ES2380664A1 - Método y dispositivo para el diagnóstico r�?pido de enfermedades en muestras fecales. - Google Patents
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Abstract
Método de diagnóstico rápido y dispositivo para llevarlo a cabo que, mediante la aplicación de una muestra de heces dispersada en un diluyente, permite la detección simultánea y diferenciada de lactoferrina y calprotectina fecales mediante la formación de conjugados con partículas coloreadas y su captura en una membrana porosa.
Description
La presente invencion se encuadra dentro del area de la biotecnologfa v en concreto en el diagnostico de enfermedades gastrointestinales. El objeto de la invencion es un procedimiento
5 rapido v sencillo de deteccion de lactoferrina (hLf) v calprotectina (hCp) fecales como marcadores para el diagnostico de la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), la diarrea infecciosa (ID) v el cancer colorrectal (CRC).
Enfermedad inflamatoria intestinal
10 Enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) es un termino amplio para describir ciertas enfermedades que se caracterizan por una inflamacion idiopatica v cronica del tracto digestivo. La enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) incluve la enfermedad de Crohn (CD), colitis ulcerosa (UC) v un tipo no especffico o indeterminado de colitis (IC).
En muchas ocasiones v debido a que presentan mucha similitud en sus sfntomas, la IBD es
15 muv diffcil de distinguir del sfndrome del intestino irritable (IBS). Este ultimo es una enfermedad benigna, en contraposicion a la IBD pero cuvos sfntomas son muv semejantes a las de la IBD.
Los procesos inflamatorios como la IBD suelen estar asociados a la presencia de leucocitos. Para un diagnostico fiable se ha identificado diversos posibles marcadores de la enfermedad.
20 En la patente europea EP0641441 se describe una prueba in vitro para la determinacion de leucocitos en muestras de heces utilizando un inmunoensavo con anticuerpos antilactoferrina. En la patente US7192724 va se describe un metodo para diferenciar IBD de IBS midiendo la concentracion de lactoferrina en heces utilizando un inmunoensavo tipo ELISA. Incluso se ha establecido que esa concentracion puede ser util para monitorizar el desarrollo
25 de la enfermedad (Patente US7560240).
Por otra parte, la patente US5455160 revela un metodo inmunologico para el despistaje de la IBD v CRC usando un ensavo ELISA para determinar calprotectina en muestras de heces.
Se han descrito otros posibles marcadores para el diagnostico de la IBD entre los que destacan ANCA v ANSA aunque los mejores resultados se obtienen con lactoferrina v calprotectina fecales (Turkav, C. et Kasapoglu, B. CLINICS 2010; 65(2):22131). Vieria, A. et al. (BMC Research Notes 2009, 2:221) indica que tanto la medida de la lactoferrina como de la calprotectina fecales por ELISA son marcadores altamente sensibles v especfficos de la IBD v correlacionan con el grado de inflamacion. Por ultimo Gisbert, J. et al. (Inflamm Bowel Dis 2009; 15:11901198) determina que la medida por separado de ambos marcadores es util en la prediccion de una recafda en pacientes con CD o UC.
Acompanando a estas patentes v resultados experimentales existen en el mercado tanto pruebas ELISA como test inmunocromatograficos (IC) para la determinacion por separado de lactoferina v calprotectina. El LEUKO EZ VUE™ de Techlab (Blacksburg, VA) es un test inmunocromatografico (IC) para la deteccion cualitativa de niveles elevados de lactoferrina en muestras de heces. El Prevent ID Caldetect de Preventis (Bensheim, Alemania) es un test IC semicuantitativo para la deteccion de calprotectina en heces para la diferenciacion de IBD de IBS, al igual que el Quantum Blue Calprotectin Rapid Test de BLhlmann (Basilea, Suiza).
En todo lo descrito hasta ahora los inmunoensavos para calprotectina v lactoferrina son distintos, es decir, se hace por un lado un inmunoensavo para calprotectina v otro para lactoferrina, lo que significa que hav que preparar muestras distintas, en diluventes distintos, v realizar ensavos distintos v esto implica:
- a.
- Un mavor gasto de tiempo.
- b.
- Un mavor numero de manipulaciones con el inherente riesgo de error.
c. Los resultados obtenidos para los dos parametros no se correlacionan directamente puesto que provienen de dos tomas de muestra diferentes.
El objeto de la presente invencion es un test rapido del tipo IC para la determinacion simultanea v diferenciada de calprotectina v lactoferrina en muestras fecales que presenta las siguientes ventajas:
- a.
- Se prepara una unica muestra. Cuando ambas protefnas se analizan por separado hav dos muestras diferentes en diluventes diferentes.
- b.
- Se ensavan simultaneamente con lo que se reduce el tiempo de ensavo v el numero de manipulaciones, reduciendose asf el riesgo de error. La determinacion simultanea de dos marcadores hace que la prueba sea mas sensible.
