ES2380664B2 - Método y dispositivo para el diagnóstico rápido de enfermedades en muestras fecales. - Google Patents
Método y dispositivo para el diagnóstico rápido de enfermedades en muestras fecales. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2380664B2 ES2380664B2 ES201031537A ES201031537A ES2380664B2 ES 2380664 B2 ES2380664 B2 ES 2380664B2 ES 201031537 A ES201031537 A ES 201031537A ES 201031537 A ES201031537 A ES 201031537A ES 2380664 B2 ES2380664 B2 ES 2380664B2
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- sample
- calprotectin
- lactoferrin
- page
- document
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title description 8
- 102000001109 Leukocyte L1 Antigen Complex Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 108010069316 Leukocyte L1 Antigen Complex Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 claims abstract description 43
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 claims abstract description 43
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 claims abstract description 43
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 claims abstract description 43
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 12
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 26
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 16
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 14
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 12
- 206010012742 Diarrhoea infectious Diseases 0.000 claims description 12
- 208000001848 dysentery Diseases 0.000 claims description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 6
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims description 5
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims description 5
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 4
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 claims description 3
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 claims description 3
- 230000000356 anti-lactoferrin effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 2
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 claims description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims 20
- 102100032241 Lactotransferrin Human genes 0.000 claims 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims 4
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 claims 3
- 241001672648 Vieira Species 0.000 claims 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 2
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 claims 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 claims 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 claims 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 claims 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 claims 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims 1
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 abstract description 31
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 35
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 8
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 7
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 101000798114 Homo sapiens Lactotransferrin Proteins 0.000 description 4
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 4
- 201000009840 acute diarrhea Diseases 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 102000050459 human LTF Human genes 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 2
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWEOQOXTVHGIFQ-UHFFFAOYSA-N 8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C=12C(S(=O)(=O)O)=CC=CC2=CC=CC=1NC1=CC=CC=C1 FWEOQOXTVHGIFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XGWFJBFNAQHLEF-UHFFFAOYSA-N 9-anthroic acid Chemical compound C1=CC=C2C(C(=O)O)=C(C=CC=C3)C3=CC2=C1 XGWFJBFNAQHLEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 102000003896 Myeloperoxidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000235 Myeloperoxidases Proteins 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000001746 atrial effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 108010071602 haptoglobin-hemoglobin complex Proteins 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000002551 irritable bowel syndrome Diseases 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 238000001507 sample dispersion Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000008646 thermal stress Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54386—Analytical elements
- G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
- G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
- A61B10/00—Other methods or instruments for diagnosis, e.g. instruments for taking a cell sample, for biopsy, for vaccination diagnosis; Sex determination; Ovulation-period determination; Throat striking implements
- A61B10/0038—Devices for taking faeces samples; Faecal examination devices
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases
- G01N2800/065—Bowel diseases, e.g. Crohn, ulcerative colitis, IBS
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Método de diagnóstico rápido y dispositivo para llevarlo a cabo que, mediante la aplicación de una muestra de heces dispersada en un diluyente, permite la detección simultánea y diferenciada de lactoferrina y calprotectina fecales mediante la formación de conjugados con partículas coloreadas y su captura en una membrana porosa.
Description
Campo de la invención
La presente invención se encuadra dentro del área de la biotecnología y en concreto en el diagnóstico de enfermedades gastrointestinales. El objeto de la invención es un procedimiento
5 rápido y sencillo de detección de lactoferrina (hLf) y calprotectina (hCp) fecales como marcadores para el diagnóstico de la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), la diarrea infecciosa (ID) y el cáncer colorrectal (CRe).
Estado de la técnica
Enfermedad inflamatoria intestinal
10 Enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) es un término amplio para describir ciertas enfermedades que se caracterizan por una inflamación idiopática y crónica del tracto digestivo. La enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) incluye la enfermedad de Crohn (CD), colitis ulcerosa (Ue) y un tipo no específico o indeterminado de colitis (le).
En muchas ocasiones y debido a que presentan mucha similitud en sus síntomas, la IBD es
15 muy difícil de distinguir del síndrome del intestino irritable (lBS). Éste último es una enfermedad benigna, en contraposición a la IBD pero cuyos síntomas son muy semejantes a las de la IBD.
Los procesos inflamatorios como la IBD suelen estar asociados a la presencia de leucocitos. Para un diagnóstico fiable se ha identificado diversos posibles marcadores de la enfermedad.
20 En la patente europea EP0641441 se describe una prueba in vitro para la determinación de leucocitos en muestras de heces utilizando un inmunoensayo con anticuerpos antilactoferrina. En la patente US7192724 ya se describe un método para diferenciar IBD de lBS midiendo la concentración de lactoferrina en heces utilizando un inmunoensayo tipo ELlSA. Incluso se ha establecido que esa concentración puede ser útil para monitorizar el desarrollo
25 de la enfermedad (Patente US7560240).
Por otra parte, la patente US5455160 revela un método inmunológico para el despistaje de la IBD y CRC usando un ensayo ELlSA para determinar calprotectina en muestras de heces.
Se han descrito otros posibles marcadores para el diagnostico de la IBD entre los que
destacan ANCA y ANSA aunque los mejores resultados se obtienen con lactoferrina y calprotectina fecales (Turkay, C. et Kasapoglu, B. CLlNICS 2010; 65(2):221-31). Vieria, A. et al. (BMC Research Notes 2009, 2:221) indica que tanto la medida de la lactoferrina como de la calprotectina fecales por ELlSA son marcadores altamente sensibles y específicos de la IBD y correlacionan con el grado de inflamación. Por último Gisbert, J. et al. (Inflamm Bowel Dis 2009; 15:1190-1198) determina que la medida por separado de ambos marcadores es útil en la predicción de una recaída en pacientes con CD o Uc.
Acompañando a estas patentes y resultados experimentales existen en el mercado tanto pruebas ELlSA como test inmunocromatograficos (le) para la determinación por separado de lactoferina y calprotectina. El LEUKO EZ VUE™ de Techlab (Blacksburg, VA) es un test inmunocromatografico (le) para la detección cualitativa de niveles elevados de lactoferrina en muestras de heces. El Prevent ID Caldetect de Preventis (Bensheim, Alemania) es un test IC semicuantitativo para la detección de calprotectina en heces para la diferenciación de IBD de lBS, al igual que el Quantum Blue Calprotectin Rapid Test de Bühlmann (Basilea, Suiza).
