ES2334772T3 - Proteinas de fusion de taci-immunoglobulina. - Google Patents

Proteinas de fusion de taci-immunoglobulina. Download PDF

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Abstract

Utilización de una proteína de fusión de activador transmembrana e interaccionador con el modulador del calcio y el ligando de la ciclofilina (TACI)-inmunoglobulina para la fabricación de un medicamento para inhibir la proliferación de células tumorales, en el que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina comprende: (a) un resto de receptor TACI que consta de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre: (i) los residuos de aminoácido 34 a 104 de SEC ID N.º 2; (ii) los residuos de aminoácido 30 a 110 de SEC ID N.º 2; y (iii) los residuos de aminoácido 30 a 154 de SEC ID N.º 2; en la que el resto de receptor TACI se une con al menos uno entre ZTNF2 o ZTNF4; y (b) un resto de inmunoglobulina que comprende una región constante de una inmunoglobulina.

Description

Proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina.
Campo de la técnica
La presente invención se refiere, en general, a proteínas de fusión mejoradas que comprenden un resto de receptor de factor de necrosis tumoral y un resto de inmunoglobulina. En concreto, la presente invención se refiere a proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina mejoradas.
Antecedentes de la invención
Las citocinas son proteínas pequeñas solubles que median en una variedad de efectos biológicos, incluyendo la regulación del crecimiento y de la diferenciación de muchos tipos de células (véase, por ejemplo, Arai et al., Annu. Rev. Biochem. 59:783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paul y Seder, Cell 76:241 (1994)). Las proteínas que constituyen el grupo de las citocinas incluyen interleucinas, interferones, factores de estimulación de colonias, factores de necrosis tumoral y otras moléculas reguladoras. Por ejemplo, la interleucina-17 humana es una citocina que estimula la expresión de la interleucina-6, la molécula de adhesión intracelular 1, la interleucina-8, el factor de estimulación de colonias de macrófagos de granulocitos y la expresión de la prostaglandina E2, y desempeña un papel en la maduración preferencial de los precursores hematopoyéticos CD34+ en neutrófilos (Yao et al., J. Immunol. 155:5483 (1995); Fossiez et al., J. Exp. Med. 183:2593 (1996)).
Los receptores que se unen a las citocinas están compuestos comúnmente por una o más proteínas integrales de membrana que se unen a la citocina con una afinidad elevada y transducen esta unión con la célula a través de partes citoplasmáticas del ciertas subunidades de los receptores. Los receptores de citocinas han sido agrupados en varias clases en base a las semejanzas entre sus dominios de unión con ligandos extracelulares. Por ejemplo, las cadenas de los receptores responsables de la unión y/o la transducción del efecto de los interferones son miembros de la familia de receptores de citocinas de tipo II, en base a un dominio extracelular característico de 200 residuos.
Las interacciones celulares que tienen lugar durante una respuesta inmune están reguladas por miembros de varias familias de receptores de la superficie celular, incluyendo la familia de los receptores de los factores de necrosis tumoral (TNFR, Tumor Necrosis Factor Receptors). La familia de los TNFR consta de un número de receptores glicoproteínicos integrales de membrana, muchos de los cuales, en combinación con sus respectivos ligandos, regulan las interacciones entre los diferentes linajes celulares hematopoyéticos (véase, por ejemplo, Cosman, Stem Cells 12:440 (1994); Wajant et al., Cytokine Growth Factor Rev. 10: 15 (1999); Yeh et al., Immunol. Rev. 169:283 (1999); Idriss y Naismith, Microsc. Res. Tech. 50:184 (2000)).
Uno de tales receptores es el TACI (transmembrane activator and CAML-interactor), activador transmembrana e interaccionador con el CAML (von Bülow y Bram, Science 228:138 (1997); Bram y von Bülow, patente estadounidense n.º 5.969.102 (1999)). El TACI es un receptor unido a la membrana que tiene un dominio extracelular que contiene dos pseudo-repeticiones ricas en cisteína, un dominio transmembranal y un dominio citoplasmático que interacciona con el CAML (CAlcium-Modulator and cyclophilin Ligand), modulador del calcio y ligando de la ciclofilina), una proteína integral de membrana ubicada en las vesículas intracelulares que es co-inductora de la activación de los NF-AT (Nuclear Factor of Activated T cells, factores nucleares de células T activadas) cuando se sobreexpresa en células Jurkat. El TACI se asocia con células B y un subconjunto de células T. Las secuencias de nucleótidos que codifican el TACI y su correspondiente secuencia de aminoácidos se proporcionan en la presente memoria como las SEC ID N.º 1 y 2, respectivamente.
El receptor TACI se une con dos miembros de la familia de ligandos de los factores de necrosis tumoral (TNF, Tumor Necrosis Factor). Un ligando se nombra de forma muy diversa ZTNF4, "BAFF", "neutrocina-\alpha", "BLyS", "TALL-1" y "THANK" (Yu et al., Publicación internacional n.º WO98/18921 (1998), Moore et al., Science 285:269 (1999); Mukhopadhyay et al., J Biol. Chem. 274:15978 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med. 189:1747 (1999); Shu et al., J Leukoc. Biol. 65:680 (1999)). La secuencia de aminoácidos de ZTNF4 se proporciona como SEC ID N.º 3. El otro ligando ha sido nombrado "ZTNF2", "APRIL" y "ligando inductor de la apoptosis de los TNFR 1" (Hahne et al., J Exp. Med. 188:1185 (1998); Kelly et al., Cancer Res. 60:1021 (2000)). La secuencia de aminoácidos de ZTNF2 se proporciona como SEC ID N.º 4. Ambos ligandos también son unidos por el receptor de maduración de células B (BCMA, B-Cell MAturation receptor) (Gross et al., Nature 404:995 (2000)). Las secuencia de nucleótidos y la de aminoácidos del BCMA se proporcionan como la SEC ID N.º 26 y la SEC ID N.º 27, respectivamente.
Las actividades demostradas in vivo de los receptores de los factores de necrosis tumoral ilustran el potencial clínico de las formas solubles del receptor. Las formas solubles del receptor TACI han sido generadas como proteínas de fusión de inmunoglobulina. Las versiones iniciales dieron como resultado una proteína heterogénea de baja expresión. La heterogeneidad se observó en el terminal amino de TACI, en el terminal carboxilo del Fc, y en la región del tallo del TACI. Existe, por tanto, la necesidad de composiciones de receptor TACI farmacéuticamente útiles.
El documento WO 00/40716 describe polipéptidos secretados solubles y sus usos para detectar ligandos, agonistas y antagonistas, así como procedimientos que modulan la activación de las células B.
El documento WO 01/81417 describe el TACI como un agente anti-humano.
La presente invención proporciona el uso de una proteína de fusión de activador transmembrana e interaccionador con el modulador del calcio y el ligando de la ciclofilina-inmunoglobulina para la fabricación de un medicamento para inhibir la proliferación de células tumorales, en el que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina comprende: (a) un resto de receptor TACI que consta de un fragmento de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácido 30 a 154 de la SEC ID N.º 2, en la que el resto de receptor TACI consta de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre (i) los residuos de aminoácido 34 a 104 de la SEC ID N.º 2, (ii) los residuos de aminoácido 30 a 110 de la SEC ID N.º 2; y (iii) los residuos de aminoácido 30 a 154 de la SEC ID N.º 2; y en la que el resto de receptor TACI se une al menos con uno entre ZTNF2 o ZTNF4, y (b) un resto de inmunoglobulina que comprende una región constante de una inmunoglobulina.
Por tanto, la presente invención también proporciona una proteína de fusión que comprende: (a) un resto de receptor activador transmembrana e interaccionador con el modulador del calcio y el ligando de la ciclofilina (TACI), en la que el resto de receptor TACI consta de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre: (i) los residuos de aminoácido 34 a 104 de la SEC ID N.º 2, (ii) los residuos de aminoácido 30 a 110 de la SEC ID N.º 2 y (iii) los residuos de aminoácido 30 a 154 de la SEC ID N.º 2; en la que el resto de receptor TACI se une al menos con uno entre ZTNF2 o ZTNF4, y (b) un resto de inmunoglobulina que comprende una región constante de una inmunoglobulina.
La presente invención proporciona mejores proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina adecuadas como compuestos terapéuticos.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos del TACI humano. Las ubicaciones de las pseudo-repeticiones ricas en cisteína se indican en sombreado, el dominio transmembrana está encuadrado y la región del tallo se indica con una línea discontinua.
La Figura 2 es un diagrama esquemático de una inmunoglobulina de la subclase de IgGl. C_{L}: región constante de las cadenas ligeras; C_{H1}, C_{H2}, C_{H3}: regiones constantes de las cadenas pesadas; V_{L}: región variable de las cadenas ligeras; V_{H}: región variable de las cadenas pesadas; CHO: hidrato de carbono; N: terminal amino; C: terminal carboxilo.
Las figuras 3A, 3B, 3C y 3D muestran una comparación de la secuencia de aminoácidos del Fc de la región constante \gamma1 humana de tipo natural con las variantes Fc-488, Fc4, Fc5, Fc6, Fc7 y Fc8. El dominio C_{H1} de la región constante \gamma1 humana no forma parte del Fc y, por tanto, no se muestra. Se indica la ubicación de la región bisagra, y de los dominios C_{H2} y C_{H3}. Se indican los residuos de Cys que normalmente están implicados en la unión mediante enlaces de tipo disulfuro con la región constante de cadena ligera (LC) y la región constante de cadena pesada (HC). Un símbolo "." indica la identidad con el tipo natural en esa posición, mientras que "***" indica la ubicación del terminal carboxilo e ilustra la diferencia en el terminal carboxilo de Fc6 en comparación con las otras versiones de Fc. Las ubicaciones de los aminoácidos se indican con las posiciones de los índices EU.
La figura 4 muestra la unión específica de ^{125}I-ZTNF4 con diversos constructos de TACI-Fc. Las proteínas de fusión de TACI-Fc tenían restos de TACI que carecían de los primeros 29 residuos de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 2. Una de las proteínas de fusión tenía un resto de TACI con una región del tallo intacta (TACI (d1-29)-Fc5), mientras que tres de las proteínas de fusión de TACI-Fc tenían restos de TACI con diversas eliminaciones en la región del tallo (TACI (d1-29, d107-154)-Fc5; TACI (d1-29, d111-154)-Fc5; TACI (d1-29, d120-154)-Fc5). En la tabla 4, se describen los datos experimentales.
Descripción detallada de la invención 1. Perspectiva general
Según lo descrito más adelante, la presente invención proporciona proteínas de fusión de activador transmembrana e interaccionador con el modulador del calcio y el ligando de la ciclofilina (TACI)-inmunoglobulina según lo definido en las reivindicaciones, y los usos de las mismas según lo definido en las reivindicaciones. Por ejemplo, la presente invención proporciona usos para inhibir la proliferación de células tumorales que comprenden el uso de una composición que comprende una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina según lo definido en las reivindicaciones. Tal composición se puede administrar a células cultivadas in vitro. La composición puede ser una composición farmacéutica que comprenda un vehículo farmacéuticamente aceptable y una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina, y la composición farmacéutica puede ser para administrarla a un sujeto que tenga un tumor. El sujeto puede ser un sujeto mamífero. La administración de la composición farmacéutica puede inhibir, por ejemplo, la proliferación de linfocitos B en un sujeto mamífero.
La presente memoria describe usos para inhibir la actividad de ZTNF4 en un mamífero, que comprenden administrar al mamífero una composición que comprende una TACI-inmunoglobulina. La actividad de ZTNP4 puede estar asociada con diversas enfermedades y trastornos. Por ejemplo, se puede usar una composición farmacéutica que comprenda una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina para tratar una enfermedad autoinmune, tal como lupus eritematoso sistémico, miastenia grave, esclerosis múltiple, diabetes mellitus dependiente de la insulina, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil de curso poliarticular y artritis psoriática. Alternativamente, se puede usar una composición farmacéutica que comprenda una TACI-inmunoglobulina para tratar un trastorno tal como asma, bronquitis, enfisema y insuficiencia renal en estadio final. También es posible usar una composición farmacéutica que comprenda una TACI-inmunoglobulina para tratar la enfermedad renal, tal como glomerulonefritis, vasculitis, nefritis, amiloidosis y pielonefritis, o un trastorno tal como neoplasma, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple, linfoma de no Hodgkin, enfermedad linfoproliferativa posterior a un transplante y gammopatía de cadena ligera. En ciertos casos, la actividad de ZTNF4 puede estar asociada con las células T. También se puede usar una composición farmacéutica que comprenda una TACI-inmunoglobulina para tratar una enfermedad o un trastorno asociado con la inmunosupresión, el rechazo de injertos, la enfermedad del injerto frente al huésped y la inflamación. Por ejemplo, se puede usar una composición farmacéutica que comprenda una TACI-inmunoglobulina para disminuir la inflamación y tratar trastornos tales como el dolor de articulaciones, la hinchazón, la anemia y el choque séptico.
La presente memoria describe usos para reducir los niveles de circulación en sangre de ZTNF4 en un sujeto mamífero que comprenden administrar al sujeto mamífero una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina, en los que la administración de la composición farmacéutica reduce el nivel de circulación en sangre de ZTNF4 del sujeto mamífero. A modo ilustrativo, la administración de tal composición farmacéutica puede reducir los niveles de circulación en sangre de ZTNF4 en al menos el 10%, en al menos el 20%, en al menos del 10 al 50%, en al menos del 20 al 50%, o en al menos del 30 al 40%, en comparación con el nivel en sangre de ZTNF24 antes de la administración de la composición farmacéutica. Los expertos en la técnica pueden medir los niveles de circulación de ZTNP4. En el ejemplo 4 y el ejemplo 5, se describen procedimientos ilustrativos.
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Según lo descrito más adelante, las proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina comprenden:
(a) un resto de receptor TACI que consta de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre: los residuos de aminoácido 34 a 104 de la SEC ID N.º 2; los residuos de aminoácido 30 a 110 de la SEC ID N.º 2; y los residuos de aminoácido 30 a 154 de la SEC ID N.º 2, y
(b) un resto de inmunoglobulina que comprende una región constante de una inmunoglobulina.
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El resto de inmunoglobulina de una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina puede comprender una región constante de cadena pesada, tal como una región constante de cadena pesada humana. Una región constante de cadena pesada de IgG1 es un ejemplo de una región constante de cadena pesada adecuada. Una región constante de cadena pesada de IgG1 ilustrativa es un fragmento Fc de IgG1 que comprende los dominios C_{H2} y C_{H3}. El fragmento Fc de IgG1 puede ser un fragmento Fc de IgG1 de tipo natural o un fragmento de Fc de IgG1 mutado, tal como el fragmento Fc que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 33. Una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina ejemplar es una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 54.
Las proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina descritas en la presente memoria pueden ser multímeros, tales como dímeros.
La presente invención también proporciona moléculas de ácido nucleico (según lo definido en las reivindicaciones) que codifican una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina. La SEC ID N.º 53 proporciona una secuencia de nucleótidos ilustrativa que codifica una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina.
La presente memoria de invención describe receptores solubles TACI que constan de un fragmento de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácido 30 a 154 de la SEC ID N.º 2, en los que el resto de receptor soluble TACI comprende al menos una entre (i) los residuos de aminoácido 34 a 66 de la SEC ID N.º 2 y (ii) los residuos de aminoácido 71 a 104 de la SEC ID N.º 2; y en los que el receptor soluble TACI se une al menos con uno entre ZTNF2 o ZTNF4. En la presente memoria, se describen otros receptores solubles TACI como restos de receptor TACI adecuados para las proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina. Además, los receptores solubles TACI se pueden usar en procedimientos descritos para las proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina.
Éstos y otros aspectos de la invención se harán evidentes tras consultar la siguiente descripción detallada y las siguientes figuras. Además, más adelante, se identifican diversas referencias.
2. Definiciones
En la siguiente descripción, se usa ampliamente una serie de términos. Las siguientes definiciones se proporcionan con el fin de facilitar la comprensión de la invención.
Como se usa en la presente memoria, "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fragmentos generados mediante cualquier unión, escisión, acción de endonucleasas y acción de exonucleasas. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas por monómeros que son nucleótidos naturales (tales como ADN y ARN) o análogos de nucleótidos naturales (p. ej., formas \alpha-enantioméricas de nucleótidos naturales) o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en los restos de azúcar y/o en los restos de bases de pirimidina o purina. Las modificaciones de los azúcares incluyen, por ejemplo, la sustitución de uno o más grupos hidroxilo con halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o los azúcares pueden estar funcionalizados como éteres o ésteres. Además, puede que todo el resto de azúcar esté reemplazado con estructuras estéricamente y electrónicamente similares, tales como aza-azúcares y análogos de azúcar carbocíclicos. Los ejemplos de modificaciones en un resto de base incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas, u otros sustitutos heterocíclicos conocidos. Los monómeros de ácido nucleico pueden estar unidos por enlaces de tipo fosfodiéster o análogos de tales enlaces. Los análogos de enlaces de tipo fosfodiéster incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato y similares. El término "molécula de ácido nucleico" también incluye los denominados "ácidos nucleicos peptídicos", que comprenden bases de ácido nucleico naturales o modificadas unidas a una estructura de poliamida. Los ácidos nucleicos pueden ser bien monocatenarios o bicatenarios.
El término "complemento de una molécula de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria y una orientación inversa en comparación con una secuencia de nucleótidos de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5' ATGCACGGG 3' (SEC ID N.º 57) es complementaria a 5' CCCGTGCAT 3' (SEC ID N.º 58).
El término "cóntigo" denota una molécula de ácido nucleico que tiene un tramo contiguo de secuencia idéntica o complementaria a otra molécula de ácido nucleico. Se dice que las secuencias contiguas se "superponen" con un tramo dado de una molécula de ácido nucleico bien en su totalidad o a lo largo de un tramo parcial de la molécula de ácido nucleico.
El término "secuencia de nucleótidos degenerada" denota una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados en comparación con una molécula de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido. Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero codifican el mismo residuo de aminoácido (es decir, los tripletes GAU y GAC codifican Asp).
El término "gen estructural" se refiere a una molécula de ácido nucleico que transcrita a ARN mensajero (ARNm), que luego es traducido en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico.
Una "molécula de ácido nucleico aislada" es una molécula de ácido nucleico que no está integrada en el ADN genómico de un organismo. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica un factor de crecimiento que ha sido separada del ADN genómico de una célula es una molécula de ADN aislada. Otro ejemplo de una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico sintetizada químicamente que no está integrada en el genoma de un organismo. Una molécula de ácido nucleico que ha sido aislada de una determinada especie es más pequeña que la molécula de ADN completa de un cromosoma de esa especie.
Un "constructo de una molécula de ácido nucleico" es una molécula de ácido nucleico, bien monocatenaria o bicatenaria, que ha sido modificada mediante la intervención humana para que contenga segmentos de ácido nucleico combinados y yuxtapuestos en una disposición que no existe en la naturaleza.
"ADN lineal" denota moléculas de ADN no circulares que tienen los extremos 5' y 3' libres. Se puede preparar ADN lineal a partir de moléculas de ADN circulares cerradas, tales como plásmidos, mediante digestión enzimática o alteración física.
"ADN complementario (ADNc)" es una molécula de ADN monocatenaria que se forma a partir de un molde de ARNm por la enzima transcriptasa inversa. Comúnmente, se emplea un cebador complementario a partes del ARNm para iniciar la transcripción inversa. Los expertos en la técnica también usan el término "ADNc" para referirse a una molécula de ADN bicatenaria que consta de tal molécula de ADN monocatenaria y su cadena de ADN complementaria. El término "ADNc" también se refiere a un clon de una molécula de ADNc sintetizada a partir de un molde de ARN.
Un "promotor" es una secuencia de nucleótidos que dirige la transcripción de un gen estructural. Comúnmente, el promotor se ubica en la región 5' no codificante de un gen, en posición proximal al sitio de iniciación de la transcripción de un gen estructural. Los elementos secuenciales de los promotores que funcionan en el inicio de la transcripción se caracterizan a menudo por secuencias de nucleótidos consenso. Estos elementos de los promotores incluyen sitios de unión a la ARN polimerasa, secuencias TATA, secuencias CAAT, elementos específicos de la diferenciación (DSE, Differentiation Specific Elements; McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)), elementos de respuesta al AMP cíclico (CRE, Cyclic AMP Response Elements), elementos de respuesta al suero (SRE, Serum Response Elements; Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990)), elementos de respuesta a glucocorticoides (GRE, Glucocorticoid Response Elements) y sitios de unión para otros factores de transcripción, tales como CRF/ATF (O'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992)), AP2 (Ye et al., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994)), SP1, proteína de unión para los elementos de respuesta a AMPc (CREB, cAMP Response Element Binding Protein; Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)) y factores octaméricos (véase, en general, Watson et al., eds., "Molecular Biology of the Gene", IV ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987) y Lemaigre y Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)). Si un promotor es un promotor inducible, entonces la velocidad de transcripción aumenta como respuesta a un agente inductor. Por el contrario, la velocidad de transcripción no está regulada por un agente inductor si el promotor es un promotor constitutivo. También se conocen los promotores represibles.
Un "promotor central" contiene secuencias de nucleótidos esenciales para la función del promotor, incluyendo la caja TATA y el inicio de la transcripción. Mediante esta definición, un promotor central puede o no puede tener una actividad detectable en ausencia de secuencias específicas que pueden aumentar la actividad o conferir una actividad específica de un tejido.
Un "elemento regulador" es una secuencia de nucleótidos que modula la actividad de un promotor central. Por ejemplo, un elemento regulador puede contener una secuencia de nucleótidos que se une con factores celulares que permiten la transcripción exclusiva o de forma preferente en determinadas células, tejidos u orgánulos. Estos tipos de elementos reguladores están normalmente asociados con genes que se expresan de un modo "específico para una célula", "específico para un tejido" o "específico para un orgánulo".
Un "potenciador" es un tipo de elemento regulador que puede aumentar la eficacia de la transcripción, independientemente de la distancia o de la orientación del potenciador con respecto al sitio de inicio de la transcripción.
"ADN heterólogo" se refiere a una molécula de ADN o una población de moléculas de ADN que no existe de manera natural en una célula huésped dada. Las moléculas de ADN heterólogas a una determinada célula huésped pueden contener ADN derivado de la especie de la célula huésped (es decir, ADN endógeno) siempre y cuando el ADN huésped esté combinado con ADN no huésped (es decir, ADN exógeno). Por ejemplo, una molécula de ADN que contiene un segmento de ADN no huésped que codifica un polipéptido unido operativamente a un segmento de ADN huésped que comprende un promotor de la transcripción se considera una molécula de ADN heteróloga. Por el contrario, una molécula de ADN heteróloga puede comprender un gen endógeno unido operativamente con un promotor exógeno. Como otro ejemplo, una molécula de ADN que comprende un gen derivado de una célula de tipo natural se considera ADN heterólogo si esa molécula de ADN está introducida en una célula mutante que carece del gen de tipo natural.
Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácido unidos mediante enlaces peptídicos, bien producido de manera natural o sintéticamente. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácido se denominan comúnmente "péptidos".
Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas. Una proteína también puede comprender componentes no peptídicos, tales como grupos carbohidrato. Los carbohidratos y otros sustituyentes no peptídicos se pueden añadir a una proteína a través de la célula en la que la proteína es producida, y variarán con el tipo de célula. Las proteínas se definen en la presente memoria en términos de sus estructuras de aminoácidos; los sustituyentes tales como los grupos carbohidrato generalmente no se especifican, aunque pueden estar presentes.
Un péptido o un polipéptido codificado por una molécula de ADN no huésped es un péptido o un polipéptido "heterólogo".
Un "elemento genético integrado" es un segmento de ADN que ha sido incorporado a un cromosoma de una célula huésped tras introducir ese elemento en la célula mediante manipulación humana. Lo más común es que, en la presente invención, los elementos genéticos integrados estén derivados de plásmidos linealizados que son introducidos en las células mediante electroporación u otras técnicas. Los elementos genéticos integrados son transmitidos de la célula huésped original a su progenie.
Un "vector de clonación" es una molécula de ácido nucleico, tal como un plásmido, un cósmico o un bacteriófago, que tiene la capacidad de replicarse de manera autónoma en una célula huésped. Los vectores de clonación contienen comúnmente un o un número pequeño de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción que permite la inserción de una molécula de ácido nucleico de una manera determinable sin la pérdida de una función biológica esencial del vector, así como las secuencias de nucleótidos que codifican un gen marcador que es adecuado para su uso en la identificación y la selección de células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores incluyen comúnmente genes que proporcionan resistencia a la tetraciclina o resistencia a la ampicilina.
Un "vector de expresión" es una molécula de ácido nucleico que codifica un gen que es expresado en una célula huésped. Comúnmente, un vector de expresión comprende un promotor de la transcripción, un gen y un terminador de la transcripción. La expresión génica habitualmente es colocada bajo el control de un promotor y se dice que tal gen está "unido operativamente" al promotor. De manera similar, un elemento regulador y un promotor central están ligados operativamente si el elemento regulador modula la actividad del promotor central.
Un "huésped recombinante" es una célula que contiene una molécula de ácido nucleico heteróloga, tal como un vector de clonación o un vector de expresión. En el presente contexto, un ejemplo de un huésped recombinante es una célula que produce una proteína de fusión de TACI-Fc a partir de un vector de expresión.
Los "transformantes integradores" son células huésped recombinantes en las que el ADN heterólogo se ha integrado en el ADN genómico de las células.
Una "proteína de fusión" es una proteína híbrida expresada por una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótidos de al menos dos genes. Por ejemplo, una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina comprende un resto de receptor TACI y un resto de inmunoglobulina. Como se usa en la presente memoria, un "resto de receptor TACI" es una parte del dominio extracelular del receptor TACI que se une con al menos uno entre ZTNF2 o ZTNF4. El término "resto de inmunoglobulina" se refiere a un polipéptido que comprende una región constante de una inmunoglobulina. Por ejemplo, el resto de inmunoglobulina puede comprender una región constante de cadena pesada. El término proteína de fusión de "TACI-Fc" se refiere a una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina en la que el resto de inmunoglobulina comprende regiones constantes de las cadenas pesadas de la inmunoglobulina, CH2 y CH3.
