BRPI0209933B1

BRPI0209933B1 - proteína de fusão, e, molécula de ácido nucleico

Info

Publication number: BRPI0209933B1
Application number: BRPI0209933-0A
Authority: BR
Inventors: A Gross Jane; W Rixon Mark
Original assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2001-05-24
Filing date: 2002-05-20
Publication date: 2018-10-16
Also published as: SI2116259T1; ES2379977T3; KR20090080570A; JP5149245B2; CY1112840T1; CN1612750A; KR20100061860A; US20060034852A1; US20100129384A1; EP1436003A2; KR20040030628A; IL158920A0; HK1076603A1; SI1436003T1; DK1436003T3; EP1436003B1; CN101628111A; US20100183609A1; BRPI0209933B8; NO20035173D0

Abstract

"uso de um ativador da transmembrana e modulador de cálcio, e proteína de fusão de (taci)-imunoglobulina interatuadora do ligando da ciclofilina, proteína de fusão, molécula de ácido nucleico, e, composição farmacêutica". as moléculas que interferem com a ligação de um receptor do fator de necrose tumoral com seu ligando, tal como um receptor solúvel, têm utilidade comprovada tanto na pesquisa básica quanto como na terapêutica. a presente invenção provê o ativador da transmembrana solúvel melhorado e o modulador de cálcio, e receptores interatuadores do ligando da ciclofilina (taci).

Description

(54) Título: PROTEÍNA DE FUSÃO, E, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO (51) lnt.CI.: A61K 39/395; C07K 16/00 (30) Prioridade Unionista: 24/05/2001 US 60/293343 (73) Titular(es): ZYMOGENETICS, INC.

(72) Inventor(es): MARK W. RIXON; JANE A. GROSS (85) Data do Início da Fase Nacional: 21/11/2003 “PROTEÍNA DE FUSÃO, E, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO”

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção diz respeito em geral a proteínas de fusão melhoradas, compreendendo uma porção de receptor do fator de necrose tumoral e uma porção de imunoglobulina. Em particular, a presente invenção diz respeito a proteínas de fusão de TACI-immunoglobulina melhoradas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

As citocinas são proteínas pequenas solúveis que medeiam uma variadede de efeitos biológicos, incluindo a regulação do crescimento e a diferenciação de muitos tipos de células [ver, por exemplo, Arai et al., Annu. Rev. Biochem. 59: 783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3: 311 (1991); Paul e Seder, Cell 76: 241 (1994)]. As proteínas que constituem o grupo das citocinas incluem as interleucinas, os interferons, os fatores estimuladores de colônias, os fatores de necrose tumoral, e outras moléculas reguladoras. Por exemplo, a interleucina-17 humana é uma citocina que estimula a expressão da interleucina-6, a molécula 1 de aderência intracelular, a interleucina-8, o fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos, e a expressão E2 da prostaglandina, e desempenha um papel na maturação preferencial dos precursores hematopoiéticos CD34+ nos neutrófilos [Yao et al., J. Immunol. 155: 5483 (1995); Fossiez et al., J. Exp. Med. 183: 2593 (1996)].

Os receptores que ligam as citocinas são tipicamente compostos de uma ou mais proteínas de membrana integrais que ligam a citocina com alta afinidade e transduzem este evento de ligação à célula através das porções citoplamáticas das subunidades de certos receptores. Os

Petição 870180051926, de 18/06/2018, pág. 6/9 receptores de citocina foram agrupados em várias classes, com base nas similaridades em seus domínios de ligação dos ligandos extracelulares. Por exemplo, as cadeias de receptores responsáveis pela ligação e/ou transdução do efeito dos interferons, são membros da família de receptores de citocina do tipo II, com base em um domínio extracelular característico de 200 resíduos.

As interações celulares, as quais ocorrem durante uma resposta imune, são reguladas pelos membros de diversas famínila de receptores da superfície celular, incluindo a família do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR). A família do TNFR consiste de vários rceptores integrais da .0^ 10 glicoproteína da membrana, muitos dos quais, em combinação com seus respectivos ligandos, regulam as interações entre diferentes linhagens de células hemapoiéticas [ver, por exemplo, Cosman, Stem Cells 12: 440 (1994); Wajant et al., Cytokine Growth Factor Rev. 10: 15 (1999); Yeh et al., Immunol. Rev. 169: 283 (1999); Idriss e Naismith, Microsc. Res. Tech. 50:

184(2000)].

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Um tal receptor é o TACI, o ativador da transmembrana e o interatuador de CAML [von Bülow e Bram, Science 228: 138 (1997); Bram e von Bülow, Patente U.S 5.969.102 (1999)]. TACI é um receptor ligado à membrana, que tem um domínio extracelular contendo duas pseudoo 20 repetições ricas em cisteína, um domínio da transmembrana e um domínio citoplasmático que interage com CAML (modulador de cálcio e ligando de ciclofilina), uma proteína de membrana integral localizada nas vesículas intracelulares, que é um co-indutor da ativação de NF-AT quando superexpresso nas células de Jurkat. TACI é associado com as células B e um subconjunto de células T. As seqüências de nucleotídeos que codificam TACI e sua correspondente seqüência de aminoácidos são aqui fornecidas como SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente.

O receptor de TACI liga dois membros da família de ligandos do fator de necrose tumoral (TNF). Um ligando é variavelmente designado «4 «4 • 4 » ·· ·· 44

Ο · · · • 4 · 4 4 • 44 4 4

4«

4 4

4 44

4444 4444 como ZTNF4, “BAFF”, “neutrocina-α”, “BLyS”, “TALL-1” e “ΊΉΑΝΚ” [Yu et al., publicação internacional n^e WO 98/18921 (1998), Moore et al. Science 285: 269 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Bioi. Chem. 274: 15978 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med. 189: 1747 (1999); Shu et al., J. Leukoc. Biol. 65: 680 (1999)]. A seqüência de aminoácidos de ZTNF4 é provida como SEQ ID NO: 3. O outro ligando foi designado como “ZTNF2”, “APRIL” e “ligando-1 de morte de TNRF” [Hahne et al., J. Exp. Med. 188: 1185 (1998); Kelly et al., Câncer Res. 60: 1021 (2000)]. A seqüência de aminoácidos de ZTNF2 é provida como SEQ ID NO: 4. Ambos os ligandos são também ligados pelo receptor de maturação de células B (BCMA) [Gross et al., Nature 404: 995 (2000)]. As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de BCMA são providas como SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27, respectivamente.

As atividades dos receptores do fator de necrose tumoral demonstradas in vivo ilustram o potencial clínico das formas solúveis do receptor. Formas solúveis do receptor de TACI têm sido geradas como proteínas de fusão de imunoglobulina. As versões iniciais resultarem em proteína heterogênea de baixa expressão. A heterogenicidade foi observada no término amino de TACI, no término carboxilia de Fc e na região do pedículo de TACI. Uma necessidade, portanto, existe quanto às composições do receptor de TACI farmaceuticamente úteis.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção provê proteínas de fusão de TACIimunoglobulina adequadas como compostos terapêuticos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra a seqüência de aminoácidos de TACI humano. As localizações das pseudo-repetições ricas em cisteína são indicadas por sombramento, o domínio da transmembrana é circundado, e a região do pedículo é indicada por marcas tracejadas.

···

A Figura 2 é um diagrama esquemático de uma imunoglobulina da subclasse de IgGl. C_L: região constante de cadeia leve; Chi, C_H2, C_H3: regiões constantes de cadeia pesada; V_L: região variável de cadeia leve; V_H: região variável de cadeia pesada; CHO: carboidrato; N: término amino; C: término carboxila.

As Figuras 3A, 3B, 3C e 3D mostram uma comparação da seqüência de aminoácidos de Fc de região constante γΐ humana do tipo selvagem com as variantes Fc-488, Fc4, Fc5, Fc6, Fc7 e Fc8. O domínio de C_Hi da região constante γΐ humana não faz parte de Fc e, portanto, não é mostrado. A localização da região da dobradiça, a C_H2, e os domínios de Ch₃, são indicados. Os resíduos de Cys normalmente envolvidos na ligação dissulfeto à região constante de cadeia leve (LC) e à região constante de cadeia pesada (HC) são indicados. Um símbolo indica identidade ao tipo selvagem naquela posição, enquanto “***” indica a localização do término carboxila, e ilustra a diferença no término carboxila de Fc6 em relação às outras versões de Fc. As localizações de aminoácido são indicadas pelas posições de índice EU.

