JP4812751B2 - Lp−PLA2活性およびLp−PLA2活性阻害を検出する方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2004年4月16日出願の米国特許仮出願第60/563078号に基づく権利を主張する。
本発明は一般に、動物から得られた組織試料中のリポタンパク質結合ホスホリパーゼA2(lipoprotein−associated phospholipase A2)(本明細書では「Lp−PLA2」)酵素活性およびその活性阻害を測定するための方法および物質に関する。
a)110μLに対して0.66μLの比率で、200mM HEPES、200mM NaCl、5mM EDTA、10mM CHAPS、10mM 1−ノナンスルホン酸ナトリウムをpH7.6で含む溶液と接触させた、90mM 1−ミリストリル−2−(4−ニトロフェニルスクシニル)ホスファチジルコリンを含む溶液
を含む溶液110μLを、
動物から得られた25μLの組織試料の少なくとも1つ;
4、3、2、1、0.4、または0.2nmol/μL p−ニトロフェノールを含むメタノール溶液をそれぞれ含むp−ニトロフェノール標準溶液25μL;および、
ブランク用のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)またはddH2O 25μL
と接触させる工程と、
b)Lp−PLA2活性を測定する工程と
を含む。
本明細書で使用される場合、「動物」には、Lp−PLA2、Lp−PLA2相同体、またはそれらのオーソログを含めた、Lp−PLA2活性を有する酵素を天然で産生できる任意のヒトもしくはヒト以外の哺乳動物または他の脊椎動物が含まれる。
a)110μLに対して0.66μLの比率で、200mM HEPES、200mM NaCl、5mM EDTA、10mM CHAPS、10mM 1−ノナンスルホン酸ナトリウムをpH7.6で含む溶液と接触させた、90mM 1−ミリストリル−2−(4−ニトロフェニルスクシニル)ホスファチジルコリンを含む溶液
を含む溶液110μLを、
動物から得られた25μLの組織試料の少なくとも1つ;
4、3、2、1、0.4、または0.2nmol/μL p−ニトロフェノールを含むメタノール溶液をそれぞれ含むp−ニトロフェノール標準溶液25μL;および、
ブランク用のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)またはddH2O 25μL
と接触させる工程と、
b)Lp−PLA2活性を測定する工程と
を含む。
a)p−ニトロフェノール標準溶液の405nmの光学濃度(OD)値を、p−ニトロフェノール(nmol/ウェル)に対してプロットすることによって検量線を作成する工程と、
b)検量線の勾配(OD/nmol)を計算する工程と、
c)組織試料を含む溶液と、ブランクを含む溶液との両方における、3分と1分との間の吸光度変化(ΔOD3min−1min)を計算する工程と、
d)式、
Lp−PLA2活性(nmol/分/mL)=(ΔODsample−ΔODblank)÷勾配(OD/nmol)÷0.025ml÷2分
を用いて、Lp−PLA2活性を計算する工程と
によって決定される。
a) 200mM HEPES、200mM NaCl、5mM EDTA、10mM CHAPS、10mM 1−ノナンスルホン酸ナトリウムをpH7.6で含む溶液を調製する工程と、
b) 90mM 1−ミリストリル−2−(4−ニトロフェニルスクシニル)ホスファチジルコリンを含む溶液を調製する工程と、
c) 100、75、50、25、10、および5nmol/μLのp−ニトロフェノールをメタノール中に含む保存液を調製する工程と、
d) 工程cの保存液40μLをメタノール960μLに希釈することによって、p−ニトロフェノール標準物質の使用液を調製する工程と、
e) 工程bの溶液と、工程aの溶液とを、0.66μL対110μLの比率で接触させて、アッセイ緩衝液を作製する工程と、
f) 120μLのアッセイ緩衝液を96ウェルV底プレートの各ウェルに添加する工程と、
g) 96ウェル平底プレートにおける2列の別々のウェルに、工程dのp−ニトロフェノールの各標準使用液25μLを添加する工程と、
h) 工程gの平底プレートにおけるp−ニトロフェノール標準物質を含有しないウェルに、動物から得られた組織試料を1ウェルあたり25μL添加する工程と、
i) ブランクとして用いるために、PBSまたはddH2O 25μLを平底プレートの空のウェルに添加する工程と、
j) V底プレート中のアッセイ緩衝液110μLを平底アッセイプレートの各ウェルと接触させる工程と、
k) この平底アッセイプレートをプレートリーダーに配置し、405nmで測定する工程と、
l) 上記標準溶液の光学濃度(OD)値を、p−ニトロフェノール(nmol/ウェル)に対してプロットすることによって検量線を作成する工程と、
m) 検量線の勾配(OD/nmol)を計算する工程と、
n) 試験試料およびブランクの両方に関して、3分と1分との間の吸光度変化(ΔOD3min−1min)を計算する工程と、
o) 式、
Lp−PLA2活性(nmol/分/mL)=(ΔODsample−ΔODblank)÷勾配(OD/nmol)÷0.025ml÷2分
を用いて、Lp−PLA2活性を計算する工程と
を含む。
(実施例)
(実施例1)
Azwell社製(大阪(日本))のAuto PAF AHアッセイキットは、米国内では、Karlan Research Products Corporation社(Santa Rosa,CA)を介して購入できる。このアッセイをOlympus Au640臨床化学分析器で評価した。それをこの実施例1で記述する。
Azwell Auto PAF−AHアッセイキット:
R1:200mM HEPES、200mM NaCl、5mM EDTA、10mM CHAPS、10mM 1−ノナンスルホン酸ナトリウム、pH7.6
R2A:20mMクエン酸一水和物、10mM 1−ノナンスルホン酸ナトリウム、pH4.5
R2B:90mM 1−ミリストリル−2−(4−ニトロフェニルスクシニル)ホスファチジルコリン
1. オリンパスAu640アナライザーに以下の表からアッセイパラメータを入力し、PAF AHアッセイプログラムを作成する。