- c.
- La determinacion es diferenciada, es decir, se visualiza en una lfnea la presencia de lactoferrina v en otra lfnea distinta la presencia de calprotectina. La determinacion diferenciada de dos marcadores hace que la prueba pueda ser mas especffica.
- d.
- Se utiliza un vial especffico que permite la toma de la muestra de forma cuantitativa v su dispersion en el diluvente de manera facil e higienica.
Diarrea infecciosa (ID)
Otro de los casos de aplicacion de la presente invencion es la gestion de la diarrea aguda. Aunque el origen de la diarrea puede ser muv diverso, es importante discernir si se trata de un proceso no invasivo (autolimitado, no inflamatorio) de un proceso invasivo (agresivo, inflamatorio). El tratamiento del primero se limita a una terapia de rehidratacion v reposicion de electrolitos mientras que el segundo requiere tratamiento especifico usualmente con agentes antimicrobianos.
Las diarreas con procesos inflamatorios suelen estar causadas por Salmonella, Shigella, Campylobaeter jejuni o Clostridium diffieile. El diagnostico de estas se hace por cultivo de las heces e identificacion de los patogenos. El cultivo es una tecnica larga v costosa. Choi, S.W. et al. (Journal of Clinical Microbiologv, 1996:928932) proponen el uso de un latex de aglutinacion para detectar la presencia de lactoferrina en muestras de heces como metodo de despistaje para evitar el cultivo en caso de diarreas agudas.
Shastri, Y.M., et al. (Am J Med. 2008, 121(12):1099106) describen que la determinacion de calprotectina fecal muestra una alta correlacion con infecciones bacterianas que producen diarrea v propone su determinacion como metodo de despistaje rapido de la diarrea infecciosa antes de proceder al cultivo.
En la patente US6727073 se describe un test IC para el diagnostico de la diarrea infecciosa que detecta simultaneamente lactoferrina v uno o varios antfgenos de las bacterias que pueden causarla, a saber, Salmonella, E. eoli 0157, Listeria, Yersinia, Shigella, Campylobaeter jejuni o Clostridium diffieile.
El dispositivo de la presente invencion permite la deteccion simultanea v diferenciada de lactoferrina v calprotectina fecales v constituve una herramienta en el diagnostico v el manejo de los casos de diarrea aguda.
Cancer colorrectal (CRC).
El cancer colorrectal es una enfermedad en la que las celulas malignas se localizan en la porcion intermedia v mas larga del intestino grueso. Una de las herramientas diagnosticas mas utilizadas para el despistaje del CRC es le deteccion de sangre oculta en heces (FOB). La forma mas sensible v especffica es un inmunoensavo para la deteccion de la hemoglobina va sea en forma de ELISA o test rapido (IC).
La patente US5552292 muestra un metodo de diagnostico del CRC consistente en un inmunoensavo tipo ELISA para la deteccion de lactoferrina o mieloperoxidasa en heces.
El documento WO 2009/065551 A1 revela un metodo de diagnostico del cancer colorrectal (CRC) a partir de muestras de heces usando como marcadores calprotectina v el complejo hemoglobinahaptoglobina.
El dispositivo de la presente invencion que permite la deteccion simultanea v diferenciada de lactoferrina v calprotectina fecales, constituve una herramienta util en el diagnostico v el despistaje del cancer colorrectal (CRC).
El metodo de diagnostico de la presente invencion consiste en: la toma de una porcion representativa de la muestra de heces, su dispersion en un diluvente especffico, la aplicacion de esta dispersion de la muestra en un dispositivo inmunocromatografico especffico, la formacion de complejos entre los anticuerpos del dispositivo v los antfgenos de la muestra v la visualizacion de estos complejos en la membrana del dispositivo.
El dispositivo inmunocromatografico utilizado es de un solo uso. No se requiere ningun tipo de instrumentacion para llevar a cabo el metodo o interpretar el resultado. Como muestra se utilizan heces.
El tiempo de preparacion de la muestra son unos dos minutos v el tiempo de desarrollo de la prueba es de 5 a 10 minutos, lo que significa entre 10 v 20 veces menos que los ensavos EIA (ELISA), mucho mas complejos de llevar a cabo v necesitan de instrumentacion de laboratorio.
Por su sencillez la prueba se puede llevar a cabo en la consulta del medico, e incluso, con las instrucciones adecuadas, por el propio paciente.
El metodo de la invencion es util para el diagnostico de la IBD v su diferenciacion de la IBS. Este ultimo es una enfermedad benigna cuvos sfntomas son muv semejantes a las de la IBD.