El término "receptor" denota una proteína asociada a una célula que se une a una molécula bioactiva denominada "ligando". Esta interacción media el efecto del ligando sobre la célula. En el contexto de la unión del receptor TACI, el término "que se une específicamente" o "unión específica" se refiere a la capacidad del ligando para unirse competitivamente con el receptor. Por ejemplo, ZTNF4 se une específicamente con el receptor TACI, y esto se puede ver observando la competición por el receptor TACI entre ZTNF4 marcado detectablemente y ZTNF4 sin marcar.
Los receptores pueden estar unidos a la membrana, ser citosólicos o nucleares; monoméricos (p.ej., el receptor de la hormona estimulante de la tiroides, receptor beta-adrenérgico) o multiméricos ((p.ej., receptor del PDGF, receptor de hormonas del crecimiento, receptor de la IL-3; receptor del GM-CSF, receptor del G-CSF, receptor de la eritropoyetina y receptor de la IL-6). Los receptores unidos a la membrana se caracterizan por una estructura de múltiples dominios que comprende un dominio de unión a ligandos extracelular y un dominio efector intracelular que está comúnmente implicado en la transducción de señales. En ciertos receptores unidos a la membrana, el dominio extracelular de unión a ligandos y el dominio efector intracelular se ubican en polipéptidos separados que comprenden el receptor funcional completo.
En general, la unión del ligando al receptor da como resultado un cambio configuracional en el receptor que provoca una interacción entre el dominio efector y otra u otras moléculas de la célula, lo que a su vez conduce a una alteración del metabolismo de la célula. Los hechos metabólicos que suelen estar ligados a las interacciones entre receptor y ligando incluyen la transcripción génica, la fosforilación, la desfosforilación, los aumentos de la producción de AMP cíclico, la movilización del calcio celular, la movilización de lípidos de membrana, la adhesión celular, la hidrólisis de lípidos de inositol y la hidrólisis de fosfolípidos.
El término "secuencia señal de secreción" denota una secuencia de ADN que codifica un péptido (un "péptido de secreción") que, como componente de un polipéptido de mayor tamaño, dirige el polipéptido más grande por una ruta de secreción de una célula en la que es sintetizado. El polipéptido más grande es comúnmente escindido para eliminar el péptido de secreción durante el tránsito por la ruta de secreción.
Un "polipéptido aislado" es un polipéptido que está esencialmente libre de componentes celulares contaminantes, tales como impurezas de carbohidratos, lípidos u otras proteínas asociadas con el polipéptido en la naturaleza. Comúnmente, una preparación de un polipéptido aislado contiene el polipéptido en una forma muy purificada, es decir, al menos aproximadamente un 80% puro, al menos aproximadamente un 90% puro, al menos aproximadamente un 95% puro, más del 95% puro o más del 99% puro. Un modo de demostrar que una determinada preparación de proteínas contiene un polipéptido aislado es mediante la aparición de una sola banda tras una electroforesis sobre gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS) de la preparación proteica y una tinción con azul brillante de Coomassie del gel. Sin embargo, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como dímeros o, alternativamente, formas glicosiladas o derivadas.
Los términos "amino-terminal" y "carboxi-terminal" se usan en la presente memoria para indicar las posiciones dentro de los polipéptidos. Cuando el contexto lo permite, estos términos se usan con referencia a una determinada secuencia o posición de un polipéptido para indicar proximidad o una posición relativa. Por ejemplo, una determinada secuencia colocada carboxi-terminalmente a una secuencia de referencia en un polipéptido está ubicada en posición proximal al terminal carboxilo de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el terminal carboxilo del polipéptido completo.
El término "expresión" se refiere a la biosíntesis de un producto génico. Por ejemplo, en el caso de un gen estructural, la expresión implica la transcripción del gen estructural en ARNm y la traducción del ARNm en uno o más polipéptidos.
El término "variante de empalme" se usa en la presente memoria para indicar formas alternativas de ARN transcrito desde un gen. La variación por empalme se produce de manera natural mediante el uso de sitios de corte y empalme alternativos de una molécula de ARN transcrito, o menos comúnmente, entre moléculas de ARN transcritas por separado, y puede dar como resultado varios ARNm transcritos del mismo gen. Las variantes de empalme pueden codificar polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos alterada. El término variante de empalme también se usa en la pre-
sente memoria para indicar un polipéptido codificado por una variante de empalme de un ARNm transcrito de un gen.
Como se usa en la presente memoria, el término "inmunomodulador" incluye citocinas, factores de crecimiento de células madre, linfotoxinas, moléculas co-estimuladoras, factores hematopoyéticos y análogos sintéticos de estas moléculas.
El término "par de complemento/anti-complemento" indica restos no idénticos que forman un par estable asociado no covalentemente en condiciones apropiadas. Por ejemplo, la biotina y la avidina (o la estreptavidina) son miembros prototípicos de un par de complemento/anti-complemento. Otros ejemplos de pares de complemento/anti-complemento incluyen pares de receptor/ligando, pares de anticuerpo/antígeno (o hapteno o epítopo), pares de polinucleótidos sentido/antisentido, y similares. Cuando se desea la posterior disociación del par de complemento/anti-complemento, el par de complemento/anti-complemento tiene preferiblemente una afinidad de unión menor de 109 M-1.
Un "fragmento de anticuerpo" es una parte de un anticuerpo tal como F(ab')_{2}, F(ab)_{2}, Fab', Fab y similares. Independientemente de la estructura, un fragmento de anticuerpo se une con el mismo antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto.
El término "fragmento de anticuerpo" también incluye un polipéptido sintético o diseñado genéticamente que se une a un antígeno específico, tal como polipéptidos que constan de la región variable de la cadena ligera, fragmentos "Fv" constituidos por las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, moléculas de polipéptido monocatenarias recombinantes en las que las regiones variables de las cadenas ligera y pesada están conectadas por un ligador peptídico ("proteínas scFv") y unidades mínimas de reconocimiento que constan de los residuos de aminoácido que imitan la región hipervariable.
Un "anticuerpo quimérico" es una proteína recombinante que contiene los dominios variables y las regiones determinantes de la complementariedad derivados de un anticuerpo de roedor, mientras que el resto de la molécula de anticuerpo está derivada de un anticuerpo humano.
Los "anticuerpos humanizados" son proteínas recombinantes en las que las regiones determinantes de la complementariedad murinas de un anticuerpo monoclonal han sido transferidas de las cadenas variables pesadas y ligeras de la inmunoglobulina murina a un dominio variable humano.
Como se usa en la presente memoria, un "agente terapéutico" es una molécula o un átomo que se conjuga con un resto de anticuerpo para producir un conjugado que es útil para una terapia. Los ejemplos de agentes terapéuticos incluyen fármacos, toxinas, inmunomoduladores, quelantes, compuestos de boro, agentes o colorantes fotoactivos y radioisótipos.
Un "marcador detectable" es una molécula o un átomo que puede ser conjugado con un resto de anticuerpo para producir una molécula útil para un diagnóstico. Los ejemplos de marcadores detectables incluyen quelantes, agentes fotoactivos, radioisótopos, agentes fluorescentes, iones paramagnéticos u otros restos marcadores.
El término "etiqueta de afinidad" es usa en la presente memoria para indicar un segmento de polipéptido que puede ser unido a un segundo polipéptido para proporcionar la purificación o la detección del segundo polipéptido, o para proporcionar sitios para la unión del segundo polipéptido a un sustrato. En principio, se puede usar cualquier péptido o proteína para la que esté disponible un anticuerpo u otro agente de unión específica como etiqueta de afinidad. Las etiquetas de afinidad incluyen un tracto de polihistidina, la proteína A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3 (1991)), glutatión-S-transferasa (Smith y Johnson, Gene 67:31 (1988)), etiqueta de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 82:7952 (1985)), sustancia P, péptido FLAG (Hopp et al., Biotechnology 6:1204 (1988)), péptido de unión a la estreptavidina, u otro epítopo antigénico o dominio de unión. Véase, en general, Ford et al, "Protein Expression and Purification" 2:95 (1991). Las moléculas de ADN que codifican etiquetas de afinidad se pueden obtener de proveedores comerciales (p.ej., Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Un "anticuerpo desnudo" es un anticuerpo entero, a diferencia de un fragmento de anticuerpo, que no está conjugado con un agente terapéutico. Los anticuerpos desnudos incluyen anticuerpos tanto policlonales como monoclonales, así como ciertos anticuerpos recombinantes, tales como anticuerpos quiméricos y humanizados.
Como se usa en la presente memoria, el término "componente de anticuerpo" incluye tanto un anticuerpo entero como un fragmento de anticuerpo.
Un "inmunoconjugado" es un conjugado de un componente de anticuerpo con un agente terapéutico o un marcador detectable.
Un "polipéptido diana" o un "péptido diana" es una secuencia de aminoácidos que comprende, al menos, un epítopo y que está expresada en una célula diana, tal como una célula tumoral, o una célula que porta un antígeno de un agente infeccioso. Las células T reconocen los epítopos peptídicos presentados por una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad a un polipéptido diana o a un péptido diana y, comúnmente, lisan la célula diana o reclutan otros inmunocitos para que se dirijan al sitio de la célula diana, matando de ese modo a la célula diana.
Un "péptido antigénico" es un péptido que se unirá a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad para formar un complejo de MHC-péptido (MHC, Mayor Histocompatibility Complex, Complejo mayor de histocompatibilidad) que es reconocido por una célula T, induciendo de ese modo una respuesta de linfocitos citotóxicos tras la presentación a la célula T. Por ende, los péptidos antigénicos son capaces de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad apropiada e inducir una respuesta de las células T citotóxicas, tales como la lisis celular o una liberación de citocinas específicas frente a la célula diana que se une al antígeno o lo expresa. El péptido antigénico puede ser unido en el contexto de una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I o clase II, en una célula presentadora de antígeno o en una célula diana.
En eucariotas, la ARN polimerasa II cataliza la transcripción de un gen estructural para producir ARNm. Es posible diseñar una molécula de ácido nucleico para que contenga un molde de ARN polimerasa II en el que el transcripto de ARN tenga una secuencia que sea complementaria a la de un ARNm específico. El transcripto de ARN se denomina un "ARN antisentido" y una molécula de ácido nucleico que codifica el ARN antisentido se denomina un "gen antisentido". Las moléculas de ARN antisentido son capaces de unirse a las moléculas de ARNm, lo que da como resultado una inhibición de la traducción del ARNm.
Debido a la falta de precisión de los procedimientos analíticos estándar, se entiende que los pesos moleculares y las longitudes de los polímeros son valores aproximados. Cuando tal valor se expresa como "aproximadamente" X, se entenderá que el valor de X expuesto tendrá una exactitud del \pm 10%.
3. Producción de moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas TACI-inmunoglobulina
La figura 1 proporciona la secuencia de aminoácidos predicha del TACI humano (von Bülow y Bram, Science 278:138 (1997)). El polipéptido TACI contiene los siguientes elementos predichos: (a) dos estructuras de pseudo-repetición ricas en cisteína características de los dominios de unión de los ligandos de los factores de necrosis tumoral; (b) una "región del tallo" de 62 aminoácidos que reside entre los dominios de unión de los ligandos y el dominio transmembrana; (c) un dominio transmembrana de 20 aminoácidos; y (d) un dominio intracelular de 127 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos no contiene una secuencia señal amino-terminal hidrófoba predicha.
Para crear una forma soluble del TACI humano para su uso como inhibidor de la interacción entre el ligando nativo y el receptor nativo, se generó una proteína de fusión de dominio extracelular del TACI-Fc de inmunoglobulina humana. Se usó la secuencia del TACI humano disponible como punto inicial para diseñar la molécula de la proteína de fusión (von Bülow y Bram, Science 278:138 (1997)). Este constructo inicial, designado "TACI-Fc4", incluía los residuos de aminoácido 1 a 154 del polipéptido TACI y una región Fc humana modificada, descritos más adelante. Se seleccionó el punto de fusión del residuo 154 para que incluyera lo máximo posible de la región del tallo del TACI, sin incluir ninguna posible parte del dominio transmembrana predicho.
Como el polipéptido TACI nativo no contiene una secuencia señal amino-terminal, se añadió una secuencia señal amino-terminal al TACI para generar una forma secretada de la proteína de fusión de TACI-Fc. La secuencia señal era una secuencia pre-pro modificada del activador tisular del plasminógeno humano. Las modificaciones se incluyeron para aumentar la escisión mediante una peptidasa señal y el procesamiento específico de la proteasa furina, y por esa razón esta secuencia ha sido denominada "tPA líder optimizado (otPA)". A continuación, se ilustra la secuencia otPA (SEC ID N.º 25); los residuos de aminoácido modificados están sombreados. Se insertó la secuencia codificante de la proteína de fusión de TACI-Fc recombinante en un vector de expresión que fue transferido a células de ovario de hámster chino.
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Las células de ovario de hámster chino a las que se realizó la transferencia produjeron la proteína TACI-Fc4 a un nivel bajo de aproximadamente 0,3 pg/célula/día. El análisis de transferencia Western de la proteína TACI-Fc con antisuero de cabra frente a Fc de IgG humana reveló dos bandas, una banda resultó ser más pequeña de lo esperad, de aproximadamente 48 kDa. El análisis de la secuencia de aminoácidos de proteínas purificadas reveló que la banda más pequeña reflejaba la escisión de las proteínas de fusión de TACI en diversos sitios de la región del tallo del TACI. Con referencia a la SEC ID N.º 2, el terminal principal fue descubierto en los residuos de aminoácido 118 y 123, aunque las proteínas también fueron escindidas en los posiciones de los aminoácidos 110, 139 y 141.
Además de la heterogeneidad provocada por la escisión en la región del tallo, también se observó heterogeneidad en los terminales amino y carboxilo. Con referencia a la SEC ID N.º 2, los terminales principales fueron descubiertos en los residuos de aminoácido 1, 10 y 13. Las diferencias en el terminal carboxilo reflejan la heterogeneidad natural de las inmunoglobulinas recombinantes y las proteínas de fusión de inmunoglobulina, que incluye la eliminación incompleta del residuo de lisina codificado carboxiterminalmente. Se encontró otro origen de la heterogeneidad en la naturaleza variable de la estructura de hidrato de carbono unida al dominio CH2 de inmunoglobulina codificado por Fc.
Se generaron nuevas versiones de TACI-Fc para tratar la heterogeneidad observada. Se diseñaron constructos que incluían al menos una de las siguientes variaciones en el resto de TACI: (1) se eliminaron partes de la región del tallo del TACI; (2) se sustituyó una parte de la región del tallo del TACI por una parte de la región del tallo del BCMA; (3) se mutó el residuo de arginina de la posición 119 para eliminar un posible sitio de escisión de furina; (4) se mutó el residuo de glutamina de la posición 121 para eliminar un posible sitio de escisión de furina; (5) se mutó el residuo de arginina de la posición 122 para eliminar un posible sitio de escisión mediante furina; (6) se mutaron el residuo de aminoácido de las posiciones 123 y 142 a residuos de aminoácido encontrados en las posiciones correspondientes del TACI murino; (7) se sustituyó la secuencia señal del otPA humano con una secuencia señal de la región variable de la cadena pesada humana; (8) se mutó el residuo de valina de la posición 29 en metionina, y se unió la secuencia señal del otPA en una posición amino-terminal con este residuo; y (9) se unió la secuencia señal otPA en una ubicación amino-terminal con el residuo de alanina de la posición 30.
También se introdujeron modificaciones en el resto de inmunoglobulina. En los vertebrados superiores, se han identificado cinco clases de inmunoglobulina, IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. Las proteínas IgG, IgD e IgE son característicamente heterotetrámeros unidos mediante enlaces de tipo disulfuro constituidos por dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. Comúnmente, la IgM se encuentra como un pentámero de un tetrámero, mientras que la IgA tiene lugar como un dímero de un tetrámero.
La IgG comprende la clase principal, pues existe normalmente como la segunda proteína más abundante encontrada en el plasma. En seres humanos, la IgG consta de cuatro subclases denominadas IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Como se muestra en la figura 2, cada cadena pesada de inmunoglobulina posee una región constante que consta de dominios proteicos de región constante (C_{H1}, bisagra, C_{H2} y C_{H3}) que son invariables para una subclase dada. Las regiones constantes de las cadenas pesadas de la clase IgG se identifican con el símbolo griego \gamma. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la subclase IgG1 contienen una región constante \gamma1 en las cadenas pesadas.
El fragmento Fc, o dominio Fc, consta de las regiones bisagra y los dominios C_{H2} y C_{H3} de las cadenas pesadas unidos mediante enlaces de tipo disulfuro. En las proteínas de fusión de inmunoglobulina, los dominios Fc de la subclase IgG1 se usan habitualmente como el resto de inmunoglobulina, porque la IgG1 tiene la vida media en suero más larga de todas las proteínas séricas. Una vida media en suero prolongada puede ser una característica proteica deseable para los estudios animales y un posible uso terapéutico en seres humanos. Además, la subclase IgG1 posee la mayor capacidad de llevar a cabo funciones efectoras mediadas por anticuerpos. La función efectora principal que puede ser la más útil en una proteína de fusión de inmunoglobulina es la capacidad de un anticuerpo IgG1 para mediar la citotoxicidad celular dependiente de un anticuerpo. Por otro lado, esto podría ser una función no deseable para una proteína de fusión que funcione fundamentalmente como antagonista. Se han identificado varios de los residuos de aminoácido específicos que son importantes para una actividad mediada por la región constante de un anticuerpo en la subclase IgG1. La inclusión o la exclusión de estos aminoácidos específicos permite por tanto la inclusión o la exclusión de una actividad mediada por la región constante de una inmunoglobulina específica.
Se generaron seis versiones de un Fc de IgG1 humana modificado para crear proteínas de fusión de Fc. Se diseñó Fc-488 para la clonación conveniente de una proteína de fusión que contenía la región Fc \gamma1 humana, y se construyó usando la región constante \gamma1 de inmunoglobulina humana de tipo natural como molde. El temor a posibles efectos perjudiciales debido a un residuo de cisteína desapareado condujo a tomar la decisión de sustituir la cisteína (residuo de aminoácido 24 de SEC ID N.º 6), que normalmente se une mediante enlaces de tipo disulfuro con la región constante de las cadenas ligeras de la inmunoglobulina, por un residuo de serina. Se introdujo otro cambio más en el codón que codifica la posición del índice EU 218 (residuo de aminoácido 22 de la SEC ID N.º 6) para introducir un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción BglII con el fin de facilitar futuras manipulaciones del ADN. Estos cambios fueron introducidos en el producto de la PCR codificado en cebadores para PCR. Debido a la ubicación del sitio de BglIII y para completar la región bisagra de Fc, se incorporaron los codones para las posiciones del índice EU 216 y 217 (residuos de aminoácido 20 y 21 de la SEC ID N.º 6) en las parejas secuenciales de la proteína de
fusión.
Fc4, Fc5 y Fc6 contienen mutaciones para reducir las funciones efectoras mediadas por el Fc reduciendo la unión a Fc\gammaRI y la unión al complemento C1q. Fc4 contiene las mismas sustituciones de aminoácidos que fueron introducidas en Fc-488. Se introdujeron más sustituciones de aminoácido para reducir posibles funciones efectoras mediadas por Fc. Específicamente, se introdujeron tres sustituciones de aminoácidos para reducir la unión a Fc\gammaRI. Éstas son las sustituciones en las posiciones del índice EU 234, 235 y 237 (residuos de aminoácido 38, 39 y 41 de SEC ID N.º 6). Se ha observado que las sustituciones realizadas en estas posiciones han reducido la unión a Fc\gammaRI (Duncan et al., Nature 332:563 (1988)). Estas sustituciones de aminoácido también pueden reducir la unión a Fc\gammaRIIa, así como la unión a Fc\gammaRIII (Sondermann et al., Nature 406:267 (2000); Wines et al., J. Immunol. 164:5313 (2000)).
Varios grupos han descrito la relevancia de las posiciones del índice EU 330 y 331 (residuos de aminoácido 134 y 135 de la SEC ID N.º 6) en la unión al complemento C1q y la posterior fijación del complemento (Canfield y Morrison, J. Exp. Med 173:1483 (1991); Tao et al., J. Exp. Med. 178:661 (1993)). Las sustituciones de los aminoácidos realizadas en estas posiciones fueron introducidas en Fc4 para reducir la fijación del complemento. El dominio CH3 de Fc4 es idéntico al encontrado en el correspondiente polipéptido de tipo natural, a excepción del codón de terminación, que fue cambiado de TGA a TAA para eliminar un posible sitio de metilación dam cuando se cultive el ADN clonado en cepas de E. coli más dam.
En Fc5, se volvió a mutar el residuo de arginina situado en la posición del índice EU 218 a una lisina, porque el esquema de clonación de BglII no se usó en proteínas de fusión que contenían este determinado Fc. El resto de la secuencia de Fc5 coincide con la descripción anterior de Fc4.
Fc6 es idéntico a Fc5, a excepción de que el codón de lisina carboxi-terminal ha sido eliminado. La lisina C-terminal de inmunoglobulinas maduras es eliminada habitualmente de las inmunoglobulinas maduras tras la traducción antes de la secreción desde células B o es eliminada durante la circulación en suero. Por consiguiente, el residuo de lisina C-terminal no se encuentra comúnmente en anticuerpos circulantes. Como en los Fc4 y Fc5 anteriores, el codón de terminación de la secuencia de Fc6 fue cambiado a TAA.
Fc7 es idéntico al Fc de \gamma1 de tipo natural, a excepción de una sustitución del aminoácido situado en la posición del índice EU 297 ubicada en el dominio CH2.
La posición del índice EU Asn-297 (residuo de aminoácido 101 de SEC ID N.º 6) es un sitio de unión de carbohidratos ligado a N. El carbohidrato ligado a N introduce una posible fuente de variabilidad en una proteína expresada recombinantemente, debido a las posibles variaciones de lote a lote de la estructura del hidrato de carbono. En un intento por eliminar esta posible variabilidad, se mutó Asn-297 a un residuo de glutamina para evitar la unión del hidrato de carbono ligado a N en esa posición de residuo. El hidrato de carbono del residuo 297 también está implicado en la unión de Fc a Fc\gammaRIII (Sondermann et al., Nature 406:267 (2000)). Por lo tanto, la eliminación del hidrato de carbono debería disminuir la unión del Fc7 recombinante que contiene las proteínas de fusión con los Fc\gammaR en general. Como en el caso anterior, el codón de terminación de la secuencia de Fc7 fue mutado a TAA.
Fc8 es idéntico a la región \gamma1 de la inmunoglobulina de tipo natural mostrada en la SEC ID N.º 6, a excepción de que el residuo de cisteína de la posición del índice EU 220 (residuo de aminoácido 24 de la SEC ID N.º 6) fue reemplazado por un residuo de serina. Esta mutación eliminó el residuo de cisteína que normalmente se une mediante enlaces de tipo disulfuro con la región constante de las cadenas ligeras de la inmunoglobulina.
En la tabla 1, se describen constructos de TACI-Fc ilustrativos.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1
2 
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Se produjeron las proteínas de TACI-Fc mediante células de ovario de hámster chino recombinantes, se aislaron y se analizaron usando un análisis de transferencia Western y un análisis de las secuencias de aminoácidos. Sorprendentemente, la eliminación de los 29 primeros aminoácidos del terminal N del polipéptido TACI dio como resultado un aumento de diez veces la producción de las proteínas de fusión de TACI-Fc mediante células de ovario de hámster chino. Esta eliminación también redujo la escisión de la región del tallo de longitud completa. Además, se suprimió la escisión en la región del tallo del TACI bien mediante el truncamiento de la región del tallo del TACI o mediante la sustitución de la región del tallo del TACI en otra secuencia de aminoácidos (p. ej., la secuencia de aminoácidos de la región del tallo del BCMA).
Según lo descrito en el ejemplo 4, los análisis funcionales de los constructos de TACI-Fc indican que las proteínas de fusión TACI (d1-29)-Fc5, TACI (d1-29, d107-154)-Fc5, TACI (d1-29, d111-154)-Fc5 y TACI (d1-29, d120-154)-Fc5 tienen afinidades de unión similares por ZTNF24. Sin embargo, los constructos TACI (d1-29)-Fc5, TACI (d1-29, d111-154)-Fc5 y TACI (d1-29, d120-154)-Fc5 parecen unirse más a ZTNF4 por mol de TACI-Fc que el constructo TACI (d1-29, d107-154)-Fc5. En función del uso deseado (es decir, terapéutico, de diagnóstico o de investigación), se pueden emplear bien proteínas de fusión de TACI-Fc de alta capacidad o de baja capacidad. Además, la combinación de proteínas de fusión de TACI-Fc de alta y baja capacidad permite la valoración de ZTNF2 o de ZTNF24.
La presente invención contempla proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina según lo definido en las reivindicaciones que comprenden un resto de receptor TACI constituido por los residuos de aminoácido 34 a 104 de la SEC ID N.º 2, 30 a 110 de la SEC ID N.º 2 ó 30 a 154 de la SEC ID N.º 2. La presente memoria describe proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina que comprenden un resto de receptor TACI constituido por los residuos de aminoácido 31 a 106 de la SEC ID N.º 2, 31 a 110 de la SEC ID N.º 2, 31 a 119 de la SEC ID N.º 2 ó 31 a 154 de la SEC ID N.º 2.
De manera más general, la presente memoria describe proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina en las que el resto de receptor TACI consta de un fragmento de los residuos de aminoácido 30 a 154 de SEC ID N.º 2 y en las que el resto de receptor TACI se une con al menos uno entre ZTNF2 o ZTNF4. Tales fragmentos comprenden una región de pseudo-repetición rica en cisteína y, opcionalmente, pueden incluir al menos uno entre un segmento N-terminal, que reside en una posición amino-terminal de la región de pseudo-repetición rica en cisteína, y un segmento del tallo, que reside en una posición carboxi-terminal con respecto a la región de pseudo-repetición rica en cisteína. Las regiones de pseudo-repetición ricas en cisteína incluyen polipéptidos que: (a) comprenden, al menos, uno entre los residuos de aminoácido 34 a 66 de la SEC ID N.º 2 y los residuos de aminoácido 71 a 104 de la SEC ID N.º 2; (b) comprenden tanto los residuos de aminoácido 34 a 66 de la SEC ID N.º 2 como los residuos de aminoácido 71 a 104 de la SEC ID N.º 2; o (c) comprenden los residuos de aminoácido 34 a 104 de la SEC ID N.º 2.
