CN105424941B - Akr1b10蛋白和用于肝硬化诊断的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药生物技术领域，具体地说，涉及一种特异性识别AKR1B10蛋白的抗体在制备肝硬化的早期诊断、诊断、治疗指导、及预后判断的试剂中的应用，以及一种用于肝硬化的早期诊断、诊断、治疗指导、及预后判断的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域，具体地说，涉及了一种肝硬化特异性抗原醛酮还原酶1B10（Aldo-Keto Reductase 1B10，AKR1B10），以及一种用于肝硬化的早期诊断、诊断、治疗指导、及预后判断的试剂盒。。
背景技术
慢性肝炎后肝硬化是指由于各种病因引起的肝脏慢性、进行性、弥漫性病变，其特点是在肝细胞坏死的基础上发生纤维化，并代之以纤维包绕的异常肝细胞结节（称之为假小叶），导致正常肝小叶结构和血管解剖的破坏。我国肝硬化的主要病因是病毒性肝炎，尤其是乙型肝炎病毒( HBV)、丙型肝炎病毒( HCV)和丁型肝炎( HDV)病毒引起的慢性、长期炎症可导致肝硬化。
肝硬化是一种常见疾病，逐渐进展，晚期出现肝功能衰竭、门静脉高压和多种并发症，是严重和不可逆的肝脏疾病。肝硬化目前无有效的治疗方法。在肝硬化的早期（代偿期），进行及时的干预，让患者避免重活动量工作，辅以饮食调节，如以高热量、高蛋白质、维生素丰富而易消化的食物为主。严禁饮酒，并限制脂肪，尤其是动物脂肪的过多摄人等，可避免或延缓其病情进展，预防晚期肝硬化及各种并发症的发生。
然而，早期肝硬化诊断比较困难，许多病理组织学证实为肝硬化的患者，常可无任何症状或仅出现非特异性的消化道症状。目前，对于肝硬化的早期诊断主要在于：①对病毒性肝炎患者严密随访观察；②对原因不明的肝大，特别是肝质地坚实、表面不光滑者，有肝病面容者，出现蜘蛛痣、肝掌及毛细血管扩张等体征者，采用包括超声、腹腔镜及肝组织活检等检查手段帮助确定性质。这些手段一则缺少特异性，二则临床操作也有实质性困难。急需更特异性的诊断或随访、追踪指标，尤其是无创性血清生物学指标。
AKR1B10蛋白是从人类原发性肿瘤组织中分离鉴定出来的。该蛋白质具有316个氨基酸，在多种人类肿瘤组织中高表达，并促进肿瘤细胞的生长与增值，在肿瘤的发生、发展中起重要作用。此前，本发明人研发了针对人类特异性抗原醛酮还原酶1B10蛋白（以下简称为AKR1B10）的特异性检测试剂盒及其抗体，以用于癌症的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测。然而，经过进一步研发，发现该人类特异性抗原醛酮还原酶1B10蛋白是肝硬化的一个新的，特异性血清标记物，可用于肝硬化的早期诊断、诊断、治疗指导、及预后判断，而成就了本发明。
发明内容
本发明人新发现AKR1B10蛋白在肝硬化再生结节中高表达，并经细胞分泌，进入血液循环，使肝硬化患者血清中该蛋白水平升高。因此AKR1B10可以作为新的肝硬化血清标记物，可用于肝硬化的筛查、追踪、早期诊断、治疗指导和预后判断，因而成为本发明的基础。
因而针对人类肝硬化特异性抗原醛酮还原酶1B10 (Aldo-Keto Reductase 1B10，AKR1B10)蛋白，开发出一种新的，灵敏、特异、高效的诊断试剂盒，用于肝硬化的筛查、诊断、疗效判断与预后评估。
具体而言，本发明涉及如下内容：
1. 一种基于人类肝硬化特异性抗原醛酮还原酶1B10 (AKR1B10)蛋白的诊断试剂盒。
2. 该试剂盒可用于肝硬化的筛查、诊断、疗效判断与预后评估，其包含特异性检测AKR1B10的试剂。
3. 项2所述的试剂盒，其中，所述特异性检测AKR1B10的试剂是特异性识别AKR1B10蛋白的特异性抗体；或所述特异性检测AKR1B10蛋白的试剂是特异性识别AKR1B10蛋白核酸的引物或探针： 5’端：CAGAAAGCAGGACGTGGGACATC，3’端：GCACGTCGATTCGCGTCTATGAC。
4. 项2-3中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂可用于检测血清与尿液等体液，或组织样本中的AKR1B10蛋白。
5. 项2-4中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含AKR1B10蛋白标准品。