A Figura 4 mostra a ligação específica de ¹²⁵I-ZTNF-4 com várias construções de TACI-Fc. As proteínas de fusão de TACI-Fc tinham porções de TACI que careciam dos primeiros 29 resíduos de aminoácido da seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Uma das proteínas de fusão tinham uma porção de TACI com uma região do pedículo intacta [TACI (dl29)Fc5], enquanto três das proteínas de fusão de TACI-Fc tinham porções de TACI com várias deleções na região do pedículo [TACI (dI-29, dl07-154)Fc5; TACI (dI-29, dl 11-154)-Fc5; TACI (dI-29, dl20-154)-Fc5]. Detalhes experimentais são descritos no Exemplo 4.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

1. Vista Geral

Como descrito abaixo, a presente invenção provê ativador de ·· ···· transmembrana e modulador de cálcio e proteínas de fusão de (TACI)imunoglobulina do interatuador de ligando da ciclofílina. Por exemplo, a presente invenção provê métodos para inibir a proliferação de células tumorais, compreendendo administrar às células tumorais uma composição que compreenda uma proteína de fusão de TACI-imunoglobulina. Uma tal composição pode ser administrada às células cultivadas in vitro. Altemativamente, a composição pode ser uma composição farmacêutica que compreenda um portador farmaceuticamente aceitável e uma proteína de fusão de TACI-imunoglobulina, e a composição farmacêutica pode ser administrada a um paciente que tenha um tumor. O paciente pode ser um paciente mamífero. A administração da composição farmacêutica pode inibir, por exemplo, a proliferação de linfócitos B em um paciente mamífero.

A presente invenção também provê métodos para inibir a atividade de ZTNF4 em um mamífero, compreendendo administrar ao mamífero uma composição que compreenda uma TACI-imunoglobulina. A atividade de ZTNF4 pode estar associada com várias doenças e distúrbios. Por exemplo, uma composição farmacêutica que compreenda uma proteína de fusão de TACI-imunoglobulina pode ser usada para tratar de uma doença autoimune, tal como o lúpus sistêmico eritematoso, a miastenia grave, a esclerose múltipla, o disbete melito dependente de insulino-dependente, a doença de Crohn, a artrite reumatóide, a artrite reumatóide juvenil de curso poliarticular, e a artrite psoriática. Altemativamente, uma composição farmacêutica que compreenda uma TACI-imunoglobulina pode ser usada para tratar de um distúrbio tal como a asma, a bronquite, o enfisema e a insuficiência renal de estágio final. Uma composição farmacêutica que compreende uma TACI-imunoglobulina também pode ser usada para tratar de doença renal, tal como a glomerulonefrite, vasculite, nefrite, amilodose e pielonefrite, ou de um distúrbio, tal como o neoplasma, a leucemia linfocítica crônica, o mieloma múltiplo, o linfoma não de Hodgkin, a doença linfoprolifarativa de pós-transplantação, e a gamopatia de cadeia leve. Em certos casos, a atividade de ZTNF4 pode estar associada com as células T. Uma composição farmacêutica que compreenda uma TACI-imunoglobulina também pode ser usada para tratar de uma doença ou distúrbio associado com imunodepressão, rejeição de enxertos, doença de enxerto-versus-hospedeiro, e inflamação. Por exemplo, uma composição farmacêutica que compreenda uma TACI-imunoglobulina pode ser usada para reduzir a inflamação, e para tratar de distúrbios tais como a dor das articulações, o inchaço, a anemia e o choque séptico.

A presente invenção também provê métodos para reduzir os níveis de ZTNF4 circulantes no sangue em um paciente mamífero, compreendendo administrar ao paciente mamífero uma composição farmacêutica que compreenda um portador farmaceuticamente aceitável e uma proteína de fusão de TACI-imunoglobulina, em que a administração da composição farmacêutica reduz o nível circulante de ZTNF4 no sangue do paciente mamífero. Como uma ilustração, a administração de uma tal composição farmacêutica pode reduzir os níveis de ZTNF4 circulantes no sangue em pelo menos 10%, em pelo menos 20%, em pelo menos 10 a 60%, em pelo menos 20 a 50%, ou em pelo menos 30 a 40%, em comparação com o nível sangüíneo de ZTNF4 antes da administração da composição farmacêutica. Aqueles versados na técnica podem medir os níveis circulantes de ZTNF4. Métodos ilustrativos são descritos no Exemplo 4 e no Exemplo 5.

Como descrito abaixo, as proteínas de fusão de TACIimunoglobulina ilustrativas compreendem:

(a) uma porção do receptor de TACI que consiste de um fragmento de um polipeptídeo que possui a seqüência de aminoácidos dos resíduos de aminoácido de 30 a 154 da SEQ ID NO: 2, em que a porção do receptor de TACI compreende pelo menos um dentre (i) os resíduos de aminoácido de 34 a 66 da SEQ ID NO: 2, e (ii) os resíduos de aminoácido de

71a 104 da SEQ ID NO: 2, e em que a porção do receptor de TACI liga pelo menos um de ZTNF2 ou ZTNF4, e (b) uma porção de imunoglobulina que compreende uma região constante de uma imunoglobulina.

Porções adequadas do receptor de TACI incluem: polipeptídeos que compreendem resíduos de aminoácido de 34 a 66 da SEQ ID NO: 2, e resíduos de aminoácido de 71 a 104 da SEQ ID NO: 2; polipeptídeos que compreendem resíduos de aminoácido de 34 a 104 da SEQ ID NO: 2; polipeptídeos que compreendem a seqüência de aminoácido de resíduos de aminoácido de 30 a 110 da SEQ ID NO: 2; e polipeptídeos que têm uma seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácido de 30 a 110 da SEQ ID NO: 2.

A porção de imunoglobulina de uma proteína de fusão de TACI-imunoglobulina pode compreender uma região constante de cadeia pesada, tal como uma região constante de cadeia pesada humana. Uma região constante de cadeia pesada de IgGl é um exemplo de uma região constante de cadeia pesada adequada. Uma região constante de cadeia pesada de IgGl ilustrativa é um fragmento Fc de IgGl que compreende os domínios Ch2 e Ch3- O fragmento Fc de IgGl pode ser um fragmento Fc de IgGl do tipo selvagem ou um fragmento Fc de IgGl transformado, tal como o fragmento Fc que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 33. Um exemplo de proteína de fusão de TACI-imunoglobulina é uma proteína que tem uma seqüência de aminoácidos compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54.

As proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina aqui descritas podem ser multímeros, tais como dímeros.

A presente invenção também provê moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina. Uma seqüência ilustrativa de nucleotídeos que codifique uma proteínas de •·· ·*·

fusão de TACI-imunoglobulina é provida pela SEQ ID NO: 53.

A presente invenção também inclui receptores solúveis de TACI que consistem de um fragmento de um polipeptídeo que tem a seqüência de aminoácidos dos resíduos de aminoácido de 30 a 154 da SEQ ID NO: 2, em que o receptor solúvel de TACI compreende pelo menos um dentre (i) resíduos de aminoácido de 34 a 66 da SEQ ID NO: 2, e (ii) resíduos de aminoácido de 71 a 104 da SEQ ID NO: 2, e em que o receptor solúvel de TACI liga pelo menos um dentre ZTNF2 ou ZTNF4. Receptores solúveis de TACI adicionais são aqui descritos como porções adequadas do receptor de TACI para as proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina. Além disso, os receptores solúveis de TACI podem ser usados nos métodos descritos quanto às proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina.

Estes e outros aspectos da invenção se tomarão evidentes após referência à seguinte descrição detalhada e aos desenhos. Além disso, várias referências são identificadas abaixo.

2. Definições

Na descrição que segue, vários termos são extensivamente usados. As seguintes definições são fornecidas para facilitar o entendimento da invenção.

