ES2341772T3 - Ensayo de alto rendimiento para determinar la actividad de lp-pla2. - Google Patents

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Abstract

Un método de alto rendimiento para determinar la actividad de una enzima fosfolipasa asociada a lipoproteína A2 (Lp-PLA2) en un conjunto de muestras que comprende las etapas de; (i) preparar una solución que comprende factor de activación de plaquetas (PAF) marcado; (ii) tomar alícuotas de cada una de las muestras del conjunto en un pocillo de una placa de microtítulo o tubo de microcentrífuga; (iii) poner en contacto cada una de las muestras de tejido del conjunto con la solución de la etapa de preparación; (iv) poner en contacto cada una de las soluciones de la primera etapa de contacto con una molécula secuestrante de PAF para formar un complejo molecular secuestrante de PAF; (v) poner en contacto dicho complejo molecular secuestrante de PAF con una solución de precipitación que comprende ácido tricloroacético (TCA) para formar un precipitado y un sobrenadante; (vi) eliminar dicho complejo molecular secuestrante de PAF centrifugando dicha placa de microtítulo o tubo de microcentrífuga a al menos 6.000 g durante al menos 5 minutos a menos de 10ºC; y (vii) detectar la actividad Lp-PLA2, en donde al menos una muestra se ha tomado de un animal al que se le ha administrado un inhibidor Lp-PLA2.

Description

Ensayo de alto rendimiento para determinar la actividad de Lp-PLA2.
Campo de la invención
Esta invención se refiere generalmente a métodos y materiales para determinar la actividad de la enzima fosfolipasa A2 asociada a lipoproteina (denominada aquí "Lp-PLA2") en muestras de animales.
Antecedentes de la invención
La enfermedad coronaria del corazón (denominada aquí "CHD") es la principal causa de muerte en muchos países industriales. La aterosclerosis es una forma de arterioesclerosis o endurecimiento de las arterias en la que hay una construcción progresiva de la placa que contiene colesterol y lípidos en las arterias de la sangre. Esta construcción está asociada con un riesgo aumentado de enfermedad del corazón y eventos coronarios mórbidos. La construcción de la placa en las arterias está asociada con una respuesta inmune que se inicia por el daño al endotelio. Inicialmente, los macrófagos derivados de los monocitos se acumulan en el lugar del daño, debido a la respuesta inmune que causa la migración y acumulación de las células del músculo liso que forman la placa fibrosa en combinación con los macrófagos, lípidos, colesterol, sales de calcio y colágeno. El crecimiento de tales lesiones puede eventualmente bloquear la arteria y restringir el flujo sanguíneo.
La fosfolipasa A2 asociada a lipoproteína (Lp-PLA2), también conocida como PAF acetilhidrolasa, es un miembro secretado, independiente de calcio de la creciente superfamilia de la fosfolipasa A2 (Tew, et al. (1996) Arterioscler Thromb Vasc Biol. 16(4):591-9; Tjoelker, et al. (1995) Nature 374(6522):549-53). Es producida por monocitos, macrófagos, y linfocitos y está asociada predominantemente con LDL (\sim80%) en el plasma humano. El enzima escinde los fosfolípidos polares, que incluye el éster sn-2 de 1-O-alquil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfocolina, también conocido como factor de activación de plaquetas (denominado aquí "PAF") (Tjoelker, et al. (1995) Nature 374(6522):549-53).
Muchas observaciones han demostrado una actividad proinflamatoria de LDL oxidado cuando se compara con las lipoproteínas no modificadas nativas. Uno de los acontecimientos más tempranos en la oxidación de LDL es la hidrólisis de la fosfatidilcolina modificada por oxidación, que genera cantidades sustanciales de lisofosfatidilcolina (liso-PC) y ácidos grasos oxidados. Esta hidrólisis está mediada únicamente por Lp-PLA2 (o sea, Lp-PLA2 hidroliza PAF para dar lisofosfatidilcolina ["liso-PC"] y acetato) (Stafforini, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 17895).
Se sospecha que liso-PC es un mediador pro inflamatorio y pro aterogénico. Además de ser citotóxico a concentraciones más altas, puede estimular a monocitos y la quimiotaxis del linfocito T, así como inducir la adhesión molecular y la expresión de la citoquina inflamatoria a concentraciones más modestas. La liso-PC ha sido identificada también como el componente de LDL oxidado que está envuelto en la antigenicidad de LDL, un hecho que puede también contribuir a la naturaleza inflamatoria de la aterosclerosis. En adición, la liso-PC promueve la proliferación de macrófagos e induce la disfunción endotelial en varios senos arteriales. Los ácidos grasos oxidados que se liberan junto con liso-PC, son también monocitos quimioatrayentes y pueden también estar envueltos en otras actividades biológicas tales como la señalización celular. Ya que ambos de estos productos de la hidrólisis de Lp-PLA2 son quimioatrayentes potentes para los monocitos circulantes, se piensa que Lp-PLA2 es responsable de la acumulación de células cargadas con el éster de colesterol en las arterias, causando las características placas de ateroma asociadas con los estados tempranos de la aterosclerosis.
Se ha encontrado también que Lp-PLA2 está enriquecida en la lipoproteína altamente aterogénica subfracción de LDL de pequeña densidad, que es susceptible de modificación oxidativa. Además, los niveles de enzima están aumentados en pacientes con hiperlipidemia, accidente vascular, diabetes melitus tipo 1 y tipo 2, así como en mujeres postmenopáusicas. Como tal, los niveles Lp-PLA2 del plasma tienden a estar elevados en aquellos individuos que están considerados como que son de alto riesgo para desarrollar aterosclerosis acelerada y eventos cardiovasculares clínicos. De modo que se esperaría que la inhibición de la enzima Lp-PLA2 detendría la construcción de esta placa de ateroma (por inhibición de la formación de la lisofosfatidilcolina), y así ser útil en el tratamiento de la aterosclerosis. Además, Lp-PLA2 puede usarse como biomarcador para determinar si un animal está en riesgo de desarrollar una enfermedad asociada con niveles elevados de Lp-PLA2 o actividad elevada de Lp-PLA2.
