CN103833856B - 抑制taci‑baff复合物形成的融合蛋白及其制法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了抑制TACI‑BAFF复合物形成的融合蛋白及其制法和用途。具体地，本发明的融合蛋白具有封闭BAFF/APPRIL的高生物活性，可明显降低正常Balb/c小鼠血清IgM浓度，以及C57/B6哮喘小鼠血清IgM和IgE浓度。本发明的TACI‑Fc融合蛋白可用于治疗自身免疫性疾病，包括哮喘、***性红斑狼疮、类风湿性关节炎等,还可用于治疗B细胞增多相关疾病，包括多发性骨髓瘤，慢性淋巴细胞白血病，巨球蛋白血症，浆细胞性白血病等。

Description

抑制TACI-BAFF复合物形成的融合蛋白及其制法和用途

技术领域

本发明涉及生物和药物领域，更具体地涉及抑制TACI-BAFF复合物形成的融合蛋白(如TACI-Fc融合蛋白)及其制法和用途。

背景技术

TNF及其受体超家族成员在机体的防御、炎症反应、免疫调节等过程中起着重要作用。它们能通过旁分泌、自分泌及内分泌，以膜结合型或可溶性形式而发挥作用，当其与相应的受体结合后，可引起一系列的生物效应。

TNF家族受体通常是I型跨膜蛋白，由若干富含半胱氨酸结构域(CRD)的胞外区和包含TRAF蛋白连接位点的胞内区组成，胞内区在某些情况下还含有死亡结构。

人TACI(transmembrane activator and calcium modulator andcyclophilinligand-interactor)属TNFR超家族，是有293个氨基酸残基的Ⅲ型膜蛋白(胞外功能区166个，穿膜区10个，胞内功能区117个)，氨基端无信号肽。胞外有2个富含半胱氨酸的重复区(S33-66和C70-C104)，但与其它TNF受体超家族成员相比缺少TNF家族的“死亡结构”。TACI主要在B细胞和活化的T细胞上表达，调控T细胞非依赖性的B细胞抗体反应、类型转换以及B细胞的稳态，可能在传导负性信号方面具有更重要的作用^[1]。

B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator factor，BAFF，或称BLyS、THANK、zTNF-4、TALL-1及TNFSF-13B)和增殖诱导配体(Aproliferation-inducing factor,APRIL，或称TALL-2、TRDL-1及TNFSF-13)是新近发现的TNF配体超家族两个关系密切的成员，与B淋巴细胞的发育、T细胞活化及体液免疫直接相关，而BAFF与APRIL的过度表达又有可能参与自身反应性B细胞的产生和自身免疫耐受的破坏，影响免疫应答，导致各种自身免疫性疾病和恶性肿瘤的发生。BAFF可与受体BCMA(B cell maturation antigen)、TACI(TNFRhomology transmernrane activator and calcium modulator andcyclophilin ligandintemtor)和BAFF-R(BAFF receptor，BR3)结合，3个受体均为Ⅲ型跨膜蛋白，属于TNFR超家族，而BCMA与TACI同时也是APRIL的受体。

TACI为BAFF和APRIL的受体^[2]，即能识别BAFF，又能作用于APPIL。此外，BAFF/APRRIL异源三聚体似乎只能被TACI所识别^[3]。

BAFF/APPRIL作为重要的免疫调节分子，在维持B细胞动态平衡中发挥关键作用。

BAFF具有很强的B细胞趋化性，能诱导活化的B细胞分泌大量的免疫球蛋白如IgG、IgA、IgM等，增强体液免疫应答，而且也可作为共刺激因子调节T细胞的活化与应答。在体内，它可以促进脾脏内T1～B细胞向T2～B细胞以及成熟B细胞的发育。BAFF的过度表达有可能涉及自身反应性B细胞的产生和自身免疫耐受的破坏，即BAFF信号的改变会影响体液免疫应答，导致自身免疫性疾病或肿瘤。

研究显示，在自身免疫疾病患者体内如***性红斑狼疮病人血清中BAFF/APPRIL水平明显升高，其抗-dsDNA抗体的滴度呈正相关^[4]。在类风湿性关节炎病人，血清BAFF/APPRIL水平明显升高^[5]。

由于BAFF/APPRIL得过量表达与自身免疫性疾病密切相关，以其为靶分子设法阻断其活性，可以减少疾病的发生，减轻发病的症状，从而达到缓解和治疗自身免疫疾病的目的。封闭BAFF/APPRIL信号的抗体或其相关受体可以特异地作用于靶细胞，有望成为治疗自身免疫疾病的新的生物制剂。

因此，本领域迫切需要开发新的、可有效抑制或封闭BAFF/APPRIL途径的化合物。

发明内容

本发明的目的就是提供一种新的可有效抑制或封闭BAFF/APPRIL途径的化合物。

在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括融合在一起的以下元件：(a)TNF受体或其活性片段；(b)BAFF受体或其活性片段，其中所述的BAFF受体b包括TACI，BCMA，BAFFR或其组合；和(c)抗体Fc区域；