試料容量:2μL
試薬1:240μL
試薬2:80μL
波長(主波長):410nm
波長(副波長):480nm
方法:速度
ポイント1(FST):14
ポイント1(LST):21
較正タイプ:MB
式:Y=AX+B
カウント:2
MBタイプ係数:11595
R1:Azwell Auto PAF AHアッセイキット中に供給されている通りにこの緩衝溶液を用いる。4℃で保存する。光から保護する。
R2:R2AおよびR2B(Azwell Auto PAF AHアッセイキット中に供給されている)を19:1の比率で混合することによって、R2使用液を調製する。4℃で保存する。光から保護する。
試験試料(2μL)+R1(240μL)、37℃、5分間[0〜5分]
R2(80μL)を添加、37℃、5分間[5〜10分]
410nmおよび480nmで吸収度を測定[6〜8分間]
PAF AH活性(IU/L)を計算
(実施例2)
試料中のLp−PLA2活性を測定するための高スループット放射分析を開発した。このアッセイは国際公開第2005/001416号に十全に記載されている。高スループット活性放射測定アッセイの概要をこの実施例2に提供する。
シンチレーションカウンター TopCount(登録商標)マイクロプレートシンチレーションおよびルミネッセンスカウンター、Perkin−Elmer社(旧名Packard社)、CA
遠心分離機 Allegra 25Rベンチトップ遠心分離機、Beckman Coulter社、CA
プレートシェーカー Lab−Line Titerプレートシェーカー(VWR社カタログ番号57019−600)
オーブン Barnstead/Thermolyne社、シリーズ9000、温度領域10〜250℃(VWR社カタログ番号52205−065)
12チャネルピペッター ブランドTransferpette(登録商標)−12、BrandTech Scientific社、Essex,CT
ポリプロピレンプレート Costar*ブランド96ウェルプレート、ポリプロピレン未滅菌、ふた無し、Costar3365、Corning社、Corning,NY(VWR社カタログ番号29444−104)
PicoPlateプレート 溶媒耐性96ウェル白色マイクロプレート、Perkin Elmer Life Sciences社、Boston,MA(カタログ番号6005162)
HEPES(4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸)、Sigma Chemical社、St.Louis,MO(カタログ番号H9897100)
塩化ナトリウム、Sigma Chemical社、St.Louis,MO(カタログ番号S5150;5.0M)
EDTA、Sigma Chemical社、St.Louis,MO(カタログ番号E7889;0.5M)
3H−血小板活性化因子、1−O−ヘキサデシル−[アセチル−3H(N)]、(3H−PAF)−NEN Life Science Products社、Roxbury,MA(カタログ番号NET−910、エタノール溶液として販売、通常0.1mCi/mL、250μCi)
C16−PAF、(1−ヘキサデシル−2−アセチル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン):Avanti Polar Lipids社、Alabaster,AL(カタログ番号878110;5.0mg/mL)
MicroScint−20:Perkin Elmer Biosciences社、Boston,MA(カタログ番号6013621)
無脂肪酸ウシ血清アルブミン(BSA):Sigma Chemical社、St.Louis,MO(カタログ番号A0281;1.0グラム)
トリクロロ酢酸(TCA):Sigma Chemical社、St.Louis,MO(カタログ番号T9159)
100mM Hepes、pH7.4
150mM NaCl
5mM EDTA
室温で保存する。
1. 3H−PAF使用液(反応100回分)を調製する:
a) 3H−PAF(10μM=10.0Ci/mmolで0.1mCi/mL)480μLと、[C16]PAF(5.0mg/ml;MW:524)125.3μLとをチューブに分注する。
b) 混合して、フード内で空気乾燥させる。
c) 乾燥したペレットをアッセイ緩衝液12.0mlに再懸濁し、100μM PAF(すなわち、3H−PAF 0.4μMと、無放射性[C16]PAF99.6μM)の使用液にする。
2. アッセイ緩衝液(総カウント用およびブランク用;n=8)または血漿試料5μLを96ウェルプレートに2つ組で分注する。
3. プレートを21℃で平衡化する。
4. 3H−PAF溶液100μLを各ウェルに添加し、混合して、プレートを21℃で5分間インキュベートする。
5. 氷冷BSA溶液(50mg/mL)50μLをすべてのウェルに添加し、混合して、プレートを冷蔵庫内で5分間インキュベートする。
6. 氷冷TCA溶液(56%)25μLを各ウェルに添加し、混合して、プレートを冷蔵庫内で15分間インキュベートする。
7. プレートを4℃、6000gで15分間遠心する。
8. 96ウェルポリスチレンプレートに上清45μLを分注する。
9. 6箇所の総カウントウェルに3H−PAF使用液10μLを添加する。
10. MicroScint−20シンチレーションカクテル200μLを各ウェルに添加する。
11. プレートをプレートテープでカバーし、最大スピードで10分間ボルテックス混合する。
12. 濡らしたティッシュでプレートを拭き、汚れていない別のティッシュを用いて乾燥させることによって、プレートから静電気を除く。
13. TopCountシンチレーションカウンターでそれぞれ2分間カウントを行う。
14. Lp−PLA2活性を計算する:
Lp−PLA2活性(nmol/分/mL)=160×(CPM45μL−supe−CPMBlanks)/(CPM10μL−spiking−CPMBlanks)
式中、CPM45μL−supeは各試料の平均カウントであり、
CPMBlanksはブランクの平均カウントであり、
CPM10μL−spikingは、総カウントの平均したカウントである。
(実施例3)