En todo lo descrito hasta ahora los inmunoensayos para calprotectina y lactoferrina son distintos, es decir, se hace por un lado un inmunoensayo para calprotectina y otro para lactoferrina, lo que significa que hay que preparar muestras distintas, en diluyentes distintos, y realizar ensayos distintos y esto implica:
- a.
- Un mayor gasto de tiempo.
- b.
- Un mayor número de manipulaciones con el inherente riesgo de error.
c. Los resultados obtenidos para los dos parámetros no se correlacionan directamente puesto que provienen de dos tomas de muestra diferentes.
El objeto de la presente invención es un test rápido del tipo IC para la determinación simultánea y diferenciada de calprotectina y lactoferrina en muestras fecales que presenta las siguientes ventajas:
a. Se prepara una única muestra. Cuando ambas proteínas se analizan por separado hay dos muestras diferentes en diluyentes diferentes.
b. Se ensayan simultáneamente con lo que se reduce el tiempo de ensayo y el El dispositivo de la presente invención permite la detección simultánea y diferenciada de
- número de manipulaciones, reduciéndose así el riesgo de error. simultánea de dos marcadores hace que la prueba sea más sensible.
- La determinación
- s
- c. La determinación es diferenciada, es decir, se visualiza en una línea la presencia de lactoferrina y en otra línea distinta la presencia de calprotectina. La determinación diferenciada de dos marcadores hace que la prueba pueda ser más específica.
- d. Se utiliza un vial específico que permite la toma de la muestra cuantitativa y su dispersión en el diluyente de manera fácil e higiénica.
- de forma
- 10
- Diarrea infecciosa (ID)
- lS
- Otro de los casos de aplicación de la presente invención es la gestión de la diarrea aguda. Aunque el origen de la diarrea puede ser muy diverso, es importante discernir si se trata de un proceso no invasivo (autolimitado, no inflamatorio) de un proceso invasivo (agresivo, inflamatorio). El tratamiento del primero se limita a una terapia de rehidratación y reposición de electrolitos mientras que el segundo requiere tratamiento especifico usualmente con agentes antimicrobianos.
- 20
- Las diarreas con procesos inflamatorios suelen estar causadas por Salmonella, Shigella, Campylobacter jejuni o Clostridium difficile. El diagnóstico de estas se hace por cultivo de las heces e identificación de los patógenos. El cultivo es una técnica larga y costosa. ehoi, S. W. et al. (Journal of elinical Microbiology, 1996:928-932) proponen el uso de un látex de aglutinación para detectar la presencia de lactoferrina en muestras de heces como método de despistaje para evitar el cultivo en caso de diarreas agudas.
- 2S
- Shastri, Y.M., et al. (Am .1 Med. 2008, 121(12):1099-106) describen que la determinación de calprotectina fecal muestra una alta correlación con infecciones bacterianas que producen diarrea y propone su determinación como método de despistaje rápido de la diarrea infecciosa antes de proceder al cultivo.
- 30
- En la patente US6727073 se describe un test le para el diagnostico de la diarrea infecciosa que detecta simultáneamente lactoferrina y uno o varios antígenos de las bacterias que pueden causarla, a saber, Salmonella, E. colí 0157, Listeria, Yersinia, Shigella, Campylobacter jejuni o Clostridium difficile.
lactoferrina y calprotectina fecales y constituye una herramienta en el diagnóstico y el manejo de los casos de diarrea aguda.
Cáncer colorrectal (CRe).
El cáncer colorrectal es una enfermedad en la que las células malignas se localizan en la porción intermedia y más larga del intestino grueso. Una de las herramientas diagnosticas más utilizadas para el despistaje del CRC es le detección de sangre oculta en heces (FOB). La forma más sensible y específica es un inmunoensayo para la detección de la hemoglobina ya sea en forma de ELlSA o test rápido (le).
La patente US5552292 muestra un método de diagnóstico del CRC consistente en un inmunoensayo tipo ELlSA para la detección de lactoferrina o mieloperoxidasa en heces.
El documento WO 2009/065551 Al revela un método de diagnóstico del cáncer colorrectal (CRe) a partir de muestras de heces usando como marcadores calprotectina y el complejo hemoglobina-haptoglobina.
El dispositivo de la presente invención que permite la detección simultánea y diferenciada de lactoferrina y calprotectina fecales, constituye una herramienta útil en el diagnóstico y el despistaje del cáncer colorrectal (CRe).
Descripción breve
El método de diagnóstico de la presente invención consiste en: la toma de una porción representativa de la muestra de heces, su dispersión en un diluyente específico, la aplicación de esta dispersión de la muestra en un dispositivo inmunocromatográfico específico, la formación de complejos entre los anticuerpos del dispositivo y los antígenos de la muestra y la visualización de estos complejos en la membrana del dispositivo.
El dispositivo inmunocromatográfico utilizado es de un solo uso. No se requiere ningún tipo de instrumentación para llevar a cabo el método o interpretar el resultado. Como muestra se utilizan heces.
El tiempo de preparación de la muestra son unos dos minutos y el tiempo de desarrollo de
la prueba es de 5 a 10 minutos, lo que significa entre 10 y 20 veces menos que los ensayos EIA (ELlSA), mucho más complejos de llevar a cabo y necesitan de instrumentación de laboratorio.
Por su sencillez la prueba se puede llevar a cabo en la consulta del médico, e incluso, con las instrucciones adecuadas, por el propio paciente.
El método de la invención es útil para el diagnostico de la IBO y su diferenciación de la lBS. Éste último es una enfermedad benigna cuyos síntomas son muy semejantes a las de la IBO.
Ante un caso de diarrea aguda, el método de la invención es útil para determinar de forma rápida si ésta tiene carácter inflamatorio e invasivo y lo tanto hay que proceder al cultivo y/o a un tratamiento con agentes antimicrobianos.