Como aqui usados, “ácido nucleico” ou “molécula de ácido nucleico” se referem a polinucleotídeos, tais como o ácido desoxirribonucleico (DNA) ou o ácido ribonucleico (RNA), a oligonucleotídeos, a fragmentos gerados pela reação em cadeia da polimerase (PCR), e a fragmentos gerados por qualquer dentre ligação, cissão, ação da endonuclease e ação da exonuclease. As moléculas de ácido nucleico podem ser compostas de monômeros que sejam nucleotídeos de ocorrência natural (tais como DNA e RNA), ou análogos de nucleotídeos de ocorrência natural (por exemplo, as formas ot-enantioméricas de nucleotídeos de ocorrência natural), ou uma combinação de ambos. Os nucleotídeos modificados podem ter alterações nas porções de açúcar e/ou nas porções de base de pirimidina ou purina. As modificações de açúcares incluem, por exemplo, a substituição de um ou mais grupos hidroxila com por halógenos, grupos alquila, aminas e grupos azido, ou os açúcares podem ser funcionalizados como éteres ou ésteres. Além disso, a porção inteira de açúcar pode ser substituída por estruturas estérica e eletronicamente similares, tais como os aza-açúcares e os análogos de açúcar carbocíclicos. Exemplos de modificações em uma porção de base incluem as purinas e pirimidinas alquiladas, as purinas ou pirimidinas aciladas, ou outros substitutos heterocíclicos bem conhecidos. Os monômeros de ácido nucleico podem ser ligados por ligações fosfodiéster ou análogos de tais articulações. Os análogos de articulações fosfodiéster incluem o fosforotioato, o fosforoditioato, o fosforosselenoato, o fosforodisselenoato, o fosforoanilotioato, o fosforanilidato, o fosforamidato, e outros. A expressão “molécula de ácido nucleico” também inclui os assim chamados “ácidos nucleico peptídicos”, os quais compreendem bases de ácido nucleico de ocorrência natural ou modificadas articuladas a uma cadeia principal de poliamida. Os ácidos nucleicos podem ser ou de filamento único ou de filamento duplo.

A expressão “complemento de uma molécula de ácido nucleico” se refere a uma molécula de ácido nucleico tendo uma seqüência complementar de nucleotídeos e orientação inversa em comparação com uma seqüência de nucleotídeos de referência. Por exemplo, a seqüência 5’ ATGCACGGG 3’ (SEQ ID NO: 57) é complementar à CCCGTGCAT 3’ (SEQIDNO: 58).

O termo “contig” denota uma molécula de ácido nucleico que tem um estiramento contíguo de seqüência idêntica ou complementar a outra molécula de ácido nucleico. As seqüências contíguas são ditas se “justaporem” a um dado estiramento de uma molécula de ácido nucleico ou em sua totalidade ou ao longode um estiramento parcial da molécula de ácido ·· nucleico.

A expressão “seqüência de nucleotídeos degenerada” denota uma seqüência de nucleotídeos que inclui um ou mais códons degenerados em comparação com uma molécula de ácido nucleico de referência que codifique um polipeptídeo. Os códons degenerados contêm diferentes tripletos de nucleotídeos, mas codificam o mesmo resíduo de aminoácido (isto é, cada um dos tripletos GAU e GAC codificam Asp).

A expressão “gene estrutural” se refere a uma molécula de ácido nucleico que é transcrita no RNA mensageiro (mRNA), que é então traduzida em uma seqüência de aminoácidos característica de um polipeptídeo específico.

Uma “molécula isolada de ácido nucleico” é uma molécula de ácido nucleico que não é integrada no DNA genômico de um organismo. Por exemplo, uma molécula de DNA que codifique um fator de crescimento que tenha sido separada do DNA genômico de uma célula é uma molécula de DNA isolada. Outro exemplo de uma molécula de ácido nucleico isolada é uma molécula de ácido nucleico quimicamente sintetizada, que não seja integrada no genoma de um organismo. Uma molécula de ácido nucleico que tenha sido isolada de uma espécie particular é menor do que a molécula completa de DNA de um cromossoma daquela espécie.

Uma “construção de molécula de ácido nucleico” é uma molécula de ácido nucleico de filamento ou único ou duplo, que tenha sido modificada através da intervenção humana para conter segmentos de ácido nucleico combinados e justapostos em uma disposição não existente na natureza.

“DNA linear” denota moléculas de DNA não circulares tendo as extremidades 5’ e 3’ livres. O DNA linear pode ser preparado de moléculas de DNA circulares fechadas, tais como os plasmídeos, mediante digestão enzimática ou disrupção física.

“DNA complementar (cDNA)” é uma molécula de DNA de filamento único que é formada de um padrão de mRNA pela transcriptase reversa da enzima. Tipicamente, um iniciador complementar às porções de mRNA é empregado para a iniciação da transcrição reversa. Aqueles versados na técnica também usam o termo “cDNA” para referirem-se a uma molécula de DNA de filamento duplo consistindo de uma tal molécula de DNA de filamento único e seu filamento de DNA complementar. O termo “cDNA” também se refere a um clone de uma molécula de cDNA sintetizada de um padrão de RNA.

Um “promotor” é uma seqüência de nucleotídeos que dirige a transcrição de um gene estrutural. Tipicamente, um promotor fica localizado na região não codificadora 5’ de um gene, proximal ao sítio de partida transcricional de um gene estrutural. Os elementos da seqüência dentro dos promotores que funcional no início da transcrição são ffeqüentemente caracterizados por seqüências de nucleotídeos de consenso. Estes elementos promotores incluem os sítios de ligação da RNA polimerase, as seqüências TATA, as seqüências CAAT, elementos específicos da diferenciação [DSEs; McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7: 551 (1993)], elementos de resposta de AMP cíclico (CREs), elementos de resposta de soro [SREs; Treisman, Seminars in Câncer Biol. 1: 47 (1990)], elementos de resposta de glicocorticóide (GREs) e sítios de ligação para outros fatores de transcrição, tais como CRE/ATF [O’Reilly et al., J. Biol. Chem. 267: 19938 (1992)], AP2 (Ye et al., J. Biol. Chem. 269: 25728 (1994)], SP1, proteína de ligação do elemento de resposta de cAMP (CREB; Loeken, Gene Expr. 3: 253 (1993)] e fatores octaméricos (ver, em geral, Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4^â edição (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987), e Lemaigre e Rousseau, Biochem, J. 303: 1 (1994)]. Se um promotor for um promotor indutível, então a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente indutor. Ao contrário, a taxa de transcrição não é regulada por um agente indutor se o promotor for um promotor constitutivo. Promotores reprimíveis são igualmente conhecidos.

Um “promotor de núcleo” contém seqüências essenciais de nucleotídeos para a função promotora, incluindo TATA boxe e a partida de transcrição. Por esta definição, um promotor de núcleo pode ou não ter atividade detectável na ausência de seqüências específicas que possam intensificar a atividade ou conferir atividade específica tecidual.

Um “elemento regulador” é uma seqüência de nucleotídeos que modula a atividade de um promotor de núcleo. Por exemplo, um elemento regulador pode conter uma seqüência de nucleotídeos que se liga com fatores celulares permitindo a transcrição exclusiva ou preferivelmente em células, tecidos ou organelas particulares. Estes tipos de elementos reguladores são normalmente associados com genes que são expressos de uma maneira “específica das células”, “específica do tecido” ou “específica da organela”.

Um “intensificador” é um tipo de elemento regulador que pode aumentar a eficiência da transcrição, não obstante a distância ou a orientação do intensificador em relação ao sítio de partida da transcrição.

“DNA heterólogo” se refere a uma molécula de DNA, ou a uma população de moléculas de DNA, que não existe naturalmente dentro de uma dada célula hospedeira. As moléculas de DNA heterólogas a uma célula hospedeira particular podem conter DNA derivado da espécie de célula hospedeira (isto é, DNA endógeno), contanto que esse DNA hospedeiro seja combinado com DNA não hospedeiro (isto é, DNA exógeno). Por exemplo, uma molécula de DNA contendo um segmento de DNA não hospedeiro codificando um polipeptídeo operavelmente articulado a um segmento de DNA hospedeiro compreendendo um promotor de transcrição, é considerado como sendo uma molécula de DNA heterólogo. De modo inverso, uma molécula de DNA heteróloga pode compreender um gene endógeno operavelmente articulado com um promotor exógeno. Como outra ilustração,

uma molécula de DNA que compreenda um gene derivado de uma célula do tipo selvagem é considerada como sendo DNA heterólogo se essa molécula de DNA for introduzida em uma célula mutante que careça do gene do tipo selvagem.

Um “polipeptídeo” é um polímero de resíduos de aminoácido unidos por ligações peptídicas, quer produzidos natural ou sinteticamente. Os polipeptídeos de menos do que cerca de 10 resíduos de aminoácido são comumente referidos como “peptídeos”.

