ES2355299T3 - Método combinado para la medición secuencial de (1) la fracción enzimáticamente activa y (2) la cantidad total de una enzima. - Google Patents
Método combinado para la medición secuencial de (1) la fracción enzimáticamente activa y (2) la cantidad total de una enzima. Download PDFInfo
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Abstract
Método in vitro para la medición secuencial de, en primer lugar, la fracción enzimáticamente activa y, en segundo lugar, la cantidad total de una enzima (1) en la misma muestra biológica compleja, siendo dicho método una combinación de una extracción inmunitaria específica seguida de una detección enzimática, o método SIEFED, y de un inmunoensayo enzimático, o método ELISA, caracterizado por que este método por «SIEFED- ELISA combinados» se realiza en el mismo soporte sólido con el mismo anticuerpo primario (2) o la misma porción hipervariable de anticuerpo primario, siendo ambos específicos contra dicha enzima y estando fijados en la superficie del soporte sólido (3).
Description
Campo de la invención La presente invención se refiere a un método combinado para la medición secuencial de la fracción enzimáticamente activa y la cantidad total de una enzima [(tal como la mieloperoxidasa (MPO)] en una muestra, y que mejora sus aplicaciones en los campos de la salud veterinaria y humana. 5 Antecedentes de la invención La solicitud de patente internacional WO2005/07586 describe un método y un kit para medir la activación de los neutrófilos. Este método se basa en un método de detección por ELISA o por SIEFED y en en un kit para medir el estado de activación de los neutrófilos en una muestra biológica obtenida de un mamífero, preferentemente un 10 caballo. Este método se podría utilizar para detectar y/o predecir enfermedades o afecciones, para seguir la activación de los neutrófilos durante el tratamiento de un mamífero enfermo, para evaluar la capacidad de los neutrófilos durante su lucha contra los microorganismos y/o su destrucción, para evaluar la eficacia de los inmunomoduladores (o la capacidad inhibidora in vitro de los fármacos) mediante la comparación del estado de 15 activación de los neutrófilos entre los neutrófilos tratados y sin tratar, para evaluar la capacidad de los neutrófilos tratados con dicho modulador y/o fármaco para luchar contra los microorganismos y/o para destruirlos, para evaluar la capacidad de defensa natural o la capacidad de un mamífero para luchar contra microorganismos y para detectar o seleccionar compuestos que interaccionan con la mieloperoxidasa (MPO). La solicitud de patente internacional WO2005/07586 describe también el uso de los métodos ELISA y 20 SIEFED y los kits para distinguir entre la mieloperoxidasa total y la mieloperoxidasa activa (contenido de MPO). No obstante, este documento no describe y no sugiere que la detección de la MPO se pueda obtener mediante estos métodos en un bioensayo o método combinado en el mismo soporte sólido con el mismo anticuerpo de unión o porción de anticuerpo. Objetivos de la invención 25 La presente invención se propone dar a conocer un método que no presenta los inconvenientes del estado de la técnica y que permite medir la fracción activa y la cantidad total de una enzima en la misma muestra, de modo secuencial con el mismo anticuerpo primario sobre el mismo soporte sólido. Un objetivo principal de la presente invención es dar a conocer un método que se utilice para la medición combinada de la fracción enzimáticamente activa y la cantidad total de los diferentes tipos de las enzimas que están 30 implicadas en diferentes enfermedades, tales como enfermedades cardíacas y cáncer, preferentemente enzimas que están implicadas en la arterioesclerosis. Otro objetivo de la presente invención es dar a conocer tal método de detección que reduce los retrasos de detección y la cantidad de mezclas reactivas utilizadas (especialmente la cantidad de anticuerpos primarios utilizados, la cantidad de soporte sólido utilizado, la cantidad de enzima purificada para obtener la curva de 35 calibración). Un último objetivo de la presente invención es proponer tal método que permita la automatización de este método, particularmente al permitir la medición simultánea de la activación de la fracción activa y la cantidad total de los diferentes tipos de enzimas, posiblemente presentes a la vez en la misma muestra biológica. Definiciones 40 El acrónimo ELISA significa «inmunoensayo enzimático» y el acrónimo SIEFED significa «Extracción inmunitaria específica seguida de detección enzimática». «Una medición secuencial de la fracción enzimáticamente activa y la cantidad total de una enzima presente en una muestra biológica» significa una método de detección que, después de unir la enzima sobre el anticuerpo primario inmovilizado, permite medir la fracción enzimáticamente activa de una enzima (a saber, la detección se 45 realiza sobre la enzima activa mediante la medición de su actividad enzimática con la adición de sustrato y cosustrato adecuados) seguida de la medición de la cantidad total de la enzima que se aplica sobre la enzima activa o inactiva. Una «medición» significa una detección y, si llega el caso, una cuantificación. La terminología «un inhibidor enzimático» significa un compuesto o agente que se une a una enzima de tal modo que impide la unión normal entre el sustrato y la enzima, y la reacción catalítica. 50 Compendio de la invención
La presente invención se refiere a un método combinado para la medición secuencial de la fracción