En el caso del diagnostico de CRC, la prueba de la invención es adecuada para establecer procedimientos de vigilancia precoz de aparición de la enfermedad especialmente en grupos de alto riesgo (edad, antecedentes familiares, ... ).
Descripción de la figuras
Figura 1: Esquema de las etapas del método de diagnóstico. El dispositivo o vial específico para la toma de muestras fecales (Figura lA) es un vial de plástico de unos 2 mL de capacidad, en el que previamente se ha dispensado 1 mi de diluyente, con un tapón a rosca que dispone de un vástago cuyo extremo, diseñado al efecto, permite la recolección cuantitativa de una muestra de heces (Figura lB) sólidas o semisólidas y su introducción en el vial. Tras esto, se cierra y se agita vigorosamente (Figura le) hasta la completa dispersión de la muestra. Por último, se rompe la parte opuesta del dispositivo (Figura 10) y se añaden unas gotas sobre el lugar de aplicación de la muestra del dispositivo inmunocromatográfico (Figura lE).
Figura 2: Vistas del dispositivo inmunocromatográfico.
Figura 2A: Vista superior del dispositivo inmunocromatográfico en formato tira. Oicha tira incluye los siguientes elementos: un material absorbente (1), una membrana porosa (2) con una línea de control (3), una línea para la detección de calprotectina (4) y otra línea para la detección de lactoferrina (5), un lugar de aplicación de la muestra (6) y un lugar para el conjugado anticuerpo-marcador (7).
Figura 2B: Vista de la sección del dispositivo inmunocromatográfico en formato tira en la
que se distinguen además de los elementos descritos en la Figura 2A, el soporte plástico (8).
Figura 2C: Vista proyectada del dispositivo inmunocromatográfico, en la que se distinguen los elementos descritos en la Figuras 2A y 2B.
5 Descripción detallada
Los dispositivos inmunocromatográficos para la detección tanto de antígenos como de anticuerpos han sido descritos anteriormente (por ejemplo, en la patente EP 1248112).
En la presente invención se trata de una prueba de de tres líneas: una de control, otra para la detección de lactoferrina y otra para la detección de calprotectina.
10 En una realización preferente se utiliza un único anticuerpo monoclonal anti -calprotectina. Este anticuerpo monoclonal (CAl) se ha desarrollado utilizando calprotectina altamente purificada. El anticuerpo monoclonal obtenido presenta una elevada afinidad y especificidad frente al complejo formado por las dos subunidades de la calprotectina mientras que apenas se une a cada una de las subunidades por separado.
15 También en una realización preferente, se utilizan anticuerpos policlonales de conejo antilactoferrina humana. Estos anticuerpos se han obtenido inmunizando conejos con lactoferrina humana purificada y posteriormente han sido purificados por cromatografía de afinidad frente al mismo antígeno (Iactoferrina humana purificada).
Con los anticuerpos descritos, se preparan, por separado, conjugados con nanopartículas
20 coloreadas. Estas nanopartículas son depositadas en uno de los materiales del dispositivo inmunocromatográfico y actúan como fase móvil. Los mismos anticuerpos son inmovilizados por separado sobre la membrana porosa que actúa como fase fija y en la que se produce la captura inmunológica por separado de la lactoferrina y calprotectina humanas. La membrana y el material con el conjugado son montados con la ayuda de otros materiales sobre un soporte
25 plástico que se corta en forma tira.
Para la realización del ensayo se resuspende la muestra de heces en el diluyente de dispersión de la muestra en una proporción aproximada 1/100. Si la muestra es liquida 10 IlL de muestra se mezclan con 1 mL del diluyente. Si la muestra es sólida se separan 10 mg de muestra con la ayuda de una espátula y se dispersan en 1 mL de diluyente. Resulta muy conveniente la utilización del vial de toma de muestra en el se introduce la muestra con la ayuda de un vástago tras lo que se cierra con el tapón a rosca y se agita vigorosoramente para posteriormente romper la parte superior del tapón y añadir 4-5 gotas sobre el punto de aplicación de la muestra del dispositivo inmunocromatográfico. El diseño del vástago es tal que al pasar por el orificio reductor del vial permite la introducción de una cantidad predeterminada de la muestra de heces, en este caso 10 mg.
Tras la aplicación de la muestra se esperan 10 minutos para visualizar las líneas y se interpreta el resultado. El test se considera negativo si solo aparece una sola línea, la de control (por ejemplo, verde) en la ventana de resultados; positivo para calprotectina si además de la línea de control aparece una línea en la posición de la calprotectina (por ejemplo, azul); positivo para lactoferrina si además de la línea de control aparece una línea en la posición de la lactoferrina (por ejemplo, roja); y positivo para ambas (hlf y hCp) si aparecen tres líneas (por ejemplo, una verde, una roja y una azul)
Ejemplos de realización:
Ejemplo 1:
Preparación y purificación de anticuerpos monoe/onales anti-calprotectina
El anticuerpo monoclonal CAl se obtuvo a partir del hibridoma del mismo nombre. la obtención del hibridoma productor del anticuerpo monoclonal CAl se realizo mediante protocolos conocidos según el método de fusión celular y selección de los clones obtenidos que fue inicialmente descrito por Kohler y Milstein en 1975 (K6hler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. l\Jature. 1975 Aug 7;256 (5517):495-7).
Ratones del tipo BALB/c fueron inmunizados con calprotectina purificada (ProtEra S.r.l., Florencia, Italia). Los linfocitos de los ratones inmunizados fueron fusionados con células mielómicas de la linea SP20 y los hibridomas obtenidos fueron seleccionados mediante técnicas ELlSA de la siguiente manera: los pocillos de una placa microtiter de 96 pocillos fueron tapizados con anticuerpo policlonal de conejo anti-calprotectina en tampón carbonato 100 mM de pH 9 a 37 grados durante 2 h. A estos pocillos se añadió la calprotectina purificada. Tras su lavado se añaden las distintas muestras de cultivo de hibridomas y la presencia del
anticuerpo anti-calprotectina se revela utilizando un conjugado anti-mlgG con peroxidada yel
sustrato correspondiente.
