JP2002514049A

JP2002514049A - ピヒア・メタノリカの栄養要求性突然変異体の製造

Info

Publication number: JP2002514049A
Application number: JP50632398A
Authority: JP
Inventors: レイモンド，クリストファー，ケー．
Original assignee: ザイモジェネティクス，インコーポレイティド
Priority date: 1996-07-17
Filing date: 1997-07-14
Publication date: 2002-05-14
Also published as: CN1238806A; AU3885697A; CA2261020A1; IL128072A0; AU708572B2; CA2261020C; WO1998002536A3; WO1998002536A2

Abstract

(57)【要約】栄養要求性突然変異を有するピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞を製造する方法が開示される。これらの方法は、工程：（ａ）ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞を突然変異化条件に暴露し；（ｂ）工程（ａ）からの細胞を富んだ培地中で培養して、突然変異を前記細胞の少なくとも一部分において確立しかつ複製できるようにし；（ｃ）工程（ｂ）からの細胞を同化可能な窒素を欠失する培地中で培養して、細胞の貯蔵窒素を枯渇させ；（ｄ）工程（ｃ）からの細胞を、無機窒素源と、増殖するピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞を殺すために十分な量のナイスタチンとを含んでなる定められた培地中で培養して、栄養遺伝子を欠失する細胞について選択し；そして（ｅ）工程（ｄ）からの選択された細胞を富んだ培地中で培養する；からなる。

Description

【発明の詳細な説明】ピヒア・メタノリカの栄養要求性突然変異体の製造発明の背景メチロトロープ酵母は、炭素およびエネルギーの唯一の源としてメタノールを利用することができる酵母である。メタノール利用に必要な生化学的経路を有する酵母の種は、４つの属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、およびトルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）に分類される。これらの属は多少人工的であり、細胞の形態学および増殖特性に基づき、そして密接な遺伝的関係を反映しない（Ｂｉｌｌｏｎ−Ｇｒａｎｄ、Ｍｙｃｏｔａｘｏｎ、３５：２０１−２０４、１９８９；Ｋｕｌｔｚｍａｎ、Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ、８４：７２−７６、１９９２）。さらに、これらの属内のすべての種が炭素およびエネルギー源としてメタノールを利用することができるわけではない。この分類の結果として、属の個々の種の間で生理学および代謝において大きい差が存在する。メチロトロープ酵母は組換えタンパク質産生系において使用するための魅力的候補である。いくつかのメチロトロープ酵母は、最少規定培地上で高いバイオマスに増殖することが示された。メチロトロープ酵母のある属は、誘導された、または抑制解除された条件下に緊密に調節されかつ高度に発現された、これらの遺伝子のブロモーターが商業的価値を有するポリペプチドの製造に有用であろうことを示唆する。例えば、下記の文献を参照のこと：Ｆａｂｅｒｅｔａｌ．、Ｙｅａｓ、１１：１３３１、１９９５；Ｒｏｍａｎｏｓｅｔａｌ．、Ｙｅａｓ、８：４２３、１９９２；およびＣｒｅｇｇｅｔａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：９０５、１９９３。組換え産生系において使用するための宿主としてのメチロトロープ酵母の開発は、一部分適当な材料（例えば、プロモーター、選択マーカー、および突然変異の宿主細胞）および方法（例えば、形質転換技術）を欠如するために、遅かった。最も高度に開発されたメチロトロープ宿主系は、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）およびアンセンヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）を利用する（Ｆａｂｅｒｅｔａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、２５：３０５−３１０、１９９４；Ｃｒｅｇｇｅｔａｌ．、前掲；Ｒｏｍａｎｏｓｅｔａｌ．、前掲；米国特許第４，８５５，２４２号；米国特許第４，８５７，４６７号；米国特許第４，８７９，２３１号；および米国特許第４，９２９，５５５号）。メチロトロープ酵母の追加の種を形質転換する方法、および工業用酵素および製薬用タンパク質を包含する、経済的重要性を有するポリペプチドを製造するための形質転換された細胞を使用する必要性がこの分野において残っている。本発明は、これらのプロセスにおいて有用な組成物および方法、ならびに他の関係する利点を提供する。発明の要約本発明は、栄養要求性突然変異を有するピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞を製造する方法を提供する。これらの方法は、工程：（ａ）ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞を突然変異化条件に暴露し；（ｂ）工程（ａ）からの細胞を富んだ培地中で培養して、突然変異を前記細胞の少なくとも一部分において確立しかつ複製できるようにし；（ｃ）工程（ｂ）からの細胞を同化可能な窒素を欠失する培地中で培養して、細胞の貯蔵窒素を枯渇させ；（ｄ）工程（ｃ）からの細胞を、無機窒素源と、増殖するピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞を殺すために十分な量のナイスタチンとを含んでなる定められた培地中で培養して、栄養遺伝子を欠失する細胞について選択し；そして（ｅ）工程（ｄ）からの選択された細胞を富んだ培地中で培養する；からなる。本発明の１つの態様の範囲内において、工程(e)からの選択された細胞を定められた培地にレプリカプレートし、培養して栄養要求性突然変異の存在を確証する。他の態様の範囲内において、選択された細胞はアデニンに対して栄養要求性である。関係する態様の範囲内において、選択された細胞はホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキラーゼを欠失する。追加の態様の範囲内において、突然変異化条件は紫外線に対する暴露または化学的突然変異原に対する暴露からなる。他の態様の範囲内において、無機窒素源はアンモニウムイオンを含んでなる。本発明のこれらの面および他の面は、下記の詳細な説明および添付図面を参照することによって明らかとなるであろう。図面の簡単な説明第１図は、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のエレクトロポレーションの効率に対する電界強度およびパルス期間の効果を示す。第２図は、プラスミドｐＣＺＲ１４０とピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のゲノムＤＮＡとの間の組換え事象の略線図である。第３図は、プラスミドｐＣＺＲ１３７とピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のゲノムＤＮＡとの間の組換え事象の略線図である。発明の詳細な説明本発明をいっそう詳細に記載する前に、本明細書おいて使用されるある種の用語を定義する：「ＤＮＡ構築物」は、ヒトの関与により、自然において存在しない配置で組合わせされかつ並置されたＤＮＡのセグメントを含有するように修飾された、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ分子である。「初期対数期の増殖」は、細胞濃度が２×１０⁶細胞／ｍｌ〜８×１０⁸細胞／ｍｌであるときの培養における細胞増殖の期である。「異種ＤＮＡ」は、所定の宿主細胞内に天然に存在しない、ＤＮＡ分子、またはＤＮＡ分子の集団を意味する。特定の宿主細胞に対して異種のＤＮＡ分子は、その宿主ＤＮＡが非宿主ＤＮＡと組合わせられているかぎり、宿主細胞種に由来するＤＮＡを含有することができる。例えば、転写プロモーターを含んでなる宿主ＤＮＡセグメントに作用可能に連結されているポリペプチドをコードする非宿主ＤＮＡセグメントを含有するＤＮＡ分子は、異種ＤＮＡ分子であると考えられる。「高等真核」生物は、多細胞の真核生物である。この用語は、植物および動物の双方を包含する。「組込み形質転換体」は、異種ＤＮＡが導入されている細胞であり、ここで異種ＤＮＡは細胞のゲノムＤＮＡの中に組込まれるようになっている。「直鎖状ＤＮＡ」は、遊離の５’および３’末端を有するＤＮＡ分子、すなわち、非円形ＤＮＡ分子を意味する。直鎖状ＤＮＡは、閉じた円形ＤＮＡ分子、例えば、プラスミドから酵素的消化または物理的崩壊により製造することができる。「作用可能に連結された」という用語は、ＤＮＡセグメントがそれらの意図する目的のために調和して機能するように、例えば、転写がプロモーターにおいて開始しかつコーディングセグメントを通してターミネーターに進行するように、ＤＮＡセグメントが配置されていることを示す。用語「プロモーター」は、本明細書において、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の開始を提供するＤＮＡ配列を含有する遺伝子の部分を表す、この分野において認識されている意味について使用される。プロモーター配列は、遺伝子の５’非コーディング領域に、常にではないが、通常見出される。転写の開始において機能するプロモーター内の配列の因子は、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列により特徴づけられる。それらのプロモーターの因子は、下記のものを包含する：ＲＮＡポリメラーゼ結合部位；ＴＡＴＡ配列；ＣＡＡＴ配列；分化特異的因子（ＤＳＥｓ；ＭｃＧｅｈｅｅｅｔａｌ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、７：５５１−５６０、１９９３）；環状ＡＭＰ応答因子（ＣＲＥｓ）；血清応答因子（ＳＲＥｓ；Ｔｒｅｉｓｍａｎ、ＳｅｍｉｎａｒｓｉｎＣａｎｃｅｒＢｉｏｌ．、１：４７−５８、１９９０）；グルココルチコイド応答因子（ＧＲＥｓ）；および他の転写因子のための結合部位、例えば、ＣＲＥ／ＡＴＦ（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：１９９３８−１９９４３、１９９２）、ＡＰ２（Ｙｅｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｌｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：２５７２８−２５７３４、１９９４）、ＳＰ１、ｃＡＭＰ応答因子結合タンパク質（ＣＲＥＢ：Ｌｏｅｋｅｎ、ＧｅｎｅＥｘｐｒ．、３：２５３−２６４、１９９３）およびオクタマー因子。一般に、下記の文献を参照のこと：Ｗａｔｓｏｎｅｔａｌ．、編、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＧｅｎｅ、第４版、ＴｈｅＢｅｎｊａｍｉｎ／ＣｕｍｍｉｎｇｓＰｕｂ１ｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州メンロパーク、１９８７；およびＬｅｍａｉｇｒｅおよびＲｏｕｓｓｅａｕ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３０３：１−１４、１９９４。