CN104820097A - 一种定量检测样本中脂蛋白磷脂酶a2浓度的液态芯片试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种定量检测样本中脂蛋白磷脂酶a2浓度的液态芯片试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于体外免疫检测技术领域，具体涉及一种检测样本中脂蛋白磷脂酶A2浓度的试剂盒及其制备方法。本试剂盒包括包被有抗脂蛋白磷脂酶A2的微球，微孔反应板，脂蛋白磷脂酶A2的浓度梯度标准品和质控品、生物素标记的抗脂蛋白磷脂酶A2抗体，链霉亲和素化的藻红蛋白、含有蛋白保护剂的磷酸盐缓冲液。本发明所用的检测仪器为Luminex的MAGPIX和Luminex 200,3D，在此平台上能够实现高通量、高速度、低成本、准确性高、重复性好地进行人血浆脂蛋白磷脂酶A2浓度的测定，同时能够自由组合增加检测标记物的种类，从而实现多种标记物同时检测，增加对心血管疾病诊断的准确率，有重要的应用前景。

Description

一种定量检测样本中脂蛋白磷脂酶A2浓度的液态芯片试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于体外免疫检测技术领域，具体涉及一种检测样本中脂蛋白磷脂酶A2浓度测定的试剂盒及其制备方法。
背景技术
Lp-PLA2属于磷脂酶A2超家族，是由441个氨基酸残基组成的一种丝氨酸脂酶，相对分子量为45kD。与磷脂酶A2家族其余成员不同的是，Lp-PLA2不需要钙离子维持其催化活性，其具有降解血小板活化因子的活性，因此也被称为血小板活化因子乙酰水解酶(platelet-activating factor acetylhydrolase，PAF-AH)。血液中Lp-PLA2主要由成熟的巨噬细胞和淋巴细胞合成和分泌，在动脉粥样硬化部位大量存在,并可被炎症介质调节。具有活性的Lp-PLA2能优先水解氧化磷脂sn-2位上短脂酰链中的酯键而生成两种强促炎介质——氧化游离脂肪酸和溶血卵磷脂。这两种炎性介质可作为单核细胞趋化因子，诱导单核细胞的活化，在动脉粥样硬化的发生、发展中具有一定的作用。大量流行病学研究显示Lp-PLA2是一种可以预测与冠脉事件有关的动脉粥样硬化和脑中风危险的酶，其作为一种独立的炎性因子，具有促进动脉粥样硬化的作用。
目前对于心血管疾病的免疫诊断方法，只能对一种单一的指标进行检测，由于不同指标存在的灵敏度、精确度以及特异性的差别，在临床诊断中经常出现高的假阴性率。本发明在新的技术平台上，通过双抗夹心法对LP-PLA2的浓度进行准确定量，同时能够与不同的标志物进行自由组合，达到多种标志物的同时检测，提高心血管疾病检测的准确性，降低临床检测中的假阴性率。
发明内容
本发明相对于传统的免疫测定法，旨在提供高通量、快速、准确的可同时检测多种心血管标志物的技术平台和试剂盒。
一种定量检测样本中脂蛋白磷脂酶A2浓度的液态芯片试剂盒，包括包被有抗脂蛋白磷脂酶A2的单克隆抗体的微球、平台载体、脂蛋白磷脂酶A2的梯度浓度标准品、脂蛋白磷脂酶A2的质控品、生物素标记的抗脂蛋白磷脂酶A2抗体、链霉亲和素化的藻红蛋白(SAPE)、样本缓冲液。
作为优选方案，所述微球为表面带有荧光色的聚苯乙烯磁微球，带孔的平台载体里面包被有1000-5000个微球/孔，而每个微球含有2*10-6-5*10-5μg的抗脂蛋白磷脂酶A2的单克隆抗体。
作为优选方案，所述带孔的平台载体为微孔反应板。
作为优选方案，所述脂蛋白磷脂酶A2的梯度浓度标准品和脂蛋白磷脂酶A2的质控品都是用脂蛋白磷脂酶A2纯品与自制的标准品稀释液按照1:200000-1:1000稀释而成，所述标准品不少于2个，所述质控品和所述标准品的区别只是浓度不同，所述质控品的作用是在试剂盒使用过程中起到核准校对的作用，即通过质控品测值是否在质控范围内来对标准品拟合出来的曲线进行核准校对，若质控品测值合格，则可以利用标准曲线来拟合出样本中的脂蛋白磷脂酶A2的浓度值。
作为优选方案，所述脂蛋白磷脂酶A2纯品是人血浆提纯的天然脂蛋白磷脂酶A2蛋白或大肠杆菌表达的重组脂蛋白磷脂酶A2蛋白。