Uma “proteína” é uma macromolécula que compreende uma ou mais cadeias de polipeptídeos. Uma proteína também pode compreender componentes não peptídicos, tais como os grupos carboidrato. Os carboidratos e outros substituintes não peptídicos podem ser adicionados a uma proteína pela célula em que a proteína é produzida, e variará com o tipo de célula. As proteínas são definidas neste relatório em termos de suas estruturas de cadeia principal de aminoácidos; substituintes tais como os grupos de carboidratos são geralmente não especificados, mas podem todavia estar presentes.

Um peptídeo ou polipeptídeo codificado por uma molécula de DNA não hospedeira é um peptídeo ou polipeptídeo “heterólogos”.

Um “elemento genético integrado” é um segmento de DNA que tenha sido incorporado em um cromossoma de uma célula hospedeira após esse elemento ser introduzido na célula através de manipulação humana. Dentro da presente invenção, os elementos genéticos integrados são o mais convenientemente derivados de plasmídeos linearizados que são introduzidos nas células por eletroporação ou outras técnicas. Os elementos genéticos integrados são passados da célula hospedeira original para sua progênie.

Um “vetor de clonagem” é uma molécula de ácido nucleico, tal como um plasmídeo, cosmideo ou bacteriófago, que tenha a capacidade de replicar autonomamente em uma célula hospedeira. Os vetores de clonagem tipicamente contêm um ou um pequeno número de sítios de reconhecimento de endonuclease de restrição que permitem a inserção de uma molécula de ácido nucleico em um forma determinável sem perda de uma função biológica essencial do vetor, assim como seqüências de nucleotídeos codificando um gene marcador que seja adequado para uso na identificação e seleção de células transformadas com o vetor de clonagem. Os genes marcadores tipicamente incluem genes que proporcionem resistência à tetraciclina ou resistência à ampicilina.

Um “vetor de expressão” é uma molécula de ácido nucleico codificando um gene que seja expresso em uma célula hospedeira. Tipicamente, um vetor de expressão compreende um promotor de transcrição, um gene e um terminador de transcrição. A expressão do gene é usualmente colocada sob o controle de um promotor, e um tal gene é dito ser “operavelmente ligado a” o promotor. De forma semelhante, um elemento regulador e um promotor de núcleo são operavelmente ligados se o elemento regulador modular a atividade do promotor de núcleo.

Um “hospedeiro recombinante” é uma célula que contém uma molécula de ácido nucleico heteróloga, tal como um vetor de clonagem ou vetor de expressão. No presente contexto, um exemplo de um hospedeiro recombinante é uma célula que produz uma proteína de fusão de TACI-Fc de um vetor de expressão.

“Transformantes integrativos” são células hospedeiras recombinantes, em que o DNA heterólogo se tenha tomado integrado no DNA genômico das células.

Uma “proteína de fusão” é uma proteína híbrida expressa por uma molécula de ácido nucleico que compreenda seqüências de nucleotídeos de pelo menos dois genes. Por exemplo, uma proteína de fusão de TACIimunoglobulina compreende uma porção do receptor de TACI e uma porção de imunoglobulina. Como aqui usado, uma “porção do receptor de TACI” é

• · uma porção do domínio extracelular do receptor de TACI que se liga a pelo menos um dentre ZTNF2 ou ZTNF4. A expressão uma “porção de imunoglobulina” se refere a um polipeptídeo que compreende uma região constante de uma imunoglobulina. Por exemplo, a porção de imunoglobulina pode compreender uma região constante de cadeia pesada. O termo de proteína de fusão “TACI-Fc” se refere a uma proteína de fusão de TACIimunoglobulina em que a porção de imunoglobulina compreenda regiões constantes de cadeia pesada de imunoglobulina, Cr2 ^e Cro·

O termo “receptor” denota uma proteína de associação celular que se ligue a uma molécula bioativa denominada de um “ligando”. Esta interação medeia o efeito do ligando sobre a célula. No contexto da ligação do receptor de TACI, as expressões “especificamente se liga” ou “ligação específica” se referem à capacidade do ligando de competitivamente ligar-se com o receptor. Por exemplo, ZTNF4 especificamente se liga com o receptor de TACI, e isto pode ser mostrado observando-se a competição para o receptor de TACI entre ZNTF4 rotulado e ZTNF4 não rotulado.

Os receptores podem ser ligados à membrana, citossólica ou nuclear; monomérica (por exemplo, o receptor de hormônios estimuladores da tireóide, o receptor beta-adrenérgico) ou multimérica (por exemplo o receptor de PDGF, o receptor do hormônio de crescimento, o receptor de IL-3, o receptor de GM-CSF, o receptor de G-CSF, o receptor de eritropoietina e o receptor de IL-6). Os receptores ligados à membrana são caracterizados por uma estrutura de múltiplos domínios compreendendo um domínio de ligação a ligando extracelular e um domínio efetor intracelular que esteja tipicamente envolvido na transdução de sinal. Em certos receptores ligados à membrana, o domínio de ligação a ligando extracelular e o domínio do efetor intracelular ficam localizados em polipeptídeos separados que compreendem o receptor funcional completo.

Em geral, a ligação de ligando ao receptor resulta em uma ··· ·· · · · ····· · · • · · ·· ···· *··· ····

mudança conformacional no receptor, que causa uma interação entre o domínio efetor e outra(s) molécula(s) na célula, as quais, por sua vez, conduz a uma alteração no metabolismo da célula. Eventos metabólicos que são freqüentemente articulados às interações de receptor-ligando incluem a transcrição de genes, a fosforilação, a desfosforilação, o aumento na produção cíclica de AMP, a mobilização do cálcio celular, a mobilização dos lipídeos da membrana, a aderência celular, a hidrólise de lipídeos de inositol e a hidrólise de fosfolipídeos.

A expressão “seqüência de sinal secretária” denota uma seqüência de DNA que codifica um peptídeo (um “peptídeo secretário”) que, como um componente de um polipeptídeo maior, direciona o polipeptídeo maior através de uma via secretária de uma célula em que ele é sintetizado. O polipeptídeo maior é comumente clivado para remover o peptídeo secretário durante o trânsito através da via secretária.

Um “polipeptídeo isolado” é um polipeptídeo que é essencialmente livre de componentes celulares contaminantes, tais como carboidratos, lipídeos ou outras impurezas proteináceas associadas com o polipeptídeo por natureza. Tipicamente, uma preparação de polipeptídeo isolado contém o polipeptídeo em uma forma altamente purificada, isto é, pelo menos cerca de 80% puro, pelo menos cerca de 90% puro, pelo menos cerca de 95% puro, mais do que 95% puro ou mais do que 99% puro. Um meio de mostrar que uma preparação protéica particular contém um polipeptídeo isolado é pela aparência de uma banda única em seguida à eletroforese em dodecil sulfato de sódio (SDS)-gel de poliacrilamida da preparação protéica e manchamento do gel com Azul Brilhante de Coomassie. No entanto, o termo “isolado” não exclue a pesença do mesmo polipeptídeo nas formas físicas alternativas, tais como dímeros ou formas altemativamente glicosiladas ou derivadas.

As expressões “terminal amino” e “terminal carboxila” são

aqui usados para denotar posições dentro dos polipeptídeos. Quando o contexto o permite, estas expressões são usadas com referência a uma seqüência particular ou porção de um polipeptídeo para denotar a proximidade ou a posição relativa. Por exemplo, uma certa seqüência posicionada no terminal carboxila de uma seqüência de referência dentro de um polipeptídeo se acha localizada proximal ao término carboxila da seqüência de referência, mas não está necessariamente no término carboxila do polipeptídeo completo.

O termo “expressão” se refere à biossíntese de um produto de genes. Por exemplo, no caso de um gene estrutural, a expressão envolve a transcrição do gene estrutural no mRNA e a translação do mRNA em um ou mais polipeptídeos.

A expressão “variante de encaixe” é aqui usada para denotar formas alternativas de RNA transcrito de um gene. A variação de encaixe surge naturalmente através do uso de sítios de encaixe alternativo dentro de uma molécula de RNA transcrita, ou menos comumente entre moléculas de RNA separadamente transcritas, e pode resultar em vários mRNAs transcritos do mesmo gene. As variantes de encaixe podem codificar polipeptídeos tendo a seqüência de aminoácidos alterada. A expressão variante de encaixe é também aqui usada para denotar um polipeptídeo codificado por uma variante de encaixe de um mRNA transcrito de um gene.