enzimáticamente activa y la cantidad total (cantidad activa y, si llega el caso, inactiva) de una enzima presente en una muestra biológica, que se basa en un bioensayo y método de detección por SIEFED-ELISA combinados; tal detección se realiza después de capturar la enzima (activa e inactiva) con el mismo anticuerpo primario fijado sobre el mismo soporte sólido (superficie), estando dirigido este anticuerpo primario contra esta enzima. Los inventores han descubierto inesperadamente que estos dos métodos (método por SIEFED-ELISA) (que parecen ser 5 antagonistas el uno del otro) se pueden simultanear eficazmente y pueden permitir una calibración eficaz con la misma curva de calibración o estándar con el uso del mismo anticuerpo primario fijado a un soporte sólido. Además, los inventores han observado inesperadamente que el mismo anticuerpo primario fijado al mismo soporte sólido se podría utilizar en estas dos etapas combinadas. De hecho, los inventores han observado inesperadamente que el anticuerpo primario fijado a un soporte sólido no resulta afectado por ninguna etapa de lavado utilizada durante los 10 dos métodos y que se podría mantener sobre el soporte sólido con su enzima unida. Como la técnica secuencial para la mieloperoxidasa (el método por SIEFED seguido por el ELISA) se realiza con el mismo recubrimiento de anticuerpos primarios de una placa multipocillo, el método de la invención - permite economizar los anticuerpos primarios, - permite economizar el soporte sólido (placa multipocillo), 15 - permite economizar la proteína pura de referencia (mieloperoxidasa) utilizada para establecer las curvas estándares (de referencia), - permite ahorrar tiempo: se necesita sólo una dilución de las muestras y solo un reparto de muestras en los pocillos. Además, el método de la invención 20 - permite economizar los reactivos (tampón de dilución). - asegura un mayor nivel de precisión en la medición de la mieloperoxidasa mediante SIEFED y mediante ELISA para una misma muestra (los anticuerpos primarios y la referencia o la muestra desconocida son idénticos para las dos mediciones, lo que descarta las variaciones debidas a alguna pequeña diferencia en la concentración de los anticuerpos en el volumen de la muestra a medir). 25 - esta característica es importante para establecer una proporción de MPO total por MPO activa para una muestra determinada. El método según la invención es un método in vitro para la medición secuencial (mediante etapas consecutivas) de la fracción enzimáticamente activa y la cantidad total de una o más enzima(s), preferentemente mieloperoxidasa (MPO), comprendiendo este método las etapas consecutivas siguientes: 30 1) proporcionar una muestra biológica, preferentemente una muestra biológica obtenida de un mamífero, tal como un caballo o un humano, conteniendo dicha muestra la(s) mencionada(s) enzima(s) [o células que pueden liberar la(s) mencionada(s) enzima(s)], 2) inmunocapturar dicha(s) enzima(s), presente(s) en la muestra biológica, mediante un anticuerpo primario (policlonal o monoclonal) específico de enzima o la porción hipervariable del mismo, siendo ambos específicos 35 contra esta(s) enzima(s) y estando fijados a la superficie de un soporte sólido, 3) si llega el caso, retirar mediante una (primera) etapa de lavado cualquier compuesto que interfiera con la medición de la actividad de la enzima inmunocapturada por este anticuerpo primario (o su porción), 4) obtener un valor de la actividad de la enzima medida a partir de una detección y cuantificación por SIEFED mediante detección y/o medición de la actividad enzimática, preferentemente con la adición de un sustrato 40 específico que será transformado por esta enzima en un producto de reacción visible (preferentemente un fluorescente), 5) si llega el caso, comparar dicho valor de actividad enzimática medida con un valor de actividad enzimática normal (a saber, valores [niveles] enzimáticos estándares de referencia o estándares preestablecidos utilizados como referencia) obtenido de un número significativo (más de 10, preferentemente más de 50, más 45 preferentemente más de 200 o 1000 individuos) de mamíferos «sanos», preferentemente caballos o humanos (a saber, mamíferos que presentan valores (niveles) enzimáticos normales y que no padecen las enfermedades ni los síntomas descritos que siguen), u opcionalmente cuantificar los niveles (valores) de actividad enzimática mediante una curva enzimática estándar, 6) si llega el caso, retirar mediante una (segunda) etapa de lavado cualquier sustrato presente en la enzima 50 inmunocapturada,
7) obtener, a partir de la detección por ELISA (etapa de ELISA), una cantidad (nivel o valor) de enzima total
medida mediante la detección y la medición de la cantidad total (activa e inactiva) de enzima presente en la muestra biológica, preferentemente mediante un anticuerpo secundario (monoclonal o policlonal) o una porción hipervariable del mismo para detectar la enzima inmunocapturada (mediante el anticuerpo primario o la porción hipervariable del mismo), siendo dichos anticuerpo secundario o porción del mismo específicos contra la enzima inmunocapturada y, si llega el caso, estando marcados por conjugación a una segunda enzima de «detección» que es diferente de la 5 primera enzima a detectar (anticuerpo secundario marcado), 8) si llega el caso, comparar la mencionada cantidad (niveles o valores) de enzima total medida obtenida con las cantidades (niveles o valores) de enzima normal obtenidas con un número significativo de mamíferos «sanos», preferentemente caballos o humanos sanos, 