm에서 원심분리한 후, LB + Cm 30 ㎍/㎖ / Km 50 ㎍/㎖ 접시 상에 플레이팅함

- 37℃에서 밤새 인큐베이션함.

그 후, 항생제-저항성 형질전환체를 선별하고, 결실 삽입을 표 2에서 제공된 적합한 올리고뉴클레오티드로 PCR 분석에 의해 점검하였다.

프로토콜 3: 재조합을 위한 PCR 산물의 도입 및 재조합체의 선별 (Cre-LOX 시스템)

유전자 또는 유전자간 영역의 교체를 위해 표 1에서 제공되고 선택된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 플라스미드 loxP-cm-loxP (진 브릿지즈(Gene Bridges))로부터의 클로람페니콜 저항성 카세트 또는 플라스미드 loxP-PGK-gb2-neo-loxP (진 브릿지즈)로부터의 네오마이신 저항성 카세트를 증폭시켰다. 그 후, 수득된 PCR 산물을 전기천공에 의해 플라스미드 pKD46을 보유하는 수용자 균주 내로 도입하였고, 이때 발현된 시스템 λ 레드 (γ, β, 엑소)는 상동성 재조합에 매우 유리하다. 그 후, 항생제-저항성 형질전환체를 선별하였고, 저항성 카세트의 삽입을 표 2에서 제공된 적합한 올리고뉴클레오티드로 PCR 분석에 의해 점검하였다.

[표 1]

[표 2]

실시예 1

발효에 의해 글리콜산을 생산하기 위한 열-유도성 균주의 구축:

균주 이. 콜라이 MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd :: Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB Δa l dA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)를 특허 출원 WO 2010/108909에서 제공된 설명에 따라 만들었다.

1. 균주 MG1655 Δ uxa CA :: RN / TT adcca - cI857 - PR / RBS01 *2- icd - TT02 :: Km 의 구축

uxaCA 영역을 TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02 단편으로 교체하기 위해, 본 발명자들은 문헌 [Datsenko & Wanner (2000)]에 기술되어 있고 프로토콜 1에 상술된 상동성 재조합 전략을 사용하였다. 이러한 전략은 관련 영역 대부분을 결실시키면서 카나마이신 저항성 카세트 및 추가적인 DNA의 삽입을 허용한다.

하기 상술된 바와 같이 이러한 목적을 위해 플라스미드 pUC18-DuxaCA-RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02를 만들었다.

단편 TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02를 PCR에 의해 합성하였고, 벡터 pUC18-DuxaCA-SMC-Km (다중 클로닝 부위용 SMC) 내로 클로닝하였다.

- 플라스미드 pUC18-DuxaCA-SMC-Km을 만들기 위해, DuxaCA-SMC-Km 단편을 주형으로서의 MG1655 DuxaCA-SMC-Km 게놈 DNA 상에서 PCR에 의해 수득하였고, pUC18 (문헌 [Norrander et al., 1983, Gene 26, 101-106]) 내로 클로닝하였다.

- 균주 MG1655 DuxaCA-SMC-Km의 구축:

uxaCA 영역을 SMC-Km으로 교체하기 위해, 본 발명자들은 상동성 재조합 기술 및 표 1에서 제공된 올리고뉴클레오티드 Ome 1506-D uxaCA-SMC F 및 Ome 1507-D uxaCA-SMC R (서열 1 및 2)로 합성된 PCR 산물을 사용하였다.

Ome 1506-D uxaCA-SMC F (서열 1)

(상기 서열에서,

- 이탤릭체 대문자는 영역 uxaCA (웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)의 서열 (3242797 - 3242724)에 대해 상동성인 영역이고,

- 밑줄친 대문자는 T7 파지로부터의 T7Te 전사 종결인자 서열 (문헌 [Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24])에 대한 영역이며,

- 대문자는 카나마이신 저항성 카세트 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645] 내의 참조 서열)의 증폭에 대한 영역이다),

Ome 1507-D uxaCA-SMC R (서열 2)

(상기 서열에서,

- 이탤릭체 대문자는 영역 uxaCA (웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)의 서열 (3239830 - 3239879)에 대해 상동성인 영역이고,

- 밑줄친 대문자는 ApaI, BstZ17I, SacII, XhoI, AvaI, BamHI, SmaI, KpnI, SacI, EcoRI 제한 부위를 보유하는 SMC에 대한 영역이며,

- 대문자는 카나마이신 저항성 카세트 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645] 내의 참조 서열)의 증폭에 대한 영역이다).