Como aqui usado, o termo “imunomodulador” inclui citocinas, fatores de crescimento de células primordiais, linfotoxinas, moléculas coestimuladoras, fatores hematopoiéticos e análogos sintéticos destas moléculas.

A expressão “par de complemento/anticomplemento” denota porções não idênticas que formam um par estável não covalentemente associado, sob condições apropriadas. Por exemplo, biotina e avidina (ou estreptavidina) são membros prototípicos de um par de complemento/anti18

....................... Jh • · · ········ · · « · · 4 < · · ·· ·*« · · • V · · · · ·· · · ♦ · «·· complemento. Outros pares exemplares de complemento/anticomplemento incluem os pares de receptor/ligando, os pares de anticorpo/antígeno (ou hapteno ou epítopo), pares de polinucleotídeos de sentido/anti-sentido, e outros. Quando a dissociação subseqüente do par de complemento/anticomplemento é desejável, o par de complemento/anticomplemento preferivelmente tem uma afinidade de ligação menor do que 10⁹ M'¹.

Um “fragmento de anticorpo” é uma porção de um anticorpo tal como F(ab’)₂, F(ab)2, Fab’, Fab, e outros. Não obstante a estrutura, um fragmento de anticorpo se liga com o mesmo antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto.

A expressão “fragmento de anticorpo” também inclui um polipeptídeo sintético ou um geneticamente engendrado, que se liga a um antígeno específico, tal como os polipeptídeos que consistem da região variável de cadeia leve, fragmentos “Fv” que consistem das regiões variáveis das cadeias pesadas e leves, moléculas de polipeptídeos recombinantes de cadeia única em que as regiões variáveis leves e pesadas são conectadas por um ligador peptídico (“proteínas scFv”), e unidades de reconhecimento mínimo consistindo dos resíduos de aminoácido que imitam a região hipervariável.

Um “anticorpo quimérico” é uma proteína recombinante que contém os domínios variáveis e as regiões de determinação complementares derivadas de um anticorpo de roedor, enquanto o remanescente da molécula de anticorpo é derivado de um anticorpo humano.

“Anticorpos humanizados” são proteínas em que as regiões de determinação complementares de murinos de um anticorpo monoclonal tenha sido transferidas das cadeias de variáveis pesadas e leves da imunoglobulina de murinos para um domínio variável humano.

Como aqui usado, um “agente terapêutico” é uma molécula ou átomo que é conjugado a uma porção de anticorpos para produzir um

conjugado, que é útil para terapia. Exemplos de agentes terapêuticos incluem medicamentos, toxinas, imunomoduladores, quelantes, compostos de boro, agentes fotoativos ou corantes, e radioisótopos.

Um “rótulo detectável” é uma molécula ou átomo, que pode ser conjugado a uma porção de anticorpos para produzir uma molécula útil para diagnóstico. Exemplos de rótulos detectáveis incluem os quelantes, os agentes fotoativos, os radioisótopos, os agentes fluorescentes, os íons paramagnéticos, ou outras porções de marcadores.

A expressão “rótulo de afinidade” é aqui usada para denotar um segmento polipeptídico que pode ser articulado a um segundo polipeptídeo para proporcionar purificação ou detecção do segundo polipeptídeo ou prover sítios para ligação do segundo polipeptídeo a um substrato. Principalmente, qualquer peptídeo ou proteína para os quais um anticorpo ou outro agente específico de ligação seja disponível, pode ser usado como umrótulo de afinidade. Os rótulos de afinidade incluem um trato de poli-histidina, a proteína A [Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3 (1991)], glutationa S transferase [Smith e Johnson, Gene 67: 31 (1988)], rótulo de afinidade Glu-Glu [Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 7952 (1985)], substância P, peptídeo FLAG [Hopp et al., Biotechnology 6: 1204 (1988)], peptídeo de ligação à estreptavidina, ou outro epítopo antigênico ou domínio de ligação. Ver, em geral, Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95 (1991). Os rótulos de afinidade codificando moléculas de DNA acham-se disponíveis de fornecedores comerciais (por exemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Um “anticorpo desnudo” é um anticorpo inteiro, em oposição a um fragmento de anticorpo, que não é conjugado com um agente terapêutico. Os anticorpos desnudos incluem anto os anticorpos policlonais quanto os monoclonais, assim como certos anticorpos recombinantes, tais como os anticorpos quiméricos e os humanizados.

Como aqui usada, a expressão “componente de anticorpo” inclui tanto um anticorpo inteiro quanto um fragmento de anticorpo.

Um “imunoconjugado” é um conjugado de um componente de anticorpo com um agente terapêutico ou um rótulo detectável.

Um “polipeptídeo alvo” ou um “peptídeo alvo” é uma seqüência de aminoácidos que compreende pelo menos um epítopo, e que é expressa em uma célula alvo, tal como uma célula tumoral, ou uma célula que carregue um antígeno de agente infeccioso. As células T reconhecem os epítopos de peptídeos apresentados por uma molécula complexa de histocompatibilidade principal a um polipeptídeo alvo ou peptídeo alvo e tipicamente lisam a célula alvo ou recrutam outras células imunes para o sítio da célula alvo, por esse meio matando a célula alvo.

Um “peptídeo antigênico” é um peptídeo que se ligará a uma molécula complexa de histocompatibilidade principal para formar um complexo de MHC-peptídeo, que é reconhecido por uma célula T, por esse meio induzindo uma resposta linfocítica citotóxica após apresentação à célula T. Assim sendo, os peptídeos antigênicos são capazes de ligar-se a uma molécula complexa de histocompatibilidade principal apropriada e induzir uma resposta citotóxica das células T, tal como a lise celular ou a liberação de citocina específica contra a célula alvo, a qual liga ou expressa o antígeno. O peptídeo antigênico pode ser ligado no contexto de uma molécula complexa de histocompatibilidade principal de classe I ou de classe II, em uma célula apresentando antígeno ou em uma célula alvo.

Nos eucariotas, a RNA polimerase II catalisa a transcrição de um gene estrutural para produzir mRNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser projetada para conter um padrão de RNA polimerase II em que o transcrito do RNA tem uma seqüência que seja complementar àquela de um mRNA específico. O transcrito de RNA é denominado um “RNA anti21 ·»· «*· <-·· ·«·· ·«. ·· _·

sentido” e uma molécula de ácido nucleico que codifique o RNA anti-sentido é denominado um “gene anti-sentido”. As moléculas de RNA anti-sentido são capazes de ligar-se às moléculas de mRNA, resultando em uma inibição de tradução do mRNA.

Por causa da imprecisão dos métodos analíticos padrão, os pesos moleculares e comprimentos dos polímeros são entendidos como sendo valores aproximados. Quando um tal valor é expresso como “cerca” de X ou “aproximadamente” X, o valor de X estabelecido será entendido como sendo obtido com a precisão de ± 10%.

3. Produção de Moléculas de Ãcido Nucleico Codificando as Proteínas de TACI-Imunoglobulina

A Figura 1 provê a seqüência de aminoácidos mencionada acima de TACI humano [von Bülow e Bram, Science 278: 138 (1997)]. O polipeptídeo de TACI contém os seguintes elementos citados anteriormente:

(a) duas estruturas de pseudo-repetição ricas em cisteína características dos domínios de ligação do ligando do fator de necrose tumoral, (b) uma “região do pedículo” de 62 aminoácidos, que se situa entre os domínios de ligação do ligando e o domínio da transmembrana, (c) um domínio da transmembrana de 20 aminoácidos, e (d) um domínio intracelular de 127 aminoácidos. A seqüência de aminoácidos não contém uma seqüência de sinal de terminal amino hidrofóbica mencionada anteriormente.

De modo a criar uma forma solúvel de TACI humano para uso como um inibidor da interação de ligando nativo:receptor nativo, um domínio extracelular de TACI - uma proteína de fusão Fc de imunoglobulina humana - foi gerado. A seqüência disponível de TACI humano foi usada como o ponto de partida para projetar a molécula de proteína de fusão [von Bülow e Bram, Science 278: 138 (1997)]. Esta construção inicial, designada como TACI-Fc4”, incluiu os resíduos de aminoácido de 1 a 154 do polipeptídeo de TACI, e uma região de Fc humano modificada, descrita abaixo. O ponto de fusão do resíduo 154 foi escolhido de modo a incluir tanta região do pedículo de TACI quanto possível, embora não incluindo qualquer porção potencial do domínio da transmembrana mencionado anteriormente.