并且所述融合蛋白具有以下功能：抑制TACI-BAFF复合物的形成。

在另一优选例中，所述的融合蛋白保留了上述元件(a)和(b)的生物活性。

在另一优选例中，所述的融合蛋白还具有以下一种或多种功能：

(a)结合于BAFF的活性；

(b)结合于TALL-2/APRIL的活性；

(c)降低IgE的血清浓度；

(d)降低血清免疫球蛋白的浓度如IgM等；

(e)降低脾脏重量；

(f)抑制或封闭BAFF/APPRIL途径；

(g)减少B细胞数量。

在另一优选例中，所述的融合蛋白具有下式I或II所示的结构：

X-Y-Z Y-X-Z

式I 式II

式中，

X为TNF受体胞外区的第一结构域、或含第一结构域的TNF受体胞外区(如第一至第二结构域、第一至第三结构域和第一至第四结构域)；

Y为全长的TACI、BCMA或BAFFR胞外区，或至少含有30-119位的TACI胞外区；

Z为无、或任选的人抗体的Fc区域；

-表示肽键或肽接头。

在另一优选例中，所述的X、Y、Z中的任何两者以头-头、头-尾、或尾-尾方式相连。

在另一优选例中，所述的“头部”指多肽或其片段的N端，尤其是野生型多肽的或其片段的N端。

在另一优选例中，所述的“尾部”指多肽或其片段的C端，尤其是野生型多肽的或其片段的C端。

在另一优选例中，所述的肽接头是1-20个长度的肽接头。

所述的X含有或具有TNF-R2氨基酸序列的第23-76位；第23-118位；第23-162位；第23-201位；和/或

所述的Y含有或具有TACI氨基酸序列的第30-119位；和/或BAFF受体BCMA氨基酸序列第1-54位;和/或BAFF受体BAFFR氨基酸序列第1-78位。

在另一优选例中，所述的Z含有或具有人γ1氨基酸序列的第216-447位。

在另一优选例中，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO.:5中第1-398位，第23-398位或第39-398位的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子编码本发明第一方面中任一所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述的核酸分子具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列中第1-1197位、第67-1197位或第115-1197位的核苷酸序列。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有本发明第二方面所述的核酸分子。

在本发明的第四方面，提供了一种基因工程化的细胞，所述的细胞含有本发明第三方面所述的载体；或所述的细胞基因组中整合有本发明第二方面中所述的核酸分子。

在本发明的第五方面，提供了一种产生本发明所述的融合蛋白的方法，所述的方法包括步骤：

在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达所述的融合蛋白；和

分离或纯化所述的融合蛋白。

在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有本发明所述的融合蛋白及其药物学上可接受的载体。

在本发明的第七方面，提供了本发明所述的融合蛋白的用途，用于制备选自下组的一种或多种组合物：(a)抑制BAFF/APPRIL信号通路组合物；(b)降低血清或血液IgE、IgM浓度的组合物；(c)治疗免疫疾病的组合物；以及(d)治疗B细胞增多相关疾病的组合物。

在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物。

在另一优选例中，所述的免疫疾病包括：哮喘、***性红斑狼疮、类风湿性关节炎等。

在另一优选例中，所述的B细胞增多相关疾病包括多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、巨球蛋白血症和浆细胞性白血病

在另一优选例中，所述的组合物还用于降低脾脏重量。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了人的TACI氨基酸序列(SEQ ID NO.:1)。斜体标记的是二个富含半胱氨酸区域(Cysteine-Rich Domain，CRD)。用框标记的是穿膜序列。下划线标记的是主茎序列。

图2显示了人的TNF-R2氨基酸序列(SEQ ID NO.:2)。下划线的序列是第一个富半胱氨酸区。用框标记的是穿膜序列。

图3显示了人的野生型γ1不变区Fc氨基酸序列(SEQ ID NO.:3)。绞链区，CH2和CH3区如图所示。由于CH1区不是Fc的一部分，故没有显示在此图。

图4A显示了融合蛋白A和B的结构示意图。

图4B显示了编码融合蛋白A前体的核苷酸序列(SEQ ID NO.:4)和其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO.:5)，其中各元件如下：

TNF-R2元件：核苷酸序列:第67-228位;氨基酸序列:第23-76位，其中，富含半胱氨酸区域CRD1位于核苷酸序列第115-228位;氨基酸序列位于第39-76位。

TACI元件：核苷酸序列:第229-498位;氨基酸序列:第77-166位

Fc区元件：核苷酸序列:第499-1194位;氨基酸序列:第167-398位。

此外，融合蛋白A前体的第1-22位氨基酸也来自TNF-R2的第1-22位氨基酸。这一段氨基酸序列是穿膜信号肽，在蛋白穿过细胞膜分泌到细胞外时被切掉，所以成熟的融合蛋白A不含此段氨基酸序列。

图5显示了Western Blot检测融合蛋白在转染细胞里的瞬间表达。显色剂是碱性磷酸酶标记的抗人的Fc抗体。各泳道如下：1，没转染的细胞培养液；2，1μg DNA质粒的转染；3，2μg DNA质粒的转染；4，4μg DNA质粒的转染。

图6显示了SDS-PAGE分析融合蛋白的表达量。细胞在96孔板里生长13天后，取出20ul培养液，进行SDS-PAGE分离，用Coomassie Blue进行蛋白显色。表达的融合蛋白分别用箭头标记。