Los inhibidores de Lp-PLA2 inhiben la oxidación de LDL. Los inhibidores de Lp-PLA2 pueden por tanto tener una aplicación general en cualquier alteración que envuelva la peroxidación de lípidos en conjunción con la actividad de la enzima, por ejemplo en adición a alteraciones tales como aterosclerosis y diabetes, otras alteraciones como artritis reumatoide, accidente vascular, infarto de miocardio (Serebruany, et al. Cardiology. 90(2):127-30 (1998)); y daño por reperfusión e inflamación aguda y crónica. Además, Lp-PLA2 está siendo explorada actualmente como un biomarcador de la enfermedad coronaria del corazón (Blankenberg, et al. J Lipid Res. 2003 Mayo 1) y arterioesclerosis (Tselepis y Chapman. Atheroscler Suppl. 3(4):57-68 (2002)). Además, se ha descrito que Lp-PLA2 juega un papel en las siguientes enfermedades: síndrome del distrés respiratorio (Grissom, et al. Crit Care Med. 31(3):770-5 (2003); nefropatía de la immunoglobulina A (Yoon, et al. Clin Genet. 62(2):128-34 (2002); apertura del injerto de bypass del femoropopliteo (Unno, et al. Surgery 132(1):66-71(2002); inflamación oral (McManus y Pinckard. Crit Rev Oral Biol Med. 11(2):240-58 (2000)); inflamación de las vías respiratorias e hiperreactividad (Henderson, et al. J Immunol. 15;164(6):3360-7 (2000)); VIH y SIDA (Khovidhunkit, et al. Metabolism. 48(12): 1524-31 (1999)); asma (Satoh, et al. Am J Respir Crit Care Med. 159(3):974-9 (1999)); artritis reumatoide juvenil (Tselepis, et al. Arthritis Rheum. 42(2):373-83 (1999)); exudados del oído medio humano (Tsuji, et al. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 60(1):25-9 (1998)); esquizofrenia (Bell, et al. Biochem Biophys Res Commun. 29;241(3):630-5 9 (1997)); desarrollo de enterocolitis necronizante (Muguruma, et al. Adv Exp Med Biol. 407:379-82 (1997)); y necrosis intestinal isquémica (Pediatr Res. 34(2):237-41 (1993)).
Otras referencias que ilustran los antecedentes técnicos son: Palmantier, et al, Biosíntesis de PAF-Acether XIV, PAF-Acether Output in Murine Peritoneal Macrophages is regulated by the level of acetylhydrolase, Biochemical and Biophysical Research Communication. Vol. 162, no. 1. 475-482 (1989); Stafforini, et al, Platelet - activating factor acetylhydrolase from human plasma, Methods in Enzymology. Vol. 187. 344-357 (1990); y Petrovic, et al, A simple assay for a human serum phospholipase A2 that is associated with high-density lipoproteins, Journal of lipid research. Vol. 42, no. 10. 1706-1713 (2001).
Se ha medido la actividad Lp-PLA2 de las muestras humana usando ensayos de actividad espectrofotométrica y ensayos de actividad fluorogénica (Cayman Chemical Company, AtheroGenics, Inc. y Karlan Research Products). Véase también Kosaka, et al. Clin Chem Acta 296(1-2):151-61 (2000) y Kosaka, et al. Clin Chem Acta 312(1-2):179-83 (2001). Sin embargo, estos métodos pueden no ser sensibles cuando el inhibidor de Lp-PLA2 está presente, particularmente cuando el inhibidor se administra a un animal antes de obtener una muestra del animal. Se ha descrito que el ensayo de la presente invención demuestra una correlación entre la concentración del inhibidor Lp-PLA2 en una muestra y la actividad Lp-PLA2. La actividad Lp-PLA2 medida frente al tiempo en pacientes tratados con el inhibidor correlaciona con el perfil farmacocinético del inhibidor.
Se ha usado PAF con marcaje radioactivo en ensayos de bajo rendimiento para la actividad de Lp-PLA2. Tselepis, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 15(10):1764-73 (1995) y Min, et al. Biochemistry, 40 (15):4539-4549 (2001). Sin embargo, estos métodos no han sido desarrollados como métodos de alto rendimiento y por tanto no son útiles para estudios a gran escala comparados con la presente invención. La concentración de Lp-PLA2 de muestras humanas se ha medido usando un ensayo ELISA por métodos de alto rendimiento. Se ha encontrado una fuerte correlación entre los ensayos de actividad actuales disponibles y el ensayo de masas o ELISA. Sin embargo, el ensayo de masas o ELISA no es probablemente sensible para detectar inhibidores de PLA2 en muestras. Para medir la actividad Lp-PLA2 con o sin inhibidor en estudios a gran escala o para cribar un conjunto de muestras para Lp-PLA2 como biomarcador selectivo, se requiere un protocolo de actividad de alto rendimiento. Consecuentemente, un método para determinar la actividad de LP-PLA2 en un conjunto de muestras es muy necesario.
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Compendio de la invención
Así, un objeto de la presente invención es proporcionar un método de alto rendimiento para determinar la actividad de la enzima de fosfolipasa A2 (Lp-PLA2) asociada a lipoproteína en un conjunto de muestras que comprende las etapas de;
(i)
preparar una solución que comprende el factor de activación de plaquetas marcado (PAF);
(ii)
llevar una alícuota de cada una de las muestras del conjunto a un pocillo de una placa de microtítulo o a un tubo de microcentrífuga;
(iii)
poner en contacto cada una de las muestras de tejido del conjunto con la solución de la etapa de preparación;
(iv)
poner en contacto cada una de las soluciones de la primera etapa de contacto con una mólécula secuestrante de PAF para formar el complejo molécula secuestrante-PAF;
(v)
poner en contacto dicho complejo molecular secuestrante de PAF con una solución de precipitación que comprende ácido tricloroacético (TCA) para formar un precipitado y un sobrenadante;
(vi)
eliminar dicho complejo molecular secuestrante de PAF por centrifugación de dicha placa de microtítulo o tubo de microcentrífuga a al menos 6.000 g durante al menos 5 minutos a menos de 10ºC; y
(vii)
detectar la actividad Lp-PLA2,
en donde al menos una muestra se ha tomado de un animal al que se le ha administrado un inhibidor de Lp-PLA2.