생성된 PCR 산물을 전기천공에 의해 균주 MG1655 (pKD46) 내로 도입하였다. 그 후, 카나마이신-저항성 형질전환체를 선별하였고, 항생제 카세트의 삽입을 표 2에 제시된 올리고뉴클레오티드 Ome 1612-uxaCA_R3 및 Ome 1774-DuxaCA_F (서열 15 및 16)를 이용하여 PCR 분석에 의해 점검하였다. 선별된 클론을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 최종 균주를 MG1655 DuxaCA-SMC-Km으로 명명하였다.

- 플라스미드 pUC18-DuxaCA-SMC-Km의 구축:

DuxaCA-SMC-Km 영역을 주형으로서의 균주 MG1655 DuxaCA-SMC-Km의 게놈 DNA 및 표 1에 제시된 올리고뉴클레오티드 Ome 1515-uxaCA R2 및 Ome 1516-uxaCA F2 (서열 3 및 4)로부터 PCR에 의해 증폭시켰다:

Ome 1515-uxaCA R2 (서열 3)

(uxaCA의 하류 영역 (3239021에서 3239044까지)에 대해 상동성임),

Ome 1516-uxaCA F2 (서열 4)

(상기 서열에서,

- 대문자는 여분의 염기가 있는 영역이고,

- 밑줄친 대문자는 EcoRV 제한 부위를 보유하는 영역이며,

- 이탤릭체 대문자는 uxaCA의 상류 영역 (3243425에서 3243402까지)에 대해 상동성인 영역이다).

그 후, PCR 산물 (평활(blunt)-말단 DNA 폴리머라제로 수득됨)을 제한 효소 EcoRV로 절단하고, pUC18의 SmaI 부위 내로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 서열분석에 의해 점검하고, pUC18-DuxaCA-SMC-Km으로 명명하였다.

- 플라스미드 pUC18-TTadcca - cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02의 구축을 위해, 단편 TTadcca - cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02를 PCR에 의해 합성하고, 상기 기술된 플라스미드 pUC18-DuxaCA-SMC-Km 내로 클로닝하였다.

첫 번째 단계에서, TTadcca - cI857-PR/RBS01*2 영역을 주형으로서의 pFC1 벡터 (문헌 [Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pp 145-148]) 및 표 1에 열거된 올리고뉴클레오티드 TTadcca - cI857 - icd F 및 PR/RBS01*2-icd-TT02 R (서열 5 및 6)로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 두 번째 단계에서, 단편 icd-TT02를 MG1655 게놈 DNA로부터 올리고뉴클레오티드 PR/RBS01*2-icd-TT02 F 및 TT02-icd R (서열 7 및 8)을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 세 번째 단계에서, TTadcca - cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02 영역을 주형으로서의 TTadcca - cI857-PR/RBS01*2 및 icd-TT02 PCR 산물의 혼합물 및 올리고뉴클레오티드 TTadcca - cI857 - icd F 및 TT02-icd R (서열 5 및 8)을 사용하여 PCR에 의해 합성하였다. 이러한 최종 PCR 산물을 pSCB 벡터 (스트라타진(Stratagene)) 내로 클로닝하고, 생성된 플라스미드를 서열분석에 의해 확인하고, pSCB-TTadcca - cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02로 명명하였다.

TTadcca-cI857-icd F (서열 5)

(상기 서열에서,

- 대문자는 여분의 염기가 있는 영역이고,

- 밑줄친 대문자는 ApaI 및 BstZ17I 제한 부위를 보유하는 영역이며,

- 이탤릭체 대문자는 TTadcca 전사 종결인자 서열 (pSOL1 메가플라스미드의 179847에서 179807까지에 대해 상동성인, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)으로부터의 adc 유전자의 전자 종결인자)에 대한 영역이고,

- 볼드체 대문자는 cI857 유전자의 3' 끝부분에 대해 상동성인 영역이다).

PR/RBS01*2-icd-TT02 R (서열 6)

(상기 서열에서,

- 대문자는 icd 유전자의 5' 끝부분 (1194378에서 1194346까지)에 대해 상동성인 영역이고,

- 밑줄친 대문자는, PsiI 제한 부위가 생성되도록 RBS01*2 버전의 RBS를 수득하기 위한 5개의 염기 (밑줄친 이탤릭체 대문자)를 제외하고는, 람다 박테리오파지 P_R 프로모터에 대해 상동성인 영역이다).