9) opcionalmente, cuantificar la cantidad (niveles o valores) de enzima mediante la(s) curva(s) enzimática(s) 10 estándar(es) y 10) si llega el caso, relacionar las fracciones enzimáticamente activas de enzima(s) medida(s) mediante SIEFED, la cantidad (niveles o valores) total de enzima(s) medida(s) mediante ELISA y las tasas calculadas de la fracción enzimáticamente activa por la cantidad (nivel o valor) total por un estado de activación de la(s) enzima(s) o de las células que liberan la(s) enzima(s) y que es indicativo de la presencia, ausencia o estado de una enfermedad 15 o afección inmunitaria. También se describe un bioensayo combinado que comprende los modos y los medios (si llega el caso, presentes en un kit o dispositivo) para la medición de un estado de activación de una(s) enzima(s) presente(s) en una muestra biológica o de células que pueden liberar dicha enzima en la muestra biológica (obtenida de un mamífero, preferentemente de un caballo o de un humano) que permite la medición secuencial descrita 20 anteriormente y la cuantificación con una curva de calibración o estándar. El bioensayo (o kit o dispositivo) combinado es un bioensayo (kit o dispositivo) por SIEFED-ELISA combinados para medir secuencialmente la fracción enzimáticamente activa y el contenido de la cantidad de enzima total (activa e inactiva), en el que los mencionados fracción y contenido están correlacionados con un posible estado de activación de las células. 25 Este bioensayo, kit o dispositivo, combinado comprende los elementos necesarios para obtener una inmunocaptura de la enzima que está presente en la muestra biológica mediante un anticuerpo primario (monoclonal o policlonal) que reconoce la enzima, o una porción del mismo, que son específicos de dicha enzima y que se fijan a la superficie de un soporte sólido. Ventajosamente, este bioensayo (kit o dispositivo) combinado comprende además un sustrato específico 30 que será transformado por la enzima en un producto de reacción visible (preferentemente un producto de reacción fluorescente) para detectar la fracción enzimáticamente activa de la enzima inmunocapturada, y un anticuerpo (si llega el caso, marcado) secundario (monoclonal o policlonal) (o una porción del mismo) para detectar la cantidad (nivel o valor) total de enzima inmunocapturada por el anticuerpo primario. Preferentemente, este bioensayo (kit o dispositivo) combinado comprende además una muestra de enzima 35 de referencia calibrada (para la actividad de la enzima y para la cantidad total) que se utilizará para establecer curvas de referencia. Además, el kit o dispositivo puede comprender adicionalmente datos, si llega el caso presentados en una base de datos o en gráficos (curva de calibración o estándar), relacionados con la cantidad (niveles o valores) de enzima (enzimáticamente activa o total) normal obtenida de un número significativo (más de 10, preferentemente más de 50, más preferentemente más de 200 o 1000 individuos) de mamíferos «sanos», 40 preferentemente caballos o humanos (a saber, mamíferos que presentan unos niveles normales de MPO y que no padecen las enfermedades ni los síntomas que se describen más adelante). Estos niveles enzimáticos normales están ventajosamente presentes en una curva de MPO estándar o se recogen en una base de datos. Por lo tanto, el kit o el dispositivo pueden comprender además estas bases de datos almacenadas en un ordenador (con un programa adecuado) para comparar la enzima medida (niveles o valores) con 45 la cantidad (niveles o valores) de enzima normal mediante métodos bien conocidos por el experto en la técnica y para relacionar esta enzima medida (niveles o valores) con un estado de actividad de la enzima o un estado de activación de las células que liberan la enzima, siendo este estado posiblemente indicativo de la presencia, ausencia o estado de una enfermedad o un estado inmunitario de sujetos mamíferos, preferentemente caballos o humanos. En el método según la invención, la enzima se selecciona preferentemente del grupo que consiste en 50 mieloperoxidasa (MPO) o una enzima que sea marcadora de una enfermedad inflamatoria o una enfermedad cardíaca (preferentemente arterioesclerosis) o cáncer. Preferentemente, esta enzima se selecciona entre el grupo que consiste en proteasas (tripsina, elastasa...), NADPH oxidasa, glutatión peroxidasa, NO sintasa, catalasa o colagenasas.
En el método según la invención, el soporte sólido es preferentemente una placa multipocillo, 55 preferentemente una placa multipocillo revestida con estreptavidina, que permite que el anticuerpo primario (o una
porción del mismo) se una a su superficie. Preferentemente, este revestimiento es suficiente para evitar la retirada de este revestimiento de anticuerpo primario después de la (primera y/o segunda) etapa de lavado utilizada para eliminar de la muestra biológica cualquier molécula que no esté unida al anticuerpo primario o una porción del mismo. Además, este revestimiento también es suficiente para impedir que se elimine este anticuerpo primario (o una porción del mismo) mediante una etapa de lavado que se utilice para eliminar el sustrato de la enzima después 5 de la etapa de detección por SIEFED y antes de añadir el segundo anticuerpo (marcado) utilizado ulteriormente en la etapa de detección por ELISA. Además, el bioensayo, kit o dispositivo descrito puede comprender además cualesquiera otros modos o medios utilizados para realizar la detección combinada según la invención, tales como nitrito(s), que se añaden al medio de reacción para amplificar la