PT1633864E

PT1633864E - Ensaio de actividade de lp-pla2 de alta produtividade

Info

Publication number: PT1633864E
Application number: PT04753533T
Authority: PT
Inventors: Yun-Fu Hu
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2003-05-28
Filing date: 2004-05-27
Publication date: 2010-06-24
Also published as: WO2005001416A2; WO2005001416A3; DE602004026439D1; ES2341772T3; ATE463562T1; EP2253702A1; HRP20100285T1; DK1633864T3; JP4892350B2; US7531316B2; SI1633864T1; EP1633864A4; CY1110138T1; JP5637959B2; JP2012050443A; PL1633864T3; EP1633864A2; JP2007502131A; US20070065892A1; EP1633864B1

Description

ΡΕ1633864 1

DESCRIÇÃO "ENSAIO DE ACTIVIDADE DE LP-PLA2 DE ALTA PRODUTIVIDADE"

Campo da Invenção:

Esta invenção refere-se genericamente a métodos e materiais para determinação da actividade enzimática de fosfolipase A2 associada a lipoproteinas (aqui designada "Lp-PLA2") em amostras provenientes de animais.

Antecedentes da Invenção: A doença cardíaca coronária (aqui designada CHD, "coronary heart disease") é a principal causa de morte em muitos países industrializados. A aterosclerose é uma forma de arterioesclerose ou endurecimento das artérias em que há a acumulação progressiva de placa contendo colesterol e lípidos nas artérias sanguíneas. Esta acumulação está associada a um risco aumentado de doença cardíaca e eventos coronários mórbidos. A acumulação de placa nas artérias está associada a uma resposta imune que é despoletada por lesão do endotélio. Inicialmente, macrófagos derivados de monócitos acumulam-se no sítio lesionado, devido à resposta imune que causa uma migração e acumulação de células de músculo liso que formam placa fibrosa em combinação com os macrófagos, lípidos, colesterol, sais de cálcio e cola- 2 ΡΕ1633864 génio. 0 crescimento dessas lesões pode eventualmente bloquear a artéria e restringir o fluxo sanguíneo. A fosfolipase A2 associada a lipoproteínas (Lp-PLA2), também conhecida como PAF acetil hidrolase, é um membro segregado, independente de cálcio da superfamília crescente das fosfolipases A2 (Tew, et ai. (1996) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16(4) :591 — 9; Tjoelker, et al. (1995) Nature 374(6522):549-53). É produzida por monócitos, macrófagos e linfócitos e é encontrada associada predominantemente a LDL (-80%) em plasma humano. A enzima cliva fosfolípidos polares, incluindo o éster sn-2 de 1-0-alquil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfocolina, também conhecido como factor de activação de plaquetas (aqui designado PAF, "platelet activating factor") (Tjoelker, et al. (1995) Nature 374(6522):549-53).

Muitas observações demonstraram uma actividade pró-inflamatória de LDL oxidadas em comparação com as lipoproteínas nativas não modificadas. Um dos primeiros eventos na oxidação de LDL é a hidrólise de fosfatidil-colina modificada oxidativamente, gerando grandes quantidades de lisofosfatidilcolina (lyso-PC) e ácidos gordos oxidados. Esta hidrólise é mediada unicamente por Lp-PLA2 (i.e., Lp-PLA2 hidrolisa PAF para dar lisofosfatidilcolina [ "liso-PC"] e acetato) (Stafforini, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 17895).

Suspeita-se de que a lyso-PC é um pro-infla- 3 ΡΕ1633864 matório e mediador pro-aterogénico. Além de ser citotóxico em concentrações mais elevadas, é capaz de estimular a quimiotaxia de monócitos e linfócitos T, bem como de induzir a expressão de molécula de adesão e citoquinas inflamatórias em concentrações mais modestas. A lyso-PC também foi identificada como o componente de LDL oxidadas que está envolvido na antigenicidade de LDL, uma caracteristica que também pode contribuir para a natureza inflamatória da aterosclerose. Além disso, a lyso-PC promove a proliferação de macrófagos e induz disfunção endotelial em vários leitos arteriais.

Os ácidos gordos oxidados que são libertados juntamente com a lyso-PC também são quimio-atractores de monócitos e também podem estar envolvidos noutras actividades biológicas, tais como a sinalização celular. Uma vez que ambos estes produtos da hidrólise de Lp-PLA2 são quimio-atractores potentes para monócitos circulantes, pensa-se que a Lp-PLA2 é responsável pela acumulação de células carregadas com éster de colesterol nas artérias, causando a caracteristica "estria gordurosa" associada às fases iniciais da aterosclerose.

Também se verificou que a Lp-PLA2 está enriquecida na subfracção de lipoproteínas altamente atero-génicas de LDL pequenas densas, que é susceptivel a modificação oxidativa. Além disso, os níveis das enzimas estão aumentados em doentes com hiperlipidemia, acidente vascular, diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2, bem como em 4 ΡΕ1633864 mulheres pós-menopáusicas. Como tal, os níveis plasmáticos de Lp-PLA2 tendem a ser elevados nos indivíduos que são considerados como estando em risco de desenvolver ateros-clerose acelerada e eventos cardiovasculares clínicos. Assim, seria de esperar que a inibição da enzima parasse a acumulação desta estria gordurosa (por inibição da formação de lisofosfatidilcolina), e assim que fosse útil no tratamento da aterosclerose. Além disso, a Lp-PLA2 pode ser utilizada como um biomarcador para determinar se um animal está em risco de desenvolver uma doença associada a níveis elevados de Lp-PLA2 ou actividade de Lp-PLA2 elevada.