Ante un caso de diarrea aguda, el metodo de la invencion es util para determinar de forma rapida si esta tiene caracter inflamatorio e invasivo v lo tanto hav que proceder al cultivo v/o a un tratamiento con agentes antimicrobianos.
En el caso del diagnostico de CRC, la prueba de la invencion es adecuada para establecer procedimientos de vigilancia precoz de aparicion de la enfermedad especialmente en grupos de alto riesgo (edad, antecedentes familiares,.).
Figura 1: Esquema de las etapas del metodo de diagnostico. El dispositivo o vial especffico para la toma de muestras fecales (Figura 1A) es un vial de plastico de unos 2 mL de capacidad, en el que previamente se ha dispensado 1 ml de diluvente, con un tapon a rosca que dispone de un vastago cuvo extremo, disenado al efecto, permite la recoleccion cuantitativa de una muestra de heces (Figura 1B) solidas o semisolidas v su introduccion en el vial. Tras esto, se cierra v se agita vigorosamente (Figura 1C) hasta la completa dispersion de la muestra. Por ultimo, se rompe la parte opuesta del dispositivo (Figura 1D) v se anaden unas gotas sobre el lugar de aplicacion de la muestra del dispositivo inmunocromatografico (Figura 1E).
Figura 2: Vistas del dispositivo inmunocromatografico.
Figura 2A: Vista superior del dispositivo inmunocromatografico en formato tira. Dicha tira incluve los siguientes elementos: un material absorbente (1), una membrana porosa (2) con una lfnea de control (3), una lfnea para la deteccion de calprotectina (4) v otra lfnea para la deteccion de lactoferrina (5), un lugar de aplicacion de la muestra (6) v un lugar para el conjugado anticuerpomarcador (7).
Figura 2B: Vista de la seccion del dispositivo inmunocromatografico en formato tira en la que se distinguen ademas de los elementos descritos en la Figura 2A, el soporte plastico (8).
Figura 2C: Vista provectada del dispositivo inmunocromatografico, en la que se distinguen los elementos descritos en la Figuras 2A v 2B.
Los dispositivos inmunocromatograficos para la deteccion tanto de antfgenos como de anticuerpos han sido descritos anteriormente (por ejemplo, en la patente EP 1248112).
En la presente invencion se trata de una prueba de de tres lfneas: una de control, otra para la deteccion de lactoferrina v otra para la deteccion de calprotectina.
10 En una realizacion preferente se utiliza un unico anticuerpo monoclonal anti -calprotectina. Este anticuerpo monoclonal (CA1) se ha desarrollado utilizando calprotectina altamente purificada. El anticuerpo monoclonal obtenido presenta una elevada afinidad v especificidad frente al complejo formado por las dos subunidades de la calprotectina mientras que apenas se une a cada una de las subunidades por separado.
15 Tambien en una realizacion preferente, se utilizan anticuerpos policlonales de conejo antilactoferrina humana. Estos anticuerpos se han obtenido inmunizando conejos con lactoferrina humana purificada v posteriormente han sido purificados por cromatograffa de afinidad frente al mismo antfgeno (lactoferrina humana purificada).
Con los anticuerpos descritos, se preparan, por separado, conjugados con nanopartfculas
20 coloreadas. Estas nanopartfculas son depositadas en uno de los materiales del dispositivo inmunocromatografico v actuan como fase movil. Los mismos anticuerpos son inmovilizados por separado sobre la membrana porosa que actua como fase fija v en la que se produce la captura inmunologica por separado de la lactoferrina v calprotectina humanas. La membrana v el material con el conjugado son montados con la avuda de otros materiales sobre un soporte
25 plastico que se corta en forma tira.
Para la realizacion del ensavo se resuspende la muestra de heces en el diluvente de dispersion de la muestra en una proporcion aproximada 1/100. Si la muestra es liquida 10 µL de muestra se mezclan con 1 mL del diluvente. Si la muestra es solida se separan 10 mg de muestra con la avuda de una espatula v se dispersan en 1 mL de diluvente. Resulta muv conveniente la utilizacion del vial de toma de muestra en el se introduce la muestra con la avuda de un vastago tras lo que se cierra con el tapon a rosca v se agita vigorosoramente para posteriormente romper la parte superior del tapon v anadir 45 gotas sobre el punto de aplicacion de la muestra del dispositivo inmunocromatografico. El diseno del vastago es tal que al pasar por el orificio reductor del vial permite la introduccion de una cantidad predeterminada de la muestra de heces, en este caso 10 mg.
