CN103575878A - 一种水产品中氯霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测水产品中氯霉素残留的化学发光酶联免疫检测试剂盒及其检测方法，属于化学发光酶免疫分析领域。包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂；其中所述酶标板包被有包被抗原，所述试剂包括：酶标抗体即辣根过氧化物酶标记氯霉素抗体，氯霉素系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、发光液。本试剂盒原理为将包被抗原吸附在微孔板上制成固相抗原，在氯霉素抗体上连接辣根过氧化物酶制成酶标记物，鲁米诺体系作为发光底物，建立了氯霉素酶促化学发光免疫分析法。该试剂盒灵敏度为0.0125ng/mL，批内变异系数小于8％，批间变异系数小于20％，鱼虾样品的回收率为87％——101％，检测线性范围0.0125——4.05ng/mL。本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的特点。

Description

一种水产品中氯霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒及其检测方法

技术领域

一种氯霉素的化学发光酶联免疫分析试剂盒及其检测方法，属于化学发光免疫分析技术领域，用于水产品中氯霉素含量的检测。 

背景技术

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)最初是由委内瑞拉链丝菌的培养基中提取制得，是一类广谱抗生素。氯霉素曾在我国畜牧业中广泛应用，对畜禽的疾病控制和治疗起到了重要作用。氯霉素存在着严重的毒副作用，能引起人的再生障碍性贫血，粒状白细胞缺乏症，新生儿、早产儿灰色综合症等，低浓度药物残留还会诱发致病菌的耐药性，对人类的健康构成巨大的潜在威胁。在美国仅允许氯霉素应用于非食用性动物，规定在任何动物性食品中不得检出氯霉素。欧共体禁止氯霉素应用于产奶牛和产蛋鸡，在其他动物性食品中的含量也做了限制，规定最高残留量为100ng/kg。中国农业部已将氯霉素从2002年版《中国兽药典》中删除列为禁药，近年已规定在动物性食品中不得检出。 

作为全国淡水渔业第一省的湖北水产业，续十三年淡水产品总量保持全国第一。我省现有水产加工企业180家，其中加工出口企业19家。作为国家明令禁止使用的兽药，在水产品等动物源性食品中，氯霉素残留一直被列为重点必检项目之一。 

目前，应用广泛的CAP检测技术有液相色谱法(LC)、质谱法(MS)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)等。LC等大型仪器分析方法对设备和操作者有较高要求，样品处理方法复杂，检测时间长。 

目前已申请的氯霉素检测相关专利中较多是采用传统的酶联免疫吸附法检测，如：江南大学申请号为02137940，名为《一种动物性食品中氯霉素酶联免疫检测试剂盒及其检测方法》；中国农业大学申请号为200410037254，名为《检测氯霉素的试剂盒》；中国农业大学申请号为200410037255，名为《一种检测氯霉素的试剂盒》；中国农业大学申请号为200410037258，名为《氯霉素的酶联免疫试剂盒》；中国农业大学申请号200410037259，名为《一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒》；北京望尔生物技术有限公司申请号200510086775，名为《一种检测动物性食品中氯霉素类药物的酶联免疫试剂盒》等。这一方法中常用的显色底物是四甲基联苯胺(TMB)或者邻苯二胺(OPD)，其中OPD具有致癌性，长期使用会对人体造成危害；且这类底物较不稳定易受外界干扰使最终测定结果受到影响，如光照或金属离子会使底物自身显色。酶联免疫吸附法是以酶催化底物显色，通常需显色10——60分钟，使显色达到平台期，显色完毕后需用酸终止显色测定结果。 

另外部分专利涉及到胶体金试纸法，如：博顿生物技术(杭州)有限公司申请号 200310109470，名为《检测氯霉素的免疫胶体金试纸及其制备方法》；云南大学申请号200610019376，名为《氯霉素胶体金检测试纸》等。该方法适操作简便，用时短用于大批量样品筛查，但灵敏度较低，结果不准确，易出现假阳性或假阴性。 

还有部分专利有采用液相色谱-串联质谱测定方法，如：上海徐汇区中心医院申请号200410067401，名为《一种蜂蜜中氯霉素残留量的液相色谱-串联质谱测定方法》；中国人民共和国江苏出入境检验检疫局申请号200810195887，名为《蜂产品中多类农兽药残留同时检测的方法》，这类方法测定结果准确，但样品前处理过程繁琐，需要用大量有机溶剂，检测需要大规模仪器。 