Os inibidores de Lp-PLA2 inibem a oxidação de LDL. Os inibidores Lp-PLA2 podem portanto ter uma aplicação geral em qualquer patologia que envolva a peroxidação de lípidos em conjunto com a actividade enzimática, por exemplo além de doenças como a aterosclerose e diabetes outras patologias tais como artrite reumatóide, acidente vascular, enfarte do miocárdio (Serebruany, et al. Cardiology 90(2):127-30 (1998)); lesão de reperfusão e inflamação aguda e crónica. Além disso, a Lp-PLA2 está actualmente a ser explorada como um biomarcador de doença cardíaca coronária (Blankenberg, et al. J. Lipid Res. 2003 May 1) e arteriosclerose (Tselepis e Chaman. Atheroscler. Suppl. 3(4):57-68 (2002)). Além disso, demonstrou-se que a Lp-PLA2 desempenha um papel nas doenças seguintes: síndrome do esforço respiratório (Grissom, et al. Crit Care Med. 31(3):770-5 (2003); nefropatia por imunoglobulina A (Yoon, et al. Clin. Genet. 62(2):128-34 (2002); patência do 5 ΡΕ1633864 enxerto do desvio femoralpopliteo (Unno, et al. Surgery 132(1):66-71 (2002); inflamação oral (McManus e Pinckard.

Crit. Ver. Oral Biol. Med. 11(2):240-58 (2000)); inflamação e hiperreactividade das vias aéreas (Henderson, et al. J. Immunol. 15; 164(6):3360-7 (2000)); VIH e SIDA (Khovidhunkit, et al. Metabollsm. 48(12):1524-31 (1999)); asma (Satoh, et al. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 159(3):974-9 (1999)); artrite reumatóide juvenil (Tselepis, et al. Arthritis Rheum. 42(2):373-83 (1999)); efusões do ouvido médio humano (Tsuji, et al. ORL J. Otorhinolaryngol. Relat. Spec. 60(1):25-9 (1998)); esquizofrenia (Bell, et ai. Biochem. Biophys. Res. Commun. 29; 241(3):630-59 (1997)); desenvolvimento de enterocolite necrosante (Muguruma, et al. Adv. Exp. Med. Biol. 407:379-82 (1997)); e necrose isquémica intestinal (Pediatr. Res. 34(2):237-41 (1993)).

Referências adicionais que ilustram os antedecentes técnicos são: Palmantier, et al., Biosynthesis of PAF-Acether XIV, PAF-Acether Output in Murine Peritoneal Macrophages is regulated by the levei of acetylhydrolase, Biochemical and Biophysical Research Communication. Vol. 162, no. 1, 475-482 (1989); Stafforini, et al., Platelet-activating factor acetylhydrolase from human plasma, Methods in Enzymology, Vol. 187, 344-357 (1990); e Petrovic, et al., A simple assay for a human serum phospholipase A2 that is associated with high-density lipoproteins, Journal of Lipid Research, Vol. 42, no. 10, 1706-1713 (2001). 6 ΡΕ1633864 A actividade de Lp-PLA2 de amostras humanas foi determinada utilizando ensaios de actividade espectro-fotométrica e actividade fluorogénica (Cayman Chemical Company, AtheroGenics, Inc. e Karlan Research Products). Ver também Kosaka et al. Clin. Chem. Acta 296 (1-2):151-61 (2000) e Kosaka, et al. Clin. Chem. Acta 312 (1-2):179-83 (2001) . Contudo, estes métodos podem ser insensíveis quando o inibidor de Lp-PLA2 está presente, particularmente quando o inibidor é administrado a um animal antes de se obter uma amostra do animal. Demonstrou-se que o ensaio da presente invenção evidencia uma correlação entre a concentração do inibidor de Lp-PLA2 numa amostra e a actividade Lp-PLA2. A actividade de Lp-PLA2 medido ao longo do tempo em doentes tratados com inibidor correlaciona-se com o perfil farmacocinético do inibidor.

Foi utilizado PAD radiomarcado em ensaios de actividade de Lp-PLA2 de baixa produtividade. Tselepis, et al. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 15(10):1764-73 (1995) e Min, et al. Biochemistry, 40(15):4539-4549 (2001). Contudo, estes métodos não foram desenvolvidos como métodos de alta produtividade e portanto não são úteis para estudos em grande escala em comparação com a presente invenção. A concentração de Lp-PLA2 de amostras humanas foi determinada utilizando um ensaio ELISA utilizando métodos de alta produtividade. Verificou-se existir uma correlação forte entre os ensaios de actividade correntes disponíveis e o ensaio de massa ou ELISA. Contudo, o ensaio de massa ou 7 ΡΕ1633864 ELISA provavelmente não é sensível à detecção de inibidores de Lp-PLA2 em amostras. De modo a medir a actividade de Lp-PLA2 com ou sem inibidor num estudo em grande escala ou para rastrear uma pluralidade de amostras quando a Lp-PLA2 como um biomarcador seleccionado, é necessário um protocolo de actividade de alta produtividade. Consequentemente, é muito necessário um método para determinação da actividade de LPPLA2 de uma pluralidade de amostras.

Sumário da Invenção

Assim, um objecto da presente invenção é proporcionar um método de alta produtividade para determinação da actividade enzimática de uma fosfolipase A2 associada a lipoproteínas (Lp-PLA2) numa pluralidade de amostras compreendendo os passos de (i) preparação de uma solução compreendendo factor de activação de plaquetas (PAF) marcado; (ii) colheita de uma alíquota de cada uma da pluralidade de amostras numa placa de microtitulação ou tubo de microcentrífuga; (iii) fazer contactar cada uma de uma pluralidade de amostras de tecidos com a solução do passo de preparação; (iv) fazer contactar cada uma das soluções do 8 ΡΕ1633864 primeiro passo de contacto com uma molécula de agente sequestrante de PAF para formar um complexo de PAF-molécula sequestrante; (v) fazer contactar o referido complexo de PAF-molécula sequestrante com uma solução de precipitação compreendendo ácido tricloroacético (TCA) para formar um precipitado e um sobrenadante; (vi) remover o referido complexo de PAF-molécula sequestrante por centrifugação da referida placa de microtitulação ou tubo de microcentrifuga a pelo menos 6000 g durante pelo menos 5 minutos a menos de 10°C; e (vii) detectar uma actividade de Lp-PLA2. em que pelo menos uma amostra foi retirada de um animal a quem foi administrado um inibidor de Lp-PLA2.