「抑制炭素源」は、制限されないとき、他の炭素源の異化に要求される遺伝子の生物中の発現を抑制する、代謝可能な，炭素含有化合物である。「制限」とは、非利用可能であるか、あるいは炭素源が直ちに消費され、したがって、生物の環境におけるその炭素源の支配的な濃度が効果的にゼロである、ような速度で利用可能となることを意味する。本発明の範囲内において使用できる抑制炭素源は、ヘキソースおよびエタノールを包含する。グルコースは特に好ましい。「富んだ」培地は、複雑な栄養源、典型的には細胞または組織の抽出物またはタンパク質の加水分解物をベースとする培地である。富んだ培地は、栄養源の組成の変動のために、バッチ毎に組成が変化する。前述したように、栄養要求性突然変異を有するピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞を製造する方法を提供する。ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）の栄養要求性突然変異体は、相同ＤＮＡ（宿主種からのＤＮＡ）および異種ＤＮＡの双方で形質転換することができ、そして生ずる形質転換体は多数の多様な生物学的用途において使用することができる。本発明の突然変異細胞は異種ＤＮＡを使用する形質転換に特によく適し、形質転換された細胞は、ヒトを包含する高等生物のポリペプチドおよびタンパク質を包含する、ポリペプチドおよびタンパク質の製造に使用することができる。栄養要求性ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞は、ＤＮＡライブラリーおよび合成ＤＮＡ分子を包含する、他のＤＮＡ分子で形質転換することができる。したがって、本発明は、遺伝的に多様なライブラリーを発現させて、新規な生物学的活性についてスクリーニングされる産物を産生することができ、化合物のライブラリーのスクリーニングのためのターゲットとして使用するように操作することができ、そして遺伝的に修飾して、他のプロセスの範囲内の実用性を増強することができる、宿主細胞を提供する。異種ＤＮＡで形質転換すべき細胞は、異種ＤＮＡ分子上の遺伝子（「選択マーカー」）により補足することができる突然変異を普通に有するであろう。この選択マーカーは、非形質転換細胞が増殖することができない条件（「選択的条件」）において形質転換された細胞の増殖を可能とする。選択の一般的原理はこの分野においてよく知られている。普通に使用される選択マーカーは、アミノ酸またはヌクレオチドの合成に要求される酵素をコードする遺伝子である。これらの遺伝子の中に突然変異を有する細胞は、突然変異が選択マーカーにより補足されないかぎり、特定のアミノ酸またはヌクレオチドを欠如する培地中で増殖することができない。このような「選択的」培地の使用は、宿主細胞内の異種ＤＮＡの安定な維持を保証する。ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）において使用するためのこの型の好ましい選択マーカーは、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のＡＤＥ２遺伝子であり、これはホスホリボシル− ５−アミノイミダゾールカルボキラーゼ（ＡＩＲＣ；ＥＣ４．１．１．２１）をコードする。ＡＤＥ２遺伝子は、ａｄｅ２宿主細胞の中に形質転換するとき、この細胞をアデニンの非存在において増殖させる。代表的なピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のＡＤＥ２遺伝子の配列のコーディングストランドは配列番号：１に示されている。図解されている配列は、５’の非コーディング配列の１００６ヌクレオチドおよび３’非コーディング配列の４４２非コーディング配列を含み、ヌクレオチド１００７−１００９に開始ＡＴＧコドンを有する。本発明の好ましい態様の範囲内において、ヌクレオチド４０７−２８５１を含んでなるＤＮＡセグメントを選択マーカーとして使用するが、コーディング部分がプロモーターおよびターミネーターの配列に作用可能に連結されているかぎり、より長いまたはより短いセグメントを使用できるであろう。当業者は認識するように、本発明において提供されるこの配列および他の配列はそれぞれの遺伝子の単一の対立遺伝子を表し、そしてその対立遺伝子の変異型は存在することが期待される。任意の機能的ＡＤＥ２対立遺伝子を本発明の範囲内で使用することができる。本発明の範囲内で使用できる他の栄養マーカーは、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のＡＤＥ１、ＨＩＳ３、およびＬＥＵ２遺伝子を包含し、これらは、それぞれ、アデニン、ヒスチジン、およびロイシンの非存在における選択を可能とする。異種遺伝子、例えば、他の真菌からの遺伝子を選択マーカーとして使用することもできる。メタノールの使用を最少化することを望む、大規模な工業的方法のために、双方のメタノール利用遺伝子（ＡＵＧ１およびＡＵＧ２）が欠失されている宿主細胞を使用することが好ましい。分泌されるタンパク質の産生のために、液胞プロテアーゼ遺伝子（ＰＥＰ４およびＰＲＢ１）を欠失する宿主細胞は好ましい。遺伝子欠失突然変異体は既知の方法、例えば、部位特異的突然変異誘発により製造することができる。ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）の遺伝子は、それらの相手サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の遺伝子との相同性に基づいてクローニングすることができる。本明細書において開示するＡＤＥ２遺伝子は、このような相同性に基づいてその表示が与えられている。ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）の株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（マリイランド州ロックビレ）および他の貯蔵所から入手可能であり、そして本発明の範囲内において出発物質として使用することができる。ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）の栄養要求性突然変異体を製造するために、細胞をまず突然変異化条件、すなわち、細胞において遺伝的突然変異を引き起こす環境的条件に暴露する。細胞を突然変異化する方法はこの分野においてよく知られており、そして化学的処理、紫外線への暴露、Ｘ線への暴露、およびレトロウイルスの挿入突然変異誘発を包含する。化学的突然変異原は、スルホン酸エチルメタン（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ− Ｎ−ニトロソグアニジン、２−メトキシ−６−クロロ−９−［３−（エチル−２ −クロロエチル）アミノプロピルアミノ］アクリジン・２ＨＣｌ、５−ブロモウラシル、アクリジン、およびアフラトキシンを包含する。下記の文献を参照のこと：Ｌａｗｒｅｎｃｅ、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．、１９４：２７３− ２８１、１９９１。得られた突然変異化細胞の比率は、細胞を暴露する突然変異化因子の強さまたは量の関数である。低いレベルの突然変異原は、低い比率の突然変異細胞を生成する。突然変異原のレベルがより高いほど、より高い比率の細胞を生成するが、また、より多い細胞を殺す。したがって、合理的な数の細胞が得られるように、突然変異誘発と細胞の死滅とを釣合わすことが必要である。釣合いは、一般に、細胞を異なる条件に暴露して死滅曲線を確立することによって、実験的に実施される。一般に、細胞を突然変異化条件に暴露し、１日間培養し、次いで細胞を標準的アッセイ法に従い試験する。本発明の範囲内において、２０〜５０％の死亡率を生ずるレベルの突然変異誘発することが好ましいが、例えば、非常に大きい数の細胞を使用して実施する場合、必要に応じてこの値を調節することができる。次いで突然変異化細胞を富んだ培地中で培養して、すべての突然変異体を細胞集団の少なくとも一部分において確立させかつ複製するようにさせる。この工程はゲノムが変更された細胞が突然変異を複製させ、それをそれらの子孫に伝え、これにより集団内で突然変異を確立するようにさせる。次いで細胞を同化可能な窒素を欠失する培地に移し、細胞の貯蔵窒素を枯渇させる。「同化可能な窒素を欠失する」とは、培地が細胞の増殖を支持するために十分な量の窒素を欠如することを意味する。細胞の貯蔵窒素を枯渇は、一般に、約１２〜２４時間のインキュベーションを必要とし、普通の条件において１６時間は十分である。貯蔵窒素の枯渇後、無機窒素源と、増殖するピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞を殺すために十分な量の抗真菌抗体とを含んでなる定められた培地中で細胞を培養する。好ましい抗体はナイスタチン（マイコスタチン）である。好ましい無機窒素源は、アンモニウムイオンを含んでなる源、例えば、硫酸アンモニウムである。一般に、培地は１０〜２００ｍＭのアンモニウム、好ましくは約６０ｍＭのアンモニウムを含有するであろう。ナイスタチンは０．１〜１００ｍｇ／ｌ、好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｌ、より好ましくは約２ｍｇ／ｌ（１０単位／ｌ）の濃度で添加される。ナイスタチンを使用する処理は１０分〜６時間、好ましくは約１時間実施される。当業者は認識するように、プロトトロフの細胞を殺すために要求される実際の抗体濃度および暴露時間は実験的に容易に決定することができ、そして抗体の個々のバッチの間の特定の活性の変動を補償するために、ある種の調節を必要とすることがある。細胞の貯蔵窒素を枯渇させ、次いで無機窒素源および抗体を含有する定められた培地中で細胞を培養することによって、アミノ酸またはヌクレオチドの生合成について栄養要求性である細胞は、定められた培地中で増殖することができないので、生きて止まる。増殖する細胞は抗体により殺される。抗体処理後、細胞を富んだ培地に移す。処理した細胞の栄養要求を決定することによって、栄養要求性突然変異を確証し、特性決定する。通常、この決定にレプリカプレート法が使用される。細胞を富んだ培地および特定の栄養成分を欠如する培地の双方上にプレートする。特定のプレート上で増殖しない細胞は欠けている栄養成分について栄養要求性である。それ以上の特性決定に、相補性の分析を使用することができる。下記の方法を包含する、いくつかの既知の方法のいずれによっても、異種ＤＮＡをピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞の中に導入することができる・リチウム形質転換（Ｈｉｅｐｅｔａｌ．、Ｙｅａｓｔ、９：１１８９−１１９７、１９９３；ＴａｒｕｔｉｎａおよびＴｏｌｓｔｏｒｕｋｏｖ、Ａｂｓｔ．ｏｆｔｈｅ１５ｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｐｅｃｉａｌｉｚｅｄＳｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎＹｅａｓｔｓ、Ｒｉｇａ（ＵＳＳＲ）、１９９１、１３７；Ｉｔｏｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５３：１６３、１９８３；Ｂｏｇｄａｎｏｖａｅｔａｌ．、Ｙｅａｓｔ、１１：３４３。