CN105021830B - 一种人乳铁蛋白双抗夹心胶体金检测试纸条 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人乳铁蛋白双抗夹心胶体金检测试纸条，该免疫胶体金试纸包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫；所述基膜上设置有C线和T线，所述C线上包被有羊抗鼠IgG的抗体，所述金标垫中含有胶体金标记的第一单克隆抗体；所述T线上包被有第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO.10595的杂交瘤细胞株分泌得到，所述第二单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO.10594的杂交瘤细胞株分泌。本发明能够通过双抗夹心免疫试纸检测方法，对人乳铁蛋白的检测取得10ng/mL的灵敏度，对牛乳铁蛋白和羊乳铁蛋白不呈现交叉反应，并且对人溶菌酶转基因牛、人α‑乳清白蛋白转基因牛不呈现交叉反应。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种人乳铁蛋白双抗夹心胶体金检测试纸条。
背景技术
“硕鼠”的问世(Palmiter et al.,1982)，加速了转基因生物的研究。克隆绵羊“多莉”的诞生(Wilmut et al.,1997)，促进了转基因技术在哺乳动物方面的广泛应用。目前研制成功多种用于生产药用或食用蛋白、提高瘦肉率、改善营养、增强抗病力的转基因猪、牛、羊(Schnieke et al.,1997；Toledo et al.,2006)，其潜在的经济效益和社会效益巨大，具有良好的商品化前景。但是由于转基因生物及其产品存在风险，转基因生物及产品的管理一直受到各国政府的高度重视。
为了保护人类自身的健康和生存环境，包括我国在内的许多国家相继制定了转基因生物安全法规，对转基因生物及产品采用标识制度，对转基因食品进出境进行严格管理。要使这些法规、制度得以顺利实施，需要有效的检测技术做支撑。目前转基因生物及其加工食品的检测方法主要包括基因水平的检测和蛋白水平的检测，在蛋白检测方面，目前人乳铁蛋白的检测方法以ELISA检测法为主，但ELISA方法操作时间较长，而且需要酶标仪等专业设备，不适用于现场快速检测。因此建立一种快速、简便的检测方法很有必要。
目前最适用于现场检测的方法主要是免疫胶体金技术，免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如抗坏血酸、柠檬酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用形成一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团牢固结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
将双抗夹心试纸用于人乳铁蛋白的检测，能够实现人乳铁蛋白的快速简便地检测；但是，现有的抗人乳铁蛋白的抗体因敏感性和特异性较低且配对性较差，无法满足双抗夹心免疫试纸检测人乳铁蛋白的要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种敏感性和特异性较高人乳铁蛋白双抗夹心胶体金检测试纸条，该试纸条能够满足双抗夹心免疫试纸检测人乳铁蛋白的要求，实现对人乳铁蛋白的快速简便地检测。
为了实现上述目的，本发明提供了一种人乳铁蛋白双抗夹心胶体金检测试纸条，该免疫胶体金试纸包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫；所述基膜上设置有C线和T线，所述C线上包被有羊抗鼠IgG的抗体，所述金标垫中含有胶体金标记的第一单克隆抗体；所述T线上包被有第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由保藏编号为CGMCCNO.10595的杂交瘤细胞株分泌得到，所述第二单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO.10594的杂交瘤细胞株分泌得到。