実施例2で記載の高スループット放射測定アッセイを用いて、3箇所の臨床試験所で、健常ヒトボランティアから得た120の血漿試料からなるパネルにおけるLp−PLA2活性をアッセイした。同じ試料パネルを、実施例1に記載のAzwell社製Auto PAF AHアッセイを使用し、Olympus Au640分析器でアッセイした。
(実施例4)
Lp−PLA2活性を測定できる低スループット放射測定アッセイを以下に示す。
シンチレーションバイアル Wheaton Omni Vials社、Millville,NJ(カタログ番号225402)
シンチレーション液 EcoLite(商標)、ICN社、Costa Mesa,CA(カタログ番号882475)
ベータ線カウンター Beckman液体シンチレーションカウンター、LS 5000TA、Beckman Instruments社、Fullerton,CA
水浴 Fisher Scientific社、Edison,NJ
微量遠心機 Jouan社、Winchester,VA、モデル番号A−14
HEPES(4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸) Sigma Chemical社、St.Louis、MO(カタログ番号H9136)
塩化ナトリウム Sigma Chemical社、St.Louis、MO(カタログ番号S7653)
クロロホルム Aldrich Chemical社、Milwaukee,WI(カタログ番号36,692−7)
メタノール Aldrich Chemical社、Milwaukee、WI(カタログ番号27,047−4)
3H−血小板活性化因子、1−O−ヘキサデシル−[アセチル−3H(N)]、(3H−PAF) NEN Life Science Products社、Roxbury,MA(カタログ番号NET−910、エタノール溶液として販売、通常0.1mCi/mL)
C16−PAF、(1−ヘキサデシル−2−アセチル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン) Avanti Polar Lipids社、Alabaster,AL(カタログ番号878110、5mg/mL CHCl3溶液として販売)。
HEPES/NaCl緩衝液:50mM HEPES、150mM NaCl、37℃、pH7.4。
3H−PAF使用液:5μCi(通常は販売会社によって供給される溶液50μL)の3H−PAF保存液を、1.4mLのガラスバイアルにピペットで移す。340μg(5mg/mL溶液68μL)のC16−PAFを添加する。換気フード内における穏やかな窒素気流の下で乾燥するまで気化させる。HEPES/NaCl緩衝液1.3mLで再構成する。これによって、アッセイチューブ約62本分として十分な使用液が調製されるであろう。
(1)HEPES/NaCl緩衝液110μL+Lp−PLA2阻害物質の適当な使用希釈液20μL+血漿試料50μLを、1.5mL微量遠心チューブに添加し、37℃で、15分間インキュベートした。
(2)3H−PAF使用液20μLを添加し、試料を37℃で30秒インキュベートした。
(3)CHCl3/CH3OH 600μLを添加して反応を終了させ、ここに記載のアッセイ手順によって処置を行った。
1. 血漿試料を融解させ、温度平衡に至るまで37℃の水浴の中に置く。
2. アッセイマスターミックス150μLを1.5mLのポリプロピレンチューブに添加し、37℃の水浴の中に置く。温度平衡させるために5分間置く。
3. 緩衝液ブランク用に血漿試料50μLまたはHEPES/NaCl緩衝液50μL(すべての試料を2検体でアッセイする)を、アッセイマスターミックスを含有する適当なチューブに添加し、短時間ボルテックスし、37℃の水浴の中で30秒間インキュベートする。
4. CHCl3/CH3OH溶液600μLを添加することによって反応を停止させ、よくボルテックスする。
5. 遠心する直前に、試料再度、短時間ボルテックスする。微量遠心機内で、最高回転数で、2分間遠心することによって、有機物質相と水相とを分離する。
6. 上側の水相250μLを収集し、新規の1.5mLポリプロピレンチューブに移す。
7. CHCl3 250μLを添加し、よくボルテックスする。
8. 微量遠心機内で、最高回転数で、1分間遠心することによって、有機物質相と水相とを分離する。
9. 上側の水相150μLを収集し7mLのシンチレーションバイアルに移す。
10. EcoLite(商標)または同等な液体シンチレーション液2mLを添加する。
11. cpm、計数効率、およびdpmを決定するように設定されているカウントプログラムを用いて、液体シンチレーション中の試料のカウントを行う。
12. 反応液中の総放射能を測定するために、アッセイマスターミックスの2検体150μLアリコートのカウントを行う。
Lp−PLA2活性の計算には、cpm値またはdpm値のいずれを用いてもよい。試料、緩衝液ブランク、および総放射能バイアルにおける計数効率が同じ場合には、cpm値を用いることができる。計数効率の相違が観測された場合には、dpm値を用いるべきである。この報告におけるすべての結果に関して、活性計算にdpm値を用いた。生データからLpPLA2活性(nmols/分/mLとして、報告される)を計算するには、式
((x−y)÷z)×40
を用い、式中、
x=血漿試料のcpm(またはdpm)×1.65(これは、各抽出における水相の全容量に関して補正する。この補正は、各抽出後に収集される水相が一部分のみなので必要である。)
y=緩衝液ブランクのcpm(またはdpm)×1.65(2検体測定の平均)である。
z=総放射能試料のcpm(またはdpm)を10で割ったものである(各反応チューブ内には10nmolのPAFが存在する)(2検体測定の平均)。
40=結果をnmol/分/mLに調整する係数である(各反応は30秒間であり、各反応で使用された血漿の容量は50μLである)。
(実施例5)
6人のヒト対象から、臨床試験中にLp−PLA2阻害物質をin vivoで薬物投与した後の様々な時点に血漿を収集した。下記に示す化学式Iを、対象#17および#18には120mg、対象#24および#25には180mg、そして、対象#21および#22には240mg投与した。対象#21および#25は別の日にプラセボを受容した。実施例4に記載の低スループット放射測定アッセイによってLp−PLA2活性を測定したところ、薬物処置を受けた6人の対象全員で>90%の阻害が観測された。しかし、実施例1に記載のAuto PAF AHアッセイによって測定した場合には、Lp−PLA2の阻害が明らかでなかった。Auto PAF AHアッセイは、in vivoでのLp−PLA2の薬物阻害に対して非感受性である。下記表1を参照のこと。