reacción enzimática, preferentemente la reacción enzimática de la peroxidasa, 10 más preferentemente para potenciar la señal de fluorescencia inducida por la 10-acetil-3,7-dihidroxifenoxazina. Se halló sorprendentemente que la sensibilidad de detección de las etapas del método por SIEFED se podía aumentar significativamente con la adición de nitritos, lo que mejora significativamente la fluorescencia. La cantidad preferente de nitrito (NO2-) a añadir a la mezcla de reacción está comprendida entre unos 0,05 y unos 0,7 mg/ml, y preferentemente unos 0,2 mg/ml. El nitrito se añade preferentemente en forma de sal, tal como sal de Na o 15 cualquier otra sal de metal alcalino o alcalinotérreo (tal como sales de Li, K, Rb, Cs, Be, Mg, Ca, Sr) excepto las sales tóxicas (tal como, presumiblemente, sales de Ba, Ra o Fr). La amplificación de la señal de detección hace posible la medición y la detección precisas de la actividad enzimática de una enzima, por ejemplo, la de la MPO que se origina en los neutrófilos, en los tejidos, muestras o medios (biológicos) más complejos. En una realización particular y preferente de la invención, la sensibilidad de la detección enzimática 20 aumentó al menos 2 veces, preferentemente al menos 5 veces, más preferentemente al menos 10 veces o 20 veces, utilizando nitrito como potenciador de la actividad de la peroxidasa, lo que conduce a un realce de la respuesta fluorescente. Esta técnica de realce de la fluorescencia es de igual modo aplicable a una detección de otras actividades peroxidasa, y es aplicable no solo a los métodos, kits y dispositivos por SIEFED descritos, sino a cualquier método o 25 kit de detección (médico o industrial) que puede requerir la utilización de una enzima peroxidasa. El bioensayo, kit o dispositivo descrito también puede comprender adicionalmente otros modos y medios bien conocidos, tales como cromógeno(s), tampón(ones), marcador(es) y solución(ones) de lavado. Además, el kit o dispositivo según la invención también puede comprender los modos y los medios de detección y/o registro de la(s) señal(es) obtenida(s) del(de los) marcador(es) utilizado(s). 30 La muestra o el medio biológico es preferentemente un líquido biológico (si llega el caso, purificado) obtenido de un mamífero (preferentemente un caballo o un humano) o de un medio de cultivo, u obtenido de bacterias, plantas u hongos, incluidas las células de levadura, que pueden liberar la enzima. Este líquido biológico puede ser un líquido biológico celular o un líquido biológico acelular. Este líquido biológico podría ser sangre venosa o capilar, suero o plasma, líquido seminal, líquido broncoalveolar, líquido pleural, esputo, fluido nasal, líquidos 35 ascíticos, líquido sinovial, muestras intestinales, gástricas y fecales, o líquido cefalorraquídeo. La muestra o medio biológico también podría ser un extracto obtenido de distintos tejidos de un mamífero u otras muestras o medios biológicos complejos que también pueden comprender otras moléculas, tales como proteínas (albúmina, lipoproteína) y reductores, que pueden interferir con la medición adecuada de la enzima tal y como se observa en los análisis clásicos conocidos en la técnica. 40 Los métodos según la invención también se aplican a algunos ensayos diagnósticos específicos ya propuestos para caballos o humanos, tales como la detección de enfermedades de origen inflamatorio, que pueden afectar a dicho mamífero, en especial a un caballo o a un humano. En un aspecto preferente de la descripción, el kit (o dispositivo) es un kit por partes (si llegara el caso, comprende diferentes partes de los elementos para realizar las etapas del método). 45 Las posibles aplicaciones de un método por SIEFED-ELISA combinados según la invención son: - La evaluación rápida de la intensidad de la activación de las células (neutrófilos) y la reacción inflamatoria sistémica o local en las enfermedades inflamatorias agudas o crónicas (tales como ateroesclerosis, septicemia, choque septicémico, enfermedades inflamatorias pulmonares, enteropatías, laminitis). - El seguimiento eficaz y rápido de la activación de las células (neutrófilos) durante el tratamiento 50 (estudio de los efectos de los fármacos) administrados al mamífero (preferentemente un caballo o un humano), mediante la toma de muestras del mismo individuo o mamífero enfermo (preferentemente un caballo o un humano) a diferentes intervalos de tiempo, por medio de lo cual se puede seguir el estado de activación de los neutrófilos con el tiempo.
- El diagnóstico temprano o la predicción de algunas enfermedades. 55
- La evaluación rápida de los neutrófilos capaces de destruir microorganismos (evaluación en neutrófilos aislados), una prueba que se aplicará en enfermedades con inmunodepresión. - La evaluación rápida de la capacidad de defensa natural o si un individuo o grupo de individuos son capaces de luchar contra las infecciones. - La medición rápida de la captura de la enzima por otras células (en relación con su capacidad para 5 luchar contra microorganismos y/o para destruirlos). - La detección rápida y la selección de compuestos que, si llega el caso, interaccionan con la enzima y, si llega el caso, afectan a la actividad de esta enzima. Por lo tanto, el kit o dispositivo descrito es preferentemente un kit o dispositivo de alto rendimiento que comprende elementos para medir, detectar o seleccionar compuestos activos. Tales «compuestos activos» son 10 elementos seleccionados entre el grupo que consiste en moléculas sintetizadas química o biológicamente (incluidos los