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Descripción detallada de la invención Glosario
Una "molécula secuestrante" como se usa en este contexto es cualquier molécula capaz de formar un complejo con una segunda molécula tanto sola como en combinación con otras moléculas o cofactores de tal manera que se facilite la separación de la segunda molécula de las otras moléculas y/o de la solución. Por ejemplo, una molécula secuestrante puede ser una proteína que se une a una segunda molécula para hacer que precipite de la solución o puede crear una carga en la segunda molécula lo que hace más fácil que sea atraída por un electrodo positivo o negativo. Ejemplos de moléculas secuestrantes para PAF comprenden, pero no están limitados a, la albúmina de suero bovino (en este contexto "BSA") y la albúmina de suero humano.
Un "complejo molecular secuestrante de PAF" como se usa en este contexto es PAF asociado con una molécula secuestrante de manera que se pone a la molécula secuestrante en contacto con PAF para facilitar la separación de PAF de otras moléculas y/o solución. Como ejemplo, PAF puede formar un complejo con BSA que puede ser precipitado de una solución. El complejo molecular secuestrante de PAF puede comprender tanto PAF no escindido como liso-PC en complejo con la molécula secuestrante. El complejo PAF-BSA es un ejemplo de un complejo molecular secuestrante de PAF.
"La actividad enzimática Lp-PLA2" como se usa en este contexto incluye, pero no está limitada a, cualquier actividad enzimática de Lp-PLA2. Esta actividad puede incluir, pero no está limitada a, unión de la enzima al sustrato, liberación de producto, y/o hidrólisis de fosfolípidos u otras moléculas.
"Polipéptido(s)" se refiere a cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos el uno al otro por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados. "Polipéptido(s)" se refiere tanto a cadenas cortas, conocidas comúnmente como péptidos, oligopéptidos u oligómeros, como a cadenas más largas, comúnmente referidas como proteínas. Los polipéptidos pueden comprender aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por genes. "Polipéptido(s)" comprende aquellos modificados o por procedimientos naturales, tales como procesamientos y otras modificaciones post-translacionales, o también por técnicas químicas de modificación. Dichas modificaciones están bien descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en la voluminosa bibliografía de investigación, y son bien conocidas por aquellos versados en la técnica. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en grados variables en varios sitios en un polipéptido dado. Además, un polipéptido dado puede comprender muchos tipos de modificaciones. Las modificaciones pueden realizarse en cualquier parte de un polipéptido, incluyendo el esqueleto peptídico, las cadenas laterales de aminoácidos y el extremo amino o carboxilo. Las modificaciones comprenden, por ejemplo, acetilación, acilación, ribosilación de ADP, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o de un derivado nucleotídico, unión covalente de un lípido o derivado lipídico, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclajes de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, glicosilación, unión de lípidos, gamma-carboxilación de restos de ácido glutámico, hidroxilación y ribosilación de ADP, selenoilación, sulfatación, y adición de aminoácidos mediada por ARN de transferencia a proteínas tales como arginilación y ubiquitinación. Véase, por ejemplo, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2ª Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman y Compañía, New York, 1993 y Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 en POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., Meth. Enzymol. (1990) 182:626-646 y Rattan, et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992). Los polipéptidos pueden ser ramificados o cíclicos, con o sin ramificaciones. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y circulares ramificados pueden originarse por procedimientos naturales post-translacionales y pueden también estar hechos por medio de métodos sintéticos en su totalidad.
"Solución de precipitación" como se usa en este contexto es cualquier solución capaz de precipitar el complejo molecular secuestrante de PAF de la solución. Una solución de precipitación puede comprender, pero no está limitada a, ácido tricloroacético ("TCA"), polímeros no iónicos tales como dextranos o polietilenglicoles, o iones metálicos tales como Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Zn2+, Cd2+, Ca2+, Ba+2, Mg+2, Pb+2, Ag+, Hg2+, y Pb2+. La solución de precipitación puede usar precipitación isoeléctrica, cambiando así el contenido salino de la solución para facilitar la precipitación. La solución de precipitación puede cambiar la constante dieléctrica de la solución con la adición de un disolvente orgánico. Disolventes orgánicos que pueden usarse en una solución de precipitación pueden incluir, pero no están limitados a, 2 metil-2,4-pentanodiol (MPD), dimetil sulfóxido (DMSO), acetona y etanol. La solución de precipitación puede también cambiar el pH de la solución que comprende la molécula secuestrante de PAF para facilitar la precipitación.
"Filtración" o "filtrar" como se usa en este contexto incluye, pero no está limitado a, la eliminación de cualquier sustancia de una solución y puede comprender pasar una solución que contiene la sustancia que se va a eliminar a través de papel de filtro, papel de Whatman, tejido de malla, o una columna que elimina selectivamente dicha sustancia de la solución basado en sus características físicas y/o químicas. La sustancia que se va a eliminar puede incluir el complejo molecular secuestrante de PAF. Las características físicas y químicas que pueden usarse para eliminar una sustancia a través de la filtración pueden incluir, pero no están limitadas a, la carga iónica, tamaño, peso, polaridad y/o restos químicos asociados con la sustancia que hace probable que se unan al material de llenado de una columna. La filtración puede comprender usar la gravedad, vacío y/o centrifugación para facilitar la eliminación de dicha sustancia de la solución.
El "cóctel de centelleo" como se usa en este contexto es una mezcla de solutos y disolventes, que típicamente contiene un disolvente orgánico capaz de solubilizar y mantener una suspensión uniforme de una muestra para el centelleo líquido. El procedimiento de centelleo líquido envuelve detectar el decaimiento beta en una muestra por medio de la captura de emisiones beta. Una mezcla de cóctel de centelleo está diseñada para capturar la emisión beta y transformarla en un fotón de emisión que pueda detectarse por medio de un tubo fotomultiplicador en un contador de centelleo. Hay varios cócteles de centelleo comercializados. Se entiende que una modificación de la composición del cóctel de centelleo puede efectuar y/o optimizar la lectura detectable del centelleo líquido dependiendo de la muestra.