通过上述技术方案，本发明能够通过双抗夹心免疫试纸检测方法，对人乳铁蛋白的检测取得10ng/mL的灵敏度，对牛乳铁蛋白和羊乳铁蛋白不呈现交叉反应，并且对人溶菌酶转基因牛、人α-乳清白蛋白转基因牛不呈现交叉反应，具有较高的敏感度和特异性。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物材料保藏
本发明的一株杂交瘤细胞株是本发明的发明人自行融合筛选得到的，其保藏编号为CGMCC NO.10595，保藏日期为2015年5月8日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为杂交瘤细胞株。
本发明的另一株杂交瘤细胞株是本发明的发明人自行融合筛选得到的，其保藏编号为CGMCC NO.10594，保藏日期为2015年5月8日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为杂交瘤细胞株。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是免疫胶体金试纸的结构示意图。
图2是试纸理论检测结果示意图。
图3为试纸条特异性试验检测图。
图4为部分阳性样品检测图。
图5为部分阴性样品检测图。
附图标记说明
1 样品垫 2 胶体金垫 3 基膜
4 吸收垫 5 T线 6 C线
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种人乳铁蛋白双抗夹心胶体金检测试纸条，该免疫胶体金试纸包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫；所述基膜上设置有C线和T线，所述C线上包被有羊抗鼠IgG的抗体，所述金标垫中含有胶体金标记的第一单克隆抗体；所述T线上包被有第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO.10595的杂交瘤细胞株分泌得到，所述第二单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO.10594的杂交瘤细胞株分泌得到。
其中，免疫胶体金试纸的检测原理可能包括：将待检样品滴入样品垫中，若样品中有人乳铁蛋白，待检样品中人乳铁蛋白先和胶体金标记的第一单克隆抗体(3B4)结合，由于毛细管作用，人乳铁蛋白和胶体金标记的第一单克隆抗体形成的复合体沿基膜向前泳动，到达检测线时遇到包被在硝酸纤维素基膜上的第二单克隆抗体(5C5)，由于第一单克隆抗体和第二单克隆抗体分别能结合人乳铁蛋白的不同抗原表位结合，从而形成“胶体金标记的第一单克隆抗体(3B4)-人乳铁蛋白-第二单克隆抗体(5C5)”复合体，从而使得胶体金富集在检测线上，形成特异性的红色层析线；没有和人乳铁蛋白结合的胶体金标记的第一单克隆抗体则会直接通过检测线，达到质控线后被质控线上的羊抗鼠IgG捕获，从而使得胶体金富集在质控线上形成红色层析线，即判为阳性结果；若样品中无人乳铁蛋白，由于无法在检测线上形成“胶体金标记的第一单克隆抗体(3B4)-人乳铁蛋白-第二单克隆抗体(5C5)”复合体，从而使得检测线上不会产生肉眼可见的颜色反应，没有和人乳铁蛋白结合的胶体金标记的第一单克隆抗体则会直接通过检测线，达到质控线后被质控线上的羊抗鼠IgG捕获，从而使得胶体金富集在质控线上形成红色层析线，即判为阴性结果。
本发明中，使用保藏编号为CGMCC NO.10595的杂交瘤细胞株和保藏编号为CGMCCNO.10594的杂交瘤细胞株分别制备和纯化第一单克隆抗体和第二单克隆抗体的方法可以为本领域常规的方法，例如小鼠腹水法和亲和层析法。