anticuerpos), moléculas naturales nuevas purificadas, extractos de microorganismos, plantas o animales, o una mezcla de los mismos. Estos compuestos son preferentemente inhibidores enzimáticos (inhibidores reversibles o irreversibles). Preferentemente, dicho kit o dispositivo utilizado para detectar inhibidores enzimáticos se basa en un método que comprende las etapas de 15 - incubar la enzima activa con el(los) inhibidor(es) potencial(es), - capturar la enzima activa (preferentemente mediante un anticuerpo específico contra la enzima o una porción hipervariable del mismo) por unión a un soporte sólido, preferentemente estando el soporte sólido del kit o dispositivo por SIEFED-ELISA de acuerdo con la invención, y lavar los compuestos sin unir, - si llega el caso, medir la actividad enzimática, preferentemente mediante la etapa (parte) de 20 SIEFED del método por SIEFED-ELISA descrito más arriba, - lavar para eliminar los reactivos después de la etapa de SIEFED del método por SIEFED-ELISA, - si llega el caso, medir la cantidad total de enzima, preferentemente mediante la etapa (parte) de ELISA del método por SIEFED-ELISA descrito más arriba, - si llega el caso, comparar la actividad enzimática y la enzima total antes o después de añadir el 25 (los) posible(s) inhibidor(es). Cuando se examina la capacidad de las células que no sean neutrófilos para luchar contra microorganismos y/o para destruirlos, los bioensayos que se han descrito más arriba se aplican entonces a las muestras que contienen otros tipos de células. Al comparar los niveles enzimáticos obtenidos para dichas células con los niveles enzimáticos de los neutrófilos de los individuos sanos, se puede elaborar una estimación de la 30 capacidad o facultad de dichas células para fijar o internalizar la enzima y en consecuencia luchar contra las infecciones por microorganismos. Las técnicas de detección anteriores pueden además encontrar un uso ventajoso en el estudio de la eficacia de determinados medicamentos tales como los inmunomoduladores. Los niveles enzimáticos de las células (neutrófilos) que han estado en contacto con, por ejemplo, dichos inmunomoduladores se comparan a continuación 35 con la cantidad (niveles o valores) de enzima de las células sin tratar (neutrófilos), siendo dicha enzima (niveles o valores) una indicación para el estado de activación de las células (neutrófilos) y/o su capacidad para luchar y/o destruir microorganismos. Los métodos de detección según la invención son útiles en particular para la predicción, el diagnóstico, si llega el caso en una etapa muy temprana, y/o el seguimiento de una de las enfermedades o afecciones siguientes: 40 enfermedades inflamatorias, enfermedades digestivas, enfermedades por estrangulamiento intestinal, septicemia, choque septicémico, enfermedades pulmonares crónicas y agudas (con neutrófilos invadiendo los alvéolos), enfermedades por isquemia-reperfusión, enfermedades articulares (con presencia de neutrófilos en las articulaciones), cólicos, alergias, infecciones, enfermedades cardiovasculares y cáncer. Los métodos de detección según la invención son además particularmente útiles para la evaluación in vitro 45 de la capacidad inhibidora de los fármacos (tanto productos naturales obtenidos de extractos vegetales o de origen animal, como moléculas de nueva síntesis) sobre la actividad enzimática, lo que permite diferenciar entre que dichos fármacos tengan un efecto neutralizante sobre los productos de la actividad de la enzima (actividad antioxidante estequiométrica) o que tengan una actividad inhibidora directa sobre la propia función de la enzima (actividad anticatalítica). 50 En un modo más general, al comparar el nivel de actividad enzimática y el nivel total de enzima medidos mediante las etapas de SIEFED-ELISA combinados, se puede ensayar la eficacia de las técnicas de purificación de la enzima.
A continuación, la presente invención se describirá con detalle en la descripción que sigue de las realizaciones preferentes de la presente invención en referencia a las figuras adjuntas. Los ejemplos dados a continuación se ofrecen a modo de ilustración, no a modo de limitación. Descripción breve de los dibujos La figura 1 representa dos curvas de calibración o estándares utilizadas en el método según la invención. 5 La figura 2 representa el método combinado de la invención. Ejemplos Ejemplo 1: SIEFED-ELISA combinados para la MPO humana a) Preparación y purificación de los anticuerpos contra la MPO humana Los anticuerpos policlonales específicos contra la MPO humana se generaron en conejos y conejillos de 10 Indias contra la MPO humana pura, se purificaron por cromatografía de afinidad y se les evaluó su inmunorreactividad siguiendo los mismos métodos que se describen para la preparación y la purificación de los anticuerpos policlonales contra la MPO equina. b) Técnica de SIEFED-ELISA combinados para medir la MPO humana Los métodos utilizados son similares a los descritos para el SIEFED-ELISA combinados de la MPO equina, 15 pero se utilizan anticuerpos policlonales específicos anti-MPO humana (IgG de conejo contra el anticuerpo primario e IgG de conejillo de Indias contra el segundo anticuerpo). c) Calibración con la MPO humana Las curvas de calibración para el SIEFED-ELISA combinados se obtuvieron con la MPO humana estándar: - tal y como se usó en el laboratorio CORD: una disolución de reserva (100 µg/ml) de MPO humana 20 (Calbiochem) en un tampón de acetato de sodio a 0,2 M, pH 5,5, se mantiene en fracciones alícuotas a –20ºC. Esta disolución de reserva se diluye con un tampón de dilución para alcanzar una concentración de 50 ng/ml de MPO (concentración del calibrador 7 [Cal 7]). Se obtienen, comenzando desde el Cal 7, las diluciones secuenciales hasta alcanzar la concentración de MPO más baja para la curva: 0,78 ng/ml (Cal 1). El calibrador 0 (Cal 0) = tampón de dilución. 