CN109682979A - 一种钙卫蛋白联合乳铁蛋白抗原检测试纸条及其制备方法 - Google Patents
一种钙卫蛋白联合乳铁蛋白抗原检测试纸条及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种钙卫蛋白联合乳铁蛋白抗原检测试纸条及其制备方法，旨在提一种检测速度快、操作简便而且灵敏度高的钙卫蛋白联合乳铁蛋白检测试纸条，同时还提供一种工艺简单、重复性好、成品结构稳定，使用性能好的钙卫蛋白联合乳铁蛋白检测试纸条的制备方法。所述钙卫蛋白联合乳铁蛋白检测试纸条包括底板、样品垫、标记垫、检测垫、吸水垫。所述制备方法：首先制备所述样品垫、所述标记垫、所述检测垫，然后将所述样品垫、所述标记垫、所述检测垫、所述吸水垫顺序搭接所述底板上。本发明应用于肠道炎性疾病标志物蛋白检测试纸条的技术领域。
Description
技术领域
本发明涉及肠道炎性疾病标志物蛋白检测试纸条的技术领域,特别涉及一种钙卫蛋白联合乳铁蛋白抗原检测试纸条及其制备方法。
背景技术
钙卫蛋白(calprotectin)属于S-100家族，是一个相对分子质量为36kDa的钙-锌结合蛋白，由两条MRP-8链和一条MRP-14链构成的异源三聚体，主要来源于中性粒细胞，是中性粒细胞更新的重要标志物。粪便中钙卫蛋白的出现是肠胃增生性疾病和肠道炎症感染性疾病的标志。一般情况下，单从疾病症状上很难区分急性肠道激惹所引起的不适病症与慢性感染性胃肠道疾病，从而导致了无必要及过度的肠镜滥用，钙卫蛋白是急性胃肠道感染的一种标志，在感染和炎症性疾病时，由于其特异性地在炎性细胞(中性粒细胞和巨噬细胞 )中表达，在传染性和炎性的情况时血清中的钙卫蛋白可以增加5到40倍。钙卫蛋白在粪便中发现，它在粪便中的浓度是正常血清浓度的6倍。在炎性肠病的患者中的粪便中可以发现大量的钙卫蛋白,并且由此可以判断感染的程度。
乳铁蛋白(1actoferrin)是近年发现的、与铁结合的糖蛋白，主要分布表达于中性粒细胞、上皮细胞，以及各种组织和体液中，具有促进铁吸收、抗菌、免疫调节、抗感染、抗氧化、抗病毒等多种生物学功能，在许多炎症情况下其含量增加。新近的研究显示乳铁蛋白在炎症性肠病(IBD)患者肠黏膜及粪便中的含量明显高于正常对照组，不仅可以作为评价疾病活动性的指标，而且可以作为预测疾病复发、检测治疗效果、评价药物疗效等作用的指标。
目前评价肠炎的金标准是结肠镜活检。但是它具有侵害性，属于创伤性检查，不能检查全部的胃肠道，而且需要熟练的操作员和不舒服的肠道准备。对于钙卫蛋白常用的检测方法还有酶联免疫吸附法和荧光酶联免疫分析法，酶联免疫吸附法和荧光酶联免疫分析法灵敏度较高，适合专业人员检测，操作时间长需要专业人员操作。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供了一种检测速度快、操作简便而且灵敏度高的钙卫蛋白联合乳铁蛋白检测试纸条，同时还提供一种工艺简单、重复性好、成品结构稳定，使用性能好的钙卫蛋白联合乳铁蛋白检测试纸条的制备方法。
本发明所采用的技术方案是：所述钙卫蛋白联合乳铁蛋白检测试纸条包括底板，所述底板上顺序搭接有样品垫、标记垫、检测垫、吸水垫，检测垫上设有钙卫蛋白检测线T1、乳铁蛋白检测线T2和质控线C，所述钙卫蛋白检测线T1上包被有钙卫蛋白抗原，所述乳铁蛋白检测线T2上包被有乳铁蛋白抗原，所述质控线C上包被有羊抗鼠或羊抗兔IgG。