此外还有天津生机集团股份有限公司申请号200810053150，名为《一种饲料或者兽药中违禁药物的快速检测方法》，该专利采用薄层色谱法检测违禁药物，这一方法操作简便，但样品处理过程中通常使用大量的有机溶剂，且检测结果只能定性判不能准确检测药物含量。江南大学申请号200910027458，名为《一种快速检测氯霉素的免疫磁珠层析试纸条及其制备方法》，采用免疫磁珠层析试纸条检测该方法与胶体金试纸法类似。江苏省原子医学研究所申请号200910182284，名为《一种氯霉素的光激化学发光免疫分析试剂盒》，采用光激化学发光免疫分析法，该方法需突破多次标记，即将CAP-OVA包被在发光微粒上，合成生物素二抗，将链霉亲和素包被在感光微粒上。本发明将具有高度灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，操作简便，用时短，无需长时间显色及终止，且灵敏度高，特异性好。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测氯霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒及其检测方法，用于水产品中氯霉素含量的检测。该试剂盒具有检测灵敏度高、应用灵活、方便的特点。 

本发明主要采用化学发光酶免疫分析方法检测氯霉素。其技术方案：一种氯霉素化学发光酶免疫分析试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有抗原，其中包被抗原是由氯霉素小分子和载体蛋白通过EDC(碳二亚胺)法偶联制成的完全抗原；所述试剂包括：氯霉素系列标准溶液、酶标抗体、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤溶液、发光溶液。 

上述氯霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒中： 

所述包被抗原是由氯霉素小分子和载体蛋白通过碳二亚胺法偶联制成的完全抗原；所述微孔板为48孔或96孔或其他孔数的可拆卸或不可拆卸酶标孔板；所述酶标抗体是由辣根过氧化物酶和氯霉素抗体通过过碘酸钠法偶联制成；所述氯霉素系列标准溶液分别是从氯霉素纯品中稀释得到，氯霉素标准品中氯霉素浓度分别为：0.0125ng/mL、0.025ng/mL、0.05ng/mL、0.15ng/mL、0.45ng/mL、1.35ng/mL、4.05ng/mL；所述化学发光液含缓冲液、鲁米诺、对 羟基苯丙烯酸、过硼酸钠等。 

用所述的试剂盒检测氯霉素的方法，测定的基础是抗原-抗体反应。顺次向白色化学发光板中加入氯霉素标准溶液或处理好的样品和酶标抗体，温育洗涤后加入发光液检测发光值，以加入氯霉素标准品的发光值绘制标准曲线，以加入被测样品的发光值从标准曲线上计算被测样品中氯霉素的含量。 

所述试剂盒检测方法，向包被好的酶标板中每孔加入标准溶液或处理好的样品和酶标物，在25-49℃下温育15分钟。洗涤后，每孔加入发光液，1-5分钟后在化学发光检测仪上检测。以所得的标准品发光值，除以第一个标准(0标准)的发光值再乘以100，得到抑制率(B/B0)，以抑制率为纵坐标，氯霉素浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。 

所述的检测氯霉素的方法，其样品处理： 

鱼虾样品：取10g去除脂肪的样品匀浆化，称量3g匀浆化的样品与6mL乙酸乙酯混合10min，4000g离心5min，转移2mL乙酸乙酯上层到干净的玻璃管中，50℃温和氮气流蒸发乙酸乙酯，脂肪残留物溶于1mL正己烷混匀1min，并加入1mL样品稀释液。涡旋混合1min，4000g离心分离5min。(注：如下层乳化，可将试管置于80℃水浴中5min左右，并再次进行离心)，弃去上层，吸取100μL下层溶液用于检测。最终检测结果应乘以稀释倍数1。 

所述试剂盒曲线灵敏度为0.0125ng/mL。 

所述试剂盒精密度可达到批内变异系数小于8％，批间变异系数小于20％。 

所述试剂盒鱼虾样品回收率在87.4——101％。 

附图说明

图1-反应时间的选择 

图2-氯霉素化学发光酶联免疫反应标准曲线 

图3-试剂盒的直观示意图 

图中：盒体(1)、酶标板(2)、酶标抗体工作液(3)、氯霉素标准溶液(4)——(11)、浓缩磷酸盐缓冲液(12)、浓缩洗涤液(13)、发光液(14) 