25 - tal y como se usó en el kit de ELISA de Zentech para la MPO humana: Los calibradores de la MPO del kit de ELISA se preparan según el modo recomendado que proporciona Zentech. Las concentraciones de la MPO son (en ng/ml): 0 (Cal 0); 0,6 (Cal 1); 2,1 (Cal 2); 11,7 (Cal 3); 22,4 (Cal 4); 78,5 (Cal 5). A estos calibradores se les añaden dos referencias plasmáticas que tienen la siguiente concentración estimada de MPO total : 30 Control 1: 1,20 (0,80 ... 2,00) ng/ml Control 2: 8,50 (6,30 ... 10,70) ng/ml d) Dilución de la muestra La dilución de la muestra se obtiene con el tampón de dilución proporcionado por el kit de Zentech. Las muestras biológicas se diluyen 20x para la dosis para SIEFED-ELISA combinados. 35 e) Curvas estándares enzimáticas para el SIEFED-ELISA combinados Se obtuvo una curva estándar de la enzima (MPO humana) para la parte SIEFED del SIEFED-ELISA combinados después de revelarse la actividad de la enzima mediante la representación gráfica de los valores de fluorescencia a 590 nm en función de las concentraciones enzimáticas estándares. La curva estándar de la «parte SIEFED» permite cuantificar la fracción enzimáticamente activa de la MPO en una muestra biológica. 40 La curva estándar de la parte ELISA del SIEFED-ELISA combinados se obtuvo mediante la representación gráfica de los valores de absorbencia a 405 nm en función de las concentraciones enzimáticas estándares (véase la figura 1). La curva estándar de la «parte ELISA» permite calcular la concentración total de la MPO en una muestra biológica. La proporción MPO total/MPO activa en la muestra biológica se obtiene por la proporción de los dos valores leídos sobre las dos curvas estándares. 45
f) Análisis comparativo de la concentración de la fracción activa y de la enzima total (MPO humana) medida en las muestras biológicas analizadas: proporción de las concentraciones de SIEFED/ELISA. La tabla 1 representa la concentración de una enzima (MPO humana) (total y activa) medida en los controles del kit de Zentech, en el plasma (P) y en el líquido broncoalveolar (Bal) de humanos. Mediante un calibrador de MPO humana adecuado de CORD para la detección de SIEFED-ELISA, los 5 inventores han observado que las concentraciones de la enzima (MPO) activa son siempre más bajas (al menos de 2 a 3 veces) que la concentración de la enzima (MPO) total en las muestras biológicas analizadas (véase la tabla 1). Tabla 1:
- Calibración de MPO (Calbiochem) de CORD
- MPO total por ELISA (ng/ml) MPO activa por SIEFED (ng/ml) MPO total/MPO activa
- MPO 1 de control
- 1,36 0,37 3,6
- MPO 2 de control
- 11,65 0,63 18,5
- P5 20 x
- 58,30 ± 2,6 25,57 2,3
- P6 20 x
- 35,25 ± 2,2 12,34 2,9
- Bal De 20 x
- 13,76 ± 3,5 6,78 2,0
- Bal Ha 20 x
- ≥ 50 10,41.55 ≥ 5
Estos resultados muestran que el bioensayo (kit o dispositivo) por SIEFED-ELISA combinados para la MPO 10 humana es eficaz y permite medir secuencialmente la fracción enzimáticamente activa y la cantidad total de la MPO en la misma muestra biológica con el mismo anticuerpo primario (2) (o la misma porción hipervariable del mismo) fijado sobre una superficie de soporte sólido (3). De hecho, los inventores han observado que la muestra biológica se puede utilizar con la misma dilución para el SIEFED y el ELISA (20x en este bioensayo). Esto significa que, para la misma muestra diluida, el nivel de solo la fracción activa y de la enzima (MPO) total está en concentraciones que 15 se ajustan al límite de sensibilidad del bioensayo y de las curvas de referencia, porque se pueden medir con el mismo factor de dilución utilizando el mismo material inmunitario (anticuerpo primario) y los mismos calibradores. Estas características ventajosas pueden, por lo tanto, simplificar claramente las etapas de los métodos según la invención en comparación con los bioensayos de ELISA y de SIEFED por separado. Estos factores de dilución se podrían modificar según el tipo de enzima y según el tipo de muestra 20 biológica. Ejemplo 2: SIEFED-ELISA combinados para la MPO equina a) Preparación y purificación de anticuerpos contra la MPO equina La producción de anticuerpos policlonales se describe en la patente internacional WO2005/075986 que se incorpora en la presente memoria por referencia. 25 Los anticuerpos generados reconocen con eficacia la enzima (MPO). b) Técnica de SIEFED-ELISA combinados para medir la MPO equina liberada por los neutrófilos activados SIEFED es una técnica de inmunodetección que consiste en dos etapas: - la captura de una enzima (tal como MPO) (1) de muestras biológicas mediante el anticuerpo primario específico (2) con el que se reviste un soporte sólido (3), seguido de 30 - la detección enzimática de la enzima (tal como MPO) (1) inmovilizada (fijada) sobre el anticuerpo primario con el que se reviste el soporte sólido. A diferencia de las etapas (parte) de ELISA del análisis combinado, la (parte) SIEFED mide sólo la enzima (MPO) activa.
El anticuerpo primario (2), que captura la enzima (MPO 1), es una IgG de conejo (3 μg/ml). La enzima 35
