ES2385625B2

ES2385625B2 - Dispositivo para el diagnóstico rápido de enfermedades causadas por Clostridium difficile en muestras fecales

Info

Publication number: ES2385625B2
Application number: ES201230810A
Authority: ES
Inventors: Beatriz Velasco Michelena; Hugo Fernando CARTAGENA LIROLA; Paula ESQUIVIAS RUÍZ-DANA
Original assignee: Certest Biotec SL
Current assignee: Certest Biotec SL
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2012-05-29
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2032-05-29
Also published as: ES2385625A1; EP2669681A1

Abstract

Dispositivo inmunocromatográfico para el diagnóstico rápido de enfermedades causadas por Clostridium difficile que, mediante la aplicación de la muestra de heces dispersada en un diluyente, permite la detección simultánea y diferenciada de glutamato deshidrogenasa de Clostridium difficile y de lactoferrina y/o calprotectina fecales mediante la formación de conjugados con partículas coloreadas y su captura en una membrana porosa.

Description

Dispositivo para el diagnóstico rápido de enfermedades causadas por Clostridium difficile en muestras fecales

Campo de la invención

La presente invención se encuadra dentro del área de la biotecnología y en concreto en el diagnóstico de enfermedades gastrointestinales causadas por Clostridium difficile. El objeto de la invención es un dispositivo que permite un diagnóstico sencillo de las enfermedades causadas por Clostridium difficile (CD) mediante la detección de la glutamato deshidrogenasa (GDH) de Clostridium difficile y lactoferrina humana (hLf) y/o calprotectina humana (hCp).

Estado de la técnica

Clostridium difficile es un bacilo anaerobio grampositivo que forma esporas que le permiten sobrevivir en condiciones adversas (sequedad, calor, salinidad,…). Clostridium difficile es uno de los patógenos entéricos más frecuentemente identificado en pacientes hospitalizados.

La infección por Clostridium difficile es la principal causa de diarrea, colitis y colitis pseudomembranosa asociada a la toma de antibióticos. Existen cepas que producen toxinas (A y/o B) y otras que no las producen. Solo las cepas toxigénicas causan diarrea.

Las formas de diagnosticar una infección causada por Clostridium difficile son:

A. Cultivo y aislamiento a partir de muestras de heces. Se hace en condiciones anaerobias y es muy lento y costoso. No tiene mucha sensibilidad, pero permite hacer test de susceptibilidad a antibióticos de cara a un posible tratamiento.

B. Citotoxicidad en cultivo celular. Este método es considerado método de referencia. Presenta una especificidad y sensibilidad cercanas al 100 %. Sin embargo, es una técnica lenta (más de dos días), costosa (cultivo celular) y requiere personal muy especializado.

C. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Método específico y sensible que además permite distinguir distintas variantes. Es caro, necesita de personal especializado y equipamiento sofisticado.

D. Enzimoinmunoensayos (ELISA). Detectan la presencia de las Toxinas A y B juntas o por separado. Es más fácil y rápida (2h) que la citotoxidad en cultivo celular y la PCR pero tiene una baja sensibilidad (45-95 %) debido a que a menudo la concentración de las toxinas en las heces es extremadamente baja. Para superar el problema de la baja sensibilidad que presentan los inmunoensayos de detección de toxinas se ha propuesto su utilización combinada con la detección de la glutamato deshidrogensa de Clostridium difficile (GDH), que presenta una buena sensibilidad y especificidad, aunque no es capaz de distinguir entre cepas patógenas (toxigénicas) y no patógenas (no toxigénicas) (EP 1019724). Pero este procedimiento adolece de baja sensibilidad para las cepas patógenas (productoras de toxinas).

E. Inmunocromatografía. Los test inmunocromatogáficos (IC) son rápidos, baratos y fáciles de llevar a cabo. Existen en el mercado varios tipos de test: los que detectan los toxinas como el C. diff QUICK CHECK (Techlab, Inc., Blacksburg, VA USA) y que adolecen de la misma falta de sensibilidad que el ELISA por la, a menudo, extremadamente baja concentración fecal de de Toxinas A y/o B; y los que detectan la glutamato deshidrogensa de Clostridium difficile (GDH) como el ImmunoCard® C. difficile GDH Test (Meridian Bioscience, Cincinnati, OH, USA). Estos test son muy sensibles y específicos pero son incapaces de distinguir entre cepas patógenas (toxigénicas) y no patógenas (no toxigénicas).

Para superar el problema de la baja sensibilidad que presentan los inmunoensayos de detección de toxinas, algunos autores (Wren, MW et al. en Br J Biomed Sci. 2009; 66 (1); 1-5.) han propuesto la determinación de la lactoferrina fecal como ayuda al diagnóstico de de las enfermedades causadas por Clostridium difficile.

La lactoferrina (hLf) fecal es un marcador de presencia de leucocitos normalmente asociados a procesos inflamatorios. En la patente europea EP0641441 se describe una prueba in vitro para la determinación de leucocitos en muestras de heces utilizando un inmunoensayo con anticuerpos anti-lactoferrina.

Al igual que la lactoferrina, la calprotectina (hCp) es marcador inflamatorio. Se libera por los leucocitos activados por procesos inflamatorios o infecciosos. La patente US5455160 describe un método inmunológico para la detección de calprotectina humana fecal y su uso para el despistaje de algunas enfermedades intestinales como la enfermedad inflamatoria intestinal y el cáncer colorrectal.