１９９５）、スフェロプラスト形質転換（Ｂｅｇｇｓ、Ｎａｔｕｒｅ、２７５：１０４、１９７８；Ｈｉｎｎｅｎｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５：１９２９、１９７８：Ｃｒｅｇｇｅｔａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：３３７６、１９８５）、凍結−融解ポリエチレングリコール形質転換（ＰｉｃｈｉａＥｘｐｒｅｓｓｎＫｉｔＩｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎＭａｎｕａｌ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．、カリフォルニア州サンディエゴ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ１７１０−０１）、またはエレクトロポレーション、後者は好ましい。エレクトロポレーションは、パルス電界を使用して細胞膜を一時的に透過可能化し、高分子、例えば、ＤＮＡを細胞の中に入れる方法である。エレクトロポレーションは、哺乳動物（例えば、Ｎｅｕｍａｎｎｅｔａｌ．、ＥＭＢＯＪ．、１：８４１−８４５、１９８２）および真菌（例えば、Ｍｅｉｌｈｏｃｅｔａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：２２３−２２７、１９９０）の宿主細胞を用いる使用について記載されてきている。しかしながら、ＤＮＡが細胞の中に転移される実際のメカニズムはよく理解されていない。ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）の形質転換について、２．５〜４．５ｋＶ／ｃｍの電界強度および１〜４０ミリセカントの時間定数（τ）を有する、指数的に減衰するパルス電界に、細胞を暴露するとき、驚くべきことには、エレクトロポレーションは効率よいことが見出された。時間定数τは、最初のピーク電圧Ｖ₀がＶ₀／ｅの値に低下するために要求される時間として定義される。時間定数は合計の抵抗とパルス回路のキャパシタンスとを掛けた値、すなわち、τ＝Ｒ×Ｃとして計算することができる。典型的には、抵抗およびキャパシタンスは前もって設定されるか、あるいは選択されたエレクトロポレーション装置に依存して、ユーザーが選択することができる。いずれの場合においても、装置は製造業者の取扱説明書に従い前述の電界強度および減衰パラメーターを提供するように形造られる。エレクトロポレーション装置は商業的供給会社から入手可能である（例えば、ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州ハーキュレス）。ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）の形質転換に使用するＤＮＡ分子は、普通に、二本鎖の、円形プラスミドとして調製され、好ましくはこれらのプラスミドは形質転換の前に線状化される。ポリペプチドまたはタンパク質の産生のために、ＤＮＡ分子は、前述の選択マーカーに加えて、転写プロモーター、問題のポリペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡセグメント（例えば、ｃＤＮＡ）、および転写ターミネーターを含んでなる発現カセットを含むであろう。これらの因子は問題のＤＮＡセグメントの転写を提供するように作用可能に連結される。プロモーターおよびターミネーターはピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）の遺伝子のそれであることが好ましい。有用なプロモーターは、構成的プロモーターおよびメタノール誘導可能なプロモーターからのものを包含する。プロモーター配列は、一般に、遺伝子のコーディング配列の１．５ｋｂ上流の範囲内に、しばしば１ｋｂまたはそれより小さい範囲内に含有される。一般に、調節されたプロモーターは、調節因子の存在のために、構成的プロモーターよりも大きい。メタノール誘導可能なプロモーターは、陽性および陰性の双方の調節因子を含み、開始ＡＴＧから１ｋｂ上流より多く伸長することができる。プロモーターは機能により同定することができ、そして既知の方法に従いクローニングすることができる。特に好ましいメタノール誘導可能なプロモーターは、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のアルコール利用遺伝子のそれである。１つのこのような遺伝子、ＡＵＧ１、の代表的なコーディングストランドの配列は配列番号：２に示されている。配列番号：２内において、開始ＡＴＧコドンはヌクレオチド１３５５−１３５７である。配列番号：２のヌクレオチド１−２３は非ＡＵＧ１ポリリンカー配列である。プロモーターとして、配列番号：２のヌクレオチド２４−１３５４を含んでなるセグメントを利用することは特に好ましいが、追加の上流の配列を含めることができる。ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）は第２アルコール利用遺伝子、ＡＵＧ２、を含有し、そのプロモーターは本発明の範囲内において使用することができる。ＡＵＧ２クローンの部分的ＤＮＡ配列は配列番号：９に示されている。本発明の範囲内において使用するＡＵＧ２プロモーターのセグメントは一般に配列番号：９のヌクレオチド９１−１６９を含んでなるが、３’末端における小さいトランケーションはプロモーター機能を無効にすることは期待されないであろう。他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＨＡＳ）、ホルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）、およびカタラーゼ（ＣＡＴ）の遺伝子のプロモーターを包含する。他の種からのこれらの酵素をコードする遺伝子は記載されてきており、そしてそれらの配列は入手可能である（例えば、Ｊａｎｏｗｉｃｚｅｔａｌ．、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１３：２０４３、１９８５；ＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇおよびＪａｎｏｗｉｃｚ、ＥＰＯ公開第０，２９９，１０８号；ＤｉｄｉｏｎおよびＲｏｇｇｅｎｋａｍｐ、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．、３０３：１１３、１９９２）。これらのタンパク質をコードする遺伝子は、プローブとして既知の配列を使用するか、あるいは既知の配列を整列させ、整列に基づいてプライマーを設計し、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のＤＮＡを増幅することによって、クローニングすることができる。構成的プロモーターは、環境的条件により活性化または不活性化されないものである；それらは常に転写的に活性である。本発明の範囲内において使用するために好ましい構成的プロモーターは、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、およびホスホグリセレートキナーゼの遺伝子のプロモーターを包含する。これらの遺伝子は、対応遺伝子の中に突然変異を有する宿主細胞、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における相補性によりクローニングすることができる。この型の突然変異体はこの分野においてよく知られている。例えば、下記の文献を参照のこと：ＫａｗａｓａｋｉおよびＦｒａｅｎｋｅｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１０８：１１０７−１１１２、１９８２；ＭｃＫｎｉｇｈｔｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ、４６：８３−８９、１９８６；ＡｇｕｉｌｅｒａおよびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２０２：８３−８９、１９８６。ＤＮＡ分子は、さらに、形質転換体の同定、選択、および維持を可能とする選択マーカーを含むであろう。ＤＮＡ分子は、さらに、追加の因子、例えば、複製起点、および別の宿主（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））におけるＤＮＡの増幅および維持を可能とする選択マーカーを含有することができる。宿主染色体の中へのＤＮＡの組込みを促進するために、宿主ＤＮＡ配列により両端においてフランクした、プロモーター−問題の遺伝子−ターミネーター＋選択マーカーを含んでなる、全体の発現セグメントを有することが好ましい。これは発現セグメントの下流端に３’非翻訳ＤＮＡ配列を含め、そして５’末端におけるプロモーター配列に頼ることによって、好都合に達成される。直鎖状ＤＮＡＤＮＡを使用するとき、発現セグメントは切断部位によりフランクして、分子の線状化および発現セグメントの他の配列（例えば、細菌の複製起点および選択マーカー）からの分離を可能とする。好ましいこのような部位は、ＤＮＡ配列内でめったに切断しない制限エンドヌクレアーゼ、例えば、８塩基のターゲット配列を認識するもの（例えば、ＮｏｔＩ）により認識される部位である。ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）において産生されることができるタンパク質は、工業的および製剤学的に重要なタンパク質を包含する。このようなタンパク質は、植物および動物、特に脊椎動物、例えば、哺乳動物からの高等真核生物のタンパク質を包含するが、微生物からのある種のタンパク質もまた大きい価値を有する。本発明の方法を使用して製造できるタンパク質は、酵素、例えば、リパーゼ、セルラーゼ、およびプロテアーゼ；酵素インヒビター、例えば、プロテアーゼインヒビター；増殖因子、例えば、血小板由来増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、および表皮増殖因子；サイトカイン、例えば、エリトロポイエチンおよびトロンボポイエチン；およびホルモン、例えば、インスリン、レプチン、およびグルカゴンを包含する。ポリペプチドを製造するために、適切な炭素源、窒素源および微量栄養素を含んでなる培地中で約２５℃〜３５℃の温度においてピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞を培養する。液体培地を慣用手段、例えば、小さいフラスコの震盪または発酵槽のスパージにより十分に通気する。好ましい培地はＹＥＰＤ（表１）である。細胞を新鮮な培地の中に希釈することによって継代培養するか、あるいは冷蔵下にプレート上で短期間貯蔵することができる。長期間の貯蔵のために、細胞を好ましくは５０％のグリセロール溶液の中に−７０℃において保持する。 −Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ粉末４．０ｇアデニン、３．０ｇアルギニン、５．０ｇアスパラギン酸、２．０ｇヒスチジン、６．０ｇイソロイシン、４．０ｇリジン、２．０ｇメチオニン、６．０ｇフェニルアラニン、５．０ｇセリン、５．０ｇチロシン、４．０ｇウラシル、および６．０ｇバリン（すべてはＬ−アミノ酸である）を組合わせることによって製造された粉末−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ粉末４．０ｇアデニン、３．０ｇアルギニン、５．０ｇアスパラギン酸、６．０ｇイソロイシン、８．０ｇロイシン、４．０ｇリジン、２．０ｇメチオニン、６．０ｇフェニルアラニン、５．０ｇセリン、５．０ｇチロシン、４．０ｇウラシル、および６．