进一步，所述钙卫蛋白检测线T1和所述乳铁蛋白检测线T2靠近所述标记垫，所述质控线C靠近所述吸水垫。
进一步，所述检测垫的材质为硝酸纤维素膜，所述标记垫的材质为玻璃纤维素。
一种钙卫蛋白联合乳铁蛋白抗原检测试纸条的制备方法包括如下步骤：
A、制备所述样品垫；
B、制备所述标记垫；
C、制备所述检测垫：取硝酸纤维素膜，间隔划出所述钙卫蛋白检测线T1、所述乳铁蛋白检测线T2和所述质控线C，所述钙卫蛋白检测线T1上包被钙卫蛋白抗原，所述乳铁蛋白检测线T2上包被乳铁蛋白抗原，所述质控线C上包被羊抗鼠或羊抗兔IgG，将包被好的硝酸纤维素膜干燥，备用；
D、将所述样品垫、所述标记垫、所述检测垫、所述吸水垫顺序搭接所述底板上。
在步骤A中，所述样品垫的制备如下：将所述样品垫置于样品垫处理液中浸泡或将样品垫处理液均匀喷涂在所述样品垫上，然后将含有样品垫处理液的所述样品垫置于温度为37℃、相对湿度小于20％的环境中烘干3～5h，备用；其中，样品垫处理液为含0.5％吐温-20、1％BSA的pH为8 .0的1mol/L硼酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
在步骤B中，所述标记垫的制备包括如下步骤：
a、制备彩色乳胶微球；
b、彩色乳胶微球分别标记钙卫蛋白单克隆抗体和乳铁蛋白单克隆抗体，在彩色乳胶微球溶液中按0.6～1.0mg/ml分别加入钙卫蛋白单克隆抗体和乳铁蛋白单克隆抗体；
c、经搅拌后再在溶液中加入彩色乳胶微球稀释液和彩色乳胶微球溶液的混合液；
d、将步骤c中的所述混合液经离心去掉上清液，得沉淀物；
e、将所述沉淀物按4～10mg/ml溶于缓冲液得金标抗体溶液，所述缓冲液中含有其重量的1%～10%的动物血清白蛋白和0.01%～0.06%的叠氮钠；
f、用玻璃纤维浸取所述金标抗体溶液，所述金标抗体溶液开始渗出为止，然后将所述玻璃纤维进行干燥从而形成所述标记垫。
本发明的有益效果是：在判断肠粘膜损伤时，通常需要首先确定是急性胃肠道感染还是慢性感染性胃肠道疾病，本发明的试纸条可以联合检测粪便中的钙卫蛋白和乳铁蛋白，能够快速判断是否是急性胃肠道感染，对于肠粘膜损伤疾病的诊断具有重要意义。通过实现联检，使用通用的样本缓冲液，一次加样，可以同时获得两个结果，联合检测可以提高检测的灵敏度和特异性。因此，本发明的所述钙卫蛋白联合乳铁蛋白抗原检测试纸条灵敏度高、特异性强，而且速度快、操作简便，无需专门设施，适用于临床检测或普查等多种场合。
由于制备所述检测试纸条的方法为：首先制备所述样品垫、所述标记垫、所述检测垫，然后将所述样品垫、所述标记垫、所述检测垫、所述吸水垫顺序搭接所述底板上，即制成所述钙卫蛋白联合乳铁蛋白抗原检测试纸条，操作简单，因此，所述制备所述检测试纸条的方法简单、重复性好，而且用该方法制备的检测试纸条结构稳定，使用性能好。
附图说明
图1是所述钙卫蛋白联合乳铁蛋白检测试纸条的结构示意图。
具体实施方式
实施例一
如图1所示，在本实施例中，所述钙卫蛋白联合乳铁蛋白检测试纸条包括底板1，所述底板1上顺序搭接有样品垫2、标记垫3、检测垫4、吸水垫5，检测垫4上设有钙卫蛋白检测线T1、乳铁蛋白检测线T2和质控线C，所述钙卫蛋白检测线T1上包被有钙卫蛋白抗原，所述乳铁蛋白检测线T2上包被有乳铁蛋白抗原，所述质控线C上包被有羊抗鼠或羊抗兔IgG。