El documento de patente WO2012052586 (A1) describe un inmunoensayo rápido para detección simultánea y diferenciada de calprotectina y lactoferrina humanas fecales y aplicación en el diagnóstico de algunas enfermedades intestinales en las que intervienen procesos inflamatorios como la enfermedad inflamatoria intestinal y el cáncer colorrectal.

En todo lo descrito anteriormente, los inmunoensayos para GDH y calprotectina y/o lactoferrina son distintos y usualmente basados en técnicas diferentes. Se realiza un determinado inmunoensayo para GDH y otro para calprotectina y/o lactoferrina, lo que significa que hay que preparar muestras distintas, en diluyentes distintos, y realizar ensayos distintos y esto implica:

a.: Un mayor gasto de tiempo.

b.: Un mayor número de manipulaciones, con el inherente riesgo de error.

c. Los resultados obtenidos para los dos parámetros no se correlacionan directamente, puesto que provienen de dos muestras o técnicas diferentes.

El objeto de la presente invención es un dispositivo de diagnóstico rápido del tipo inmunocromatogáfico (IC) para la determinación simultánea y diferenciada de GDH, calprotectina y/o lactoferrina en muestras fecales que presenta las siguientes ventajas:

a.: Se ensayan simultáneamente, con lo que se reduce el tiempo de ensayo y el número de manipulaciones, reduciéndose así el riesgo de error. La determinación simultánea de los marcadores hace que la prueba sea más sensible.

b.: La determinación es diferenciada, es decir, se visualiza en líneas distintas la presencia de calprotectina, lactoferrina y GDH. La determinación diferenciada de los marcadores hace que la prueba pueda ser más específica.

c.: Se utilizan unos viales específicos que permiten la toma de la muestra de forma cuantitativa y su dispersión en el diluyente de manera fácil e higiénica.

Descripción breve

El método de diagnóstico de la presente invención consiste en: la toma de una porción representativa de la muestra de heces, su dispersión en un diluyente específico, la aplicación de esta dispersión de la muestra en un dispositivo inmunocromatográfico específico, la formación de complejos entre los anticuerpos del dispositivo y los antígenos de la muestra y la visualización de estos complejos en la membrana del dispositivo.

El dispositivo inmunocromatográfico utilizado es de un solo uso. No se requiere ningún tipo de instrumentación para llevar a cabo el método o interpretar el resultado. Como muestra se utilizan heces.

El tiempo de preparación de la muestra son unos dos minutos y el tiempo de desarrollo de la prueba es de 5 a 10 minutos, lo que significa entre 10 y 20 veces menos que los ensayos ELISA o PCR, mucho más complejos de llevar a cabo y que necesitan de instrumentación de laboratorio.

Por su sencillez, la prueba se puede llevar a cabo en la consulta del médico, e incluso, con las instrucciones adecuadas, por el propio paciente.

Descripción de la figuras

Figura 1: Esquema de las etapas del método de diagnóstico. El dispositivo o vial específico para la toma de muestras fecales de forma cuantitativa (Figura 1A) es un vial de plástico de unos 2-3 mL de capacidad, en el que previamente se ha dispensado 1 mL de diluyente, con un tapón a rosca que dispone de un vástago cuyo extremo, diseñado al efecto, permite la recolección cuantitativa de una muestra de heces (Figura 1B) sólidas o semisólidas cuando al pasar por el anillo reductor (8) son introducidas en el vial. Tras esto, se cierra y se agita vigorosamente (Figura 1C) hasta la completa dispersión de la muestra. Por último, se rompe la parte opuesta del dispositivo (Figura 1D) y se añaden unas gotas sobre el lugar de aplicación de la muestra del dispositivo inmunocromatográfico (Figura 1E). En caso de que no se requiera la toma de muestras de forma cuantitativa se utiliza un vial de características similares pero sin anillo reductor (8).

Figura 2: Vistas del dispositivo de diagnóstico.

Figura 2A: Vista de la tira inmunocromatográfica para la detección de GDH. Dicha tira incluye los siguientes elementos: un material absorbente (1), una membrana porosa (2) con una línea de control (3), una línea para la detección de GDH (4), un lugar de aplicación de la muestra (7) y un lugar en el que se ha depositado el conjugado anticuerpo-marcador (6).

Figura 2B: Vista superior del dispositivo de diagnóstico abierto en la que se observan las dos tiras inmunocromatográficas en colocación paralela sobre la parte inferior del dispositivo.

Figura 2C: Vista superior del dispositivo de diagnóstico, en la que se observan las ventanas de resultados y los puntos de aplicación de la muestra (S) en la cara superior del dispositivo. A 5 y B indican la posición de cada una de las tiras inmunocromatográficas. C y T indican la

posición de las líneas del test.

Figura 3: Vistas del dispositivo de diagnóstico.

Figura 3A: Vista de la tira inmunocromatográfica para la detección de lactoferrina y calprotectina. Dicha tira incluye los siguientes elementos: un material absorbente (1´), una

10 membrana porosa (2´) con una línea de control (3´), una línea para la detección de calprotectina (4´) y otra línea para la detección de lactoferrina (5´), un lugar de aplicación de la muestra (7´) y un lugar en el que se ha depositado el conjugado anticuerpo-marcador (6´).

Figura 3B: Vista superior del dispositivo de diagnóstico abierto en la que se observan las dos tiras inmunocromatográficas en colocación paralela sobre la parte inferior del dispositivo.

15 Figura 3C: Vista superior del dispositivo de diagnóstico, en la que se observan las ventanas de resultados y los puntos de aplicación de la muestra (S) en la cara superior del dispositivo.