０ｇバリン（すべてはＬ−アミノ酸である）を組合わせることによって製造された粉末−Ｕｒａ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ粉末４．０ｇアデニン、３．０ｇアルギニン、５．０ｇアスパラギン酸、２．０ｇヒスチジン、６．０ｇイソロイシン、８．０ｇロイシン、４．０ｇリジン、２．０ｇメチオニン、６．０ｇフェニルアラニン、５．０ｇセリン、５．０ｇチロシン、および６．０ｇバリン（すべてはＬ−アミノ酸である）を組合わせることによって製造された粉末−Ａｄｅ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ粉末３．０ｇアルギニン、５．０ｇアスパラギン酸、２．０ｇヒスチジン、６．０ｇイソロイシン、８．０ｇロイシン、４．０ｇリジン、２．０ｇメチオニン、６．０ｇフェニルアラニン、５．０ｇセリン、５．０ｇチロシン、４．０ｇウラシル、および６．０ｇバリン（すべてはＬ−アミノ酸である）を組合わせることによって製造された粉末２００×トリプトファン、スレオニン溶液Ｈ₂Ｏ中の３．０％Ｌ−スレオニン、０．８％Ｌ−スレオニンプレートのために、１．８％Ｂａｃｔｏ^TM寒天（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加する。ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のエレクトロポレーションは、初期対数期の増殖における細胞について実施ことが好ましい。細胞を固形培地、好ましくは固形ＹＥＰＤ上の単一のコロニーに対してストリークする。３０℃において約２日の増殖後、新鮮なプレートからの単一のコロニーを使用して、所望の体積の富んだ培地（例えば、ＹＥＰＤ）を約５〜１０×１０⁵細胞／ｍｌの細胞密度に接種する。細胞が初期対数期にあるまで、激しく震盪しながら約２５〜３５℃、好ましくは３０℃において細胞をインキュベートする。次いで、例えば、３０００×ｇにおける２〜３分間の遠心により、細胞を収集し、再懸濁させる。細胞壁中のジサルファイド結合を還元することによって、細胞をエレクトロコンピテントとし、エレクトロポレーション条件と適合性であるイオン溶液中で細胞を平衡化し、細胞を冷却する。典型的には、還元剤、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を含有するｐＨ６〜８の緩衝液中で細胞をインキュベートして、細胞壁のタンパク質を還元して引き続くＤＮＡの吸収を促進することによって、細胞をエレクトロコンピテントとする。これに関して好ましいインキュベーション緩衝液は、２５ｍＭのＤＴＴを含有する５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５の新鮮な溶液である。細胞をこの緩衝液（典型的にはもとの培養体積の１／５を使用する）中で約３０ ℃において約５〜３０分間、好ましくは約１５分間インキュベートする。次いで細胞を収集し、氷冷して使用する適当なエレクトロポレーション緩衝液中で洗浄する。これに関して適当な緩衝液は、弱い緩衝剤、２価のカチオン（例えば、Ｍｇ⁺⁺、Ｃａ⁺⁺）および浸透圧安定剤（例えば、糖）を含有するｐＨ６〜８の溶液を包含する。洗浄後、細胞を小さい体積の緩衝液の中に再懸濁させ、この時細胞をエレクトロポレートし、そして直接使用するか、あるいはアリコートを取り、凍結して（好ましくは−７０℃において）貯蔵することができる。好ましいエレクトロポレーション緩衝液はＳＴＭ（２７０ｍＭのスクロース、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＭｇＣｌ₂）である。好ましいプロトコールの範囲内において、細胞を２回洗浄し、まずもとの培養体積の氷冷緩衝液中で、次いでもとの体積の１／２中で洗浄する。第２回の洗浄後、細胞を収集し、典型的には、２００ｍｌのもとの培養値について約３〜５ｍｌの緩衝液を使用して、再懸濁させる。小さい体積のエレクトロコンピテント細胞（典型的には約１００μｌ)および１／１０体積までの直鎖状ＤＮＡ分子を使用して、エレクトロポレーションを実施する。例えば、０．１ｍｌの５０ｍＭのイオン強度を超えない緩衝液中の細胞懸濁液を０．１〜１０μｇのＤＮＡ（体積≦１０μｌ）と組合わせる。この混合物を氷冷エレクトロポレーションクベットの中に入れ、そして２．５〜４．５ｋＶ／ｃｍ、好ましくは約３．７５ｋＶ／ｃｍのおよび１〜４０ミリセカント、好ましくは１０〜３０ミリセカント、より好ましくは１５〜２５ミリセカント、最も好ましくは約２０ミリセカントの時間定数のパルス電界に、指数的減衰で、暴露する。所望のパルスパラメーターを達成するために使用する実際の装置の設定は、使用する装置により決定されるであろう。ＢｉｏＲａｄ（カリフォルニア州ハーキュレス）ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ^TMを２ｍｍのエレクトロポレーションクベットとともに使用するとき、抵抗は６００オームまたはそれより大きく、好ましくは「無限」であり、そしてキャパシタンスを２５μＦに設定して所望の電界特性を得る。パルス後、細胞を１ｍｌのＹＥＰＤブロスの中にほぼ１０×に希釈し、３０℃において１時間インキュベートする。次いで細胞を収集し、選択培地上にプレートする。好ましい態様の範囲内において、細胞を小さい体積（エレクトロポレートした細胞の希釈体積に等しい）の１×酵母窒素原基礎培地（６．７ｇ／ｌのアミノ酸を含まない酵母窒素原基礎培地；ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ミシガン州デトロイト）で１回洗浄し、最少選択培地上にプレートする。ＡＤＥ２選択マーカーで形質転換されたａｄｅ２突然変異を有する細胞を、アデニンを欠如する最少培地、例えば、ＡＤＥＤ（表１）またはＡＤＥＤＳ（表１）上にプレートすることができる。典型的な手順において、２５０μｌのアリコートの細胞を４つの別々のＡＤＥＤおよびＡＤＥＤＳプレート上にプレートして、Ａｄｅ⁺細胞について選択する。ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）は、ある種のめったに存在しない配列［自律的に複製する配列（ＡＲＳ）と命名する］を、ＤＮＡ複製起点として認識し、そしてこれらの配列は形質転換に使用されるＤＮＡ分子内に偶発的に存在して、形質転換するＤＮＡの染色体外の維持を可能とすることがある。しかしながら、組込み形質転換体は一般にタンパク質産生系において使用するために好ましい。組込み形質転換体は、炭素源としてソルビトールを含有する選択培地上でＡＲＳ形質転換体を越えた深遠な増殖の利点を有し、これにより組込み形質転換体を形質転換された細胞集団の中から選択するための方法を提供する。ＡＲＳ配列はピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のＡＤＥ２遺伝子および、多分、ＡＵＧ１遺伝子の中に存在することが見出された。したがって、ＡＤＥ２遺伝子で形質転換されたピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のａｄｅ２宿主細胞は少なくとも２つの異なるモードによりＡｄｅ⁺ となることができる。ＡＤＥ２遺伝子内のＡＲＳは、形質転換するＤＮＡの不安定な染色体外の維持を可能とする（Ｈｉｅｐｅｔａｌ．、Ｙｅａｓｔ、９：１１８９−１１９７、１９９３）。このような形質転換体のコロニーは、Ａｄｅ^-である子孫の多産性世代のために、より遅い増殖速度およびピンク色により特性決定される。形質転換するＤＮＡは、また、宿主ゲノムの中に組込まれて、急速に増殖し、白色であり、そしてＡｄｅ^-子孫の検出可能なメンバーを生ずることができない、安定な形質転換体を生ずることができる。ＡＤＥＤプレートは、形質転換された細胞の最も急速な増殖、およびほぼ同一の速度における不安定および安定な形質転換体の増殖を可能とする。３０℃においてＡＤＥＤプレート上の３〜５日のインキュベーション後、安定な形質転換体のコロニーは白色であり、そして不安定な、ピンク色の形質転換体はほぼ２倍の大きさを有する。ＡＤＥＤＳプレートは安定な形質転換体についていっそう選択的であり、これらの形質転換体は５〜７日で大きい（約５ｍｍ）のコロニーを形成するが、不安定な（ＡＲＳ維持）コロニーは非常に小さい（約１ｍｍ）。したがって、より選択的なＡＤＥＤＳ培地は安定な形質転換体の同定および選択のために好ましい。いくつかの用途のために、例えば、遺伝的に多様なライブラリーを遺伝因子の希有な組合わせについてスクリーニングするために、ほぼ１００倍で安定な形質転換体に数でまさって観察された、多数の不安定な形質転換体をスクリーニングすることが時々望ましい。このような場合において、低い選択性の培地、例えば、ＡＤＥＤ上に形質転換体をプレートする実用性を当業者は認識するであろう。組込み形質転換体はタンパク質生産法において使用するために好ましい。このような細胞は連続的な選択的圧力なしに増殖することができる。なぜなら、ＤＮＡはゲノムからめったに失われないからである。宿主染色体の中へのＤＮＡの組込みはサザンブロット分析により確証することができる。簡単に述べると、形質転換された宿主ＤＮＡおよび非形質転換の宿主ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化し、電気泳動により分離し、支持膜にブロットし、そして適当な宿主ＤＮＡセグメントでプローブする。非形質転換細胞および形質転換された細胞において見られるフラグメントのパターンの差は、組込み形質転換を示す。形質転換するＤＮＡセグメント（例えば、プロモーター、ターミネーター、異種ＤＮＡ、および選択マーカーの配列）をゲノムフラグメントの中から同定するために、制限酵素およびプローブを選択することができる。異種タンパク質の発現レベルの差は、組込み部位および発現カセットのコピー数のような因子および個々の単離物の間のプロモーターの差から発生させることができる。したがって、産生株を選択する前に、多数の単離物を発現レベルについてスクリーニングすることが有利である。種々の適当なスクリーニング法が利用可能である。例えば、形質転換体のコロニーをプレート上で増殖させ、プレートをタンパク質に結合する膜（例えば、ニトロセルロース）でオーバーレイする。タンパク質は細胞から分泌によるか、あるいは引き続く溶解により解放され、そして膜に結合する。次いで結合したタンパク質を既知の方法、例えば、イムノアッセイによりアッセイすることができる。細胞を液体培地中で培養し、必要に応じて、コンディショニングされた培地または細胞ライゼイトを分析することによって、発現レベルのより正確な分析を得ることができる。タンパク質を培地およびライゼイトから濃縮しかつ精製する方法は、問題のタンパク質により一部分決定されるであろう。小規模のタンパク質の生産（例えば、プレートまたは震盪フラスコの生産）のために、メタノール調節プロモーター（例えば、ＡＵＧ１プロモーター）を含んでなる発現カセットを有するピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）の形質転換体を、メタノールの存在においてかつ妨害量の他の炭素源（例えば、グルコース）の非存在において増殖させる。発現レベルの予備的スクリーニングを包含する、小規模の実験のために、形質転換体を、例えば、２０ｇ／ｌのＢａｃｔｏ寒天（Ｄｉｆｃｏ）、６．７ｇ／ｌのアミノ酸を含まない酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｇ／ｌのメタノール、０．４μｇ／ｌのビオチン、および０．５６ｇ／ｌのＡｄｅ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ粉末を含有する固形培地上で３０℃において増殖させることができる。