Descrição Pormenorizada da Invenção

Glossário

Uma "molécula sequestrante", como aqui utilizada, é uma molécula capaz de formar um complexo com uma segunda molécula quer só quer em associação com outras moléculas ou cofactores de modo a facilitar a separação da segunda molécula de outras moléculas e/ou da solução. Por exemplo, uma molécula sequestrante pode ser uma proteína que se liga 9 ΡΕ1633864 a uma segunda molécula para a fazer precipitar da solução ou pode criar uma carga na segunda molécula tornando-a mais susceptivel de ser atraida para um eléctrodo positivo ou negativo. Exemplos de moléculas sequestradoras de PAF incluem, mas não estão limitadas a albumina de soro de bovino (doravante "BSA") e albumina de soro humano.

Um "complexo de PAF-molécula sequestrante" tal como aqui utilizado é PAF em associação com uma molécula sequestrante de modo que a molécula sequestrante contactou PAF para facilitar a separação de PAF de outras moléculas e/ou da solução. Como exemplo, o PAF pode formar um complexo com a BSA que pode ser precipitado de solução. 0 complexo de PAF-molécula sequestrante pode compreender tanto PAF não clivado como lyso-PC no complexo com a molécula sequestrante. 0 complexo de PAF-BSA é um exemplo de um complexo de PAF-molécula sequestrante. A "actividade enzimática de Lp-PLA2" tal como aqui utilizada inclui, mas não está limitada a qualquer actividade enzimática de Lp-PLA2. Esta actividade pode incluir, mas não está limitada ao substrato de ligação à enzima, libertando o produto, e/ou hidrólise de fosfo-lípidos ou outras moléculas. "Polipéptido(s)" refere-se a qualquer péptido ou proteina que compreende dois ou mais aminoácidos ligados uns aos outros por ligações peptidicas ou ligações peptidicas modificadas. "Polipéptido(s)" refere-se tanto a 10 ΡΕ1633864 cadeias curtas, geralmente referidos como péptidos, oligo-péptidos e oligómeros e a cadeias mais longas geralmente referidas como proteinas. Os polipéptidos podem conter aminoácidos diferentes dos aminoácidos codificados pelos 20 genes. "Polipéptido(s)" compreendem os modificados por processos naturais, tais como o processamento e outras modificações pós-translacionais, mas também os modificados por técnicas de modificação química. Essas modificações são bem descritas em textos básicos e em monografias mais pormenorizadas, bem como numa volumosa literatura de investigação, e são bem conhecidos pelos peritos na arte. Entender-se-á que o mesmo tipo de modificação pode estar presente no mesmo, ou em graus variáveis em vários sítios de um dado polipéptido. Além disso, um dado polipéptido pode compreender muitos tipos de modificações. As modificações podem ocorrer em qualquer lugar num polipéptido, incluindo o esqueleto do péptido, as cadeias laterais do aminoácido, e os terminais amino ou carboxilo. As modificações compreendem, por exemplo, acetilação, acilação, ribosilação de ADP, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma molécula de heme, ligação covalente de um nucleótido ou derivado de nucleótido, ligação covalente de um lípido ou derivado de um lípido, ligação covalente de fosfatidilinositol, reticulação, ciclização, a formação de ligações dissulfureto, desme-tilação, formação de ligações reticuladas covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formi-lação, gama-carboxilação, formação de uma âncora de GPI, hidroxilação, iodação, metilação, miristoílação, oxidação, 11 ΡΕ1633864 transformação proteolítica, fosforilação, prenilação, racemização, glicosilação, fixação de lípidos, sulfatação, gama-carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, hidro-xilação e ribosilação de ADP, selenoílação, sulfatação, adição mediada por ARN de transferência de aminoácidos a proteínas, tais como arginilação e ubiquitinação. Ver, por exemplo, PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993) e Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, páginas. 1-12 em POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed. , Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990) e Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N. Y. Acad. Sei. 663:48-62 (1992). Os polipéptidos pode ser ramificados ou cíclicos, com ou sem ramificação. Os polipéptidos cíclicos, ramificados e circulares ramificados podem resultar de processos naturais pós-translacionais e também podem ser produzidos por métodos inteiramente sintéticos. "Solução de precipitação", tal como aqui utilizada, é qualquer solução capaz de precipitar o complexo de PAF-molécula sequestrante da solução. Uma solução de precipitação pode compreender, mas não está limitada a ácido tricloroacético ("TCA"), polímeros não iónicos tais como dextranos ou polietileno glicóis, ou iões metálicos tais como Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Zn2+, Cd' 2+, Ca2+, Ba+2, Mg+2, Pb+2, Ag\ Hg2+ e Pb2+. A solução de precipitação pode 12 ΡΕ1633864 utilizar precipitação isoeléctrica, alterando assim o teor de sal da solução para facilitar a precipitação. A solução de precipitação pode mudar a constante dieléctrica da solução com a adição de um solvente orgânico. Solventes orgânicos que podem ser utilizados numa solução de precipitação podem incluir, mas não estão limitados a 2-metil-2,4-pentano diol (MPD), sulfóxido de dimetilo (DMSO), acetona e etanol. A solução de precipitação também pode alterar o pH da solução compreendendo o complexo de PAF-molécula sequestrante para facilitar a precipitação. "Filtração" ou "filtrar", tal como aqui utilizada, inclui mas não está limitada à remoção de qualquer substância de uma solução e pode incluir a passagem de uma solução contendo a substância a ser removida através de papel de filtro, papel Whatman, tecido de algodão, ou um coluna que remove selectivamente a referida substância da solução com base nas suas caracteristicas fisicas e/ou quimicas. A substância a ser removida pode incluir complexo de PAF-molécula sequestrante. As caracteristicas fisicas e quimicas que podem ser utilizadas para remover uma substância através de filtração podem incluir, mas não estão limitadas a carga iónica, tamanho, peso, polaridade e/ou unidades quimicas associadas à substância que tornam provável que se ligue ao material de enchimento de uma coluna. A filtração pode incluir a utilização de gravidade, vácuo e/ou centrifugação para facilitar a remoção da referida substância da solução. 13 ΡΕ1633864 "Mistura de cintilação" tal como aqui utilizado é uma mistura de solutos e solventes, tipicamente contendo um solvente orgânico capaz de solubilizar e manter uma suspensão uniforme de uma amostra para cintilações liquidas. 0 processo de cintilação liquida envolve a detecção do decaimento beta no seio de uma amostra através de captura de emissões beta. Uma mistura de cintilação é concebida para capturar a emissão beta e transformá-la numa emissão de fotões que pode ser detectada através de um tubo fotomultiplicador dentro de um contador de cintilações. Estão disponíveis comercialmente várias misturas de cintilação. Entende-se que uma modificação da composição da mistura de cintilação pode efectuar e/ou optimizar a leitura detectável da cintilação líquida dependendo da amostra. "Tecido(s)", tal como aqui utilizado, compreende soro, lisado de células, lisado de tecidos, urina, plasma sanguíneo, placa, monócitos ou macrófagos. Estes tecidos podem ser de seres humanos, mamíferos não humanos ou outros animais que exprimem Lp-PLA2, os seus homólogos ou ortólogos. 0 símbolo utilizado nas fórmulas aqui apre sentadas indica que a função matemática de multiplicação. A Lp-PLA2 é um hidrolisador conhecido de fosfolípidos. A Lp-PLA2 pode decompor fosfolípidos na posição sn-2 para criar lisofosfatidilcolina (lyso-PC) e 14 ΡΕ1633864 ácidos gordos oxidados. 0 PAF tem um grupo acilo com dois carbonos na posição sn-2; portanto, quando o PAF é hidrolisado por Lp-PLA2, o grupo acilo curto é clivado do resto da molécula como acetato solúvel em água, que é lisofosfatidilcolina (lyso-PC). 0 acetato é solúvel em água em condições em que a lyso-PC pode ser precipitada de uma solução aquosa. Por exemplo, uma molécula sequestrante tal como BSA pode associar-se ao PAF não clivado e/ou lyso-PC formando um complexo. Este complexo pode ser removido da solução deixando a molécula pequena solúvel em água, neste caso acetato, em solução. É entendido na arte que existem vários métodos para detectar a quantidade de moléculas pequenas solúveis em água que permanecem na solução após a precipitação. Por exemplo, o acetato pode ser radiomarcado antes de clivagem e detectado por cintilações líquidas. Alternativamente, a quantidade de fosfocolina separada da solução por precipitação pode ser detectada para medir a actividade de Lp-PLA2.