Descripción detallada

En la presente invención se trata de un dispositivo con dos tiras inmunocromátográficas: una tira para la detección sensible de GDH y otra para la detección cuantitativa de lactoferrina y/o calprotectina. Existen tres posibilidades: (A) una tira inmunocromatográfica de detección de GDH y otra de lactoferrina; (B) una tira inmunocromatográfica de detección de GDH y otra de calprotectina; (C) una tira inmunocromatográfica de detección de GDH y otra de detección simultánea de lactoferrina y calprotectina.

Para la detección de GDH se utiliza un único anticuerpo monoclonal anti–GDH. Este anticuerpo monoclonal (GD10) se ha desarrollado utilizando GDH altamente purificada. El anticuerpo monoclonal obtenido presenta una elevada afinidad y especificidad frente al complejo formado por las subunidades de la GDH. Para la detección de calprotectina se utiliza un único anticuerpo monoclonal anti–calprotectina. Este anticuerpo monoclonal (CA1) se ha desarrollado utilizando calprotectina altamente purificada. Al igual que en caso anterior, el anticuerpo monoclonal obtenido presenta una elevada afinidad y especificidad frente al complejo formado por las dos subunidades de la calprotectina, mientras que apenas se une a cada una de las subunidades por separado. Por último, para la detección de lactoferrina, se utilizan anticuerpos policlonales de conejo anti-lactoferrina humana. Estos anticuerpos se han obtenido inmunizando conejos con lactoferrina humana purificada y posteriormente han sido purificados por cromatografía de afinidad frente al mismo antígeno (lactoferrina humana purificada).

Con los anticuerpos descritos, se preparan, por separado, conjugados con nanopartículas coloreadas. Estas nanopartículas son depositadas en cada una de las tiras del dispositivo de ensayo y actúan como fase móvil. Los mismos anticuerpos son inmovilizados por separado sobre la membrana que actúa como fase fija y en la que se produce la captura inmunológica, bien de la GDH de Clostridium difficile, bien de la calprotectina y/o lactoferrina humanas. Las membranas y los materiales con los conjugados son montados con la ayuda de otros materiales sobre un soporte plástico y el conjunto se corta en forma tira. Estas tiras son introducidas en el dispositivo de diagnóstico.

Para mejorar la utilidad diagnóstica del dispositivo de la invención se utiliza un valor de corte para la concentración lactoferrina y calprotectina. Este valor de corte se ha establecido en 10 μg hLf/g y 50 μg hCp/g de heces. El valor de corte no es necesario para la detección de GDH puesto que al tratarse de un antígeno de un agente infeccioso se requiere la máxima sensibilidad.

Para realizar el ensayo con un valor de corte es necesaria una toma de muestra cuantitativa. Para facilitar la toma de la muestra de forma cuantitativa se utiliza un vial calibrado. Este vial posee un vástago unido al tapón del vial que posee unas hendiduras tales que, al pasar por el anillo reductor incorporado en el cuerpo del vial, introduce solamente una cantidad conocida de muestra, que en este caso es de 10 mg (o 10 μL en el supuesto de muestra líquida).

Para la realización del ensayo es necesaria la preparación de dos viales a partir de la misma muestra de heces. Para determinar la lactoferrina y/o la calprotectina se resuspende la muestra de heces en el diluyente de dispersión de la muestra, en una proporción aproximada 1/100. Si la muestra es líquida, 10 !L de muestra se mezclan con 1 mL del diluyente. Si la muestra es sólida se separan 10 mg de muestra con la ayuda de una espátula y se dispersan en 1 mL de diluyente. Resulta muy conveniente la utilización del vial de toma de muestra en el que se introduce la muestra con la ayuda de un vástago, tras lo que se cierra con el tapón a rosca y se agita vigorosoramente para posteriormente romper la parte superior del tapón y añadir 4-5 gotas sobre el punto de aplicación de la muestra del dispositivo inmunocromatográfico. El diseño del vástago es tal que al pasar por el orificio reductor del vial permite la introducción de una cantidad predeterminada de la muestra de heces, en este caso 10 mg.

Para determinar la GDH se resuspende la muestra de heces en el diluyente de dispersión de la muestra en una proporción aproximada 1/10. Si la muestra es líquida, 100 !L de muestra se mezclan con 1 mL del diluyente. Si la muestra es sólida se separan 100 mg de muestra con la ayuda de una espátula y se dispersan en 1 mL de diluyente. Resulta muy adecuado la utilización del vial de toma de muestra en el que se introduce la muestra con la ayuda de un vástago, tras lo que se cierra con el tapón a rosca y se agita vigorosoramente para posteriormente romper la parte superior del tapón y añadir 4-5 gotas sobre el punto de aplicación de la muestra del dispositivo inmunocromatográfico. De esta manera la manipulación de la muestra resulta un procedimiento sencillo rápido e higiénico.

Para una mayor facilidad y conveniencia, el dispositivo de diagnóstico, el diluyente y los viales pueden agruparse, junto las instrucciones de uso, en forma de kit para la realización de una o más pruebas diagnósticas.

Interpretación analítica de los resultados de la prueba.