作为优选方案，所述的标准品稀释液，是在pH 7.0-7.4、浓度为10-100mM磷酸盐缓冲液中，分别加入1-10％质量分数的动物血清、0.01-0.5％质量分数的防腐剂、1-10％质量分数的蛋白保护剂、0.05-1％质量分数的表面活性剂混合而成。
作为优选方案，所述样本缓冲液是在10-100mM的磷酸盐缓冲液中，分别加入1-10％质量分数的蛋白保护剂、0.01-0.5％质量分数的防腐剂混合而成。
作为优选方案，所述生物素标记的抗脂蛋白磷脂酶A2抗体为单克隆抗体或者多克隆抗体中的任意一种。
作为优选方案，所述的表面活性剂为曲达通X-100、吐温20、布里杰-35、吐温40、吐温60、吐温80、十二烷基磺酸钠、斯盘20、烷基酚聚氧乙烯4醚、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000。
作为优选方案，所述的防腐剂为Proclin 300、叠氮钠、硫柳汞、硫酸庆大霉素。
作为优选方案，所述的蛋白保护剂为牛血清白蛋白、牛γ蛋白、海藻糖、甘油、蔗糖。
制备所述试剂盒的方法，包括以下制备过程，所述制备过程不分先后：
包被有抗脂蛋白磷脂酶A2的单克隆抗体的微球的制备：将未包被的微球中加入磷酸二氢钠缓冲液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液进行活化，然后加入特异性的抗脂蛋白磷脂酶A2的单克隆抗体1-125μg在4-8℃进行包被；洗涤三次；再加入含1-10％质量分数的动物血清蛋白的封闭液进行封闭；最后在10-100mM磷酸盐缓冲液中避光、4-8℃存放；
脂蛋白磷脂酶A2梯度浓度标准品和脂蛋白磷脂酶A2质控品的制备：先在PH 7.0-7.4、浓度为10-100mM磷酸盐缓冲液中，分别加入1-10％质量分数的动物血清、0.01-0.5％质量分数的防腐剂、1-10％质量分数的蛋白保护剂、0.05-1％质量分数的表面活性剂混合而成标准品稀释液；再将纯品与自制的标准品稀释液按照1:200000-1:1000稀释而成标示浓度为0-800ng/ml的梯度浓度标准品以及80-300ng/ml的脂蛋白磷脂酶A2质控品；
生物素标记抗脂蛋白磷脂酶抗体：将抗脂蛋白磷脂酶抗体与生物素按照摩尔比1:20混合，再通过纯化得到生物素标记的抗脂蛋白磷脂酶抗体；
链霉亲和素化藻红蛋白：0.5mg的链霉亲和素，加入异双功能试剂无水甲醇液，使得异双功能试剂与链霉亲和素的摩尔比为20，常温反应60min，加入二硫苏糖醇(DTT)使得其终浓度为25mM，常温反应30min，同上过葡聚糖凝胶层析，收集蛋白峰，得到巯基化的链霉亲和素；
取0.75mg/mL衍生化的荧光藻红蛋白与0.25mg/mL巯基化的链霉亲和素按照质量浓度比是3:1混合交联，摇床低速振荡，4-8℃反应过夜；
样本缓冲液的制备：在10-100mM磷酸盐缓冲液中，加入1-10％质量分数的蛋白保护剂，0.01-0.5％质量分数的防腐剂混合而成。
作为优选方案，所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液购买于Pierce公司，所述动物血清蛋白为牛血清白蛋白。
作为优选方案，所述异双功能试剂为琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯或3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯中的一种或两者混合物。
本发明基于Luminex xMAP技术平台，把直径为6.5μm的聚苯乙烯小磁球用荧光染色的方法进行编码，通过调节两种荧光染料的不同配比获得最多可达100种具有不同特征荧光谱的微球，然后将每种编码微球共价交联上针对特定检测物的抗原、抗体或核酸探针等捕获分子。检测时微球被微量液体传送***排成单列通过两束激光，一束判定颗粒的颜色从而决定被测物的特异性(定性)；另一束测定微粒上的荧光标记强度对被检测测物定量，所得的数据经电脑处理后可以直接用来判断结果。该技术具有自由组合、高通量、高速度、低成本、准确性高、重复性好、灵敏度高、线性范围广、无需洗涤、操作简便的优点。在临床诊断中引进液态芯片技术和产品，将极大地提高检测效率和降低检测成本。