Los segmentos N-terminales incluyen los siguientes con referencia a la SEC ID N.º 2: el residuo de aminoácido 33; los residuos de aminoácido 32 a 33; los residuos de aminoácido 31 a 33; y los residuos de aminoácido 30 a 33. Los segmentos del tallo adecuados incluyen uno o más aminoácidos de los residuos de aminoácido 105 a 154 de la SEC ID N.º 2. Por ejemplo, el segmento del tallo puede constar de los siguientes con referencia a la SEC ID N.º 2: el residuo de aminoácido 105, los residuos de aminoácido 105 a 106, los residuos de aminoácido 105 a 107, los residuos de aminoácido 105 a 108, los residuos de aminoácido 105 a 109, los residuos de aminoácido 105 a 110, los residuos de aminoácido 105 a 111, los residuos de aminoácido 105 a 112, los residuos de aminoácido 105 a 113, los residuos de aminoácido 105 a 114, los residuos de aminoácido 105 a 115, los residuos de aminoácido 105 a 116, los residuos de aminoácido 105 a 117, los residuos de aminoácido 105 a 118, los residuos de aminoácido 105 a 119, los residuos de aminoácido 105 a 120, los residuos de aminoácido 105 a 121, los residuos de aminoácido 105 a 122, los residuos de aminoácido 105 a 123, los residuos de aminoácido 105 a 124, los residuos de aminoácido 105 a 125, los residuos de aminoácido 105 a 126, los residuos de aminoácido 105 a 127, los residuos de aminoácido 105 a 128, los residuos de aminoácido 105 a 129, los residuos de aminoácido 105 a 130, los residuos de aminoácido 105 a 131, los residuos de aminoácido 105 a 132, los residuos de aminoácido 105 a 133, los residuos de aminoácido 105 a 134, los residuos de aminoácido 105 a 135, los residuos de aminoácido 105 a 136, los residuos de aminoácido 105 a 137, los residuos de aminoácido 105 a 138, los residuos de aminoácido 105 a 139, los residuos de aminoácido 105 a 140, los residuos de aminoácido 105 a 141, los residuos de aminoácido 105 a 142, los residuos de aminoácido 105 a 143, los residuos de aminoácido 105 a 144, los residuos de aminoácido 105 a 145, los residuos de aminoácido 105 a 146, los residuos de aminoácido 105 a 147, los residuos de aminoácido 105 a 148, los residuos de aminoácido 105 a 149, los residuos de aminoácido 105 a 150, los residuos de aminoácido 105 a 151, los residuos de aminoácido 105 a 152, los residuos de aminoácido 105 a 153 y los residuos de aminoácido 105 a 154.
Otros segmentos del tallo adecuados incluyen uno o más aminoácidos de la región del tallo del BCMA (es decir, los residuos de aminoácido 42 a 54 de SEC ID N.º 27). Por ejemplo, el segmento del tallo puede constar de los siguientes con referencia a la SEC ID N.º 27: el residuo de aminoácido 42, los residuos de aminoácido 42 a 43, los residuos de aminoácido 42 a 44, los residuos de aminoácido 42 a 45, los residuos de aminoácido 42 a 46, los residuos de aminoácido 42 a 47, los residuos de aminoácido 42 a 48, los residuos de aminoácido 42 a 49, los residuos de aminoácido 42 a 50, los residuos de aminoácido 42 a 51, los residuos de aminoácido 42 a 52, los residuos de aminoácido 42 a 53 y los residuos de aminoácido 42 a 54.
De manera más general, el segmento del tallo puede constar de dos a 50 residuos de aminoácido.
El resto de inmunoglobulina de una proteína de fusión descrita en la presente memoria comprende, al menos, una región constante de una inmunoglobulina. Preferiblemente, el resto de inmunoglobulina representa un segmento de una inmunoglobulina humana. La secuencia de la inmunoglobulina humana puede ser una secuencia de aminoácidos de tipo natural o una secuencia de aminoácidos de tipo natural modificada que tenga, al menos, una de las mutaciones de aminoácidos tratadas anteriormente.
La secuencia de aminoácidos de la inmunoglobulina humana también puede variar del tipo natural teniendo una o más mutaciones características de un determinante alotípico conocido. La tabla 2 muestra los determinantes alotípicos de la región constante de la IgG\gamma1 humana (Putman, "The Plasma Proteins", Vol. V, páginas 49 a 140 (Academic Press, Inc. 1957)). Las posiciones del índice EU 214, 356, 358 y 431 definen los alotipos de IgG\gamma1 conocidos. La posición 214 está en el dominio C_{H1} de la región constante de la IgG\gamma1 y, por tanto, no reside en la secuencia de Fc. La secuencia de Fc de tipo natural de la SEC ID N.º 6 incluye los alotipos Glm(1) y Glm(2-). Sin embargo, se puede modificar el resto de Fc de una proteína TACI-Fc para que refleje cualquier combinación de estos alotipos.
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TABLA 2
4
Los ejemplos de proteínas de TACI-Fc revelados en la presente memoria comprenden regiones constantes de la IgG1 humana. Sin embargo, los restos de inmunoglobulina adecuados también incluyen polipéptidos que comprenden, al menos, una región constante, tal como una región constante de una cadena pesada de cualquiera de las siguientes inmunoglobulinas: IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE e IgM. Ventajosamente, los restos de inmunoglobulina derivados de la IgG2 de tipo natural o de la IgG4 de tipo natural ofrecen una función efectora reducida en comparación con la IgG1 de tipo natural o la IgG3 de tipo natural. La presente memoria describe las proteínas de fusión que comprenden un resto de receptor TACI, según lo descrito anteriormente, y bien albúmina o \beta2-macroglobulina.
Otro tipo de proteína de fusión de receptor que se une con ZTNF2 o ZTNF24 es una proteína de fusión de BCMA-inmunoglobulina. Se han realizado estudios con una proteína de fusión de BCMA-Fc4 en la que el resto de BCMA consta de los residuos de aminoácido 1 a 48 de la SEC ID N.º 27. Sorprendentemente, los estudios farmacocinéticos realizados en ratones revelaron que la proteína de fusión de BCMA-Fc4 resultó tener una vida media de aproximadamente 101 horas, mientras que una proteína TACI-Fc resultó tener una vida media de 25 horas. Por ende, puede ser preferible la administración de una proteína de fusión de BCMA-inmunoglobulina en ciertos entornos clínicos. Además, la combinación de las proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina y de BCMA-inmunoglobulina puede ser ventajosa para tratar ciertas afecciones. Esta terapia de combinación se puede realizar mediante la administración de las proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina y de BCMA-inmunoglobulina, o mediante la administración de heterodímeros de las proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina y BCMA-inmunoglobulina.
Otro tipo de proteína de fusión de receptor que se une con ZTNF4 es una proteína de fusión de inmunoglobulina que comprende un dominio extracelular de un receptor denominado "Ztnfr12". Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de Ztnfr12 se proporcionan como la SEC ID N.º 59 y la SEC ID N.º 60, respectivamente. Los restos de receptor Ztnfr12 incluyen los polipéptidos que comprenden los residuos de aminoácido 1 a 69 de la SEC ID N.º 60 o los residuos de aminoácido 19 a 35 de la SEC ID N.º 60.
Las proteínas de fusión de la presente invención pueden tener la forma de polipéptidos monocatenarios, dímeros, trímeros o múltiplos de dímeros o de trímeros. Los dímeros pueden ser homodímeros o heterodímeros, y los trímeros pueden ser homotrímeros o heterotrímeros. Los ejemplos de heterodímeros incluyen un polipéptido TACI-inmunoglobulina con un polipéptido de BCMA-inmunoglobulina, un polipéptido TACI-inmunoglobulina con un polipéptido de Ztnfr12-immunoglobulina y un polipéptido de BCMA-inmunoglobulina con un polipéptido de Ztnfr12-immunoglobulina. Los ejemplos de heterodímeros incluyen un polipéptido TACI-inmunoglobulina con dos polipéptidos de BCMA-inmunoglobulina, un polipéptido TACI-inmunoglobulina con dos polipéptidos de Ztnfr12-immunoglobulina, un polipéptido de BCMA-inmunoglobulina con dos polipéptidos de Ztnfr12-immunoglobulina, dos polipéptidos TACI-inmunoglobulina con un polipéptido de BCMA-inmunoglobulina, dos polipéptidos TACI-inmunoglobulina con un polipéptido de Ztnfr12-immunoglobulina, dos polipéptidos de BCMA-inmunoglobulina con un polipéptido de Ztnfr12-immunoglobulina y un trímero de un polipéptido TACI-inmunoglobulina, un polipéptido de BCMA-inmunoglobulina y un polipéptido de Ztnfr12-immunoglobulina.
En tales proteínas de fusión, el resto de receptor TACI puede constar de la siguiente secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º 2: los residuos de aminoácido 30 a 154. El resto de receptor BCMA puede comprender, al menos, una entre las siguientes secuencias de aminoácidos de SEC ID N.º 27: los residuos de aminoácido 1 a 48, los residuos de aminoácido 8 a 41 y los residuos de aminoácido 21 a 37. El resto de receptor Ztnfr12 puede comprender, al menos, una entre las siguientes secuencias de aminoácidos de SEC ID N.º 60: los residuos de aminoácido 1 a 69 y los residuos de aminoácido 19 a 35.
Se pueden producir proteínas de fusión usando los procedimientos de PCR usados para construir las moléculas de TACI-Fc ilustrativas que se describen en los ejemplos. Sin embargo, los expertos en la técnica pueden usar otros enfoques estándar. Por ejemplo, se pueden obtener moléculas de ácido nucleico que codifiquen los polipéptidos TACI, BCMA, Ztnfrl2 o inmunoglobulina rastreando bancos de ADNc humano o genotecas usando sondas de polinucleótido basadas en las secuencias reveladas en la presente memoria. Estas técnicas son estándar y están bien establecidas (véase, por ejemplo, Ausubel et al. (eds.), "Short Protocols in Molecular Biology", III Edición, páginas 4-1 a 4-6 (John Wiley & Sons 1995) ("Ausubel (1995)"); Wu et al., "Methods in Gene Biotechnology", páginas 33-41 (CRC Press, Inc. 1997) ("Wu (1997)"); Ausubel (1995) en las páginas 5-1 a 5-6; Wu (1997) en las páginas 307-327)).
Alternativamente, se pueden obtener moléculas para construir proteínas de fusión de inmunoglobulina sintetizando moléculas de ácido nucleico mediante el uso de oligonucleótidos largos que se ceban mutuamente y las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria (véase, por ejemplo, Ausubel (1995) en las páginas 8-8 a 8-9). Las técnicas establecidas que usan la reacción en cadena de la polimerasa proporcionan la capacidad de sintetizar moléculas de ADN de una longitud de, al menos, dos kilobases (Adang et al., Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993), Bambot et al., "PCR Methods and Applications" 2:266 (1993), Dillon et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes" en "Methods in Molecular Biology", Vol. 15: "PCR Protocols: Current Methods and Applications", White (ed.), páginas 263-268, (Humana Press, Inc. 1993) y Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299 (1995)).
Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención también pueden ser sintetizadas con "máquinas de genes" usando protocolos tales como el procedimiento de la fosforamidita. Si se requiere ADN bicatenario sintetizado químicamente para una aplicación tal como la síntesis de un gen o de un fragmento de gen, entonces se forma cada cadena complementaria por separado. La producción de genes cortos (60 a 80 pares de bases) es sencilla técnicamente y se puede realizar sintetizando las cadenas complementarias y luego apareándolas. Para la producción de los genes más largos (>300 pares de bases), sin embargo, pueden ser necesarias estrategias especiales, porque la eficacia del acoplamiento de cada ciclo durante la síntesis de ADN químico es casi del 100%. Para solucionar este problema, los genes sintéticos (bicatenarios) son ensamblados de forma modular a partir de fragmentos monocatenarios que son de 20 a 100 nucleótidos de longitud. Para más información sobre la síntesis de polinucleótidos, véase, por ejemplo, Glick y Pasternak, "Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA" (ASM Press 1994), Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984) y Climie et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EE.UU. 87:633 (1990).
4. Producción de polipéptidos TACI-inmunoglobulina
Los polipéptidos de la presente invención se pueden producir en células huésped recombinantes siguiendo técnicas convencionales. Para expresar una secuencia que codifica TACI-inmunoglobulina, se debe ligar operativamente una molécula de ácido nucleico que codifique el polipéptido con secuencias reguladoras que controlen la expresión de la transcripción en un vector de expresión y, luego, introducirla en una célula huésped. Además de las secuencias reguladoras de la transcripción, tales como promotores y potenciadores, los vectores de expresión pueden incluir secuencias reguladoras de la traducción y un gen marcador que sea adecuado para la selección de células que porten el vector de expresión.
Los vectores de expresión que son adecuados para la producción de una proteína foránea en células eucariotas contienen comúnmente (1) elementos de ADN procariota que codifican un origen de replicación bacteriano y un marcador de la resistencia a un antibiótico para proporcionar el crecimiento y la selección del vector de expresión en un huésped bacteriano; (2) elementos de ADN eucariota que controlan el inicio de la transcripción, tales como un promotor; y (3) elementos de ADN que controlan el procesamiento de los transcriptos, tales como una secuencia de terminación de la transcripción/poliadenilación.
Los vectores de expresión también pueden incluir secuencias de nucleótidos que codifiquen una secuencia secretora que dirija al polipéptido heterólogo hacia la ruta secretora de una célula huésped. Por ejemplo, un vector de expresión puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifique TACI-inmunoglobulina y una secuencia secretora derivada de cualquier gen secretado. Según lo tratado anteriormente, una secuencia señal adecuada es una secuencia señal tPA. La SEC ID N.º 25 proporciona un ejemplo de secuencia señal tPA. Otra secuencia señal adecuada es una secuencia señal de la V_{H} del 26-10 murino. El anticuerpo 26-10 murino es descrito, por ejemplo, por Near et al., Mol. Immunol. 27:901 (1990). Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos ilustrativas de la secuencia señal de la V_{H} de 26-10 murino son proporcionadas por la SEC ID N.º 61 y la SEC ID N.º 65, respectivamente. La SEC ID N.º 62 revela la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión de TACI-Fc5 que comprende una secuencia señal de la V_{H} de 26-10 murino.
Las proteínas TACI-inmunoglobulina de la presente invención pueden estar expresadas en células de mamífero. Los ejemplos de células huésped de mamífero adecuadas incluyen células de riñón de mono verde africano (Vero; ATCC CRL 1587), células de riñón embrionario humano (293-HEK; ATCC CRL 1573), células de riñón de hámster neonato (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), células de riñón canino (MDCK; ATCC CCL 34), células de ovario de hámster chino (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44 (Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)), células pituitarias de rata (GH1; ATCC CCL82), células HeLa S3 (ATCC CCL2.2), células de hepatoma de rata (H-4-II-E; ATCC CRL 1548), células de riñón de mono transformadas con el SV40 (COS-1; ATCC CRL 1650) y células embrionarias murinas (NIH-3T3; ATCC CRL 1658).
Para un huésped mamífero, las señales reguladoras de la transcripción y de la traducción pueden tener un origen vírico, tal como de adenovirus, virus del papiloma bovino, virus de simio o similares, en el que las señales reguladoras están asociadas con un determinado gen que tiene un nivel de expresión elevado. Las secuencias reguladoras de la transcripción y de la traducción también se pueden obtener de genes de mamífero, tales como genes de actina, de colágeno, de miosina y de metalotioneína.
Las secuencias reguladoras de la transcripción incluyen una región promotora suficiente para dirigir el inicio de la síntesis de ARN. Los promotores eucariotas adecuados incluyen el promotor del gen de la metaloteoneína I de ratón (Harner et al., J. Molec. Appl. Genet. 1:273 (1982)), el promotor TK del virus Herpes (McKnight, Cell 31:355 (1982)), el promotor temprano del SV40 (Benoist et al., Nature 290:304 (1981)), el promotor del virus del sarcoma de Rous (Gorman et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EE.UU. 79:6777 (1982)), el promotor del citomegalovirus (Foecking et al., Gene 45:101 (1980)) y el promotor del virus del tumor de mama de ratón (véase, en general, Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture", en "Protein Engineering: Principles and Practice", Cleland et al. (eds.), páginas 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)). El promotor del virus del sarcoma mieloproliferativo y el potenciador del citomegalovirus humano proporcionan una combinación útil de un promotor y un potenciador.
Alternativamente, se puede usar un promotor procariota, tal como el promotor de la ARN polimerasa del bacteriófago T3, para controlar la producción de proteínas TACI-inmunoglobulina en células de mamífero si el promotor procariota está regulado por un promotor eucariota (Zhou et al., Mol. Cell. Biol. 10:4529 (1990) y Kaufman et al., Nucl. Acids. Res. 19:4485 (1991)).
Se puede introducir un vector de expresión en células huésped usando una variedad de técnicas estándar que incluyen la transfección mediante fosfato de calcio, la transfección mediada por liposomas, la administración mediada por microproyectiles, la electroporación y similares. Las células transfectadas se pueden seleccionar y propagar para proporcionar células huésped recombinantes que comprendan el vector de expresión integrado establemente en el genoma de las células huésped. Las técnicas para introducir vectores en células eucariotas y las técnicas para seleccionar tales transformantes estables usando un marcador seleccionable dominante están descritas, por ejemplo, por Ausubel (1995) y por Murray (ed.), "Gene Transfer and Expression Protocols" (Humana Press 1991).
Por ejemplo, un marcador seleccionable adecuado es un gen que proporciona resistencia al antibiótico neomicina. En este caso, la selección se lleva a cabo en presencia de un fármaco del tipo de la neomicina, tal como G-418 o uno similar. También se pueden usar sistemas de selección para aumentar el nivel de expresión del gen de interés, procedimiento que se denomina "amplificación". La amplificación se lleva a cabo mediante el cultivo de transfectantes en presencia de un nivel bajo del agente selectivo y, luego, mediante el aumento de la cantidad del agente selectivo para seleccionar células que produzcan niveles elevados de los productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionable amplificable adecuado es la dihidrofolato-reductasa, que confiere resistencia al metotrexato. También se pueden usar otros genes de resistencia a otros fármacos (p. ej, de resistencia a la higromicina, de resistencia a múltiples fármacos, de la puromicina-acetiltransferasa). Alternativamente, se pueden usar marcadores que introduzcan un fenotipo modificado, tal como proteína verde fluorescente, o proteínas de la superficie celular, tales como CD4, CD8, MHC de clase I, fosfatasa alcalina de placenta, para diferenciar las células transfectadas de las células no transfectadas mediante procedimientos como la clasificación FACS o la tecnología de separación mediante perlas
magnéticas.
También se pueden producir polipéptidos TACI-inmunoglobulina mediante células de mamífero cultivadas usando un sistema de administración vírico. Los ejemplos de virus útiles a tal efecto incluyen adenovirus, virus del herpes, virus Vaccinia y virus adenoasociados (AAV, Adeno-Associated Virus). El adenovirus, un virus de ADN bicatenario, es actualmente el vector de transferencia génica mejor estudiado para la administración de ácido nucleico heterólogo (para más información, véase Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994) y Douglas y Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)). Las ventajas del sistema de adenovirus incluyen el alojamiento de insertos de ADN relativamente largos, la capacidad para crecer hasta títulos elevados, la capacidad para infectar una gran selección de tipos de células de mamífero y la flexibilidad que permite su uso con un gran número de vectores disponibles que contienen diferentes promotores.
Mediante la eliminación de partes del genoma del adenovirus, se pueden alojar insertos más largos (de hasta 7 kb) del ADN heterólogo. Estos insertos pueden ser incorporados en el ADN vírico mediante la unión directa o mediante la recombinación homóloga con un plásmido cotransfectado. Una opción es la de eliminar el gen E1 esencial del vector vírico, lo que da como resultado la incapacidad para replicarse a no ser que el gen E1 sea proporcionado por la célula huésped. Se pueden cultivar, por ejemplo, células 293 humanas infectas con un vector de adenovirus (N.º ATCC CRL-1573, 45504, 45505) como células adherentes o en cultivo en suspensión a una densidad de células relativamente elevada para producir cantidades significativas de proteína (véase Garnier et al., Cytotechnol. 15:145 (1994)).
Los expertos en la técnica pueden crear vectores de expresión adecuados para producir las proteínas de fusión descritas en la presente memoria con células de mamífero. El ejemplo 4 describe características de un vector de expresión. Como otro ejemplo, un vector de expresión puede comprender un casete de expresión bicistrónico que incluye una parte del potenciador del citomegalovirus humano, el promotor del virus del sarcoma mieloproliferativo, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión, los sitios de entrada ribosómicos internos del poliovirus, una secuencia de nucleótidos que codifica la dihidrofolato-reductasa murina, seguida por la secuencia de adición de poli(A) del SV40. La secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 69 muestra un constructo de potenciador de citomegalovirus/promotor de la LTR del virus del sarcoma mieloproliferativo, en el que el potenciador del citomegalovirus se extiende del nucleótido 1 al 407. El promotor de la LTR del virus del sarcoma mieloproliferativo, con la región de control negativo ausente, se extiende del nucleótido 408 al nucleótido 884 de la SEC ID N.º 69. La SEC ID N.º 70 proporciona una secuencia de nucleótidos para el promotor de la LTR del virus del sarcoma mieloproliferativo sin la región de control negativo.
El ejemplo 1 describe un vector de expresión que comprende un promotor del citomegalovirus para dirigir la expresión del transgén de proteína recombinante, un intrón de una inmunoglobulina y una secuencia señal del activador tisular del plasminógeno. Un intrón de inmunoglobulina adecuado es un intrón de la V_{H} del 26-10 murino. La SEC ID N.º 66 proporciona una secuencia de nucleótidos ilustrativa de un intrón de la V_{H} del 26-10 murino. Un vector de expresión también puede incluir una región no traducida 5' (UTR, Untranslated Region) ubicada secuencia arriba de la secuencia de nucleótidos que codifique una proteína TACI-inmunoglobulina. Una 5'-UTR adecuada puede derivar del gen de la V_{H} del 26-10 murino. La SEC ID N.º 63 revela la secuencia de nucleótidos de una 5'-UTR de la V_{H} del 26-10 murino nativa útil, mientras que la SEC ID N.º 64 muestra la secuencia de nucleótidos de una 5'-UTR de la V_{H} del 26-10 murino, que ha sido optimizada en el extremo 3'.
A modo de ilustración, la SEC ID N.º 67 proporciona una secuencia de nucleótidos que incluye los siguientes elementos: una 5'-UTR de la V_{H} del 26-10 murino nativa (nucleótidos 1 a 51), una secuencia señal de la V_{H} del 26-10 murino (nucleótidos 52 a 97 y 182 a 192), un intrón de la V_{H} del 26-10 murino (nucleótidos 98 a 181), una secuencia de nucleótidos que codifica un resto de TACI (nucleótidos 193 a 435) y una secuencia de nucleótidos que codifica un resto de Fc5 (nucleótidos 436 a 1.131). La secuencia de nucleótidos de la SEC ID N.º 68 difiere de la SEC ID N.º 67 debido a la sustitución de una 5'-UTR de la V_{H} del 26-10 murino optimizada (nucleótidos 1 a 51) por la secuencia nativa.
Las proteínas TACI-inmunoglobulina también se pueden expresar en otras células eucariotas superiores, tales como células de ave, de hongo, de insecto, de levadura o vegetales. El sistema de baculovirus proporciona un medio eficaz para introducir genes clonados en células de insectos. Los vectores de expresión adecuados se basan en el virus de la polihedrosis nuclear múltiple de Autographa californica (AcMNPV) y contienen promotores conocidos, tales como el promotor 70 de la proteína del choque térmico (hsp) de Drosophila, el promotor del gen inmediato-temprano del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (ie-1) y el promotor temprano retardado de 39K, el promotor del baculovirus p10 y el promotor de la metalotioneína de Drosophila. Un segundo procedimiento para fabricar baculovirus recombinantes utiliza un sistema basado en transposones descrito por Luckow (Luckow, et al., J. Virol. 67:4566 (1993)). Este sistema, que utiliza vectores de transferencia, se comercializa en el equipo BAC-to-BAC (Life Technologies, Rockville, MD). Este sistema utiliza un vector de transferencia, PFASTBAC (Life Technologies), que contiene un transposón Tn7 para mover el ADN que codifica el polipéptido TACI-inmunoglobulina al genoma del baculovirus mantenido en E. coli como un gran plásmido denominado "bácmido". Véase Hill-Perkins y Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994), y Chazenbalk y Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995). Además, los vectores de transferencia pueden incluir una fusión en marco con ADN que codifica una etiqueta epitópica en el terminal C o N del polipéptido TACI-inmunoglobulina, por ejemplo, una etiqueta epitópica Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 82:7952 (1985). Usando una técnica conocida en la técnica, se transforma un vector de transferencia que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína TACI-inmunoglobulina en E. coli y se rastrea en busca de bácmidos que contengan un gen lacZ interrumpido indicador del baculovirus recombinante. El ADN de bácmido que contiene el genoma de baculovirus recombinante es entonces aislado usando técnicas comunes.
El vector PFASTBAC ilustrativo se puede modificar hasta un grado considerable. Por ejemplo, se puede retirar el promotor de la polihedrina y sustituirlo por el promotor de la proteína básica del baculovirus (también conocido como promotor Pcor, p6.9 o MP) que es expresado antes en la infección del baculovirus y del que se ha observado que es ventajoso para expresar proteínas secretadas (véase, por ejemplo, Hill-Perkins y Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994) y Chazenbalk y Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995)). En tales constructos de vectores de transferencia, se puede usar una versión corta o larga del promotor de la proteína básica. Además, se pueden construir vectores de transferencia con las secuencias señal secretoras derivadas de proteínas de insectos. Por ejemplo, se puede usar en tales constructos una secuencia señal secretora de la Ecdisteroide glucosiltransferasa (EGT), la melitina de abeja de miel (Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA) o el baculovirus gp67 (PharMingen: San Diego, CA).