Tras la aplicación de la muestra en el dispositivo se espera 10 minutos para visualizar las líneas y se interpreta el resultado. El test se considera negativo si solo aparecen las líneas de control en las ventanas de resultados. Se considera positivo para GDH si, además de la línea de

5 control, aparece una línea en la posición de la tira para GDH. Se considera positivo para calprotectina si en la tira correspondiente, además de la línea de control, aparece una línea en la posición de la calprotectina (por ejemplo, roja); positivo para lactoferrina si en su tira, además de la línea de control, aparece una línea en la posición de la lactoferrina (por ejemplo, azul); y positivo para ambas (hLf y hCp) si aparecen tres líneas (por ejemplo, verde, roja y azul)

10 Interpretación diagnóstica de los resultados de la prueba.

Un resultado negativo para GDH, hLf y hCp indica que no hay infección por Clostridium difficile. Positivo para GDH y negativo para hLf y hCp indica que hay colonización de Clostridium difficile pero de una cepa no patógena (no toxigénica). Por último un resultado positivo para GDH y positivo para hLf o hCp indica un proceso inflamatorio causado por una

15 infección de Clostridium difficile.

Ejemplos de realización:

Ejemplo 1:

Obtención de GDH de Clostridium difficile: Clonación del gen gluD de Clostridium difficile

El gen gluD (Glutamato Dehidrogenasa, Número de Acceso de GenBank M65250) de

20 Clostridium difficile se clonó en los sitios NcoI/XhoI del plásmido pET-30b(+) (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) empleando como molde para la amplificación mediante PCR de dicho gen ADN genómico de la cepa toxigénica estándar VP1 10463 (ATCC 43255).

La extracción de ADN genómico de la cepa VP1 10463 se llevó a cabo mediante el kit QIAamp

DNA Minikit (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante.

25 El gen gluD (1.282 pb) se amplificó usando la ADN Polimerasa TaKaRa LA Taq (Takara Bio Inc., Shiga, Japón) y de los cebadores gluD1 (AGGACCATGGCTTCAGGAAAAGATGTAAATGTC) y gluD2 (CAGCCTCGAGTTAGTACCATCCTCTTAATTTCATAGC). A la mezcla de PCR se añadieron deoxinucleótidostrifosfato (2.5 mM de cada uno), cebadores (0.2 μM de cada uno), 5 μl de 10x LA PCR Buffer (Mg2+), 2 unidades de ADN polimerasa TaKaRa LA Taq, 50 ng de DNA genómico y agua purificada hasta un volumen final de 50 μL. La amplificación del ADN se llevó a cabo mediante una desnaturalización inicial de 1 minuto a 94ºC, 30 ciclos de desnaturalización (10 segundos a 98ºC), anillamiento (30 segundos a 58ºC) y extensión (30 segundos a 72ºC) y un último ciclo de extensión de 10 minutos a 72ºC.

El producto de PCR se visualizó por electroforesis en gel de agarosa al 1% preparados en tampón TBE (89 mM Tris, 89 mM Ácido Bórico, 2mM EDTA, pH 8.4) y teñidos con 1x GelRed (Biotium Inc., Hayward, Ca, EEUU). El tamaño de las bandas de ADN se estimó con ayuda del marcador de peso molecular Perfect DNA Markers (0.1-12 Kb) (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania).

El fragmento de ADN resultante se aisló y purificó mediante columnas Ultra Clean PCR Clean-Up (Mo BioLaboratories, Inc., Carlsbad, CA, EEUU) y se clonó en el plásmido pET-30b(+) previa digestión tanto del producto de PCR purificado como del plásmido con las enzimas de restricción NcoI y XhoI (Takara Bio Inc., Shiga, Japón) y posterior ligación con la enzima T4DNA Ligase (Takara Bio Inc, Shiga, Japón).

Con el plásmido resultante se transformaron células competentes DH5α de Escherichia coli (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EEUU). Los clones positivos se seleccionaron en placas de LB + 50μg/mL Kanamicina. La presencia en las células del plásmido pET-30b(+) + gluD se comprobó mediante PCR y digestión con enzimas de restricción.

Obtención de GDH de Clostridium difficile: Expresión y purificación de la proteína GDH en E. coli

La expresión de la proteína Glutamato Dehidrogenasa (GDH) se llevó a cabo en células competentes BL21 (DE3) pLysS de E. coli (Promega, Southampton, Reino Unido). Estas células se transformaron con el plásmido pET-30b(+) + gluD y los clones positivos se seleccionaron en placas de LB + 50 μg/mL Kanamicina + 25 μg/mL Cloranfenicol.

Para inducir la expresión de GDH, una de estas colonias se inoculó en 80 ml de LB + 50 μg/mL Kanamicina + 25 μg/mL Cloranfenicol y se cultivó durante toda la noche a 37ºC en agitación (225 rpm). Al día siguiente el cultivo se diluyó 20 veces en un volumen final de 1.200 mL de LB

+ 50 μg/mL Kanamicina + 25 μg/mL Cloranfenicol y se incubó manteniendo las mismas condiciones de temperatura y agitación hasta que éste alcanzó una D.O. de 0.5 a 600 nm. A continuación se añadió IPTG a una concentración 1mM y se cultivaron las células durante 6 horas a 37ºC y una agitación de 225 rpm para inducir la expresión de GDH. Las células se recogieron mediante centrifugación a 11.000 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos.

Para la obtención del extracto proteico el pellet de células se resuspendió en un volumen de 5 ml de Buffer de Lisis (0.2 mg/mL Lysozyme from chicken egg white (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania), 20 μg/mL Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania), 20 μg/mL RNAse A (Applichem GmbH, Darmstadt, Alemania), 1 mM MgCl2 (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania), 1mM PMSF (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania), 1 pastilla de complete ULTRA Tablets Mini EDTA-free, EASYpack (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) Binding Buffer (20 mM sodio fosfato, 0.5 M NaCl, 50 mM imidazol, pH 7.4) por cada gramo de células y se incubó durante una hora a 4ºC.