6. 项2-5中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒是酶联免疫法吸附测定(ELISA)试剂盒、时间分辨免疫荧光分析（TRFIA）试剂盒及化学发光检测试剂盒。
7. 项6所述的试剂盒，其包括：
包被有肝硬化特异性抗原AKR1B10特异性捕获抗体的检测板板；
生物素标记的另一种属来源的AKR1B10的特异性检测抗体。该捕获单克隆抗体与检测抗体均可与AKR1B10蛋白结合。
8. 项7所述的试剂盒，其还包括：
包被缓冲液(1×PBS，pH7.3±0.1)；
样品稀释液(1×PBS、1%BSA、0.05%NaN3，pH 7.3±0.1)；
封闭液(1×PBS、3% BSA)；
洗脱液PBST(1×PBS、0.05% Tween-20)；
Streptavidin-Eu/HRP。
9. 根据项7或8的试剂盒，其中捕获抗体来自用全长AKR1B10抗原免疫小鼠，并进行细胞融合，分离单克隆杂交细胞株，而制备的，特异性识别AKR1B10的单克隆抗体；检测抗体来自用全长AKR1B10抗原免疫兔获得的纯化抗体。
10. 根据项2-9中任一项所述的试剂盒，其中所述筛查、诊断、疗效判断及预后评估包括：
a) 利用所述特异性检测AKR1B10的试剂测量来自受试者的生物学样品中AKR1B10蛋白的水平；
b) 将a)中测得的水平与正常样品中的相应水平比较。
11. 根据项10的试剂盒，其中所述样品是血清、尿液、等体液，或组织样品。
12. 特异性检测AKR1B10蛋白的试剂在制备用于肝硬化筛查、早期诊断、疗效判断与预后评估的试剂盒中的用途。
13. 根据项12所述的用途，其中，所述特异性检测AKR1B10的试剂是特异性识别AKR1B10蛋白的单克隆抗体，其是保藏号为CGMCC No.9249、或CGMCC No.9250单抗细胞株所产生的单克隆抗体。
附图说明
图1. 鼠源性AKR1B10单克隆抗体的特异性。此为用纯化的AKR1B10单克隆抗体进行Western blot以检测其特异性。M，蛋白分子量标记物；H460，人肺癌细胞系（表达AKR1B10）；293T，人胚胎肾细胞系（表达AR，但不表达AKR1B10）；AKR1B10，纯化蛋白；AR，纯化蛋白。抗AKR1B10单克隆抗体具有高特异性，与AR蛋白无交叉反应（注：AR（AldoseReductase）与AKR1B10为高度相似的同一家族蛋白）。
图2：用抗AKR1B10 特异性抗体检测AKR1B10蛋白在人类肝硬化组织中的表达。此为用人类肝硬化活检组织切片进行免疫组织化学检测所得结果，表明AKR1B10蛋白在人类肝硬化组织中特异表达，并可以用AKR1B10特异性抗体检测到。
图3：时间分辨免疫荧光测定（TRFIA）试剂盒的灵敏度。其中捕获抗体来自用全长AKR1B10抗原制备的鼠源性单克隆抗体；检测抗体来自用全长AKR1B10抗原免疫兔获得的纯化抗体。用纯化的、不同量AKR1B10蛋白作为待检样品，以确定最低检测灵敏度。
图4：正常人群和肝硬化患者血清中AKR1B10浓度。用上述TRFIA检测。
具体实施方式
本发明涉及一种新发现，即AKR1B10蛋白在肝硬化再生结节中高表达，并经细胞分泌，进入血液循环，使肝硬化患者血清中该蛋白水平升高(参见图2与图4)。因此AKR1B10可以作为新的肝硬化血清标记物，可用于肝硬化的筛查、追踪、早期诊断、治疗指导和预后判断。
本发明提供的检测AKR1B10蛋白的试剂盒，包括特异性识别AKR1B10蛋白的单克隆抗体，该抗体被包被在固体载体上。
本发明基于抗AKR1B10特异性单克隆抗体，新开发出利用夹心时间分辨免疫荧光分析（TRFIA）技术检测血清AKR1B10抗原的试剂盒，此试剂盒适用于肝硬化的筛查、追踪、早期诊断和指导治疗与判断预后。
本发明提供的检测AKR1B10抗原的夹心时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）试剂盒特征是，主要包括有：包被有捕获AKR1B10蛋白的鼠源性特异性单克隆抗体的时间分辨免疫荧光测定（TRFIA）板；生物素标记的检测抗体(2μg/ml 兔抗AKR1B10抗体)。捕获抗体与检测抗体均可与AKR1B10抗原结合。