El virus recombinante o bácmido se usa para transfectar células huésped. Las células huésped de insectos adecuadas incluyen líneas celulares derivadas de IPLB-Sf-21, una línea celular de ovario de pupas de Spodoptera frugiperda, tal como Sf9 (ATCC CRL 1711), Sf21AE y Sf21 (Invitrogen Corporation; San Diego, CA), así como células Schneider-2 de Drosophila y la línea celular HIGH FIDEO (Invitrogen) derivada de Trichoplusia ni (Patente estadounidense n.º 5.300.435). Se pueden usar medios libres de suero comercialmente disponibles para desarrollar y mantener las células. Los medios adecuados son II^{TM} de Sf900 (Life Technologies) o 921^{TM} de ESF (Expression Systems) para las células Sf9; y Ex-cellO405^{TM} (JRH Biosciences, Lenexa, KS) o Express FiveO^{TM} (Life Technologies) para las células de T. ni. Cuando se usa virus recombinante, las células se desarrollan comúnmente de una densidad de inoculación de aproximadamente 2-5 x 10^{5} células hasta una densidad de 1-2 x 10^{6} células, momento en el cual se añade una reserva vírica recombinante a una multiplicidad de infección (MdI) de 0,1 a 10, más comúnmente a casi 3.
Las técnicas establecidas para producir proteínas recombinantes en sistemas de baculovirus son proporcionadas por Bailey et al., "Manipulation of Baculovirus Vectors" en Methods in Molecular Biology, Volumen 7: "Gene Transfer and Expression Protocols", Murray (ed.), páginas 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991), por Patel et al., "The baculovirus expression system" en DNA Cloning 2: Expression Systems, II edición, Glover et al. (eds.), páginas 205-244 (Oxford University Press 1995), por Ausubel (1995) en las páginas 16-37 a 16-57, por Richardson (ed.), "Baculovirus Expression Protocols" (The Humana Press, Inc. 1995) y por Lucknow, "Insect Cell Expression Technology" en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996).
También se pueden usar células de hongos, incluyendo células de levaduras, para expresar los genes descritos en la presente memoria. Las especies de levaduras de particular interés a este respecto incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Pichia methanolica. Los promotores adecuados para la expresión en levaduras incluyen promotores de GAL1 (galactosa), PGK (fosfoglicerato cinasa), ADH (alcohol deshidrogenasa), AOX1 (alcohol oxidasa), HIS4 (histidinol deshidrogenasa) y similares. Se han diseñado muchos vectores de clonación de levadura y se pueden obtener fácilmente. Es posible diseñar un vector para generar constructos que utilicen los elementos necesarios para llevar a cabo una recombinación homóloga en levadura (véase, por ejemplo, Raymond et al., BioTechniques 26:134 (1999)). Por ejemplo, tal vector de expresión puede incluir secuencias de URA3 y CEN-ARS (Autonomously Replicating Sequence, secuencia de replicación autónoma) necesarias para la selección y la replicación en S. cerivisiae. Otros vectores adecuados incluyen vectores basados en YIp, tales como YIp5, vectores basados en YRp, tales como YRp17, vectores basados en YEp, tales como YEp13 y vectores basados en YCp, tales como YCp19. Los procedimientos para transformar células de S. cerevisiae con ADN exógeno y producir polipéptidos recombinantes a partir de estas células son revelados por, por ejemplo, Kawasaki, patente estadounidense n.º 4.599.311, Kawasaki et al., patente estadounidense n.º 4.931.373, Brake, patente estadounidense n.º 4.870.008, Welch et al., patente estadounidense n.º 5.037.743 y Murray et al., patente estadounidense n.º 4.845.075. Las células transformadas son seleccionadas por el fenotipo determinado por el marcador seleccionable, comúnmente, la resistencia a un fármaco o la capacidad para desarrollarse en ausencia de un determinado nutriente (p. ej., leucina). Un sistema vectorial adecuado para su uso en Saccharomyces cerevisiae es el sistema vectorial POT1 revelado por Kawasaki et al. (Patente estadounidense n.º 4.931.373), que permite la selección de células transformadas mediante su crecimiento en medios que contienen glucosa. Otros promotores y terminadores adecuados para su uso en levadura incluyen aquéllos de genes de enzimas glicolíticas (véase, p. ej., Kawasaki, patente estadounidense n.º 4.599.311, Kingsman et al., patente estadounidense n.º 4.615.974 y Bitter, patente estadounidense n.º 4.977.092 y genes de la alcohol deshidrogenasa. Véanse también las patentes estadounidenses n.º 4.990.446, 5.063.154, 5.139.936 y 4.661.454.
En la técnica se conocen sistemas de transformación para otras levaduras, que incluyen Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii y Candida maltosa. Véase, por ejemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986) y Cregg, Patente estadounidense n.º 4.882.279. Se Pueden utilizar células de Aspergillus según los procedimientos de McKnight et al., patente estadounidense n.º 4.935.349. Los procedimientos para transformar Acremonium chrysogenum son revelados por Sumino et al, Patente estadounidense n.º 5.162.228. Lambowitz, patente estadounidense n.º 4.486.533, revela procedimientos para transformar Neurospora.
Por ejemplo, el uso de Pichia methanolica como huésped para la producción de proteínas recombinantes es revelado por Raymond, patente estadounidense 5.716.808, Raymond, patente estadounidense n.º 5.736.383, Raymond et al., Yeast 14:11-23 (1998) y en las publicaciones internacionales n.º WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 y WO 98/02565. Las moléculas de ADN para su uso en la transformación de P. methanolica se prepararán comúnmente como plásmidos circulares bicatenario, que serán preferiblemente linealizados antes de su transformación. Para la producción de polipéptidos en P. methanolica, el promotor y el terminador del plásmido pueden ser los del gen de P. methanolica, tales como el gen de utilización del alcohol de P. methanolica (AUG1 o AUG2). Otros promotores útiles incluyen aquéllos de los genes de la dihidroxiacetona sintasa (DHAS), de la formiato deshidrogenasa (FMD) y de la catalasa (CAT). Para facilitar la integración del ADN en el cromosoma del huésped, es preferible tener el segmento de expresión entero del plásmido flanqueado por ambos extremos por las secuencias de ADN del huésped. Un marcador seleccionable adecuado para su uso en Pichia methanolica es un gen ADE2 de P. methanolica, que codifica la fosforibosil-5-aminoimidazol carboxilasa (AIRC; EC 4.1.1.21) y que permite el crecimiento de las células huésped de ade2 en ausencia de adenina. Para los procedimientos industriales a gran escala en los que es deseable minimizar el uso del metanol, se pueden usar células huésped en las que se hayan eliminado ambos genes de utilización del metanol (AUG1 y AUG2). Para la producción de proteínas secretadas, las células huésped pueden ser deficientes en genes de proteasa vacuolar (PEP4 y PRB1). La electroporación se usa para facilitar la introducción de un plásmido que contiene ADN que codifica un polipéptido de interés en células de P. methanolica. Las células de P. methanolica se pueden transformar mediante electroporación usando un campo eléctrico pulsado decreciente exponencialmente que tenga una fuerza de 2,5 a 4,5 kV/cm, preferiblemente de aproximadamente 3,75 kV/cm y una constante de tiempo (t) de 1 a 40 milisegundos, lo más preferible, de aproximadamente 20
milisegundos.
También se pueden introducir vectores de expresión en protoplastos vegetales, tejidos vegetales intactos o células vegetales aisladas. Los procedimientos para introducir vectores de expresión en tejido vegetal incluyen la infección directa o el cocultivo del tejido vegetal con Agrobacterium tumefaciens, la administración mediada con microproyectiles, la inyección de ADN, la electroporación y similares. Véase, por ejemplo, Horsch et al., Science 227:1229 (1985), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992) y Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (eds.), páginas 67-88 (CRC Press, 1993).
Alternativamente, las proteínas TACI-inmunoglobulina pueden ser producidas en células huésped procariotas. Los promotores adecuados que se pueden usar para producir polipéptidos TACI-inmunoglobulina en un huésped procariota son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen promotores capaces de reconocer las polimerasas de T4, T3, Sp6 y T7, los promotores P_{R} y P_{L} del bacteriófago Lambda, los promotores trp, recA, de choque térmico, lacUV5, tac, lpp-lacSpr, phoA y lacZ de E. coli, los promotores de B. subtilis, los promotores de los bacteriófagos de Bacillus, los promotores de Streptomyces, el promotor int del bacteriófago Lambda, el promotor bla de pBR322 y el promotor CAT del gen de la cloranfenicol acetilo transferasa. Los promotores procariotas han sido revisados por Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987), Watson et al., "Molecular Biology of the Gene", IV Ed. (Benjamin Cummins 1987) y por Ausubel et al. (1995).
Los huéspedes procariotas adecuados incluyen E. coli y Bacillus subtilus. Las cepas de E. coli adecuadas incluyen BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21 (DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451 y ER1647 (véase, por ejemplo, Brown (ed.), "Molecular Biology Labfax" (Academic Press 1991)). Las cepas adecuadas de Bacillus subtilus incluyen BR151, YB886, MI119, MI120 y B170 (véase, por ejemplo, Hardy, "Bacillus Cloning Methods" en DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)).
Cuando se expresa una proteína TACI-inmunoglobulina en bacterias tales como E. coli, el polipéptido puede ser retenido en el citoplasma, comúnmente, como gránulos insolubles, o puede ser dirigido al espacio periplásmico por una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, las células son lisadas y los gránulos son recubiertos y desnaturalizados usando, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. Entonces se puede volver a plegar el polipéptido desnaturalizado y dimerizarlo diluyendo el desnaturalizante, tal como mediante diálisis frente a una solución de urea y una combinación de glutationa reducida y oxidada, seguida por la diálisis frente a una solución salina tamponada. En el último caso, es posible recuperar el polipéptido del espacio periplásmico en forma soluble y funcional ejerciendo un efecto sobre las células (mediante, por ejemplo, un tratamiento de ultrasonidos o un choque osmótico) para liberar los contenidos del espacio periplásmico y recuperar la proteína, evitando así la necesidad de la desnaturalización y el replegamiento.
Los procedimientos para expresar proteínas en huéspedes procariotas son conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies" en DNA Cloning 2: Expression Systems, II edición, Glover et al. (eds.), página 15 (Oxford University Press 1995), Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies" en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995) y Georgiou, "Expression of Proteins in Bacteria" en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), página 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)).
Ausubel (1995) proporciona procedimientos estándar para introducir vectores de expresión en células bacterianas, de levadura, de insecto y vegetales.
Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture" en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996) proporcionan procedimientos generales para expresar y recuperar proteína foránea producida por un sistema celular de mamífero. Por ejemplo, Grisshammer et al., "Purification of over-produced proteins from E. coli cells" en DNA Cloning 2: Expression Systems, II edición, Glover et al. (eds.), páginas 59-92 (Oxford University Press 1995) proporcionan técnicas estándar para recuperar proteína producida por un sistema bacteriano. Richardson (ed.), "Baculovirus Expression Protocols" (The Humana Press, Inc. 1995) describe procedimientos establecidos para aislar proteínas recombinantes de un sistema de baculovirus.
Como alternativa, los polipéptidos de la presente invención se pueden sintetizar mediante la síntesis exclusiva en fase sólida, los procedimientos parciales en fase sólida, la condensación de fragmentos o la síntesis clásica de soluciones. Estos procedimientos de síntesis son conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963), Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (II edición), (Pierce Chemical Co. 1984), Bayer y Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986), Atherton et al., "Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach" (IRL Press 1989), Fields y Colowick, "Solid-Phase Peptide Synthesis" Methods in Enzymology Volumen 289 (Academic Press 1997) y Lloyd-Williams et al, "Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins" (CRC Press, Inc. 1997)). Las variaciones en las estrategias de síntesis química total, tales como "la unión química nativa" y la "unión de proteínas expresadas" también son estándar (véase, por ejemplo, Dawson et al., Science 266:776 (1994), Hackeng et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EE.UU. 94:7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol. 287: 34 (1997), Muir et al, Proc. Nat'l Acad. Sci. EE.UU. 95:6705 (1998) y Severinov y Muir, J. Biol. Chem. 273:16205 (1998)).
5. Análisis para proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina
Es posible examinar la función de las proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina usando una variedad de enfoques para medir la capacidad de las proteínas de fusión para unirse con ZTNF4 o con ZTNF2. A modo ilustrativo, el ejemplo 4 proporciona procedimientos para medir la afinidad y la capacidad de unión con ZTNF4.
Alternativamente, las proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina pueden ser caracterizadas por la capacidad para inhibir la estimulación de células B humanas por ZTNF4 soluble, según lo descrito por Gross et al., publicación internacional n.º WO00/40716. En síntesis, se aíslan células B humanas de células mononucleares de sangre periférica usando perlas magnéticas de CD19 y el sistema de separación magnética VarioMacs (Miltenyi Biotec Auburn, CA) según las instrucciones del fabricante. Se mezclan células B purificadas con ZTNF4 soluble (25 ng/ml) e IL-4 humana recombinante (10 ng/ml, Pharmingen) y se colocan las células en placas de 96 pocillos de fondo redondo a 1 x 10^{5} células por pocillo.
Las proteínas TACI-inmunoglobulina solubles se pueden diluir de aproximadamente 5 \mug/ml a aproximadamente 6 ng/ml, e incubarlas con las células B durante cinco días, emitiendo pulsaciones durante una noche el día cuatro con 1 \muCi de ^{3}H-timidina por pocillo. Como control, también se puede incubar proteína TACI-inmunoglobulina con células B e IL-4 sin ZTNF4. Las placas se cosechan usando un cosechador de placas de Packard y se realiza el recuento usando un lector de Packard.
Se usó este enfoque general para examinar tres proteínas de fusión de TACI-Fc. Aunque todas las proteínas de fusión inhibieron la proliferación de células B, los constructos TACI (d1-29, d111-154)-Fc5 y TACI (d1-29, d120-154)-Fc5 fueron más potentes que TACI (d1-29, d107-154)-Fc5.
Hay modelos animales bien establecidos disponibles para analizar la eficacia in vivo de las proteínas TACI-inmunoglobulina en ciertos estados patológicos. Por ejemplo, se pueden analizar las proteínas TACI-inmunoglobulina en un número de modelos animales de enfermedad autoinmune, tales como cepas congénitas de ratones MRL-lpr/lpr o NZB x NZW F1, que sirven como modelo del LES (lupus eritematoso sistémico). Tales modelos animales son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Cohen y Miller (Eds.), "Autoimmune Disease Models: A Guidebook" (Academic Press, Inc. 1994).
La descendencia de un cruce entre ratones negros de Nueva Zelanda (NZB) y ratones blancos de Nueva Zelanda (NZW) desarrolla una forma espontánea de LES que se asemeja mucho al LES en seres humanos. La descendencia de los ratones, conocida como NZBW, comienza a desarrollar auto-anticuerpos IgM frente a las células T a un mes de edad, y de los cinco a los siete meses de edad, los auto-anticuerpos frente al ADN son la inmunoglobulina dominante. La hiperactividad de las células B policlonales conduce a la sobre-producción de los auto-anticuerpos. La sedimentación de estos auto-anticuerpos, particularmente, de aquéllos dirigidos frente al ADN monocatenario, está asociada con el desarrollo de la glomerulonefritis, que se manifiesta clínicamente como proteinuria, azotemia y muerte a partir de una insuficiencia renal.
La insuficiencia de riñón es la causa principal de mortalidad en los ratones afectados de LES espontáneo y en la cepa NZBW, este procedimiento es crónico y obliterativo. La enfermedad es más rápida y grave en hembras que en machos, con una supervivencia media de sólo 245 días en comparación con los 406 días para los machos. Mientras que muchos de los ratones hembra serán sintomáticos (proteinuria) de los siete a los nueve meses de edad, algunos pueden ser mucho más jóvenes o más viejos cuando desarrollen los síntomas. La nefritis inmune mortal observada en los ratones NZBW es muy similar a la glomerulonefritis observada en el LES humano, lo que hace este modelo murino espontáneo muy atractivo para analizar los posibles agentes terapéuticos para el LES (Putterman y Naparstek, "Murine Models of Spontaneous Systemic Lupus Erythematosus" en Autoimmune Disease Models: A Guidebook, páginas 217-234 (Academic Press, Inc., 1994); Mohan et al., J. Immunol. 154:1470 (1995); y Daikh et al., J. Immunol. 159:3104 (1997)).
Según lo descrito por Gross et al, publicación internacional n.º WO00/40716, se pueden administrar las proteínas TACI-inmunoglobulina a ratones NZBW para controlar su efecto supresor sobre las células B durante un período de cinco semanas cuando, como media, se cree que la producción de auto-anticuerpos frente a las células B está a niveles elevados en los ratones NZBW. En síntesis, se pueden dividir 100 ratones (NZB x NZW)F_{1} hembra de 8 semanas de edad en seis grupos de 15 ratones. Antes del tratamiento, se analiza la proteína en orina de los ratones una vez al mes y se extrae sangre para CBC y el banco de suero. El suero se puede rastrear en cuanto a la presencia de auto-anticuerpos. Debido a que la proteinuria es el signo distintivo de la glomerulonefritis, se controlan los niveles de proteína en orina con una varilla medidora a intervalos regulares en el transcurso del estudio. El tratamiento puede comenzar cuando los ratones son de una edad de aproximadamente cinco meses. Los ratones reciben inyecciones intraperitoneales de sólo de vehículo (solución salina tamponada con fosfato) o de TACI-inmunoglobulina humana (proteína control) o de proteína TACI-inmunoglobulina (p. ej., de 20 a 100 \mug de proteína de prueba por dosis) tres veces a la semana durante cinco semanas.
La sangre se recoge dos veces durante el tratamiento y será recogida al menos dos veces después del tratamiento. Se determinan los valores de la varilla medidora de orina para la proteinuria y los pesos corporales cada dos semanas tras comenzar el tratamiento. Se recogen sangre, el valor de la varilla medidora de orina y el peso corporal en el momento de la eutanasia. Se dividen el bazo y el timo para un análisis de clasificación celular activada por fluorescencia y una histología. También se recogen glándulas salivales submandibulares, cadena de nódulos linfáticos mesentéricos, lóbulo de hígado con vesícula biliar, intestino ciego y grueso, estómago, intestino delgado, páncreas, riñón derecho, glándula suprarrenal, lengua con tráquea y esófago, corazón y pulmones para la histología.
Los modelos murinos para la encefalomielitis alérgica experimental se han usado como herramienta para investigar tanto los mecanismos de las enfermedades mediadas por el sistema inmunológico como los procedimientos de una posible intervención terapéutica. El modelo se asemeja a la esclerosis múltiple humana y produce una desmielinización como resultado de la activación de células T a neuroproteínas tales como la proteína básica mielina o la proteína proteolipídica. La inoculación con antígeno conduce a la inducción de CD4+, células T restringidas al MHC de clase II (Th1). Los cambios en el protocolo para la encefalomielitis alérgica experimental pueden producir variantes agudas, recidivas crónicas o de transferencia pasiva del modelo (Weinberg et al., J. Immunol. 162:1818 (1999); Mijaba et al., Cell. Immunol. 186:94 (1999); y Glabinski, Meth. Enzym. 288:182 (1997)).
Gross et al., publicación internacional n.º WO00/40716, describen un enfoque para evaluar la eficacia de las proteínas TACI-inmunoglobulina en la mejoría de los síntomas asociados con la encefalomielitis alérgica experimental. En síntesis, se administra una inyección subcutánea a 25 ratones PLxSJL F1 hembra (12 semanas de edad) de 125 \mug/ratón de antígeno (proteína proteolipídica de mielina, PLP, residuos 139-151), formulada en adyuvante completo de Freund. Se dividen los ratones en cinco grupos de cinco ratones. Se administran inyecciones intraperitoneales de toxina pertussis (400 ng) el día 0 y 2. Se administra a los grupos una dosis x 1, x 10 y x 100 de proteína TACI-inmunoglobulina, un grupo sólo recibirá vehículo y un grupo no recibirá tratamiento. La terapia de prevención comienza el día 0, la terapia de intervención comienza el día 7 o al aparecer los signos clínicos. Los signos de la enfermedad, la pérdida de peso y la parálisis, se manifiestan a los aproximadamente 10 a 14 días y duran aproximadamente una semana. Se analizan diariamente los animales recogiendo los pesos corporales y asignando una puntuación clínica correspondiente al grado de sus síntomas. Los signos clínicos de la encefalomielitis alérgica experimental aparecen a los 10 a 14 días de la inoculación y duran aproximadamente una semana. Al finalizar el estudio, se sacrifican todos los animales mediante sobredosis de gas y se les hace una necropsia. Se recogen el cerebro y la columna vertebral para la histología o se congelan para el análisis del ARNm. Se representan el peso corporal y los datos de puntuación clínica por individuo y por grupo.
En el modelo de artritis inducida por colágeno, los ratones desarrollan artritis inflamatoria crónica, que se asemeja mucho a la artritis reumatoide humana. Como la artritis inducida por colágeno comparte características inmunológicas y patológicas similares con la artritis reumatoide, éste se convierte en un modelo ideal para rastrear los posibles compuestos anti-inflamatorios humanos. Otra ventaja del uso del modelo de artritis inducida por colágeno es que los mecanismos de patogénesis son conocidos. Se han identificado los epítopos de células T y B en el colágeno de tipo II, y se han determinado diversos parámetros inmunológicos (hipersensibilidad de tipo retardado y anticuerpo frente al colágeno) e inflamatorios (citocinas, quimiocinas y enzimas degradantes de la matriz), y se pueden usar para medir la eficacia de los compuestos de prueba en los modelos (Wooley, Curr. Open. Rheum. 3:407 (1999); Williams et al., Immunol. 89:9784 (1992); Myers et al., Life Sci. 61:1861 (1997); y Wang et al., Immunol. 92:8955 (1995)).
Gross et al., publicación internacional n.º WO00/40716, describen un procedimiento para evaluar la eficacia de las proteínas TACI-inmunoglobulina en la mejoría de los síntomas asociados con la artritis inducida por colágeno. En síntesis, se dividen ratones DBA/1J macho de ocho semanas de edad (Jackson Labs) en grupos de cinco ratones/grupo y se les administran dos inyecciones subcutáneas de 50 a 100 \mul de 1 mg/ml de colágeno (de pollito o de origen bovino) a intervalos de tres semanas. Un control no recibe inyecciones de colágeno. La primera inyección está formulada en adyuvante completo de Freund y la segunda inyección está formulada en adyuvante incompleto de Freund. Se administra la proteína TACI-inmunoglobulina profilácticamente en o antes de la segunda inyección, o después de que el animal desarrolle una puntuación clínica de dos o más que dure al menos 24 horas. Los animales comienzan a mostrar síntomas de artritis tras la segunda inyección de colágeno, habitualmente, a las dos a tres semanas. Por ejemplo, se pueden administrar TACI-Fc, una proteína control, IgFc humana o solución salina tamponada con fosfato (vehículo) profilácticamente comenzando siete días antes de la segunda inyección (día -7). Las proteínas se pueden administrar a 100 \mug, tres veces a la semana como una inyección intraperitoneal de 200 \mul, y continuando durante cuatro semanas.
En el modelo de artritis inducida por colágeno, se evalúa el grado de la enfermedad en cada pata usando un calibrador para medir el grosor de la pata y asignando una puntuación clínica a cada pata. Por ejemplo, una puntuación clínica de "0" indica un ratón normal, una puntuación de "1" indica que hay uno o más dedos inflamados, una puntuación de "2" indica una inflamación suave de la pata, una puntuación de "3" indica una inflamación moderada de la pata y una puntuación de "4" indica una inflamación grave de la pata. Se sacrifican los animales una vez que la enfermedad se haya establecido durante un período establecido de tiempo, habitualmente, de siete días. Se extraen las patas para su histología o análisis del ARNm, y se extrae suero para los análisis de inmunoglobulina y citocina.
La miastenia grave es otra enfermedad autoinmune para la que hay modelos murinos disponibles. La miastenia grave es un trastorno de transmisión neuromuscular que implica la producción de auto-anticuerpos dirigidos frente al receptor de la acetilcolina nicotínica. Esta enfermedad es adquirida o heredada con características clínicas que incluyen una debilidad anormal y una fatiga al realizar ejercicio.
Se ha establecido un modelo murino de miastenia grave. (Christadoss et al., "Establishment of a Mouse Model of Myasthenia gravis Which Mimics Human Myasthenia gravid Pathogenesis for Immune Intervention" en Immunobiology of Proteins and Peptides VIII, Atassi y Bixler (Eds.), páginas 195-199 (1995)). La miastenia grave autoinmune experimental es una enfermedad mediada por anticuerpos caracterizada por la presencia de anticuerpos frente al receptor de la acetilcolina. Estos anticuerpos destruyen el receptor conduciendo a impulsos eléctricos neuromusculares defectuosos, dando como resultado una debilidad muscular. En el modelo de la miastenia grave autoinmune experimental, se inmunizan los ratones con el receptor de la acetilcolina nicotínica. Los signos clínicos de la miastenia grave se hacen evidentes semanas después de la segunda inmunización. La miastenia grave autoinmune experimental se evalúa mediante varios procedimientos que incluyen la medición de los niveles en suero de los anticuerpos frente al receptor de la acetilcolina mediante radioinmunanálisis (Christadoss y Dauphinee, J. Immunol. 136:2437 (1986); Lindstrom et al., Methods Enzymol. 74:432 (1981)), la medición del receptor de la acetilcolina muscular o la electromiografía (Coligan et al. (Eds.), Protocols in Immunology. Vol.3, página 15.8.1 (John Wiley & Sons, 1997)).
Se puede determinar el efecto de TACI-inmunoglobulina sobre la miastenia grave autoinmune experimental mediante la administración de proteínas de fusión cuando la miastenia grave clínica está en curso en ratones B6. Por ejemplo, se inmunizan 100 ratones B6 con 20 \mug de receptor de la acetilcolina en adyuvante completo de Freund los días 0 y 30. Aproximadamente del 40 al 60% de los ratones desarrollará una miastenia grave clínica moderada (grado 2) a severa (grado 3) tras volver a inmunizar con receptor de acetilcolina. Se dividen los ratones con enfermedad clínica de grado 2 y 3 en tres grupos (con grados iguales de debilidad) y se pesan (los ratones con debilidad también pierden peso, pues tienen dificultades en consumir alimento y agua) y se les extrae suero (para el nivel de isotipos y anticuerpos frente al receptor de la acetilcolina previos al tratamiento). Al grupo A se le inyecta I.P. solución salina tamponada con fosfato, al grupo B se le inyecta intraperitonealmente IgG-Fc humana como proteína control (100 \mug) y al grupo C se le inyectan 100 \mug de TACI-Fc tres veces a la semana durante cuatro semanas. Se rastrean los ratones en cuanto a la debilidad muscular clínica dos veces a la semana, y se pesan y se extrae suero a los 15 y 30 días del comienzo del tratamiento. Se recoge sangre entera el día 15 para determinar la proporción entre células T/B mediante un análisis de clasificación celular activada mediante fluorescencia usando los marcadores B220 y CD5. Se sacrifican los ratones supervivientes a los 30 a 45 días del inicio del tratamiento y se congelan los cuerpos de los animales muertos para una extracción posterior del receptor de la acetilcolina muscular para determinar la pérdida de receptor de acetilcolina muscular, la patología principal de la miastenia grave (véase, por ejemplo, Coligan et al. (Eds.), Protocols in Immunology. Vol. 3, página 15.8.1 (John Wiley & Sons, 1997)).