Transcurrido este tiempo las muestras se sonicaron 5 veces durante 30 segundos con intervalos de 1 minuto en hielo a una Intensidad de 7 en un equipo Branson Sonifier 250 (Branson Ultrasonics Co., Danbury, CT, EEUU) y se centrifugaron a 11.000 rpm durante 30 minutos a 4ºC. El sobrenadante se filtró con una membrana de 0.2 μm (Pall Corporation, Ann Arbor, MI, EEUU).

La purificación de la proteína recombinante se realizó por cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) utilizando una columna HisTrap HP (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suecia). Previamente la columna fue pre-equilibrada con 10 volúmenes de Binding Buffer (20 mM sodio fosfato, 0.5 M NaCl, 50 mM imidazol, pH 7.4) y después se aplicó el extracto proteico filtrado a la columna a un flujo de 5mL/minuto. A continuación se lavó la columna con 10 volúmenes de Binding Buffer manteniendo el flujo de 5mL/minuto. La proteína recombinante unida a la columna se eluyó a un flujo de 2,5 mL/minuto con Elution Buffer (20 mM sodio fosfato, 0.5 M NaCl, 500 mM imidazol, pH 7.4) y se recogieron fracciones. Se determinó el grado de pureza mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). La eliminación de la cola de histidinas se realizó por digestión enzimática con Enterokinasa (4μL/mg de proteína, New England Biolabs, Ipswhich, MA, Reino Unido) durante 16 horas a 23ºC y posterior pase por una columna HisTrap HP (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suecia).

Ejemplo 2:

Preparación y purificación de anticuerpos monoclonales anti-GDH

El anticuerpo monoclonal GD10 se purifica a partir del cultivo del hibridoma del mismo nombre. La obtención del hibridoma productor del anticuerpo monoclonal GD10 se realizó mediante protocolos conocidos según el método de fusión celular y selección de los clones obtenidos que fue inicialmente descrito por Kohler y Milstein en 1975 (Köhler G, Milstein C.

Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975 Aug 7;256 (5517):495-7).

El procedimiento es el siguiente. Ratones del tipo BALB/c se inmunizan con GDH Clostridium difficile purificada. Los linfocitos de los ratones inmunizados se fusionan con células 5 mielómicas de la linea SP20 y los hibridomas obtenidos se seleccionan mediante técnicas ELISA de la siguiente manera: los pocillos de una placa microtiter de 96 pocillos se tapizan con anticuerpo policlonal de conejo anti-GDH en tampón carbonato 100 mM de pH 9 a 37 ºC durante 2 h. A estos pocillos se añade la GDH purificada. Tras su lavado se añaden las distintas muestras de cultivo de hibridomas y la presencia del anticuerpo anti-GDH se revela utilizando

10 un conjugado anti-mIgG con peroxidasa y el sustrato correspondiente.

Se seleccionan los hibridomas que mayor afinidad y mejor especificidad presentan. Entre estos se seleccionan los más productores y los que mejores prestaciones ofrecen en los pruebas de estrés térmico y velocidad de reacción frente al antígeno.

El hibridoma seleccionado GD10 se cultiva en medio RPMI-HT durante varios días a 37

15 grados centígrados con 5% de CO2. A partir del medio de cultivo se purifica el anticuerpo por cromatografía de afinidad a proteína A según las instrucciones del fabricante de la columna (GE Healthcare) tras lo que se dializa en PBS de pH 7,4.

Ejemplo 3:

Preparación de los conjugados anti-GDH

20 Se prepara un conjugado del anticuerpo GD10 con micropartículas de poliestireno. Se utilizan partículas coloreadas con grupos carboxilo en su superficie de 200 nm de diámetro nominal (K1 020 de la marca Estapor, Merck, Darmstadt, Alemania). 1 mL de partículas al 10% se lavan por centrifugación y resuspensión en tampón MES (ácido 2-(Nmorfolino)etanosulfónico) 10 mM de pH 6 y se le añade EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)

25 carbodiimida) hasta una concentración de 5 mM. Se incuba 1h a 37 grados y se retira el exceso de reactivo por centrifugación. Las partículas así activadas se resuspenden en MES 10 mM de pH 6 y se les añade el anticuerpo monoclonal anti-GDH hasta una concentración superficial de 2 mg/m2 tras lo que se incuban 18 h a 4 grados y posteriormente se lavan en Tween 20 al 0,1%.

Los conjugados con partículas para línea de control se obtienen de la misma manera pero, utilizando en lugar del anticuerpo, streptavidina (S4762, Sigma-Aldrich) a una concentración superficial final de 1 mg/m2.

Ejemplo 4:

Preparación de la tira de detección de GDH

Una mezcla de los conjugados con partículas con anti-GDH y streptavidina descritos en concentraciones de 0,05% y 0,03% respectivamente, se diluyen en una solución que contiene sacarosa 10%, caseína bovina 2%, albúmina bovina 2%, PEG-6000 1% y Tween-20 2% en tampón TRIS (tris(hidroximetil)aminometano) de pH 8,3. Esta solución se deposita a razón de 13 μL/cm en un material bobinado de fibras de poliéster no entretejidas de 29 mm de ancho que se seca en corriente de aire a 45 grados tras la deposición (5 minutos) y durante 24 h en una cámara a 30 grados centígrados y 15 % de humedad relativa.