Uma forma de realização da presente invenção é proporcionar um método de alta produtividade para determinar a actividade da enzima fosfolipase A2 associada a lipoproteínas (Lp-PLA2) numa pluralidade de amostras compreendendo os passos de: (i) preparar uma solução compreendendo factor de activação de plaquetas (PAF) marcado; (ii) dividir em porções cada uma da pluralidade 15 ΡΕ1633864 de amostras num poço de uma placa de microtitulação ou tubo de microcentrifuga; (iii) fazer contactar cada uma de uma pluralidade de amostras de tecidos com a solução do passo de preparação; (iv) fazer contactar cada uma das soluções do primeiro passo de contacto com uma molécula de agente sequestrante de PAF para formar um complexo de PAF-molécula sequestrante; (v) fazer contactar o referido complexo de PAF- molécula sequestrante com uma solução de precipitação compreendendo ácido tricloroacético (TCA) para formar um precipitado e um sobrenadante; (vi) remover o referido complexo de PAF-molécula sequestrante por centrifugação da referida placa de microtitulação ou tubo de microcentrifuga a pelo menos 6000 g durante pelo menos 5 minutos a menos de 10°C; e (vii) detectar uma actividade de Lp-PLA2. em que pelo menos uma amostra foi retirada de um animal a quem foi administrado um inibidor de Lp-PLA2.

Num aspecto da invenção pelo menos uma amostra compreende sangue. Noutro aspecto, pelo menos uma amostra tem um volume de cerca de 5 pL. 16 ΡΕ1633864

Noutro aspecto da invenção, o PAF marcado está radiomarcado. 0 PAF marcado pode estar tritiado ou marcado com 14C. Noutro aspecto da invenção, o PAF marcado compreende mais de 20% do PAF na solução, e noutro aspecto, pode ser cerca de 0,4% a cerca de 2,0% da solução de PAF. O PAF pode ter uma concentração de pelo menos cerca de 20 μΜ em solução. Noutro aspecto da invenção, o PAF é um substrato para Lp-PLA2. Noutro aspecto, o PAF está numa solução tamponada. A solução tamponada pode compreender ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetano sulfónico (HEPES), cloreto de sódio (NaCl) e ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA).

Noutro aspecto da invenção, é proporcionado um método que compreende a mistura da solução do passo de preparação e da amostra durante pelo menos 5 segundos e incubação a cerca de 21°C durante pelo menos cerca de 1 minuto. A amostra pode ser incubada com a solução do passo de preparação durante cerca de 5 minutos.

Noutro aspecto da invenção, a molécula seques-trante de um passo de contacto é albumina de soro de bovino exógena (BSA), mas também pode ser albumina de soro humano endógena. A temperatura da BSA pode ser inferior a cerca de 10°C, e pode ser de cerca de 4°C. Noutro aspecto, a BSA está numa concentração de cerca de 50 mg/mL. Noutro aspecto, a molécula sequestrante e a amostra são incubadas a menos de 10°C durante pelo menos cerca de 1 minuto. 17 ΡΕ1633864

Noutro aspecto da presente invenção, a solução de precipitação compreende TCA. Noutro aspecto, a solução de precipitação compreendendo TCA está a menos de cerca de 10°C. Noutro aspecto, o TCA tem uma concentração de cerca de 56% volume/volume com água. Noutro aspecto, a solução do segundo passo de contacto é incubada com a solução compreendendo TCA durante pelo menos um minuto. Noutro aspecto, a centrifugação é realizada a cerca de 4°C durante cerca de 15 minutos.

Noutro aspecto da invenção, retira-se aliquotas da solução tampão para pelo menos dois recipientes para utilização como reacções de contagem total ou reacções em branco. Estes recipientes podem ser tubos de microcen-trifuga ou poços de uma placa de microtitulação. Noutro aspecto, a solução tampão é a mesma que a solução do passo de preparação em que não foi adicionado PAF à solução.