Los anticuerpos en suero frente al receptor de la acetilcolina muscular de los ratones se pueden determinar mediante un radioinmunoanálisis establecido, y los isotipos de los anticuerpos frente al receptor de la acetilcolina (IgM, IgG1, IgG2b y IgG2c) se miden mediante ELISA. Tales procedimientos son conocidos. Se determinan los efectos de TACI-inmunoglobulina sobre la miastenia grave clínica en curso, el nivel de anticuerpos e isotipos frente al receptor de la acetilcolina y la pérdida de receptor de la acetilcolina muscular.
Se pueden inmunizar aproximadamente 100 ratones con 20 \mug de receptor de la acetilcolina en adyuvante completo de Freund los días 0 y 30. Se dividen los ratones con miastenia grave clínica en cuatro grupos. Al grupo A se le inyectan intraperitonealmente 100 \mug de Fc control, al grupo B se le inyectan 20 \mug de Fc control, al grupo C se le inyectan 100 \mug de TACI-Fc y al grupo D se le inyectan 20 \mug de TACI-Fc tres veces a la semana durante cuatro semanas. Se pesan los ratones y se les extrae suero antes y a los 15 y 30 días del inicio del tratamiento. Se analiza el suero en cuanto al anticuerpo y los isotipos frente al receptor de la acetilcolina según lo descrito anteriormente. También se puede medir la pérdida de receptor de la acetilcolina muscular.
Los expertos en la técnica pueden determinar otros análisis adecuados de las proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina.
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6. Producción de conjugados de TACI-inmunoglobulina
La presente memoria describe composiciones de TACI-inmunoglobulina modificadas químicamente en las que un polipéptido TACI-inmunoglobulina está ligado con un polímero. Comúnmente, el polímero es hidrosoluble, tal que el conjugado de TACI-inmunoglobulina no precipite en un medio acuoso, tal como un medio fisiológico. Un ejemplo de un polímero adecuado es uno que haya sido modificado para tener un solo grupo reactivo, tal como un éster activo para la acilación o un aldehído para la alquilación. De este modo, se puede controlar el grado de polimerización. Un ejemplo de aldehído reactivo es el propionaldehído de polietilenglicol o monoalcoxiloC_{1}-C_{10}) o derivados de ariloxilo del mismo (véase, por ejemplo, Harries, et al., patente estadounidense n.º 5.252.714). El polímero puede estar ramificado o no ramificado. Además, se puede usar una mezcla de polímeros para producir conjugados de TACI-inmunoglobulina.
Los conjugados de TACI-inmunoglobulina usados para una terapia pueden comprender restos poliméricos hidrosolubles farmacéuticamente aceptables. Los polímeros hidrosolubles adecuados incluyen polietilenglicol (PEG), monometoxi-PEG, mono-alcoxi(C_{1}-C_{10})-PEG, ariloxi-PEG, poli(N-vinilpirrolidon)PEG, tresil-monometoxi-PEG, propionaldehído de PEG, bis-succinimidil-carbonato-PEG, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (p. ej., glicerol), alcohol polivinílico, dextrano, celulosa u otros polímeros basados en carbohidratos. Los PEG adecuados pueden tener un peso molecular de aproximadamente 600 a aproximadamente 60.000, incluyendo, por ejemplo, 5.000, 12.000, 20.000 y 25.000. Un conjugado de TACI-inmunoglobulina también puede comprender una mezcla de tales polímeros hidrosolubles.
Un ejemplo de un conjugado de TACI-inmunoglobulina comprende un resto de TACI-inmunoglobulina y un resto de óxido de polialquilo unido al terminal N de TACI-inmunoglobulina. El PEG es un óxido de polialquilo adecuado. A modo ilustrativo, el TACI-inmunoglobulina se puede modificar con PEG, procedimiento conocido como "PEGilación". La PEGilación de TACI-inmunoglobulina se puede llevar a cabo mediante cualquiera de las reacciones de PEGilación conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, el documento EP 0 154 316, Delgado et al., "Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems" 9:249 (1992), Duncan y Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27:290 (1994) y Francis et al., Int J Hematol 68:1 (1998)). Por ejemplo, se puede realizar la PEGilación mediante una reacción de acilación o mediante una reacción de alquilación con una molécula de polietilenglicol reactiva. En un enfoque alternativo, se forman conjugados de TACI-inmunoglobulina mediante la condensación de PEG activado, en el que se ha reemplazado un grupo amino o hidroxilo terminal del PEG por un ligador activado (véase, por ejemplo, Karasiewicz et al., patente estadounidense n.º 5.382.657).
La PEGilación mediante acilación requiere, por lo común, hacer reaccionar un derivado de éster activo de PEG con un polipéptido TACI-inmunoglobulina. Un ejemplo de un éster de PEG activado es el PEG esterificado en N-hidroxisuccinimida. Como se usa en la presente memoria, el término "acilación" incluye los siguientes tipos de enlaces entre TACI-inmunoglobulina y un polímero hidrosoluble: amida, carbamato, uretano y similares. Los procedimientos para preparar TACI-inmunoglobulina PEGilado mediante acilación comprenderán comúnmente las etapas de (a) hacer reaccionar un polipéptido TACI-inmunoglobulina con PEG (tal como un éster reactivo de un derivado de aldehído de PEG) en condiciones mediante las cuales uno o más grupos de PEG se unan con TACI-inmunoglobulina y (b) obtener el o los productos de reacción. Generalmente, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones de acilación serán determinadas en base a parámetros conocidos y según los resultados que se deseen obtener. Por ejemplo, cuanto mayor sea la proporción entre PEG:TACI-inmunoglobulina, mayor será el porcentaje de producto de TACI-inmunoglobulina poliPEGilado.
El producto de la PEGilación mediante acilación es, comúnmente, un producto de TACI-inmunoglobulina poliPEGilado, en el que los grupos \varepsilon-amino de la lisina están PEGilados mediante un grupo de unión acilo. Un ejemplo de enlace conector es una amida. Comúnmente, el TACI-inmunoglobulina resultante estará, al menos, un 95% mono-, di- o tri-pegilado, aunque se pueden formar algunas especies con grados más elevados de PEGilación en función de las condiciones de reacción. Es posible separar la especie PEGilada de los polipéptidos TACI-inmunoglobulina sin conjugar usando procedimientos de purificación estándar, tales como diálisis, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y similares.
La PEGilación mediante alquilación implica generalmente hacer reaccionar un derivado de aldehído terminal del PEG con TACI-inmunoglobulina en presencia de un agente reductor. Los grupos de PEG se pueden unir al polipéptido mediante un grupo -CH_{2}-NH.
La derivación mediante alquilación reductora para generar un producto monoPEGilado aprovecha la reactividad diferencial de los diferentes tipos de grupos amino primarios disponibles para la derivación. Comúnmente, la reacción se lleva a cabo a un pH que permite aprovechar las diferencias de pKa entre los grupos \varepsilon-amino de los residuos de lisina y el grupo \alpha-amino del residuo N-terminal de la proteína. Mediante tal derivación selectiva, se controla la unión de un polímero hidrosoluble que contiene un grupo reactivo, tal como un aldehído, con una proteína. La conjugación con el polímero tiene lugar predominantemente en el terminal N de la proteína sin una modificación significativa de otros grupos reactivos tales como los grupos amino de las cadenas laterales de los residuos de lisina. La presente invención proporciona una preparación sustancialmente homogénea de conjugados monopoliméricos de TACI-inmunoglobulina.
La alquilación reductora para producir una población sustancialmente homogénea de moléculas de conjugado de TACI-inmunoglobulina monopolimérico puede comprender las etapas de: (a) hacer reaccionar un polipéptido TACI-inmunoglobulina con un PEG reactivo en condiciones de alquilación reductora a un pH adecuado para permitir la modificación selectiva del grupo \alpha-amino del terminal amino de TACI-inmunoglobulina y (b) obtener el o los productos de reacción. El agente reductor usado para la alquilación reductora debería ser estable en solución acuosa y capaz de reducir sólo la base de Schiff formada en el procedimiento inicial de la alquilación reductora. Los agentes reductores ilustrativos incluyen borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, dimetilamin-borano, trimetilamin-borano y piridin-borano.
Para una población sustancialmente homogénea de conjugados de TACI-inmunoglobulina monopoliméricos, las condiciones de la reacción de alquilación reductora son aquéllas que permitan la unión selectiva del resto polimérico hidrosoluble con el terminal N de TACI-inmunoglobulina. Tales condiciones de reacción proporcionan generalmente diferencias de pKa entre los grupos amino de los residuos de lisina y el grupo \alpha-amino del terminal N. El pH también afecta a la proporción entre el polímero y la proteína que se vaya a usar. En general, si el pH es inferior, se deseará un mayor exceso de polímero frente a proteína, porque cuanto menos reactivo sea el grupo \alpha N-terminal, más polímero se necesita para alcanzar las condiciones óptimas. Si el pH es mayor, el polímero-TACI-inmunoglobulina no necesita ser tan grande, porque hay disponibles más grupos reactivos. Comúnmente, el pH estará en el intervalo de 3 a 9 o de 3 a 6.
Otro factor por considerar es el peso molecular del polímero hidrosoluble. Generalmente, cuanto más alto sea el peso molecular del polímero, menor será el número de moléculas poliméricas que podrán ser unidas a la proteína. Para las reacciones de PEGilación, el peso molecular más común es de aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 50 kDa, o de aproximadamente 12 kDa a aproximadamente 25 kDa. La proporción molar entre el polímero hidrosoluble y TACI-inmunoglobulina estará, generalmente, en el intervalo de 1:1 a 100:1. Comúnmente, la proporción molar entre el polímero hidrosoluble y TACI-inmunoglobulina será de 1:1 a 20:1 para la poliPEGilación y de 1:1 a 5:1 para la monoPEGilación.
Los procedimientos generales para producir conjugados que comprenden un polipéptido y restos poliméricos hidrosolubles son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Karasiewicz et al., patente estadounidense n.º 5.382.657, Greenwald et al., patente estadounidense n.º 5.738.846, Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996), Monkarsh et al., Anal. Biochem. 247:434 (1997)).
La presente invención contempla composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de fusión, según lo definido en las reivindicaciones, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo puede ser un vehículo orgánico o inorgánico convencional. Los ejemplos de vehículos incluyen agua, solución tampón, alcohol, propilenglicol, macrogol, aceite de sésamo, aceite de maíz y similares.
7. Aislamiento de polipéptidos TACI-inmunoglobulina
Los polipéptidos de la presente invención pueden ser purificados hasta al menos aproximadamente un 80% de pureza, hasta al menos aproximadamente un 90% de pureza, hasta al menos aproximadamente un 95% de pureza o más de un 95% de pureza con respecto a macromoléculas contaminantes, particularmente, otras proteínas y ácidos nucleicos, y libres de agentes infecciones y pirogénicos. Los polipéptidos de la presente invención también pueden ser purificados hasta un estado farmacéuticamente puro que tenga una pureza de más del 99,9%. En ciertas preparaciones, el polipéptido purificado está sustancialmente libre de otros polipéptidos, particularmente, de otros polipéptidos de origen animal.
Se pueden usar procedimientos de fraccionamiento y/o purificación convencional para obtener preparaciones de polipéptidos TACI-inmunoglobulina sintéticos y polipéptidos TACI-inmunoglobulina recombinantes purificados a partir de células huésped recombinantes. En general, se puede usar la precipitación en sulfato de amonio y la extracción mediante agentes ácidos o caotrópicos para el fraccionamiento de las muestras. Las etapas de purificación ejemplares pueden incluir la exclusión por tamaño con hidroxiapatita, FPLC y cromatografía en fase líquida de alta resolución de fase inversa. Los medios cromatográficos adecuados incluyen dextranos derivados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílices especializadas y similares. Son adecuados los derivados de PEI, DEAE, QAE y Q. Los ejemplos de medios cromatográficos incluyen aquellos medios derivados de grupos fenilo, butilo u octilo, tales como fenil-sefarosa FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octil-Sefarosa (Pharmacia) y similares; o resinas poliacrílicas, tales como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Los soportes sólidos adecuados incluyen perlas de vidrio, resinas basadas en sílice, resinas celulósicas, perlas de agarosa, perlas de agarosa entrecruzada, perlas de poliestireno, resinas de poliacrilamida entrecruzada y similares que sean insolubles en las condiciones en que vayan a ser usadas. Estos soportes se pueden modificar con grupos reactivos que permitan al unión de las proteínas por los grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o restos de hidrato de carbono.
Los ejemplos de químicas de acoplamiento incluyen la activación con bromuro de cianógeno, la activación con N-hidroxisuccinimida, la activación con epóxido, la activación con sulfhidrilo, la activación con hidrazina, y los derivados carboxilo y amino para las químicas de acoplamiento con carbodiimida. Estos y otros medios sólidos son conocidos y se usan ampliamente en la técnica, y se pueden obtener de proveedores comerciales. La selección de un determinado procedimiento para el aislamiento y la purificación de los polipéptidos es una cuestión de diseño rutinario y está determinada, en parte, por las propiedades del soporte seleccionado. Véase, por ejemplo, "Affinity Chromatography: Principles & Methods" (Pharmacia LKB Biotechnology 1988) y Doonan, "Protein Purification Protocols" (The Human Press 1996).
Los expertos en la técnica pueden crear otras variaciones en el aislamiento y la purificación de TACI-inmunoglobulina. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos frente a TACI o frente a Fc para aislar grandes cantidades de proteína mediante purificación por inmunoafinidad.
Los polipéptidos de la presente invención también pueden ser aislados mediante la explotación de determinadas propiedades. Por ejemplo, se puede usar una cromatografía de adsorción de iones metálicos inmovilizados (IMAC) para purificar las proteínas ricas en histidina, incluyendo aquéllas que comprenden etiquetas de polihistidina. En síntesis, primero se carga un gel con iones metálicos divalentes para formar un quelatado (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985)). Se adsorberán las proteínas ricas en histidina a esta matriz con afinidades diferentes, en función del ión metálico usad, y serán eluidas mediante elución competitiva, descendiendo el pH o el uso de agentes quelantes potentes. Otros procedimientos de purificación incluyen la purificación de proteínas glicosiladas mediante la cromatografía de afinidad a la lectina, cromatografía de la proteína A y cromatografía de intercambio iónico (M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol. 182:529 (1990)).
También se pueden preparar polipéptidos TACI-inmunoglobulina o fragmentos de los mismos mediante síntesis química, según lo descrito anteriormente. Los polipéptidos TACI-inmunoglobulina pueden ser monómeros o multímeros; glicosilados o no glicosilados; PEGilados o no PEGilados; y pueden o no incluir un residuo de aminoácido de metionina inicial. Una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina puede estar no glicosilada, glicosilada o glicosilada sólo en el resto de TACI o en el resto de inmunoglobulina. El resto de inmunoglobulina se puede obtener de un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.
8. Usos terapéuticos de los polipéptidos TACI-inmunoglobulina
Las proteínas TACI-inmunoglobulina se pueden usar para modular el sistema inmune mediante su unión con ZTNF4 o ZTNF2, evitando así la unión de estos ligandos con receptores TACI o BCMA endógenos. Por consiguiente, la presente memoria describe específicamente el uso de proteínas TACI-inmunoglobulina en un sujeto que carezca de una cantidad adecuada de receptores TACI o BCMA, o que produzca un exceso de ZTNF4 o ZTNF2. Estas moléculas se pueden administrar a cualquier sujeto en necesidad de tratamiento. La presente invención contempla usos terapéuticos tanto veterinarios como humanos, según lo definido en las reivindicaciones, incluyendo los sujetos ilustrativos sujetos mamíferos, tales como animales de granja, animales domésticos y pacientes humanos.
Los polipéptidos TACI-inmunoglobulina se pueden usar para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, cánceres de células B, inmunomodulación, IBD y patologías mediadas por anticuerpos frente a IBD o cualquier anticuerpo (p. ej., ITCP, miastenia grave y similares), enfermedades renales, respuesta inmune indirecta de células T, rechazo de injertos y la enfermedad del injerto frente al huésped. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser dirigidos a regular específicamente las respuestas de las células B durante una respuesta inmune. Además, los polipéptidos de la presente invención se pueden usar para modular el desarrollo de las células B, el desarrollo de otras células, la producción de anticuerpos y la producción de citocina. Los polipéptidos de la presente invención también pueden modular la comunicación de las células T y B mediante la neutralización de los efectos proliferativos de ZTNF4.
Los polipéptidos TACI-inmunoglobulina de la presente invención pueden ser útiles para neutralizar los efectos de ZTNF24 para tratar leucemias de células pre-B o B, tales como leucemia de células plasmáticas, leucemia linfocítica crónica o aguda, mielomas tales como el mieloma múltiple, mieloma de células plasmáticas, mieloma endotelial y mieloma de células gigantes, y linfomas tales como linfoma de no Hodgkin, para los que está asociado un aumento de los polipéptidos ZTNF4.
ZTNF4 se expresa en células CD8+, monocitos, células dendríticas, monocitos activados, lo que indica que, en ciertos trastornos auto-inmunes, las células T citotóxicas podrían estimular la producción de células B a través de un exceso en la producción de ZTNF4. Las proteínas inmunosupresoras que bloquean selectivamente la acción de los linfocitos B serían de utilidad en el tratamiento de la enfermedad. La producción de auto-anticuerpos es común en varias enfermedades autoinmunes y contribuye a la destrucción de tejidos y al agravamiento de la enfermedad. Los auto-anticuerpos también pueden conducir a la aparición de complicaciones en la sedimentación de complejos inmunes y conducir a muchos síntomas del lupus eritematoso sistémico, incluyendo la insuficiencia renal, síntomas neurálgicos y la muerte. La modulación de la producción de anticuerpos independiente de la respuesta celular también sería beneficiosa en muchos estados patológicos. También se ha observado que las células B desempeñan un papel en la secreción de las inmunoglobulinas artritogénicas en la artritis reumatoide. Como tal, la inhibición de la producción de anticuerpos frente a ZTNF4 sería beneficiosa en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, tales como la miastenia grave, la artritis reumatoide, la artritis reumatoide juvenil de curso poliarticular y la artritis psoriática. Los agentes terapéuticos inmunosupresores tales como las proteínas TACI-inmunoglobulina que bloquean o neutralizan selectivamente la acción de los linfocitos B serían útiles a tales efectos.
La invención proporciona usos que emplean proteínas TACI-inmunoglobulina para bloquear o neutralizar selectivamente las acciones de las células B en asociación con enfermedades renales en un estadio final, que pueden estar o no asociadas con enfermedades autoinmunes. Tales procedimientos también serían útiles para tratar enfermedades renales inmunológicas. Tales procedimientos serían útiles para tratar glomerulonefritis asociada con enfermedades tales como nefropatía membranosa, nefropatía por IgA o enfermedad de Berger, nefropatía por IgM, enfermedad de Goodpasture, glomerulonefritis post-infecciosa, enfermedad mesangioproliferativa, leucemia linfoide crónica, síndrome nefrótico de cambio mínimo. Tales procedimientos también servirían como aplicaciones terapéuticas para tratar glomerulonfritis secundaria o vasculitis asociadas con enfermedades tales como el lupus, poliarteritis, Henoch-Schonlein, esclerodermia, enfermedades relacionadas con el VIH, amiloidosis y síndrome urémico hemolítico. Los usos de la presente invención también serían útiles como parte de una aplicación terapéutica para tratar nefritis intersticial o pielonefritis asociada con pielonefritis crónica, abuso de analgésicos, nefrocalcinosis, nefropatía provocada por otros agentes, nefrolitiasis o nefritis intersticial crónica o aguda.
La presente memoria describe el uso de proteínas TACI-inmunoglobulina en el tratamiento de enfermedades hipertensivas o de vasos grandes, incluyendo la estenosis u oclusión de las arterias renales y los émbolos de colesterol o émbolos renales.
La presente invención también proporciona usos para el tratamiento de neoplasmas renales o urológicos, mielomas múltiples, linfomas, neuropatía o amiloidosis de cadena ligera.
La invención también proporciona usos para bloquear o inhibir células B activadas usando proteínas TACI-inmunoglobulina para el tratamiento del asma y de otras enfermedades de las vías respiratorias crónicas, tales como la bronquitis y el enfisema. Las proteínas TACI-inmunoglobulina descritas en la presente memoria también se pueden usar para tratar el Síndrome de Sjögren.
También se proporcionan usos para inhibir o neutralizar un respuesta de células T efectoras usando proteínas TACI-inmunoglobulina para su uso en inmunosupresión, en concreto, para un uso terapéutico tal como la enfermedad del injerto frente al huésped y el rechazo de injertos. Además, las proteínas TACI-inmunoglobulina serían útiles en protocolos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades autoinmunes tales como la diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM) y la enfermedad de Crohn. Los usos de la presente invención tendrían un valor terapéutico adicional para el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas, en concreto, para disminuir el dolor articular, la hinchazón, la anemia y otros síntomas asociados, así como para tratar el choque séptico.
Hay modelos animales bien establecidos disponibles para analizar la eficacia in vivo de las proteínas TACI-inmunoglobulina de la presente invención en ciertos estados patológicos. En concreto, se pueden analizar las proteínas TACI-inmunoglobulina in vivo en un número de modelos animales de enfermedad autoinmune, tales como cepas congénitas de ratones MRL-lpr/lpr o NZB x NZW F1, que sirven como modelo del LES (lupus eritematoso sistémico). Tales modelos animales son conocidos en la técnica.
La descendencia de un cruce entre ratones negros de Nueva Zelanda (NZB) y ratones blancos de Nueva Zelanda (NZW) desarrolla una forma espontánea de LES que se asemeja mucho al LES en seres humanos. La descendencia de los ratones, conocida como NZBW, comienza a desarrollar auto-anticuerpos IgM frente a las células T a 1 mes de edad, y a los 5-7 meses de edad, los auto-anticuerpos frente al ADN de Ig son la inmunoglobulina dominante. La hiperactividad de las células B policlonales conduce a la sobre-producción de los auto-anticuerpos. La sedimentación de estos auto-anticuerpos, particularmente, de los dirigidos frente al ADN monocatenario, está asociada con el desarrollo de la glomerulonefritis, que se manifiesta clínicamente como proteinuria, azotemia y muerte a partir de la insuficiencia renal. La insuficiencia de riñón es la causa principal de mortalidad en los ratones afectados de LES espontáneo y en la cepa NZBW, este procedimiento es crónico y obliterativo. La enfermedad es más rápida y grave en hembras que en machos, con una supervivencia media de sólo 245 días en comparación con los 406 días para los machos. Mientras que muchos de los ratones hembra serán sintomáticos (proteinuria) a los 7-9 meses de edad, algunos pueden ser mucho más jóvenes o más viejos cuando desarrollen los síntomas. La nefritis inmune mortal observada en los ratones NZBW es muy similar a la glomerulonefritis observada en el LES humano, lo que convierte a este modelo murino espontáneo en útil para analizar los posibles agentes terapéuticos para el LES.
Los modelos de ratón para la encefalomielitis alérgica experimental (EAE) se han usado como herramienta para investigar tanto los mecanismos de las enfermedades mediadas por el sistema inmunológico como los procedimientos de una posible intervención terapéutica. El modelo se asemeja a la esclerosis múltiple humana y produce una desmielinización como resultado de la activación de células T a neuroproteínas tales como la proteína básica mielina (MBP) o la proteína proteolipídica (PLP). La inoculación con antígeno conduce a la inducción de CD4+, células T restringidas al MHC de clase II (Th1). Los cambios en el protocolo para la EAE pueden producir variantes agudas, recidivas crónicas o de transferencia pasiva del modelo.
En el modelo de artritis inducida por colágeno (AIC), los ratones desarrollan artritis inflamatoria crónica, que se asemeja mucho a la artritis reumatoide humana (AR). Como la AIC comparte características inmunológicas y patológicas similares con la AR, éste se convierte en un modelo ideal para rastrear los posibles compuestos anti-inflamatorios humanos. Otra ventaja del uso del modelo de AIC es que los mecanismos de patogénesis son conocidos. Se han identificado los epítopos de células T y B en el colágeno de tipo II, y se han determinado diversos parámetros inmunológicos (hipersensibilidad de tipo retardado y anticuerpo frente al colágeno) e inflamatorios (citocinas, quimiocinas y enzimas degradantes de la matriz) relativos a la artritis mediada por el sistema inmune, y se pueden usar para medir la eficacia de los compuestos de prueba en los modelos.
La miastenia grave (MG) es otra enfermedad autoinmune para la que hay disponibles modelos murinos. La MG es un trastorno de transmisión neuromuscular que implica la producción de auto-anticuerpos dirigidos frente al receptor de la acetilcolina nicotínica (AChR). La MG es adquirida o heredada con características clínicas que incluyen una debilidad anormal y una fatiga al realizar ejercicio. Se ha establecido un modelo de ratones de la MG. La miastenia grave autoinmune experimental (MGAE) es una enfermedad mediada por anticuerpos caracterizada por la presencia de anticuerpos frente al AChR. Estos anticuerpos destruyen el receptor conduciendo a impulsos eléctricos neuromusculares defectuosos, que dan como resultado una debilidad muscular. En el modelo de la MGAE, se inmunizan los ratones con el receptor de la acetilcolina nicotínica. Los signos clínicos de la MG se hacen evidentes semanas después de la segunda inmunización. La MGAE se evalúa mediante varios procedimientos que incluyen la medición de los niveles en suero de los anticuerpos frente al AChR mediante radioinmunanálisis, la medición del AChR muscular o la electromiografía.