臨床試験中に第2のLp−PLA2阻害物質100mgを受容した8人の対象から得た血漿試料を評価した。この研究に使用されたLp−PLA2阻害物質、すなわち1−(N−(2−(ジメチルアミノ)エチル)−N−(4(4−トリフルオロメチルフェニル)ベンジル)−アミノカルボニルメチル)−2−(4−フルオロベンジル)チオ−5,6−トリメチレンピリミジン−4−オン酒石酸水素塩を下記に化学式IIとして示す。これは、国際公開第01/60805号に記載されている。
Azwell社(大阪(日本))製造の1−ミリストイル−2−(p−ニトロフェニルスクシニル)ホスファチジルコリン基質を用いた、手動の比色分析Lp−PLA2活性アッセイを開発した。このアッセイは、Auto PAF AHアッセイに対応する、分光光度プレートリーダーに適合したマイクロタイタープレートバージョンである。このアッセイは、基質の物理学的特性を評価するのに用いた。ここにでは、基質の特異性に関するデータを示す。
R1:200mM HEPES、200mM NaCl、5mM EDTA、10mM CHAPS、10mM 1−ノナンスルホン酸ナトリウム、pH7.6、4℃で保存する。
R2A:20mMクエン酸一水和物、10mM 1−ノナンスルホン酸ナトリウム、pH4.5、
R2B:1−ミリストリル−2−(4−ニトロフェニルスクシニル)ホスファチジルコリン、90mM
p−ニトロフェノール:Sigma−Aldrich Chemical社、St.Louis、MO(カタログ番号1048−25G)
エタノール:Sigma−Aldrich Chemical社、St.Louis、MO(カタログ番号7023)
メタノール:VWR International社、West Chester,PA(カタログ番号EM−MX0482−6)
R2:R2AおよびR2Bを10:1の比率で混合する。4℃で保存する。使用前に2週間より長い間保存しない。
p−ニトロフェノール標準物質:メタノール中に1M 4−ニトロフェノール溶液を調製する。100μL、75μL、50μL、25μL、10μL、5μLの1M溶液を1mLのメタノール中に希釈して、それぞれ、100、75、50、25、10、および5nmol/μL保存液を調製する。保存液100μLをメタノール900μLに希釈(1:10希釈)することによって、各標準物質の使用液を作製する。保存液および使用液の両方を4℃で保存する。
1. プレートリーダー(SPECTRAmax(登録商標)PLUS384 UV/VISマイクロプレート分光光度計、Molecular Devices社、Sunnyvale,CA)の温度を21℃に設定する。
2. マルチチャンネルピペッターを用いて、96ウェル平底アッセイプレート(Costar 3595、Corning社、Corning,NY)の各ウェルにR1を120μL添加する。
3. 第1列および第2列の2つ組のウェルそれぞれに、p−ニトロフェノール標準物質使用液10μLを添加する。検量線を作成するのに、7種類の標準物質濃度、すなわち0、5、10、25、50、75、100nmol/ウェルを用いる。ウェル1Hおよび2Hをブランク対照用に残しておく。
4. 血漿5μLを各ウェルに個々に添加する。各試料を2検体で用いる。ウェル1Hおよび2Hに、血漿の代わりにddH2O 5μLを添加することによって、ブランク対照を用意する。プレート内を手操作でよく混合する。
5. プレートを37℃で5分間インキュベートする。
6. プレートをプレートリーダー内、21℃で5分間冷却する。
7. プレートをプレートリーダーから取り出す。マルチチャンネルピペッターを用い、各添加の後でチップを交換し、各ウェルにR2を40μL添加する。R2添加を開始したときを記録する。
8. マルチチャンネルピペッターを用い、各添加の後でチップを交換し、各ウェルにエタノールを2μL添加する。この工程の目的は、ウェル中に生成した気泡をすべて取り除くことである。最初にR2を添加してから、工程#9でプレートを測定するまでの間の時間は4分間である。
9. 2分間隔で20分間、405nmでプレートを測定する。プレート測定の前に、2分間の自動混合が含まれる。
1. 0分および20分における7種類の標準物質の平均OD値(OD0minおよびOD20min)を、p−ニトロフェノール(nmol/ウェル)に対してプロットすることによって検量線を生成する。検量線の勾配を計算する。
2. 各ブランクウェルにおける2分と4分との間のΔOD値(OD4min−OD2min)を計算し、ブランクにおける2つのΔOD値を平均する。
3. 各試料ウェルについて、2分と4分との間のΔOD値を計算し、次いで、Lp−PLA2活性(nmol/分/mL)=(ΔODsample−ΔODblank)÷勾配(OD/nmol)÷0.005ml÷2分を計算する。
4. 2検体試料ウェルの平均活性値を計算する。
2種類のLp−PLA2阻害物質化合物、すなわち、実施例6に記載の化学式IIと、下記に示す化学式IIIとを用いることによって、Lp−PLA2に対する基質特異性をアッセイした。
Auto PAF AHアッセイでは、血漿試料が約160倍に希釈され、基質はKmより高い濃度で使用される。基質の濃度がKmより高い場合には、Lp−PLA2に結合した薬物と基質が競合し、酵素からの薬物解離を促進するようである。例えば、Auto PAF AHアッセイで使用される基質濃度は1100μMであり、これはKmより5倍以上高い(酵素源として血漿を使用し、Auto PAF AHプロトコールによってアッセイした場合、Kmは約200μMである。実施例1を参照)。アッセイ反応開始前に血漿を、Auto PAF AHアッセイにおける緩衝剤R1と共にプレインキュベーションするのも、薬物解離を促進するようである。したがって、Auto PAF AHアッセイと比較して、大きな血漿試料容量と、低い基質濃度とを用いることによって、本発明のアッセイを修正した。さらに、基質を添加する前に、血漿をR1と共にプレインキュベーションする工程を除いた。さらに、緩衝液R2Aを除去することによって、反応速度が上昇し、次にこれによって、Auto PAF AHアッセイと比較して、さらに低い基質濃度およびさらに短いアッセイインキュベーション時間の使用が可能となった。薬物の解離は、アッセイインキュベーション時間中に起こる。