图4-酶标板的直观示意图 

具体实施方式

实施例1、包被抗原、酶标抗体的制备及稀释度的选择 

1.包被抗原的制备 

称取载体蛋白(牛血清白蛋白BSA)以超纯水溶解，配制成浓度为5——30mg/mL的BSA溶液。称取氯霉素以超纯水溶解，配制成浓度为1——5mg/mL的CAP溶液。称 取EDC·HCl，加超纯水溶解，配制成浓度为1——5mg/mL的EDC溶液。向EDC溶液中加入0.1——0.5mL CAP溶液，混合2min，再将已活化的CAP溶液加入到0.5mL BSA溶液中，上下混合均匀后，室温避光混合2h，收集偶联产物转移至30kDa超滤管，于冷冻离心机4℃下3000rpm离心5min，加等体积甘油混匀，-20℃冻存。 

2.酶标抗体的制备 

称取HRP溶解于超纯水中，配制成浓度为1——10mg/mL的HRP溶液，4℃静置过夜，使之充分溶解；次日取上述HRP溶液0.5mL并向其中加入0.025——1mL新配的0.01——1M NaIO₄水溶液，混匀后放置冰箱避光搅拌5——20分钟后取出。取出反应液装入透析袋中，4℃对pH4.0的醋酸溶液透析过夜。次日将透析后的混合物取出，调节混合物pH值，使其接近9.6；立即将0.5——5mg的氯霉素单抗加入，室温避光搅拌。反应结束后取混合液中加入0.05——0.5mL浓度为1——10mg/mL的NaBH4；然后将混合液超滤加等量甘油保存。 

3.包被抗原与酶标抗体浓度筛选 

纵向用包被抗原按照1∶20K、1∶40K、1∶80K、1∶100K、1∶200K、1∶400K的系列稀释度包被酶标板，每种浓度包被2列，100μL/孔，0——4℃放置过夜。次日用洗涤液洗板5次，每次拍干；50——300μL/孔封闭液封闭，25——40℃放置0.5——2小时，洗板5次，每次拍干。 

奇数列加入50μL/孔PBS缓冲液，偶数列加入50μL/孔浓度为4ppb的氯霉素标准溶液，然后横向用酶标抗体按照1∶30K、1∶50K、1∶60K、1∶80K的稀释度加入，每种浓度加入2行，每孔加入50μL，室温放置15——60分钟，洗板5次，每次拍干，加入100μL/孔TMB显色剂，室温避光放置5——45分钟，加入50μL/孔终止液，450nm处测试OD值。 

表1-包被抗原及酶标抗体浓度选择 

由表1可以看出不同抗原浓度结合不同抗体浓度所得吸光度以及加入竞争抗原后得到的吸光度，选择抗原包被浓度1∶400K，酶标抗体使用浓度选择1∶80K，对应吸光度较其他浓度适宜。 

4.反应时间选择 

将包被抗原以0.1M pH＝9.5的碳酸盐缓冲液稀释至3μg/mL，每孔加入200μL置于4℃冰箱包被过夜。次日将包被抗原的酶标板取出以0.01M pH＝7.4的PBST洗涤5次后每孔加300μL 1％BSA(0.01M pH＝7.4的PBST)封闭液，置于37℃水浴锅封闭1小时后再洗涤5次。 

在包被好的酶标板中每孔加入标准溶液100μL，标准溶液浓度为0、0.1、10以及1000ng/mL(非特异点)和酶标物50μL，酶标物稀释度为1∶10K，在37℃下分别温育5、15、30、60分钟。洗涤5次后，每孔加入TMB显色液100μL并在37℃温育15分钟，最后每孔加入50μL终止液，检测OD450nm值。 

由图1可以看出反应时间15分钟后趋于平衡，30分钟以后各标准点OD450nm变化不明显，为了缩短检测时间，选择反应时间为15分钟。 

5.氯霉素化学发光酶联免疫反应标准曲线建立 

将偶联抗原以0.1M pH＝9.5的碳酸盐缓冲按照1∶400K稀释，每孔加入200μL置于4℃冰箱包被过夜。次日将包被抗原的酶标板取出以0.01M pH＝7.4的PBST洗涤5次后每孔加300μL 1％BSA(0.01M pH＝7.4的PBST)封闭液，置于37℃水浴锅封闭1小时后再洗涤5次。 