本发明中，将单克隆抗体进行胶体金标记的方法可以为本领域常规的方法，例如可以包括：将0.01重量％的HAuCl4溶液加热煮沸后加入1重量％的柠檬酸三钠溶液直至溶液的颜色完全变为透明的红色时，继续回流10min后停止加热，冷却至室温，即得到胶体金；取1ml制取好的胶体金，用1重量％的K2CO3调节pH值到8.0，加入8μg单克隆抗体，混合均匀，室温反应40min；加入5重量％的BSA至终浓度为0.1重量％，静置30min；先用低速(1500r/min)离心15分钟，弃去由凝聚的金胶粒形成的沉淀；然后用10000r/min离心30分钟；仔细吸出上清，沉淀物用0.1ml含1％BSA的0.1M PBS(PH7.4)复溶，加入5％叠氮钠至终浓度为0.05％，4℃保存。
本发明中，制备免疫胶体金试纸的方法可以为本领域常规的方法，例如可以包括：用喷金点膜机将第二单克隆抗体和羊抗鼠IgG喷于硝酸纤维素膜上，形成相互平行的检测T线和质控C线，然后烘干；将胶体金标记的第一单克隆抗体用喷金点膜机均匀的喷在金标垫上；然后将样品垫、金标垫、喷有T线和C线的基膜(硝酸纤维素膜)和吸水纸依次连接组装，而后裁切包装备用。
其中，所述金标垫中所含有胶体金标记的第一单克隆抗体可以是由5-100μg/mL胶体金标记的第一单克隆抗体溶液以0.5-5μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在金标垫上干燥后得到的。
其中，所述T线上包被的第二单克隆抗体可以是由0.2-5mg/mL的第二单克隆抗体溶液以0.2-4μL/cm的喷涂速度喷涂在T线上干燥后得到的。
其中，所述C线上包被的羊抗鼠IgG的抗体可以是由0.2-5mg/mL的羊抗鼠IgG的抗体溶液以0.2-4μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在C线上干燥后得到的。
以下通过实施例进一步详细说明本发明：
实施例1
本实施例用于说明人乳铁蛋白双抗夹心胶体金检测试纸条所用的抗体对的筛选。
人乳铁蛋白(hLF)的蛋白序列如NCBI Genbank序列号：U95626所示。按照文献(Penghua Yang,et al.,Cattle Mammary Bioreactor Generated by a Novel Procedureof Transgenic Cloning for Large-Scale Production of Functional HumanLactoferrin.,PLoS ONE,2008,3(10),e3453)中的方法获得人乳铁蛋白(hLF)的转基因乳牛。
向转基因乳牛肌肉注射催乳针(购自西安草滩制药厂生产的***牛催乳针，该产品为盒装，I号针10支，II号针3支)进行催乳，其中I号针连续肌肉注射10天，每日一次。II号针在第13、15、17天各注射一支。从注射7天开始每天温水按摩转基因乳牛***，II号针注射完毕后开始人工挤乳两周，每天两次，得到奶样。
将奶样于4℃、4500rpm离心15min后取出，可见上层为凝固的乳脂，将下层液体吸出并转移到另一个离心管。将脱脂乳用1M盐酸调节pH值至3.8-4.6，使得酪蛋白沉淀出来，其中脱脂乳与1M的HCl的体积比为25：1；然后将调好pH值的奶样于4℃、5000rpm离心12min。取出，沉淀为酪蛋白，上清液为乳清蛋白，将上清液转移到另一离心管。用1M的NaOH水溶液将上清液的pH值调回至7.5，其中上清液与1M的NaOH水溶液的体积比为25:1。将调好pH值的奶样于4℃、5000rpm离心15min，将离心后的上清收集，得到纯化的乳清。
使用HiLoadTM 16/10SP Sepharose High performance色谱柱，将其预先用0.4M的NaCl、20mM的Na3PO4(pH7.5)平衡5个柱体积。15ml脱脂乳通过注射器上样，进入上样环。用0.4M的NaCl、20mM的Na3PO4(pH7.5)平衡5个柱体积，未结合的蛋白收集到一离心管中，用0.4M-1M的NaCl、20mM的Na3PO4(pH7.5)洗脱15个柱体积，收集分离到的各个峰值蛋白，并合并同一峰值的洗脱液。再用1M的NaCl、20mM的Na3PO4(pH7.5)继续洗脱2个柱体积，最后用1M的NaCl、20mM的Na3PO4(pH7.5)洗脱5个柱体积。上述操作均在AKTA purifer10液相色谱仪上进行。最后得到在0.6M的NaCl的洗脱峰。收集该洗脱峰的洗脱液并进行超滤浓缩和冷冻干燥，然后经N端测序和蛋白电泳，证明该洗脱峰为重组提纯的人乳铁蛋白(hLF)。