R1:200mM HEPES、200mM NaCl、5mM EDTA、10mM CHAPS、10mM 1−ノナンスルホン酸ナトリウム、pH7.6、
R2B:90mM 1−ミリストリル−2−(4−ニトロフェニルスクシニル)ホスファチジルコリン
p−ニトロフェノール:Sigma−Aldrich Chemical社、St.Louis、MO(カタログ番号1048−25G)
アッセイ緩衝剤:R1およびR2Bを110μLに対して0.66μLの比率で混合する。氷上または4℃で保存する。使用の直前に調製する。
p−ニトロフェノール標準物質:1M p−ニトロフェノール溶液をメタノール中に調製する。1M p−ニトロフェノール100、75、50、25、10、および5μLをメタノール1mLに希釈し、それぞれ、100、75、50、25、10、および5nmol/μL保存液を調製する。保存液40μLをメタノール960μLに希釈(1:25希釈)することによって、各標準物質の使用液を調製する。保存液および使用液を4℃で保存する。
1. マルチチャンネルピペッターまたはロボットを用いて、アッセイ緩衝液120μLを96ウェルV底プレート(Costar 3897、Corning社、Corning,NY)の各ウェルに添加する。
2. 別の96ウェル平底プレート(Costar 9017、Corning社、Corning,NY)における第1列および第2列の2つ組のウェルに、p−ニトロフェノール標準物質使用液25μLを添加する。検量線を作成するのに、7種類の標準物質濃度、すなわち0,5,10,25,50,75,100nmol/ウェルを用いる。ブランク対照用にPBS 25μLをウェル1Hおよび2Hに添加する。
3. 線維素塊/粒子を沈殿させるために、血漿を短時間遠心する。p−ニトロフェノール標準物質を含有している、同じ平底プレートの第3〜12列に1ウェルあたり25μLの血漿を添加する。各試料を2検体で用いる。
4. マルチチャンネルピペッターまたはロボットを用いて、アッセイ緩衝液110μLをV底プレートから、血漿試料およびp−ニトロフェノール標準物質を含有している平底アッセイプレートに移す。Zymark RapidPlate(Caliper Life Sciences社、Hopkinton,MA)は、ウェルに気泡を発生させずに、この工程を行うことができる。R1の界面活性剤含有量が高いため、他の移動方法は気泡を発生させる可能性がある。気泡を除去するのに小容量のエタノールを用いることができる。
5. アッセイプレートを直ちにプレートリーダー(SPECTRAmax(登録商標)PLUS384 UV/VISマイクロプレート分光光度計、Molecular Devices社、Sunnyvale,CA)上に配置し、15秒間自動混合を行う。
6. 15秒間隔で10分間、室温、405nmでプレートを測定する。酵素反応開始(アッセイプレートへのアッセイ緩衝液の添加)から、最初の吸光度測定の完了までの時間は、1分間である。
このアッセイは室温で行うことができる。実験室内または実験室間で室温が変動する場合には、より厳密な温度調整が必要となることもある。
1. 0分および10分における7種類の標準物質の平均OD値(OD0minおよびOD10min)を、p−ニトロフェノール(nmol/ウェル)に対してプロットすることによって検量線を生成する。検量線の勾配を計算する。
2. 1分と3分との間における各ブランクウェルの値の変化(ΔOD)(OD3min−OD1min)を計算し、ブランクにおける2つのΔOD値を平均する。
3. 各試料ウェルに関して、1分と3分との間のΔOD値を計算し、次いで、Lp−PLA2活性(nmol/分/mL)=(ΔODsample−ΔODblank)÷勾配(OD/nmol)÷0.025ml÷2分を計算する。
4. 2検体試料ウェルの平均活性値を計算する。
(実施例9)
Lp−PLA2阻害物質を投与された健康ヒト対象から得た血漿試料のLp−PLA2活性を、実施例2に記載の高スループット放射測定アッセイおよび以下の小さな変更を伴った実施例8の方法を用いて測定した。使用されたウェルあたりの血漿容量は25μLであった。基質濃度は1125μMであった。また、2μLの基質溶液R2Bを40μLのR2Aに混合し、その後、95μLのR1をさらに混合して、アッセイ緩衝液を調製した。投与後の5つの時点(投与後0.5、1.0、6.0、48、および96時間)で血漿試料を収集した。表6に示す通り、各試料におけるLp−PLA2活性およびパーセント阻害を測定するのに、放射測定アッセイと比色分析アッセイとの両方を使用した。表6に示す通り、放射測定アッセイによって測定された、Lp−PLA2活性のパーセント阻害は、投与の1時間後に約94%のピーク阻害を示した。一方、薬物感受性の修正比色分析アッセイは、6時間後の時点で、活性の約64%を阻害するピーク阻害を示した。これらのデータは、Lp−PLA2阻害物質を投与された動物から得た試料におけるLp−PLA2活性の阻害を測定するのに、両方の方法が使用できることを実証するものである。投与の96時間後には、ヒトから得た血液試料は、Lp−PLA2阻害物質を本質的に含まないものとする。
新規のLp−PLA2阻害物質である化学式I(実施例5を参照)の臨床試験に採用された4人のヒト対象は、異なった用量の薬物を受容した。対象#13、#36、#24、および#41の薬剤投与量は、それぞれ、80mg、120mg、180mg、および240mgであった。血漿は、薬物投与の0、0.5、1、および3時間後に収集した。これらの血漿試料のLp−PLA2活性を、実施例4に記載の低スループット放射測定アッセイ、実施例1に記載のAuto PAF AHアッセイ、および実施例8に記載の薬物感受性修正比色分析アッセイによってアッセイした。放射測定活性アッセイは、4人の対象すべてで、投与の3時間後にLp−PLA2活性が>90%阻害されたことを示したが、Auto PAF AHアッセイは薬物阻害を示さなかった。しかし、表7に示す通り、実施例8の薬物感受性修正比色分析アッセイは85〜90%の薬物阻害を示した。