Noutro aspecto da presente invenção, o volume das aliquotas de solução tamponada para reacções de contagem total e branco da reacção são os mesmos que o volume de amostra utilizado para cada reacção da amostra. A solução do passo de preparação e a molécula sequestrante podem ser adicionadas às aliquotas de solução tamponada para utilização como reacções em branco nas mesmas condições de volume, concentração, contacto e precipitação que a amostra. Noutro aspecto da invenção, pelo menos duas aliquotas de reacção de contagem total são contactadas com cerca do mesmo volume de solução do passo de preparação e 18 ΡΕ1633864 uma solução substituta da molécula sequestrante, em que a solução substituta não contém molécula sequestrante. Uma solução tamponada ou água destilada pode ser adicionada a cada reacção de contagem total aproximadamente no mesmo volume que uma solução compreendendo molécula sequestrante, que é adicionada às amostras e/ou às reacções de branco.

Noutro aspecto da presente invenção, uma porção de cada sobrenadante da amostra, branco da reacção, e reacção contagem total são amostradas em recipientes separados. Cada aliquota de sobrenadante, branco da reacção, e reacção de contagem total pode ser contactado por uma mistura de cintilação e contada num contador de cintilações durante pelo menos cerca de 1 minuto.

Noutro aspecto da presente invenção, CPMCOntagens totais são calculadas como a contagem média liquida das reacções de contagem total utilizando a seguinte fórmula: CPMcontagens totais = (CPMcontagens totais liquidas * Vrt) / (Vsa) em que CPMCOntagens totais líquidas = contagem média liquida em aliquotas de sobrenadantes das reacções de contagem total; VRT = volume total da solução de reacção final antes da centrifugação; VSa = volume de sobrenadante das reacções de contagem total divididas em aliquotas para contagem de cintilações. 19 ΡΕ1633864

Noutro aspecto, a actividade de Lp-PLA2 em cada sobrenadante é calculada utilizando a seguinte fórmula: actividade de Lp-PLA2 (nmoles/min/mL) = S* (CPMamostra - CPMgrancos) *Vst (CPMcontagens totais *VSA*V*T) em que S = quantidade total de PAF (nmoles) na solução do passo de preparação; CPMamostra = contagem média dos sobrenadantes de cada amostra; CPMsrancos = contagem média dos sobrenadantes de brancos da reacção; VSt = volume da soma dos sobrenadantes; CPMcontagens totais = contagem média das reacções de contagem total; VSa = volume de cada sobrenadante amostrado para contagem de cintilações; V = volume total da amostra (pL) retirada no primeiro passo de contacto; e T = quantidade total de tempo (minutos) para o primeiro passo de contacto. 20 ΡΕ1633864

Noutro aspecto da invenção, uma solução tamponada é amostrada em pelo menos dois recipientes para utilização como branco da reacção. Estes recipientes podem ser tubos de microcentrifuga ou poços de uma placa de microtitulação. Noutro aspecto, a solução tamponada é a mesma que a solução do passo de preparação em que não foi adicionado PAF à solução. Noutro aspecto da presente invenção, o volume de solução tamponada amostrada para um branco da reacção é o mesmo que o volume de amostra utilizado para cada reacção da amostra. A solução do passo de preparação pode ser adicionada a alíquotas de solução tamponada para utilização como brancos de reacção nas mesmas condições de volume, concentração, contacto, e precipitação que a amostra.

Noutro aspecto da presente invenção, uma aliquota da solução do passo de preparação é contactada com pelo menos um branco de reacção para utilização como contagens adicionadas totais. O volume da aliquota da solução do passo de preparação pode estar entre cerca de 1 pL a cerca de 20 pL, ou pode ser de cerca de 10 pL. Noutro aspecto da presente invenção, cada aliquota de sobrenadante, brancos de reacções e contagens adicionadas totais é contactada por uma mistura de cintilação e contada num contador de cintilações durante pelo menos cerca de 1 minuto.

Noutro aspecto da presente invenção, CPMCOntagens adicionadas totais é calculado como a contagem média liquida com 21 ΡΕ1633864 o volume ajustado das reacções de contagem adicionadas totais utilizando a seguinte fórmula: CPM0Ontagens adicionadas totais = (CPMcontagens reforçadas totais *

Vpaf) / (Vreforçado) em que CPMCOntagens reforçadas totais = contagem média liquida de sobrenadantes de contagens adicionadas totais;

Vpaf = volume da solução do passo de preparação adicionado no primeiro passo de contacto; VReforçado = volume da solução do passo de preparação adicionado aos sobrenadantes dos brancos de reacção para utilização como contagens adicionadas totais.

Noutro aspecto da presente invenção, a actividade de Lp-PLA2 é calculada em cada sobrenadante utilizando a seguinte fórmula: actividade de Lp-PLA2 (nmoles/min/mL) = S* (CPMamostra ~ CPMBrancos) *Vst (CPMcontagens totais*Vsa*V*T) em que S = quantidade total de PAF (nmoles) na solução do passo de preparação; CPMamostra = contagem média dos sobrenadantes de cada amostra; 22 ΡΕ1633864 CPMBrancos = contagem média dos sobrenadantes de brancos das reacções; VSt = soma do volume dos sobrenadantes; CPMcontagens adicionadas totais = contagem média das contagens adicionadas totais;

Vsa = volume de cada sobrenadante amostrado para contagem de cintilações; V = volume total de amostra (pL) amostrado no primeiro passo de contacto; e T = quantidade total de tempo (min) para o primeiro passo de contacto.

Também pode ser proporcionado um kit para a determinação da actividade enzimática de fosfolipase A2 associada a lipoproteinas (Lp-PLA2) numa pluralidade de amostras de sangue que compreendem factor de activação de plaquetas (PAF), uma molécula de agente sequestrante de PAF e uma solução compreendendo TCA.

Os exemplos seguintes ilustram vários aspectos desta invenção. Estes exemplos não limitam o âmbito desta presente invenção que é definida pelas reivindicações anexas. 23 ΡΕ1633864

Exemplos

Exemplo 1. Titulação da concentração de BSA para sequestração e precipitação

Examinou-se a concentração de BSA e tempo de contacto com 3H-PAF livre. 3H-PAF numa concentração de 200 μΜ em solução tamponada foi contactado com BSA numa concentração de 1,04 mg/mL-16,67 mg/mL durante 5 minutos ou de um dia para o outro. A BSA e complexos de PAF foram precipitados com TCA a 7,78% e sedimentados com centrifugação a 6.000 g durante 15 minutos a 4°C. A percentagem de 3H-PAF livre remanescente na solução foi medida no sobrenadante com contagem de cintilações. Tal como apresentado na Tabela 1, a percentagem de PAF livre removido da solução por precipitação aumentou com concentrações crescentes de BSA e periodos de incubação prolongados.