"Tejido(s)" como se usa en este contexto comprende el suero, lisados celulares, lisados tisulares, orina, plasma sanguíneo, células plaquetas, monocitos, o macrófagos. Estos tejidos pueden ser de seres humanos, mamíferos no humanos u otros animales que expresen Lp-PLA2, homólogos u ortólogos de la misma.
El símbolo "*" usado en las fórmulas presentadas aquí indica la función matemática de la multiplicación.
Lp-PLA2 es un hidrolizante conocido de los fosfolípidos. Lp-PLA2 puede escindir los fosfolípidos en la posición sn-2 para crear lisofosfatidilcolina (lyso-PC) y ácidos grasos oxidados. PAF tiene un grupo acilo de dos carbonos en la posición sn-2; por lo tanto, cuando PAF es hidrolizado por Lp-PLA_{2}, el grupo acilo corto es escindido como un acetato soluble en agua del resto de la molécula, que es lisofosfatidilcolina (liso-PC). El acetato es soluble en agua en condiciones en las que la liso-PC puede ser precipitada en una solución acuosa. Por ejemplo, una molécula secuestrante tal como BSA puede asociarse con el PAF no escindido y/o la liso-PC formando un complejo. Este complejo puede después eliminarse de la solución dejando la molécula pequeña soluble en agua, en este caso el acetato, en solución. Se entiende en la técnica que hay varios métodos para detectar la cantidad de moléculas pequeñas solubles en agua que permanecen en solución después de la precipitación. Por ejemplo, el acetato puede ser marcado con radioactividad antes de su escisión y ser detectado por centelleo líquido. Alternativamente, puede detectarse la cantidad de fosfocolina precipitada en la solución para medir la actividad Lp-PLA2.
Una realización de la presente invención es proporcionar un método de alto rendimiento para determinar la actividad de la enzima de fosfolipasa A2 (Lp-PLA2) asociada a lipoproteína en un conjunto de muestras que comprende las etapas de;
(i)
preparar una solución que comprende el factor de activación de plaquetas marcado (PAF);
(ii)
llevar una alícuota de cada una de las muestras de un conjunto a un pocillo de una placa de microtítulo o a un tubo de microcentrífuga;
(iii)
poner en contacto cada una de las muestras de tejido del conjunto con la solución de la etapa de preparación;
(iv)
poner en contacto cada una de las soluciones de la primera etapa de contacto con una mólécula secuestrante de PAF para formar un complejo molécula secuestrante-PAF;
(v)
poner en contacto dicho complejo molecular secuestrante de PAF con una solución de precipitación que comprende ácido tricloroacético (TCA) para formar un precipitado y un sobrenadante;
(vi)
eliminar dicho complejo molecular secuestrante de PAF por centrifugación de dicha placa de microtítulo o tubo de microcentrífuga a al menos 6.000 g durante al menos 5 minutos a menos de 10ºC; y
(vii)
detectar la actividad Lp-PLA2,
en donde al menos una muestra se ha tomado de un animal al que se le ha administrado un inhibidor de Lp-PLA2.
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En un aspecto de la invención al menos una muestra comprende sangre. En otro aspecto, al menos una muestra tiene aproximadamente 5 \mul de volumen.
En otro aspecto de la invención, el PAF marcado está marcado con radioactividad. El PAF marcado puede ser con tritio o marcado con ^{14}C. En otro aspecto de la invención, el PAF marcado comprende a lo más el 20% del PAF en la solución, y en otro aspecto, puede ser aproximadamente 0,4% a aproximadamente 2,0% del PAF en solución. PAF puede tener una concentración de al menos aproximadamente 20 \muM en la solución. En otro aspecto de la invención, PAF es un sustrato para Lp-PLA2. En otro aspecto, PAF está en una solución tamponada. La solución tamponada puede comprender el ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetano sulfónico (HEPES), cloruro sódico (NaCl), y ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA).
En otro aspecto de la invención se proporciona un método que comprende mezclar la solución de la etapa de preparación y la muestra durante al menos 5 segundos e incubar a aproximadamente 21ºC durante al menos alrededor de 1 minuto. La muestra puede ser incubada con la solución de la etapa de preparación durante aproximadamente 5 minutos.
En otro aspecto de la invención, la molécula secuestrante de la etapa de contacto es albúmina exógena de suero bovino (BSA), pero puede ser también albúmina endógena de suero humano. La temperatura de BSA puede ser menor de aproximadamente 10ºC, y puede ser aproximadamente 4ºC. En otro aspecto, BSA está en una concentración de aproximadamente 50 mg/ml. En todavía otro aspecto, la molécula secuestrante y la muestra se incuban a menos de 10ºC durante al menos alrededor de 1 minuto.
En otro aspecto de la presente invención, la solución de precipitación comprende TCA. En otro aspecto, la solución de precipitación que comprende TCA está a menos de alrededor de 10ºC. En otro aspecto, TCA tiene una concentración de alrededor del 56% volumen/volumen en agua. En otro aspecto, la solución de la segunda etapa de contacto se incuba con la solución que comprende TCA durante al menos 1 minuto. En otro aspecto, la centrifugación se realiza a aproximadamente 4ºC durante alrededor de 15 minutos.
En otro aspecto de la invención, se ponen alícuotas de una solución tamponada en al menos dos receptáculos para su uso como reacciones de contaje total o reacciones de blanco. Estos receptáculos pueden ser tubos de microcentrífuga o pocillos de una placa de microtítulo. En otro aspecto, la solución tamponada es la misma que la solución de la etapa de preparación en donde no se ha añadido PAF a la solución.
En otro aspecto de la presente invención, el volumen de solución tamponada de la que se toman alícuotas para las reacciones de contaje total y reacciones de blanco es el mismo que el volumen de muestra usado para cada reacción con muestra. La solución de la etapa de preparación y la molécula secuestrante pueden añadirse a alícuotas de la solución tamponada para uso como reacciones de blanco a las mismas condiciones de volumen, concentración, contacto, y precipitación que la muestra. En otro aspecto de la invención, al menos dos alícuotas de reacción de contaje total se ponen en contacto con aproximadamente el mismo volumen de solución de la etapa de preparación y una solución sustituta de la molécula secuestrante en donde la solución sustituta no contiene molécula secuestrante. Puede añadirse una solución tamponada o agua destilada a cada reacción de contaje total a aproximadamente el mismo volumen que la solución que comprende la molécula secuestrante que se añade a las muestras y/o las reacciones de blanco.