Los anticuerpos anti-GDH y anti-streptavidina (para la línea de control) se dializan en PBS, se llevan a una concentración de 1 mg/mL y se depositan linealmente por separado y de forma paralela sobre una membrana de nitrocelulosa laminada (Hi-Flow Plus de Millipore) de 25 mm de ancho y de tamaño de poro entre 10 y 30 micrómetros a razón de 1 !L/cm tras lo cual se seca en corriente de aire a 45 grados tras la deposición (2 minutos) e inmediatamente después durante 24 h en una cámara a 30 grados centígrados y 15 % de humedad relativa.

El material con el conjugado, la membrana y el material absorbente se montan conforme indica la figura 2A sobre un soporte plástico con una lámina adhesiva y las tiras son cortadas transversalmente a su montaje a una anchura de 4 mm.

Ejemplo 5:

Preparación de la tira de detección de lactoferrina y calprotectina

La tira para la de detección de lactoferrina y calprotectina se prepara de manera similar a como se describe en el documento de patente WO2012052586 (A1). La tira para la de detección de lactoferrina exclusivamente, se prepara de la misma forma pero sin utilizar el anticuerpo anti-hCp en la membrana y sin depositar el coloide anti-calprotectina en el absorbente. La tira para la de detección de calprotectina exclusivamente se prepara de la misma manera pero sin el anticuerpo anti-hLf en la membrana y sin el coloide anti-lactoferrina en el absorbente.

Montaje del dispositivo.

Las dos tiras IC se disponen en el interior de una carcasa de material plástico que se ha

5 diseñado de tal forma que presenta un alojamiento para cada una de las tiras, dos ventanas diferencias para la adición de las muestras y otras dos ventanas para la visualización de los resultados. La carcasa plástica puede ir marcada o impresa para la correcta indicación al usuario de la posición de cada tira.

Se prepara una solución para la dispersión de las muestras de heces consistente en una

10 disolución acuosa de cloruro de sodio 300 mM, Triton X-100 al 1%, anticuerpos IgG inespecíficos de ratón 100 μg/mL y anticuerpos IgG inespecíficos de conejo a 200 μg/mL en un tampón TRIS-HCl 200 mM a un pH de 8,5. Esta preparación de dispensa en viales para la toma de muestra a razón de 1 mL/vial.

Ejemplo 6.

15 Detección GDH

Se prepararan diluciones seriadas 1/2 de GDH en el diluyente de dispersión de muestras descrito en el apartado anterior. 100 !L de estas diluciones se aplican a los dispositivos inmunocromatográficos de la invención y se deja progresar el ensayo durante 10 minutos a temperatura ambiente (25 ºC) tras lo cual se procede a interpretar el resultado mediante

20 apreciación visual de aparición de la línea de test. Se realiza la misma operación pero diluyendo la GDH en un pool de muestras de heces resuspendidas aproximadamente 1/10 en el mismo tampón. Los resultados se muestran en la tabla 1.

Tabla 1

ng GDH/mL: En diluyente En heces

100: + +

50: + +

25: + +

12,5: + +

6,25: + +

3,125: + +

1,56: + +

0,78: + +

0,39: - -

0: - -

Detección calprotectina y lactoferrina fecales

Para que el dispositivo de la invención tenga una adecuada utilidad diagnóstica es necesario utilizar unos valores de corte, es decir, la concentración del analito por encima de la cual el 5 test es positivo y por debajo de la cual el test es negativo. En el caso de la calprotectina el valor

de corte es 50 μg/g de heces y para la lactoferrina es 10 μg hLf/g de heces.

Debido a la existencia del valor de corte, es necesario tomar la muestra de heces de forma cuantificada. Para ello se utiliza un vial específico para la toma de muestras fecales que contiene un vástago con hendiduras para la muestra y un reductor para eliminar la muestra

10 sobrante, de manera que el sistema ha sido calibrado para que se introduzcan en el vial exactamente 10 mg de muestra fecal. Por otro lado, y puesto que el vial contiene 1 mL de diluyente, la toma de la muestra se realiza de forma cuantitativa.

Calprotectina:

Se prepararan diluciones seriadas 1/2 de calprotectina en el diluyente de dispersión de

15 muestras descrito en el apartado anterior. 100 !L de estas diluciones se aplican a los dispositivos inmunocromatográficos de la invención y se deja progresar el ensayo durante 10 minutos a temperatura ambiente (25ºC) tras lo cual se procede a interpretar el resultado mediante apreciación visual de aparición de la línea de test. Se realiza la misma operación pero diluyendo la calprotectina en un pool de muestras de heces resuspendidas aproximadamente

20 1/100 en el mismo tampón. Los resultados se muestran en la tabla 2.

Tabla 2

ng hCp/mL: En diluyente En heces g hCp/g heces

16000: + + 1600

8000: + + 800

4000: + + 400

2000: + + 200

1000: + + 100

500: + + 50

250: - - 25

125: - - 12,5

0: - -
0

Lactoferrina:

Se prepararan diluciones seriadas 1/2 de lactoferrina en el diluyente de dispersión de

5 muestras descrito en el apartado anterior. 100 μL de estas diluciones se aplican a los dispositivos inmunocromatográficos de la invención y se deja progresar el ensayo durante 10 minutos a temperatura ambiente (25ºC) tras lo cual se procede a interpretar el resultado mediante apreciación visual de aparición de la línea de test. Se realiza la misma operación pero diluyendo la lactoferrina en un pool de muestras de heces resuspendidas aproximadamente

10 1/100 en el mismo tampón. Los resultados se muestran en la tabla 3.