Tabela 1. Titulação da concentração de BSA para PAF sequestrante

Percentagem (%) de 3H-PAF remanescente em solução após precipitação Tempo em contacto com 3H-PAF antes da precipitação Concentração de BSA (mg/mL) 5 minutos de um dia para o outro 0 100 100 1,04 29, 91 28, 99 2,08 12,25 10,16 4,17 2,00 1,42 8,33 1,55 1,01 16, 67 1,19 0, 95 24 ΡΕ1633864

Exemplo 2. Optimização do tempo e temperatura de precipitação com TCA 3H-PAF em solução tamponada foi sequestrado com BSA numa concentração de 16,67 mg/mL e incubado durante 5 minutos em gelo. 0 PAF foi precipitado com TCA gelado a 7,78% e incubado em gelo durante 15 minutos, ou com TCA a 7,78% a temperatura ambiente por incubação à temperatura ambiente durante 5, 10 ou 20 minutos. Tal como apresentado na Tabela 2, o TCA gelado seguido por incubação em gelo durante 15 minutos causou a menor percentagem de PAF a ser deixada em solução.

Tabela 2. Precipitação com TCA

Percentagem (%) de 3H-PAF remanescente em solução após precipitação Temperatura Tempo em contacto com TCA Gelo Temperatura ambiente (minutos) 5 Não foi feito 1,28 10 Não foi feito 1,43 15 1,09 Não foi feito 20 Não foi feito 1, 67

Exemplo 3. Centrifugação de complexos de PAF-BSA 3H-PAF em solução tamponada foi sequestrado com 25 ΡΕ1633864 BSA numa concentração de 16,6 mg/mL e incubado em gelo durante 5 minutos. 0 complexo de PAF-BSA foi precipitado com TCA gelado a 7,78% e incubado em gelo durante 15 minutos. Os complexos de PAF-BSA precipitados foram centrifugados utilizando uma força microcentrifuga de 800 g a 13000 g. Determinou-se a percentagem de 3H-PAF remanescente na solução após centrifugação. Cerca de 1,3% a cerca de 2% de complexo de PAF-BSA permaneceu em solução utilizando uma força microcentrifuga de menos de 5000 g. Quando a força microcentrifuga foi aumentado para pelo menos 6000 g só cerca de 1,1% ou menos do complexo de PAF-BSA permaneceu em solução.

Exemplo 4. Actividade de Lp-PLA2 influenciada pela temperatura da reacção ao longo do tempo

Fez-se reagir Lp-PLA2 com PAF durante 30 minutos tanto a 37°C como à temperatura ambiente (~21°C) e mediu-se a radioactividade (i.e., Desintegração Por Minuto ou DPM) dos produtos libertados do PAF por contagem de cintilações. As velocidades de reacção foram lineares ao longo de um periodo de 30 minutos independentemente das temperaturas de reacção. As reacções efectuadas a 37°C apresentaram maior actividade de Lp-PLA2 do que as realizadas à temperatura ambiente. A actividade de Lp-PLA2 aos 30 minutos era de aproximadamente 80000 DPM para a reacção a 37°C e 40000 DPM para a reacção à temperatura ambiente. 26 ΡΕ1633864

Exemplo 5. Misturas para contagem de cintilações dos produtos de reacção

Três misturas de cintilação disponiveis comercialmente foram utilizadas para medir a radioactividade de PAF numa solução tamponada. Testou-se MicroScint-20®, MicroScint-40® e Scintisafe®. As contagens por minuto (CPM) de 40 pL da solução de PAF foram maiores com MicroScint-20 que MicroScint-40. Além disso, a contagem de 80 pL dos produtos da reacção em MicroScint-40 não conseguiu duplicar a radioactividade de 40 pL dos mesmos produtos de reacção em MicroScint-20. Analogamente, o MicroScint-20 mostrou eficácia de contagem significativamente melhor do que o ScintiSafe-30%.

Exemplo 6. Linearidade da diluição do plasma para determinações da actividade de Lp-PLA2 A actividade de Lp-PLA2 foi determinada a partir de diluições de uma amostra de plasma humano numa reacção de 5 minutos com 3H-PAF à temperatura ambiente. As reacções foram terminadas com sequestração dos substratos de PAF com BSA gelado a 16,67 mg/mL. Os complexos de PAF-BSA foram precipitados com TCA gelado a 7,78% e sedimentados a 6.000 g durante 15 minutos a 4°C. Os produtos de reacção nos sobrenadantes foram determinados por contagem de cintilações utilizando mistura MicroScint-20. Utilizou-se entre 0,1 pL/reacção e 5 pL/reacção de plasma em reacções separadas. Os valores da actividade Lp-PLA2 determinados numa 27 ΡΕ1633864 amostra de plasma humano eram linearmente proporcionais às quantidades de plasma humano adicionado às reacções.

Exemplo 7. Doseamento da actividade de Lp-PLA2 para uma pluralidade de amostras utilizando uma placa de microtitulação

Preparou-se tampão de ensaio e armazenou-se à temperatura ambiente com as seguintes especificações: 100 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 150 mM e EDTA 5 mM.

Preparou-se solução de 3H-PAF para 100 reacções retirando aliquotas de 480 pL de 3H-PAF (10 μΜ =0,1 mCi/mL a 10,0 Ci/mmol) e 24,6 pL de C16-PAF (também conhecido como "l-hexadecil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfocolina") (5,0 mg/mL; PM: 524) para um tubo. As duas soluções foram misturadas e secas ao ar numa hote. Os sedimentos secos foram ressuspensos em 12,0 mL de tampão de ensaio criando uma solução de 3H-PAF de PAF a 20 pM de PAF (ou seja, 3H-PAF a 0,4 pM e Cl6-PAF frio a 19,6 pM) .