メタノールは揮発性炭素源であるので、それは延長したインキュベーションで容易に失われる。倒立プレートの蓋の中に水中の５０％メタノール溶液を入れることによってメタノールを連続的に供給することができ、これによりメタノールは蒸発的転移により増殖する細胞に転移される。一般に、１００ｍｍのプレートにつき１ｍｌ以下のメタノールを使用する。震盪フラスコ中で増殖させた培養物を使用して、わずかにより大きい規模の実験を実施することができる。典型的な手順において、前述したように３０℃において最少メタノールプレート上で細胞を２日間培養し、次いでコロニーを使用して小さい体積の最少メタノール培地（６．７ｇ／ｌのアミノ酸を含まない酵母窒素原基礎培地、１０ｇ／ｌのメタノール、０．４μｇ／ｌのビオチン）を約１×１０⁶細胞／ｍｌの細胞密度で接種する。細胞を３０℃において増殖させる。メタノール上で増殖する細胞は高い酸素要求を有し、培養の間の激しい震盪を必要とする。メタノールを毎日補充する（典型的には１／１００体積の５０％メタノール／日）。生産規模の培養のために、高い産生性のクローンの新鮮な培養物を震盪フラスコ中で調製する。次いで生ずる培養物を使用して、発酵槽中の培地を接種する。典型的には、３０℃において１〜２日間激しく撹拌しながら増殖させたＹＥＰＤ中の５００ｍｌの培養物を使用して、５リットルの発酵槽を接種する。塩類、グルコース、ビオチン、および微量元素を含有する適当な培地中で２８℃、ｐＨ５．０、および＞３０％溶解Ｏ₂において、細胞を増殖させる。最初に供給したグルコースが消費された後（酸素消費の減少により示される）、グルコース／メタノールの供給物を容器の中に導入して、問題のタンパク質の産生を誘発する。大規模の発酵は制限する炭素の条件下に実施されるので、供給物中のグルコースの存在はメタノール誘発可能なプロモーターを抑制しない。グルコースが制限された条件下にメタノールと組み合わせてグルコースを使用すると、急速な増殖、炭素のバイオマスへの効率よい変換、および生理学的増殖状態の急速な変化を生ずると同時に、メタノール誘導可能な遺伝子のプロモーターの完全な誘発が得られる。典型的な発酵において、約８０〜約４００ｇ／ｌの湿潤細胞ペーストが得られる。「湿潤細胞ペースト」は、発酵槽からの細胞の収集により、典型的には培養物の遠心により得られる細胞の塊を意味する。下記の非限定的実施例により、本発明をさらに説明する。実施例実施例１ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞（ＣＢＳ６５１５株、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マリイランド州ロックビレ）を紫外線暴露により突然変異誘発した。まず、いくつかのプレート上にほぼ２００〜２５０細胞／プレートでプレートすることによって、死滅曲線を発生させた。次いでプレートの表面から２５ｃｍに懸垂されたＧ８Ｔ５殺菌燈（Ｓｙｌｖａｎｉａ）を使用して、プレートを紫外線に表２に示す時間の間暴露した。次いでプレートを可視光線源から保護し、３０℃において２日間インキュベートした。次いで２秒の紫外線暴露を使用して約２０％の死滅を発生させることによって、大規模の突然変異誘発を実施した。同族体を欠乏した潜在的栄養要求株の増殖を補助するために添加された、１００ｍｇ／ｌの各ウラシル、アデニン、およびロイシンを補充した、８つのＹＥＰＤプレート上に細胞をほぼ１０⁴細胞／プレートでプレートした。紫外線暴露後、プレートを箔の中に包み、３０℃において一夜インキュベートした。次の日に、プレート上のコロニー（合計約１０⁵）を水中に再懸濁させ、水で１回洗浄した。０．１〜０．２のＯＤ₆₀₀を与えるために十分な量の細胞懸濁液を使用して、アミノ酸またはアンモニアを含まない酵母窒素原基礎培地を使用して調製され、１％グルコースおよび４００μｇ／ｌのビオチンを補充した、５００ｍｌの最小ブロスを接種した。培養物を２．８リットルのバッフルベル（ｂａｆｆｌｅｄＢｅｌｌ）フラスコの中に入れ、３０℃において一夜激しく震盪した。次の日に、細胞は約１．０〜２．０のＯＤ₆₀₀に到達した。細胞を沈降させ、５ｇ／ｌの硫酸アンモニウムを補充した５００ｍｌの最小ブロスの中に再懸濁させた。細胞懸濁液を２．８リットルのバッフルベルフラスコの中に入れ、３０℃において６時間激しく震盪した。培養物の５０ｍｌを対照として取って置き、培養物の残りに１ｍｇのナイスタチンを添加して栄養要求性突然変異体について選択した（Ｓｎｏｗ、Ｎａｔｕｒｅ、２１１：２０６− ２０７、１９６６）。培養物をさらに１時間震盪しながらインキュベートした。次いで、対照細胞およびナイスタチン処理細胞を遠心により収集し、水で３回洗浄した。洗浄した細胞を５０％グリセロールの中に１．０のＯＤ₆₀₀に再懸濁させ、凍結させた。コロニー形成単位についてナイスタチン処理細胞／対照細胞の力価は、ナイスタチンの濃縮が生存できる細胞の数を１０⁴倍減少させたことを明らかにした。ナイスタチン処理細胞の１０^-2希釈物を１５のＹＥＰＤプレート上にプレートした。コロニーを最小プレート（２％寒天、１×ＹＮＢ、２％グルコース、４００μｇ／ｌビオチン）上にレプリカープレートした。栄養要求株の頻度は約２〜４％であった。ほぼ１８０の栄養要求性コロニーをＹＥＰＤ＋Ａｄｅ、Ｌｅｕ、Ｕｒａプレートに取り上げ、種々のドロップアウトプレートにレプリカ−プレートした。栄養要求株のすべてはＡｄｅ^-であった。これらのうちで、３０はドロップアウトプレート上で顕著にピンク色であった（ＬＥＵＤ、ＨＩＳＤ、およびその他；表１参照）。３０のピンク色の突然変異体のうちで、２１をそれ以上の研究のために選択した；残りはＡＤＥＤプレート上の増殖について漏出性であるか、あるいは野生型細胞で汚染されていた。次いでＡｄｅ^-突然変異体を相補性分析および表現型試験に付した。突然変異体により定められる遺伝子座の数を決定するために、すべての２１の突然変異体を単一のピンク色のＡｄｅ^-テスター株（株＃２）に交配させた。細胞懸濁液（ＯＤ₆₀₀＝１）を混合し、この混合物を１０μｌのアリコートでＹＥＰＤプレート上にプレートすることによって、交配を実施した。次いで細胞をＳＰＯＲ培地（０．５％酢酸ナトリウム、１％ＫＣｌ、１％グルコース、１％寒天）に複製し、３０℃において一夜インキュベートした。表３に示すように、突然変異体のいくつかの組合わせはＡｄｅ⁺コロニーを与えることができなかった（多分株＃２におけるのと同一の遺伝子座を定めるために）が、他のものは多数のＡｄｅ⁺コロニーを生じた（多分別の遺伝子座を定めるために）。突然変異体＃３は、＃２と交配させたとき、Ａｄｅ⁺コロニーを与えたので、相補性の試験を突然変異体＃３を使用して反復した。突然変異体のグループが２つの遺伝子座を定める場合、株＃２と交配させたとき、Ａｄｅ⁺コロニーを与えることができなかったすべての突然変異体は、株＃３と交配させたとき、Ａｄｅ⁺コロニーを与えるであろう。交雑の結果を表３に示す。表３に示すように、大部分の突然変異体は２つのグループのうちの１つに入り、欠如したとき、制限アデニン培地上でピンク色のコロニーを生ずる、２つのアデニン生合成遺伝子が存在するという考えと一致する。３つのコロニー（＃４、＃１２、および＃１６）は３つの遺伝子座を定めるか、あるいは遺伝子内相補性を示す。２つの相補性グループ（＃３および＃１０、＃６および＃１１）の各々からの強く色素沈着した突然変異体をそれ以上の研究のために選択した。追加の分析は、Ａｄｅ^-がこれらの株の中に存在する唯一の栄養要求株であることを示した。ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のクローンのバンクをベクターｐＲＳ４２６、すなわち、２μおよびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＵＲＡ配列を含んでなるシャトルベクター、中で構築し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるその増殖を可能とした。標準的手順に従い、ＣＢＳ６５１５株からゲノムＤＮＡを調製した。簡単に述べると、細胞を富んだ培地中で一夜培養し、ザイモリアーゼでスフェロプラストとし、そしてＳＤＳで溶解した。ＤＮＡをライゼイトからエタノールで沈降させ、フェノール／クロロホルム混合物で抽出し、次いで酢酸アンモニウムおよびエタノールで沈降させた。ＤＮＡ調製物のゲル電気泳動は、完全な、高分子量のＤＮＡおよび認められる量のＲＮＡの存在を示した。酵素の希釈系列の存在においてＤＮＡをインキュベートすることによって、ＤＮＡをＳａｕ３Ａで部分的に消化した。消化物のサンプルを電気泳動により分析して、フラグメントの大きさ分布を決定した。４〜１２ｋｂの間を移動するＤＮＡをゲルから切断し、ゲルのスライスから抽出した。次いで大きさで分画したＤＮＡをＢａｍＨＩで消化したｐＲＳ４２６に結合し、アルカリ性ホスファターゼで処理した。製造業者が推奨するようにＢｉｏＲａｄＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ^TM装置を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１において、反応混合物のアリコートをエレクトロポレートした。ゲノムライブラリーを使用してエレクトロポレーションによりＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＨＢＹ２１Ａ株（ａｄｅ２ｕｒａ３）を形質転換した（ＢｅｃｋｅｒおよびＧｕａｒｅｎｔｅ、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．、１９４：１８２−１８７、１９９１）。細胞を１．２Ｍのソルビトールの中に再懸濁させ、６ ×３００μｌのアリコートをＡＤＥＤ、ＡＤＥＤＳ、ＵＲＡＤおよびＵＲＡＤＳプレート（表１）上にプレートした。プレートを３０℃において４〜５日間インキュベートした。ＡＤＥＤまたはＡＤＥＤＳプレート上で、Ａｄｅ⁺ コロニーは回収されなかった。ＵＲＡＤおよびＵＲＡＤＳプレートからのコロニーをＡＤＥＤプレートにレプリカ−プレートし、２つの密接に間隔を置いて位置する白色のコロニーが得られた。これらのコロニーを再ストリークし、Ｕｒａ⁺およびＡｄｅ⁺であることが確証された。これらの２つの株（Ａｄｅ１およびＡｄｅ６と表示する）を、５ＦＯＡ（５フルオロオロト酸；ＳｉｋｏｒｓｋｉおよびＢｏｅｋｅ、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．、１９４：３０２−３１８）を含有する培地上にストリークした。Ｕｒａ^-が得られ、これらはレプリカプレートするときＡｄｅ^-であることが見出された。これらの結果が示すように、Ａｄｅ⁺補足活性はプラスミドを含むＵＲＡ３マーカーに遺伝的に関係づけられる。酵母Ａｄｅ１およびＡｄｅ６から得られたプラスミドは、後述するように、制限マッピングにより同一であるように見えた。これらのゲノムのクローンを、それぞれ、ｐＡＤＥ１−１およびｐＡＤＥ１−６と表示する。全体のＤＮＡをＨＢＹ２１Ａ形質転換体Ａｄｅ１およびＡｄｅ６から単離し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１をＡｍｐ^rに形質転換するために使用した。Ａｄｅ１の２つのＡｍｐ^rコロニーおよびＡｄｅ６の３つのＡｍｐ^rコロニーからＤＮＡを調製した。ＤＮＡをＰｓｔＩ、ＳｃａＩ、およびＰｓｔＩ＋ＳｃａＩで消化し、ゲル電気泳動により分析した。すべての５つの単離物は同一の制限パターンを生成した。ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のＡＤＥ２遺伝子（また、ＡＤＥ１として知られている；Ｈｉｅｐｅｔａｌ．、Ｙｅａｓｔ、９：１２５１−１２５８、１９９３）の発表された配列から、ＰＣＲプライマーを設計した。