用提纯的人乳铁蛋白(hLF)免疫雌性BALB/c小鼠，取脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，经ELISA法进行阳性克隆筛选、通过有限稀释法进行亚克隆，获得稳定分泌抗hLF单克隆抗体的10个克隆的细胞株。将这些杂交瘤细胞株分别注射至小鼠腹腔，收集腹水，亲和柱纯化得10种单克隆抗体。
将这10种单克隆抗体两两组合得到45个组合，将各个组合分别制备胶体金免疫试纸，具体地，将每一个组合中的一个抗体进行胶体金标记并制备金标垫，另外一个抗体用于制备T线。
胶体金的制备方法包括：将0.01重量％的HAuCl4溶液加热煮沸后加入1重量％的柠檬酸三钠溶液直至溶液的颜色完全变为透明的红色时，继续回流10min后停止加热，冷却至室温，即得到胶体金。将单克隆抗体进行胶体金标记的方法包括：取1ml制取好的胶体金，用1重量％的K2CO3调节pH值到8.0，加入8μg单克隆抗体，混合均匀，室温反应40min；加入5重量％的BSA至终浓度为0.1重量％，静置30min；先用低速(1500r/min)离心15分钟，弃去由凝聚的金胶粒形成的沉淀；然后用10000r/min离心30分钟；仔细吸出上清，沉淀物用0.1ml含1％BSA的0.1M PBS(pH7.4)复溶，加入5％叠氮钠至终浓度为0.05％，4℃保存。
用喷金点膜机将第二单克隆抗体和羊抗鼠IgG喷于硝酸纤维素膜上，形成相互平行的检测T线和质控C线，然后烘干；将胶体金标记的第一单克隆抗体用喷金点膜机均匀的喷在金标垫上；然后如图1所示，将样品垫、金标垫、喷有T线和C线的基膜(硝酸纤维素膜)和吸水纸依次连接组装，而后裁切包装备用。共得到45种免疫胶体金试纸。对于金标垫，喷金点膜机的喷涂速度为2.0μL/cm。对于T线和C线，喷金点膜机的喷涂速度为1μL/cm，T线为浓度1mg/mL的第二单克隆抗体，C线为浓度1mg/mL的羊抗鼠IgG抗体。
将人乳铁蛋白的PBS溶液作为阳性样本，将牛乳铁蛋白PBS溶液作为阴性样本，对上述45种免疫胶体金试纸进行筛选。去除44种对人乳铁蛋白呈现阴性反应或对牛乳铁蛋白呈现阳性反应的免疫胶体金试纸，最终得到一种免疫胶体金试纸，该免疫胶体金试纸能够对10ng/mL的人乳铁蛋白PBS溶液呈现阳性反应，并且对100μg/mL的牛乳铁蛋白PBS溶液不呈现阳性反应。该免疫胶体金试纸即为本实施例筛选得到的免疫胶体金试纸。该免疫胶体金试纸所用的第一单克隆抗体是由杂交瘤细胞株3B4分泌得到的，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.10595；该免疫胶体金试纸所用的第二单克隆抗体是由杂交瘤细胞株5C5分泌得到的，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.10594。经鉴定这两株株单克隆抗体亚型均为IgG1+kappa。
实施例2
本实施例用于说明本发明的人乳铁蛋白双抗夹心胶体金检测试纸条(即实施例1筛选得到的免疫胶体金试纸)在检验实际样本时的敏感性和特异性。
(1)样品制备：采集的牛奶、溶解的奶粉及液态乳制品。取约200μl的牛奶样品加入样品管中。
(2)检测：取出实施例1筛选得到的免疫胶体金试纸试纸条，室温平衡20分钟，打开包装取出试纸条，将试纸条按照箭头方向***样品管中，静置10-15分钟，判定结果。
(3)结果判定：当时纸条出现肉眼可见的***质控线，没有出现肉眼可见的***检测线，判为阴性，记为“－”；当试纸条出现肉眼可见的***质控线，同时出现肉眼可见的***检测线，判为阳性，记为“+”；检测线颜色深度与待检抗原量成正比，颜色越深说明待检抗原含量越高，质控线无条带则判为试纸条失效。判定结果示意图见附图2。