在包被好的酶标板中每孔加入标准溶液100μL，标准溶液浓度为0、0.0125、0.025、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05ng/mL和酶标物50μL，酶标物稀释度为1∶80K，在室温下温育15分钟。洗涤5次后，每孔加入鲁米诺化学发光液180μL，5分钟后在化学发光检测仪上检测。 

6.检测氯霉素的化学发光酶联免疫试剂盒的组装 

1)包被有偶联抗原(氯霉素和载体蛋白偶联制成的完全抗原，包被浓度为1∶400K)的固相载体(NUNC白色化学发光板) 

2)辣根过氧化物酶标记氯霉素抗体工作液(工作浓度为1∶80K) 

3)氯霉素标准溶液8瓶：浓度分别为0、0.0125、0.025、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05ng/mL 

4)浓缩磷酸盐缓冲溶液：每升含NaCl 80g、KH₂PO₄2.0g、Na₂HPO₄·12H₂029.0g、KCl 2.0g的水溶液 

5)浓缩洗涤液：是上述浓缩磷酸盐缓冲液中加入体积比为0.05％的吐温-20 

6)发光液：0.1M pH＝8.5Tris-HCl缓冲液配制的2mmol/L鲁米诺，其中增强剂为对羟基苯丙烯酸浓度为0.25mmol/L，氧化剂为过硼酸钠浓度为20mmol/L。 

7)酶标板的制备 

将偶联抗原以0.1M pH＝9.5的碳酸盐缓冲液按照1∶400K稀释，每孔加入200μL置于4℃冰箱包被过夜。次日将包被抗体的酶标板取出以0.01M pH＝7.4的PBST洗涤5次后每孔加300μL 1％BSA(0.01M pH＝7.4的PBST)封闭液，置于37℃水浴锅封闭1小时后再洗涤5次，拍干，用锡箔纸真空密封在4℃下保存。 

7.本发明的氯霉素的化学发光酶联免疫试剂盒的测定程序 

试剂盒使用的注意事项 

1)使用之前将所有的试剂放置室温平衡30分钟至1个小时，使用后立即放回4℃冰箱保存。 

2)在使用过程中务必不能让微孔干燥。 

3)严格按照说明书操作。 

4)使用中避免光线直射，在孵育过程中用锡箔纸避光。 

●试剂的准备 

5)样品稀释液：将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲液用蒸馏水稀释10倍后使用。 

6)洗涤液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用蒸馏水稀释10倍后使用。 

7)发光液：0.1M pH＝8.5Tris-HCl缓冲液配制的2mmol/L鲁米诺，其中增强剂为对羟基苯丙烯酸浓度为0.25mmol/L，氧化剂为过硼酸钠浓度为20mmol/L。 

样品前处理 

8)组织样品(虾、鱼及肉类)：取10g去除脂肪的样品匀浆化，称量3g匀浆化的样品与6mL乙酸乙酯混合10min，4000g离心5min，转移2mL乙酸乙酯上层到干净的玻璃管中，50℃温和氮气流蒸发乙酸乙酯，脂肪残留物溶于1mL正己烷混匀1min，并加入1mL样品稀释液。涡旋混合1min，4000g离心分离5min。(注：如下层乳化，可将试管置于80℃水浴中5min左右，并再次进行离心)，弃去上层，吸取100μL下层溶液用于检测。最终检测结果应乘以稀释倍数1。 

●检测步骤 

9)在包被好的酶标板中每孔加入标准溶液100μL，标准溶液(或处理好的样品)标准溶液浓度为0、0.0125、0.025、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05ng/mL和酶标物50μL，在室温下分别温育15分钟。 

10)洗涤，倾出孔中液体，向酶标板中加入300μL/孔的洗涤液，静置2分钟后拍 干，重复五次。 

11)每孔加入鲁米诺化学发光液180μL，5分钟后在化学发光检测仪上检测。 

●结果判断 

以所得的标准品发光值，除以第一个标准(0标准)的发光值再乘以100，得到抑制率(B/B0)，以抑制率为纵坐标，氯霉素浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。 