Se seleccionaron los hibridomas que mayor afinidad y mejor especificidad presentaron. Entre estos se seleccionaron los más productores y los que mejores prestaciones ofrecieron en los test de estrés térmico y velocidad de reacción frente al antígeno.
El hibridoma seleccionado CAl fue cultivado en medio RPMI-HT durante varios días a 37 grados centígrados con 5% de C02. A partir del medio de cultivo fue purificado el anticuerpo por cromatografía de afinidad a proteína A según las instrucciones del fabricante de la columna (GE Healthcare) tras lo que fue dializado en PBS de pH 7,4.
Ejemplo 2:
Preparación y purificación de anticuerpos policlonales anti-Iactoferrina
La lactoferrina humana fue purificada a partir del producto comercial Lactoferrin from human milk (L0520 Sigma-Aldrich) por cromatografía de intercambio iónico hasta una pureza superior al 99% por SDS-PAGE.
Inmunización de conejos.
La inmunización se realiza por vía intradérmica (día 1), inoculando 250 ~g de lactoferrina purificada en 0,5 mL de PBS al que se le añaden 0,5 mL de Adyuvante Completo de Freund. Después del la inmunización se administran dosis de recuerdo cada tres semanas hasta completar un total de tres. En cada dosis se administran 250 ~g de antígeno en un volumen de 0,5 mi por vía intramuscular (al que se le añaden 0,5 mL de Adyuvante Incompleto de Freund).
Dos semanas después de la administración de cada dosis de recuerdo se procede a realizar la sangría para la obtención de los diferentes sueros. La sangre se extrae por punción de la arteria auricular. De cada sangrado se obtienen entre 15 y 30 mi de sangre completa (que equivalen a 7 y 15 mi de suero). Este suero se congela hasta su posterior purificación.
Purificación de los anticuerpos por afinidad.
Se prepara una columna HiTrap I\IHS-activated HP de 5 mL (GE Healthcare) con 5 mg de
lactoferrina purificada según las instrucciones del fabricante. Por dicha columna se hacen pasar 10 mL de suero hiperinmune de conejo y se lava con PBS hasta que la absorbancia a 280 nm es inferior a 0.050. Los anticuerpos son eluídos en un tampón glicina 250 mM de pH 2,75 Y
- 5
- se recogen fracciones que son posteriormente dializadas en PBS. nm.
- Ejemplo 3:
- Preparación de los conjugados
- 10
- Calprotectina
inmediatamente neutralizadas con tampón fosfato y La concentración se determina por su absorbancia a 280
Se prepara un conjugado del anticuerpo CAl con micropartículas de poliestireno. Se utilizan partículas coloreadas con grupos carboxilo en su superficie de 200 nm de diámetro nominal (Kl 020 de la marca Estapor, Merck, Darmstadt, Alemania). 1 mL de partículas al 10 % se lavan por centrifugación y resuspensión en tampón MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico) 10
15 mM de pH 6 Y se le añade EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida) hasta una concentración de 5 mM. Se incuba lh a 37 grados y se retira el exceso de reactivo por centrifugación. Las partículas así activadas se resuspenden en MES 10 mM de pH 6 Y se les añade el anticuerpo monoclonal anti-calprotectina hasta una concentración superficial de 2 mgJm 2 tras lo que se incuban 18 h a 4 grados y posteriormente se lavan en Tween 20 al 0,1%.
20 Lactoferrina
De la misma manera, se prepara un conjugado del anticuerpo policlonal anti-Iactoferrina purificado por afinidad con micropartículas de poliestireno. Se utilizan partículas coloreadas con grupos carboxilo en su superficie de 300 nm de diámetro nominal (Kl 030 de la marca Estapor, Merck, Darmstadt, Alemania). Igualmente, 1 mL de partículas al 10 % se lavan por
25 centrifugación y resuspensión en tampón MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico) 10 mM de pH 6 Y se le añade EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida) hasta una concentración de 5 mM. Se incuba lh a 37 grados y se retira el exceso de reactivo por centrifugación. Las partículas así activadas se resuspenden en MES 10 mM de pH 6 Y se les añade el anticuerpo policlonal anti-Iactoferrina purificado por afinidad hasta una concentración superficial de 1 mgjm2 tras lo que se incuban 4 h a 37 grados y posteriormente se lavan en Tween 20 al 0,1%.
Los conjugados con partículas para línea de control se obtienen de la misma manera pero utilizando streptavidina (54762, Sigma-Aldrich) a una concentración superficial final de 1 mgjm2•
Una mezcla de los tres conjugados con partículas descritos en concentraciones de 0,02%, 0,04% Y 0,05% respectivamente, se diluyen en una solución que contiene sacarosa 10%, caseína bovina 2%, PEG-6000 1% y Tween-20 2% en tampón TRIS (tris(hidroximetil)aminometano) de pH 8. Esta solución se deposita a razón de 15 uLjcm en un material bobinado de fibras de poliéster no entretejidas de 29 mm de ancho que se seca en corriente de aire a 45 grados tras la deposición (5 min) y durante 24 h en una cámara a 30 grados y 20 % de humedad relativa.
Ejemplo 4:
Preparación de las líneas de test y control.
Los anticuerpos anti-Iactoferrina, anti-calprotectina y anti-streptavidina (para la línea de control) se dializan en PBS, se llevan a una concentración entre 0,5 y 1 mgjmL y se depositan linealmente de forma paralela sobre una membrana de nitrocelulosa laminada (Millipore HiFlow Plus) de 25 mm de ancho y de tamaño de poro entre 10 y 30 micrómetros a razón de 1 microLjcm tras lo cual se seca en corriente de aire a 45 grados tras la deposición (2 min) e inmediatamente después durante 24 h en una cámara a 30 grados y 20 % de humedad relativa.
Ejemplo 5.
Montaje del test inmunocromatografico.
El material con el conjugado, la membrana y el material absorbente se montan conforme indica la figura 2 sobre un soporte plástico con una lámina adhesiva y las tiras son cortadas transversalmente a su montaje a una anchura de 4 mm.