(実施例11)
化学式IのLp−PLA2阻害物質に関する臨床試験における10人の対象から血漿試料を収集した。対象#109、#114、#115、#142、および#145は化学式Iを50mg受容し、一方、対象#118、#119、#121、#123、および#124はこの化合物を120mg受容した。これらの血漿試料のLp−PLA2活性を、実施例4に記載の高スループット放射測定アッセイ、実施例1に記載のAuto PAF AHアッセイ、および実施例8に記載の薬物感受性修正比色分析アッセイによってアッセイした。一貫して、Auto PAF AHアッセイは、これらの試料におけるLp−PLA2活性の薬物阻害の測定に失敗しており、対象#123で検出された29%の阻害が最大のものであった。しかし、実施例8の薬物感受性修正比色分析アッセイは、すべての対象で放射測定アッセイに匹敵する薬物阻害を示した。表9に示す通り、放射測定アッセイおよび薬物感受性修正比色分析アッセイでの阻害値は、4つの時点(#114/12hr、#115/12hr、#142/0.5hr、および#142/12hr)を除いたすべて15%以内の一致を示した。
(実施例12)
定量における測定器下限
0.67μLのR2Bを含有する110μLのR1に25μLのPBSを添加した。16の複製を調製し、マイクロタイタープレート全体からランダムに選ばれたウェル内に入れた。405nmの吸光度を測定し、複製間の標準偏差を計算した。標準偏差(6xSD)の6倍を、このマイクロタイタプレートリーダー(SPECTRAmax(登録商標)PLUS384 UV/VISマイクロプレート分光光度計、Molecular Devices社、Sunnyvale,CA)の定量の下限と定義した。1の複製から得られたODの平均測定値は0.0437であり、標準偏差は0.0009であった。このマイクロタイタプレートリーダーの定量の下限は、アッセイインキュベーション中における、OD単位6x0.0009すなわち0.0054の変化と定義された。
p−ニトロフェノールの系列希釈をメタノール中に調製した。各濃度について、25μLのp−ニトロフェノールを、マイクロタイタープレート中のR1(R2Bを含まない)110μLに添加した。405nmにおける吸光度は、0.05から125nmolまでのp−ニトロフェノールで線形であった(r=0.996)。しかし、0.05nmol p−ニトロフェノール試料のブランク補正した吸光度は0.00415しかなかった。これは、上記に定義したマイクロタイタプレートリーダーの定量の下限である0.0054 ODより低い。したがって、p−ニトロフェノールの線形検出範囲は、p−ニトロフェノールの1ウェルあたり0.1から125nmolまでの間に設定される。
自家生成した組換型ヒトLp−PLA2タンパク質(hrLp−PLA2)と、ヒト血漿から自家精製したLp−PLA2タンパク質との両方を用いることによって、アッセイダイナミックレンジを定義した。
室温で120分間以上15分間毎に吸光度変化をモニターすることによって、修正アッセイ緩衝剤(110μL R1+0.67μL R2B+25μL PBS)中での基質の安定性を検査した。ゆるやかな基質分解を反映して、吸光度は、ゆっくりではあるが一貫して2時間超の間増大するが、吸収度の変化は、15分間あたりOD単位0.002にすぎなかった。したがって、基質分解は、修正されたアッセイ条件下では、2時間を超える時間、穏やかなようである。アッセイは、完了するのに10分間しかかからず、活性は、2分間の反応時間に基づいて計算されるので、基質分解による吸光度変化は微々たるものであり、ブランク補正することが可能である。
(実施例14)
Auto PAF AHアッセイでは、血漿を緩衝剤R1と共に37℃で5分間プレインキュベートする。このプレインキュベーション工程は、Lp−PLA2に結合した薬物の解離を反応開始前に加速している可能性がある。解離の加速が起こるかどうか試験するため、ヒト対象(#10)から得た血漿試料を、様々な量のLp−PLA2阻害物質と共に37℃で1時間インキュベートした。化学式IIの薬物でin vitroで処置された血漿25μLを、その後、100μLのR1と共に、室温で様々な時間プレインキュベートし、その後、40μLのR2を添加して(最終基質濃度1100μM)、室温でアッセイを10分間行った。血漿をR1と共にプレインキュベーションすることによって、薬物阻害が低減し、これは、特に薬物濃度が低いときに顕著であった。表12に示す通り、最高レベルの薬物阻害は、R1とR2とが予め混合され、プレインキュベーションせずに直接血漿に添加された場合に得られた。室温の代わりに37℃で、R1中で血漿をプレインキュベーションすると、薬物阻害がさらに悪化する。
Auto PAF AFアッセイでは、基質濃度が1100μMであるが、これはKmより5倍以上高い(酵素源として血漿を使用し、Auto PAF AHプロトコールによってアッセイした場合、Km=200μMである)。基質濃度が高いと、Lp−PLA2への薬物結合と競合する可能性がある。この可能性を試験するため、Lp−PLA2の阻害物質である化学式IIでin vitroで処置されたヒト血漿試料25μLを、予め混合されていて、様々な量の基質を含有しているR1(100μL)およびR2(40μL)に添加した。直ちに、基質加水分解を、室温で10分間モニターした。基質濃度が低い程、より大きな薬物阻害を示す。基質を154μM以下で用いた場合には、加水分解速度が遅いことによって、薬物濃度が高くなるのに連れて、活性値が定量の下限に近づいた。したがって、薬物阻害レベルを維持しながら、迅速な基質加水分解を誘導するためには、表13に示す通り、基質濃度はKmより若干上に維持するべきである。
Auto PAF AFアッセイでは、血漿2μLが320μLの反応でアッセイされ、これは、160倍の血漿希釈係数に相当する。血漿希釈率が高いと、Lp−PLA2からの薬物解離を促進する可能性がある。したがって、Lp−PLA2阻害物質である化学式IIでin vitroで処置された血漿試料5から50μLを、様々な容量のR1と、40μLのR2とで希釈し、最終容量が165μLとなり、1100μMの基質を含有するように調製した直ちに、加水分解を室温で10分間モニターした。表14に示す通り、血漿試料容量が大きいほど、大きな薬物阻害が観測された。