Tras la aplicacion de la muestra se esperan 10 minutos para visualizar las lfneas v se interpreta el resultado. El test se considera negativo si solo aparece una sola lfnea, la de control (por ejemplo, verde) en la ventana de resultados; positivo para calprotectina si ademas de la lfnea de control aparece una lfnea en la posicion de la calprotectina (por ejemplo, azul); positivo para lactoferrina si ademas de la lfnea de control aparece una lfnea en la posicion de la lactoferrina (por ejemplo, roja); v positivo para ambas (hLf v hCp) si aparecen tres lfneas (por ejemplo, una verde, una roja v una azul)
Ejemplo 1:
Preparaeion y purifieaeion de antieuerpos monoelonales anti-ealproteetina
El anticuerpo monoclonal CA1 se obtuvo a partir del hibridoma del mismo nombre. La obtencion del hibridoma productor del anticuerpo monoclonal CA1 se realizo mediante protocolos conocidos segun el metodo de fusion celular v seleccion de los clones obtenidos que fue inicialmente descrito por Kohler v Milstein en 1975 (Kohler G, Milstein C. Continuous eultures of fused eells seereting antibody of predefined speeifieity. Nature. 1975 Aug 7;256 (5517):4957).
Ratones del tipo BALB/c fueron inmunizados con calprotectina purificada (ProtEra S.r.l., Florencia, Italia). Los linfocitos de los ratones inmunizados fueron fusionados con celulas mielomicas de la linea SP20 v los hibridomas obtenidos fueron seleccionados mediante tecnicas ELISA de la siguiente manera: los pocillos de una placa microtiter de 96 pocillos fueron tapizados con anticuerpo policlonal de conejo anticalprotectina en tampon carbonato 100 mM de pH 9 a 37 grados durante 2 h. A estos pocillos se anadio la calprotectina purificada. Tras su lavado se anaden las distintas muestras de cultivo de hibridomas v la presencia del anticuerpo anticalprotectina se revela utilizando un conjugado antimIgG con peroxidada v el sustrato correspondiente.
Se seleccionaron los hibridomas que mavor afinidad v mejor especificidad presentaron. Entre estos se seleccionaron los mas productores v los que mejores prestaciones ofrecieron en los test de estres termico v velocidad de reaccion frente al antfgeno.
El hibridoma seleccionado CA1 fue cultivado en medio RPMIHT durante varios dfas a 37 grados centfgrados con 5% de CO2. A partir del medio de cultivo fue purificado el anticuerpo por cromatograffa de afinidad a protefna A segun las instrucciones del fabricante de la columna (GE Healthcare) tras lo que fue dializado en PBS de pH 7,4.
Ejemplo 2:
Preparaeion y purifieaeion de antieuerpos polielonales anti-laetoferrina
La lactoferrina humana fue purificada a partir del producto comercial Laetoferrin from human milk (L0520 SigmaAldrich) por cromatograffa de intercambio ionico hasta una pureza superior al 99% por SDSPAGE.
Inmunizacion de conejos.
La inmunizacion se realiza por vfa intradermica (dfa 1), inoculando 250 Ig de lactoferrina purificada en 0,5 mL de PBS al que se le anaden 0,5 mL de Advuvante Completo de Freund. Despues del la inmunizacion se administran dosis de recuerdo cada tres semanas hasta completar un total de tres. En cada dosis se administran 250 Ig de antfgeno en un volumen de 0,5 ml por vfa intramuscular (al que se le anaden 0,5 mL de Advuvante Incompleto de Freund).
Dos semanas despues de la administracion de cada dosis de recuerdo se procede a realizar la sangrfa para la obtencion de los diferentes sueros. La sangre se extrae por puncion de la arteria auricular. De cada sangrado se obtienen entre 15 v 30 ml de sangre completa (que equivalen a 7 v 15 ml de suero). Este suero se congela hasta su posterior purificacion.
Purificacion de los anticuerpos por afinidad.
Se prepara una columna HiTrap NHSactivated HP de 5 mL (GE Healthcare) con 5 mg de lactoferrina purificada segun las instrucciones del fabricante. Por dicha columna se hacen pasar 10 mL de suero hiperinmune de conejo v se lava con PBS hasta que la absorbancia a 280 nm es inferior a 0.050. Los anticuerpos son elufdos en un tampon glicina 250 mM de pH 2,75 v se recogen fracciones que son inmediatamente neutralizadas con tampon fosfato v posteriormente dializadas en PBS. La concentracion se determina por su absorbancia a 280 nm.
Ejemplo 3:
Preparaeion de los eonjugados
Calprotectina
Se prepara un conjugado del anticuerpo CA1 con micropartfculas de poliestireno. Se utilizan partfculas coloreadas con grupos carboxilo en su superficie de 200 nm de diametro nominal (K1 020 de la marca Estapor, Merck, Darmstadt, Alemania). 1 mL de partfculas al 10 % se lavan por centrifugacion v resuspension en tampon MES (acido 2(Nmorfolino)etanosulfonico) 10 mM de pH 6 v se le anade EDC (1etil3(3dimetilaminopropil)carbodiimida) hasta una concentracion de 5 mM. Se incuba 1h a 37 grados v se retira el exceso de reactivo por centrifugacion. Las partfculas asf activadas se resuspenden en MES 10 mM de pH 6 v se les anade el anticuerpo monoclonal anticalprotectina hasta una concentracion superficial de 2 mg/m2 tras lo que se incuban 18 h a 4 grados v posteriormente se lavan en Tween 20 al 0,1%.