PR/RBS01*2-icd-TT02 F (서열 7)

(상기 서열에서,

- 대문자는 icd 유전자의 5' 끝부분 (1194346에서 1194378까지)에 대해 상동성인 영역이고,

TT02-icd R (서열 8)

(상기 서열에서,

- 대문자는 여분의 염기가 있는 영역이고,

- 이탤릭체 대문자는 EcoRV 제한 부위를 보유하는 영역이며,

- 밑줄친 대문자는 이. 콜라이의 rrnB 유전자의 전사 종결인자 T₁ (문헌 [Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9])에 상응하는 TT02 전사 종결인자 서열에 대해 상동성인 영역이며,

- 볼드체 대문자는 icd 유전자의 3' 끝부분 (1195596에서 1195570까지)에 대해 상동성인 영역이다).

- TTadcca - cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02 단편을 벡터 pUC18-DuxaCA-SMC-Km 상에 전달하기 위해, 플라스미드 pSCB-TTadcca - cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02를 제한 효소 ApaI 및 EcoRV로 제한하고, 생성된 TTadcca - cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02 단편을 벡터 pUC18-DuxaCA-SMC-Km의 ApaI/SmaI 부위 내로 클로닝하여, 벡터 pUC18-DuxaCA-RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02::Km을 산출하였다.

마지막으로, 상동성 재조합에 의해 uxaCA 영역을 TTadcca - cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02::Km으로 교체하기 위해, 플라스미드 pUC18-DuxaCA-RN/TTadcca - cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02::Km을 MluI 및 NruI로 제한하고, DNA 단편 DuxaCA-RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02::Km을 전기천공에 의해 균주 MG1655 (pKD46) 내로 도입하였다. 그 후, 카나마이신-저항성 형질전환체를 선별하고, 염색체 내로의 DuxaCA-RN/TTadcca - cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02::Km의 삽입을 올리고뉴클레오티드 Ome 1612-uxaCA_R3 및 Ome 1774- DuxaCA_F (서열 15 및 16)로 PCR 분석에 의해 점검하였다. 이러한 균주를 MG1655 DuxaCA-RN/TTadcca - cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02::Km으로 명명하였다.

2. 균주 MG1655 Ptrc50 / RBSB / TTG - icd :: Cm Δ uxaCA :: RN / TTadcca - cI857 - PR / RBS01 *2-icd-TT02::Km Δ aceB Δ gcl Δ glcDEFGB Δ aldA Δ iclR Δ edd + eda Δ poxB Δ ackA + pta ( pME101 - ycdW - TT07 - PaceA - aceA - TT01 )의 구축

MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB Δa l dA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01) 균주에서 uxaCA 영역을 TTadcca - cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02::Km으로 교체하기 위해, 구축물 ΔuxaCA::RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02::Km을 P1 파지 형질도입 (프로토콜 2 참조)에 의해 균주 MG1655 ΔuxaCA::RN/TTadcca - cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02::Km으로부터 균주 MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA Δi c lR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta 내로 전달하였다. 항생제 저항성 형질전환체를 선별하고, 염색체 상의 ΔuxaCA :: RN/TTadcca - cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02::Km의 삽입을 올리고뉴클레오티드 Ome 1612- uxaCA_R3 (서열 15) 및 Ome 1774- DuxaCA_F (서열 16)로 PCR 분석에 의해 점검하였다. 생성된 균주를 MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔuxaCA::RN/TTadcca - cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02::Km ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta로 명명하였다.

마지막으로 플라스미드 pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01 (이전에 특허 출원 EP 09155971,6 및 US 61162,712에서 기술됨)을 전기천공에 의해 도입하여, AG1385로 명명된 MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔuxaCA::RN/TTadcca - cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02::Km ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)을 산출하였다.

실시예 2

균주 이. 콜라이 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda Δp o xB ΔackA+pta (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)를 특허 출원 EP 09155971,6 및 US 61162,712에서 제공된 설명에 따라 만들었다.

1. 균주 MG1655 TT adcca - cI857 - PR01 / RBS01 *2- icd :: Km 의 구축

천연 icd 프로모터를 균주 이. 콜라이 MG1655에서 DNA 단편 TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2::Km으로 교체하였다. 천연 icd 프로모터를 TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2 DNA 단편으로 교체하기 위해, 본 발명자들은 문헌 [Datsenko & Wanner (2000)]에 기술된 상동성 재조합 전략을 사용하였다. 프로토콜 1에 기술된 기술에 따라 구축을 수행하였다.