所述钙卫蛋白检测线T1和所述乳铁蛋白检测线T2靠近所述标记垫3，所述质控线C靠近所述吸水垫5。
所述检测垫4的材质为硝酸纤维素膜，所述标记垫3的材质为玻璃纤维素。
一种钙卫蛋白联合乳铁蛋白抗原检测试纸条的制备方法包括如下步骤：
A、制备所述样品垫2；
B、制备所述标记垫3；
C、制备所述检测垫4：将浓度为1.0～2.0mg/ml的钙卫蛋白和乳铁蛋白抗体中加入1%～3%的固定剂，再利用点膜机将所述钙卫蛋白和乳铁蛋白抗体分别点在硝酸纤维膜上，点膜后放入37～39℃的环境中烘干，再用0.01摩尔pH值为9.0含0.5%吐温20的PBS缓冲液，在37℃下封闭30分钟烘干。在本实施例中，取钙卫蛋白联合乳铁蛋白单抗，调蛋白浓度至1.5mg/ml，加入划膜稀释液，用喷膜机在硝酸纤维膜中段喷所述钙卫蛋白检测线T1、所述乳铁蛋白检测线T2；再取羊抗兔IgG抗体调蛋白浓度至1mg/ml，加入划膜稀释液，用喷膜机在硝酸纤维膜的中段，距检测线一段距离处喷所述质控线C，按0.036ul/l0cm设置喷膜量，抗体包被的膜烘干，醋酸纤维素膜可以替换所述硝酸纤维素膜；
D、将所述样品垫2、所述标记垫3、所述检测垫4、所述吸水垫5顺序搭接所述底板1上。
在步骤A中，所述样品垫2的制备如下：将所述样品垫2置于样品垫处理液中浸泡或将样品垫处理液均匀喷涂在所述样品垫2上，然后将含有样品垫处理液的所述样品垫2置于温度为37℃、相对湿度小于20％的环境中烘干3～5h，备用；其中，样品垫处理液为含0.5％吐温-20、1％BSA的pH为8 .0的1mol/L硼酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
在步骤B中，所述标记垫3的制备包括如下步骤：
a、制备彩色乳胶微球；
b、彩色乳胶微球分别标记钙卫蛋白单克隆抗体和乳铁蛋白单克隆抗体，在彩色乳胶微球溶液中按0.6～1.0mg/ml分别加入钙卫蛋白单克隆抗体和乳铁蛋白单克隆抗体；
c、经搅拌后再在溶液中加入彩色乳胶微球稀释液和彩色乳胶微球溶液的混合液；
d、将步骤c中的所述混合液经离心去掉上清液，得沉淀物；
e、将所述沉淀物按4～10mg/ml溶于缓冲液得金标抗体溶液，所述缓冲液中含有其重量的1%～10%的动物血清白蛋白和0.01%～0.06%的叠氮钠；
f、用玻璃纤维浸取所述金标抗体溶液，所述金标抗体溶液开始渗出为止，然后将所述玻璃纤维进行干燥从而形成所述标记垫3。
钙卫蛋白联合乳铁蛋白抗原检测方法：取待测标本，在本实施例中，所述待测标本为粪便标本，所述待测标本在室温解冻后,取约50～150 mg溶解后滴于彩色乳胶微球标记的钙卫蛋白和乳铁蛋白抗体的载体上，如有钙卫蛋白或乳铁蛋白抗体在所述检测载体上形成所述钙卫蛋白检测线T1、所述乳铁蛋白检测线T2和所述质控线C，则为阳性，否则为阴性。
所述钙卫蛋白和乳铁蛋白抗体为单抗，或者多抗，或者为所述单抗和所述多抗的混合物，在本实施例中，所述钙卫蛋白和乳铁蛋白抗体为鼠抗钙卫蛋白和乳铁蛋白单克隆抗体。
所述钙卫蛋白联合乳铁蛋白抗原检测方法为一步法，其具有高度的种特异性、很少出现困扰临床的假阴性、假阳性问题，具有高度的灵敏性，而且操作简便，无需专门设施。
所述钙卫蛋白联合乳铁蛋白抗原检测试纸条检测灵敏度高、检测迅速、快捷、方便，很少出现假阴性和假阳性的问题，适于临床或普查。
实施例二
本实施例与实施例一不同之处：在本实施例中，所述控制线232由羊抗鼠IgG抗体形成的组成。