プライマー９０８０（配列番号：３）をＡＤＥ２のＤＮＡ（配列番号：１）の塩基４０６−４２９においてプライムするように設計し、そしてプライマー９０７９（配列番号：４）を塩基２８５２−２８２９においてプライムするように設計した。双方のプライマーは、増幅された配列の各末端にＡｖｒＩＩおよびＳｐｅＩを導入するテイルを含んだ。生ずるＰＣＲフラグメントの予測された大きさは２４５０ｂｐであった。鋳型ＤＮＡとして５つの推定上のＡＤＥ２からのプラスミドＤＮＡを使用して、ＰＣＲを実施した。１００μｌの反応混合物は、１×ＴａｑＰＣＲ緩衝液（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）インジアナ州インディアナポリス）、１０〜１００ｎｇのプラスミドＤＮＡ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰｓ、１００ｐｍｏｌの各プライマー、および１μｌのＴａｑポリメラーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を含有した。ＰＣＲを３０サイクルの３０秒、９２℃、および１２０秒、７２℃で実施した。５つの推定上のＡＤＥ２ゲノムのクローンの各々は、期待された大きさ（２．４ｋｂ）のＰＣＲ生成物を生じた。１つの反応からのＤＮＡフラグメントの制限マッピングは、ＢｇｌＩＩまたはＳａｌＩで消化したとき、期待された大きさのフラグメントを与えた。陽性のＰＣＲ反応物をプールし、ＳｐｅＩで消化した。ベクターｐＲＳ４２６をＳｐｅＩで消化し、仔ウシ腸ホスファターゼで処理した。４μｌのＰＣＲフラグメントおよび１μｌのベクターＤＮＡを、慣用の結合条件を使用して、１０μ ｌの反応混合物中で組合わせた。結合したＤＮＡをゲル電気泳動により分析した。ＳｐｅＩ消化物を分析して、ｐＲＳ４２６内にＡＤＥ２遺伝子のサブクローンを有するプラスミドを同定した。正しいプラスミドをｐＣＺＲ１１８と表示した。ｐＣＺＲ１１８中のＡＤＥ２遺伝子はＰＣＲにより増幅されたので、その遺伝子の機能特性を不能とする突然変異を発生させることができた可能性が存在した。このような突然変異を試験するために、所望のインサートを有するサブクローンを単一にサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＢＹ２１Ａ株の中に形質転換した。標準的手順に従い、細胞をエレクトロコンピテントとし、形質転換した。形質転換体をＵＲＡＤおよびＡＤＥＤプレート上にプレートした。３つの表現型のグループが同定された。クローン１、２、１１、および１２は、ＡＤＥＤ上で多数の形質転換体の健康な増殖を与えた。形質転換体の頻度はＵｒａ＋形質転換体の頻度に匹敵した。クローン６、８、１０、および１４は、また、Ｕｒａ⁺およびＡｄｅ⁺の双方に対する形質転換の高い効率を与えたが、Ａｄｅ⁺コロニーは第１グループにおけるそれらよりも多少小さかった。クローン３は多数のＵｒａ⁺コロニーを与えたが、Ａｄｅ⁺コロニーを与えず、それは非機能的ａｄｅ２突然変異を有することが示唆された。クローン１、２、１１、および１２をプールした。ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のａｄｅ２相補性グループを同定するために、各相補性グループ（＃３および＃１０；＃６および＃１１）からの２つのそれぞれの突然変異体（これらは制限アデニン上で増殖させたとき、深い赤色の色素沈着に基づいて選択された）をクローニングされたＡＤＥ遺伝子で形質転換した。初期対数期の細胞の２００ｍｌの培養物を３０００×ｇの２分間の遠心により収集し、２０ｍｌの新鮮なＫＤ緩衝液（５０、ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５、２５ｍＭのＤＴＴを含有する）の中に再懸濁させた。細胞を３０℃においてこの緩衝液中で１５分間インキュベートした。次いで細胞を収集し、２００ｍｌの氷冷ＳＴＭ（２７０ｍＭのスクロース、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＭｇＣｌ₂）の中に再懸濁させた。細胞を収集し、１００ｍｌの氷冷ＳＴＭの中に再懸濁させた。再び、細胞を収集し、３〜５ｍｌの氷冷ＳＴＭの中に再懸濁させた。次いで、各培養からのエレクトロコンピテント細胞の１００μｌのアリコートをＮｏｔＩ消化したｐＡＤＥ１−１のＤＮＡと混合した。細胞／ＤＮＡ混合物を２ｍｍのエレクトロポレーションクベットの中に入れ、１０００Ωの抵抗および２５μＦのキャパシタンスに設定されたＢｉｏＲａｄＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ^TM装置を使用して、５ｋＶ／ｃｍのパルス電界に暴露した。パルス後、細胞を１ｍｌのＹＥＰＤの添加により希釈し、３０ ℃において１時間インキュベートした。次いで細胞をおだやかな遠心により収集し、アデニンを欠如する４００μｌの最小選択培地（ＡＤＥＤ）の中に再懸濁させた。再懸濁させたサンプルを２００μｌのアリコートに分割し、ＡＤＥＤおよびＡＤＥＤＳプレート上にプレートした。プレートを３０℃において４〜５日間インキュベートした。突然変異体＃６および＃１１はＡｄｅ⁺形質転換体を与えた。ＤＮＡを省略したとき、Ａｄｅ⁺形質転換体は観察されず、それゆえ、単離物はａｄｅ２相補性グループを定めるように見えるた。ＡＤＥ２配列を配列番号：１に示す。実施例２実施例１開示したピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のクローンのバンクを、アルコール利用遺伝子（ＡＵＧ１）をクローニングするための源として使用した。このクローンのバンクを独立のプールとして貯蔵し、各々は約２００〜２５０の個々のゲノムのクローンを表した。ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、カンジダ・ボイディニ（Ｃａｎｄｉｄａｂｏｉｄｉｎｉ）、およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）からのアルコールオキシダーゼ遺伝子の中に保存された配列の整列から設計された、ＰＣＲプライマー（８７８４、配列番号：５；８７８７；配列番号：６）を使用するポリメラーゼ連鎖反応において、各プールからの０．１μｌの「ミノプレプ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）」ＤＮＡを鋳型として使用した。増幅反応を３０サイクルの９４℃、３０秒；５０℃、３０秒；７２℃、６０秒で実施し、次いで７２℃において７分間インキュベートした。１つのプール（＃５）は約６００ｂｐのバンドを与えた。このＰＣＲ生成物のＤＮＡの配列決定において、ＡＯＸ１遺伝子によりコードされるピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）のアルコールオキシダーゼと約７０％の配列の同一性およびＡＯＸ１遺伝子によりコードされるハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）のアルコールオキシダーゼと約８５％の配列の同一性を有するアミノ酸配列をそれがコードすることが明らかにされた。クローニングされたＡＵＧ１遺伝子の配列を配列番号：２に示す。最初の増幅において使用したのと同一のプライマーを使用するＰＣＲにより、プール＃５のサブプールを分析した。１つの陽性のサブプールをさらに破壊して、陽性のコロニーを同定した。この陽性のコロニーをプレート上にストリークし、ＤＮＡを個々のコロニーから調製した。３つのコロニーは、ＣｌａＩで消化後、同一のパターンを与えた。ゲノムのクローンおよびＰＣＲ生成物の制限マッピングにおいて、ＡＵＧ１遺伝子は７．５ｋｂのゲノムのインサート上に横たわり、そしてＰＣＲフラグメント内の部位をゲノムのインサート内でユニークに同定できることが明らかにされた。ＰＣＲフラグメント内の遺伝子の向きは知られているので、ＰＣＲフラグメントの情報はゲノムのインサート内のＡＵＧ１遺伝子の概算位置および方向を提供した。この領域内のＤＮＡの配列決定は、アミノ酸レベルにおいて他の既知のアルコールオキシダーゼ遺伝子に対して非常に高い類似性を有する遺伝子を明らかにした。実施例３ａｄｅ２突然変異体のピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞を、本質的前述したように、ＡＵＧ１のプロモーターおよびターミネーター、ヒトＧＡＤ６５ＤＮＡ（Ｋａｒｌｓｅｎｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：８３３７−８３４１、１９９１）、およびＡＤＥ２選択マーカーを含んでなる発現ベクターを使用して、エレクトロポレーションにより形質転換する。２０ｇ／ｌのＢａｃｔｏ^TM寒天（Ｄｉｆｃｏ）、６．７ｇ／ｌのアミノ酸を含まない酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｇ／ｌのメタノール、および０．４μｇ／ｌのビオチンを含有する寒天最小メタノールプレートにコロニーをパッチする（１０〜１００コロニー／１００ｍｍのプレート）。寒天をニトロセルロースでオーバーレイし、１ｍｌの水中の５０％メタノールを含有する蓋上にプレートを倒立させ、３０℃において３〜５日間インキュベートする。次いで膜をフィルターに移し、０．２ＭのＮａＯＨ、０．１％のＳＤＳ、３５ｍＭのジチオスレイトールの中にソーキングして、付着した細胞を溶解する。３０分後、細胞の破片をフィルターから蒸留水せすすぎ、フィルターを０．１Ｍの酢酸中で３０分間すすぐことによって中和する。次いでフィルターを付着したタンパク質についてアッセイする。ＴＴＢＳ−ＮＦＭ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．１％のツイーン２０、１６０ｍＭのＮａＣｌ、５％の粉末状無脂肪ミルク）中で室温において３０分間すすぐことによって、非占有部位をブロックする。次いで、ＴＴＢＳ−ＮＦＭ中で１：１０００に希釈した、ＧＡＤ６モノクローナル抗体（ＣｈａｎｇおよびＧｏｔｔｌｉｅｂ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、８：２１２３−２１３０、１９８８）を含有する溶液に、フィルターを移す。フィルターを抗体溶液中でおだやかに撹拌しながら少なくとも１時間インキュベートし、次いでＴＴＢＳ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．１％のツイーン２０、１６０ｍＭのＮａＣｌ）で各回５分間２回洗浄する。次いで、フィルターをセイヨウワサビペルオキシダーゼに接合したヤギ抗マウス抗体（ＴＴＢＳ−ＮＦＭ中の１μｇ／ｍｌ）中で少なくとも１時間インキュベートし、ＴＴＢＳで各回５分間３回洗浄する。次いでフィルターを商業的に入手可能な化学発光性試薬（ＥＣＬ^TM、ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｃ．、イリノイ州アーリントンハイツ）に暴露する。陽性のパッチから発生する光をＸ線フィルム上に検出する。ＧＡＤ₆₅発現レベルをいっそう精確に検出するために、候補のクローンを震盪フラスコの培養において培養する。前述したように、３０℃において最小メタノールプレート上でコロニーを２日間増殖させる。これらのコロニーを使用して、２０ｍｌの最小メタノール培地（６．７ｇ／ｌのアミノ酸を含まない酵母窒素原基礎培地、１０ｇ／ｌのメタノール、０．４μｇ／ｌのビオチン）を１×１０⁶ 細胞／ｍｌの細胞密度で接種する。培養物を激しく震盪しながら３０℃において１〜２日間増殖させる。０．２ｍｌの５０％メタノールを各培養物に毎日添加する。