本发明所用的检测仪器为Luminex的MAGPIX和Luminex200,3D，在此平台上能够实现高通量、高速度、低成本、准确性高、重复性好地进行人血浆脂蛋白磷脂酶A2浓度的测定，同时能够自由组合增加检测标记物的种类，从而实现多种标记物同时检测，增加对心血管疾病诊断的准确率，有重要的应用前景。
附图说明
图1为实施例3标准曲线图。
图2为实施例4标准曲线图。
图3为实施例5标准曲线图。
图4为实施例6标准曲线图。
图5为实施例7标准曲线图。
图6为实施例8标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细说明。
实施例1：
本发明脂蛋白磷脂酶A2(LP-PLA2)浓度液态芯片检测试剂盒的操作使用方法如下：
1.将标准品和质控品用去离子水复溶混匀，分别向微孔板中加入标准品50μl/孔、质控和样本各10μl和40μl样本缓冲液/孔；
2.将包被抗体的磁微粒稀释25倍，然后分别向微孔板中加入50μl磁微粒，常温振荡反应120min；
3.用洗板机洗板两次；
4.向微孔板中加入生物素标记的单克隆抗体25μl/孔，放在摇床上室温反应60min；
5.向微孔板中加入链霉亲和素化的藻红蛋白25μl/孔，放在摇床上室温反应30min；
6.用洗板机洗板两次；
7.向微孔板中加入150μl/孔的鞘液，常温振荡10min；
8.利用Luminex 200读取各反应孔的荧光值；
9.将标准品的浓度值和荧光值进行二次曲线回归拟合出标准曲线，再将样本的荧光值带入标准曲线中，即可得出样本中LP-PLA2的浓度值。
实施例2：
通过以下方法制备该试剂盒链霉亲和素化的藻红蛋白：
藻红蛋白的链霉亲和素化：
1)藻红蛋白的脱盐处理
已纯化的R-PE一般保存在60％饱和度的硫酸氨缓冲液中,使用前须离心去除上清液，并重悬于50mmol/L PBS中,使用脱盐柱去除硫酸氨。
2)藻红蛋白的衍生化
取4.5mg藻红蛋白溶于1.0mL磷酸盐缓冲液中，加入10μL 3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)无水甲醇溶液(4mg/mL)，使得SPDP与藻红蛋白摩尔比约为10，常温反应120min，经葡聚糖凝胶层析脱盐，磷酸盐缓冲液平衡和洗脱，收集藻红蛋白溶液峰。
3)链霉亲和素的巯基化
取0.5mg的链霉亲和素，加入上述SMCC无水甲醇液，使得SMCC与链霉亲和素的摩尔比约为20，常温反应60min，加入二硫苏糖醇(DTT)使得其终浓度为25mM，常温反应30min，同上过葡聚糖凝胶层析，收集蛋白峰。
4)藻红蛋白与链霉亲和素的交联
取0.75mg/mL衍生化的荧光藻红蛋白与0.25mg/mL巯基化的链霉亲和素等量混合，摇床低速振荡，4℃反应过夜。
5)交联反应的终止
将交联好的加入20mg/ml的碘乙酸钠60μl，反应30min，终止反应。最后将藻红蛋白标记制品溶于磷酸盐缓冲液中，4℃保存。
实施例3：
通过以下方法制备该试剂盒：
分别包被有抗脂蛋白磷脂酶A2的单克隆抗体的微球的制备：取未包被的微球5.0×106个，加入60μL的pH值为6.2的100mM磷酸二氢钠缓冲液、20μL的25mg/mL N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和20μL的25mg/mL碳二亚胺溶液进行活化，然后加入特异性的单克隆抗体25μg进行包被；再加入含1％质量分数的牛血清白蛋白的封闭液进行封闭；最后在10mM的磷酸盐缓冲液中避光、4℃存放；
脂蛋白磷脂酶A2的浓度梯度标准品和质控品的制备：用含有1％质量分数的新生牛血清、0.01％Proclin300、1％牛血清白蛋白、0.05％Triton X-100的10mM磷酸钠缓冲溶液(PH7.0)分别将标志物的纯品配制成标示浓度为0、50、100、200、400、800ng/ml的浓度梯度标准品以及80、300ng/ml的质控品；然后制成冻干粉，4℃保存；
生物素标记抗脂蛋白磷脂酶抗体：将抗脂蛋白磷脂酶抗体与生物素按照摩尔比1:20混合，再通过纯化得到生物素标记的抗脂蛋白磷脂酶抗体；
链霉亲和素化的藻红蛋白的制备：与实施例1相同；