所述检测AKR1B10抗原的夹心时间分辨免疫荧光测定（TRFIA）试剂盒还包括有：包被缓冲液(1×PBS，pH7.3±0.1)；样本稀释液/抗体稀释液(1×PBS、1%BSA、0.05%NaN3，pH7.3±0.1)；封闭液(1×PBS、3% BSA)；洗脱液PBST(1×PBS、0.05% Tween-20)；辣根过氧化物酶(HRP)或Eu标记的Streptavidin；标准品(不同浓度AKR1B10纯抗原：0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20 ng/ml)。
所述捕获抗体来自用全长AKR1B10抗原制备的鼠源性单克隆抗体；检测抗体来自用全长AKR1B10抗原免疫兔获得的纯化抗体。
本发明的另一个目的是提供上述试剂盒的制备方法。
一种制备上述检测AKR1B10抗原的夹心时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）试剂盒的方法，包括以下步骤：
用包被缓冲液将捕获抗体稀释成7-10 μg/ml，在时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）板的每孔中加入100μl上述抗体稀释液，4ºC过夜；取出，置于37ºC 30分钟；甩去液体，用PBST洗涤5次；空干，每孔加入100 μl封闭液，37ºC 2小时；甩去液体，用PBS洗2次；在室温下，自然风干2小时；用锡箔纸真空密封，放于4ºC，备用。
使用时，将血清样本1:10稀释，每孔加入100μl稀释血清和标准品(0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20ng/ml AKR1B10纯蛋白稀释品)，37 ºC孵育1小时。去除样本液，用PBST洗5次，用Antibody/Conjugate buffer稀释生物标记的兔抗AKR1B10抗体(1:500)，然后每孔加入100μl抗体稀释液，37 ºC孵育1小时。去除抗体液，用PBST洗5次，用Antibody/Conjugate buffer稀释Streptavidin-EU(1:5000)，然后每孔加入100μl稀释液，37ºC孵育1小时。去除Streptavidin-Eu稀释液，用PBST洗5次，每孔加入100μl Stop solution终止反应，读取OD值。以标准品制作标准曲线，计算出稀释血清中AKR1B10的浓度，然后将浓度乘以10，得到血清样本中的终浓度。
任选地，该试剂盒还可以包含下述：与正常或疾病样本产生的信号相关的信息、标准化材料、如用于对照的来自正常和/或疾病样本的AKR1B10蛋白标准品、适当的酶、缓冲液和溶液。任选地，所述试剂盒还可包含任何描述如何实施本发明方法的说明书、任选地提供用于解析实施本发明方法时获得的结果的标准图、数据和软件。
我们建立的检测AKR1B10的夹心时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）试剂盒及化学发光检测试剂盒，可适用于肝硬化早期诊断和人群筛查、治疗效果判断及预后评估等方面，具有快速、客观和准确性等优点。
早期（代偿期）诊断：无任何症状或仅出现非特异性的消化道症状，但是病理组织学证实为肝硬化的患者。通过检测血清中AKR1B10蛋白的改变，进行诊断。肝硬化的早期诊断是避免发展为晚期肝硬化，导致患者死亡的关键。
指导治疗：检测接受治疗的肝硬化病人血清中AKR1B10蛋白的改变，可判断疗效。降低则有效，升高则预示病情恶化。
判断预后：肝硬化病人血清中AKR1B10蛋白的水平往往与肝硬化组织中AKR1B10的表达水平有关，二者均为预后不良的征兆。再有接受治疗的肝硬化病人血清中AKR1B10的变化，也预示治疗的效果及病人的预后。
实施例
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实验中使用的试剂购自西格玛奥德里奇中国公司（Sigma-Aldrich Co. LLC）。
实施例1: 鼠源性抗AKR1B10蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备