細胞を遠心により収集し、氷***解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、４０ｍＭのＨＣｌ、２ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、１μｇ／ｍｌのペプスタチン、１μｇ／ｍｌのアプロチニン）の中に１０ｍｌの最終体積／１ｇの細胞ペーストで懸濁させる。生ずる懸濁液の２．５ｍｌを１５ｍｌの容器中の２．５ｍｌの４００〜６００ミクロンの氷冷酸洗浄したガラスビーズに添加し、この混合物を１分間激しく撹拌し、次いで氷上で１分間インキュベートする。この手順を細胞が合計５分間撹拌されるまで反復する。大きい破片および未破壊の細胞を１０００×ｇにおける５分間の遠心により除去する。次いで清浄化ライゼイトをきれいな容器にデカントする。透明なライゼイトをサンプル緩衝液（５％のＳＤＳ、８Ｍの尿素、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ６．８、１０％のグリセロール、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のブロモフェノールにかわ）中に希釈し、４〜２０％のアクリルアミドの勾配ゲル（Ｎｏｖｅｘ、カリフォルニア州サンディエゴ）上で電気泳動させる。前述したように、タンパク質をニトロセルロース上にブロットし、ＧＡＤ６抗体で検出する。震盪フラスコの培養において高いレベルの外来タンパク質のメタノール誘発発現を示すクローンを、高い密度の発酵条件下にいっそう広範に分析する。細胞をまず０．５リットルのＹＥＰＤブロス中で３０℃において１〜２日間激しく撹拌しながら培養し、次いで５リットルの発酵装置（例えば、ＢｉｏＦｌｏｗＩＩＩ；ＮｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋＳｃｉｅｎｔｉｆｃＣｏ．，Ｉｎｃ．、ニュージャージイ州エジソン）を接種するために使用する。発酵容器にまず無機質塩を供給し、次いで５７．８ｇの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、６８ｇのＫＨ₂ＰＯ₄、３０．８ｇのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、８．６ｇのＣａＳＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、２．０ｇのＮａＣｌ、および１０ｍｌの泡消剤（ＰＰＧ）を添加する。Ｈ₂Ｏを添加して体積を２．５リットルにし、この溶液を４０分間オートクレーブ処理する。冷却後、３５０ｍｌの５０％グルコース、２５０ｍｌの１０×微量元素（表４）、２５ｍｌの２００μｇ／ｍｌのビオチン、および２５０ｍｌの細胞接種物を添加する。１〜２ｍｌ／ｌのＨ₂ＳＯ₄を添加して化合物を溶液にする。発酵容器を２８℃、ｐＨ５．０、および＞３０％の溶解Ｏ₂において運転する。グルコース消費の間の酸素の鋭い要求および引き続くグルコース消耗後の酸素消費の減少により示されるように、細胞はグルコースの開始供給物を消費するであろう。開始グルコース供給物の消耗後、ＮＨ₄ ⁺および微量元素を補充したグルコース−メタノール供給物を容器に０．２％（ｗ／ｖ）グルコース、０．２％（ｗ／ｖ）メタノールで５時間導入し、次いで０．１％（ｗ／ｖ）グルコース、０．４％（ｗ／ｖ）メタノールで２５時間導入する。容器の１つの口を通して純粋なメタノールとして１２．５ｍｌ／時の開始導入速度および２５ｍｌ／時の最終速度で、合計５５０ｇのメタノールを供給する。１７５ｇのグルコース、２５０ｍｌの１０×微量元素、および９９ｇの（ＮＨ₄）₂ ＳＯ₄を含有する７００ｍｌの溶液を使用して、第２口を通して、グルコースを供給する。これらの条件下に、グルコースおよびメタノールは同時に利用され、グルコース−メタノールの供給が開始されると、ＧＡＤ₆₅の発現が誘発される。震盪フラスコの培養について前述したように、発酵容器からの細胞をＧＡＤ₆₅の発現について分析する。細胞を発酵容器からある時間間隔で取出し、引き続いて分析する。グルコースについての増殖の間に、ＧＡＤ₆₅の発現はほとんど観察されない。グルコースの消耗はＧＡＤ₆₅タンパク質の低い発現に導く；発酵培養の供給の間におけるＭｅＯＨの添加により、発現は増強される。メタノールの添加は、メタノール応答性ＡＵＧ１プロモーターにより推進されるヒトＧＡＤ₆₅の発現に対して明瞭な刺激効果を有する。実施例４形質転換条件を研究して、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）の効率よい形質転換に最適である、電界条件、ＤＮＡのトポロジー、およびＤＮＡ濃度を決定した。すべての実験において、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のａｄｅ２株＃１１を使用した。前述したように、コンピテント細胞を調製した。ＢｉｏＲａｄＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ^TMを使用して、エレクトロポレーションを実施した。２つの電界のパラメーターはエレクトロポレーションによる形質転換効率に影響を及ぼす：キャパシタンス、電界強度、およびパルスの期間。電界強度は電気パルスの電圧により決定されるが、パルスの期間は計装の抵抗の設定により決定される。この組の実験の範囲内において、種々の抵抗における電界強度の設定のマトリックスを検査した。すべての実験において、計装の最高のキャパシタンスの設定（２５μＦ）を使用した。氷上で、ほぼ１μｇの制限酵素ＮｏｔＩで線状化されたＡＤＥ２プラスミドｐＣＺＲ１３３を含有するＤＮＡの１０μｌと、エレクトロコンピテント細胞の１００μｌのアリコートを混合した。細胞およびＤＮＡを２ｍｍのエレクトロポレーションクベット（ＢＴＸＣｏｒｐ．、カリフォルニア州サンディエゴ）に移し、０．５ｋＶ（２．５ｋＶ／ｃｍ）、０．７５ｋＶ（３．７５ｋＶ／ｃｍ）、１．０ｋＶ（５．０ｋＶ／ｃｍ）、１．２５ｋＶ（６．２５ｋＶ／ｃｍ）、および１．５ｋＶ（７．５ｋＶ／ｃｍ）においてエレクトロポレートした。これらの電界強度の条件を種々のパルスの期間において検査した。計装の設定抵抗を２００オーム、または「無限」オームに変化させることによって、パルスの期間を操作した。パルスした細胞をＹＥＰＤの中に懸濁させ、３０℃において１時間インキュベートし、収集し、再懸濁させ、プレートした。３つの別々の組の実験を実施した。各組において、「無限」オームの抵抗における０．７５ｋＶ（３．７５ｋＶ／ｃｍ）のエレクトロポレーション条件は、試験した他の条件よりも劇的により高い形質転換効率を与えることが見出された（第１図参照）。最適なパルス条件が確立された後、形質転換効率に対するＤＮＡのトポロジーの影響を研究した。エレクトロコンピテント細胞を１μｇの非切断の円形ｐＣＺＲ１３３または１μｇのＮｏｔＩ消化ｐＣＺＲ１３３と混合した。３つの別々の実験において、円形ＤＮＡを使用して平均ほぼ２５の形質転換体が回収されたが、直鎖状ＤＮＡは平均ほぼ１×１０⁴の形質転換体を生じた。これらのデータが示すように、直鎖状ＤＮＡは円形ＤＮＡよりも非常により大きい効率でピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）を形質転換する。最後に、ＤＮＡ濃度と形質転換効率との間の関係を研究した。直鎖状ｐＣＺＲ１３３ＤＮＡのアリコート（１０μｌのＨ₂Ｏ中の１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇおよび１μｇ）を１００μｌのエレクトロコンピテント細胞と混合し、３．７５ｋＶ／ｃｍおよび「無限」オームにおいてエレクトロポレーションを実施した。形質転換体の数は約１０（１ｎｇのＤＮＡ）から１０⁴（１μｇのＤＮＡ）の間で変化し、そしてＤＮＡ濃度に比例することが見出された。実施例５野生型細胞および安定な、白色の形質転換体のコロニーからのＤＮＡを比較することによって、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のゲノムの中への形質転換するＤＮＡの組込みを検出した。２つのクラスの組込み形質転換体が同定された。第１において、形質転換するＤＮＡは相同部位の中に組込まれることが見出された。第２のクラスにおいて、形質転換するＤＮＡは内因性ＡＵＧ１オープンリーディングフレームと置換することが見出された。理論により拘束されたくないが、この第２の形質転換体は「転位組換え事象」により発生したと考えられ（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．、１９４：２８１−３０１、１９９１）これにより形質転換するＤＮＡを二重組換え事象を経て内因性ＤＮＡを置換する。ＡｓｐＩ消化ｐＣＺＲ１４０、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のＡＤＥ２遺伝子を含有するブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ^TM ）（ＳｔｒａｔａｇｎｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州ラジョラ）をベースとするベクター、およびプロモーター領域とターミネーター領域との間の全体のオープンリーディングフレームが欠失されているＡＵＧ１の突然変異体を使用して、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のａｄｅ２株＃１１をＡｄｅ⁺に形質転換した（第２図）。野生型細胞および３０℃においてＹＥＰＤプレート上で２日間増殖させた形質転換体細胞から、ゲノムＤＮＡを調製した。約１００〜２００μｌの細胞を１ｍｌのＨ₂Ｏの中に懸濁させ、次いでマイクロ遠心機により３０秒間遠心した。細胞ペレットを回収し、４００μｌのＳＣＥ＋ＤＴＴ＋ザイモリアーゼ（１．２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＮａクエン酸塩、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１〜２ｍｇ／ｍｌのザイモリアーゼ１００Ｔ）の中に再懸濁させ、３７℃において１０〜１５分間インキュベートした。４００μｌの１％ＳＤＳを添加し、この溶液を透明になるまで混合した。３００μｌの５Ｍの酢酸カリウム、ｐＨ８．９を添加し、この溶液を混合し、マイクロ遠心機中で５分間最高速度において遠心した。７５０μｌの上清を新しい管に移し、等しい体積のフェノール／クロロホルムで抽出した。６００μｌの生ずる上清を回収し、ＤＮＡを２体積のエタノールの添加により沈降させ、冷時に１５分間遠心した。ＤＮＡペレットを５０ｍｌのＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ）＋１００μｇ／ｍｌのＲＮアーゼの中に６５℃において約１時間再懸濁させた。３７℃において１０μｌのＤＮＡサンプルを１００μｌの反応体積においてＥｃｏＲＩ（５μｌ）で消化した。ＤＮＡをエタノールで沈降させ、遠心により回収し、７．５μｌのＴＥ＋２．５μｌの５×負荷色素の中に再懸濁させた。０．５×ＴＢＥ（１０×ＴＢＥは１０８ｇ／ｌのＴｒｉｓ塩基７〜９、５５ｇ／ｌのホウ酸、８．３ｇ／ｌの２ナトリウムＥＤＴＡ）ゲル中の０．７％アガロースの１レーンに、全体の１０ｍｌの体積を適用した。臭化エチジウムを含有する０．５×ＴＢＥ中で１００Ｖにおいてゲルを展開させた。ゲルを写真撮影し、陽性に誘導化されたナイロン膜（Ｎｙｔｒａｎ^TMＮ＋、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、ニューハンプシャイヤー州キーン）に４００ｍＡ、２０ｍＶにおいて３０分間ＤＮＡを電気泳動的に移した。