Auto PAF AFアッセイでは、基質保存液R2Bを緩衝液R2A(20mM クエン酸一水和物、10mM 1−ノナンスルホン酸ナトリウム、pH4.5)に予め混合する。緩衝液R2Aは、基質安定化剤として作用する。基質は、R2A中に希釈された後、4℃で14日間安定に維持される。R2Aをアッセイから除いた際に、より速い加水分解速度が観測された。例えば、180nmolの基質(R2B 2μL)と、25μLまたは50μLいずれかの血漿とを用いて、比色分析アッセイを行った。さらに、試料は、0μLまたは40μLいずれかのR2Aを含有していた。R1ですべての反応液を125μlまたは165μLのいずれかに希釈した。緩衝剤成分を予め混合し、ヒト血漿を添加して、反応を開始させた。直ちに、基質加水分解を室温で10分間モニターした。Vmax(ミリOD/分)を計算し、異なった条件相互で比較した。表15に示す通り、血漿容量に関わりなく、R2Aを除いた際に、より高い加水分解速度が観測された。
(実施例18)
元のAuto PAF AFアッセイの薬物無感受性に寄与する個々の因子を同定した後に、個々の因子の相互作用を調査する実験を設計するため、そして、適切なダイナミックレンジで薬物阻害を検出するための最適な組合せを特定するために、JMPソフトウェア(実験計画、本明細書では「DOE」)を用いた。
第1のDOE実験では、緩衝液R1容量(2レベル)、血漿容量(4レベル)、基質濃度(8レベル)、および薬物処置(2レベル)を含めた4つの因子に注目した。[示されている基質濃度のレベルは、別段の支持がない限り、各反応に添加される、予め混合されたR2B/R1のアリコートにおける基質濃度を指す。]変数の完全な要因の組合せでは、128のアッセイ反応が必要となるであろうが、D−最適計画は48の異なった組合せを示唆した。予め化学式IIとin vitro、37℃で1時間インキュベートした後、あるいはインキュベートせずに、単一血漿試料を用いて、これらの48の反応を2検体で行った。基質をR1中に直接希釈し、その後、血漿を添加して、室温で加水分解を開始させた。Vmaxおよび薬物阻害は、室温、405nmにおける5分間にわたる吸光度の測定値に基づいて計算した。
第2のDOE実験では、その前のDOE実験によって同定された条件に注目した。この実験では、R1容量(1レベル)、血漿容量(2レベル)、基質濃度(4レベル)、および薬物処置(4レベル)を含めたすべての変数の完全な要因の組合せを設計した。32条件を2検体でアッセイした。アッセイプロトコールは第1のDOE実験と同一であった。[示されている基質濃度のレベルは、今度も、別段の支持がない限り、各反応に添加される、予め混合されたR2B/R1のアリコートにおける基質濃度を指す。]Prediction Profilerは、血漿25μLと、545μMの基質を含有するR1 110μLとによって、薬物処置されていない血漿で76ミリOD/分のVmaxが生じ、900ng/mLの薬物でin vitroで処置された血漿では95%近くの薬物阻害を示すであろうと予測した。したがって、薬物感受性の修正アッセイでは、血漿25μLと、545μMの基質を含有するR1 110μLとを用い、このアッセイでの最終基質濃度は440μMとなる。
(実施例19)
Lp−PLA2阻害薬でin vivoで処置された単一の対象から得た4時点のヒト血漿試料のLp−PLA2活性を、基質440μMおよび血漿25μLを含有する、薬物感受性の修正比色分析アッセイ(実施例8に記載)によってアッセイした。同じ4つの血漿試料は、同じアッセイプロトコールではあるが、血漿50μLと基質154μMを用いたアッセイプロトコールによってもアッセイした(表17参照)。各反応について、最初の5分間の加水分解をモニターし、反応開始から1分、2分、3分、4分、または5分の時間間隔に基づいて、5つのVmax値を計算した。高度のLp−PLA2阻害(投与後1および3時間)に対応する試料は、血漿25μLおよび基質440μMを用いた場合、さらに長いアッセイ反応時間にわたって、さらに高いVmax値を示した。これは、薬物と基質との間の競合が比較的強いそのような条件下では薬物解離が起こりうることを示している。対照的に、さらに多くの血漿と、さらに少ない基質とを用いた場合(例えば、50μL血漿/154μM基質)には、投与後1および3時間の時点におけるVmax値がアッセイ反応時間に依存しない。しかし、薬物阻害がより低い試料(0および0.5時間)では、アッセイ反応時間が長い程、Vmax値が低下する傾向があり、特に、血漿容量が大きく、基質濃度が低い場合には、かなりの総基質量が高レベルのLp−PLA2活性によって消費されるので、その傾向が強い。したがって、アッセイ性能は、3つの属性に影響を与える少なくとも3つの因子によって影響を受ける。すなわち、
(1)血漿容量が大きく、インキュベーション時間が短く、かつ基質濃度が低いと、高レベルの薬物阻害の測定が促進され、
(2)血漿容量が小さく、インキュベーション時間が短く、かつ基質濃度が高いと、定量の上限の上昇が促進され、
(3)血漿量容量が大きく、インキュベーション時間が長く、かつ基質濃度が高いと、定量の下限の高感度化が促進される。
アッセイ間検証
10人の健康な(絶食していない)ヒト対象から得た血漿試料を用いてアッセイ内可変性を評価した。各対象から得た血漿の6つの複製を同じアッセイプレートでアッセイした。表18に示す通り、個々の対象のCVは2.57から9.14%の範囲に及び、平均のアッセイ内CVは5.36%であった。
10人の健康な(絶食していない)ヒト対象から得た血漿試料を用いてアッセイ間可変性を評価した。これらの血漿試料は、異なった日に行われた3つの別々のアッセイでアッセイした。個々の血漿試料のアッセイ間CVは、1.90から23.78%の範囲にわたり、平均のアッセイ間CVは7.59%であった。表19に示す通り、対象#5181480(アッセイ間CV=23.78%)から得た血漿は、短時間の遠心後に、白色/混濁の外観を表した。これは、試料中の高い脂質含量を示す。
10人の健康対象から得た血漿試料を用いて、操作者間可変性を評価した。これらの血漿試料は、異なった日に3人の異なった操作者によってアッセイされた。表20に示す通り、個々の血漿試料の操作者間CVは5.11から14.91%の範囲にわたり、平均の操作者間CVは8.32%であった。