Para o ensaio da actividade Lp-PLA2, aliquotas de 5 pL de tampão de ensaio (para Contagens totais e Brancos; n = 8) ou amostras de plasma em duplicado foram aplicadas numa placa com 96 poços. Cada placa foi selada com uma fita para impedir a evaporação. As placas foram equilibradas a 21 °C.

Adicionou-se cem microlitros da solução de 3H-PAF 28 ΡΕ1633864 a cada poço, misturou-se e incubou-se a 21°C durante 5 minutos. Adicionou-se solução de BSA gelada (50 pL de BSA a 50 mg/mL em solução aquosa) a cada poço, com excepção das amostras utilizadas como Contagens totais, às quais adicionou em vez disso 50 pL de água. As soluções foram então misturadas e incubadas num frigorifico durante 5 minutos.

Adicionou-se solução de TCA gelada (25 pL de uma solução a 56% v/v) a cada poço, misturou-se e incubou-se num frigorifico durante 15 minutos. A placa foi então centrifugada a 6.000 g durante 15 minutos a 4°C. Uma aliquota de 45 pL de cada sobrenadante foi transferida para uma placa de poliestireno com 96 poços.

Adicionou-se solução de 3H-PAF (10 pL) a seis poços para servir como Contagens totais. Adicionou-se mistura de cintilações MicroScint-20 (200 pL) a cada poço e as placas foram cobertas com fita e misturadas num Vortex à velocidade máxima durante 10 minutos. A electricidade estática foi retiradas das placas limpando com um pano húmido e secando com outro limpo. Obteve-se as contagens da amostra para cada amostra utilizando um contador de cintilações TopCount durante 2 minutos cada. A actividade de Lp-PLA2 foi calculada utilizando a fórmula seguinte: 29 ΡΕ1633864

Actividade de Lp-PLA2 (nmoles/min/mL) = 32 * (CPM45pL-SUpe -CPMurancos) / (CPMRef 0rç0 de 10 PL " CPMgrancos) em que CPM45pL-supe é a contagem média de cada amostra CPMBrancos é a contagem média dos brancos CPMRef0rço de io pL é a contagem média das Contagens totais

Exemplo 8. Actividade de Lp-PLA2 em seres humanos tratados com inibidor de Lp-PLA2

Foram colhidas amostras de plasma de voluntários saudáveis na linha de base e em pontos de tempo determinados depois da administração até 144 horas depois da administração de inibidor de Lp-PLA2 ou de placebo. As amostras de plasma foram analisadas quanto à actividade de Lp-PLA2 tal como descrito no exemplo 7. Observou-se inibição significativa da actividade de Lp-PLA2 (>85%) em voluntários tratados com fármaco desde cerca de 1 hora após a administração do inibidor até cerca de 6 horas a cerca de 8 horas após a administração de inibidor. Esta inibição quantificada correlacionava-se com os dados farmacociné-ticos do inibidor. Em contraste, não se observou decréscimo significativo da actividade de Lp-PLA2 em voluntários que receberam placebo. Quando amostras de plasma foram quantificadas num ensaio espectrofotométrico, só foi detectada cerca de 30% da inibição de Lp-PLA2 das mesmas amostras de voluntários tratados com inibidor. 30 ΡΕ1633864

Exemplo 9: Validação das determinações radlomé-tricas de alta produtividade da actividade de Lp-PLA2

Os métodos desta invenção relacionados com a determinação de alta produtividade da actividade de Lp-PLA2 de alta utilizando substrato radiomarcado tal como descrito no Exemplo 7 foram validados por comparação de determinações de actividade intra-ensaios bem como por comparação com determinações da actividade feitas a partir de métodos de extracção. Os métodos desta invenção mostraram excelentes caracteristicas de desempenho com um limite de detecção ("Limit of Detection", LOD) de 0,2 nmoles/min/mL e uma gama dinâmica linear de cerca de 100 vezes (0,5-48,5 nmoles/min/mL). A estimativa do limite de quantificação ("Limit of Quantitation", LOQ) e o extremo inferior do intervalo dinâmico linear eram os mesmos.

Além disso, os valores da actividade de Lp-PLA2 determinados utilizando os métodos da invenção estão altamente correlacionados com os determinados com os procedimentos de extracção, quando comparadas com amostras de dois ensaios clinicos de Ensaio A (n = 68) e Ensaio B (n = 48). Além disso, oferece uma série de vantagens em relação a um protocolo de extracção, incluindo pequeno volume da amostra de plasma, residuos orgânicos não radioactivos e muito maior produtividade que pode ser mais aumentada com automação, se necessário. As análises de componentes de variância para o ensaio de alta produti- 31 ΡΕ1633864 vidade da actividade de Lp-PLA2 utilizando substratos radiomarcados (Exemplo 7) desta invenção mostraram que o componente de variância ("CV") estimado na placa (intra-ensaio) preencheu os critérios de validação (Estudo dos componentes de variância CV intra-ensaio é de cerca de 11,2%; <15% dos critérios). A estimativa de CV inter-

ensaios também preencheu os critérios de validação (CV inter-ensaio é de cerca de 12,9%; <20% dos critérios) . A estimativa da redução da variabilidade inter-ensaios quando o número dos poços do branco do soro e das contagens totais foi aumentada de 2 cada para 4 cada era de aproximadamente 1,5% com os poços adicionais do soro dos brancos e de contagens total. Uma análise separada da variabilidade entre filas de diferentes pontas de pipetas mostraram uma contribuição de cerca de 13% da estimativa da CV intra-ensaios.