图7显示了经四步分离纯化后融合蛋白A和B的非还原电泳图。

图8显示了融合蛋白A和B对RPMI 8226细胞增殖的影响。其中图A为融合蛋白A/B的细胞活性比较；图B为融合蛋白A与TACI-Fc(R&D)的细胞活性比较。

图9显示了融合蛋白A和B与rhBAFF的体外结合分析。结果表明，融合蛋白保留了TACI与其配体结合的活性。

图10显示了单次给予融合蛋白A和B后血药浓度与时间曲线。结果表明，融合蛋白的半衰期延长，血药浓度显著提高。

图11显示了不同剂量融合蛋白A和B对正常BALB/C小鼠血清IgM浓度的影响。

图12显示了不同剂量融合蛋白A和B对正常BALB/C小鼠脾重/体重的影响。

图13显示了融合蛋白A和B对OVA诱导的C57/B6哮喘小鼠血清IgE和IgM浓度影响。

图14显示了融合蛋白A和B对OVA诱导的C57/B6哮喘小鼠脾重/体重的影响。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，意外地发现，将(a)TNF受体或其活性片段、(b)TACI，BCMA，BAFFR或其活性片段、和(c)抗体Fc区域相融合，获得的融合蛋白具有极其优异的生物活性，并且可以非常显著地降低IgE的血清浓度。此外，该融合蛋白且稳定性好、半衰期长，因此有助于治疗某些自身免疫疾病。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人制备了优化的TACI-Fc融合蛋白，研究表明，融合蛋白具有生物活性强且明显降低正常Balb/c小鼠血清IgM浓度和脾脏重量。此外，本发明融合蛋白可显著降低C57/B6哮喘小鼠血清IgE浓度，这将为TACI-Fc融合蛋白的制备以及在疾病治疗方面的应用奠定基础。

如本文所用，除非另外说明，TNF-R2，TNFR II，hTNFR II可互换使用，都指人肿瘤坏死因子II型受体。

如本文所用，除非另外说明，Fc是指人免疫球蛋白的Fc片段。术语“免疫球蛋白Fc区”指免疫球蛋白链恒定区，特别是免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分，例如免疫球蛋白Fc区可包括重链CH1、CH2、CH3的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合，在优选例中，所用的免疫球蛋白的Fc区包括至少一个免疫球蛋白绞链区，一个CH2结构域和一个CH3结构域，优选缺少CH1结构域。

已知人免疫球蛋白有多种类别，如IgA、IgD、IgE、IgM及IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4四个亚类)，从特定的免疫球蛋白类别和亚类中选择特定的免疫球蛋白Fc区是在本领域技术人员所掌握的范围之内的，在一个优选的实例中，免疫球蛋白Fc区可选择包含有人免疫球蛋白IgG4亚类Fc区的编码序列，其中缺失一个免疫球蛋白重链1结构域(CH1)，但包括了铰链区以及CH2、CH3、二个结构域的编码序列。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，除非另外说明，所述的融合蛋白是一种分离的蛋白，与其它蛋白、多肽或分子无联系，是重组宿主细胞培养的纯化产物或作为一种纯化的提取物。

本发明提供了一种融合蛋白，包含以下元件：(a)TNF受体或其活性片段、(b)BAFF受体(如TACI，BCMA和BAFFR)或其活性片段、和(c)抗体Fc区域。本发明所述的融合蛋白中，所述的各元件之间(如元件a与元件b、元件b或元件c之间)，可以含有或不含有连接序列。所述的连接序列通常是对两个蛋白不产生影响作用的序列。

本发明的融合蛋白，不仅具有更长的体内半衰期，可以更有效地抑制血清中免疫疾病相关的抗体(尤其是IgE)的浓度。

根据本发明提供的氨基酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的融合蛋白。这些方法例如但不限于：重组DNA法，人工合成，等[参见Murray KM,DahlSLAnn；Pharmacother 1997Nov；31(11):1335-8]。

在得知了本发明的融合蛋白的氨基酸序列后，本领域人员可以方便地根据所述的氨基酸序列获得编码本发明的融合蛋白的基因序列。

作为本发明的优选方式，本发明的融合蛋白的编码基因具有SEQ ID NO:4所示的序列，采用该序列，特别适合于在真核细胞(优选CHO细胞)中高表达本发明的融合蛋白，其中包括其氨基酸序列如SEQ ID NO.:5全长(即第1-398位)或其活性片段，例如第23-398位或第39-398位所示的多肽(融合蛋白)。

根据本文所述的核苷酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。

本发明还提供了一种表达载体，包含编码本发明的融合蛋白的序列以及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

表达和克隆载体可含有一个或多个筛选基因，也称作可筛选标记。典型的筛选基因编码蛋白可以(a)抵抗抗菌素等；(b)补偿营养缺陷或(c)提供关键的在培养基中没有的营养物质。例如，DHFR(二氢叶酸还原酶缺陷细胞)缺陷的DG44细胞不能生长在不含次黄嘌呤-胸腺嘧啶的培养基里生长，在细胞被可表达DHFR的载体转染后，转染的细胞不仅可生长在不含含次黄嘌呤-胸腺嘧啶的培养基里生长，还可生长在含有一定量的MTX(氨甲喋呤)培养基里生长。

表达载体和克隆载体通常都会含有一个或多个基因转录启动子，或者被原核细胞转录机制识别，或者被真核细胞转录机制识别。用于真核细胞转录的启动子有但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子，反转录病毒启动子，猴病毒40(SV40)前期启动子等。

表达载体可采用市售的例如但不限于：pIRES、pDR，pUC18等可用于真核细胞***表达的载体。本领域技术人员可以根据宿主细胞来选择合适的表达载体。

根据已知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将本发明的融合蛋白的编码序列***合适的限制性位点，制得本发明的重组表达载体。

本发明还提供了表达本发明融合蛋白的宿主细胞，其中含有本发明的融合蛋白的编码序列。所述的宿主细胞优选的是真核细胞，例如但不限于CHO，COS细胞，293细胞，RSF细胞等。作为本发明的优选方式，所述的细胞是CHO细胞，其可良好地表达本发明的融合蛋白，可获得结合活性良好，稳定性良好的融合蛋白。