Lactoferrina
De la misma manera, se prepara un conjugado del anticuerpo policlonal antilactoferrina purificado por afinidad con micropartfculas de poliestireno. Se utilizan partfculas coloreadas con grupos carboxilo en su superficie de 300 nm de diametro nominal (K1 030 de la marca Estapor, Merck, Darmstadt, Alemania). Igualmente, 1 mL de partfculas al 10 % se lavan por centrifugacion v resuspension en tampon MES (acido 2(Nmorfolino)etanosulfonico) 10 mM de pH 6 v se le anade EDC (1etil3(3dimetilaminopropil)carbodiimida) hasta una concentracion de 5 mM. Se incuba 1h a 37 grados v se retira el exceso de reactivo por centrifugacion. Las partfculas asf activadas se resuspenden en MES 10 mM de pH 6 v se les anade el anticuerpo policlonal antilactoferrina purificado por afinidad hasta una concentracion superficial de 1 mg/m2 tras lo que se incuban 4 h a 37 grados v posteriormente se lavan en Tween 20 al 0,1%.
Los conjugados con partfculas para lfnea de control se obtienen de la misma manera pero utilizando streptavidina (S4762, SigmaAldrich) a una concentracion superficial final de 1 mg/m2.
Una mezcla de los tres conjugados con partfculas descritos en concentraciones de 0,02%, 0,04% v 0,05% respectivamente, se diluven en una solucion que contiene sacarosa 10%, casefna bovina 2%, PEG6000 1% v Tween20 2% en tampon TRIS (tris(hidroximetil)aminometano) de pH 8. Esta solucion se deposita a razon de 15 uL/cm en un material bobinado de fibras de poliester no entretejidas de 29 mm de ancho que se seca en corriente de aire a 45 grados tras la deposicion (5 min) v durante 24 h en una camara a 30 grados v 20 % de humedad relativa.
Ejemplo 4:
Preparaeion de las lfneas de test y eontrol.
Los anticuerpos antilactoferrina, anticalprotectina v antistreptavidina (para la lfnea de control) se dializan en PBS, se llevan a una concentracion entre 0,5 v 1 mg/mL v se depositan linealmente de forma paralela sobre una membrana de nitrocelulosa laminada (Millipore HiFlow Plus) de 25 mm de ancho v de tamano de poro entre 10 v 30 micrometros a razon de 1 microL/cm tras lo cual se seca en corriente de aire a 45 grados tras la deposicion (2 min) e inmediatamente despues durante 24 h en una camara a 30 grados v 20 % de humedad relativa.
Ejemplo 5.
Montaje del test inmunoeromatografieo.
El material con el conjugado, la membrana v el material absorbente se montan conforme indica la figura 2 sobre un soporte plastico con una lamina adhesiva v las tiras son cortadas transversalmente a su montaje a una anchura de 4 mm.
Se prepara una solucion para la dispersion de las muestras de heces consistente en una disolucion acuosa de cloruro de sodio 300 mM, Triton X100 al 1%, anticuerpos IgG inespecfficos de raton 100 microgr/mL v anticuerpos IgG inespecfficos de conejo a 200 microgr/mL en un tampon TRIS 200 mM a un pH de 9. Esta preparacion de dispensa en viales
5 para la toma de muestra a razon de 1 mL/vial.
Ejemplo 6.
Deteeeion ealproteetina y laetoferrina feeales
Para que el dispositivo de la invencion tenga una adecuada utilidad diagnostica es necesario utilizar unos valores de corte, es decir, la concentracion de analito por encima de la cual el test 10 es positivo v por debajo de la cual el test es negativo. En el caso de la calprotectina el valor de
corte es 50 microgr hCp/gr de heces v para la lactoferrina es 10 microgr hLf/gr de heces.
Debido a la existencia del valor de corte, es necesario tomar la muestra de heces de forma cuantificada. Para ello se utiliza un vial especifico para la toma de muestra fecales que contiene un vastago con hendiduras para la muestra v un reductor para eliminar la muestra
15 sobrante de manera que el sistema ha sido calibrado para que se introduzcan en el vial exactamente 10 mg de muestra fecal. Por otro lado, v puesto que el vial contiene 1 mL de diluvente, se puede cuantificar la concentracion de la muestra.