用纯化的AKR1B10全长蛋白抗原1.0mg，加入等体积弗氏佐剂，以便增强抗原的特异性免疫反应，用5ml注射器将上述混合物反复抽吸进行乳化，达到有油包水的状态。选用2只6-8周龄的健康雄性,分三次免疫,300 μL/只,每次将乳化好的AKR1B10特异抗原注射到小鼠皮下与腹腔,每隔2周进行一次免疫,免疫剂量和途径均不变,细胞融合前3天,将抗原与PBS直接混合不添加任何佐剂,直接注射到小鼠腹腔进行加强免疫。然后，无菌条件下,取出已取血的小鼠脾脏,研磨成细胞悬液,置于50 mL离心管中,室温 1,400 r/min 离心 3min。弃上清,用10 mL红细胞裂解液将脾细胞重悬,混勾后,静置l0min,再直接加入15 mLMD6无血清培养基终止红细胞裂解,室温,1,400 r/min,离心3 min。弃上清,用10 mL MD6无血清培养基将脾细胞重悬,混匀后吸取少许用台盼蓝染色,加入细胞计数板,于倒置显微镜上计数，与黑色素瘤细胞按1:1~5:1的比例混匀,室温,1,400/min,离心3 min。弃上清,轻轻弹击离心管底使两种细胞沉淀松动,45s内沿离心管内壁加入1.2 mL的PEG细胞融合剂,边加边转动离心管,使PEG充分接触细胞。加入45 mL已37°C预热的MD6无血清培养基,终止PEG的作用,缓慢颠倒离心管2~3次,37℃下静置5 min。室温,1,400 r/min,离心3 min。弃上清,于96孔细胞培养板中37℃，5%C02培养。第10天即可观察杂交瘤细胞的生长状态,若观察到明显的单个细胞集落，即可取杂交瘤细胞培养上清液, 使用间接ELISA方法进行抗AKR1B10抗体检测,筛选选能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。进一步使用有限稀释法获得分泌针对单一表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明获得两株鼠源性单抗细胞株，即8-DC-1和9-DC-2，保藏号分别为CGMCC No.9249和CGMCC No.9250，于2014年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）（保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），经检测存活。然后，用使用蛋白G亲和层析方法纯化单克隆抗体，透析、定量。
实施例2: 制备检测AKR1B10抗原的夹心时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）试剂盒
实施例1中所使用的捕获抗体和检测抗体是野生型全长AKR1B10蛋白分别免疫山羊和家兔后获得血清，并用AKR1B10抗原制备的亲和柱纯化后获得的。兔抗AKR1B10抗体被生物素标记。本发明获得的捕获抗体和检测抗体的灵敏度和特异性都很强，时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）可检测到0.03125ng/ml的AKR1B10蛋白。其中生物素标记试剂盒购自Pierce 公司。Streptavidin-Eu购自Perkin Elmer 公司。检测AKR1B10的时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）板由自己制备；所用试剂自配：包被缓冲液(1×PBS，pH7.3±0.1)；样本稀释液/抗体稀释液(1×PBS、1%BSA、0.05%NaN3，pH 7.3±0.1)；封闭液(1×PBS、3% BSA)；洗脱液PBST(1×PBS、0.05% Tween-20)；检测抗体(1μg/ml 兔抗AKR1B10抗体)；标准品(不同浓度AKR1B10抗原：0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20 ng/ml)。
实施例3：正常人群和肝硬化者血清中AKR1B10浓度
时间分辨荧光免疫测定板的制备：用包被缓冲液将捕获抗体稀释成7-10 μg/ml，在时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）板的每孔中加入100μl上述抗体稀释液，4ºC过夜；取出，置于37ºC 30分钟；甩去液体，用PBST洗涤5次；空干，每孔加入100 μl封闭液，37ºC 2小时；甩去液体，用PBS洗2次；在室温下，自然风干2小时；用锡箔纸真空密封，放于4ºC，备用。