(MPO) estándar o la muestra desconocida se incuba 2 h a 37ºC. Después del lavado, la actividad (peroxidasa) de la enzima (MPO) se detecta con la adición de 100 µl de una disolución de H2O2 a 10 µM y 40 µM de Amplex® Red (8) (10-acetil-3,7-dihidroxifenoxacina; de Molecular Probes) en tampón de fosfato (50 mM, pH 7,5). La fluorescencia se lee durante 30 minutos (a 37ºC) a 590 nm con un equipo Fluoroskan Ascent (Labsystems). El volumen del anticuerpo primario (2) y de la muestra puesto en los pocillos es de 200 µl. Los controles (blancos) y las diluciones 5 de las muestras se establecen con tampón de dilución. El realce de la fluorescencia se obtuvo cuando se añadía una concentración definida de iones nitrito (unos 10 mM) a la disolución Amplex® Red (8). La respuesta de fluorescencia obtenida en esta etapa (parte) de SIEFED del bioensayo por SIEFED-ELISA combinados es directamente proporcional a la fracción enzimáticamente activa de la enzima (MPO equina) presente en la muestra. 10 Después de la detección por SIEFED, se realiza un lavado (disolución de NaCl al 0,9% con Tween-20 al 0,1%) antes de comenzar la parte ELISA del método combinado; el complejo anticuerpo inmovilizado (2)-antígeno (1) se incuba (2 h, 37ºC) con un exceso de IgG de conejillo de Indias (5 µg/ml), que es el anticuerpo secundario (4). Después del lavado, se le añade un tercer anticuerpo (5) producido contra la IgG de conejillo de Indias. Esta tercera IgG (5) (IgG de cabra) se marca con fosfatasa alcalina (6) y reconoce el complejo en «sandwich» que forman 15 «anticuerpo primario (2)-MPO (1)-anticuerpo secundario (4)». Después del lavado, se detecta la actividad fosfatasa por incubación (30 min, 37ºC, en la oscuridad) con una disolución de fosfato de paranitrofenilo (sustrato de la fosfatasa, Sigma). Se para la reacción con NaOH y se mide la absorbencia (405 nm) con un equipo Multiscan Ascent (Labystem). Todos los volúmenes añadidos en los pocillos comprenden 100 µl, excepto para el lavado (300 µl) y para la disolución del sustrato (200 µl). Los controles (blancos) y las diluciones de la enzima (MPO) estándar y las 20 muestras se establecieron con tampón de dilución [PBS (fosfato a 20 mM, NaCl a 137 mM y KCl a 2,7 mM, pH 7,4) a la que se le añadieron seroalbúmina bovina (5 g/l) y Tween 20 al 0,1%]. La respuesta de absorbencia obtenida para esta parte ELISA del método combinado es directamente proporcional a la cantidad del complejo en sandwich formado, es decir, a la concentración total de la enzima (MPO) en la muestra. 25 c) Curvas enzimáticas estándares para el bioensayo por SIEFED-ELISA combinados para la MPO equina Se obtuvo una curva estándar de la enzima (MPO equina) para las etapas (parte) de SIEFED de los SIEFED-ELISA combinados con la representación gráfica de los valores de fluorescencia a 590 nm en función de las concentraciones de enzima estándares y para las etapas (parte) de ELISA de los SIEFED-ELISA combinados mediante la representación gráfica de los valores de absorbencia a 405 nm en función de las concentraciones 30 estándares de la enzima (MPO). Las curvas estándares son clásicas, y se acaban estancando en las concentraciones de enzima (MPO) más elevadas. Los ajustes lineales se obtienen cuando las concentraciones de enzima (MPO) se expresan en forma logarítmica. Una tabla (véase la patente internacional WO2005/075986) recoge los valores de fluorescencia y de absorbencia con las desviaciones estándares (DE) y los coeficientes de variación intraserial (CV en %) para la curva de referencia de SIEFED y de ELISA del SIEFED-ELISA combinados. 35 Las curvas estándares de la enzima (MPO) permiten cuantificar la fracción enzimáticamente activa de la enzima (curva estándar para SIEFED) y la cantidad total de la enzima (MPO) (curva estándar para ELISA). La proporción de enzima total por enzima activa se obtiene mediante el índice de los valores leídos sobre las curvas estándares respectivas. La monitorización de la progresión de la enfermedad puede sacar provecho de tal cuantificación. Al comparar los niveles de la enzima (MPO) activa y total medidos en los individuos sanos con los de 40 los individuos enfermos, se pueden establecer valores de corte que permiten diferenciar entre mamíferos sanos y mamíferos enfermos. Preferentemente, tales valores de corte se establecen para las diferentes muestras biológicas a las que se les analizan los niveles de enzima (MPO) de las células. La adición de los iones nitrito (unos 10 mM) en forma de una sal (sal de sodio) al medio de reacción podría aumentar hasta diez veces la sensibilidad de las etapas (parte) de SIEFED del bioensayo de SIEFED-ELISA. 45 d) El bioensayo por SIEFED-ELISA combinados desarrollado para la MPO equina permite detectar la enzima en muestras complejas, tales como el plasma y el sobrenadante de neutrófilos activados Se detectaron los niveles de la enzima (MPO) activa y total en muestras biológicas que consisten en plasma extraído de sangre que no coagula por contener EDTA, ya que previamente se demostró que el EDTA era el mejor anticoagulante para evitar la desgranulación in vitro de los neutrófilos en la muestra de sangre y la obtención 50 de valores artefactuales de las concentraciones de MPO activa y total. Se establecieron los coeficientes de variación (testigo de la precisión de la técnica) intra- e interseriales para el plasma tomado de caballos sanos y de caballos con enfermedades inflamatorias.
Se observaron las concentraciones más elevadas de enzima (MPO) activa y total en el plasma de caballos con enfermedades por estrangulación intestinal. Se observó una liberación importante de la enzima (MPO) total con 55 fracción variable de la enzima enzimáticamente activa en el sobrenadante de los neutrófilos excitados en comparación con los neutrófilos sin excitar.