样本缓冲液的制备：向10mM磷酸缓冲液(PH7.4)中分别添加：1％质量分数的牛血清白蛋白和0.01％质量分数的Proclin 300，充分混匀。
如附图1所示为本实施例的标准曲线图，表1为采用实施例1所述的方法检测本实施例质控品、样本的检测结果，其中样本1、2来源于人体血浆，从表1可以看出质控品1和质控品2的检测值在对应的靶值范围内，所以可以确定质控品可控，结果可信；而样本1、2的检测值偏差与其对应的靶值相比，偏差小于10％，说明该试剂盒检测准确率高。
表1 质控品、样本检测结果
实施例4：
通过以下方法制备该试剂盒：
分别包被有抗脂蛋白磷脂酶A2的单克隆抗体的微球的制备：取未包被的微球5.0×106个，加入60μL的pH值为6.2的100mM磷酸二氢钠缓冲液、20μL的25mg/mL N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和20μL的25mg/mL碳二亚胺溶液进行活化，然后加入特异性的单克隆抗体25μg进行包被；再加入含10％质量分数的牛血清白蛋白的封闭液进行封闭；最后在100mM的磷酸盐缓冲液中避光、8℃存放；
脂蛋白磷脂酶A2的浓度梯度标准品和质控品的制备：用含有10％质量分数的新生牛血清、0.5％质量分数的Proclin300、10％牛血清白蛋白、1％质量分数的Triton X-100的100mM磷酸钠缓冲溶液(PH7.4)分别将标志物的纯品配制成标示浓度为0、50、100、200、400、800ng/ml的浓度梯度标准品以及80、300ng/ml的质控品；然后制成冻干粉，4℃保存；
生物素标记抗脂蛋白磷脂酶抗体：与实施例3相同；
链霉亲和素化的藻红蛋白的制备：与实施例2相同；
样本缓冲液的制备：向100mM磷酸缓冲液(PH7.4)中分别添加：10％质量分数的牛血清白蛋白和0.5％质量分数的Proclin 300，充分混匀。
如附图2所示为本实施例的标准曲线图，表2为采用实施例1所述的方法检测本实施例质控品、样本的检测结果，其中样本1、2来源于人体血浆，从表2可以看出质控品1和质控品2的检测值在对应的靶值范围内，所以可以确定质控品可控，结果可信；而样本1、2的检测值偏差与其对应的靶值相比，偏差小于10％，说明该试剂盒检测准确率高。
表2 质控品、样本检测结果
实施例5：
与实施例3基本相同，不同的是：
脂蛋白磷脂酶A2的浓度梯度标准品和质控品的制备：用含有2％新生牛血清、0.05％Proclin300、5％牛血清白蛋白、0.15％Triton X-100的20mM磷酸钠缓冲溶液(PH7.4)分别将标志物的纯品配制成标示浓度为0、50、100、200、400、800ng/ml的一浓度梯度标准品以及80、300ng/ml的质控品；然后制成冻干粉，4℃保存；
样本缓冲液的制备：向100mM磷酸缓冲液(PH7.4)中分别添加：1％牛血清白蛋白和0.05％ Proclin 300，充分混匀。
如附图3所示为本实施例的标准曲线图，表3为采用实施例1所述的方法检测本实施例质控品、样本的检测结果，其中样本1、2来源于人体血浆，从表3可以看出质控品1和质控品2的检测值在对应的靶值范围内，所以可以确定质控品可控，结果可信；而样本1、2的检测值偏差与其对应的靶值相比，偏差小于10％，说明该试剂盒检测准确率高。
表3 质控品、样本检测结果
实施例6：
与实施例3基本相同，不同的是：
分别包被有抗脂蛋白磷脂酶A2的单克隆抗体的磁珠的制备：取未包被的微球5.0×106个，加入60μl的pH值为6.2的100mM磷酸二氢钠缓冲液、20μl的25mg/mL N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和20μl的25mg/mL碳二亚胺溶液进行活化，然后加入特异性的单克隆抗体50μg进行包被；再加入含牛血清白蛋白的封闭液进行封闭；最后在磷酸盐缓冲液中避光、4℃存放；
脂蛋白磷脂酶A2的浓度梯度标准品和质控品的制备：用含有2％新生牛血清、0.05％Proclin300、5％牛血清白蛋白、0.10％Triton X-100的20mM磷酸钠缓冲溶液(PH7.4)分别将标志物的纯品配制成标示浓度为0、50、100、200、400、800ng/ml的一浓度梯度标准品以及80、300ng/ml的质控品；然后制成冻干粉，4℃保存；