Uma vez que o polipeptídeo de TACI nativo não contém uma seqüência de sinal de terminal amino, uma seqüência de sinal de terminal amino foi adicionada ao TACI de modo a gerar uma forma secretada da proteína de fusão de TACI-Fc. A seqüência de sinal foi uma seqüência prepro modificada do ativador plasminogênico de tecido humano. As modificações foram incluídas para intensificar a clivagem da peptidase de sinal e processamento específico da furin protease e por essa razão esta seqüência tem sido referida como a “condutora otimizada de tPA (otPA)”. A seqüência otPA (SEQ ID NO: 25) é ilustrada abaixo; os resíduos de aminoácido modificados são sombreados. A seqüência codificando a proteína de fusão de TACI-Fc recombinante foi inserida em um vetor de expressão, a qual foi transfectada em células de ovário de hamster chinês.

(copiar da página 15) - peptidase de sinal - sítio de clivagem sítio de clivagem de furin.

As células de ovário de hamster chinês transfectadas produziram a proteína de TACI-Fc4 em um nível baixo de cerca de 0,3 pg/célula/dia. A análise de Western blot da proteína de TACI-Fc com antisoro Fc de IgG anti-humano de cabra revelou duas bandas, uma banda foi menor do que o tamanho esperado de aproximadamente 48 kDa. A análise de proteínas purificadas da seqüência de aminoácidos revelou que a menor banda refletiu a clivagem das proteínas de fusão de TACI em vários sítios dentro da região do pedículo de TACI. Com referência à SEQ ID NO: 2, os términos principais foram encontrados nos resíduos de aminoácido 118 e 123, embora as proteínas tivessem sido também clivadas nas posições 110, 139 e 141 de aminoácidos.

Além da heterogenicidade causada pela clivagem na região do ·· • · pedículo, a heterogenicidade foi também observada nos términos amino e carboxila. Com referência à SEQ ID NO: 2, os términos amino principais foram encontrados nos resíduos 1, 10 e 13 de aminoácido. As diferenças no término carboxila refletem a heterogenicidade natural das imunoglobulinas recombinantes e das proteínas de fusão das imunoglobulinas, o que inclui a remoção incompleta do resíduo de lisina terminalmente codificado por carboxila. Outra fonte de heterogenicidade foi encontrada na natureza variável da estrutura de carboidrato ligada ao domínio C_H2 da imunoglobulina codificado por Fc.

Novas versões de TACI-Fc foram geradas para tratar da heterogenicidade observada. Foram projetadas construções que incluíam pelo menos uma das seguintes variações na porção de TACI: (1) as porções da região do pedículo de TACI foram deletadas, (2) uma porção da região do pedículo de TACI foi substituída por uma porção da região do pedículo de BCMA, (3) o resíduo de arginina na posição 119 foi transformado para eliminar um sítio de clivagem potencial de furin, (4) o resíduo de glutamina na posição 121 foi transformado para eliminar um sítio de clivagem potencial de furin, (5) o resíduo de arginina na posição 122 foi transformado para eliminar um sítio de clivagem potencial de furin, (6) os resíduos de aminoácido nas posições 123 e 142 foram transformados nos resíduos de aminoácido encontrados nas posições correspondentes de TACI de murino, (7) a seqüência de sinal otPA humano foi substituída por uma seqüência de sinal de região variável de cadeia pesada humana, (8) o resíduo de valina na posição 29 foi transformado em metionina, e a seqüência de sinal otPa foi ligada em uma posição de terminal amino a este resíduo, e (9) a seqüência de sinal otPA foi ligada em uma localização de terminal amino ao resíduo de alanina na posição 30.

Modificações também foram introduzidas na porção de imunoglobulina. Cinco classes de imunoglobulina, IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, foram identificadas em vertebrados mais elevados. As proteínas IgG, IgD e IgE são caracteristicamente heterotetrâmeros ligados a dissulfeto, consistindo de duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas. Tipicamente, IgM é encontrada como um pentâmero de um tetrâmero, enquanto IgM ocorre como um dímero de um tetrâmero.

IgG compreende a classe principal, já que ela normalmente existe como a segunda proteína mais abundante encontrada no plasma. Nos seres humanos, a IgG consiste de quatro subclasses, designadas IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Como mostrado na Figura 2, cada cadeia pesada de imunoglobulina possui uma região constante que consiste dos domínios protéicos de região constante (C_Hi, dobradiça, C_H2 e C_H3) que são invariáveis para uma dada subclasse. As regiões constantes de cadeia pesada da classe de IgG são identificadas com o símbolo grego γ. Por exemplo, as imunoglobulinas da subclasse IgGl contêm uma região constante de cadeia pesada γΐ.

O fragmento Fc, ou domínio Fc, consiste das regiões de dobradiça de cadeia pesada ligada a dissulfeto, domínios C_H2 ^e C_H3. Nas proteínas de fusão de imunoglobulina, os domínios Fc da subclasse IgGl são freqüentemente usados como a porção de imunoglobulina, porque a IgGl tem a meia-vida de soro mais longa do que qualquer uma das proteínas de soro. A meia-vida de soro prolongada pode ser uma característica desejável da proteína para estudos de animais e uso terapêutico potenciais de seres humanos. Além disso, a subclasse IgGl possui a capacidade mais intensa para realizar as funções efetoras mediadas pelos anticorpos. A função efetora principal que pode ser mais útil em uma proteína de fusão de imunoglobulina é a capacidade para um anticorpo de IgGl mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos. Por outro lado, esta pode ser uma função indesejável para uma proteína de fusão que funcione principalmente como um antagonista. Vários dos resíduos de aminoácido específicos que são

importantes para a atividade mediada pela região constante de anticorpos na subclasse IgGl foram identificados. A inclusão ou exclusão destes aminoácidos específicos, portanto, leva em conta a inclusão ou exclusão da atividade específica mediada pela região constante da imunoglobulina.

Seis versões de um Fc de IgGl humano modificado foram geradas para criar as proteínas de fusão Fc. A Fc-488 foi projetada para clonagem conveniente de uma proteína de fusão contendo a região de Fc γΐ humana, e ela foi construída usando-se a região constante γΐ de imunoglobulina humana do tipo selvagem como um padrão. A preocupação com os efeitos deletérios devidos a um resíduo ímpar de cisteína conduziu à decisão de substituir a cisteína (resíduo de aminoácido 24 da SEQ ID NO: 6) que normalmente o dissulfeto se liga com a região constante de cadeia leve de imunoglobulina por um resíduo de serina. Uma mudança adicional foi introduzida no códon que codifica a posição 218 do índice EU (resíduos de aminoácido 22 da SEQ ID NO: 6) para introduzir um sítio de reconhecimento da enzima de restrição Bglll para facilidade de manipulações futuras do DNA. Estas mudanças foram introduzidas no produto da PCR codificado nos iniciadores da PCR. Por causa da localização do sítio BgBI e de modo a completar a região da dobradiça de Fc, os códons para as posições 216 e 217 do índice EU (resíduos 20 e 21 de aminoácido da SEQ ID NO: 6) foram incorporados nas seqüências companheiras das proteínas de fusão.

Fc4, Fc5 e Fc6 contêm mutações para reduzir as funções efetoras mediadas pela Fc mediante redução da ligação FcyRI e da ligação Clq do complemento. Fc4 contém as mesmas substituições de aminoácidos que foram introduzidas em Fc-488. As substituições de aminoácidos adicionais foram introduzidas para reduzir as funções efetoras potenciais mediadas por Fc. Especificamente, três substituições de aminoácidos foram introduzidas para reduzir a ligação FcyRI. Estas são as substituições nas posições 234, 235 e 237 do índice EU (resíduos de aminoácido 38, 39 e 41 da

SEQ ID NO: 6). As substituições nestas posições mostraram-se reduzir a ligação a FcyRI [Duncan et al., Nature 332: 563 (1988)]. Estas substituições de aminoácidos também podem reduzir a ligação de FcyRIIa, bem como a ligação de FcyRIII [Sondermann et al., Nature 406: 267 (2000); Wines et al., J.Immunol. 164: 5313 (2000)].