Calprotectina:
Se prepararan diluciones seriadas 1/2 de calprotectina en el diluvente de dispersion de
20 muestras descrito en el apartado anterior. 100 µL de estas diluciones se aplican a los dispositivos inmunocromatograficos de la invencion v se deja progresar el ensavo durante 10 minutos a temperatura ambiente (25 QC) tras lo cual se procede a interpretar el resultado mediante apreciacion visual de aparicion de la lfnea de test. Se realiza la misma operacion pero diluvendo la calprotectina en un pool de muestras de heces resuspendidas aprox. 1/100 en el
25 mismo tampon. Los resultados se muestran en la tabla 1.
Tabla 1
- ngr hCp/ml
- En diluyente En heces gr hCp/gr heces
- 16000
- + + 1600
- 8000
- + + 800
- 4000
- + + 400
- 2000
- + + 200
- 1000
- + + 100
- 500
- + + 50
- 250
- 25
- 125
- 12,5
- 0
- 0
Lactoferrina:
Se prepararan diluciones seriadas 1/2 de lactoferrina en el diluvente de dispersion de muestras descrito en el apartado anterior. 100 microL de estas diluciones se aplican a los
5 dispositivos inmunocromatograficos de la invencion v se deja progresar el ensavo durante 10 minutos a temperatura ambiente (25 QC) tras lo cual se procede a interpretar el resultado mediante apreciacion visual de aparicion de la lfnea de test. Se realiza la misma operacion pero diluvendo la lactoferrina en un pool de muestras de heces resuspendidas aprox. 1/100 en el mismo tampon. Los resultados se muestran en la tabla 1.
10 Tabla 2
- ngr hlf/ml
- En diluyente En heces gr hlf/gr heces
- 3200
- + + 320
- 1600
- + + 160
- 800
- + + 80
- 400
- + + 40
- 200
- + + 20
- 100
- + + 10
- 50
- 5
- 25
- 2,5
- 0
- 0
Una muestra de heces que contenga una concentracion de calprotectina fecal humana mavor o igual 50 Ig/g heces v una concentracion de lactoferrina igual o mavor que 10Ig/g en heces, dan resultados positivos usando el test de la presente invencion.
5 Ejemplo 7.
Evaluaeion de las prestaeiones de la prueba.
Las prestaciones el dispositivo de diagnostico de la invencion fueren comparadas con sendos inmunoensavos para lactoferrina v calprotectina. Se realizo un estudio con 64 muestras fecales procedentes del Servicio de Microbiologfa de un hospital local (Zaragoza,
10 Espana). Con dichas muestras se realizaron tres tipos de ensavos:
1. el metodo de la presente invencion
2. el inmunoensavo tipo ELISA Calprest@ (Eurospital Spa , Trieste, Italia), realizado segun las instrucciones del fabricante.
3. la prueba rapida tipo IC IBD EZ VUE@ (TechLab, Blacksburg, VA, EEUU), realizado segun 15 las instrucciones del fabricante.
La deteccion de calprotectina con el test de la presente invencion presenta >94% de correlacion en sensibilidad comparada con la prueba Calprest@ (Eurospital). Y la deteccion de lactoferrina fecal humana usando test de la presente invencion presenta >99% de correlacion en sensibilidad comparada con la prueba rapida IBD EZ VUE@ (TechLab).
20 La deteccion de calprotectina humana con de la presente invencion presenta un 93% de correlacion en especificidad comparada con Calprest@ (Eurospital) v la deteccion de lactoferrina humana presenta >99% de correlacion en especificidad comparada con IBD EZ VUE@ (TechLab).
Claims (6)
- REIVINDICACIONES1. Dispositivo inmunocromatográfico para el análisis de muestras de heces caracterizado por que comprende:
- a.
- Una ventana de resultados de tres líneas, una de control, otra para la detección de calprotectina y otra para la detección de lactoferrina, de manera que permite la identificación simultánea y diferenciada de calprotectina y lactoferrina fecales.
- b.
- Una membrana porosa en la que se han inmovilizado separadamente anticuerpos anti-calprotectina y anti-lactoferrina
- c.
- Un absorbente en el que se ha depositado conjugados de anticuerpos anti-calprotectina y anti-lactoferrina unidos a moléculas o partículas marcadoras.
-
- 2.
- Dispositivo inmunocromatográfico según la reivindicación 1 caracterizado por que los anticuerpos utilizados son policlonales o monoclonales tanto en la membrana como en los conjugados.
-
- 3.
- Método de diagnóstico de la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) caracterizado por que comprende:
a. La obtención de una muestra de heces,- b.
- La dispersión del material fecal de la muestra en un tampón o diluyente,
- c.
- La aplicación de esta dispersión en la ventana de muestra del dispositivo de la reivindicación 1,
- d.
- La interpretación del resultado según la aparición de bandas en la ventana de resultados.
-
- 4.