样本缓冲液的制备：向100mM磷酸缓冲液(PH7.4)中分别添加：1％牛血清白蛋白和0.05％ Proclin 300，充分混匀。
如附图4所示为本实施例的标准曲线图，表4为采用实施例1所述的方法检测本实施例质控品、样本的检测结果，其中样本1、2来源于人体血浆，从表4可以看出质控品1和质控品2的检测值在对应的靶值范围内，所以可以确定质控品可控，结果可信；而样本1、2的检测值偏差与其对应的靶值相比，偏差小于10％，说明该试剂盒检测准确率高。
表4 质控品、样本检测结果
实施例7：
与实施例6基本相同，不同的是：
分别包被有抗脂蛋白磷脂酶A2的单克隆抗体的磁珠的制备：取未包被的微球5.0×106个，加入60μL的pH值为6.2的100mM磷酸二氢钠缓冲液、20μl的25mg/mL N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和20μl的25mg/mL碳二亚胺溶液进行活化，然后加入特异性的单克隆抗体100μg进行包被；再加入含牛血清白蛋白的封闭液进行封闭；最后在磷酸盐缓冲液中避光、4℃存放；
脂蛋白磷脂酶A2的浓度梯度标准品和质控品的制备：用含有2％新生牛血清、0.05％Proclin300、5％牛血清白蛋白、0.10％Triton X-100的20mM磷酸钠缓冲溶液(PH7.4)分别将标志物的纯品配制成标示浓度为0、50、100、200、400、800ng/ml的一浓度梯度标准品以及80、300ng/ml的质控品；然后制成冻干粉，4℃保存；
样本缓冲液的制备：向100mM磷酸缓冲液(PH7.4)中分别添加：1％牛血清白蛋白和0.05％ Proclin 300，充分混匀。
如附图5所示为本实施例的标准曲线图，表5为采用实施例1所述的方法检测本实施例质控品、样本的检测结果，其中样本1、2来源于人体血浆，从表5可以看出质控品1和质控品2的检测值在对应的靶值范围内，所以可以确定质控品可控，结果可信；而样本1、2的检测值偏差与其对应的靶值相比，偏差小于10％，说明该试剂盒检测准确率高。
表5 质控品、样本检测结果
实施例8：
与实施例6基本相同，不同的是：
分别包被有抗脂蛋白磷脂酶A2的单克隆抗体的磁珠的制备：取未包被的微球5.0×106个，加入60μl的pH值为6.2的100mM磷酸二氢钠缓冲液、20μl的25mg/mL N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和20μl的25mg/mL碳二亚胺溶液进行活化，然后加入特异性的单克隆抗体125μg进行包被；再加入含牛血清白蛋白的封闭液进行封闭；最后在磷酸盐缓冲液中避光、4℃存放；
脂蛋白磷脂酶A2的浓度梯度标准品和质控品的制备：用含有2％新生牛血清、0.05％Proclin300、5％牛血清白蛋白、0.10％Triton X-100的20mM磷酸钠缓冲溶液(PH7.4)分别将标志物的纯品配制成标示浓度为0、50、100、200、400、800ng/ml的一浓度梯度标准品以及80、300ng/ml的质控品；然后制成冻干粉，4℃保存；
样本缓冲液的制备：向100mM磷酸缓冲液(PH7.4)中分别添加：1％牛血清白蛋白和0.05％ Proclin 300，充分混匀。
如附图6所示为本实施例的标准曲线图，表6为采用实施例1所述的方法检测本实施例质控品、样本的检测结果，其中样本1、2来源于人体血浆，从表6可以看出质控品1和质控品2的检测值在对应的靶值范围内，所以可以确定质控品可控，结果可信；而样本1、2的检测值偏差与其对应的靶值相比，偏差小于10％，说明该试剂盒检测准确率高。