本发明还提供一种用重组DNA制备本发明融合蛋白的方法，其步骤包括：

1)提供编码融合蛋白的核酸序列(如SEQ ID NO:4序列)；

2)将1)的核酸序列***到合适的表达载体，获得重组表达载体；

3)将2)的重组表达载体导入合适的宿主细胞；

4)在适合表达的条件下培养转化宿主细胞；

5)收集上清液，并纯化融合蛋白产物。

将所述编码序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于：磷酸钙沉淀，原生质体融合，脂质体转染，电穿孔，微注射，反转录法，噬菌体转导法，碱金属离子法。

有关宿主细胞的培养和表达可参见Olander RM Dev Biol Stand1996;86:338。可通过离心去除悬浮液中的细胞和残渣，收集清液。可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行鉴定。

可将上述制备获得的融合蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。例如，当重组蛋白为分泌表达时，可以采用商品化的超滤膜来分离所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司产品，首先将表达上清浓缩。浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化，或采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析(DEAE等)或阳离子交换层析。凝胶基质可为聚丙烯酰胺、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的基质。Q-或SP-基团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用羟基磷灰石吸附层析，金属螯合层析，疏水相互作用层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。

可利用含有所述融合蛋白的特异性抗体、受体或配体的亲和层析柱对表达的融合蛋白进行纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。可选择地，所述的融合蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，6-His或8-His等。这些标签可用于对融合蛋白进行纯化。

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-90wt%；较佳的0.1-50wt%；更佳的，5-40wt%)的本发明的融合蛋白，以及药学上可接受的载体。

通常，可将本发明的融合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的融合蛋白以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明所述的融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的融合蛋白每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明的主要优点在于：

(a)本发明融合蛋白半衰期长；

(b)本发明融合蛋白可显著地降低IgE的血清浓度;

(c)本发明融合蛋白可特异性地抑制TACI-BAFF复合物的形成，从而终止膜上TACI的激活，进而终止信号传导。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1

融合蛋白A表达质粒的构建

融合蛋白A前体(图4)是由下列三部分片段从N端到C端组成，具体氨基酸序列如下：

片段1．TNF-R2氨基酸序列从第1至76位，包含第一个富半胱氨酸区(图2)。

片段2．TACI氨基酸序列从第30至119位，含有二个富半胱氨酸区和部分主茎序列(图1)。

片段3．人的γ1氨基酸序列从第216至447位，含有绞链区和二个CH区(图3)。

片段1的cDNA的合成。PCR模板是用常规方法制备的人cDNA。5’端的引物AAGCTTGCGGCCGCGAGCTCGGATCCACT(SEQ ID NO.:6)是质粒载体的序列。为了克隆进pT载体，在5’端引进了Not I酶切位点。3’端的引物序列是GGGGCAGGATCTCATAGCGTCACACACGGTGTCCGAG(SEQ ID NO.:7)，为了和TACI cDNA连接，它含有19个TACI的核糖核苷酸。

片段2和3的cDNA的合成。编码片段2和3的cDNA已重组在编码融合蛋白B的载体里(见实施例2)，用此载体作模板，用片段2的5’端引物和片段3的3’端的引物来扩增编码片段2和3的重组基因。

为了把片段1和的片段2和3的cDNA连接起来，将提纯的这二个片段的cDNA混合作为模板，用片段1的5’端的引物和片段2/3的3’端的引物来实施聚合酶链反应。提纯扩增的PCR片段，克隆到载体pCR-BluntII-TOPO(购自Invitrogen公司)。将重组质粒转染进感受态细菌XL-1(购自Invitrogen公司)细菌，挑选阳性菌落，提纯重组质粒。用酶切和测序鉴定重组基因的正确性。

把重组质粒克隆进哺乳动物细胞表达载体。所用的市售表达载体含人的CMV启动子，并含有DHFR表达基因，可用来筛选融合蛋白表达的稳定细胞株和扩增表达基因拷贝数。用NotI和XbaI酶切重组质粒和表达载体，用胶提纯法纯化切下的重组基因和双酶切的载体，在体外链接后转染到感受态细菌DH5α(购自Invitrogen公司)，挑选阳性克隆，扩增和提纯TACI-Fc表达质粒。

实施例2

融合蛋白B表达质粒的构建

融合蛋白B前体(图4)是由下列三部分来源从N端到C端组成，具体氨基酸序列如下：

片段1．人的CD33蛋白信号肽，含有N端前16个氨基酸。

片段2．TACI氨基酸序列从第30至119，含有二个富半胱氨酸区和部分主茎序列(图1)。

片段3．人的IgG1的氨基酸序列从第216至447，含有绞链区和二个CH区(图3)。

编码融合蛋白B的重组基因是由重叠聚合酶链反应(PCR)构建。PCR反应用的模板是用常规方法制备的人cDNA。聚合酶链反应(PCR)是用Invitrogen公司的PlantiumSuperMix，按厂商的操作说明进行PCR反应。用Qiagen公司的胶提纯DNA片段的试剂盒来提纯各PCR片段。由于TACI本身没有蛋白分泌信号肽，所以在构建表达载体时，本实施例采用人CD33蛋白的分泌信号肽。

编码CD33蛋白分泌信号肽基因的合成。人工合成此片段的cDNA，AGGTATAGCGGCCGCCACCATGCCGCTGCTGCTACTGCTGCCCCTGCTGTGGGCAGGGGCCCTGGCT(SEQ IDNO：12)，为了克隆进哺乳动物细胞表达载体，在5’端引进了Not I酶切位点。