血清样本的检测：血清样本用PBS以1:10稀释，每孔加入100 μl样品稀释液或标准品(不同浓度AKR1B10抗原：0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20 ng/ml)，37ºC，60分钟；甩去液体，用洗涤缓冲液洗涤5次，空干；检测抗体用抗体稀释液以1:500稀释，每孔加入100 μl检测抗体稀释液，37ºC，60分钟；甩去液体，用洗涤缓冲液洗涤5次，空干；Streptavidin-Eu用抗体稀释液以1:80000稀释，每孔加入100 μl Streptavidin-Eu稀释液，37ºC，60分钟；甩去液体，用洗涤缓冲液洗涤5次，空干；100 μl加入反应液；用酶标仪以450 nm波长测定OD值。绘制标准曲线，根据标准曲线，计算出血清样本中AKR1B10的浓度，并×10，得到血清AKR1B10终浓度。
检测结果分析
选取100例健康人、40例肝硬化患者进行血清样本检测，结果用Graphpad 4.0统计学软件进行分析。t检验结果显示，平均AKR1B10抗原水平在两组人群中有显著性统计学差异(p < 0.001)。在这100例正常人群中，血清AKR1B10的浓度平均为138pg/ml，肝硬化患者血清AKR1B10的浓度为562pg/ml。
Claims (4)
1.特异性识别AKR1B10蛋白的抗体在制备肝硬化早期诊断试剂中的应用，其中，所述抗体为单克隆抗体，用于特异性检测血清样品中的AKR1B10蛋白。
2. 根据权利要求1所述的应用，其中，所述特异性识别AKR1B10蛋白的抗体是保藏号为CGMCC No.9249、或CGMCC No.9250单抗细胞株所产生的单克隆抗体。
3.特异性识别AKR1B10蛋白的抗体在制备肝硬化早期诊断试剂盒中的应用，其中，所述特异性识别AKR1B10蛋白的抗体为单克隆抗体，用于特异性检测血清样品中的AKR1B10蛋白。
4. 根据权利要求3所述的应用，其中所述特异性识别AKR1B10蛋白的抗体是保藏号为CGMCC No.9249、或CGMCC No.9250单抗细胞株所产生的单克隆抗体。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zhu Yueqiu Inventor after: Lu Fengmin Inventor before: Zhu Yueqiu |
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: AKR1B10 protein and reagent kit for the diagnosis of liver cirrhosis Granted publication date: 20180410 Pledgee: Hunan Ningxiang Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Industrial Park sub branch Pledgor: HUNAN LAITUOFU BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Registration number: Y2024980006689 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Granted publication date: 20180410 Pledgee: Hunan Ningxiang Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Industrial Park sub branch Pledgor: HUNAN LAITUOFU BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Registration number: Y2024980006689 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: AKR1B10 protein and reagent kit for the diagnosis of liver cirrhosis Granted publication date: 20180410 Pledgee: Hunan Yuanjiang Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Jinfu Branch Pledgor: HUNAN LAITUOFU BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Registration number: Y2024980019644 |