血漿試料は通常、凍結され、その状態で保存される。反復して分析される場合、通常、試料は凍結/融解サイクルに曝される。10の血漿試料を4回の凍結/融解サイクルそれぞれの後に分析した。表20に示す通り、Lp−PLA2値における決定的な傾向は観察されなかった。これは、試料を4回凍結融解してもよいことを示す。
基質440μMおよび血漿試料容量25μLは、それらが、適当なアッセイダイナミックレンジを維持しながら、高い検出可能なin vivo薬物阻害を示すので、現行の修正アッセイプロトコールに使用するのに選択した。しかし、基質濃度をさらに低減し、かつ/あるいはアッセイにおける血漿試料容量を増大させることによって、アッセイダイナミックレンジを犠牲にして、さらに高い測定可能なin vivo薬物阻害を検出することができた。臨床試験で化学式IIを9日間受容した5人のヒト対象から得た血漿試料を、10日目の異なった時点に収集した。試験0日目における各対象の投与前血漿試料も利用可能であった。このアッセイで、基質440μMと血漿25μLとを用いた場合、表22に示す通り、最大68%の薬物阻阻害が、4時間目の時点に対象N030で観測された。血漿容量25μLに維持しながら、基質濃度を112μMに低下させたところ、薬物阻害が76%に増大した。さらに、基質濃度を112μMに低下させ、かつ、血漿容量を45μLに増加させることによって、4時間目の時点における薬物阻害を79%まで増大させることが実現した。
血清中のLp−PLA2活性、および、特にその薬物阻害を測定する修正比色分析アッセイの有用性を評価するために10人の正常なドナーから収集した血清試料をアッセイした。表26で示す、これらの血清試料で測定されたLp−PLA2活性は、130から190nmol/分/mLまでの間にわたった。各試料の2検体の%CVは、ほとんどの場合5%未満であった。分析に利用可能な、一致した血漿試料は得られなかった。しかし、実施例10および11に記載した14人の対象から得た投与前血漿試料は、80〜200nmol/分/mLの範囲のLp−PLA2活性を示しており、これに匹敵するものである。
Claims (17)
- 少なくとも1つの試料における、Lp−PLA2酵素活性の阻害を測定する方法であって:
a)比色分析または蛍光定量用検出可能部分を含む、Lp−PLA2の基質を含む溶液を調製する工程と;
b)前記少なくとも1つの試料を調製工程の溶液と接触させる工程と;
c)分光光度法によりLp−PLA2活性を検出する工程と;
d)Lp−PLA2阻害物質を含まない、動物から得られた少なくとも1つの第2の試料におけるLp−PLA2活性と比較する工程を含み、
該試料がLp−PLA2阻害物質をインビボ投与された動物からのものであり、基質が、濃度440μMまたは112μMである1−ミリストリル−2−(4−ニトロフェニルスクシニル)ホスファチジルコリンである方法。 - 1−ミリストリル−2−(4−ニトロフェニルスクシニル)ホスファチジルコリンの濃度が440μMである、請求項1に記載の方法。
- 1−ミリストリル−2−(4−ニトロフェニルスクシニル)ホスファチジルコリンの濃度が112μMである、請求項1に記載の方法。
- Lp−PLA2阻害物質の投与後の複数の時点で動物から得られたものである複数の試料におけるLp−PLA2活性の阻害を測定する、請求項1に記載の方法。
- 試料が血漿である、請求項1に記載の方法。
- 試料が血清である、請求項1に記載の方法。
- 血漿が、前記調製工程の溶液で3倍から9倍に希釈されている、請求項1に記載の方法。
- 試料の光学濃度を測定することによって前記Lp−PLA2活性が測定される、請求項1に記載の方法。
- Lp−PLA2の基質を含む溶液が緩衝剤をさらに含み、前記緩衝剤が、前記基質を前記試料と接触させる前に前記基質と共にインキュベートされる、請求項1に記載の方法。
- 前記緩衝剤がクエン酸一水和物を含まない、請求項9に記載の方法。
- 血漿試料の容量が、調製工程の溶液容量125μLから170μL中15μLから50μLである、請求項1に記載の方法。
- 試料を調製工程の溶液と接触させる前に、反応のpHが7.6に維持される、請求項1に記載の方法。
- 試料取得前にLp−PLA2阻害剤が投与された動物から得られた試料中のLp−PLA2酵素活性の阻害を測定する方法であって、
a)110μLに対して0.66μLの比率で、200mM HEPES、200mM NaCl、5mM EDTA、10mM CHAPS、10mM 1−ノナンスルホン酸ナトリウムをpH7.6で含む溶液と接触させた、90mM 1−ミリストリル−2−(4−ニトロフェニルスクシニル)ホスファチジルコリンを含む溶液
を含む溶液110μLを、
動物からの25μLの組織試料の少なくとも1つ;
4、3、2、1、0.4、または0.2nmol/μL p−ニトロフェノールを含むメタノール溶液をそれぞれ含むp−ニトロフェノール標準溶液25μL;および、
ブランク用のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)またはddH2O 25μL
と接触させる工程と、
b)分光光度法により試料のLp−PLA2活性を測定する工程と
c)該試料と、Lp−PLA2阻害物質を含まない試料のLp−PLA2活性とを比較することによりLp−PLA2酵素活性の阻害を測定する工程
を含む方法。 - 動物から得られた試料が血漿である、請求項13に記載の方法。
- 動物から得られた試料が血清である、請求項13に記載の方法。
- 前記動物がヒトである、請求項13に記載の方法。
- d)p−ニトロフェノール標準溶液の405nmの光学濃度(OD)値を、p−ニトロフェノール(nmol/ウェル)に対してプロットすることによって検量線を作成する工程と、
e)検量線の勾配(OD/nmol)を計算する工程と、
f)組織試料を含む溶液と、ブランクを含む溶液との両方における、3分と1分との間の吸光度変化(ΔOD3min−1min)を計算する工程と、
g)次式:
Lp−PLA2活性(nmol/分/mL)=(ΔODsample−ΔODblank)÷勾配(OD/nmol)÷0.025ml÷2分
を用いて、Lp−PLA2活性を計算する工程と
をさらに含む、請求項13に記載の方法。
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