Vários grupos têm descrito a relevância das posições 330 e 331 do índice EU (resíduos de aminoácido 134 e 135 da SEQ ID NO: 6) na ligação Clq do complemento e fixação subseqüente do complemento [Canfield e Morrison, J. Exp. Med. 173: 1483 (1991); Tao et al., J. Exp. Med. 178: 661 (1993)]. As substituições de aminoácido nestas posições foram introduzidas em Fc4 para reduzir a fixação do complemento. O domínio Ch3 de Fc4 é idêntico àquele encontrado no correspondente polipeptídeo do tipo selvagem, exceto quanto ao códon de parada, que foi mudado de TGA para TAA para eliminar um sítio de metilação potencial dam quando o DNA clonado é cultivado em dam mais as cepas de E. coli.

Em F5, o resíduo de arginina na posição 218 do índice EU foi transformada de volta em uma lisina, porque o esquema de clonagem de BgBl não foi usado nas proteínas de fusão contendo este Fc particular. O remanescente da seqüência de Fc5 se equipara com a descrição acima quanto a Fc4.

Fc6 é idêntico a Fc5, exceto que o códon da lisina de terminal carboxila foi eliminado. A lisina C-terminal das imunoglobulina maduras é frequentemente removida das imunoglobulinas maduras póstranslacionalmente antes da secreção das células B, ou removida durante a circulação de soro. Conseqüentemente, o resíduo da lisina C-terminal não é tipicamente encontrado nos anticorpos circulantes. Como em Fc4 e Fc5 acima, o códon de parada na seqüência F6 foi mudado para TAA.

Fc7 é idêntico so Fc yl do tipo selvagem, excedto quanto a uma substituição de aminoácido na posição 297 do índice EU localizada no η

·»·· ···· domínio Ch2· A posição Asn-297 do índice EU (resíduo 101 de aminoácido da SEQ ID NO: 6) é um sítio de ligação de carboidrato N-ligado. O carboidrato N-ligado introduz uma fonte potencial de variabilidade em uma proteína recombinantemente expressa por causa das variações potenciais de batelada5 para-batelada na estrutura do carboidrato. Em uma tentativa para eliminar esta variabilidade potencial, Asn-297 foi transformado em um resíduo de glutamina para impedir a ligação do carboidrato N-ligado naquela posição do resíduo. O carboidrato no resíduo 297 também é envolvido na ligação de Fc à FcyRIII [Sondermann et al., Nature 406: 26Ί (2000)]. Portanto, a remoção do carboidrato deve reduzir a ligação de Fc7 recombinante contendo as proteínas de fusão à FcyRs em geral. Como acima, o códon de parada na seqüência Fc7 foi transformado para TAA.

Fc8 é idêntico à região yl de imunoglobulina do tipo selvagem mostrada na SEQ ID NO: 6, exceto que o resíduo de cisteína na posição 220 do índice EU (resíduo 24 de aminoácido da SEQ ID NO: 6) foi substituído por um resíduo de serina. Esta mutação eliminou o resíduo de cisteína que normalmente o dissulfeto se liga com a região constante da cadeia leve de imunoglobulina.

As construções ilustrativas de TACI-Fc são descritas na

Tabela 1.

TABELA 1

CONSTRUÇÕES ILUSTRATIVAS DA PROTEÍNA DE FUSÃO TACI-Fc

Seqüência de TACI“	Versão Fc
TACI^b	Fc4
TACI^b	Fc5
TACI^b	Fcyl
TACI (dl07-154)	Fc5
TACI(R119Q)	Fc4
TACI (l-104)-BCMA (42-54)^c	Fc5
TACI (Ú143-150)	Fc5
TACI (R142G, Ú143-150)	Fc5
TACI (RI 19G, Q121P, R122Q, S123A)	Fc5
TACI(R119G, R122Q)	Fc5
TACI (dl-28, V29M)	Fc6
TACI (dl-29)	Fc6
TACI (dl-29)	Fc5
TACI (dl-29, dl07-154)	Fc5
TACI (dl-29, dl 11-154)	Fc5
TACI (dl-29, d120-154)	Fc5

“Informações sobre localizações, mutações e deleções de seqüências de aminoácidos são fornecidas dentro de parênteses com referência à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

^bInclui os resíduos de aminoácido de 1 a 154 da SEQ ED NO: 2.

^cEsta construção inclui os resíduos de aminoácido de 1 a 104 da SEQ ID NO: 2 (TACI) e os aminoácidos de 42 a 54 da SEQ ID NO: 27 (BCMA).

As proteínas de TACI-Fc foram produzidas por células recombinantes de hamster chinês, isoladas e analisadas usando-se a análise de

Western blot e a análise de seqüências de aminoácidos. Surpreendentemente, a deleção dos primeiros 29 aminoácidos do término N do polipeptídeo de TACI resultou em um aumento de dez vezes na produção das proteínas de fusão de TACI-Fc pelas células de ovário de hamster chinês. A deleção também reduziu a clivagem da região do pedículo de comprimento completo.

Além disso, a clivagem dentro da região do pedículo de TACI foi suprimida ou por truncamento da região do pedículo de TACI, ou por substituição da região do pedículo de TACI dentro de outra seqüência de aminoácidos (por exemplo, a seqüência de aminoácidos da região do pedículo de BCMA).

Como descrito no Exemplo 4, análises funcionais das construções de TACI-Fc indicam que as proteínas de fusão TACI(dl-29)-Fc5,

TACI(dl-29, dlO7-154)-Fc5, TACI (dl-29, dlll-154)-Fc5 e TACI(dl-29, dl20-154)-Fc5 têm afinidades de ligação similares quanto a ZTNF4. Entretanto, as construções TACI(dl-29)-Fc5, TACI(dl-29, dl 11-154)-Fc5 e TACI(dl-29, dl20-154)-Fc5 parecem ligar-se mais a ZTNF4 por mol de TACI-Fc do que a construção TACI (dl-29, dlO7-154)-Fc5. Dependendo do uso pretendido (isto é, terapêutico, diagnóstico ou pesquisa) as proteínas de fusão de TACI-Fc ou de alta capacidade ou de baixa capacidade podem ser empregadas. Além disso, uma combinação de proteínas de fusão de TACI-Fc de alta capacidade e de baixa capacidade possibilita a titulação de ZTNF2 ou de ZTNF4.

A presente invenção considera proteínas de fusão de TACIimunoglobulina que compreendam uma porção do receptor de TACI consistindo dos resíduos de aminoácido de 30 a 106 da SEQ ID NO: 2, de 30 a 110 da SEQ ID NO: 2, de 30 a 119 da SEQ ID NO: 2 ou de 30 a 154 da SEQ ID NO: 2. A presente invenção também inclui proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina que compreendam uma porção do receptor de TACI consistindo dos resíduos de aminoácido de 31 a 106 da SEQ ID NO: 2, de 31 a 110 da SEQ ID NO: 2, de 31 a 119 da SEQ ID NO: 2 ou de 31 a 154 da SEQ ID NO: 2.

Mais geralmente, a presente invenção inclui as proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina, em que a porção do receptor de TACI consiste de um fragmento de resíduos de aminoácido de 30 a 154 da SEQ ID NO: 2, e em que a porção do receptor de TACI liga pelo menos um dente ZTNF2 ou ZTNF4. Tais fragmentos compreendem uma região de pseudorepetições rica em cisteína e, opcionalmente, podem incluir pelo menos um de um segmento N-terminal, que se situa em uma posição de terminal amino até a região de pseudo-repetição rica em cisteína, e um segmento do pedículo, que se situa em uma posição de terminal carboxila até a região de pseudorepetição rica em cisteína. Regiões de pseudo-repetição ricas em cisteína ···· ····

adequadas incluem polipeptídeos que: (a) compreendem pelo menos um dentre os resíduos de aminoácido de 34 a 66 da SEQ ID NO: 2, e resíduos de aminoácido de 71 a 104 da SEQ ID NO: 2, (b) compreendem tanto os resíduos de aminoácido de 34 a 66 da SEQ ID NO: 2, quanto os resíduos de aminoácido de 71 a 104 da SEQ ID NO: 2, ou (c) compreendem os resíduos de aminoácido de 34 a 104 da SEQ ID NO: 2.