- Método de despistaje rápido de la diarrea infecciosa (ID) caracterizado por que comprende:
a. La obtención de una muestra de heces,b. La dispersión del material fecal de la muestra en un tampón o 5 diluyente,- c.
- La aplicación de esta dispersión en la ventana de muestra del dispositivo de la reivindicación 1,
- d.
- La interpretación del resultado según la aparición de bandas en la ventana de resultados.
10 5. Método de ayuda al diagnóstico del cáncer colorrectal (CRC) caracterizado por que comprende:a. La obtención de una muestra de heces,b. La dispersión del material fecal de la muestra en un tampón o diluyente,15 c. La aplicación de esta dispersión en la ventana de muestra del dispositivo de la reivindicación 1,d. La interpretación del resultado según la aparición de bandas en la ventana de resultados. - 6. Kit para llevar a cabo los métodos de diagnostico de las reivindicaciones 3, 4 y 20 5 caracterizado porque comprende:
- a.
- Un dispositivo inmunocromatográfico según la reivindicación 1,
- b.
- un diluyente adecuado para suspensión y dispersión del material fecal,
- c.
- un vial para la toma de muestra y su manipulación.
OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCASN.º solicitud: 201031537ESPAÑAFecha de presentación de la solicitud: 19.10.2010Fecha de prioridad:INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA51 Int. Cl. : G01N33/53 (2006.01)DOCUMENTOS RELEVANTES- Categoría
- Documentos citados Reivindicaciones afectadas
- A
- WO 0136975 A1 (BINAX, INC. [US/US]) 25.05.2001, página 3, línea 32 – página 4, línea 25; página 5, línea 29 – página 9, línea 9; reivindicaciones 1,3-5,7,8,11,12,15,17,21,25,26,29,31. 1-6
- A
- VIEIRA A. et al. Inflammatory bowel disease activity assessed by fecal calprotectin and lactoferrina: correlation with laboratory parameters, clinical endoscopic and histological indexes. BMC Research Notes. 2009. Vol. 2:221, todo el documento. 1-6
- A
- SIPPONEN T. et al. Fecal Calprotectin, Lactoferrin, and Endoscopic Disease Activity in Monitoring Anti-TNF-alpha Therapy for Crohn’s Disease. Inflammatory Bowel Diease. 2008. Vol. 14(10), páginas: 1392-1398, todo el documento. 1-6
- A
- EP 0884594 A2 (TORELLI G.) 16.12.1998, columna 2, línea 46 – columna 3, línea 34; reivindicaciones 1,6,10. 1-2
- A
- US 20090104630 A1(REITER PC.) 23.04.2009, página 3, párrafos 0032-0038; figura 2. 1-2
- Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud
- El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:
- Fecha de realización del informe 16.06.2011
- Examinador M. García Grávalos Página 1/5
INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICANº de solicitud: 201031537Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) G01N Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos debúsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, BIOSIS, MEDLINE, EMBASE, USPTO PATENT DATABASE, GOOGLE ACADEMICO.Informe del Estado de la Técnica Página 2/5OPINIÓN ESCRITANº de solicitud: 201031537Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 16.06.2011Declaración- Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)
- Reivindicaciones Reivindicaciones 1-6 SI NO
- Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)
- Reivindicaciones Reivindicaciones 1-6 SI NO
Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).Base de la Opinión.-La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.Informe del Estado de la Técnica Página 3/5OPINIÓN ESCRITANº de solicitud: 2010315371. Documentos considerados.-A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.- Documento
- Número Publicación o Identificación Fecha Publicación
- D01
- WO 0136975 A1 25.05.2001
- D02
- VIEIRA A. et al. BMC Research Notes. 2009. Vol. 2:221. 29.10.2009
- D03
- SIPPONEN T. et al. Inflammatory Bowel Diease. 2008. Vol. 14(10), páginas: 1392-1398. 2008
- D04
- EP 0884594 A2 16.12.1998
- D05
- US 20090104630 A1 23.04.2009
- 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaraciónLa presente solicitud divulga un dispositivo inmunocromatográfico que, mediante la aplicación de una muestra de heces dispersada en un diluyente, permite la detección simultánea de calprotectina y lactoferrina fecales, mediante la formación de conjugados de anticuerpos anti-calprotectina y anti-lactoferrina unidos a partículas coloreadas y su captura en una membrana porosa (reivindicaciones 1-2). Se refiere también a el uso de dicho dispositivo en un método de diagnóstico de de una enfermedad inflamatoria intestinal, de diarrea infecciosa o de cáncer colorectal (reivindicaciones 3-5), y a un kit para llevar a cabo dicho método que incluye el dispositivo de la invención, un diluyente adecuado y un vial para la recogida de muestra (reivindicación 6).El documento D01 divulga un método rápido y económico para diagnóstico de una enfermedad inflamatoria intestinal, basado