Generalmente, la dosis de la proteína TACI-inmunoglobulina administrada variará en función de factores tales como la edad, el peso, la altura, el sexo, el estado de salud general y el historial médico previo del sujeto. Comúnmente, es deseable proporcionar al receptor una dosis de proteína TACI-inmunoglobulina que esté en el intervalo de aproximadamente 1 pg/kg a 10 mg/kg (cantidad de agente/peso corporal del sujeto), aunque también se puede administrar una dosis más baja o más alta según las circunstancias.
La administración de una proteína TACI-inmunoglobulina a un sujeto puede ser intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intrapleural, intratecal, por perfusión mediante un catéter regional o mediante inyección intralesional directa. Cuando se administran las proteínas terapéuticas por inyección, la administración puede ser mediante infusión continua, o mediante un solo o múltiples bolos.
Otras vías de administración incluyen la vía oral, por la membrana mucosa, pulmonar y transcutánea. La administración oral es adecuada para microesferas de poliéster, microesferas de zeína, microesferas proteinoides, microesferas de policianoacrilato y sistemas basados en lípidos (véase, por ejemplo, DiBase y Morrel, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins" en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 255-288 (Plenum Press 1997)). La viabilidad de una administración intranasal está ejemplificada mediante un modo tal como la administración de insulina (véase, por ejemplo, Hinchcliffe y Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999)). Las partículas en polvo o líquidas que comprenden TACI-inmunoglobulina se pueden preparar y ser inhaladas con la ayuda de dispensadores de polvo seco, generadores de aerosol líquido o nebulizadores (p.ej., Pettit y Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999)). Este enfoque se ilustra mediante el sistema de tratamiento de la diabetes AERX, que es un inhalador electrónico de mano que administra insulina en aerosol a los pulmones. Los estudios han mostrado que se han administrado proteínas tan grandes como de 48.000 kDa a través de la piel a concentraciones terapéuticas con la ayuda de ultrasonido de baja frecuencia, lo que ilustra la viabilidad de la administración transcutánea (Mitragotri et al., Science 269:850 (1995)). La administración transdérmica mediante el uso de electroporación proporciona otro medio para administrar una proteína TACI-inmunoglobulina (Potts et al., Pharm. Biotechnol. 10:213 (1997)).
Se puede formular una composición farmacéutica que comprenda una proteína TACI-inmunoglobulina según los procedimientos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, mediante los cuales las proteínas terapéuticas se combinan en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se dice que una composición es un "vehículo farmacéuticamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por un paciente receptor. La solución salina estéril tamponada con fosfato es un ejemplo de un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los expertos en la técnica conocen otros vehículos adecuados. Véase, por ejemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, XIX Edición (Mack Publishing Company 1995).
A efectos terapéuticos, las proteínas TACI-inmunoglobulina se administran a un paciente en una cantidad terapéuticamente eficaz. Se dice que una proteína TACI-inmunoglobulina y un vehículo farmacéuticamente aceptable se administran en una "cantidad terapéuticamente eficaz" si la cantidad administrada es fisiológicamente relevante. Un agente es fisiológicamente relevante si su presencia da como resultado un cambio detectable en la fisiología de un paciente receptor. Por ejemplo, un agente usado para tratar una inflamación es fisiológicamente relevante si su presencia calma la respuesta inflamatoria. Como otro ejemplo, un agente usado para inhibir el crecimiento de células tumorales es fisiológicamente relevante si la administración del agente da como resultado una disminución del número de células tumorales, una disminución de la metástasis, una disminución del tamaño de un tumor sólido o un aumento de la necrosis de un tumor. Además, un agente usado para tratar el lupus eritematoso sistémico es fisiológicamente relevante si la administración del agente da como resultado una disminución de los anticuerpos circulantes frente al ADN bicatenario o una disminución en al menos uno de los siguientes síntomas: fiebre, dolor articular, lesiones cutáneas eritematosas u otras características del lupus eritematoso sistémico. Un ejemplo de la indicación general de administrar una proteína TACI-inmunoglobulina en una cantidad terapéuticamente eficaz es que, tras su administración a un sujeto, haya una disminución de los niveles de circulación de ZTNF4 (BLyS).
Se puede preparar una composición farmacéutica que comprenda una proteína TACI-inmunoglobulina en forma líquida, en un aerosol o en forma sólida. Las formas líquidas se ilustran mediante soluciones inyectables y suspensiones orales. Los ejemplos de formas sólidas incluyen cápsulas, comprimidos y formas de liberación controlada. La última forma se ilustra mediante bombas miniosmóticas e implantes (Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery" en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et al., "Protein Delivery with Infusion Pumps" en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant" en Protein Delivery: Physical System, Sanders y Hendren (eds.), páginas 93-117 (Plenum Press 1997)).
Los liposomas proporcionan un medio para administrar polipéptidos terapéuticos a un sujeto intravenosamente, intraperitonealmente, intratecalmente, intramuscularmente, subcutáneamente o mediante administración oral, por inhalación o administración intranasal. Los liposomas son vesículas microscópicas que constan de uno o más compartimentos acuosos rodeados de bicapas lipídicas (véase, en general, Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Supl. 1):S61 (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993) y Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers" en Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), páginas 3-24 (CRC Press 1995)). Los liposomas tienen una composición similar a las membranas celulares y, como resultado de ello, los liposomas pueden ser administrados de manera segura, siendo biodegradables. En función del procedimiento de preparación, los liposomas pueden ser unilaminares o multilaminares, y los liposomas pueden variar en el tamaño con diámetros que varían de 0,02 \mum a más de 10 \mum. Se puede encapsular una variedad de agentes en los liposomas: La división de los agentes hidrófobos en las bicapas y la división de los agentes hidrófilos en el espacio o los espacios acuosos internos (véase, por ejemplo, Machy et al., "Liposomes In Cell Biology And Pharmacology" (John Libbey 1987) y Ostro et al., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)). Además, es posible controlar la disponibilidad terapéutica del agente encapsulado variando el tamaño de los liposomas, el número de las bicapas, la composición lipídica, así como las características de carga y superficie de los liposomas.
Los liposomas pueden adsorberse a casi cualquier tipo de célula y luego liberar lentamente el agente encapsulado. Alternativamente, un liposoma absorbido puede ser sometido a endocitosis por células que sean fagocíticas. La endocitosis es seguida por la degradación intralisosomal de los lípidos liposomales y la liberación de los agentes encapsulados (Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446:368 (1985)). Tras la administración intravenosa, los pequeños liposomas (0,1 a 1,0 \mum) son comúnmente absorbidos por las células del sistema reticuloendotelial, ubicado principalmente en el hígado y el bazo, mientras que los liposomas más grandes de 3,0 \mum son depositados en el pulmón. Esta absorción preferencial de los liposomas más pequeños por las células del sistema reticuloendotelial ha sido usada para administrar agentes quimioterapéuticos a macrófagos y a tumores del hígado.
El sistema reticuloendotelial puede ser sorteado por varios procedimientos que incluyen la saturación con grandes dosis de partículas liposomales o la desactivación selectiva de macrófagos mediante procedimientos farmacológicos (Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984)). Además, se ha observado que la incorporación de fosfolípidos derivados de glicolípidos o de polietilenglicol en las membranas liposomales da como resultado una reducción significativa de la absorción por parte del sistema reticuloendotelial (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).
También se pueden preparar los liposomas para dirigirlos a determinadas células u órganos variando la composición fosfolipídica o mediante la inserción de receptores o ligandos en los liposomas. Por ejemplo, se han usado liposomas preparados con un alto contenido de un tensioactivo no iónico para dirigirlos al hígado (Hayakawa et al., patente japonesa 04-244.018; Kato et al., Biol. Phann. Bull. 16:960 (1993)). Estas formulaciones fueron preparadas mezclando fospatidilcolina de soja, \alpha-tocoferol y aceite de ricino hidrogenado etoxilado (HCO-60) en metanol, concentrando la mezcla al vacío y luego reconstituyendo la mezcla con agua. También se ha observado una formulación liposomal de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) con una mezcla de esterilglucósido derivado de soja (SG) y colesterol (Ch) dirigirse al hígado (Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20:881 (1997)).
Alternativamente, se pueden unir diversos ligandos dirigidos con la superficie del liposoma, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, carbohidratos, vitaminas y proteínas transportadoras. Por ejemplo, se pueden modificar liposomas con derivados galactosilipídicos de tipo ramificado para dirigirlos a receptores de asialoglicoproteínas (galactosa), que se expresan exclusivamente sobre la superficie de células de hígado (Kato y Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997); Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997)). De manera similar, Wu et al., Hepatology 27:772 (1998), han observado que el marcaje de liposomas con asialofetuína condujo a una reducción de la vida media en plasma de los liposomas, aumentando enormemente la absorción del liposoma marcado con asialofetuína por los hepatocitos. Por otro lado, la acumulación hepática de liposomas que comprenden derivados de galactosilípidos de tipo ramificado puede ser inhibida mediante una preinyección de asialofetuína (Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997)). Los liposomas de albúmina de suero humano poliaconitilados proporcionan otro enfoque para dirigir liposomas a las células de hígado (Kamps et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EE.UU. 94:11681 (1997)). Además, Geho, et al., patente estadounidense n.º 4.603.044, describen un sistema de administración de vesículas de liposoma dirigidas a los hepatocitos que tiene especificidad por receptores hepatobiliares asociados con las células metabólicas especializadas del hígado.
En un enfoque más general sobre la dirección hacia tejidos, las células diana son marcadas previamente con anticuerpos biotinilados específicos de un ligando expresado por la célula diana (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)). Tras la eliminación del anticuerpo libre del plasma, se administran liposomas conjugados con estreptavidina. En otro enfoque, los anticuerpos dirigidos son unidos directamente con los liposomas (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)).
Las proteínas TACI-inmunoglobulina se pueden encapsular en los liposomas usando técnicas estándar de microencapsulación de proteínas (véase, por ejemplo, Anderson et al., Infect. Immun. 31:1099 (1981), Anderson et al., Cancer Res. 50:1853 (1990) y Cohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving et al. "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies" en Liposonae Technology, II Edición, Vol. III, Gregoriadis (ed.), página 317 (CRC Press 1993), Wassef et al., Meth. Enzymol. 149:124 (1987)). Según lo indicado anteriormente, los liposomas terapéuticamente útiles pueden contener una variedad de componentes. Por ejemplo, los liposomas pueden comprender derivados lipídicos de poli(etilenglicol) (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).
Se han diseñado microesferas de polímeros degradables para mantener niveles sistémicos elevados de proteínas terapéuticas. Las microesferas se preparan a partir de polímeros degradables, tales como poli(lactida-co-glicólido) (PLG), polianhídridos, poli(orto-ésteres), polímeros de acetato de etilvinilo no biodegradables, en los que las proteínas están inmovilizadas en el polímero (Gombotz y Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery" en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 51-93 (CRC Press 1995); Roskos y Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery" en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus et al., Science 281:1161 (1998); Putney y Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998)). Las nanoesferas revestidas de polietilenglicol (PEG) también pueden proporcionar vehículos para una administración intravenosa de proteínas terapéuticas (véase, por ejemplo, Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10: 167 (1997)).
La presente memoria describe proteínas TACI-inmunoglobulina modificadas químicamente en las que el polipéptido está ligado con un polímero, según lo tratado anteriormente.
Los expertos en la técnica pueden crear otras formas de dosificación, como muestran, por ejemplo, Ansel y Popovich, "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", V Edición (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), "Remington's Pharmaceutical Sciences", XIX Edición (Mack Publishing Company 1995) y por Ranade y Hollinger, "Drug Delivery Systems" (CRC Press 1996).
A modo ilustrativo, las composiciones farmacéuticas se pueden suministrar como un equipo que comprende un recipiente que comprende una proteína TACI-inmunoglobulina. Los polipéptidos terapéuticos se pueden proporcionar en forma de una solución inyectable para una sola o múltiples dosis, o en forma de un polvo estéril que será reconstituido antes de su inyección. Alternativamente, tal equipo puede incluir un dispensador de polvos secos, un generador de aerosol líquido o un nebulizador para la administración de un polipéptido terapéutico. Tal equipo puede comprender además información por escrito sobre las indicaciones y el uso de la composición farmacéutica. Además, tal información puede incluir la afirmación de que la composición de proteína TACI-inmunoglobulina está contraindicada en pacientes con hipersensibilidad conocida bien hacia el resto de receptor TACI o el resto de inmunoglobulina.
9. Usos terapéuticos de las secuencias de nucleótidos de TACI-inmunoglobulina
La presente memoria describe el uso de moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de fusión de TACI e inmunoglobulina para proporcionar estas proteínas de fusión a un sujeto en necesidad de tal tratamiento. Para un uso terapéutico veterinario o un uso terapéutico humano, se pueden administrar tales moléculas de ácido nucleico a un sujeto que tenga un trastorno o una enfermedad, según lo tratado anteriormente. Como en un ejemplo tratado anteriormente, las moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina se pueden usar para un tratamiento a largo plazo del lupus eritematoso sistémico.
Existen numerosos enfoques para introducir un gen de TACI-inmunoglobulina en un sujeto, incluyendo el uso de células huésped recombinantes que expresan TACI-inmunoglobulina, la administración de ácido nucleico desnudo que codifica TACI-inmunoglobulina, el uso de un vehículo lipídico catiónico con una molécula de ácido nucleico que codifica TACI-inmunoglobulina y el uso de virus que expresan TACI-inmunoglobulina, tales como retrovirus recombinantes, virus adeno-asociados recombinantes, adenovirus recombinantes y virus del Herpes simplex recombinantes (véase, por ejemplo, Mulligan, Science 260:926 (1993), Rosenberg et al., Science 242:1575 (1988), LaSalle et al., Science 259:988 (1993), Wolff et al., Science 247:1465 (1990), Breakfield y Deluca, The New Biologist 3:203 (1991)). En un enfoque ex vivo, por ejemplo, las células son aisladas de un sujeto, transfectadas con un vector que expresa un gen de TACI-inmunoglobulina y luego transplantadas en el sujeto.
Para efectuar la expresión de un gen de TACI-inmunoglobulina, se construye un vector de expresión en el que una secuencia de nucleótidos que codifica un gen de TACI-inmunoglobulina está ligada operativamente a un promotor central y, opcionalmente, a un elemento regulador para controlar la transcripción del gen. Los requisitos generales de un vector de expresión se describen anteriormente.
Alternativamente, se puede administrar un gen de TACI-inmunoglobulina usando vectores víricos recombinantes (p. ej., Kass-Eisler et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EE.UU. 90:11498 (1993), Kolls et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EE.UU. 91:215 (1994), Li et al., Hum. Gene Ther. 4:403 (1993), Vincent et al., Nat. Genet. 5:130 (1993) y Zabner et al., Cell 75:207 (1993)), vectores víricos asociados con adenovirus (Flotte et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EE.UU. 90:10613 (1993)), virus alfa tales como el virus del Bosque de Semliki y el virus Sindbis (Hertz y Huang, J. Vir. 66:857 (1992), Raju y Huang, J. Vir. 65:2501 (1991) y Xiong et al., Science 243:1188 (1989)), vectores del virus del Herpes (p. ej., patentes estadounidenses n.º 4.769.331, 4.859.587, 5.288.641 y 5.328.688), vectores de parvovirus (Koering et al., Hum. Gene Yherap. 5:457 (1994)), vectores del virus de la viruela (Ozaki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 193:653 (1993), Panicali y Paoletti, Proc. Nat'l Acad. Sci. EE.UU. 79:4927 (1982)), virus de la viruela, tales como el virus de la viruela de canario o el virus Vaccinia (Fisher-Hoch et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EE.UU. 86:317 (1989) y Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86 (1989)) y retrovirus (p. ej., Baba et al., J. Neurosurg 79:729 (1993), Ram et al., Cancer Res. 53:83 (1993), Takamiya et al., J. Neurosci. Res 33:493 (1992), Vile y Hart, Cancer Res. 53:962 (1993), Vile y Hart, Cancer Res. 53:3860 (1993) y Anderson et al., patente estadounidense n.º 5.399.346). En diversas realizaciones, se puede utilizar bien el propio vector vírico, o una partícula vírica que contenga al vector vírico, en los procedimientos y las composiciones descritos más adelante.
Como ilustración de un sistema, el adenovirus, un virus de ADN bicatenario, es un vector de transferencia génica bien caracterizado para la administración de una molécula de ácido nucleico heteróloga (para más información, véase Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994); Douglas y Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)). El sistema de adenovirus ofrece varias ventajas que incluyen: (i) la capacidad de alojar insertos de ADN relativamente grandes; (ii) la capacidad de ser desarrollado hasta títulos elevados; (iii) la capacidad para infectar una amplia selección de tipos de células de mamífero; y (iv) la capacidad para ser usado con promotores muy diferentes, incluyendo promotores ubicuos, específicos de un tejido y regulables. Además, se pueden administrar adenovirus mediante inyección intravenosa, porque los virus son estables en el torrente sanguíneo.
Usando vectores de adenovirus en los que hay eliminadas partes del genoma del adenovirus, se incorporan insertos en el ADN vírico mediante la unión directa o mediante la recombinación homóloga con un plásmido cotransfectado. En un ejemplo de sistema, se elimina el gen E1 esencial del vector vírico, y el virus no se replicará a no ser que el gen E1 sea proporcionado por la célula huésped. Cuando se administra intravenosamente a animales intactos, el adenovirus se dirige fundamentalmente al hígado. Aunque un sistema de administración adenovírico con la eliminación de un gen E1 no puede replicarse en las células huésped, el tejido del huésped expresará y procesará una proteína heteróloga codificada. Las células huésped también secretarán la proteína heteróloga si el gen correspondiente incluye una secuencia señal secretora. Las proteínas secretadas entrarán en circulación desde el tejido que expresa el gen heterólogo (p. ej., el hígado muy vascularizado).
Además, los vectores adenovíricos que contienen diversas eliminaciones de genes víricos se pueden usar para reducir o eliminar respuestas inmunes hacia el vector. Tales adenovirus tienen eliminados E1 y, además, contienen eliminaciones de E2A o E4 (Lusky et al., J. Virol. 72:2022 (1998); Raper et al., Human Gene Therapy 9:671 (1998)). También se ha publicado que la eliminación de E2b reduce respuestas inmunes (Amalfitano et al., J. Virol. 72:926 (1998)). Mediante la eliminación de todo el genoma del adenovirus, se pueden alojar insertos muy largos del ADN heterólogo. La generación de los denominados adenovirus "cobardes", en los que se han eliminado todos los genes víricos, es particularmente ventajosa para la inserción de insertos grandes de ADN heterólogo Yeh. y Perricaudet, FASEB J. 11:615 (1997)).
Las reservas de títulos elevados de virus recombinantes capaces de expresar un gen terapéutico se pueden obtener a partir de células de mamífero infectadas usando procedimientos estándar. Por ejemplo, se puede preparar el virus del Herpes simplex en células Vero, según lo descrito por Brandt et al., J. Gen. Virol. 72:2043 (1991), Herold et al., J. Gen. Virol. 75:1211 (1994), Visalli y Brandt, Virology 185:419 (1991), Grau et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30:2474 (1989), Brandt et al., J. Virol. Meth. 36:209 (1992) y por Brown y MacLean (eds.), "HSV Virus Protocols" (Humana Press 1997).
Alternativamente, se puede introducir un vector de expresión que comprenda un gen de TACI-inmunoglobulina en las células de un sujeto mediante la lipofección in vivo usando liposomas. Se pueden usar lípidos catiónicos sintéticos para preparar liposomas para la transfección in vivo de un gen que codifique un marcador (Felgner et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EE.UU. 84:7413 (1987); Mackey et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EE.UU. 85:8027 (1988)). El uso de la lipofección para introducir genes exógenos en órganos específicos in vivo tiene ciertas ventajas prácticas. Se pueden usar liposomas para dirigir la transfección a determinados tipos de células, lo que es particularmente ventajoso en un tejido con heterogeneidad celular, tal como el páncreas, el hígado, el riñón y el cerebro. Los lípidos se pueden acoplar químicamente con otras moléculas a efectos de la dirección. Los péptidos dirigidos (p. ej., las hormonas o los neurotransmisores), las proteínas tales como los anticuerpos o las moléculas no peptídicas se pueden acoplar a los liposomas químicamente.
La electroporación es otro modo alternativo de administración. Por ejemplo, Aihara y Miyazaki, Nature Biotechnology 16:867 (1998) han demostrado el uso de electroporación in vivo para la transferencia de genes en el músculo.
Generalmente, la dosis de una composición que comprende un vector terapéutico que tiene una secuencia de nucleótidos de TACI-inmunoglobulina, tal como un virus recombinante, variará en función de factores tales como la edad, el peso, la altura, el sexo, el estado de salud general y el historial médico previo del sujeto. Las vías adecuadas de administración de vectores terapéuticos incluyen inyección intravenosa, inyección intraarterial, inyección intraperitoneal, inyección intramuscular, inyección intratumoral e inyección en la cavidad que contiene un tumor. A modo ilustrativo, Horton et al., Proc. Nat'l Acad Sci. EE.UU. 96:1553 (1999), demostraron que la inyección intramuscular de ADN plasmídico que codifica interferón \alpha produce potentes efectos antitumorales sobre los tumores primarios y metastásicos en un modelo murino.
Se puede formular una composición que comprenda vectores víricos, vectores no víricos o una combinación de vectores víricos y no víricos según los procedimientos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, mediante los cuales los vectores o los virus se combinan en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Según lo indicado anteriormente, se dice que una composición, tal como una solución salina tamponada con fosfato, es un "vehículo farmacéuticamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por un sujeto receptor. Hay otros vehículos adecuados que son conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", XIX Ed. (Mack Publishing Co. 1995) y "Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics", VII Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985)).
A efectos terapéuticos, el vector terapéutico de expresión génica, o un virus recombinante que comprende tal vector, y un vehículo farmacéuticamente aceptable se administran a un sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz. Se dice que una combinación de un vector de expresión (o un virus) y un vehículo farmacéuticamente aceptable se administra en una "cantidad terapéuticamente eficaz" si la cantidad administrada es fisiológicamente relevante. Un agente es fisiológicamente relevante si su presencia da como resultado un cambio detectable en la fisiología de un sujeto receptor. Por ejemplo, un agente usado para tratar una inflamación es fisiológicamente relevante si su presencia calma la respuesta inflamatoria. Como otro ejemplo, un agente usado para inhibir el crecimiento de células tumorales es fisiológicamente relevante si la administración del agente da como resultado una disminución del número de células tumorales, una disminución de la metástasis, una disminución del tamaño de un tumor sólido o un aumento de la necrosis de un tumor.
Cuando el sujeto tratado con un vector terapéutico de expresión génica o un virus recombinante es un ser humano, entonces la terapia es, preferiblemente, una terapia de genes en células somáticas. Es decir, el tratamiento preferido para un ser humano con un vector terapéutico de expresión génica o un virus recombinante no implica introducir en células una molécula de ácido nucleico que pueda formar parte de una línea germinal humana y ser transmitida de generación en generación (es decir, terapia génica en línea germinal humana).
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10. Producción de ratones transgénicos
Es posible diseñar genéticamente ratones transgénicos para que sobre-expresen secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen las proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina en todos los tejidos, o bajo el control de un elemento regulador específico de un tejido o preferido por un tejido. Estos sobre-productores de las proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina se pueden usar para caracterizar el fenotipo que resulta de la sobre-expresión, y los animales transgénicos pueden servir como modelos para la enfermedad humana provocada por un exceso de la proteína receptora TACI. Los ratones transgénicos que sobre-expresan las proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina también proporcionan biorreactores modelo para la producción de proteínas de fusión de TACI-inmunoglobulina en leche o sangre de animales de mayor tamaño. Los procedimientos para producir ratones transgénicos son conocidos por aquéllos expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Jacob, "Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice" en Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), páginas 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994), Monastersky y Robl (eds.), "Strategies in Transgenic Animal Science" (ASM Press 1995) y Abbud y Nilson, "Recombinant Protein Expression in Transgenic Mice" en Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression, Fernandez y Hoeffler (eds.), páginas 367-397 (Academic Press, Inc. 1999)).
Por ejemplo, se puede comenzar un procedimiento para generar un ratón transgénico que exprese una secuencia de ácido nucleico que codifique una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina con machos fértiles adultos (sementales) (B6C3f1, de 2 a 8 meses de edad (Taconic Farms, Germantown, NY)), machos vasectomizados (castrados) (B6D2f1, de 2 a 8 meses, (Taconic Farms)), hembras fértiles prepubescentes (donantes) (B6C3f1, de 4 a 5 semanas, (Taconic Farms)) y hembras fértiles adultas (receptoras) (B6D2f1, de 2 a 4 meses, (Taconic Farms)). Se aclimatan las donantes durante una semana y luego se les inyectan aproximadamente 8 UI/ratón de gonadotropina sérica de yegua preñada (Sigma Chemical Company; St. Louis, MO) I.P., y 46-47 horas después, 8 UI/ratón de gonadotropina coriónica humana (hCG (Sigma)) I.P. para inducir una superovulación. Se aparean las donantes con los sementales tras las inyecciones de hormonas. La ovulación generalmente tiene lugar a las 13 horas de la inyección de hCG. La copulación se confirma por la presencia de un tapón vaginal la semana después del apareamiento.
Se recogen los óvulos fertilizados bajo un microscopio quirúrgico. Se recogen los oviductos y los óvulos son depositados en portaobjetos para análisis de orina que contienen hialuronidasa (Sigma). Se lavan los óvulos una vez en hialuronidasa y dos veces en medio de Whitten W640 (descrito, por ejemplo, por Menino y O'Claray, Biol. Reprod. 77:159 (1986) y Dienhart y Downs, Zygote 4:129 (1996)) que ha sido incubado con CO_{2} al 5%, O_{2} al 5% y N_{2} al 90% a 37ºC. Entonces se almacenan los óvulos en una incubadora con CO_{2} al 5%/37ºC hasta la microinyección.
Se linealizan de diez a veinte microgramos de ADN plasmídico que contiene una secuencia que codifica la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina, se purifican sobre gel y se vuelven a suspender en Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), EDTA 0,25 mM (pH 8,0) a una concentración final de 5-10 nanogramos por microlitro para la microinyección. Por ejemplo, las secuencias que codifican la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina pueden codificar un polipéptido TACI con la eliminación de los residuos de aminoácido 1 a 29 y 111 a 154 de la SEC ID N.º 2, y un resto de inmunoglobulina Fc5.