Tabla 3

ng hLf/mL: En diluyente En heces g hLf/g heces

3200: + + 320

1600: + + 160

800: + + 80

400: + + 40

200: + + 20

100: + + 10

50: - - 5

25: - - 2,5

0: - -
0

Una muestra de heces que contenga una concentración de GDH igual o superior a 0,8 ng/mL, una concentración de calprotectina fecal humana mayor o igual 50 μg/g heces y una concentración de lactoferrina igual o mayor que 10μg/g en heces, dan resultados positivos usando el test de la presente invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Dispositivo inmunocromatográfico para el diagnóstico de las enfermedades causadas por Clostridium difficile en muestras de heces caracterizado por que comprende:

a. Una tira inmunocromatográfica para detección de glutamato deshidrogenasa 5 de Clostridium difficile.

b. Una tira inmunocromatográfica para detección diferenciada de lactoferrina y/o calprotectina.
2. Dispositivo según la reivindicación 1 en el que, además de glutamato deshidrogenasa, se detecta sólo lactoferrina.

10 3. Dispositivo según la reivindicación 1 en el que, además de glutamato deshidrogenasa, se detecta sólo calprotectina.
4. Kit de diagnóstico de enfermedades causadas por Clostridium difficile caracterizado porque comprende:

a.

Un dispositivo inmunocromatográfico según las reivindicaciones 1-3, 15 b. Uno o varios diluyentes para la suspensión y dispersión del material fecal,

c. Dos viales para la toma de muestra y su manipulación.

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.º solicitud: 201230810

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 29.05.2012

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría

56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas

X

ES 2374365 A1 (CERTEST BIOTEC, S.L.) 16.02.2012, resumen; reivindicaciones 1-3,5-6,8, figura 2A. 4,6

A

1-3,5

X

ES 2380664 A1 (CERTEST BIOTEC, S.L.) 17.05.2012, resumen; reivindicaciones 1-6; figuras 1,2A. 4,6

A

1-3,5

X

CERTEST BIOTEC S.L. "CERTEST HAV. One step Hepatitis A virus Card Test". Versión 02.1, Mayo 2010. Recuperado de Internet: <URL: http://www.certest.es/instrucciones/Hepatitis%20A/Instrucciones%20HA/IU-HA8FV%20 rev%2002.1.pdf>. Todo el documento. 4,6

A

1-3,5

X

WO 0136975 A1 (BINAX INC (US)) 25.05.2001, página 3, línea 32 – página 4, línea 25; página 5, línea 29 – página 9, línea 9; reivindicaciones 1,3-5,7-9,12,15,26,29,31,33. 4-5

A

1-3

X

US 20060148097 A1 (YAMAGUCHI, H. et al.) 06.07.2006, párrafo (0044); reivindicaciones 1,14,16-18; figura 1. 4

A

1-3,5

X

US 5965375 A (VALKIRS, G.E.) 12.10.1999, reivindicaciones 1-6,10-11,17,20,26-28,32-33. 4

A

1-3,5-6

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:

Fecha de realización del informe 26.06.2012

Examinador I. Galíndez Labrador Página 1/5

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 201230810

CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD

G01N33/569 (2006.01) G01N33/573 (2006.01) G01N33/577 (2006.01) G01N33/577 (2006.01)

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

G01N

Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados)

INVENES, EPODOC, WPI, BIOSIS, MEDLINE, NPL

Informe del Estado de la Técnica Página 2/5

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201230810

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 26.06.2012

Declaración

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

Reivindicaciones 1-3, 5-6 Reivindicaciones 4 SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

Reivindicaciones 1-3 Reivindicaciones 4-6 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

Base de la Opinión.-

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Técnica Página 3/5

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201230810

1. Documentos considerados.-

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

Documento

Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

D01

ES 2374365 A1 (CERTEST BIOTEC, S.L.) 16.02.2012

D02

ES 2380664 A1 (CERTEST BIOTEC, S.L.) 17.05.2012

D03

CERTEST BIOTEC S.L. "CERTEST HAV. One step Hepatitis A virus Card Test". Versión 02.1, Mayo 2010. Recuperado de Internet: <URL: http://www.certest.es/instrucciones/Hepatitis%20A/Instrucciones%20HA/IUHA8FV%20rev%2002.1.pdf>. Todo el documento.

D04

WO 0136975 A1 (BINAX INC (US)) 25.05.2001

D05

US 20060148097 A1 (YAMAGUCHI, H. et al.) 06.07.2006

D06

US 5965375 A (VALKIRS, G.E.) 12.10.1999
2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