表6 质控品、样本检测结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种定量检测样本中脂蛋白磷脂酶A2浓度的液态芯片试剂盒，其特征在于：包括包被有抗脂蛋白磷脂酶A2的单克隆抗体的微球、带孔的平台载体、脂蛋白磷脂酶A2的梯度浓度标准品、脂蛋白磷脂酶A2的质控品、生物素标记的抗脂蛋白磷脂酶A2抗体、链霉亲和素化的藻红蛋白、样本缓冲液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述微球为表面带有荧光色的聚苯乙烯磁微球，带孔的平台载体里面包被有1000-5000个微球/孔，而每个微球含有2*10-6-5*10-5μ的抗脂蛋白磷脂酶A2的单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述带孔平台载体为微孔反应板。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述脂蛋白磷脂酶A2的梯度浓度标准品和脂蛋白磷脂酶A2的质控品都是用脂蛋白磷脂酶A2纯品与自制的标准品稀释液按照1:200000-1:1000稀释而成。
5.根据权利要求书4所述的试剂盒，其特征在于：所述脂蛋白磷脂酶A2纯品是人血浆提纯的天然脂蛋白磷脂酶A2蛋白或大肠杆菌表达的重组脂蛋白磷脂酶A2蛋白。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的标准品稀释液，是在PH 7.0-7.4、浓度为10-100mM磷酸盐缓冲液中，分别加入1-10％质量分数的动物血清、0.01-0.5％质量分数的防腐剂、1-10％质量分数的蛋白保护剂、0.05-1％质量分数的表面活性剂混合而成。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述生物素标记的抗脂蛋白磷脂酶A2抗体为单克隆抗体或者多克隆抗体中的任意一种。
8.制备如权利要求1所述的试剂盒的方法，其特征在于：包括以下步骤，以下步骤不分前后顺序：
包被有抗脂蛋白磷脂酶A2的单克隆抗体的微球的制备：将未包被的微球中加入磷酸二氢钠缓冲液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液进行活化；然后加入特异性的抗脂蛋白磷脂酶A2的单克隆抗体1-125μg在4-8℃进行包被；洗涤；再加入含1-10％质量分数的动物血清蛋白的封闭液进行封闭；最后在10-100mM磷酸盐缓冲液中避光、4-8℃存放；
脂蛋白磷脂酶A2的梯度浓度标准品和脂蛋白磷脂酶A2的质控品的制备：先在PH 7.0-7.4、浓度为10-100mM磷酸盐缓冲液中，分别加入1-10％质量分数的动物血清、0.01-0.5％质量分数的防腐剂、1-10％质量分数的蛋白保护剂、0.05-1％质量分数的表面活性剂混合而成标准品稀释液；再将纯品与自制的标准品稀释液按照1:200000-1:1000稀释而成标示浓度为0-800ng/ml的梯度浓度标准品以及80-300ng/ml的脂蛋白磷脂酶A2质控品；
生物素标记抗脂蛋白磷脂酶A2抗体：将抗脂蛋白磷脂酶A2抗体与生物素按照摩尔比1:20混合，再通过纯化得到生物素标记的抗脂蛋白磷脂酶A2抗体；
链霉亲和素化藻红蛋白：0.5mg的链霉亲和素，加入异双功能试剂无水甲醇液，使得异双功能试剂与链霉亲和素的摩尔比为20，常温反应60min，加入二硫苏糖醇(DTT)使得其终浓度为25mM，常温反应30min，同上过葡聚糖凝胶层析，收集蛋白峰，得到巯基化的链霉亲和素；
取0.75mg/mL衍生化的荧光藻红蛋白与0.25mg/mL巯基化的链霉亲和素按照质量浓度比是3:1混合交联，摇床低速振荡，4-8℃反应过夜；
样本缓冲液的制备：在10-100mM磷酸盐缓冲液中，加入1-10％质量分数的蛋白保护剂，0.01-0.5％质量分数的防腐剂混合而成。
9.如权利要求8所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液购买于Pierce公司，所述动物血清蛋白为牛血清白蛋白。
10.如权利要求8所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述异双功能试剂为琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯或3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯中的一种或两者混合物。
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