MG1655 TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2-icd::Km 균주를 구축하기 위해, 유전자 cI857, 프로모터 PR01 및 카나마이신 카세트 (Km)를 MG1655 ΔuxaCA::RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02::Km 게놈 DNA 상에서 표 1에 기술된 올리고뉴클레오티드 (서열 9, 10, 11 및 12)로 PCR에 의해 증폭시켰다.

ymfC-TT07 F (서열 9)

(상기 서열에서,

- 대문자는 ymfC 유전자의 5' 끝부분(1194125에서 1194175까지)에 대해 상동성인 영역이고,

- 밑줄친 대문자는 T7 파지로부터의 T7Te 전사 종결인자 서열 (문헌 [Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. 2001, PNAS Apr 24;98(9):5019-24])에 대한 영역이며,

- 볼드체 대문자는 카나마이신 저항성 카세트 (문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645] 내의 참조 서열)의 증폭에 대한 영역이다),

PR01 - R (서열 10)

(- PR01 돌연변이체 버전의 P_R 프로모터를 수득하기 위한 1개의 염기 (볼드체 대문자)를 제외하고는, 람다 박테리오파지 P_R 프로모터에 대해 상동성임),

PR01 - F (서열 11)

icd - R (서열 12)

(- icd 유전자 (1194434에서 1194399까지)에 대해 상동성임).

- 먼저 PCR 단편 TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2-icd::Km을 전기천공에 의해 균주 MG1655 (pKD46) 내로 도입하여 균주 MG1655 TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2-icd::Km을 제공하였다. 카나마이신 저항성 형질전환체를 선별하였다. TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2-icd::Km 단편의 삽입을 표 2에 열거된 올리고뉴클레오티드 Ome 704 seq Ptrc-icd F 및 Ome 705 seq Ptrc-icd R (서열 17 및 18)로 PCR 분석에 의해 점검한 후, 서열분석에 의해 확인하였다. 생성된 균주를 MG1655 TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2-icd::Km으로 명명하였다.

2. 균주 MG1655 TTadcca / CI857 / PR01 / RBS01 *2- icd :: Km Δ aceB Δ gcl Δ glcDEFGB ΔaldA Δ iclR Δ edd + eda Δ poxB Δ ackA + pta Δ aceK :: Cm ( pME101 - ycd W - TT07 - P ace A - ace A-TT01 )의 구축

구축물 TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2-icd::Km을 형질도입 (프로토콜 2 참조)에 의해 공여자 균주 MG1655 TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2-icd::Km으로부터 수용자 균주인 MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta 균주로 전달하였다. 그 후, 카나마이신-저항성 형질전환체를 선별하고, TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2-icd-TT02::Km 영역의 삽입을 올리고뉴클레오티드 Ome 704 seq Ptrc-icd F (서열 17) 및 Ome 705 seq Ptrc-icd R (서열 18)로 PCR 분석에 의해 점검하였다. 이러한 균주를 MG1655 TTadcca - cI857-PR01/RBS01*2-icd-TT02::Km ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta로 명명하였다.

표 1에 기술된 올리고뉴클레오티드 Ome 0205-DaceBAKR 및 Ome 0700-DaceK F (서열 13 및 14)를 사용하여 상기 기술된 바와 같은 상동성 재조합에 의해 균주 이. 콜라이 MG1655 TTadcca - cI857-PR01/RBS01*2-icd-TT02::Km ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB Δa l dA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta (pKD46)에서 유전자 aceK를 결실시켰다 (프로토콜 3 참조).

(상기 서열에서,

- 대문자는 유전자 aceK (웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)의 서열 (4216621-4216702)에 대해 상동성인 영역이고,

- 밑줄친 대문자는 클로람페니콜 저항성 카세트 (참조 서열 진 브릿지즈)의 증폭에 대한 영역이다),

(상기 서열에서,

- 대문자는 유전자 aceK (웹사이트 http://ecogene.org/ 상의 참조 서열)의 서열 (4218298-4218220)에 대해 상동성인 영역이고,

- 밑줄친 대문자는 클로람페니콜 저항성 카세트 (참조 서열 진 브릿지즈)의 증폭에 대한 영역이다).