En otro aspecto de la presente invención, una porción alícuota del sobrenadante de cada muestra, de la reacción de blanco, y la reacción de contaje total se toman en recipientes separados. Cada alícuota del sobrenadante, reacción de blanco, y reacción de contaje total se ponen en contacto con un cóctel de centelleo y se cuentan en un contador de centelleo por lo menos alrededor de 1 minuto.
En otro aspecto de la presente invención, CPM_{Cuentas \ totales} se calcula como la media de cuentas netas de las cuentas totales de las reacciones usando la fórmula siguiente:
CPM_{Cuentas \ totales} = (CPM_{Cuentas \ totales \ netas} * V_{RT}) / (V_{SA})
donde
CPM_{Cuentas \ totales \ netas} = Cuentas medias netas en alícuotas de los sobrenadantes de cuentas totales de las reacciones;
V_{RT} = volumen total de la solución de la reacción final antes de la centrifugación; y
V_{SA} = volumen del sobrenadante a partir de las alícuotas de las reacciones de cuentas total para el contaje de centelleo.
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En otro aspecto, la actividad de Lp-PLA2 en cada sobrenadante se calcula usando la fórmula siguiente:
actividad de Lp-PLA2 (nmoles/min/ml) = S * (CPMmuestra - CPM_{Blancos}) * V_{ST}/(CPM_{Cuentas \ totales} * V_{SA} * V * T)
donde
S = cantidad total de PAF (nmoles) en la solución de la etapa de preparación;
CPM_{muestra} = media de las cuentas del sobrenadante en cada muestra;
CPM_{blancos} = media de las cuentas del sobrenadante en las reacciones de blanco;
V_{ST} = suma de los volúmenes de los sobrenadantes;
CPM_{Cuentas \ totales} = media de las cuentas de las reacciones de cuenta total;
V_{SA} = volumen de cada sobrenadante del que se ha tomado una alícuota para el contaje de centelleo;
V = volumen total de la muestra (\mul) de la que se ha tomado una alícuota en la primera etapa de contacto; y
T = cantidad total de tiempo (minutos) para la primera etapa de contacto.
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En otro aspecto de la invención, una solución tamponada se divide en alícuotas en al menos dos recipientes para usar como la reacción de blanco. Estos receptáculos pueden ser tubos de microcentrífuga o pocillos de una placa de microtítulo. En otro aspecto, la solución tamponada es la misma que la solución de la etapa de preparación en donde no se ha añadido PAF a la solución. En otro aspecto de la presente invención, el volumen de la solución tamponada en alícuotas para una reacción de blanco es el mismo que el volumen de la muestra usado para cada reacción de muestra. La solución de la etapa de preparación puede añadirse a alícuotas de la solución tamponada para usar como reacciones de blanco del mismo volumen, concentración, condiciones de contacto y precipitación que la muestra.
En otro aspecto de la presente invención, una alícuota de la solución de la etapa de preparación se pone en contacto con al menos una reacción de blanco para usar como cuentas añadidas totales. El volumen de la solución de la alícuota de la etapa de preparación puede ser entre alrededor de 1 \mul a alrededor de 20 \mul, o puede ser de alrededor de 10 \mul. En otro aspecto de la presente invención, cada alícuota del sobrenadante, reacciones de blanco y cuentas añadidas totales se ponen en contacto con el cóctel de centelleo y se cuentan en un contador de centelleo por al menos alrededor de 1 minuto.
En otro aspecto de la presente invención, CPM_{Total \ de \ cuentas \ añadidas} se calcula como las cuentas medias netas ajustadas por volumen de las cuentas totales añadidas de las reacciones usando la fórmula siguiente:
CPM_{Cuentas \ añadidas \ totales} = (CPM_{Cuentas \ añadidas \ netas} * VPAF) / (V_{añadidas})
donde
CPM_{Cuentas \ añadidas \ netas} = cuentas medias netas de los sobrenadantes a partir de las cuentas totales añadidas;
V_{PAF} = volumen de la solución de la etapa de preparación añadido en la primera etapa de poner en contacto;
V_{Añadida} = volumen de la solución de la etapa de preparación añadido a los sobrenadantes de las reacciones de blanco para usar como cuentas añadidas totales.
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En otro aspecto de la presente invención, la actividad Lp-PLA2 en cada sobrenadante se calcula usando la fórmula siguiente:
Actividad de Lp-PLA2 (nmoles/min/ml) = S* (CPM_{muestra} - CPM_{Blancos}) * V_{ST}/(CPM_{Cuentas \ añadidas \ totales} * V_{SA} * V * T)
donde
S = cantidad total de PAF(nmoles) en la solución de la etapa de preparación;
CPM_{muestra} = media de las cuentas de sobrenadantes en cada muestra;
CPM_{blancos} = media de las cuentas de sobrenadantes en las reacciones de blanco;
V_{ST} = suma de los volúmenes de los sobrenadantes;
CPM_{Cuentas \ totales \ añadidas} = Media de las cuentas del total de cuentas añadidas;
V_{SA} = volumen de alícuotas de cada sobrenadante para el contaje de centelleo;
V = volumen total de la alícuota de la muestra (\mul) en la primera etapa de contacto; y
T = Cantidad total de tiempo (min) para la primera etapa de poner en contacto.
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También se puede proporcionar un kit para determinar la actividad de la enzima de fosfolipasa asociada con lipoproteína A2 (Lp-PLA2) en un conjunto de muestras de sangre que comprenden el factor de activación de plaquetas PAF); una molécula secuestrante de PAF; y una solución que comprende TCA.
Los siguientes ejemplos ilustran diversos aspectos de esta invención. Estos ejemplos no limitan el alcance de esta invención que se define por las reivindicaciones adjuntas.