片段2的cDNA的合成。PCR模板是常规方法制备的人cDNA。5’端的引物是GGCAGGGGCCCTGGCT GCTATGAGATCCTGCCCC(SEQ ID NO.:8)，头16个核苷酸序列和CD33编码的核苷酸3’端序列相同，是为了链接片段1和2的PCR片段。3’端的引物序列是TGTAACAAGATTTGGGTTC CCTGAGCTCTGGTGGAAG(SEQ ID NO.:9)。

片段3的cDNA的合成。PCR模板是常规方法制备的人cDNA。扩增出的DNA序列编码人的γ1免疫球蛋白Fc氨基酸序列，从216至447位。5’端的引物是GAACCCAAATCTTGTTACA(SEQID NO.:10)，和片段2cDNA 3’端序列互补。3’端的引物序列是TGGTGGTGTCTAGAGACTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC(SEQ IDNO.:11)，为了克隆进pT载体，在3’端引进了Xba I酶切位点。

为了把三个片段的cDNA连接起来，将提纯的三个片段混合作为模板，用片段1的5’端的引物，AGGTATAGCGGCCGCCACCATGCCGCTGC(SEQ ID NO.:13)和片段3的3’端的引物(同上，SEQ ID NO.:11)来实施聚合酶链反应。提纯扩增的PCR片段，克隆入载体pCR-Blunt II-TOPO(购自Invitrogen公司)。将重组质粒转染进感受态细菌XL-1(购自Invitrogen公司)，挑选阳性菌落，提纯重组质粒。用酶切和测序鉴定重组基因的正确性。

把重组质粒克隆进哺乳动物细胞表达载体。同实施例1，用NotI和XbaI酶切重组质粒表达载体，用胶提纯法纯化切下的重组基因和双酶切的表达载体，在体外链接后转染到感受态细菌DH5α(Invi trogen)，挑选阳性克隆，扩增和提纯TACI-Fc表达质粒。

实施例3

融合蛋白表达细胞株的建立

在本实施例中，用稳定转染和基因扩增的方法建立稳定高效蛋白表达的CHO DG44细胞系。克隆出来的CHO DG44细胞悬浮培养在无血清，无动物蛋白的培育液里。

原始CHO DG44细胞来源于Invitrogen公司，细胞培养和传代的方法参照公司的操作手册。无转染细胞悬浮培养在CD DG44培养液里，培养液含有8mMGlutamine，0.18%Fluronic F-18。

用Qiagen的试剂盒制备大量的编码融合蛋白的表达质粒。为了质粒不被细菌污染，用酒精沉淀法纯化一次质粒。在基因转染前，CD DG44细胞传三代后再进行转染。当细胞的密度达到1×10⁶/ml时，吸取1ml转到12-孔培养板里，每孔1ml。

转染是用Invitrogen公司的转染试剂LIPOFECTAMINE 2000CD来进行的。为了找到最高的转染效率，每种质粒用三种不同的质粒对转染试剂比例(1.5ug:40ul,2ug:40ul和3ug:40ul)进行转染。转染2天后，对细胞培养液进行Western Blot分析(图5)，结果显示2ugDNA质粒转染效率最高(图5，第3泳道)。

选取2μg DNA质粒转染的细胞进行下一步的筛选，用有限稀释法在96孔培养板里进行筛选。筛选培养液是不含有Hypothanxine和Thymidine的CHO培养液，含有20nM或100nM的氨甲碟呤(MTX)。二个星期后，用ELISA方法对每个孔的细胞培养液进行分析，检测融合蛋白的含量并SDS-PAGE分析培养液里的蛋白。

结果如图6所示。结果表明编码融合蛋白A和B的基因已整合进细胞的染色体，并能表达和分泌融合蛋白A和B，分子量分别为约42和47千道尔顿，比理论值略高(约5千道尔顿)，与预测值相符(在真核细胞中表达时存在蛋白糖基化现象)。

把融合蛋白高表达的细胞株转到24孔培养板，培养7天后，再进行ELISA蛋白含量的分析。从每个融合蛋白库里，再挑选3个高表达的细胞进行扩增，冻存。

实施例4

融合蛋白的制备

融合蛋白A、B细胞株作为种子细胞，以0.5×10⁶细胞/ml的初试密度开始进行培养，培养基为S4(含8g/L葡萄糖、4mmol/L谷氨酰胺和0.5mg/L的胰岛素)，pH控制在6.7-7.1，溶氧不低于30%，初始温度35℃，细胞密度长至6.5-7.0×10⁶cells/ml时降温至31℃，第二天再降至29℃，通过补加葡萄糖维持糖浓度，细胞存活率接近50%时结束培养，融合蛋白A、B的目的蛋白表达量可以达到200mg/L。细胞培养收获液经第一步Protein A亲和层析：目标蛋白纯度达到79.1%，收率为54.4%；第二步CM阳离子层析：目标蛋白纯度达到87.4%，收率为81.6%；第三步Phenyl-650M疏水层析：目标蛋白纯度达到94.5%，收率为78.0%；最后一步超滤浓缩换液：目标蛋白纯度达到95.3%，收率为92.9%。

四步分离纯化后融合蛋白A、B的非还原电泳结果见图7。

实施例5

融合蛋白A和融合蛋白B对RPMI 8226细胞的生物学活性

融合蛋白TACI-Fc的体外生物学活性主要通过在***(dexamethasone)和rhBAFF存在时，对人骨髓瘤细胞RPMI 8226(购自ATCC)生长的抑制作用得以体现。***的作用是使RPMI 8226细胞发生凋亡，降低实验的背景，BAFF则能恢复并促进细胞生长，在此基础上加入TACI-Fc中和BAFF，则能够减弱甚至消除BAFF对细胞生长的促进作用。通过这种方法即可检测TACI-Fc的体外生物学活性^[6]。