그 후, 클로람페니콜 및 카나마이신 저항성 형질전환체를 선별하고, 표 2에 열거된 올리고뉴클레오티드 Ome 0169-BAK F 및 Ome 0701-aceK F (서열 19 및 20)로 PCR 분석에 의해 확인하였다. 마지막 단계에서, 플라스미드 pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01을 균주 MG1655 TTadcca - cI857-PR01/RBS01*2-icd-TT02::Km ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔaceK::Cm 내로 도입하였다. 최종 균주 MG1655 TTadcca - cI857-PR01/RBS01*2-icd-TT02::Km ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔaceK::Cm (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)을 AG1413으로 명명하였다.

생산자 균주의 발효

열-유도성 균주 AG1385 및 AG1413에서 글리콜산 생산을 결정하였다. 이러한 균주들의 구축은 실시예 1 및 2에서 기술되었다. 사용된 균주의 유전자형은 하기와 같다:

AG0662: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd :: Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA Δi c lR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)

AG0662의 구축은 특허 출원 WO 2007/141316A, US 61/162,712 및 EP 09155971.6에 기술되어 있다.

AG1385: MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd::Cm ΔuxaCA::RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02::Km ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)

AG1413: MG1655 TTadcca/CI857/PR01/RBS01*2-icd::Km ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔaceK::Cm (pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)

균주 AG0662는 icd 유전자의 발현이 약화되어 있다. 배양 온도가 어떻든지, 이러한 세포의 이소시트레이트 데히드로게나제 활성 (ICD)은 약 50 mUI/㎎ (표 4)이다.

균주 AG1385 및 AG1413에는 icd 유전자의 열-유도성 카피가 있다. 37℃에서는 icd 발현이 최대이고, ICD 활성이 1000 mUI/㎎ 초과인 반면, 30℃에서는 icd 발현이 억제되고 ICD 활성이 약 50 내지 100 mUI/㎎이다 (실시예 5 참조).

실시예 3

산업-유사 조건에서의 글리콜산을 생산하기 위한 균주 AG0662 , AG1385 및 AG1413 의 발효 배양

균주 AG0662, AG1385 및 AG1413의 안정성을 검정하기 위해, 이들을 산업 공정에 대한 최소 횟수에 상응하는 30세대 동안 연속적으로 배양한 후, 발효기에서의 성능을 결정하였다.

이러한 목적을 위해, 각각의 균주의 3 내지 5개의 배양물을 40 g/ℓ의 MOPS 및 10 g/ℓ의 글루코스가 보충된 합성 배지 MML8AG1_100 (표 1의 조성 참조)에서 배플(baffled) 플라스크에서 연속적으로 수행하였다. 플라스크를 2일 동안 200 rpm에서 37℃에서 진탕시켰다 (최종 OD 6 내지 8).

[표 1]

연속 배양물을 멀티포스 다중 발효기 시스템(Multifors Multiple Fermentor System) (인포스(Infors)) 상에 조립된 700 ㎖ 작업량의 용기들에서 또한 성장시켰다. 각각의 용기에 20 g/ℓ의 글루코스 및 50 ㎎/ℓ의 스펙티노마이신이 보충된 200 ㎖의 합성 배지 MML11AG1_100를 채우고, 0.01 내지 0.8의 OD로 접종하였다.

[표 2]

37℃에서 0.2 lpm의 통기로 배양을 수행하였고, 진탕 (초기: 300 rpm; 최대: 1200 rpm) 및 산소 공급 (0 내지 40 ㎖/분)을 제어함으로써 용존 산소를 30％ 포화 초과로 유지시켰다. 염기 (NH4OH 7.5％ w/w와 NaOH 2.5％ w/w의 혼합물)를 첨가하는 것에 의해 pH를 pH 6.8 ± 0.1에서 조정하였다. 700 g/ℓ 글루코스의 공급 용액으로, 불연속 유가식(fed-batch) 방식으로 발효를 수행하였다 (표 3 참조). 글루코스가 배양 배지에서 고갈되었을 때, 공급물의 펄스가 글루코스 20 g/ℓ의 농도를 회복시켰다.

[표 3]

37℃에서 30세대 동안 성장시킨 후, 집단의 샘플을 취하고, -80℃에서 글리세롤 내에서 보관하였다 (40％ w/w의 멸균 글리세롤 용액에서의 희석).