选用购买的Sigma人乳铁蛋白标准品(纯化)的PBS溶液、人乳铁蛋白标准品(重组表达)的PBS溶液、购买的Sigma牛乳铁蛋白标准品的PBS溶液、购买的Sigma羊乳铁蛋白标准品的PBS溶液、以及购买的Sigma人溶菌酶标准品的PBS溶液和购买的Sigma人α-乳清白蛋白标准品的PBS溶液进行特异性测定，检测结果如表1，结果表明，该试纸条可以特异性识别人乳铁蛋白，但与牛乳铁蛋白、羊乳铁蛋白、人溶菌酶和人α-乳清白蛋白不呈现阳性反应。部分检测结果如图3所示。
表1试纸条特异性试验结果
将人乳铁蛋白标准品(纯化)和人乳铁蛋白标准品(重组表达)进行梯度稀释，用胶体金试纸条进行灵敏度检测，检测结果见表2，表2结果显示，试纸条的灵敏度可达10ng/mL。
表2试纸条灵敏度试验结果
实施例3
采集140份已知人乳铁蛋白阴性的牛奶(其中包括100份采集自位于河北大厂的奶牛养殖场的非转基因奶牛，20份位于中国农业大学的奶牛养殖场的转人溶菌酶的转基因奶牛和20份位于中国农业大学的奶牛养殖场的转人α-乳清白蛋白的转基因奶牛)、和22份已知人乳铁蛋白阳性牛奶(采集自位于中国农业大学的奶牛养殖场，转人乳铁蛋白基因奶牛)，共162份样品，用实施例1筛选得到的免疫胶体金试纸进行盲测，测定结果显示140份已知人乳铁蛋白阴性的牛奶均显示为检测阴性，22份已知人乳铁蛋白阳性牛奶均显示为检测阳性，试纸条的诊断特异性为100％。部分测定结果图见图4和图5所示。
根据实施例1-3的数据可见，本发明能够通过双抗夹心免疫试纸检测方法，对人乳铁蛋白的检测取得10ng/mL的灵敏度，对牛乳铁蛋白和羊乳铁蛋白不呈现交叉反应，并且对人溶菌酶转基因牛、人α-乳清白蛋白转基因牛不呈现交叉反应，具有较高的敏感度和特异性。这可能是由于本发明的人乳铁蛋白双抗夹心胶体金检测试纸条所用的单克隆抗体对能够高灵敏且高特异性地识别人乳铁蛋白，并且本发明的两个单克隆抗体能够分别针对不同的抗原决定簇，由此特别适合用于双抗夹心免疫试纸的检测。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (4)
1.一种人乳铁蛋白双抗夹心胶体金检测试纸条，该人乳铁蛋白双抗夹心胶体金检测试纸条包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫；其特征在于，所述基膜上设置有C线和T线，所述C线上包被有羊抗鼠IgG的抗体，所述金标垫中含有胶体金标记的第一单克隆抗体；所述T线上包被有第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO.10595的杂交瘤细胞株分泌得到，所述第二单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO.10594的杂交瘤细胞株分泌得到。
2.根据权利要求1所述的人乳铁蛋白双抗夹心胶体金检测试纸条，其中，所述金标垫中所含有胶体金标记的第一单克隆抗体是由5-100μg/mL胶体金标记的第一单克隆抗体溶液以0.5-5μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在金标垫上干燥后得到的。
3.根据权利要求1所述的人乳铁蛋白双抗夹心胶体金检测试纸条，其中，所述T线上包被的第二单克隆抗体是由0.2-5mg/mL的第二单克隆抗体溶液以0.2-4μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在T线上干燥后得到的。
4.根据权利要求1所述的人乳铁蛋白双抗夹心胶体金检测试纸条，其中，所述C线上包被的羊抗鼠IgG的抗体是由0.2-5mg/mL的羊抗鼠IgG的抗体溶液以0.2-4μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在C线上干燥后得到的。
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