反应在96孔细胞培养板中进行，每孔接种10000个RPMI 8226细胞于150μl培养液中，其中包括0.1μM***(dexamethasone)(Wako，CODE#041-18861)和1μg/ml rhBAFF(R&D,Cat#2149-BF/CF)，待测样品终浓度为从16μg/ml起始依次4倍梯度稀释，同时进行一组不含rhBAFF的实验作为对照。在37°C二氧化碳培养箱中培养5天后，每孔加入10μlcck-8溶液(Cell Counting Kit-8，DOJINDO，cat：ck04)进行显色反应。37°C显色6小时，用酶标仪(Bio-Rad，iMark)以655nm为参比，检测450nm的吸收值。由于待测样品自身对细胞有抑制作用，从实验组OD450中减去不含rhBAFF对照组的OD450，得到校正的OD450值(calibratedOD450)，以此对待测样品浓度的对数做图，通过Origin软件进行S型曲线拟合，计算EC₅₀，即为半数有效抑制浓度，可代表待测样品的体外细胞活性。

结果见图8，显示了融合蛋白A与融合蛋白B的RPMI 8226细胞活性的比较。各自的浓度效应曲线显示：当融合蛋白TACI-Fc浓度很低时，溶液中rhBAFF基本均呈游离状态，促进RPMI 8226细胞生长并增殖；随着其浓度逐渐升高，开始中和培养液中的rhBAFF，游离rhBAFF逐渐减少，细胞的增殖也随之降低；直至有足够的融合蛋白与rhBAFF结合，可以完全抵消rhBAFF的作用，细胞生长速度降到最低。将450nm吸收值对样品浓度对数作图，发现三者的效应曲线呈现S型，经过拟合后计算得到的半数有效抑制浓度表明：融合蛋白A的RPMI8226细胞活性略低于融合蛋白B的细胞活性。

实施例6

融合蛋白A和融合蛋白B体外结合实验研究

融合蛋白A/B体外结合分析检测主要利用ELISA原理：将一定量rhBAFF固定在酶标板上，各孔加入系列浓度梯度的融合蛋白A/B进行结合反应，最后通过HRP偶联的anti-human Fc检测结合在平板rhBAFF上的融合蛋白量来考察其与rhBAFF的结合情况。

用PBS(pH7.4)将重组人BAFF的可溶性片段(rhBAFF，R&D,Cat#2149-BF/CF)稀释成0.5μg/ml，加入酶标板中(greiner bio-one,Cat＃655001)，50μl/孔，4°C包被过夜。第二天经超纯水洗涤后，用5%脱脂奶粉/PBST进行封闭。之后将待测样品从3μg/ml起始，依次3倍梯度稀释，加入酶标板中，50μl/孔，室温孵育2小时。经PBST洗涤3次后，每孔加入50μl 0.8μg/ml检测抗体(Peroxidase-conjμgated Goat anti-Human IgG，FcγFragmentSpecific：Jackson ImmunoResearchLABORATORIES,INC.Code#109-036-098)，室温孵育1小时。PBST再次洗涤之后，进行显色反应，每孔加入100μl of0.4mg/ml OPD，避光显色10分钟，用100μl1MH₂SO₄终止反应。在酶标仪(Bio-Rad，iMark)上以655nm为参比，检测490nm的吸收值。将吸收值对待测样品摩尔浓度的对数作图，通过Origin软件进行S型曲线拟合，计算出EC₅₀(吸收值变化50%对应的浓度)代表待测样品的体外结合活性。

结果如图9所示。随酶标板中每孔加入融合蛋白浓度的升高，其与固定于酶标板上的rhBAFF结合增加，之后结合的检测抗体就越多，因此最后通过显色反应读取的490nm吸光值就越高。两者的结合曲线均呈现典型的S型曲线特征，经过软件拟合计算得到的EC₅₀表明：融合蛋白A的EC₅₀略大于融合蛋白B，说明其与rhBAFF的体外结合能力略低于融合蛋白B。

实施例7

融合蛋白A和融合蛋白B对动物药代动力学研究

为了研究药物在体内的药代动力学特点，确定血药浓度与给药时间的关系。选用正常雌性BALB/C小鼠(18～20g)48只，3只/时间点，共设立7个时间点，即1、2、4、8、24、48、72h。分别腹腔注射5mg/kg的融合蛋白A或融合蛋白B，准确记录每组的给药时间，然后于每个时间点对小鼠进行***麻醉后摘取眼球取血，收集血清。ELISA法检测各时间点两种药物的血药浓度。

如图10所示，两种药物的血药浓度与时间的拟合曲线基本相似，但是融合蛋白A在不同时间点的血药浓度明显高于融合蛋白B，基本是2倍左右。通过软件得出融合蛋白A和融合蛋白B在小鼠体内的半衰期分别为14h和11h。

实施例8

融合蛋白A和融合蛋白B对正常小鼠体内药效学研究

本实施例评价两种药物融合蛋白A和融合蛋白B对小鼠的药理作用。选用正常雌性BALB/C小鼠(18～20g)42只，6只/组，共分为7组，即对照(Control)、融合蛋白A-5mg/kg、融合蛋白A-2.5mg/kg、融合蛋白A-1.25mg/kg)、融合蛋白B-5mg/kg、融合蛋白B-2.5mg/kg、融合蛋白B-1.25mg/kg组。