Se prepara una solución para la dispersión de las muestras de heces consistente en una
disolución acuosa de cloruro de sodio 300 mM, Triton X-lOO al 1%, anticuerpos IgG inespecíficos de ratón 100 microgr/ml y anticuerpos IgG inespecíficos de conejo a 200 microgr/ml en un tampón TRIS 200 mM a un pH de 9. Esta preparación de dispensa en viales
5 para la toma de muestra a razón de 1 ml/vial.
Ejemplo 6.
Detección calprotectina y lactoferrína fecales
Para que el dispositivo de la invención tenga una adecuada utilidad diagnóstica es necesario utilizar unos valores de corte, es decir, la concentración de analito por encima de la cual el test 10 es positivo y por debajo de la cual el test es negativo. En el caso de la calprotectina el valor de
corte es 50 microgr hCp/gr de heces y para la lactoferrina es 10 microgr hlf/gr de heces.
Debido a la existencia del valor de corte, es necesario tomar la muestra de heces de forma cuantificada. Para ello se utiliza un vial especifico para la toma de muestra fecales que contiene un vástago con hendiduras para la muestra y un reductor para eliminar la muestra
15 sobrante de manera que el sistema ha sido calibrado para que se introduzcan en el vial exactamente 10 mg de muestra fecal. Por otro lado, y puesto que el vial contiene 1 ml de diluyente, se puede cuantificar la concentración de la muestra.
Calprotectina:
Se prepararan diluciones seriadas 1/2 de calprotectina en el diluyente de dispersión de
20 muestras descrito en el apartado anterior. 100 ~ll de estas diluciones se aplican a los dispositivos inmunocromatográficos de la invención y se deja progresar el ensayo durante 10 minutos a temperatura ambiente (25 ºC) tras lo cual se procede a interpretar el resultado mediante apreciación visual de aparición de la línea de test. Se realiza la misma operación pero diluyendo la calprotectina en un pool de muestras de heces resuspendidas aprox. 1/100 en el
25 mismo tampón. los resultados se muestran en la tabla 1.
Tabla 1 Lactoferrina:
- ngr hCP/mL
- En diluyente En heces Ilgr hCp/gr heces
- 16000
- + + 1600
- 8000
- + + 800
- 4000
- + + 400
- 2000
- + + 200
- 1000
- + + 100
- 500
- + + 50
- 250
- - - 25
- 125
- - - 12,5
- O
- - -
- O
Se prepararan diluciones seriadas 1/2 de lactoferrina en el diluyente de dispersión de muestras descrito en el apartado anterior. 100 microL de estas diluciones se aplican a los
5 dispositivos inmunocromatográficos de la invención y se deja progresar el ensayo durante 10 minutos a temperatura ambiente (25 ºC) tras lo cual se procede a interpretar el resultado mediante apreciación visual de aparición de la línea de test. Se realiza la misma operación pero diluyendo la lactoferrina en un pool de muestras de heces resuspendidas aprox. 1/100 en el mismo tampón. Los resultados se muestran en la tabla 1.
10 Tabla 2
- ngr hLf/ml
- En diluyente En heces ~rhLf/gr heces
- 3200
- + + 320
- 1600
- + + 160
- 800
- + + 80
- 400
- + + 40
- 200
- + + 20
- 100
- + + 10
- 50
- - - 5
- 25
- - - 2,5
- O
- - -
- O
Una muestra de heces que contenga una concentración de calprotectina fecal humana mayor o igual 50 ¡..tg/g heces y una concentración de lactoferrina igualo mayor que 10¡..tg/g en heces, dan resultados positivos usando el test de la presente invención.
5 Ejemplo 7.
Evaluación de las prestaciones de la prueba.
Las prestaciones el dispositivo de diagnóstico de la invención fueren comparadas con sendos inmunoensayos para lactoferrina y calprotectina. Se realizó un estudio con 64 muestras fecales procedentes del Servicio de Microbiología de un hospital local (Zaragoza,
10 España). Con dichas muestras se realizaron tres tipos de ensayos:
1. el método de la presente invención
2. el inmunoensayo tipo ELlSA Calprest® (Eurospital Spa , Trieste, Italia), realizado según las instrucciones del fabricante.
3. la prueba rápida tipo IC IBO EZ VUE® (TechLab, Blacksburg, VA, EEUU), realizado según 15 las instrucciones del fabricante.
La detección de calprotectina con el test de la presente invención presenta >94% de correlación en sensibilidad comparada con la prueba Calprest® (Eurospital). Y la detección de lactoferrina fecal humana usando test de la presente invención presenta >99% de correlación en sensibilidad comparada con la prueba rápida IBO EZ VUE® (TechLab).
20 La detección de calprotectina humana con de la presente invención presenta un 93% de correlación en especificidad comparada con Calprest® (Eurospital) y la detección de lactoferrina humana presenta >99% de correlación en especificidad comparada con ISO EZ VUE® (TechLab).
Claims (6)
- REIVINDICACIONES1. Dispositivo inmunocromatográfico para el análisis de muestras de heces caracterizado por que comprende:
- a.
- Una ventana de resultados de tres líneas, una de control, otra para la detección de calprotectina y otra para la detección de lactoferrina, de manera que permite la identificación simultánea y diferenciada de calprotectina y lactoferrina fecales.
- b.
- Una membrana porosa en la que se han inmovilizado separadamente anticuerpos anti-calprotectina yanti-Iactoferrina
- c.
- Un absorbente en el que se ha depositado conjugados de anticuerpos anti-calprotectina y anti-Iactoferrina unidos a moléculas o partículas marcadoras.
-
- 2.
- Dispositivo inmunocromatográfico según la reivindicación 1 caracterizado por que los anticuerpos utilizados son policlonales o monoclonales tanto en la membrana como en los conjugados.
-
- 3.
- Método de diagnóstico de la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) caracterizado por que comprende:
a. La obtención de una muestra de heces,- b.
- La dispersión del material fecal de la muestra en un tampón o diluyente,
- c.
- La aplicación de esta dispersión en la ventana de muestra del dispositivo de la reivindicación 1,
- d.
- La interpretación del resultado según la aparición de bandas en la ventana de resultados.
-
- 4.
- Método de despistaje rápido de la diarrea infecciosa (ID) caracterizado por que comprende:
a. La obtención de una muestra de heces,b. La dispersión del material fecal de la muestra en un tampón o 5 diluyente,- c.