Se microinyecta el ADN plasmídico en los óvulos cosechados contenidos un una gota de medio W640 cubierta por aceite mineral equilibrado con CO_{2} tibio. Se extrae el ADN con una aguja para inyección (retirada de un tubo capilar de vidrio de borosilicato de 0,75 mm de D.I., 1 mm de D.E.) y se inyecta en los óvulos individuales. Cada óvulo es penetrado con la aguja para inyección hasta uno o ambos pronúcleos haploides.
Se inyectan picolitros de ADN en los pronúcleos y se retira la aguja para inyección sin entrar en contacto con los nucléolos. Se repite el procedimiento hasta que todos los óvulos hayan sido inyectados. Se transfieren los óvulos correctamente microinyectados a una placa de cultivo de tejido orgánico con medio W640 pregasificado para un almacenamiento durante una noche en una incubadora a 37ºC/con CO_{2} al 5%.
Al día siguiente, se transfieren los embriones de dos células a las receptoras pseudo-preñadas. Las receptoras son identificadas por la presencia de tapones de copulación tras la copulación con los castrados vasectomizados. Las receptoras son anestesiadas y rasuradas en el flanco dorsal izquierdo, y transferidas a un microscopio quirúrgico. Se realiza una pequeña incisión en la piel, atravesando la pared muscular, en el centro del área abdominal delimitada por la caja torácica, la silla y la pata trasera, entre medias de la rodilla y el bazo. Se sacan al exterior los órganos reproductores sobre un pequeño paño quirúrgico. Se extiende la almohadilla adiposa sobre el paño quirúrgico y se sujeta una pinza para vasos pequeña (Roboz, Rockville, MD) a la almohadilla adiposa, que se deja colgando sobre la parte trasera del ratón, evitando que los órganos se vuelvan a deslizar hacia el interior.
Con una pipeta fina de transferencia que contiene aceite mineral seguido de burbujas alternantes de W640 y aire, se transfieren 12-17 embriones de dos células sanos de la inyección del día anterior en la receptora. Se localiza la ampolla hinchada y se sujeta el oviducto entre la ampolla y la bolsa, se hace un pequeño corte en el oviducto con una aguja de 28 g cerca de la bolsa, asegurándose de no rasgar la ampolla ni la bolsa.
Se transfiere la pipeta al corte del oviducto, y se meten los embriones soplando, dejando escapar la primera burbuja de aire de la pipeta. Se presiona suavemente la almohadilla adiposa en el peritoneo y se permite el deslizamiento hacia el interior de los órganos reproductores. Se cierra la pared peritoneal con una sutura y se cierra la piel con una pinza para heridas. Los ratones se recuperan en un calentador para portaobjetos a 37ºC durante un mínimo de cuatro horas.
Se devuelven las receptoras a las jaulas en parejas y se permite que transcurran los 19-21 días de gestación. Tras el nacimiento, se deja que pase un período de postparto de 19-21 días antes del destete. Se sexan los animales destetados, se colocan en jaulas separadas por sexos y se les extrae una muestra para biopsia de 0,5 cm de la cola (usada para la genotipificación) con tijeras limpias.
Se prepara el ADN genómico de los trozos de cola usando, por ejemplo, un equipo DNEASY de QIAGEN siguiendo las instrucciones del fabricante. Se analiza el ADN genómico por PCR usando cebadores diseñados para amplificar una secuencia de ácido nucleico que codifique una proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina o un gen marcador seleccionable que fue introducido en el mismo plásmido. Una vez confirmado que los animales son transgénicos, se realiza un retrocruzamiento con una cepa endogámica colocando una hembra transgénica con un macho de tipo natural o un macho transgénico con una o dos hembras de tipo natural. A medida que van naciendo las crías y son destetadas, se separan por sexos y se les corta la cola para la genotipificación.
Para comprobar la expresión de un transgén en un animal vivo, se realiza una hepatectomía parcial. Se prepara quirúrgicamente el abdomen superior, justo debajo de la apófisis xifoides. Usando una técnica estéril, se realiza una pequeña incisión de 1,5-2 cm debajo del esternón y se saca al exterior el lóbulo lateral izquierdo del hígado. Se hace una ligadura con seda 4-0 alrededor del lóbulo inferior sujetándolo por fuera de la cavidad corporal. Se usa una pinza atraumática para sujetar la ligadura mientras que se coloca un segundo bucle de Dexon absorbible (American Cyanamid; Wayne, N.J.) en posición proximal a la primera ligadura. Se hace un corte distal de la ligadura de Dexon y se colocan aproximadamente 100 mg del tejido de hígado extirpado en una placa Petri estéril. Se transfiere la sección de hígado extraída a un tubo de fondo redondo de polipropileno de 14 ml y se congela rápidamente en nitrógeno líquido y luego se almacena sobre hielo seco. Se cierra la zona de la cirugía con una sutura y pinzas para cerrar heridas, y se coloca la jaula de los animales sobre una placa de calentamiento a 37ºC durante las 24 horas posteriores a la operación. Se controla al animal diariamente después de la operación y se retiran las pinzas a los 7-10 días después de la cirugía. Se examina el nivel de expresión del ARNm de la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina para cada ratón transgénico usando un análisis de hibridación de solución de ARN o mediante la reacción en cadena de la polimerasa.
Con el enfoque general anteriormente descrito, se han producido ratones transgénicos que expresan niveles relevantes de la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina en la leche. En este caso en particular, la secuencia que codifica la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina codificaba un polipéptido TACI con la eliminación de los residuos de aminoácido 1 a 29 y 111 a 154 de la SEC ID N.º 2, y un resto de inmunoglobulina Fc5.
La presente invención, descrita así de manera general, se comprenderá más fácilmente en referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo ilustrativo y no pretenden ser restrictivos de la presente invención.
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Ejemplo 1 Construcción de moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas TACI-Fc
Las moléculas de ácido nucleico que codifican el TACI humano fueron obtenidas durante la clonación y la expresión de los receptores de ZTNF4 según lo descrito por Gross et al., Nature 404:995 (2000). Las secuencias codificantes contenidas en los constructos de expresión de TACI-Fc fueron generadas mediante PCR de solapamiento, usando técnicas estándar (véase, por ejemplo, Horton et al., Gene 77:61 (1989)). Se usaron ADNc de TACI y ADNc de Fc humanos como moldes iniciales para las amplificaciones por PCR. Los cebadores para la PCR fueron diseñados para que produjeran los extremos 5' y 3' deseados de las secuencias codificantes y para introducir los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción con el fin de facilitar la inserción de estas secuencias codificantes en los vectores de expresión. Las secuencias codificantes de TACI-Fc fueron insertadas en los vectores de expresión que incluían un gen de la dihidrofolato reductasa murino funcional. Un vector de expresión también contenía un promotor del citomegalovirus para dirigir la expresión del transgén de proteína recombinante, un intrón de inmunoglobulina, una secuencia señal del activador tisular del plasminógeno, una secuencia interna de entrada al ribosoma, un cistrón de CD8 eliminado para la selección superficial de las células transfectadas y elementos de expresión de levaduras para el crecimiento del plásmido en células de levadura.
El procedimiento usado para construir TACI-Fc4 ilustra un enfoque que fue usado para producir las proteínas de fusión de TACI-Fc. Se produjeron otras proteínas de fusión de TACI-Fc mediante la inserción de secuencias de nucleótidos que codificaban una proteína de fusión de TACI-Fc en un vector de expresión de mamífero y la introducción de ese vector de expresión en las células de mamífero.
A. Construcción del fragmento Fc4 de Ig\gammal
Para preparar la proteína de fusión de TACI-Fc4, se modificó la región Fc de la IgG1 humana (la región bisagra y los dominios CH_{2} y CH_{3}) para eliminar el receptor Fcy1 (Fc\gammaRI) y las funciones de unión a complementos (C1q). Esta versión modificada de la Fc de la IgG1 humana fue denominada "Fc4".
Se aisló la región Fc a partir de una PCR de un banco de hígados fetales humanos (Clontech), usando los cebadores de oligo 5' ATCAGCGGAA TTCAGATCTT CAGACAAAAC TCACACATGC CCAC 3' (SEC ID N.º 7) y 5' GG
CAGTCTCT AGATCATTTA CCCGGAGACA GGGAG 3' (SEC ID N.º 8). Las mutaciones de la región Fc fueron introducidas por PCR reducir la unión a Fc\gammaRI. El sitio de unión a Fc\gammaRI (Leu-Leu-Gly-Gly; residuos de aminoácido 38 a 41 de SEC ID N.º 6, que corresponden a las posiciones del índice EU 234 a 237) fue mutado a Ala-Glu-Gly-Ala para reducir la unión a Fc\gammaR1 (véase, por ejemplo, Duncan et al., Nature 332:563 (1988); Baum et al., EMBO J. 13:3992 (1994)). Se usaron los cebadores de oligonucleótido 5' CCGTGCCCAG CACCTGAAGC C GAGGGGGCA CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC C 3' (SEC ID N.º 9) y 5' GGATTCTAGA TTATTTACCC GGAGACAGGG A 3' (SEC ID N.º 10) para introducir la mutación. Se añadieron a un volumen final de 50 \mul 570 ng de molde de IgFc, 5 \mul de 10 x tampón de reacción de Pfu (Stratagene), 8 \mul de dNTP 1,25 mM, 31 \mul de agua destilada, 2 \mul de cebadores de oligonucleótido 20 mM. Se añadió un volumen igual de aceite mineral y se calentó la reacción hasta 94ºC durante 1 minuto. Se añadió la polimerasa de Pfu (2,5 unidades, Stratagene) seguida de 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1 minuto seguido de una prolongación a 72ºC durante 7 minutos. Se fraccionaron los productos de reacción mediante electroforesis y se detectó la banda correspondiente al tamaño predicho de aproximadamente 676 pares de bases. Se extirpó esta banda del gel y se recuperó usando un equipo de extracción de gel QIAGEN QIAquickTM (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.
También se usó la PCR para introducir una mutación de Ala a Ser (residuo de aminoácido 134 de SEC ID N.º 6, que corresponde a la posición del índice EU 330) y de Pro a Ser (residuo de aminoácido 135 de SEC ID N.º 6, que corresponde a la posición del índice EU 331) para reducir la unión al complemento C1q o la fijación de complementos (Duncan y Winter, Nature 332:788 (1988)). Se realizaron dos reacciones de la primera serie usando la secuencia de IgFc con el sitio de unión con Fc\gammaRI mutado como molde. Se añadieron a un volumen final de 50 \mul 1 \mul de molde de IgFc con el sitio de unión con Fc\gammaRI mutado, 5 \mul de 10 x tampón de reacción de Pfu (Stratagene), 8 \mul de dNTP 1,25mM, 31 \mul de agua destilada, 2 \mul de 5' GGTGGCGGCT CCCAGATGGG TCCTGTCCGA GCCCAGATCT TCAGACAAAA CTCAC 3' (SEC ID N.º 11) 20 mM, un cebador 5' que comienza en el nucleótido 36 de la SEC ID N.º 5 y 2 \mul de 5' TGGGAGGGCT TTGTTGGA 3' (SEC ID N.º 12) 20 mM, un cebador 3' que comienza en el complemento del nucleótido 405 de SEC ID N.º 5. La segunda reacción contenía 2 \mul de cada una de las reservas 20 mM de los cebadores de oligonucleótido 5' TCCAACAAAG CCCTCCCATC CTCCATCGAG AAAACCATCT CC 3' (SEC ID N.º 13), un cebador 5' que comienza en el nucleótido 388 de SEC ID N.º 5, y 5' GGATGGATCC ATGAAGCACC TGTGGTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGGCTC CCAGATG 3' (SEC ID N.º 14), un cebador 3', para introducir la mutación de Ala a Ser , el sitio de restricción de XbaI y el codón de terminación. Se añadió un volumen igual de aceite mineral y se calentaron las reacciones hasta 94ºC durante 1 minuto. Se añadió polimerasa de Pfu (2,5 unidades, Stratagene) seguida de 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 2 minutos seguidos de una prolongación a 72ºC durante 7 minutos. Se fraccionaron los productos de reacción mediante electroforesis y se detectaron bandas correspondientes a los tamaños predichos de aproximadamente 370 y aproximadamente 395 pares de bases, respectivamente. Se extirparon las bandas del gel y se extrajeron usando un equipo de extracción de gel QIAGEN QIAquickTM (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.
Se realizó una reacción de la segunda serie para unir los fragmentos anteriores y añadir el sitio de restricción BamHI de 5' y una secuencia señal de la región variable de cadena pesada JBL 2'C_{L} de la inmunoglobulina humana (Cogne et al., Eur. J. Immunol. 18:1485 (1988)). A un volumen final de 50 \mul, se añadieron 30 \mul de agua destilada, 8 \mul de dNTP 1,25 mM, 5 \mul de 10 x tampón de reacción de la polimerasa de Pfu (Stratagene) y 1 \mul de cada uno de los dos primeros productos de la PCR. Se añadió un volumen igual de aceite mineral y se calentó la reacción hasta 94ºC durante 1 minuto. Se añadió polimerasa de Pfu (2,5 unidades) seguida de 5 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos. Se volvió a llevar la temperatura hasta 94ºC y se añadieron 2 \mul de cada reserva 20 mM de 5' GGATGGATCC ATGAAGCACC TGTGGTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGGCTC CCAGATG 3' (SEC ID N.º 14), un cebador 5' que comienza en el nucleótido 1 de SEC ID N.º 5, y 5' GGATTCTAGA TTATTTACCC GGAGACAGGG A 3' (SEC ID N.º 10), seguidos de 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos, y una prolongación final de 7 minutos a 72ºC. Se visualizó una parte de la reacción usando electroforesis sobre gel. Se detectó una banda de 789 pares de bases correspondiente al tamaño predicho.
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B. Construcción de vectores de expresión de TACI-Fc4
Se construyeron plásmidos de expresión que comprendían una región codificante de la proteína de fusión de TACI-Fc4 mediante la recombinación homóloga en levadura. Se aisló un fragmento de ADNc de TACI usando una PCR que incluía la secuencia polipeptídica desde el nucleótido 14 al nucleótido 475 de SEC ID N.º 1. Los dos cebadores usados en la producción del fragmento de TACI fueron: (1) un cebador que contenía 40 pares de bases de la secuencia flanqueadora del vector en 5' y 17 pares de bases correspondientes al terminal amino del fragmento de TACI (5' CTCAGCCAGG AAATCCATGC CGAGTTGAGA CGCTTCCGTA GAATGAGTGG CCTGGGCCG 3'; SEC ID N.º 15); (2) 40 pares de bases del extremo 3' correspondiente a la secuencia Fc4 flanqueadora y 17 pares de bases correspondientes al terminal carboxilo del fragmento de TACI (5' GCATGTGTGA GTTTTGTCTG AAGATCTGGG CTCCTTCAGC CCCGGGAG 3'; SEC ID N.º 16). A un volumen final de 100 \mul se añadieron 10 ng del molde de TACI, 10 \mul de 10 x tampón de reacción de la polimerasa de Taq (Perkin Elmer), 8 \mul de dNTP 2,5 nM, 78 \mul de agua destilada, 2 \mul de cada una de las reservas 20 mM de los cebadores de oligonucleótido y polimerasa de Taq (2,5 unidades, Life Technology). Se añadió un volumen igual de aceite mineral y se calentó la reacción hasta 94ºC durante 2 minutos, seguidos de 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 65ºC durante 30 segundos, 65ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1 minuto seguido de una prolongación a 72ºC durante 5 minutos.
El fragmento que contenía el ADNc codificante del fragmento Fc4 fue construido de una manera similar. Los dos cebadores usados en la producción del fragmento Fc4 fueron (secuencia arriba y secuencia abajo) un cebador de oligonucleótido que contenía 40 pares de bases de la secuencia flanqueadora 5' de TACI y 17 pares de bases correspondientes al terminal amino del fragmento Fc4 (5' GCACAGAGGC TCAGAAGCAA GTCCAGCTCT CCCGGGGCTG AAGGAGCCCA GATCTTCAGA 3'; SEC ID N.º 17); y un cebador de oligonucleótido que contenía 40 pares de bases del extremo 3' correspondiente a la secuencia flanqueadora del vector y 17 pares de bases correspondientes al terminal carboxilo del fragmento Fc4 (5' GGGGTGGGTA CAACCCCAGA GCTGTTTTAA TCTAGATTAT TTACCCGGAG ACAGGG 3'; SEC ID N.º 18). A un volumen final de 100 \mul se añadieron 10 ng del molde de Fc4, anteriormente descrito, 10 \mul de 10 x tampón de reacción de la polimerasa de Taq (Perkin Elmer), 8 \mul de dNTP 2,5 nM, 78 \mul de agua destilada, 2 \mul de cada una de las reservas 20 mM de los oligonucleótidos y polimerasa de Taq (2,5 unidades, Life Technology). Se añadió un volumen igual de aceite mineral y se calentó la reacción hasta 94ºC durante 2 minutos, seguidos de 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 65ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1 minuto, seguido de una prolongación a 72ºC durante 5 minutos.
Se procesaron diez microlitros de cada una de las reacciones PCR de 100 \mul descritas anteriormente sobre gel de agarosa LMP al 0,8% (Seaplaque GTG) con 1 x tampón de TBE para análisis. Se precipitaron los 90 \mul restantes de cada reacción PCR con la adición de 5 \mul de cloruro de sodio 1M y 250 \mul de etanol absoluto. Se escindió el plásmido pZMP6 con SmaI para linealizarlo en el poliligador. El plásmido pZMP6 fue derivado del plásmido pCZR199 (Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA, ATCC n.º 98668) y es un vector de expresión de mamífero que contiene un casete de expresión que tiene el promotor temprano inmediato del citomegalovirus, un intrón consenso de la región variable del locus de cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón, múltiples sitios de restricción para la inserción de secuencias codificantes, un codón de terminación y un terminador de hormona del crecimiento humano. El plásmido también tiene un origen de replicación de E. coli, una unidad de expresión de marcadores seleccionables de mamífero que tiene un promotor de SV40, un potenciador y un origen de replicación, un gen de la dihidrofolato reductasa y el terminador de SV40. El vector pZMP6 fue construido a partir de pCZR199 mediante la sustitución del promotor de la metalotioneína con el promotor temprano inmediato del citomegalovirus y las secuencias de Kozac del extremo 5' del marco de lectura abierto.
Se combinaron cien microlitros de células de levadura competentes (S. cerevisiae) con 10 \mul que contenían aproximadamente 1 \mug del dominio extracelular de TACI y los fragmentos PCR de Fc4, y 100 ng del vector pZMP6 digerido por SmaI y transferido a una cubeta de electroporación de 0,2 cm. Se sometieron a electroporación las mezclas de levadura/ADN a 0,75 kV (5 kV/cm), \infty ohms, 25 \muF. Se añadieron a cada cuveta 600 \mul de sorbitol 1,2M y se emplacó la levadura en dos alícuotas de 300 \mul sobre placas URA-D que se incubaron a 30ºC.
Tras aproximadamente 48 horas, se volvieron a suspender los transformantes de levadura Ura+ de una sola placa en 1 ml de agua y se centrifugaron brevemente hasta hacer sedimentar las células de levadura. Se volvieron a suspender los sedimentos celulares en 1 ml de tampón de lisis (Triton X-100 al 2%; SDS al 1%; NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM). Se añadieron quinientos microlitros de la mezcla de lisis a un tubo Eppendorf que contenía 300 \mul de perlas de vidrio lavadas en ácido y 200 \mul de fenol-cloroformo, se sometió a movimientos vorticiales durante intervalos de 1 minuto dos o tres veces, seguidos de una centrifugación de 5 minutos en un centrifugador Eppendorf a la velocidad máxima. Se transfirieron trescientos microlitros de la fase acuosa a un tubo limpio, y se hizo precipitar el ADN con 600 \mul de etanol, siguiendo con una centrifugación durante 10 minutos a 4ºC. Se volvieron a suspender los sedimentos de ADN en 100 \mul agua.
La transformación de las células de E. coli electrocompetentes (DH10B, GibcoBRL) se realizó con 0,5-2 ml de preparación de ADN de levadura y 40 \mul de células DH10B. Se electropulsaron las células a 2,0 kV, 25 mF y 400 ohms. Tras la electroporación, se emplacaron 1 ml de SOC (Bacto-Triptona al 2% (Difco, Detroit, MI)), extracto de levadura al 2,5% (Difco), NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM; MgCl_{2} 10 mM; MgSO_{4} 10 mM, glucosa 20 mM) en alícuotas de 250 \mul sobre cuatro placas LB/AMP (Caldo de L.B. (Lennox), Bacto-Agar al 1,8% (Difco), 100 mg/l de ampicili-
na).
Se identificaron clones individuales que albergaban el constructo de expresión correcto para TACI-Fc4 mediante digestión por restricción para verificar la presencia del inserto y para confirmar que diversas secuencias de ADN se habían unido correctamente entre sí. Se sometió a un análisis secuencial el inserto de clones positivos. Se aísla el ADN plasmídico a gran escala con el equipo Qiagen Maxi (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.
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C. Construcción de Fc5, Fc6 y Fc7
En Fc5, se volvió a cambiar el residuo de Arg de la posición de índice EU 218 por un residuo de Lys. La Ig\gamma1 humana de tipo natural contiene una lisina en esta posición. En síntesis, se produjeron moléculas de ácido nucleico que codificaban Fc5 usando los cebadores de oligonucleótido 5' GAGCCCAAATCTTCAGACAAAACTCACA
CATGCCCA 3' (SEC. ID. N.º 19) y 5' TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' (SEC. ID. N.º 20). Las condiciones para la amplificación por PCR fueron las siguientes. A un volumen final de 50 \mul se añadieron 236 ng del molde de Fc4, 5 \mul de 10 x tampón de reacción de Pfu (Stratagene), 4 \mul de dNTP 2,5 mM, 1 \mul de cada uno de los oligonucleótidos 20 \muM y 1 \mul de polimerasa de Pfu (2,5 unidades, Stratagene). El perfil térmico de la amplificación consistió en 94ºC durante 2 minutos, 5 ciclos a 94ºC durante 15 segundos, 42ºC durante 20 segundos, 72ºC durante 45 segundos, 20 ciclos a 94ºC durante 15 segundos, 72ºC durante 1 minuto y 20 segundos, seguidos de una prolongación a 72ºC durante 7 minutos. Se fraccionó el producto de reacción mediante electroforesis sobre gel de agarosa y se detectó la banda correspondiente al tamaño predicho de aproximadamente 718 pares de bases. Se extirpó la banda del gel y se recuperó usando un equipo de extracción de gel QIAGEN QIAquick (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.
Fc6 es idéntico a Fc5, a excepción de que el codón de lisina carboxi-terminal ha sido eliminado. Como en los Fc4 y Fc5 anteriores, el codón de terminación de la secuencia de Fc6 fue cambiado a TAA. Fc6 se generó a partir del molde de ADN que codificaba Fc5 usando los cebadores de oligonucleótido 5' GAGCCCAAAT CTTCAGACAA AACTCACACA TGCCCA 3' (SEC ID N.º 19) y 5' GGCGCGCCTC TAGATTAACC CGGAGACAGG GAGAGGC 3' (SEC ID N.º 21).
Fc7 es idéntico al Fc de \gamma1 de tipo natural, a excepción de una sustitución de un aminoácido situado en la posición del índice EU Asn 297 ubicada en el dominio CH2. Se mutó Asn-297 a un residuo de Gln para evitar la unión del hidrato de carbono ligado a N en esa posición de residuo. Como antes, el codón de terminación de la secuencia de Fc7 fue cambiado a TAA. Fc7 se generó mediante una PCR de solapamiento usando ADNc de Fc de IgC\gammal humana de tipo natural como molde y los cebadores de oligonucleótido 5' GAGCCCAAATCTTGCGACAAAACTCACA 3' (SEC ID N.º 22) y 5' GTACGTGCTTTGGTACTGCTCCTCCCGCGGCTT 3' (SEC ID N.º 23) para generar la mitad de 5' de Fc7, y los cebadores de oligonucleótido 5' CAGTACCAAAGCACGTACCGTGTGGTCA 3' (SEC ID N.º 24) y 5' TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3' (SEC ID N.º 20) para generar la mitad de 3' de Fc7. Los dos productos de la PCR se combinaron y se amplificaron usando los cebadores de oligonucleótido 5' GAGCCCAAATCTTGCGACAAAACTCACA 3' (SEC ID N.º 22) y 5' TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATT
TACCCGGAGACA 3' (SEC ID N.º 20).
Todos los productos resultantes de la PCR fueron purificados sobre gel, clonados y verificados mediante el análisis de las secuencias de ADN.
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D. Construcción de proteínas de fusión de TACI-Fc amino-truncadas
Se generaron cuatro versiones truncadas en el terminal amino de TACI-Fc. Las cuatro tenían una secuencia señal modificada del activador tisular del plasminógeno humano (SEC ID N.º 25) fusionada con el residuo de aminoácido número 30 de SEC ID N.º 2. Sin embargo, las cuatro proteínas diferían en la ubicación del punto en el que Fc5 estaba fusionado con la secuencia de aminoácidos de TACI de SEC ID N.º 2. La tabla 3 resume las estructuras de las cuatro proteínas de fusión.
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TABLA 3
5
Los casetes de expresión codificantes de las proteínas se generaron mediante PCR de solapamiento usando técnicas estándar (véase, por ejemplo, Horton et al., Gene 77:61 (1989)). Se usaron una molécula de ácido nucleico codificante de TACI y una molécula de ácido nucleico codificante de Fc5 como moldes para la PCR. En las tablas 4 y 5, se identifican los cebadores de oligonucleótido.