Lisboa, 17 de Junho de 2010

Claims

ΡΕ1633864 1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de alta produtividade para determinação de uma actividade enzimática de fosfolipase A2 associada a lipoproteínas (Lp-PLA2) numa pluralidade de amostras compreendendo os passos de: (i) preparação de uma solução compreendendo factor de activação de plaquetas (PAF) marcado; (ii) dividir em porções cada uma da pluralidade de amostras num poço de uma placa de microtitulação ou tubo de microcentrifuga; (iii) fazer contactar cada uma de uma pluralidade de amostras de tecidos com a solução do passo de preparação; (iv) fazer contactar cada uma das soluções do primeiro passo de contacto com uma molécula de agente sequestrante de PAF para formar um complexo de PAF-molécula sequestrante; (v) fazer contactar o referido complexo de PAF-molécula sequestrante com uma solução de precipitação compreendendo ácido tricloroacético (TCA) para formar um precipitado e um sobrenadante; (vi) remover o referido complexo de PAF-molécula 2 ΡΕ1633864 sequestrante por centrifugação da referida placa de microtitulação ou tubo de microcentrifuga a pelo menos 6000 g durante pelo menos 5 minutos a menos de 10°C; e (vii) detectar uma actividade de Lp-PLA2. em que pelo menos uma amostra foi retirada de um animal a quem foi administrado um inibidor de Lp-PLA2.
2. Método de acordo com a reivindicação 1 em que pelo menos uma amostra é seleccionada do grupo que consiste em soro, lisado de células, lisado de tecidos, urina ou plasma sanguíneo.
3. Método de acordo com qualquer das reivin- dicações anteriores, em que o PAF marcado está radio- marcado.
4. Método de acordo com qualquer das reivin- dicações anteriores, em que a concentração total de PAF em solução do passo de preparação é de pelo menos 20 μΜ.
5. Método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a solução compreendendo PAF marcado e não marcado é uma solução tamponada.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a solução tamponada compreende HEPES, cloreto de sódio (NaCl) e ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA). 3 ΡΕ1633864
7. Método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a solução do passo de preparação e a amostra são misturadas durante pelo menos 5 segundos e incubadas a 21°C durante pelo menos 1 minuto.
8. Método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a molécula sequestrante de um passo de contacto é albumina de soro de bovino (BSA) exógena.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a BSA está a menos de 10°C.
10. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a BSA está a 4°C.
11. Método de acordo com a reivindicação 8 ou 9, em que a BSA tem uma concentração de 50 mg/mL.
12. Método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a molécula sequestrante de um passo de contacto é albumina de soro humano endógena.
13. Método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a solução de precipitação que compreende TCA está a menos de 10°C.
14. Método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a centrifugação é realizada a 4°C durante 15 minutos. 4 ΡΕ1633864
15. Método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a actividade de Lp-PLA2 é medida por contagem de cintilações.
16. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda a divisão em aliquotas de uma solução tamponada em pelo menos dois recipientes para utilização como reacções de contagens totais ou brancos de reacção.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que os recipientes são tubos de microcentrifuga ou poços de uma placa de microtitulação.
18. Método de acordo com a reivindicação 17 compreendendo ainda fazer contactar pelo menos um branco da reacção com cerca do mesmo volume e concentração de solução do passo de preparação e molécula sequestrante e fazer contactar pelo menos duas aliquotas da reacção de contagens totais com cerca do mesmo volume de solução do passo de preparação e uma solução substituta para a molécula sequestrante em que a solução substituta não contém molécula sequestrante; dividir em aliquotas uma porção de cada sobrenadante da amostra, branco da reacção e reacção de contagens totais; e fazer contactar uma mistura de cintilações com cada uma das referidas amostras. Lisboa, 17 de Junho de 2010 1 ΡΕ1633864 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Literatura que não é de patentes citada na Descrição * Tev# ei aL 18(4.:. 691-9 * TJoefker«tsl. Na&m'1 SS5,:5SS22I, » Ssrebiiárçr^ VOi. SQ Í2). 127-30 « Tseiepfe,; 2Q82, 3 $743$ : Griss®® et ai. Cr4 íp-evtóf,, voí. 31 ;3>: » YocM «tat Citi Ssísaf.., 2530¾ Vot '62·' ^ 128-34 * Un?i<5 sí aí. Ãírgaíy £0:02, voí. 132 Π: 68-7 s *' filcWsrsí.» ; Pmtkaríí ΐΓ···;ίR-s·;·'Orai S\vi-feo..2000. v->:- 11 (¾ 240-58 * H&iífterson st aí. J mmmsg, 2:308, v«, 164 i>3;. 3350-7 1:524-34; - is®, «si, 158(¾. S74-S * Tsstepsis et aLAAO??® mstim,. 1998, «oi. 4.2 j2i. 373-83 * TsHjs «t ai. im, J aterhvziamga! «eà* 1398. voí. ©3 (1í. 25-9 « B&H et ai. Sio-chem 1987, vai 241 Í3VS30-S 8 379-82 * í%aÉ#áf4.»,im v#,: 34 (2^ 237-41 Psims«Uer st ai. Εί*ε> stOesis ai PAF-AteiiíSf X;V. PAF-Aeether Osiipist iAirais Peifiíífsçai tecfo-'s íegyiaiea t>y Jhe i&vsi of áeeiyíOydreie&e aorf SwU.ysícsi fíesssfco Cofrmmi-c&kps. 1S88,voi 162(1).4754¾ Staff»»;;: at aí PísS-isi - «clivstlig f&aor scstyfpy-drsss* fís-rp tsurmri pia&sns. ^isábotís íi £ar,>*mte-gy. 19M vai 187 344-357 Psírâ¥i« at ai A siipgie ssssy fcf a senau pho&íJiiagpaEe A2 toat i s sssociaíed wftn í^i-gh -6eo sity ί^ϊρ-roiSiiii J-xtrtâ σί 8Ά<& rssssfçh. 2001, vui. 42 (181. 1708-:713 Kosaka ei ai. £3¾ Ctewe 2008, «ai, 208 {:1-2.¾ 151-61 ités»**.** ai. *#' 312 {1-¾ 178-83 Mi. IS (10), 1764-73 Mio et aL Biocheiwsm 2081,. «si 40 (1¾ 4539-4548 PRDTEÍWS - STRUCTURE AND NtOLECULAR RR0PER75ES, tffif.-H.· Frsess&misrjcl Conspaoy, 1983 Posfósmissonai Prateás MoiSScaiiísisi PerapeaiiSes SRri; Prsspeoís WoW, F. PQSTTRAMSLATiCMAL CÍ3VALE54T MCsDiRCATíON OF PROTEJAS. Acs-áefSfcPfsss. 1983 1-42 &mur ei ai. *fe». eozym».. Í988, voí. 162, €28-646 Rróan et at. pspss&mawa ^,Μ*κΜμ» M.Jp3.48-82