- La aplicación de esta dispersión en la ventana de muestra del dispositivo de la reivindicación 1,
- d.
- La interpretación del resultado según la aparición de bandas en la ventana de resultados.
10 5. Método de ayuda al diagnóstico del cáncer colorrectal (eRe) caracterizado por que comprende:a. La obtención de una muestra de heces,b. La dispersión del material fecal de la muestra en un tampón o diluyente,15 c. La aplicación de esta dispersión en la ventana de muestra del dispositivo de la reivindicación 1,d. La interpretación del resultado según la aparición de bandas en la ventana de resultados. - 6. Kit para llevar a cabo los métodos de diagnostico de las reivindicaciones 3, 4 Y 20 5 caracterizado porque comprende:
- a.
- Un dispositivo inmunocromatográfico según la reivindicación 1,
- b.
- un diluyente adecuado para suspensión y dispersión del material fecal,
- c.
- un vial para la toma de muestra y su manipulación.
lBlAle IDlEFIGURA 11 2A2...............--31!1111111111111-45 7062B7 234 5 1 I » 1/ 1 1 Io~QoQoQoQoQQQoQQ&QQIJV'~;oQOd'881- 8
- 2C
- 6
- 7 234 5 1
FIGURA 2OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCASN.º solicitud: 201031537ESPAÑAFecha de presentación de la solicitud: 19.10.2010Fecha de prioridad:INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA51 Int. Cl. : G01N33/53 (2006.01)DOCUMENTOS RELEVANTES- Categoría
- Documentos citados Reivindicaciones afectadas
- A
- WO 0136975 A1 (BINAX, INC. [US/US]) 25.05.2001, página 3, línea 32 – página 4, línea 25; página 5, línea 29 – página 9, línea 9; reivindicaciones 1,3-5,7,8,11,12,15,17,21,25,26,29,31. 1-6
- A
- VIEIRA A. et al. Inflammatory bowel disease activity assessed by fecal calprotectin and lactoferrina: correlation with laboratory parameters, clinical endoscopic and histological indexes. BMC Research Notes. 2009. Vol. 2:221, todo el documento. 1-6
- A
- SIPPONEN T. et al. Fecal Calprotectin, Lactoferrin, and Endoscopic Disease Activity in Monitoring Anti-TNF-alpha Therapy for Crohn’s Disease. Inflammatory Bowel Diease. 2008. Vol. 14(10), páginas: 1392-1398, todo el documento. 1-6
- A
- EP 0884594 A2 (TORELLI G.) 16.12.1998, columna 2, línea 46 – columna 3, línea 34; reivindicaciones 1,6,10. 1-2
- A
- US 20090104630 A1(REITER PC.) 23.04.2009, página 3, párrafos 0032-0038; figura 2. 1-2
- Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud
- El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones □ para las reivindicaciones nº:
- Fecha de realización del informe 16.06.2011
- Examinador M. García Grávalos Página 1/5
INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICANº de solicitud: 201031537Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) G01N Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos debúsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, BIOSIS, MEDLINE, EMBASE, USPTO PATENT DATABASE, GOOGLE ACADEMICO.Informe del Estado de la Técnica Página 2/5OPINIÓN ESCRITANº de solicitud: 201031537Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 16.06.2011Declaración- Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)
- Reivindicaciones Reivindicaciones 1-6 SI NO
- Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)
- Reivindicaciones Reivindicaciones 1-6 SI NO
Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).Base de la Opinión.-La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.Informe del Estado de la Técnica Página 3/5OPINIÓN ESCRITANº de solicitud: 2010315371. Documentos considerados.-A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.- Documento
- Número Publicación o Identificación Fecha Publicación
- D01
- WO 0136975 A1 25.05.2001
- D02
- VIEIRA A. et al. BMC Research Notes. 2009. Vol. 2:221. 29.10.2009
- D03
- SIPPONEN T. et al. Inflammatory Bowel Diease. 2008. Vol. 14(10), páginas: 1392-1398. 2008
- D04
- EP 0884594 A2 16.12.1998
- D05
- US 20090104630 A1 23.04.2009
- 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaraciónLa presente solicitud divulga un dispositivo inmunocromatográfico que, mediante la aplicación de una muestra de heces dispersada en un diluyente, permite la detección simultánea de calprotectina y lactoferrina fecales, mediante la formación de conjugados de anticuerpos anti-calprotectina y anti-lactoferrina unidos a partículas coloreadas y su captura en una membrana porosa (reivindicaciones 1-2). Se refiere también a el uso de dicho dispositivo en un método de diagnóstico de de una enfermedad inflamatoria intestinal, de diarrea infecciosa o de cáncer colorectal (reivindicaciones 3-5), y a un kit para llevar a cabo dicho método que incluye el dispositivo de la invención, un diluyente adecuado y un vial para la recogida de muestra (reivindicación 6).El documento D01 divulga un método rápido y económico para diagnóstico de una enfermedad inflamatoria intestinal, basado en un dispositivo inmunocromatográfico capaz de detectar al tiempo, en una muestra fecal, con anticuerpos específicos y conjugados de anticuerpos marcados, la presencia de un microorganismo patógeno y de lactoferrina como marcador de la enfermedad entérica. El dispositivo inmunocromatográfico consta de dos partes; una, con un pocillo para la depositar la muestra; otra, formada por una tira, donde fluye la muestra, uniéndose en una fase móvil a los conjugados anticuerpo-marcador, quedando posteriormente fijados en una membrana de nitrocelulosa con anticuerpos específicos dispuestos en paralelo, siendo identificados los positivos por sus