그 후, 각각의 집단을 글리콜산의 생산에 대해 시험하였다.

균주 AG0662 및 이로부터 유래된 집단 (30세대)에 사용된 발효 조건은 특허 출원 EP 09155971.6 및 EP 09171297.6에 이미 기술되어 있다.

열-유도성 균주 AG1385 및 AG1413에 사용된 발효 공정은 하기 실시예 4에서 기술된다.

균주 AG0662, AG1385 및 AG1413 및 이들 각각으로부터 유래된 집단 (± 30세대)의 글리콜산 생산이 표 4에서 제시된다.

[표 4]

표 4에서 볼 수 있듯이, 성능 시험 전에 30세대 동안 배양되었을 때의 균주의 성능이 시험 전에 추가적인 배양이 없는 것보다 훨씬 더 낮기 때문에 균주 AG0662는 고도로 불안정하다.

성능 상실은 더 높은 ICD 활성에 또한 연관된다 (표 4).

세포의 icd 발현, 그리고 그에 따른 ICD 활성을 개선할 수 있는 모든 돌연변이는 성장률을 증가시킬 것이고, 생산 수율을 감소시킬 것이다. AG0662의 집단은 icd의 더 높은 발현에 이르도록 진화 및 재조합되었다. 이러한 집단에서의 ICD 활성은 모 균주에서보다 10배 더 높다 (50 mUI/㎎ 대신 1045 mUI/㎎).

대조적으로, icd 발현을 구동하는 열-유도성 프로모터를 보유하는 양쪽 균주 (AG1385 및 AG1413)의 성능은, 시험 전에 30세대 동안 성장되지 않은 조건 (I) 또는 30세대 동안 성장된 조건 (II)의 두 조건을 비교하는 경우 성능 시험에서 아주 약간만 달라진다. 따라서, 글리콜산 생산자 균주 내의 열-유도성 icd 유전자의 존재가 균주 안정성을 개선한다.

이소시트레이트 데히드로게나제 활성 (ICD)은 각각의 균주 및 각각의 집단에 대해 동일한 OD에서 실시예 5에 기술된 프로토콜에 따라 측정하였다.

최대 글리콜산 생산을 위해, ICD의 활성이 낮아야 한다; 약 50 내지 100 mUI/㎎.

실시예 4

열-유도성 균주에 대한 발효 공정

열-유도성 균주에 사용된 프로토콜은 특허 EP 09171297.6에 기술된 "pH 증가" 프로토콜을 기초로 하고, 이때 icd 유전자의 열-조절로 인해 특이적인 변형이 있다.

균주 AG1385 및 AG1413으로 발효를 실행하였다.

각각의 균주에 대해, 독립적인 예비배양을 40 g/ℓ의 MOPS 및 10 g/ℓ의 글루코스가 보충된 55 ㎖ 합성 배지 MML8AG1_100이 채워진 500 ㎖ 배플 삼각 플라스크에서 37℃에서 2일 동안 수행하였다 (OD 7 내지 10). 각각의 예비배양물 20 ㎖를 발효기에 접종하는데 사용하였다.

배양물을 멀티포스 다중 발효기 시스템 (인포스) 상에 조립된 700 ㎖ 작업량의 용기들에서 성장시켰다. 각각의 용기에 20 g/ℓ의 글루코스 및 50 ㎎/ℓ의 스펙티노마이신이 보충된 200 ㎖의 합성 배지 MML11AG1_100을 채우고, 약 1의 OD로 접종하였다.

30℃에서 0.2 lpm의 통기 하에 배양을 수행하였고, 진탕 (초기: 300 rpm; 최대: 1200 rpm) 및 산소 공급 (0 내지 40 ㎖/분)을 제어함으로써 용존 산소를 30％ 포화 초과로 유지시켰다.

염기 (NH4OH 7.5％ w/w와 NaOH 2.5％ w/w의 혼합물)를 첨가하는 것에 의해 pH를 pH 6.8 ± 0.1에서 조정하였다. 700 g/ℓ 글루코스의 공급 용액으로, 불연속 유가식 방식으로 발효를 수행하였다.

글루코스가 배양 배지에서 고갈되었을 때, 공급물의 펄스가 글루코스 20 g/ℓ의 농도를 회복시켰다.