次いで膜を２×ＳＳＣ中ですすぎ、変性溶液上に５分間ブロットし、次いで紫外線架橋装置（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ^TM 、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ）中で自動設定において湿潤状態で架橋させた。商業的に入手可能なキット（ＥＣＬ^TMキット、ＡｍｅｒｓｈａｍＣｏｒｐ．、イリノイ州アーリントンハイツ）を使用して、ＰＣＲ発生ＡＵＧ１プロモーターのプローブに、ブロットをハイブリダイゼーションさせた。これらの結果が示すように、形質転換するＤＮＡはＡＵＧ１プロモーターＤＮＡの構造を変更させ、これは相同組込み事象と一致した（第２図）。第２実験において、ＮｏｔＩ消化ｐＣＺＲ１３７、ＡＵＧ１プロモーターとターミネーターとの間でヒトＧＡＤ６５ｃＤＮＡを含有するベクターを使用して、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のａｄｅ２株＃１１をＡｄｅ⁺に形質転換させた（第３図）。前述したようにゲノムＤＮＡを野生型細胞および安定な、白色のＡｄｅ⁺ 形質転換体から調製し、ＥｃｏＲＩで消化した。消化したＤＮＡを電気泳動により分離し、膜上にブロットした。ＡＵＧ１オープンリーディングフレームまたはＡＵＧ１プロモーターに対応するＰＣＲ発生プローブでブロットをプロービングした。ＡＵＧ１オープンリーディングフレームは形質転換体株に存在せず、そしてＡＵＧ１プロモーターは有意な再配列を行っていることを結果は証明した。これらの結果は、形質転換するＤＮＡと宿主ゲノムとの間の二重組換え事象（転位）と一致する（第３図）。実施例６ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のＡＵＧ１株を高い密度の発酵条件において増殖させる。５７．８ｇの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、４６．６ｇのＫＣｌ、３０．８ｇのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、８．６ｇのＣａＳＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、２．０ｇのＮａＣｌ、および１０ｍｌの泡消剤（ＰＰＧ）の添加により、発酵容器に無機塩類を供給する。Ｈ₂Ｏを添加して体積を２．５リットルにし、この溶液を４０分間オートクレーブ処理する。冷却後、３５０ｍｌの５０％グルコース、２５０ｍｌの１０×微量元素（表４）、２１０ｍｌの３０％リン酸ナトリウム、２５ｍｌの２００μｇ／ｍｌのビオチン、および２５０ｍｌの細胞接種材料を添加する。細胞は３相のバッチ供給グルコースまたはグルコース／メタノールである。相１において、１．５リットル当たり７５０ｇのグルコース、１１０ｇの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、および２７８ｍｌの１０×微量元素を使用して、細胞に０．４％／ｌ／時のグルコース（ｗ／ｖ最終発酵体積）を２５時間供給する。次いで細胞に０．２％グルコース、０．２％メタノール／ｌ／時を５時間トランジション供給する。最終のグルコース補充メタノール供給物は、０．１％グルコース、０．４％メタノール／ｌ／時を２５時間の間含有する。最終のバイオマスは約３００ｇ／ｌの細胞ペーストである。実施例７ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のａｕｇ１△株の発酵のために、発酵容器に最初に無機塩類、グルコース、微量元素およびビオチンを実施例６に開示するように供給する。２５０ｍｌの細胞接種材料を添加する。１．２リットル当たり６００ｇのグルコース、１０８ｇの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、および２７３ｍｌの１０×微量元素を使用して、グルコース供給物を調製する。細胞を３相でバッチ供給する。第１相において、細胞にグルコースを１２〜２５時間の間０．４％／ｌ／時において供給する。次いで細胞を１重量％のメタノールのボーラス添加により誘発し、混合０．２％グルコース／０．１％メタノール供給物で１０時間の間メタノール利用にトランジションする。第３相において、０．２％グルコース、０．２％メタノールの混合供給物を１５時間の間導入する。実施例８ＧＡＤ６５発現構築物の挿入によりＡＵＧ１遺伝子が崩壊されているピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞はメタノール上で増殖する能力保持し、第２アルコールオキシダーゼが存在したことを示した。ＡＵＧ２と表示する第２遺伝子がＰＣＲにより同定された。この遺伝子の５’コーディング領域の配列の分析により、コード化されたタンパク質のＮ−末端は既知のアルコールオキシダーゼ遺伝子のそれに類似することが示された。最少メタノールブロス上で非常に低い増殖を示す形質転換体であるＭＣＧＡＤ８株を、ＡＵＧ２遺伝子のクローニング源として使用した。ゲノムＤＮＡをＭＣＧＡＤ８から調製し、ＡＵＧ１オープンリーディングフレームに対して特異的なセンスおよびアンチセンスのＰＣＲプライマーを使用して増幅した（８７８４、配列番号：５；８７８７、配列番号：６）。サイズがＡＵＧ１産物と同一であるが、分析用ゲル上で非常に低い強度を示す産物が得られた。推定上のＡＵＧ２ＰＣＲ生成物を１連の制限酵素で消化した。ＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩによる部分的消化、およびいくつかのＢｇｌＩＩ部位の存在は、ＤＮＡが少量のＡＵＧ１で汚染されていることを示唆した。汚染するＡＵＧ１ＤＮＡを除去するために、ＰＣＲ混合物をＥｃｏＲＩで切断し、ゲル精製した。ＭＣＧＡＤ８産物はＥｃｏＲＩ部位を有するように思われなかったので、それは影響を受けなかった。生ずるゲル精製されたＤＮＡを再増幅し、再び制限消化により分析した。ＤＮＡはＡＵＧ１のＰＣＲ生成物のそれと異なる制限地図を与えた。プローブとしてＡＵＧ１またはＡＵＧ２のオープンリーディングフレームのＰＣＲフラグメントを使用して、ＭＣＧＡＤ８および野生型細胞からのゲノムＤＮＡについてサザンブロット分析を実施した。ＡＵＧ２プローブは、低いストリンジェンシイでＡＵＧ１遺伝子座にハイブリダイゼーションし、低いおよび高い双方のストリンジェンシイで第２遺伝子座にハイブリダイゼーションした。ＡＵＧ１プローブは双方の遺伝子座に低いストリンジェンシイで結合したが、主としてＡＵＧ１遺伝子座に高いストリンジェンシイで結合した。これらのデータが示すように、ＭＣＧＡＤ８からの新しいＰＣＲ生成物はＡＵＧ１に類似するが、それと区別された。配列の分析は、ＡＵＧ１およびＡＵＧ２遺伝子産物の間の８３％の同一性を示した。ＡＵＧ２ゲノムの遺伝子座をクローニングするために、ＰＣＲプライマーをもとのＡＵＧ２ＰＣＲフラグメントから設計した。プライマー９８８５（配列番号：７）および９８８３（配列番号：８）を使用して、ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）のゲノムライブラリーをスクリーニングした。次いで陽性のクローンバンクのプールを、もとのＭＣＧＡＤ８ＰＣＲ生成物でプロービングした。細胞を１０プレート上に約５０００コロニー／プレートでプレートし、一夜増殖させ、次いでプレートをフィルターディスク（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、ＡｍｅｒｓｈａｍＣｏｒｐ．、イリノイ州アーリントンハイツ）でオーバーレイした。コロニーを変性し、中和し、紫外線架橋させた。細菌の破片をフィルターから５×ＳＳＣで洗浄し、フィルターを再び架橋させた。ブロットを対で４２℃において１時間２５ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液中でプレハイブリダイゼーションした。次いで、ほぼ２５０ｎｇのプローブをフィルターの各対に添加した。ハイブリダイゼーションを４２ ℃において４時間実施した。次いでブロットを５００ｍｌの０．１×ＳＳＣ、６Ｍの尿素、０．４％のＳＤＳ中で４２℃において１０分間４回洗浄した。次いでブロットを５００ｍｌの２×ＳＳＣで室温において５分間中和し、２回すすいだ。次いでブロットを１００ｍｌの展開試薬（ＥＣＬ、ＡｍｅｒｓｈａｍＣｏｒｐ．）の中に浸漬した。陽性コロニーを取り上げ、ＰＣＲプライマー９８８５（配列番号：７）および９８８３（配列番号：８）を使用して増幅して、それらの同一性を確証した。陽性プールをプレート上でストリークし、シングルコロニーをＰＣＲにより再スクリーニングした。１つのコロニーをそれ以上の分析のために選択した（制限マッピングおよび配列決定）。ＡＵＧ２遺伝子の部分的配列は配列番号：９に示されている。配列番号：９に示すように、ＡＵＧ２配列はヌクレオチド９１におけるＨｉｎｄＩＩＩ部位において開始する。この位置から上流のヌクレオチドはベクターの配列である。コーディング配列はヌクレオチド１７０において開始する。ＡＵＧ２遺伝子の崩壊はメタノール上の細胞の増殖に対してほとんど作用をもたなかった。機能的ＡＵＧ１およびＡＵＧ２の双方の遺伝子産物を欠如する細胞はメタノール上で増殖しなかった。引き続く分析により、ＡＵＧ１遺伝子産物は発酵槽中で増殖した細胞において唯一の検出可能なオキシダーゼであることが示された。以上から、理解されるように、本発明の特定の態様を例示の目的で記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱しないで種々の変更が可能である。したがって、本発明は添付された請求の範囲以外限定されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．工程：（ａ）ピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞を突然変異化条件に暴露し；（ｂ）工程（ａ）からの細胞を富んだ培地中で培養して、突然変異を前記細胞の少なくとも一部分において確立しかつ複製できるようにし；（ｃ）工程（ｂ）からの細胞を同化可能な窒素を欠失する培地中で培養して、細胞の貯蔵窒素を枯渇させ；（ｄ）工程（ｃ）からの細胞を、無機窒素源と、増殖するピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞を殺すために十分な量のナイスタチンとを含んでなる定められた培地中で培養して、栄養遺伝子を欠失する細胞について選択し；そして（ｅ）工程（ｄ）からの選択された細胞を富んだ培地中で培養する；からなる、栄養要求性突然変異を有するピヒア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）細胞を製造する方法。２．工程（ｅ）からの選択された細胞を定められた培地にレプリカプレートし、培養して栄養要求性突然変異の存在を確証する、請求項１に記載の方法。３．前記選択された細胞がアデニンに対して栄養要求性である、請求項１に記載の方法。４．前記選択された細胞がホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキラーゼを欠失する、請求項３に記載の方法。５．前記定められた培地が２ｍｇ／ｌのナイスタチンを含有する、請求項１に記載の方法。６．前記突然変異化条件が紫外線に対する暴露からなる、請求項１に記載の方法。７．前記突然変異化条件が化学的突然変異原に対する暴露からなる、請求項１に記載の方法。８．前記無機窒素源がアンモニウムイオンを含んでなる、請求項１に記載の方法。９．前記無機窒素源が硫酸アンモニウムである、請求項８に記載の方法。