correspondientes marcadores (ver página 3, línea 32 página 4, línea 25; página 5, línea 29 -página 9, línea 9; reivindicaciones 1, 3-5, 7, 8, 11, 12, 15, 17, 21, 25, 26, 29, 31).El documento D02 divulga un estudio sobre la detección de lactoferrina y calprotectina en muestras fecales, evaluando su utilidad como marcadores, muy sensibles y específicos, para detección y/o pronóstico de la enfermedad inflamatoria intestinal (ver todo el documento).El documento D03 divulga una evaluación de la lactoferrina y calprotectina fecales, como marcadores de pronóstico de la enfermedad de Crohn después del tratamiento con interferon-alpha (ver todo el documento).El documento D04 divulga un método para análisis de muestras biológicas, basado en un dispositivo inmunocromatográfico capaz de detectar al tiempo, de modo rápido y que precisa poca cantidad de muestra, más de una molécula de interés. Está formado por una membrana cromatográfica, inserta en un soporte, donde se deposita la muestra para analizar, aplicándose el agente marcador en un diluyente que se desplaza sobre la muestra mostrando el resultado del análisis en bandas paralelas (ver columna 2, línea 46 -columna 3, línea 34; reivindicaciones 1, 6, 10).El documento D05 divulga un método y un dispositivo inmunocromatográfico para detectar el estado del sistema inmune en casos de SIDA, basado en la determinación de los niveles de células T CD4+, empleando equivalentes de estas células como el ligando soluble CD40/CD154. El dispositivo está formado por un material que permite el flujo lateral de la muestra, desde un extremo, pasando por una fase móvil donde se une al ligando detector formando un complejo que posteriormente es capturado por el agente específico, dejando una señal de identificación según el tipo de marcador empleado (ver página 3, párrafos 0032-0038; Figura 2).Informe del Estado de la Técnica Página 4/5OPINIÓN ESCRITANº de solicitud: 2010315371. NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 6.1 y Art. 8.1 LP 11/1986)La presente solicitud divulga un dispositivo inmunocromatográfico que permite la detección simultánea de calprotectina y lactoferrina fecales y a su uso en un método de diagnóstico de de una enfermedad inflamatoria intestinal, de diarrea infecciosa o de cáncer colorrectal.1.1. REIVINDICACIONES 1-6El documento D01 se considera el más cercano al estado de la técnica, ya que anticipa un método y un dispositivo inmunocromatográfico para diagnóstico de una enfermedad inflamatoria intestinal, detectando en una muestra fecal, mediante conjugados de anticuerpos marcados, la presencia de un microorganismo patógeno y de lactoferrina como marcador de la enfermedad entérica.Aunque el dispositivo descrito en D01 es muy parecido al de la invención, anticipando el uso de conjugados anticuerpomarcador en una fase móvil y la posterior captura e identificación de las moléculas por sus correspondientes marcadores, que pueden ser partículas coloreadas, sin embargo, en este documento no se menciona a la calprotectina como marcador de la enfermedad entérica.En consecuencia, según lo divulgado en el documento D01, las reivindicaciones 1-6 cumplen el requisito de novedad (Art. 6.1 LP11/1986).Los documentos D02 y D03 anticipan el uso de lactoferrina y calprotectina como marcadores específicos para detección y/o pronóstico de la enfermedad inflamatoria intestinal en muestras fecales, por lo que el uso de estos marcadores en un dispositivo inmunocromatográfico, para diagnóstico de una enfermedad inflamatoria intestinal podría resultar evidente para un experto en la materia. Sin embargo, se considera que el dispositivo de la presente invención aporta una serie de ventajas sobre lo divulgado en el estado de la técnica, como el vial para recogida de muestra y la detección y cuantificación simultánea de calprotectina y lactoferrina.De acuerdo con lo expuesto, las reivindicaciones 1-6 cumplen con el requisito de actividad inventiva (Art. 8.1 LP 11/1986)Los documentos D04 y D05 se refieren al estado de la técnica y no se consideran relevantes en relación con el objeto de la invención.Informe del Estado de la Técnica Página 5/5
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES201031537A ES2380664B2 (es) | 2010-10-19 | 2010-10-19 | Método y dispositivo para el diagnóstico rápido de enfermedades en muestras fecales. |
| EP11833896.1A EP2631649A4 (en) | 2010-10-19 | 2011-10-17 | METHOD AND DEVICE FOR FAST DIAGNOSIS OF DISEASES IN FAKE SAMPLE |
| PCT/ES2011/070714 WO2012052586A1 (es) | 2010-10-19 | 2011-10-17 | Método y dispositivo para el diagnóstico rápido de enfermedades en muestras fecales |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES201031537A ES2380664B2 (es) | 2010-10-19 | 2010-10-19 | Método y dispositivo para el diagnóstico rápido de enfermedades en muestras fecales. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2380664A1 ES2380664A1 (es) | 2012-05-17 |
| ES2380664B2 true ES2380664B2 (es) | 2012-09-13 |
Family
ID=45974733
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES201031537A Active ES2380664B2 (es) | 2010-10-19 | 2010-10-19 | Método y dispositivo para el diagnóstico rápido de enfermedades en muestras fecales. |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP2631649A4 (es) |
| ES (1) | ES2380664B2 (es) |
| WO (1) | WO2012052586A1 (es) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015067913A1 (en) | 2013-11-07 | 2015-05-14 | Diagnodus Limited | Biomarkers |