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Ejemplos Ejemplo 1 Valoración de la concentración de BSA para el secuestro y la precipitación
Se examinaron la concentración de BSA y el tiempo de contacto con ^{3}H-PAF libre. ^{3}H-PAF a una concentración de 200 \muM en solución tamponada se puso en contacto con BSA a una concentración de 1,04 mg/ml -16,67 mg/ml durante 5 minutos o toda la noche. Los complejos de BSA y PAF fueron después precipitados con 7,78% TCA y se formó una pelet por centrifugación a 6.000 g durante 15 minutos a 4ºC. Se midió el porcentaje de ^{3}H-PAF libre que permanece en solución en los sobrenadantes con el contaje de centelleo. Como se muestra en la Tabla 1, el porcentaje de PAF libre eliminado de la solución por precipitación aumentó con concentraciones de BSA en aumento y periodos de incubación prolongados.
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TABLA 1 Valoración de las concentraciones de BSA para secuestrar PAF
1 
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Ejemplo 2 Optimización del tiempo y la temperatura de precipitación de TCA
Se secuestró ^{3}H-PAF en solución de tampón con BSA a una concentración de 16,67 mg/ml y se incubó durante 5 minutos sobre hielo. PAF se precipitó o con TCA enfriado con hielo al 7,78% e incubado sobre hielo durante 15 minutos, o con TCA al 7,78% a temperatura ambiente seguido por la incubación a temperatura ambiente durante 5, 10 o 20 minutos. Como se muestra en la Tabla 2, TCA enfriado con hielo seguido por la incubación sobre hielo durante 15 minutos causó que el menor porcentaje de PAF en la solución.
TABLA 2 Precipitación con TCA
2 
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Ejemplo 3 Centrifugación de complejos de PAF-BSA
Una solución tamponada de ^{3}H-PAF fue secuestrada con BSA a una concentración de 16,6 mg/ml e incubada sobre hielo durante 5 minutos. El complejo PAF-BSA se precipitó con TCA enfriado en hielo al 7,78% y se incubó sobre hielo durante 15 minutos. Los complejos de PAF-BSA precipitados fueron centrifugados usando una fuerza microcentrífuga de 800 g a 13.000 g. Se midió el porcentaje de ^{3}H-PAF que permaneció en solución después de la centrifugación. Alrededor de 1,3% a alrededor de 2% del complejo PAF-BSA permaneció en solución usando una fuerza microcentrífuga de menos de 5.000 g. Cuando la fuerza microcentrífuga se aumentó hasta al menos 6.000 g solamente alrededor de 1,1% o menos del complejo PAF-BSA permaneció en solución.
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Ejemplo 4 La actividad de Lp-PLA2 está influida por la temperatura de reacción en el tiempo
Se hizo reaccionar Lp-PLA2 con PAF a lo largo de 30 minutos a ambas temperaturas 37ºC y temperatura ambiente (\sim21ºC), y se midió la actividad como la radioactividad (o sea, desintegración por minuto o DPM) de los productos liberados del PAF por contaje de centelleo. Las velocidades de reacción fueron lineales en un periodo de 30 minutos a cualquier temperatura de reacción. Las reacciones llevadas a cabo a 37ºC mostraron mayor actividad Lp-PLA2 que aquellas a temperatura ambiente. La actividad Lp-PLA2 a 30 minutos fue aproximadamente de 80.000 DPM durante la reacción a 37ºC y 40.000 DPM para la reacción a temperatura ambiente.
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Ejemplo 5 Cócteles para contaje de centelleo de los productos de reacción
Tres cócteles de centelleo comercializados se usaron para la medida de la radioactividad de PAF en una solución tampón. Se probaron MicroScint-20®, MicroScint-40® y Scintisafe®. Las cuentas por minuto (CPM) de 40 \mul de la solución PAF fueron mayores con MicroScint-20 que con MicroScint-40. Además, eI contaje de 80 \mul de los productos de reacción en MicroScint-40 no doblaron la radioactividad de 40 \mul de los mismos productos de reacción en MicroScint-20. De forma similar, MicroScint-20 mostró significativamente mejor eficiencia de contaje que ScintiSafe-30%.
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Ejemplo 6 Linealidad de la dilución de plasma para las medidas de la actividad de Lp-PLA2
Se midió la actividad de Lp-PLA2 de las diluciones de una muestra de plasma humana en una reacción de 5 minutos con ^{3}H-PAF a temperatura ambiente. Las reacciones se finalizaron con el secuestro de los sustratos PAF con 16,67 mg/ml de BSA enfriado con hielo. Los complejos de BSA y PAF fueron precipitados con 7,78% TCA con hielo y se formó una pelet por centrifugación a 6.000 g durante 15 minutos a 4ºC. Los productos de la reacción en los sobrenadantes se midieron por centelleo usando el cóctel MicroScint-20. Se usó entre 0,1 \mul/reacción y 5 \mul/reacción de plasma en reacciones separadas. Los valores de la actividad Lp-PLA2 medidos en una muestra de plasma humano fueron linealmente proporcionales a las cantidades de plasma humano añadidas a las reacciones.
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Ejemplo 7 Ensayo de la actividad Lp-PLA2 para un conjunto de muestras usando una microplaca
Se preparó el tampón de ensayo y se guardó a temperatura ambiente con las siguientes especificaciones: HEPES 100 mM, pH 7,4; NaCl 150 mM; y EDTA 5 mM.
Se preparó la solución de ^{3}H-PAF para 100 reacciones poniendo alícuotas de 480 \mul de ^{3}H-PAF (10 \muM = 0,1 mCi/ml a 10,0 Ci/mmol) y 24,6 \mul de C16-PAF (también conocido como "1-hexadecil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfocolina") (5,0 mg/ml; Pm: 524) en un tubo. Se mezclaron las dos soluciones y se secaron al aire en una vitrina. Se resuspendieron las pelets secas en 12,0 ml de tampón de ensayo creando una solución de ^{3}H-PAF de PAF 20 \muM (o sea ^{3}H-PAF a 0,4 \muM y C16-PAF frío a 19,6 \muM).
Para el ensayo de la actividad de Lp-PLA2, se pusieron alícuotas de 5 \mul de tampón de ensayo (para cuentas totales y de blancos; n = 8) o muestras de plasma en duplicado en una placa de 96 pocillos. Cada placa se selló con cinta para prevenir la evaporación. Se equilibraron las placas a 21ºC.