Lo mencionado anteriormente demuestra que el bioensayo por SIEFED-ELISA combinados de la presente invención es sensible, preciso y capaz de diferenciar con claridad entre animales sanos y animales enfermos. Demuestra adicionalmente que la medición de la enzima (MPO) total y activa del plasma se puede tomar como testigo de la activación de las células (neutrófilos) y se correlacionan positivamente con determinadas enfermedades. 5 El análisis combinado también se aplicó con éxito a líquido peritoneal y líquido seminal. e) Sensibilidad y precisión del bioensayo por SIEFED-ELISA combinados aquí desarrollado La sensibilidad del ensayo combinado es de aproximadamente 1 ng/ml, con unas buenas precisiones intra- e interseriales para las curvas estándares (inferior al 8%) y para las muestras biológicas (por lo general, inferior al 10%). 10 Ejemplo 3: SIEFED-ELISA combinados para el estudio de los efectos de los polifenoles naturales, curcumina y tetrahidrocurcumina (THC), sobre neutrófilos activados de equinos Se contaron los neutrófilos aislados de la sangre con citrato de caballos sanos, se suspendieron en una disolución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,4 y se incubaron 10 min a 37ºC con curcumina o THC a la concentración final de 10-4, 10-5 o 10-6 M. Después de la incubación y la centrifugación (1000 x g, 10 min), se 15 resuspendieron los neutrófilos en PBS y se activaron 30 min con acetato de miristato de forbol (PMA) a 8 x 10-7 M seguido de centrifugación y de la medición de la enzima (MPO) activa y la total en el sobrenadante mediante el bioensayo específico por SIEFED-ELISA combinados. Los efectos de los polifenoles sobre la fracción activa y total de la enzima (MPO) liberada por los neutrófilos estimulados se estudiaron mediante la preincubación de los neutrófilos con los fármacos en diferentes concentraciones, antes de la estimulación de los neutrófilos. 20 La curcumina y la THC tenían efectos inhibidores, dependientes de la dosis, sobre la enzima total, y sobre la fracción activa de la enzima (MPO) liberada por los neutrófilos activados. Los porcentajes de inhibición fueron el 44 % y el 60 % para la curcumina (10-5 M) y el 18 % y el 22 % para la THC (10-5 M) sobre la liberación de la enzima (MPO) total y sobre la actividad de la MPO, respectivamente. Estos efectos inhibidores de la curcumina hacen surgir perspectivas terapéuticas para las enfermedades equinas en las que hay un exceso de reacción inflamatoria. 25 La actividad enzimática de la enzima (MPO) produce HClO (ácido hipocloroso) o NaClO (hipoclorito de sodio) y otras especies oxidantes potencialmente tóxicas si la enzima actúa directamente al entrar en contacto con los tejidos o con el interior de las células, por lo tanto, en lugares diferentes al fagolisosoma. La enzima (MPO) puede estar presente en los líquidos biológicos en forma inactiva (inhibición por oxidación o por inhibidores específicos). Es interesante diferenciar la enzima (MPO) activa de su forma inactiva en las muestras biológicas. 30
Claims (3)
- REIVINDICACIONES 1. Método in vitro para la medición secuencial de, en primer lugar, la fracción enzimáticamente activa y, en segundo lugar, la cantidad total de una enzima (1) en la misma muestra biológica compleja, siendo dicho método una combinación de una extracción inmunitaria específica seguida de una detección enzimática, o método 5 SIEFED, y de un inmunoensayo enzimático, o método ELISA, caracterizado por que este método por «SIEFED-ELISA combinados» se realiza en el mismo soporte sólido con el mismo anticuerpo primario (2) o la misma porción hipervariable de anticuerpo primario, siendo ambos específicos contra dicha enzima y estando fijados en la superficie del soporte sólido (3). 2. Método según la reivindicación 1, que comprende las etapas sucesivas de: 10
- 1) inmunocapturar una enzima (1) presente en una muestra biológica obtenida de un mamífero, conteniendo dicha muestra la enzima (1) o las células capaces de liberar dicha enzima, mediante un anticuerpo primario monoclonal o policlonal específico (2) o una porción hipervariable del mismo, siendo ambos específicos de dicha enzima (1) y estando fijados a una superficie de soporte sólido (3), 15
- 2) retirar mediante una primera etapa de lavado cualquier compuesto que interfiera con la medición de la actividad enzimática de la enzima inmunocapturada en la superficie del soporte sólido (3) mediante el anticuerpo primario (2) o una porción de él,
- 3) obtener un valor de actividad enzimática medido mediante detección y cuantificación por SIEFED al detectar y medir la actividad de la enzima (1) inmunocapturada, 20
- 4) si llega el caso, comparar el valor de dicha actividad enzimática medida con los valores de actividad enzimática normal obtenidos de un número significativo de mamíferos sanos
- 5) y opcionalmente cuantificar el valor de actividad enzimática mediante una curva estándar de la enzima,
- 6) retirar mediante una segunda etapa de lavado cualquier sustrato y compuesto utilizado para la 25 detección en las etapas de SIEFED, o que se obtienen de las mismas, y presente en la disolución con la enzima inmunocapturada (1),
- 7) obtener mediante detección por ELISA la cantidad de enzima total medida por detección y medición de la cantidad total activa e inactiva de enzima (1) presente en una muestra biológica, mediante la adición de un anticuerpo secundario monoclonal o policlonal (4) o una porción del 30 mismo, para la detección de la enzima (1) inmunocapturada por dicho anticuerpo primario (2) o una porción del mismo,
- 8) si llega el caso, comparar dicha cantidad total de enzima medida con la cantidad de enzima total normal obtenida a partir de un número significativo de mamíferos sanos,
- 9) opcionalmente, cuantificar la cantidad de enzima total mediante la curva estándar de la enzima y, 35 si llega el caso, relacionar la cantidad de enzima total medida con un estado de activación de la célula que libera la enzima en relación con la presencia, ausencia o condición de una enfermedad o un estado inmunológico,
- 10) si llega el caso, calcular la proporción de la enzima total por la enzima activa en una muestra biológica y comparar esta proporción con una proporción normal obtenida a partir de un número 40 significativo de mamíferos sanos, o relacionar esta proporción con un estado de activación de la enzima asociada a una condición patológica.
- 3. Método según la reivindicación 2, en el que la etapa de obtener una detección y cuantificación por SIEFED mediante la detección y la medición de la actividad enzimática se realiza añadiendo un sustrato específico (8) destinado a ser transformado por la enzima (1) en un producto de reacción visible. 45 4. Método según la reivindicación 3, en el que el producto de reacción visible es un producto de reacción fluorescente. 5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la muestra biológica se obtiene de un mamífero. 6. Método según la reivindicación 5, en el que el mamífero es un caballo o un ser humano. 50 7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la enzima se selecciona entre el grupo que consiste en mieloperoxidasa, proteasas, NADPH oxidasa, glutatión peroxidasa, NO sintasa, catalasa o colagenasas. 8. Método según la reivindicación 7, en el que la proteasa es tripsina o elastasa.
- 9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el soporte sólido (3) es una placa multipocillo. 10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo secundario (4) está marcado. 11. Método según la reivindicación 10, en el que el anticuerpo secundario (4) está marcado por 5 conjugación a una enzima.
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