| ES2385625B2 (es) | 2012-05-29 | 2013-09-25 | Certest Biotec, S.L. | Dispositivo para el diagnóstico rápido de enfermedades causadas por Clostridium difficile en muestras fecales |
| ES2441291B1 (es) * | 2012-07-02 | 2014-11-17 | Certest Biotec, S.L. | Método y dispositivo para el diagnóstico rápido de enfermedades causadas por Yersinia, en muestras fecales |
| CN103336132A (zh) * | 2013-07-08 | 2013-10-02 | 无锡安迪生物工程有限公司 | 一种检测泪液中乳铁蛋白的方法及其专用胶体金检测卡 |
| CN105131111B (zh) * | 2015-07-30 | 2018-03-27 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种人乳铁蛋白单克隆抗体对 |
| CN105021830B (zh) * | 2015-07-30 | 2017-03-15 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种人乳铁蛋白双抗夹心胶体金检测试纸条 |
| CN105181977A (zh) * | 2015-11-05 | 2015-12-23 | 四川沃文特生物技术有限公司 | 一种检测粪便中钙卫蛋白的试剂盒 |
| CN105842459A (zh) * | 2016-03-24 | 2016-08-10 | 泰州海路生物技术有限公司 | 快速定量检测粪便钙卫蛋白的免疫层析试剂盒 |
| CN105785041A (zh) * | 2016-04-05 | 2016-07-20 | 付国亮 | 用于定量检测钙卫蛋白的试纸条及其制备方法和钙卫蛋白浓度的测定方法 |
| CN109682979A (zh) * | 2019-01-30 | 2019-04-26 | 珠海市银科医学工程股份有限公司 | 一种钙卫蛋白联合乳铁蛋白抗原检测试纸条及其制备方法 |
| CN110068688B (zh) * | 2019-05-22 | 2020-08-14 | 福建农林大学 | 一种牛乳中乳铁蛋白竞争法纳米花免疫测流层析检测卡 |
| CN110244062A (zh) * | 2019-07-18 | 2019-09-17 | 珠海市医友生物科技有限公司 | 一种粪便钙卫蛋白或乳铁蛋白联合检测试剂及其制备方法 |
| WO2023180899A1 (en) * | 2022-03-21 | 2023-09-28 | Swain Manish Kumar | Device and method for detecting diarrhea |
| CN117430701A (zh) * | 2023-12-20 | 2024-01-23 | 南京佰抗生物科技有限公司 | 抗人钙卫蛋白的单克隆抗体组合物及应用 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0560411B1 (en) | 1987-04-27 | 2000-07-26 | Unilever N.V. | Specific binding assays |
| AU1870392A (en) | 1991-03-22 | 1992-10-21 | Valter Araujo | In vitro test for leukocytes in body fluids |
| US5552292A (en) | 1993-01-18 | 1996-09-03 | Ikagaku Co., Ltd. | Method of screening for colorectal cancer |
| US5455160A (en) | 1993-05-27 | 1995-10-03 | Fagerhol; Magne K. | Diagnostic test and kit for disease or disorders in the digestive system |
| IT1292163B1 (it) * | 1997-06-13 | 1999-01-25 | Giorgio Torelli | Dispositivo immunocromatografico a fissazione dell'analita |
| US6727073B1 (en) * | 1999-11-19 | 2004-04-27 | Binax, Inc. | Method for detecting enteric disease |
| AU2002902A (en) | 2000-11-14 | 2002-05-27 | Techlab Inc | Method for differentiating irritable bowel syndrome from inflammatory bowel disease (ibd) and for monitoring persons with ibd using total endogenous lactoferrinas a marker |
| JP2004251851A (ja) * | 2003-02-21 | 2004-09-09 | Japan Clinical Laboratories Inc | 糞便成分の検査方法 |
| WO2009054921A1 (en) * | 2007-10-19 | 2009-04-30 | Reiter Paul C | Semi-quantitative immunochromatographic device and method for the determination of hiv/aids immune-status via measurement of soluble cd40 ligand/cd 154, a cd4+ t cell equivalent |
| EP2212700B8 (en) | 2007-11-20 | 2011-10-12 | Roche Diagnostics GmbH | Method of assessing colorectal cancer from a stool sample by use of the marker combination calprotectin and hemoglobin/haptoglobin complex |
-
2010
- 2010-10-19 ES ES201031537A patent/ES2380664B2/es active Active
-
2011
- 2011-10-17 EP EP11833896.1A patent/EP2631649A4/en not_active Withdrawn
- 2011-10-17 WO PCT/ES2011/070714 patent/WO2012052586A1/es active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2012052586A1 (es) | 2012-04-26 |
| EP2631649A8 (en) | 2014-03-05 |
| EP2631649A1 (en) | 2013-08-28 |
| EP2631649A4 (en) | 2014-08-13 |
| ES2380664A1 (es) | 2012-05-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2380664B2 (es) | Método y dispositivo para el diagnóstico rápido de enfermedades en muestras fecales. | |
| JP6742978B2 (ja) | ラテラルフローおよび関連する免疫アッセイにおけるシグナル増幅 | |
| AU2016203292B2 (en) | Monoclonal antibody, and immunoassay using same | |
| CN107102135A (zh) | 用于减少非特异性结合的免疫检验方法和试剂 | |
| CN110361547B (zh) | 一种化学发光定量检测粪便潜血的试剂及其检测方法和其在检测下消化道健康的用途 | |
| BRPI1005176B1 (pt) | ensaio de insulina e reagente de ensaio de insulina | |
| Li et al. | A sandwich immunoassay for brucellosis diagnosis based on immune magnetic beads and quantum dots | |
| Zhang et al. | An indirect competitive fluorescence immunoassay for determination of dicyclohexyl phthalate in water samples | |
| ES2755679T3 (es) | Procedimientos de detección de un marcador de tuberculosis activa | |
| ES2846794T3 (es) | Anticuerpos policlonales específicos para el serogrupo X de N. meningitidis y usos de los mismos en el diagnóstico | |
| CN107677807A (zh) | 一种吉他霉素磁免疫化学发光检测试剂盒 | |
| CN105424941B (zh) | Akr1b10蛋白和用于肝硬化诊断的试剂盒 | |
| ES2842283T3 (es) | Métodos y composiciones para el diagnóstico y tratamiento de la meningitis | |
| KR101495225B1 (ko) | Ast 양의 측정을 통한 간 질환 진단, 예후 또는 모니터링 키트 및 방법 | |
| CN104931685A (zh) | 一种基于携带His标签重组抗原的发光免疫检测方法 | |
| Lu et al. | Development of an immunochromatographic strip for the rapid and ultrasensitive detection of gamithromycin | |
| JP2006234627A (ja) | 体液中の結核菌抗原を検出する方法 | |
| US20230055382A1 (en) | Detecting gut barrier dysfunction and/or cirrhosis | |
| CN103575878A (zh) | 一种水产品中氯霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN107533054A (zh) | 免疫测定方法以及用于所述方法的测定试剂 | |
| CN114181909B (zh) | 一种杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与试剂盒 | |
| JP2017036917A (ja) | ヘリコバクター・ピロリの検出方法 | |
| CN102998451B (zh) | 与肝病进程相关的检测试剂盒及其应用 | |
| EP3919509A1 (en) | Method for immunological analysis of free aim in biological sample | |
| JP2023030004A (ja) | アデノウイルスの免疫測定方法及び免疫測定器具 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2380664 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B2 Effective date: 20120913 |