en un dispositivo inmunocromatográfico capaz de detectar al tiempo, en una muestra fecal, con anticuerpos específicos y conjugados de anticuerpos marcados, la presencia de un microorganismo patógeno y de lactoferrina como marcador de la enfermedad entérica. El dispositivo inmunocromatográfico consta de dos partes; una, con un pocillo para la depositar la muestra; otra, formada por una tira, donde fluye la muestra, uniéndose en una fase móvil a los conjugados anticuerpo-marcador, quedando posteriormente fijados en una membrana de nitrocelulosa con anticuerpos específicos dispuestos en paralelo, siendo identificados los positivos por sus correspondientes marcadores (ver página 3, línea 32 página 4, línea 25; página 5, línea 29 -página 9, línea 9; reivindicaciones 1, 3-5, 7, 8, 11, 12, 15, 17, 21, 25, 26, 29, 31).El documento D02 divulga un estudio sobre la detección de lactoferrina y calprotectina en muestras fecales, evaluando su utilidad como marcadores, muy sensibles y específicos, para detección y/o pronóstico de la enfermedad inflamatoria intestinal (ver todo el documento).El documento D03 divulga una evaluación de la lactoferrina y calprotectina fecales, como marcadores de pronóstico de la enfermedad de Crohn después del tratamiento con interferon-alpha (ver todo el documento).El documento D04 divulga un método para análisis de muestras biológicas, basado en un dispositivo inmunocromatográfico capaz de detectar al tiempo, de modo rápido y que precisa poca cantidad de muestra, más de una molécula de interés. Está formado por una membrana cromatográfica, inserta en un soporte, donde se deposita la muestra para analizar, aplicándose el agente marcador en un diluyente que se desplaza sobre la muestra mostrando el resultado del análisis en bandas paralelas (ver columna 2, línea 46 -columna 3, línea 34; reivindicaciones 1, 6, 10).El documento D05 divulga un método y un dispositivo inmunocromatográfico para detectar el estado del sistema inmune en casos de SIDA, basado en la determinación de los niveles de células T CD4+, empleando equivalentes de estas células como el ligando soluble CD40/CD154. El dispositivo está formado por un material que permite el flujo lateral de la muestra, desde un extremo, pasando por una fase móvil donde se une al ligando detector formando un complejo que posteriormente es capturado por el agente específico, dejando una señal de identificación según el tipo de marcador empleado (ver página 3, párrafos 0032-0038; Figura 2).Informe del Estado de la Técnica Página 4/5OPINIÓN ESCRITANº de solicitud: 2010315371. NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 6.1 y Art. 8.1 LP 11/1986)La presente solicitud divulga un dispositivo inmunocromatográfico que permite la detección simultánea de calprotectina y lactoferrina fecales y a su uso en un método de diagnóstico de de una enfermedad inflamatoria intestinal, de diarrea infecciosa o de cáncer colorrectal.1.1. REIVINDICACIONES 1-6El documento D01 se considera el más cercano al estado de la técnica, ya que anticipa un método y un dispositivo inmunocromatográfico para diagnóstico de una enfermedad inflamatoria intestinal, detectando en una muestra fecal, mediante conjugados de anticuerpos marcados, la presencia de un microorganismo patógeno y de lactoferrina como marcador de la enfermedad entérica.Aunque el dispositivo descrito en D01 es muy parecido al de la invención, anticipando el uso de conjugados anticuerpomarcador en una fase móvil y la posterior captura e identificación de las moléculas por sus correspondientes marcadores, que pueden ser partículas coloreadas, sin embargo, en este documento no se menciona a la calprotectina como marcador de la enfermedad entérica.En consecuencia, según lo divulgado en el documento D01, las reivindicaciones 1-6 cumplen el requisito de novedad (Art. 6.1 LP11/1986).Los documentos D02 y D03 anticipan el uso de lactoferrina y calprotectina como marcadores específicos para detección y/o pronóstico de la enfermedad inflamatoria intestinal en muestras fecales, por lo que el uso de estos marcadores en un dispositivo inmunocromatográfico, para diagnóstico de una enfermedad inflamatoria intestinal podría resultar evidente para un experto en la materia. Sin embargo, se considera que el dispositivo de la presente invención aporta una serie de ventajas sobre lo divulgado en el estado de la técnica, como el vial para recogida de muestra y la detección y cuantificación simultánea de calprotectina y lactoferrina.De acuerdo con lo expuesto, las reivindicaciones 1-6 cumplen con el requisito de actividad inventiva (Art. 8.1 LP 11/1986)Los documentos D04 y D05 se refieren al estado de la técnica y no se consideran relevantes en relación con el objeto de la invención.Informe del Estado de la Técnica Página 5/5
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