％抑制率＝％标准品(样品)发光值/0标准品发光值。 

8.试剂盒的灵敏度、准确度 

●试剂盒的灵敏度 

同时检测10个0标准样品，求出 

值，并将此值代入标准曲线求得灵敏度为0.0125ng/mL。 

●以批内误差和批间误差表示方法的准确度 

批内误差：每一标准品浓度作5次重复，以其批内变异系数表示批内误差。 

批间误差：重复已建立的测定操作，连续作5次，以其批间变异系数表示批间误差。 

表2-批内、批间误差 

实施例七、试剂盒的精密度 

取3份10g虾，加入一定量氯霉素配制成浓度为0.2、0.8、2ng/mL的虾样品，按照实施例三组织预处理方法进行处理，并求得回收率，结果列于表4，回收率为87.4——101％。 

表3-虾样品回收率 

实施例二、试剂盒特异性的试验 

判定试剂盒特异性的指标是交叉反应率，将氯霉素以及与氯霉素有类似结构和功能的几 种药物测定交叉反应率。通过各种药物的标准曲线得到其50％抑制浓度。用以下公式计算试剂盒对其他药物的交叉反应率。交叉反应率越小，说明此试剂盒对氯霉素的检测特异性越好。交叉反应率(％)＝(抑制50％氯霉素的浓度/抑制50％的氯霉素类似物浓度)×100％ 

表4-素交叉反应率 

Claims (9)

1.一种氯霉素的化学发光酶联免疫分析试剂盒，其特征是由(1)包被有包被抗原的微孔板，(2)氯霉素标准品，(3)酶标抗体工作液，(4)缓冲液，(5)洗涤液，(6)发光液组成。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是包被抗原(1)是由氯霉素小分子和载体蛋白(牛血清白蛋白BSA)通过EDC(碳二亚胺)法偶联制成的完全抗原。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是酶标氯霉素抗体(3)该酶标抗体是将辣根过氧化物酶通过过碘酸钠法与氯霉素抗体连接，形成酶标抗体。

4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征是包被有包被抗原的微孔板(1)，其特征为48孔、96孔或其他孔数的可拆卸或不可拆卸微孔板。

5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征是包被有包被抗原的微孔板，其制备：将包被抗原以包被缓冲液稀释，每孔加入50-300μL置于4℃冰箱包被。次日将包被抗原的微孔板取出洗涤后每孔加50-300μL封闭液，置于25-40℃水浴锅封闭0.5-2小时后再洗涤，拍干，用真空密封在4℃下保存。

6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征是发光液(6)，该发光液包含T缓冲液、鲁米诺、对羟基苯丙烯酸、过硼酸钠。

7.一种用权利要求1所述的试剂盒检测氯霉素的方法，其特征是向微孔板中加入氯霉素标准溶液或处理好的样品和酶标抗体，温育洗涤后加入发光液检测发光值，以加入氯霉素标准品的发光值绘制标准曲线，以加入被测样品的发光值从标准曲线上计算被测样品中氯霉素的含量。

8.根据权利要求7所述的检测氯霉素的方法，其特征是操作为：向包被好的酶标板中每孔加入标准溶液或处理好的样品和酶标物，在25-40℃下温育15分钟。洗涤后，每孔加入发光液1-5分钟后在化学发光检测仪上检测。以所得的标准品发光值，除以第一个标准(0标准)的发光值再乘以100，得到抑制率(B/B₀)，以抑制率为纵坐标，氯霉素浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。

9.根据权利要求7、8所述的检测氯霉素的方法，其特征是样品处理：

鱼虾样品：取10g去除脂肪的样品匀浆化，称量3g匀浆化的样品与6mL乙酸乙酯混合10min，4000g离心5min，转移2mL乙酸乙酯上层到干净的玻璃管中，50℃温和氮气流蒸发乙酸乙酯，脂肪残留物溶于1mL正己烷混匀1min，并加入1mL样品稀释液。涡旋混合1min，4000g离心分离5min。(注：如下层乳化，可将试管置于80℃水浴中5min左右，并再次进行离心)，弃去上层，吸取100μL下层溶液用于检测。最终检测结果应乘以稀释倍数1。

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