5번째 공급물 펄스 후 (100 g/ℓ의 글루코스가 소모됨), 2시간 간격에 걸쳐 pH를 6.8에서 7.4로 조정하였고, 배양을 끝낼 때까지 일정하게 유지시켰다.

이러한 조건 하에 성장된 균주 AG1385 및 AG1413의 글리콜산 생산이 하기 표 5에서 제공된다.

[표 5]

실시예 5

이소시트레이트 데히드로게나제 ( ICD ) 활성 검정

이소시트레이트 데히드로게나제 활성을 검정하기 위해, 세포 (25 ㎎)를 프리셀라이스(Precellys) (6500 rpm에서 1×30s, 베르뗑 떼끄놀로지(Bertin Technologies))에 의해 용해시키고, 세포 잔해물을 30분 동안 12000g (4℃)에서의 원심분리에 의해 제거하였다. 단백질 농도를 브래드포드(Bradford)에 의해 결정하였다. ICD 활성을 pH 8.2 및 30℃에서 300 ㎕ 부피로 결정하였다. 검정 혼합물은 50 mM 트리스-HCl (pH 8.2), 50 mM MgCl₂, 5 mM NADP⁺, 0.5 mM 옥살레이트 및 3-6 ㎍의 조 세포 추출물을 함유하였다. 반응 혼합물을 10분 동안 30℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 10 mM의 이소시트레이트를 첨가하여 반응을 개시시켰다. NADPH 형성으로 인한 340 nm에서의 흡광도 (ε = 4.57 μmol^-1.㎖.㎝^-1)의 변화를 30분 동안 30℃에서 모니터링하였다.

[표 6]

참고문헌

SEQUENCE LISTING <110> METABOLIC EXPLORER <120> Use of inducible promoters in the production of glycolic acid <130> D28623 <140> PCT/EP2011/059884 <141> 2011-06-15 <150> EP10305635.4 <151> 2010-06-15 <150> US61/654,887 <151> 2010-06-15 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 128 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 1 gcaagctagc tcactcgttg agaggaagac gaaaatgact ccgtttatga ctgaagattt 60 cctgttagat accgtcacac tggctcacct tcgggtgggc ctttctgctg taggctggag 120 ctgcttcg 128 <210> 2 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 2 ttaacaactc atttcgactt tatagcgtta cgccgctttt gaagatcgcc gaattcgagc 60 tcggtacccg gggatccatc tcgagatccg cggatgtata catgggcccc atatgaatat 120 cctccttag 129 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 3 cccactggcc tgtaatatgt tcgg 24 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 4 atgcgatatc gaccgtataa gcagcagaat aggc 34 <210> 5 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 5 gcctacaggg cccgtatact aaaaataaga gttaccttaa atggtaactc ttattttttt 60 tatcagccaa acgtctcttc aggccactga ctagcgataa ctttccccac 110 <210> 6 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 6 gccttgtgcc ggaacaacta ctttactttc catttataac ctccttagta catgcaacca 60 ttatcaccgc cagaggtaaa atagtcaaca cgc 93 <210> 7 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 7 gcgtgttgac tattttacct ctggcggtga taatggttgc atgtactaag gaggttataa 60 atggaaagta aagtagttgt tccggcacaa ggc 93 <210> 8 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 8 ctagatatca acagataaaa cgaaaggccc agtctttcga ctgagccttt cgttttattt 60 gatgttacat gttttcgatg atcgcgtcac c 91 <210> 9 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 9 ctaaaagaag ttttttgcat ggtattttca gagattatga attgccgcat ttcacactgg 60 ctcaccttcg ggtgggcctt tctgctgtag gctggagctg cttcg 105 <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 10 caccgccaga ggtaaaatag tcaacacgca cggtgttaga tatttatccc 50 <210> 11 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 11 gggataaata tctaacaccg tgcgtgttga caattttacc tctggcggtg 50 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 12 gggataatcg gattttcagg aacgttgagt ttgccg 36 <210> 13 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 13 gccgcgtggc ctggaattat tgattgctca aaccattttg caaggcttcg atgctcagta 60 tggtcgattc ctcgaagtga ccaattaacc ctcactaaag gg 102 <210> 14 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 14 aacatcttcc acatgccctt cacgtatgcg gttttgtagt gcgcgccagt aatcagcgcg 60 gaacaggtcg gcgtgcatct aatacgactc actataggg 99 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 15 ggtgtggtgg aaaattcgtc g 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 16 gcattacgat tgcccatacc 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 17 cagagattat gaattgccgc a 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 18 ccaggagatt ttacgctcgc c 21 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 19 aacgcattac ccactctgtt taatacg 27 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 20 cttatcatgc ctacagccg 19