Se añadió cien microlitros de la solución de ^{3}H-PAF a cada pocillo, se mezcló y se incubó a 21ºC durante 5 minutos. Se añadió solución de BSA enfriado en hielo (50 \mul de una solución de BSA de 50 mg/ml en solución acuosa) a cada pocillo, menos a las muestras usadas como cuentas totales, a las que se añadió en su lugar 50 \mul de agua. Entonces se mezclaron e incubaron las soluciones en una nevera durante 5 minutos.
La solución de TCA enfriada con hielo (25 \mul de una solución al 56% v/v) se añadió a cada pocillo, se mezcló e incubó en un refrigerador durante 15 minutos. Después la placa se centrifugó a 6.000 g durante 15 minutos a 4ºC. Una alícuota de 45 \mul de cada sobrenadante se transfirió a una placa de poliestireno de 96 pocillos.
Se añadió solución de ^{3}H-PAF (10 \mul) a seis pocillos para servir como cuentas totales. Se añadió el cóctel de centelleo MicroScint-20 (200 \mul) a cada pocillo y las placas se cubrieron con cinta y se mezclaron con vórtex a una velocidad máxima durante 10 minutos. El polvo estático se eliminó de las placas frotando con tejido húmedo y secando con otro limpio. Las cuentas de la muestra se obtuvieron para cada muestra usando el contador de centelleo TopCount durante dos minutos cada una.
La actividad Lp-PLA2 se calculó usando la fórmula siguiente:
Actividad de Lp-PLA2 (nmoles/min/ml) = 32 * (CPM_{45 \ \mu l - sobrenadante} - CPM_{Blancos})/(CPM_{añadidos \ de 10 \ \mu l} CPM_{Blancos})
donde
CPM_{45 \ \mu l-sobrenadante} es la media de cuentas de cada muestra
CPM_{Blancos} es la media de las cuentas de los blancos
CPM_{añadidos \ de 10 \ \mu l} es la media de las cuentas de las cuentas totales
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Ejemplo 8 Actividad Lp-PLA2 en seres humanos tratados con el inhibidor Lp-PLA2
Se recogieron muestras de plasma de voluntarios sanos en la línea de base y a los tiempos determinados después de la dosificación hasta 144 horas después de la dosificación con el inhibidor Lp-PLA2 o el placebo. Las muestras de plasma se analizaron para actividad Lp-PLA2 como se describió en el Ejemplo 7. Se observó inhibición significativa de la actividad Lp-PLA2 (>85%) en voluntarios tratados con el compuesto desde alrededor de 1 hora después de la administración del inhibidor hasta alrededor de 6 a alrededor de 8 horas después de la administración del inhibidor. Esta inhibición medida correlacionó con los datos farmacocinéticos del inhibidor. Por el contrario, no se detectó una disminución significativa en la actividad Lp-PLA2 en voluntarios que recibieron el placebo. Cuando las muestras de plasma se ensayaron con un ensayo espectrofotométrico, solamente se detectó alrededor del 30% de inhibición de Lp-PLA2 en las mismas muestras de los voluntarios tratados con el inhibidor.
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Ejemplo 9 Validación de las medidas de actividad de Lp-PLA2 radiométricas de alto rendimiento
Los métodos de esta invención que se refieren a la medida de alto rendimiento de la actividad de Lp-PLA2 usando sustrato marcado con radioactividad como se describe en el ejemplo 7, se validaron por comparación de las medidas de actividad intra-ensayo así como por una comparación de las medidas de actividad determinadas por métodos de extracción. Los métodos de esta invención mostraron características de realización excelentes con un límite de detección ("LOD") de 0,2 nmoles/min/ml y un intervalo dinámico lineal de alrededor de 100 veces (0,5-48,5 nmoles/min/ml). El límite de cuantificación estimado ("LOQ") y el extremo bajo del intervalo dinámico lineal fueron lo mismo.
Además, los valores de actividad de Lp-PLA2 determinados usando los métodos de la invención se correlacionan muy bien con los determinados por procedimientos de extracción cuando se compararon muestras de dos ensayos clínicos, Ensayo A (n=68) y Ensayo B (n=48). Además, ofrece un número de ventajas sobre los protocolos de extracción, incluyendo volúmenes pequeños de muestras de plasma, ningún residuo orgánico radioactivo y rendimiento mucho más alto que puede aumentarse con la automatización si es necesario. El análisis de los componentes de la varianza para el ensayo de la actividad de Lp-PLA2 de alto rendimiento usando sustrato marcado con radioactividad (Ejemplo 7) de esta invención mostró que el componente de variación ("CV") de dentro de la placa (intra-ensayo) estimado cumplió con el criterio de validación (el CV de los componentes de variación intra-ensayo del estudio es aproximadamente 11.2%; el criterio es <15%). La estimación del CV entre ensayos cumplió también con el criterio de validación (CV entre ensayos es aproximadamente 12,9%; criterio<20%). La estimación de la reducción de la variabilidad entre ensayos cuando se aumentó el número de sueros de blanco y pocillos de cuentas totales de 2 a 4 fue aproximadamente de 1,5% con los sueros de blanco y pocillos de cuentas totales adicionales. Un análisis por separado de la variabilidad entre las filas proveniente de las diferentes puntas de las pipetas mostró una contribución de aproximadamente el 13% de la estimación del CV intra ensayo.

Claims (18)

1. Un método de alto rendimiento para determinar la actividad de una enzima fosfolipasa asociada a lipoproteína A2 (Lp-PLA2) en un conjunto de muestras que comprende las etapas de;
(i)
preparar una solución que comprende factor de activación de plaquetas (PAF) marcado;
(ii)
tomar alícuotas de cada una de las muestras del conjunto en un pocillo de una placa de microtítulo o tubo de microcentrífuga;
(iii)
poner en contacto cada una de las muestras de tejido del conjunto con la solución de la etapa de preparación;
(iv)
poner en contacto cada una de las soluciones de la primera etapa de contacto con una molécula secuestrante de PAF para formar un complejo molecular secuestrante de PAF;
(v)
poner en contacto dicho complejo molecular secuestrante de PAF con una solución de precipitación que comprende ácido tricloroacético (TCA) para formar un precipitado y un sobrenadante;
(vi)
eliminar dicho complejo molecular secuestrante de PAF centrifugando dicha placa de microtítulo o tubo de microcentrífuga a al menos 6.000 g durante al menos 5 minutos a menos de 10ºC; y
(vii)
detectar la actividad Lp-PLA2,
en donde al menos una muestra se ha tomado de un animal al que se le ha administrado un inhibidor Lp-PLA2.