El documento a estudio tiene por objeto un dispositivo para el diagnóstico rápido de enfermedades causadas por Clostridium difficile en muestras fecales mediante la detección de la glutamato deshidrogenasa del microorganismo y de lactoferrina y/o calprotectina humanas, marcadores estas dos últimas de la presencia de leucocitos asociados a procesos inflamatorios o infecciosos. El método consiste en la toma de una muestra de heces, su dispersión en un diluyente, la aplicación de esta dispersión en una tira inmunocromatográfica, la formación de complejos antígeno-anticuerpo y la visualización de estos complejos. (Reivindicación 4) Emplea anticuerpos monoclonales anti-GDH y anti-calprotectina y anticuerpos policlonales de conejo anti-lactoferrina. Con los anticuerpos descritos se preparan conjugados con nanopartículas coloreadas que se depositan en la tira y actúan como fase móvil. Los mismos anticuerpos se inmovilizan por separado sobre la membrana que actúa como fase fija. La tira está dividida en las siguientes zonas (en el sentido en el que corre la muestra): aplicación de la muestra, conjugado anticuerpo-marcador, membrana porosa, en la que se encuentran las líneas de detección de los antígenos y la línea de control y, finalmente, un material absorbente. Se emplean 2 tiras, una para la detección de GDH y otra para la detección de lactoferrina y/o calprotectina. (reiv. 1-3). También se reivindican la dispersión de la muestra en 2 viales separados, uno para la GDH y otro para lactoferrina y/o calprotectina (reiv. 5) y el kit empleado (reiv. 6). El documento D01 describe un método de diagnóstico de hepatitis A en muestras de heces (reiv. 1-5), una tira inmunocromatográfica para la realización de dicho método (reiv. 6-7) y el kit correspondiente (reiv. 8). Este documento difiere del documento a estudio en que en el primero se detecta un único antígeno en una única tira, mientras que en el segundo se detectan 2 o hasta 3 antígenos en tiras diferentes. Sin embargo, la tira, los viales y el procedimiento son idénticos. No se considera que el aplicarlo a un microorganismo u otro o usar 1 o varias tiras en las que se detecten 1 o varios antígenos implique actividad inventiva alguna, en el sentido del artículo 8 de la Ley 11/86 de Patentes, ya que resulta obvio para cualquier experto en la materia. Se estima, por tanto, que este documento destruye la actividad inventiva de las reivindicaciones 4 y 6 de la solicitud a estudio. El documento D2 divulga una tira inmunocromatográfica que, mediante la aplicación de una muestra de heces dispersada en un diluyente, permite la detección simultánea de lactoferrina y calprotectina, mediante la formación de conjugados anticuerpos-partículas coloreadas y su captura en una membrana porosa (reiv. 1-2). Se refiere también al uso de dicha tira para el diagnóstico de enfermedad inflamatoria intestinal, diarrea infecciosa o cáncer colorectal (reiv. 3-5) y al kit correspondiente (reiv. 6). Este documento difiere del documento a estudio en que en el primero se detectan hasta 2 antígenos en una única tira, mientras que en el segundo se detectan 2 o hasta 3 antígenos en tiras diferentes. Al igual que en el documento D01, la tira, los viales y el procedimiento son idénticos, así como los anticuerpos, en este caso. No se considera, por las mismas razones esgrimidas para el documento D01, que las diferencias anteriores impliquen actividad inventiva alguna, en el sentido del artículo 8 de la Ley 11/86 de Patentes, Se estima, por tanto, que este documento destruye la actividad inventiva de las reivindicaciones 4 y 6 de la solicitud a estudio. El documento D3 describe una prueba de un solo paso en tira inmunocromatográfica para la detección del virus de la hepatitis A en heces. Se estima que este documento destruye la actividad inventiva de las reivindicaciones 4 y 6 de la solicitud a estudio. El razonamiento es el mismo que en el caso del documento D01. El documento D04 divulga un método rápido de diagnóstico de una enfermedad inflamatoria intestinal basado en una tira inmunocromatográfica capaz de detectar simultáneamente, en una muestra fecal, con anticuerpos específicos y conjugados con un marcador de color, la presencia de un microorganismo patógeno y de lactoferrina como marcador de la enfermedad entérica. La tira se sumerge en la muestra diluida y ésta fluye por capilaridad, uniéndose en una fase móvil a los conjugados anticuerpo-marcador, quedando éstos posteriormente fijados a una membrana de nitrocelulosa mediante anticuerpos complementarios, identificándose finalmente los resultados positivos visualmente por la aparición del color correspondiente. Se considera que este documento destruye la actividad inventiva de las reivindicaciones 4 y 5 de la solicitud a estudio, ya que las opciones de aplicar la muestra en la tira o de sumergir esta última en la muestra y el número de tiras empleadas resultan obvias para un experto en la materia y, por tanto, no constituyen una diferencia significativa.

Informe del Estado de la Técnica Página 4/5

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201230810

El documento D05 describe una tira inmunocromatográfica para la detección preferente, aunque no exclusivamente, de analitos homólogos, como virus de la hepatitis A a E, o VIH, tipos I y II (párrafo 0036 de la solicitud analizada). Tanto la tira como el procedimiento se consideran básicamente idénticos a los de la solicitud a estudio, y, aunque en este documento se utiliza una única tira y un material bloqueante para evitar la aparición de falsos positivos, se estima que destruye la actividad inventiva de la reivindicación 4 de la solicitud analizada, en virtud de los argumentos esgrimidos anteriormente en cuanto al número de tiras y al patógeno detectado. El documento D06 hace referencia a pruebas y kits diagnósticos para detectar en diversos dispositivos de inmunocromatografía, entre ellos una tira (columna 9, líneas 45-47) glutamato deshidrogenasa y toxinas A y B de Clostridium difficile por separado o conjuntamente. El método consiste en inmovilizar un anticuerpo sobre un soporte sólido que se unirá a un primer epitopo del antígeno y un marcador unido a un segundo anticuerpo que se unirá a otro epitopo del mismo antígeno. El revelado de dicho marcador, ya sea mediante color o de otro tipo, implicará un resultado positivo. Se considera que este documento destruye la novedad de la reivindicación 4 de la solicitud a estudio, en el sentido del artículo 6 de la ley 11/86, de Patentes.

Informe del Estado de la Técnica Página 5/5