首先于第0天由眼底静脉丛取血，收集血清，然后分别腹腔给予PBS、不同剂量的融合蛋白A和融合蛋白B(5mg/kg、2.5mg/kg、1.25mg/kg)，隔天给药，共2周。最后一次给药后24h，先将小鼠称重，***麻醉后眼眦取血，处死后解剖取出小鼠脾脏，去除周围组织，用滤纸稍稍吸干后称重，计算脾重/体重。ELISA法检测给药前和给药结束后每组动物血清中IgM的浓度。

如图11所示，对照组血清IgM浓度给药前后无显著差异，不同剂量的融合蛋白A和融合蛋白B(5mg/kg、2.5mg/kg、1.25mg/kg)给药后第14天血清IgM浓度均有显著下降，与第0天比较差异显著(**p<0.01)。融合蛋白A组与融合蛋白B组相比没有显著差异。

如图12所示，不同剂量的融合蛋白A和融合蛋白B(5mg/kg、2.5mg/kg、1.25mg/kg)给药后第14天脾重/体重显著降低，其中融合蛋白A(5mg/kg、2.5mg/kg、1.25mg/kg)、融合蛋白B(5mg/kg、2.5mg/kg)组与对照比较具有显著差异(**p<0.01,*p<0.05)。融合蛋白B(1.25mg/kg)组与对照比较无统计学意义。结果可见，融合蛋白A的降低小鼠脾重/体重的作用明显优于融合蛋白B。

实施例8

融合蛋白A和融合蛋白B对哮喘模型小鼠体内药效学研究

为了评价两种药物融合蛋白A和融合蛋白B对哮喘模型小鼠的药理作用，选用正常雌性C57/B6小鼠(18～20g)44只，共分为7组，即对照(Control)组(6只)、模型组(11只)、融合蛋白A-5mg/kg(13只)、融合蛋白B-5mg/kg(14只)进行研究。首先，将模型组和实验组小鼠分别于第1和14天用OVA/ALUM混悬液腹腔注射致敏，于第13天开始分别腹腔注射PBS、不同剂量的融合蛋白A和融合蛋白B，隔天给药，共给药12次。其次，第28天、30天、32天接受OVA蛋白溶液的鼻滴入攻击。最后，给药全部结束后24h，即第36天，先将小鼠称重，***麻醉后眼底静脉丛取血，处死后解剖取出小鼠脾脏，去除周围组织，用滤纸稍稍吸干后称重。抽取其肺泡灌洗液，计算其中总的白细胞数量。ELISA法检测每组小鼠血清中IgE、IgM浓度。

如图13(A)所示，模型组第36天血清IgM浓度与对照相比明显升高。融合蛋白A-5mg/kg、融合蛋白B-5mg/kg与模型组IgM浓度比较显著降低(**p<0.01)。如图13(B)所示，模型组、融合蛋白A-5mg/k g、融合蛋白B-5mg/kg第36天血清IgE浓度与对照相比均不同程度升高，其中融合蛋白A组与模型组IgE浓度比较具有显著差异(**p<0.01)。

出乎意料的是，与融合蛋白B相比，融合蛋白A可显著降低IgE的浓度，提示融合蛋白A可更有效地抑制***反应。

如图14所示，模型组第36天脾重/体重与对照相比明显升高。融合蛋白A-5mg/kg、融合蛋白B-5mg/kg与模型组脾重/体重比较显著降低(**p<0.01)。

实施例9

药物组合物

根据融合蛋白A和融合蛋白B药物特点，以融合蛋白A(40mg/ml)为例，设计了几组药物组合物，并在液体加速试验条件下考察了融合蛋白A药物组合物包括聚集与降解的稳定性，通过SEC-HPLC和SDS-PAGE方法对样品的聚集与降解进行分析，最终确定融合蛋白A的药物组合物。

A)缓冲溶液：10mM乙酸缓冲溶液(pH5.0)，组成：80mg/mL海藻糖；

B)缓冲溶液：10mM琥珀酸缓冲溶液(pH5.0)，组成：80mg/mL蔗糖；

C)缓冲溶液：10mM乙酸缓冲溶液(pH5.0)，组成：80mg/mL海藻糖，0.05mg/mL吐温20；

D)缓冲溶液：10mM乙酸缓冲溶液(pH5.0)，组成：80mg/mL海藻糖，0.05mg/mL聚羟亚烃188；

E)缓冲溶液：10mM琥珀酸缓冲溶液(pH5.0)，组成：80mg/mL海藻糖，0.05mg/mL吐温20；

F)缓冲溶液：10mM琥珀酸缓冲溶液(pH5.0)，组成：80mg/mL海藻糖，0.05mg/mL聚羟亚烃188。

六组药物组合物在4℃、25℃、40℃条件下储存2周，稳定性结果可见，4℃条件下储存2周，药物组合物均未发生聚集与降解。25℃、40℃条件下未产生降解片段，但聚集体有增加，具体结果见表1。

表1

由表1结果可见，药物组合物A和D条件下，融合蛋白A具有相对较高的稳定性，在4℃和25℃环境下是稳定的，但对于40℃环境而言，组合物D比组合物A有相对较高的聚集趋势。因此，对于融合蛋白A而言，一种特别优选的药物组合物组成为40mg/mL融合蛋白A、80mg/mL海藻糖、10mM乙酸缓冲溶液(pH5.0)。