TABLA 4
6 
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TABLA 5
8
La primera serie de las amplificaciones por PCR constó de dos reacciones para cada una de las cuatro versiones truncadas en el terminal amino. Las dos reacciones se llevaron a cabo por separado usando los oligonucleótidos de TACI 5' y 3' en una reacción, y los oligonucleótidos de Fc5 5' y 3' en otra reacción para cada versión. Las condiciones para la primera serie de la amplificación por PCR fueron las siguientes: a un volumen final de 25 \mul se añadieron aproximadamente 200 ng del molde de ADN, 2,5 \muL de 10 x tampón de reacción de Pfu (Stratagene), 2 \mul de dNTP 2,5 mM, 0,5 \mul de cada oligonucleótido 5' y oligonucleótido 3' 20 \muM y 0,5 \mul de polimerasa de Pfu (2,5 unidades, Stratagene). El perfil térmico de la amplificación consistió en 94ºC durante 3 minutos, 35 ciclos a 94ºC durante 15 segundos, 50ºC durante 15 segundos, 72ºC durante 2 minutos, seguidos de una prolongación a 72ºC durante 2 minutos. Se fraccionaron los productos de reacción mediante electroforesis sobre gel de agarosa y se extirparon del gel las bandas correspondientes a los tamaños predichos y se recuperaron usando un equipo de extracción de gel QIAGEN QIAquick (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.
La segunda serie de amplificación por PCR, o reacción de amplificación por PCR de solapamiento, se realizó usando los fragmentos purificados sobre gel de la primera serie de PCR como molde de ADN. Las condiciones para la segunda serie de la amplificación por PCR fueron las siguientes: a un volumen final de 25 \mul se añadieron aproximadamente 10 ng del molde de ADN del fragmento de ADN y del fragmento de Fc5, 2,5 \muL de 10 x tampón de reacción de Pfu (Stratagene), 2 \mul de dNTP 2,5 mM, 0,5 \mul de cada ZC24.903 (SEC ID N.º 40) y ZC24.946 (SEC ID N.º 20) 20 \muM y 0,5 \mul de polimerasa de Pfu (2,5 unidades, Stratagene). El perfil térmico de la amplificación consistió en 94ºC durante 1 minutos, 35 ciclos a 94ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 15 segundos, 72ºC durante 2 minutos, seguidos de una prolongación a 72ºC durante 2 minutos. Se fraccionaron los productos de reacción mediante electroforesis sobre gel de agarosa, y se extirparon del gel las bandas correspondientes a los tamaños predichos y se recuperaron usando un equipo de extracción de gel QIAGEN QIAQUICK (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.
Se clonó por separado cada una de las cuatro versiones de los productos de la PCR de TACI-Fc con el terminal amino truncado usando el equipo de clonación de PCR ZEROBLUNT TOPO de Invitrogen siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. La tabla 6 identifica las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de estos constructos de TACI-Fc.
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TABLA 6
9
Una vez verificadas las secuencias de nucleótidos, se digirieron plásmidos que comprendían cada una de las cuatro versiones de las fusiones de TACI-Fc con el terminal amino truncado con FreI y AscI para liberar los segmentos codificantes de los aminoácidos. Se unieron los fragmentos de FreI/AscI en un vector de expresión de mamífero que contenía el promotor del CMV y un segmento poli(A) de SV40. Los vectores de expresión se introdujeron en células de ovario de hámster chino según lo descrito más adelante.
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Ejemplo 2 Producción de proteínas de TACI-Fc por células de ovario de hámster chino
Se usaron los constructos de expresión de TACI-Fc para transfectar, mediante electroporación, células DG44 de ovario de hámster chino (CHO) adaptadas a una suspensión desarrolladas en medio libre de proteínas animales (Urlaub et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555 (1986)). Las células DG44 CHO carecen de un gen de la dihidrofolato reductasa funcional debido a las eliminaciones en ambas ubicaciones cromosómicas de la dihidrofolato reductasa. El crecimiento de las células en presencia de concentraciones crecientes de metotrexato da como resultado la amplificación del gen de la dihidrofolato reductasa y del gen codificado por la proteína recombinante ligada en el constructo de expresión.
Se pasaron las células DG44 CHO a medio PFCHO (JRH Biosciences, Lenexa, KS), L-glutamina 4 mM (JRH Biosciences) y 1 x suplemento de hipotanxina-timidina (Life Technologis), y se incubaron las células a 37ºC y CO_{2} al 5% en matraces de agitación Corning a 120 rpm sobre una plataforma agitadora por rotación. Las células se transfectaron por separado con plásmidos de expresión linealizados. Para garantizar la esterilidad, se realizó una sola etapa de precipitación en etanol sobre hielo durante 25 minutos mediante la combinación de 200 \mug de ADN plasmídico en un tubo Eppendorf con 20 \mul de ADN vehículo de esperma de salmón triturado (5' \rightarrow 3' Inc. Boulder, CO, 10 mg/ml), 22 \mul de NaOAc 3M (pH 5,2) y 484 \mul de etanol al 100% (Gold Shield Chemical Co., Hayward, CA). Tras la incubación, se centrifugó el tubo a 14.000 rpm en un microcentrifugador colocado en una sala fría a 4ºC, se retiró el sobrenadante y se lavaron los sedimentos dos veces con 0,5 ml de etanol al 70% y se dejaron secar al aire.
Las células DG44 CHO se prepararon mientras se secaban los sedimentos de ADN mediante la centrifugación de 10^{6} células totales (16,5 ml) en un tubo de centrifugación cónica de 25 ml a 900 rpm durante 5 minutos. Se volvieron a suspender las células DG44 CHO en un volumen total de 300 \mul de medio de crecimiento PFCHO y se colocaron en una cubeta para Gene-Pulser con una separación de las puntas dl electrodo de 0,4 cm (Bio-Rad). Se volvió a suspender el ADN, tras un tiempo de secado de aproximadamente 50 minutos, en 500 \mul de medio de crecimiento PFCHO y se añadieron las células a la cubeta tal que el volumen total no superara los 800 \mul, y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos para disminuir la formación de burbujas. Se colocó la cubeta en una unidad II del electroporador Gene Pulser de BioRad configurado a 0,296 kV (kilovoltios) y 0,950 de AC (Alta Capacidad) y se realizó de inmediato la electroporación.
Se incubaron las células durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de colocarlas en un volumen total de 20 ml de medios PFCHO en un matraz T-75 de CoStar. Se colocó el matraz a 37ºC y CO_{2} al 5% durante 48 horas, luego se contaron las células con un hemocitómetro utilizando la exclusión con azul de tripano y se pusieron en medios de selección PFCHO sin suplemento de hipotanxina-timidina y que contenían metotrexato 200 mM (Cal Biochem).
Tras la recuperación del procedimiento de selección en metotrexato, se examinaron los medios acondicionados que contenían proteínas TACI-Fc secretadas mediante análisis de transferencia Western.
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Ejemplo 3 Análisis estructural de las proteínas TACI-Fc
En ciertos casos, se purificaron parcialmente las proteínas de fusión de TACI-Fc antes de su análisis. Se filtró de forma estéril el medio acondicionado de los cultivos de ovario de hámster chino a través de un filtro de 0,22 \mum y se capturó la proteína TACI-Fc sobre una columna de proteína A. Se eluyó el material unido a la proteína A y se pasó a una columna de exclusión por tamaño S-200 para la purificación final.
Se realizó un análisis de transferencia Western tanto en el medio celular acondicionado como en la proteína purificada para evaluar la estabilidad estructural de las proteínas TACI-Fc. En síntesis, se transfirieron muestras de proteína o de sobrenadante a membranas de nitrocelulosa y se detectaron las proteínas TACI-Fc usando IgG2a de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa (Boehringer Mannheim) o antisueros específicos de la Fc de la IgG de cabra anti-humana conjugada con peroxidasa (Pierce).
Se realizaron análisis de las secuencias de aminoácidos amino-terminales sobre los sistemas secuenciadores de proteínas modelo 476A y 494 de la División de Applied Biosystems de Perkin Elmer (Foster City, CA). Los análisis de datos se realizaron con el sistema de análisis de datos modelo 610A de Applied Biosystems para la secuenciación de proteínas, versión 2.1a (Applied Biosystems, Inc.). La mayoría de los suministros y los reactivos usados eran de Applied Biosystems, Inc.
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Ejemplo 4 Análisis funcional de las proteínas TACI-Fc
Se usaron dos enfoques para examinar las características de unión para cuatro proteínas TACI-Fc con ZTNF4. Un enfoque midió la capacidad de los constructos de TACI-Fc para competir con las placas revestidas de TACI en la unión de ZTNF4 marcado con ^{125}I. En el segundo enfoque, se incubaron concentraciones crecientes de ZTNF4 marcado con ^{125}I con cada constructo de TACI-Fc, y se determinó la radiactividad asociada a los complejos de ZTNF4-TACI-Fc precipitados. Las proteínas de fusión de TACI-Fc tenían restos de TACI que carecían de los primeros 29 residuos de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 2. Una de las proteínas de fusión tenía un resto de TACI con una región del tallo intacta (TACI (d1-29)-Fc5), mientras que tres de las proteínas de fusión de TACI-Fc tenían restos de TACI con diversas eliminaciones en la región del tallo (TACI (d1-29, d107-154)-Fc5; TACI (d1-29, d111-154)-Fc5; TACI (d1-29, d120-154)-Fc5).
A. Ensayo de unión competitiva
Se radioyoduró ZTNF4 con perlas de yodo (Pierce) según los procedimientos estándar. En síntesis, se yoduraron 50 \mug del ZTNF4 con 4 mCi de ^{125}I usando una sola perla de yodo. Se detuvo la reacción con una solución al 0,25% de albúmina de suero bovino y se retiró el ^{125}I libre mediante filtración sobre gel usando una columna PD-10 (Pierce). Se determinó la radiactividad específica de las preparaciones de ^{125}I-ZTNF4 mediante precipitación en ácido tricloroacético antes y después de la etapa de desalinización.
Se añadió un fragmento N-terminal del receptor TACI, denominado "TACI-N" a placas de 96 pocillos (100 \mul a 0,1 \mug/ml) y se incubaron durante una noche a 4ºC. Se lavaron las placas, se bloquearon con Superblock (Pierce) y se volvieron a lavar. Se mezclaron los constructos de TACI-Fc, a diversas concentraciones que variaban de 0 a 11,5 ng/ml, con una concentración fija de ^{125}I-ZTNF4 (20 ng/ml) y se incubaron durante 2 horas a 37ºC sobre la placa revestida con TACI-N. Los controles bien contenían TACI-N en disolución o carecían de TACI-Fc. Tras la incubación, se lavaron las placas y se realizó el recuento. Cada determinación se realizó por triplicado.
Los resultados mostraron que todos los constructos de TACI-Fc inhibieron la unión de ^{125}I-ZTNF4 completamente a concentraciones de aproximadamente 100 ng/ml o superiores. Las proteínas TACI-Fc, TACI (d1-29)-Fc5, TACI (d1-29, d111-154)-Fc5 y TACI (d1-29, d120-154)-Fc5 fueron inhibidores más eficaces que el constructo de TACI-Fc, TACI (d1-29, d107-154-Fc5. Un fragmento Fc sólo no inhibió la unión. Se calcularon los valores de CI_{50} para cada constructo en tres experimentos. Los valores medios para los constructos fueron: TACI (d1-29)-Fc5: 2,07 nM; TACI (d1-29, d107-154)-Fc5: 4,95 nM; TACI (d-129, d111-154) Fc5: 2,31 nM; y TACI (d1-29, d120-154)-Fc5: 2,21 nM.
B. Ensayo de unión en disolución
Se incubó una concentración de 0,05 nM de cada constructo de TACI-Fc con 0,4 pM a 1,5 nM de I-ZTNF4 durante 30 minutos a temperatura ambiente en un volumen total de 0,25 ml/tubo. Se añadió una suspensión de Pansorbina (Staph A) a cada tubo y, tras 15 minutos, se centrifugaron las muestras, se lavaron dos veces y se realizó el recuento de los sedimentos. Se determinó la unión inespecífica mediante la adición de ZTNF4 sin marcar 130 nM a la mezcla de ^{125}I-ZTNF4/TACI-Fc. Se calculó la unión específica restando la cpm unida en presencia de ZTNF4 sin marcar de la cpm unida total a cada concentración de ^{125}I-ZINF4. Cada determinación se realizó por triplicado. Se calcularon las constantes de unión usando el programa informático GraphPad Prism (MacIntosh v. 3.0).
La figura 4 ilustra la unión específica de ^{125}I-ZTNF4 con los diversos constructos de TACI-Fc. La unión pareció acercarse a la saturación con cada constructo, y fue significativamente superior para los constructos TACI (d1-29)-Fc5, TACI (d1-29, d111-154-Fc5, TACI (d1-29, d120-154-Fc5, en comparación con la unión de TACI (d1-29, d107-154-Fc5. Se calcularon los valores de Bmax y Kd, y en la tabla 7 se resumen los resultados.
TABLA 7
10 
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Ejemplo 5 Medición del ZTNF2 circulante
Se determinaron los niveles de ZTNF4 en los individuos con una afección patológica (tal como el LES, la artritis reumatoide, por ejemplo) en comparación con individuos normales usando un análisis de electroquimioluminiscencia. Se preparó una curva estándar a partir de ZTNF4 humano soluble a 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,01 ng/ml y 0 ng/ml en tampón ORIGIN (Igen, Gaithersburg, MD). Se diluyeron muestras de suero en tampón ORIGIN. Se incubaron los patrones y las muestras a temperatura ambiente durante dos horas con anticuerpo anti-ZTNF4-NF BV humano de conejo biotinilado diluido hasta 1 \mug/ml en tampón para análisis Origin (IGEN) y anticuerpo policlonal anti-ZTNF4-NF BV humano de conejo rutenilado diluido hasta 1 \mug/ml en tampón para análisis Origin (IGEN). Tras la incubación, se sometieron las muestras a movimientos vorticiales y se añadieron 0,4 mg/ml de perlas Dynabeads (Dynal, Oslo, Noruega) de estreptavidina a cada patrón y cada muestra a 50 \mul/tubo, y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Entonces se sometieron las muestras a movimientos vorticiales y se leyeron sobre un analizador Origin (Igen) según las instrucciones del fabricante. El análisis Origin se basa en la electroquimioluminiscencia y produce una lectura en ECL. En un estudio, se detectó un nivel elevado de ZTNF4 en las muestras de suero de ratones tanto NZBWF1/J como MRL/Mpj-Fas1pr, lo que ha progresado hasta estadios avanzados de glomerulonefritis y enfermedad autoinmune.
El Análisis ORIGIN también se usó para medir los niveles de ZTNF4 en la sangre de pacientes de LES, en comparación con los niveles de circulación en individuos normales. Se preparó una curva estándar a partir de ZTNF4 humano soluble a 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,01 ng/ml y 0 ng/ml en tampón ORIGIN (Igen). Todas las muestras de los pacientes fueron procesadas por triplicado con un volumen final de 25 \mul. Se incubaron los patrones y las muestras a temperatura ambiente durante dos horas con anticuerpo de captura, anticuerpo policlonal anti-ZTNF4-NF BV humano de conejo biotinilado diluido hasta 1 \mug/ml en tampón para análisis Origin (IGEN) y un anticuerpo de detección, anticuerpo policlonal anti-ZTNF4-NF BV humano de conejo rutenilado diluido hasta 1 \mug/ml en tampón para análisis Origin (IGEN). Tras la incubación, se sometieron las muestras a movimientos vorticiales y se añadieron 0,4 mg/ml de perlas Dynabeads (Dynal) de estreptavidina a cada patrón y cada muestra a 50 \mul/tubo, y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Entonces se sometieron las muestras a movimientos vorticiales y se analizaron sobre un analizador 1.5 Origin (Igen) según las instrucciones del fabricante.
Este análisis incluía 28 muestras control normales y muestras de 20 pacientes diagnosticados con LES. Se observaron niveles elevados de ZTNF4 en el suero de los pacientes diagnosticados con LES, en comparación con los donantes de suero control normal. Los niveles de ZTNF4 se calcularon como un aumento de los niveles de ZTNF4 en el paciente o las muestras control en comparación con una muestra de suero humano de referencia arbitraria. La media de las 28 muestras control fue de 1,36 veces frente a la muestra de referencia humana y la media de las 20 muestras de los pacientes de LES fue de 4,92. Siete de los 20 pacientes de LES tenían niveles de ZTNF4 que eran dos veces la media de las muestras control, mientras que sólo hubo un individuo control que presentó un nivel de más del doble de la media control.
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.
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<160> 70
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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
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12
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<223> tPA líder optimizado.
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\newpage
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<212> ADN
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de inmunoglobulina modificado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)...(759)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
46
47
48 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 251
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
49
490 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 762
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de inmunoglobulina modificado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)...(759)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
50
51
52 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 251
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
53 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm111 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm112 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm113 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm114 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm115 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm116 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm117 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm118 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm119 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1214
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)...(1192)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
54
55
56 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 392
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
57
58 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1070
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)...(1048)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
59
60
61 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 344
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
62 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1082
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)...(1060)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
64
65
66 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 348
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
67
68 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)...(1090)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
69
70
71 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 357
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
72
73 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos ilustrativa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm120 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos ilustrativa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm121 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 586
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)...(578)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
74
75 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
76
760 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia señal de la V_{H} de 26-10.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm77 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 332
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm78
79 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 5'-UTR de la V_{H} de 26-10.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm80 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 5'-UTR de la V_{H} de 26-10 modificada.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm81 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia señal de la V_{H} de 26-10.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(57)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
82 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Intrón de la V_{H} de 26-10.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm83 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1135
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
84 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1135
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
85
86 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 884
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Constructo promotor de la LTR del MPSV/potenciador del CMV.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
87 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 455
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor de la LTR del MPSV sin la región de control negativo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
88

Claims (32)

1. Utilización de una proteína de fusión de activador transmembrana e interaccionador con el modulador del calcio y el ligando de la ciclofilina (TACI)-inmunoglobulina para la fabricación de un medicamento para inhibir la proliferación de células tumorales, en el que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina comprende:
(a) un resto de receptor TACI que consta de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:
(i)
los residuos de aminoácido 34 a 104 de SEC ID N.º 2;
(ii)
los residuos de aminoácido 30 a 110 de SEC ID N.º 2; y
(iii)
los residuos de aminoácido 30 a 154 de SEC ID N.º 2;
en la que el resto de receptor TACI se une con al menos uno entre ZTNF2 o ZTNF4; y
(b) un resto de inmunoglobulina que comprende una región constante de una inmunoglobulina.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Utilización según la reivindicación 1, en el que el medicamento comprende la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina y un vehículo farmacéuticamente aceptable, y en el que la composición farmacéutica es para su administración a un sujeto mamífero que tiene un tumor.
3. Utilización según la reivindicación 2 para inhibir la proliferación de linfocitos B en el sujeto mamífero.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Utilización de una proteína de fusión de activador transmembrana e interaccionador con el modulador del calcio y el ligando de la ciclofilina (TACI)-inmunoglobulina para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad autoinmune, en el que la proteína de fusión e TACI-inmunoglobulina comprende:
(a) un resto de receptor TACI que consta de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:
(i)
los residuos de aminoácido 34 a 104 de SEC ID N.º 2;
(ii)
los residuos de aminoácido 30 a 110 de SEC ID N.º 2; y
(iii)
los residuos de aminoácido 30 a 154 de SEC ID N.º2;
en la que el resto de receptor TACI se une con al menos uno entre ZTNF2 o ZTNF4; y
(b) un resto de inmunoglobulina que comprende una región constante de una inmunoglobulina.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Utilización según la reivindicación 4, en el que dicha enfermedad autoinmune se selecciona del grupo constituido por lupus eritematoso sistémico, miastenia grave, esclerosis múltiple, diabetes mellitus dependiente de la insulina, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil de curso poliarticular y artritis psoriática.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Utilización de una proteína de fusión de activador transmembrana e interaccionador con el modulador del calcio y el ligando de la ciclofilina (TACI)-inmunoglobulina para la fabricación de un medicamento para tratar asma, bronquitis o enfisema, en el que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina comprende:
(a) un resto de receptor TACI que consta de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:
(i)
los residuos de aminoácido 34 a 104 de SEC ID N.º 2;
(ii)
los residuos de aminoácido 30 a 110 de SEC ID N.º 2; y
(iii)
los residuos de aminoácido 30 a 154 de SEC ID N.º2;
en la que el resto de receptor TACI se une con al menos uno entre ZTNF2 o ZTNF4; y
(b) un resto de inmunoglobulina que comprende una región constante de una inmunoglobulina.
\newpage
7. Utilización de una proteína de fusión de activador transmembrana e interaccionador con el modulador del calcio y el ligando de la ciclofilina (TACI)-inmunoglobulina para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad renal, en el que la proteína de TACI-inmunoglobulina comprende:
(a) un resto de receptor TACI que consta de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:
(i)
los residuos de aminoácido 34 a 104 de SEC ID N.º 2;
(ii)
los residuos de aminoácido 30 a 110 de SEC ID N.º 2; y
(iii)
los residuos de aminoácido 30 a 154 de SEC ID N.º2;
en la que el resto de receptor TACI se une con al menos uno entre ZTNF2 o ZTNF4; y
(b) un resto de inmunoglobulina que comprende una región constante de una inmunoglobulina.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Utilización según la reivindicación 7, en el que dicha enfermedad renal se selecciona del grupo constituido por insuficiencia renal en estadio terminal, glomerulonefritis, vasculitis, nefritis, amiloidosis y pielonefritis.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Utilización de una proteína de fusión de activador transmembrana e interaccionador con el modulador del calcio y el ligando de la ciclofilina (TACI)-inmunoglobulina para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad o un trastorno asociado con inmunosupresión, rechazo de injertos, enfermedad del injerto frente al huésped, inflamación, dolor articular, hinchazón, anemia y choque séptico, en el que la proteína de TACI-inmunoglobulina comprende:
(a) un resto de receptor TACI que consta de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:
(i)
los residuos de aminoácido 34 a 104 de SEC ID N.º 2;
(ii)
los residuos de aminoácido 30 a 110 de SEC ID N.º 2; y
(iii)
los residuos de aminoácido 30 a 154 de SEC ID N.º2;
en la que el resto de receptor TACI se une con al menos uno entre ZTNF2 o ZTNF4; y
(b) un resto de inmunoglobulina que comprende una región constante de una inmunoglobulina.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Utilización de una proteína de fusión de activador transmembrana e interaccionador con el modulador del calcio y el ligando de la ciclofilina (TACI)-inmunoglobulina para la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno seleccionado entre neoplasma, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple, linfoma de no Hodgkin, enfermedad linfoproliferativa posterior a un transplante y gammopatía de cadena ligera, en el que la proteína de TACI-inmunoglobulina comprende:
(a) un resto de receptor TACI que consta de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:
(i)
los residuos de aminoácido 34 a 104 de SEC ID N.º 2;
(ii)
los residuos de aminoácido 30 a 110 de SEC ID N.º 2; y
(iii)
los residuos de aminoácido 30 a 154 de SEC ID N.º2;
en la que el resto de receptor TACI se une con al menos uno entre ZTNF2 o ZTNF4; y
(b) un resto de inmunoglobulina que comprende una región constante de una inmunoglobulina.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Utilización según cualquier reivindicación anterior, en el que el resto de receptor TACI consta de los residuos de aminoácido 34 a 104 de SEC ID N.º 2 y en el que la proteína de fusión comprende además un segmento del tallo que consta de una serie continua de 2 a 50 residuos de aminoácido consecutivos que parte del residuo de aminoácido 105 de SEC ID N.º 2.
12. Utilización según cualquier reivindicación anterior, en el que el resto de inmunoglobulina comprende una región constante de cadena pesada.
13. Utilización según la reivindicación 12, en el que el resto de inmunoglobulina comprende una región constante de cadena pesada humana.
14. Utilización según la reivindicación 13, en el que la región constante de cadena pesada es una región constante de cadena pesada de IgG1.
15. Utilización según la reivindicación 14, en el que el resto de inmunoglobulina es un fragmento Fc de IgG1 que comprende los dominios C_{H2} y C_{H3}.
16. Utilización según la reivindicación 15, en el que el resto de inmunoglobulina es un fragmento Fc de IgG1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 33.
17. Utilización según la reivindicación 16, en el que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 54.
18. Utilización según cualquier reivindicación anterior, en el que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina es un dímero.
19. Utilización según cualquier reivindicación anterior, en el que el medicamento es para su administración a células cultivadas in vitro.
\vskip1.000000\baselineskip
20. Proteína de fusión que comprende:
(a) un resto de receptor activador transmembrana e interaccionador con el modulador del calcio y el ligando de la ciclofilina (TACI), en la que el resto de receptor TACI consta de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:
(i)
los residuos de aminoácido 34 a 104 de SEC ID N.º 2;
(ii)
los residuos de aminoácido 30 a 110 de SEC ID N.º 2; y
(iii)
los residuos de aminoácido 30 a 154 de SEC ID N.º2;
en la que el resto de receptor TACI se une con al menos uno entre ZTNF2 o ZTNF4; y
(b) un resto de inmunoglobulina que comprende una región constante de una inmunoglobulina.
\vskip1.000000\baselineskip
21. Proteína de fusión según la reivindicación 20, en la que el resto de receptor TACI consta de los residuos de aminoácido 34 a 104 de SEC ID N.º 2, y en la que la proteína de fusión comprende además un segmento del tallo que consta de una serie continua de 2 a 50 residuos de aminoácido consecutivos que parte del residuo de aminoácido 105 de SEC ID N.º 2.
22. Proteína de fusión de la reivindicación 20 ó 21, en la que el resto de inmunoglobulina comprende una región constante de cadena pesada.
23. Proteína de fusión de la reivindicación 22, en la que el resto de inmunoglobulina comprende una región constante de cadena pesada humana.
24. Proteína de fusión de la reivindicación 23, en la que la región constante de cadena pesada es una región constante de cadena pesada de IgG1.
25. Proteína de fusión de la reivindicación 24, en la que el resto de inmunoglobulina es un fragmento Fc de IgG1 que comprende los dominios C_{H2} y C_{H3}.
26. Proteína de fusión de la reivindicación 25, en la que el resto de inmunoglobulina es un fragmento Fc de IgG1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 33.
27. Proteína de fusión de la reivindicación 26, en la que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 54.
28. Proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 20-27, en la que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina es un dímero.
29. Molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 20-28.
\newpage
30. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 29, en la que la molécula de ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 53.
31. Composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una proteína de fusión de activador transmembrana e interaccionador con el modulador del calcio y el ligando de la ciclofilina (TACI)-inmunoglobulina, en la que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º: 54.
32. Composición farmacéutica según la reivindicación 31, en la que la proteína de fusión de TACI-inmunoglobulina es un dímero.
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