本发明应用于肠道炎性疾病标志物蛋白检测试纸条的技术领域。
虽然本发明的实施例是以实际方案来描述的，但是并不构成对本发明含义的限制，对于本领域的技术人员，根据本说明书对其实施方案的修改及与其他方案的组合都是显而易见的。
Claims (6)
1.一种钙卫蛋白联合乳铁蛋白抗原检测试纸条，包括底板（1），其特征在于：所述底板（1）上顺序搭接有样品垫（2）、标记垫（3）、检测垫（4）、吸水垫（5），检测垫（4）上设有钙卫蛋白检测线（T1）、乳铁蛋白检测线（T2）和质控线（C），所述钙卫蛋白检测线（T1）上包被有钙卫蛋白抗原，所述乳铁蛋白检测线（T2）上包被有乳铁蛋白抗原，所述质控线（C）上包被有羊抗鼠或羊抗兔IgG。
2.根据权利要求1所述的一种钙卫蛋白联合乳铁蛋白抗原检测试纸条，其特征在于：所述钙卫蛋白检测线（T1）和所述乳铁蛋白检测线（T2）靠近所述标记垫（3），所述质控线（C）靠近所述吸水垫（5）。
3.根据权利要求1或2所述的一种钙卫蛋白联合乳铁蛋白抗原检测试纸条，其特征在于：所述检测垫（4）的材质为硝酸纤维素膜，所述标记垫（3）的材质为玻璃纤维素。
4.如权利要求1所述的一种钙卫蛋白联合乳铁蛋白抗原检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括如下步骤：
A、制备所述样品垫（2）；
B、制备所述标记垫（3）；
C、制备所述检测垫（4）：取硝酸纤维素膜，间隔划出所述钙卫蛋白检测线（T1）、所述乳铁蛋白检测线（T2）和所述质控线（C），所述钙卫蛋白检测线（T1）上包被钙卫蛋白抗原，所述乳铁蛋白检测线（T2）上包被乳铁蛋白抗原，所述质控线（C）上包被羊抗鼠或羊抗兔IgG，将包被好的硝酸纤维素膜干燥，备用；
D、将所述样品垫（2）、所述标记垫（3）、所述检测垫（4）、所述吸水垫（5）顺序搭接所述底板（1）上。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：在步骤A中，所述样品垫（2）的制备如下：将所述样品垫（2）置于样品垫处理液中浸泡或将样品垫处理液均匀喷涂在所述样品垫（2）上，然后将含有样品垫处理液的所述样品垫（2）置于温度为37℃、相对湿度小于20％的环境中烘干3～5h，备用；其中，样品垫处理液为含0.5％吐温-20、1％BSA的pH为8 .0的1mol/L硼酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：在步骤B中，所述标记垫（3）的制备包括如下步骤：
a、制备彩色乳胶微球；
b、彩色乳胶微球分别标记钙卫蛋白单克隆抗体和乳铁蛋白单克隆抗体，在彩色乳胶微球溶液中按0.6～1.0mg/ml分别加入钙卫蛋白单克隆抗体和乳铁蛋白单克隆抗体；
c、经搅拌后再在溶液中加入彩色乳胶微球稀释液和彩色乳胶微球溶液的混合液；
d、将步骤c中的所述混合液经离心去掉上清液，得沉淀物；
e、将所述沉淀物按4～10mg/ml溶于缓冲液得金标抗体溶液，所述缓冲液中含有其重量的1%～10%的动物血清白蛋白和0.01%～0.06%的叠氮钠；
f、用玻璃纤维浸取所述金标抗体溶液，所述金标抗体溶液开始渗出为止，然后将所述玻璃纤维进行干燥从而形成所述标记垫（3）。
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