讨论

肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的胞外区通常含有1至6个富含半胱氨酸的结构域(CRD)主要负责与配体的识别和结合。这些受体通常以三聚体的形式结合配体发挥受体功能。而上述功能则由含有至少1个富含半胱氨酸的前配体装配域(Pre-ligand bindingassembly domain，PLAD)所介导。更具体的说，TNFR超家族成员，包括TRAIL受体1、CD40、60kDa的TNFR和80kDa的TNFR，均表现出这种同型缔合功能。研究发现，在缺少配体的情况下，PLAD对受体聚合体的形成是必须且充分的。虽然PLAD不直接参与对TNFα和TNFβ的识别与结合，但删除PLAD或者PLAD发生突变，配体与受体的亲和能力会丧失。因此，PLAD对于TNFR多聚体的形成以及配基的结合相关，在TNF相关信号传导途径中起着至关重要的作用。

本发明的融合蛋白可有效封闭TACI的PLAD区，从而特异性地抑制TACIR的聚合，从而终止TACI-BAFF复合物的形成，达到终止信号传导的目的。

试验结果还表明，本发明的TACI-FC融合蛋白具有延长药物的半衰期，显著降低血清中IgE的浓度，并可有效抑制TACI-BAFF复合物的形成，进而终止信号传导。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献：

1.Gross JA,Johnston J,Mudri S,et al.TACI and BCMA are receptorsfor aTNF homologue implicated in B-cell autoimmune disease.Nature.2000;404(6781):995-999.

2.Wu Y,Bressette D,Carrell JA,et al.Tumor necrosis factor(TNF)receptor superfamily member TACI is a high affinity receptor for TNFfamilymembers APPIL and BLyS.J Biol Chem.2000,275(45):35478-35485.

3.Roschke V,Sosnovtseava S,Ward CD,et al.BLyS and APPRILfrombiologically active heterotrimers that are expressd in patientswithsystemic immune-based rheumatic diseases.J Immunol.2002,169(8):4314-4321.

4.Stohl W,Metyas S,Tan SM,et al.Inverse associationbetweencirculating APPRIL levels and serological and clinical diseaseactivityin patients with systemic lupus erythematosus.Ann Rheum Dis.2004,63(9):1096-1103.

5.Cheema GS,Roschke V,Hi lbert DM.Elevated serum Blymphocytestimulator levels in patients with systemic immune-basedrheumaticdiseases.Arthritis Rheum.2001,44(6):1313-1319.

6.Francis Ka-Ming Chan.The pre-ligand binding assembly domain:apotential target of inhibition of tumour necrosis factorreceptorfunction.Ann Rheum Dis.2000,59(suppl Ⅰ):i50-i53.

Claims (16)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括融合在一起的以下元件：(a)TNF受体或其活性片段；(b)BAFF受体或其活性片段，其中所述的BAFF受体包括TACI，BCMA，BAFFR或其组合；和(c)抗体Fc区域；

并且所述融合蛋白具有以下功能：抑制TACI-BAFF复合物的形成；

所述的融合蛋白具有下式I或II所示的结构：

X-Y-Z Y-X-Z

式I 式II

式中，

X为TNF受体胞外区的CRD1、或含CRD1的TNF受体胞外区；

Y为全长的TACI、BCMA或BAFFR胞外区，或至少为30-119位的TACI胞外区；

Z为人抗体的Fc区域；

-表示肽键或肽接头。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白还具有以下一种或多种功能：

(a)结合于BAFF的活性；

(b)结合于TALL-2/APRIL的活性；

(c)降低血清免疫球蛋白的浓度；

(d)降低脾脏重量；

(e)抑制或封闭BAFF/APPRIL途径；

(f)减少B细胞数量。

3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白是IgE或IgM。

4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的X、Y、Z中的任何两者以头-头、头-尾、或尾-尾方式相连；和/或

所述的X为TNF-R2氨基酸序列的第23-76位；第23-118位；第23-162位；或第23-201位；和/或

所述的Y为TACI氨基酸序列的第30-119位；或BAFF受体BCMA氨基酸序列第1-54位；或BAFF受体BAFFR氨基酸序列第1-78位；和/或

所述的Z为人γ1氨基酸序列的第216-447位；或

所述的融合蛋白为SEQ ID NO:5中第1-398位，第23-398位或第39-398位的氨基酸序列；

其中人γ1氨基酸序列的第216-447位的序列如下所示：

5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的肽接头是1-20个长度的肽接头。

6.一种核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子编码权利要求1-4任一所述的融合蛋白。

7.如权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列中第1-1197位、第67-1197位或第115-1197位的核苷酸序列。

8.一种载体，其特征在于，它含有权利要求6所述的核酸分子。

9.一种基因工程化的细胞，其特征在于，所述的细胞含有权利要求8所述的载体；或所述的细胞基因组中整合有权利要求6所述的核酸分子。

10.一种产生权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养权利要求9所述的细胞，从而表达所述的融合蛋白；和

分离或纯化所述的融合蛋白。

11.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有权利要求1所述的融合蛋白及其药物学上可接受的载体。

12.如权利要求1所述的融合蛋白的用途，其特征在于，用于制备选自下组的一种或多种组合物：(a)抑制BAFF/APPRIL信号通路组合物；(b)降低血清或血液IgE、IgM浓度的组合物；(c)治疗免疫疾病的组合物；以及(d)治疗B细胞增多相关疾病的组合物。

13.如权利要求12所述的融合蛋白的用途，其特征在于，所述的组合物为药物组合物。

14.如权利要求12所述的融合蛋白的用途，其特征在于，所述的B细胞增多相关疾病包括多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、巨球蛋白血症和浆细胞性白血病。

15.如权利要求12所述的融合蛋白的用途，其特征在于，所述的免疫疾病包括：哮喘、***性红斑狼疮、类风湿性关节炎。

16.如权利要求12所述的融合蛋白的用途，其特征在于，所述的组合物还用于降低脾脏重量。