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2. El método de la reivindicación 1, en donde al menos una muestra se selecciona del grupo que consiste en suero, lisado celular, lisado tisular, orina o plasma sanguíneo.
3. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el PAF marcado está marcado con radioactividad.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la concentración total de PAF en la solución de la etapa de preparación es al menos 20 \muM.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución que comprende PAF marcado y no marcado es una solución tamponada.
6. El método de la reivindicación 5, en donde la solución tamponada comprende HEPES, cloruro sódico (NaCl), y ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA).
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución de la etapa de preparación y la muestra se mezclan durante al menos 5 segundos y se incuban a 21ºC durante al menos 1 minuto.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la molécula secuestrante de la etapa de contacto es albúmina de suero bovino exógeno (BSA).
9. El método de la reivindicación 8, en donde la BSA está a menos de 10ºC.
10. El método de la reivindicación 8, en donde la BSA está a 4ºC.
11. El método de las reivindicaciones 8 o 9, en donde la BSA tiene una concentración de 50 mg/ml.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la molécula secuestrante de la etapa de contacto es albúmina de suero humano endógena.
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución de precipitación que comprende TCA está a menos de 10ºC.
14. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la centrifugación se lleva a cabo a 4ºC durante 15 minutos.
15. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la actividad Lp-PLA2 se mide por contaje de centelleo.
16. El método de la reivindicación 1, que comprende además tomar alícuotas de una solución tamponada en al menos dos receptáculos para uso como reacciones de contaje total o reacciones de blanco.
17. El método de la reivindicación 16, en donde los receptáculos son tubos de microcentrífuga o pocillos de una placa de microtítulo.
18. El método de la reivindicación 17 que comprende además, poner en contacto al menos una reacción de blanco con aproximadamente el mismo volumen y concentración de la solución de la etapa de preparación y molécula secuestrante y poner en contacto al menos dos alícuotas de la reacción de contaje total con aproximadamente el mismo volumen de solución de la etapa de preparación y una solución sustituta de la molécula secuestrante en donde la solución sustituta no contiene molécula secuestrante; tomar alícuotas de una parte de sobrenadante de cada muestra, reacción de blanco, y reacción de cuentas totales en receptáculos separados; y poner en contacto un cóctel de centelleo con cada dicha alícuota.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4892350B2 (ja) 2003-05-28 2012-03-07 グラクソ グループ リミテッド Ｌｐ−ＰＬＡ２活性のハイスループットアッセイ
DK1718967T3 (da) 2004-02-03 2013-06-03 Diadexus Inc Metoder til at detektere Lp-PLA2 aktivitet
EP1735457A4 (en) 2004-04-16 2007-08-29 Glaxo Group Ltd METHODS FOR DETECTING Lp-PLA2 ACTIVITY AND INHIBITION OF Lp-PLA2 ACTIVITY
US20150017671A1 (en) 2004-04-16 2015-01-15 Yaping Shou Methods for detecting lp-pla2 activity and inhibition of lp-pla2 activity
US20140283157A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Diadexus, Inc. Lipoprotein-associated phospholipase a2 antibody compositions and methods of use
EP3258269B1 (en) * 2015-02-10 2019-06-05 Shenzhen New Industries Biomedical Engineering Co. Ltd. Reagent kit used for detecting lipoprotein-associated phospholipase a2, and preparation method and application for reagent kit
CN104820097A (zh) * 2015-05-22 2015-08-05 北京协和洛克生物技术有限责任公司 一种定量检测样本中脂蛋白磷脂酶a2浓度的液态芯片试剂盒及其制备方法
WO2017221795A1 (ja) 2016-06-22 2017-12-28 旭化成ファーマ株式会社 Ｌｐ－ＰＬＡ２活性の測定

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3204681B2 (ja) 1991-05-24 2001-09-04 株式会社シノテスト 新規なエーテル型チオリン脂質化合物およびその製造法
EP0974663A1 (en) * 1993-06-25 2000-01-26 Smithkline Beecham Plc Lipoprotein associated phospholipase A2, inhibitors thereof and use of same in diagnosis and therapy
JPH0759597A (ja) 1993-08-23 1995-03-07 Shinotesuto:Kk 血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ活性測定方法
DK0673426T3 (da) * 1993-10-06 2001-08-27 Icos Corp Blodpladeaktiveringsfaktor-acetylhydrolase
US6146625A (en) * 1993-10-06 2000-11-14 Icos Corporation Platelet-activating factor acetylhydrolase
JPH1017600A (ja) 1996-06-28 1998-01-20 Suntory Ltd 血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼおよびその遺伝子
JP4220603B2 (ja) 1998-12-02 2009-02-04 アルフレッサファーマ株式会社 血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ活性の測定方法
US20020102231A1 (en) * 1999-05-07 2002-08-01 Icos Corporation Therapeutic uses of PAF-AH products in diabetes
FR2815857B1 (fr) 2000-10-30 2003-02-14 Oreal Composition, notamment cosmetique, renfermant un retinoide et une silicone benzotriazole
ATE269342T1 (de) 2001-12-07 2004-07-15 Sirs Lab Gmbh Verbindungen zur bestimmung der aktivität von phospholipase a2
US20030134082A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-17 Morin Brian G. Carpet comprising a low-shrink backing of polypropylene tape fibers
US20070077614A1 (en) 2003-04-01 2007-04-05 Wolfert Robert L Uses of lp-pla2 in combination to assess coronary risk
JP4892350B2 (ja) 2003-05-28 2012-03-07 グラクソ グループ リミテッド Ｌｐ−ＰＬＡ２活性のハイスループットアッセイ
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