Claims

- 변형된 미생물을 탄소원을 포함하는 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계,
- 상기 미생물에서 표적 유전자의 발현을 외부 자극으로 조정하고, 여기서 상기 외부 자극은 온도인 단계, 및
- 배양 배지로부터 글리콜산을 회수하는 단계
를 포함하고, 이때 상기 미생물에서, icd 유전자의 발현이, 상기 외부 자극으로 활성이 조정되는 이종성 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 것인, 발효 공정에서의 글리콜산 생산 방법.
제1항에 있어서, 유도성 프로모터가 온도에 의해 유도되고,
- 파지 람다의 변형된 억제인자에 의해 조절되는 프로모터,
- 온도 민감성 Lac 억제인자에 의해 조절되는 변형된 lac 프로모터
로부터 선택된 것인 방법.
제2항에 있어서, 변형된 억제인자에 의해 조절되는 프로모터가 프로모터 PR, 프로모터 PL, 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 파지 람다의 변형된 억제인자가 람다 억제인자 cI의 온도 불안정성 대립유전자인 방법.
제4항에 있어서, 상기 람다 억제인자 cI의 온도 불안정성 대립유전자가 람다 억제인자 대립유전자 cI857인 방법.
제1항에 있어서, 변형된 미생물에서, 유전자 recA가 결실된 것인 방법.
제1항에 있어서, 유도성 프로모터의 사용이 37℃ 내지 42℃에서 icd 유전자의 발현을 허용하고, 28℃ 내지 32℃에서 icd 유전자의 발현을 억제하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 배양 배지 내의 생산된 글리콜산의 회수가 배양 배지 내에 존재하는 글리콜산의 유도체 및 전구체의 회수를 포함하는 것인 방법.
개선된 글리콜산 생산을 위해 변형된 미생물에서 글리콜산 생합성 경로에 관여하는 icd 유전자의 발현이 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 이종성 유도성 프로모터의 제어 하에 있는, 개선된 글리콜산 생산을 위해 변형된 미생물.
제9항에 있어서, 상기 유도성 프로모터의 사용이 37℃ 내지 42℃에서 icd 유전자의 발현을 허용하고, 28℃ 내지 32℃에서 icd 유전자의 발현을 억제하는 것인 미생물.
제9항에 있어서, 글리콜산 생산이 30세대 후 초기 생산의 50％ 이상인 미생물.
제1항에 있어서, 미생물이 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 속에 속하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 미생물이 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 종으로부터의 것인 방법.
제1항 또는 제4항에 있어서, 미생물이 하기 유전자 변형:
- 유전자 aceB, gcl, glcDEFGB, aldA, iclR, edd, eda, poxB, ackA 및 pta의 결실, 및
- 유전자 ycdW의 과발현
을 나타내는 것인 방법.
제14항에 있어서, 미생물이 유전자 aceK의 결실을 추가로 나타내는 것인 방법.
제9항에 있어서, 엔테로박테리아세아에 속에 속하는 미생물.
제16항에 있어서, 에스케리키아 콜라이 종으로부터의 것인 미생물.
제9항에 있어서, 유도성 프로모터가 온도에 의해 유도되고,
- 파지 람다의 변형된 억제인자에 의해 조절되는 프로모터,
- 온도 민감성 Lac 억제인자에 의해 조절되는 변형된 lac 프로모터
로부터 선택된 것인 미생물.
제18항에 있어서, 변형된 억제인자에 의해 조절되는 프로모터가 프로모터 PR, 프로모터 PL, 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 미생물.
제18항에 있어서, 상기 파지 람다의 변형된 억제인자가 람다 억제인자 cI의 온도 불안정성 대립유전자인 미생물.
제19항에 있어서, 상기 람다 억제인자 cI의 온도 불안정성 대립유전자가 람다 억제인자 대립유전자 cI857인 미생물.
제9항에 있어서, 하기 유전자 변형:
- 유전자 aceB, gcl, glcDEFGB, aldA, iclR, edd, eda, poxB, ackA 및 pta의 결실, 및
- 유전자 ycdW의 과발현
을 나타내는 미생물.
제22항에 있어서, 유전자 aceK의 결실을 추가로 나타내는 미생물.