Segmentos N-terminais adequados incluem os seguintes com referência à SEQ ID NO: 2: resíduo de aminoácido 33, resíduos de aminoácido 32 a 33, resíduos de aminoácido 31 a 33, e resíduos de aminoácido 30 a 33. Segmentos de pedículo adequados incluem um ou mais aminoácidos de resíduos de aminoácido de 105 a 154 da SEQ ID NO: 2. Por exemplo, o segmento de pedículo pode consistir do seguinte, com referência à SEQ ID NO: 2: resíduo de aminoácido 105, resíduos de aminoácido 105 a 106, resíduos de aminoácido 105 a 107, resíduos de aminoácido 105 a 108,

resíduos	de	aminoácido	105	a	109,	resíduos	de	aminoácido	105	a	110,
resíduos	de	aminoácido	105	a	in,	resíduos	de	aminoácido	105	a	112,
resíduos	de	aminoácido	105	a	113,	resíduos	de	aminoácido	105	a	114,
resíduos	de	aminoácido	105	a	115,	resíduos	de	aminoácido	105	a	116,
resíduos	de	aminoácido	105	a	117,	resíduos	de	aminoácido	105	a	118,
resíduos	de	aminoácido	105	a	119,	resíduos	de	aminoácido	105	a	120,
resíduos	de	aminoácido	105	a	121,	resíduos	de	aminoácido	105	a	122,
resíduos	de	aminoácido	105	a	123,	resíduos	de	aminoácido	105	a	124,
resíduos	de	aminoácido	105	a	125,	resíduos	de	aminoácido	105	a	126,
resíduos	de	aminoácido	105	a	127,	resíduos	de	aminoácido	105	a	128,
resíduos	de	aminoácido	105	a	129,	resíduos	de	aminoácido	105	a	130,
resíduos	de	aminoácido	105	a	131,	resíduos	de	aminoácido	105	a	132,
resíduos	de	aminoácido	105	a	133,	resíduos	de	aminoácido	105	a	134,
resíduos	de	aminoácido	105	a	135,	resíduos	de	aminoácido	105	a	136,
resíduos	de	aminoácido	105	a	137,	resíduos	de	aminoácido	105	a	138,

Μ

resíduos	de	aminoácido	105	a	139,	resíduos	de	aminoácido	105	a	140,
resíduos	de	aminoácido	105	a	141,	resíduos	de	aminoácido	105	a	142,
resíduos	de	aminoácido	105	a	143,	resíduos	de	aminoácido	105	a	144,
resíduos	de	aminoácido	105	a	145,	resíduos	de	aminoácido	105	a	146,
resíduos	de	aminoácido	105	a	147,	resíduos	de	aminoácido	105	a	148,
resíduos	de	aminoácido	105	a	149,	resíduos	de	aminoácido	105	a	150,
resíduos	de	aminoácido	105	a	151,	resíduos	de	aminoácido	105	a	152,

resíduos de aminoácido 105 a 153, resíduos de aminoácido 105 a 154.

Segmentos de pedículos adequados adicionais incluem um ou mais aminoácidos da região de pedículo de BCMA (isto é, resíduos de aminoácido de 42 a 54 da SEQ ID NO: 27. Por exemplo, um segmento de pedículo pode consistir do seguinte com referência à SEQ ID NO: 27: resíduo de aminoácido 42, resíduos de aminoácido 42 a 43, resíduos de aminoácido 42 a 44, resíduos de aminoácido 42 a 45, resíduos de aminoácido 42 a 46, resíduos de aminoácido 42 a 47, resíduos de aminoácido 42 a 48, resíduos de aminoácido 42 a 49, resíduos de aminoácido 42 a 50, resíduos de aminoácido 42 a 51, resíduos de aminoácido 42 a 52, resíduos de aminoácido 42 a 53, resíduos de aminoácido 42 a 54.

De uma forma mais geral, um segmento de pedículo pode consistir de dois a 50 resíduos de aminoácido.

A porção de imunoglobulina de uma proteína de fusão aqui descrita compreende pelo menos uma região constante de uma imunoglobulina. A seqüência de imunoglobulina humana pode ser uma seqüência de aminoácidos do tipo selvagem, ou uma seqüência de aminoácidos do tipo selvagem modificada, a qual tenha pelo menos uma das mutações de aminoácido examinadas acima.

A seqüência de aminoácidos de imunoglobulina humana pode também variar a partir do tipo selvagem, mediante possuir uma ou mais mutações características de um determinante alotípico conhecido. A Tabela 2 ·· • · ·· ···· ···« apresenta os determinantes alotípicos da região constante de IgGyl humana [Putman, The Plasma Proteins, Vol. V, páginas 49 a 140 (Academic Press, Inc. 1987)]. As posições 214, 356, 358 e 431 do índice EU definem os alótipos de IgGyl conhecidos. A posição 214 acha-se no domínio C_Hi da região constante de IgGyl e, portanto, não se situa dentro da seqüência de Fc. A seqüência de Fc do tipo selvagem da SEQ ID NO: 6 inclui os alótipos Glm(l) e Glm(2-). Entretanto, a porção de Fc de uma proteína de TACI-Fc pode ser modificada para refletir qualquer combinação destes alótipos. TABELA 2

DETERMINANTES ALOTÍPICOS DA REGIÃO CONSTANTE yl DA IMUNOGLOBULINA HUMANA

Alótipo	Resíduo de Aminoácido	Posição do Aminoácido r
índice EU	SEQ ID NO: 6
Glm(l)	Asp, Leu	356,358	160, 162
Glm(l-)	Glu, Met	356, 358	160, 162
Glm(2)	Gly	431	235
Glm(2-)	Ala	431	235
Glm(3)	Arg	214	—
Glm(3-)	Lys	214	—

Os exemplos de proteínas de TACI-Fc aqui apresentados compreendem regiões constantes de IgGl humano. Entretanto, as porções de imunoglobulina adequadas também incluem polipeptídeos que compreendem pelo menos uma região constante, tal como uma região constante de cadeia pesada de qualquer uma das seguintes imunoglobulinas: IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE e IgM. Vantajosamente, as porções de imunoglobulina derivadas da IgG2 do tipo selvagem ou IgG4 do tipo selvagem oferecem a função efetora reduzida, em comparação com IgGl do tipo selvagem ou IgG3 do tipo selvagem. A presente invenção também considera proteínas de fusão que compreendam uma porção do receptor de TACI, conforme descrito acima, e ou albumina ou 32-macroglobulina.

Outro tipo de proteína de fusão receptora que liga ZTNF2 ou ZTNF4 é uma proteína de fusão de BCMA-imunoglobulina. Estudos têm sido ··« ···· ···♦ realizados com uma proteína de fusão de BCMA-Fc4 emque a porção de BCMA consiste dos resíduos de aminoácido de 1 a 48 da SEQ ID NO: 27. Surpreendentemente, estudos farmacocinéticos em camundongos revelaram que a proteína de fusão de BCMA-Fc4 possuía uma meia-vida de cerca de 101 horas, enquanto uma proteína de TACI-Fc possuía uma meia-vida de 25 horas. Assim sendo, a administração de uma proteína de fusão de BCMAimunoglobulina pode ser preferida em certas colocações clínicas. Além disso, uma combinação de proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina e BCMAimunoglobulina pode ser vantajosa para tratar de certas condições. Esta terapia de combinação pode ser obtida pela administração de proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina e BCMA-imunoglobulina, ou pela administração de heterodímeros de proteínas de fusão de TACIimunoglobulina e BCMA-imunoglobulina.

Outro tipo de proteína de fusão receptora que liga ZTNF4 é uma proteína de fusão de imunoglobulina que compreenda um domínio extracelular de um receptor designado como “Ztnffl2”. As seqüências de aminoácidos e de nucleotídeos de Ztnfrl2 são providas como SEQ ID NO: 59 e SEQ ID NO: 60, respectivamente. Porções adequadas do receptor ZtnfiT2 incluem polipeptídeos que compreendem os resíduos de aminoácido de 1 a 69 da SEQ ID NO: 60 ou os resíduos de aminoácido de 19 a 35 da SEQ ID NO: 60,

As proteínas de fusão da presente invenção podem ter a forma de polipeptídeos de cadeia única, dímeros, trímeros ou múltiplos de dímeros ou trímeros. Os dímeros podem ser homodímeros ou heterodímeros, e os trímeros podem ser homotrímeros ou heterotrímeros. Exemplos de heterodímeros incluem um polipeptídeo de TACI-imunoglobulina com um polipeptídeo de BCMA-imunoglobulina, um polipeptídeo de TACIimunoglobulina com um polipeptídeo de Ztnffl2-imunoglobulina, e um polipeptídeo de BCMA-imunoglobulina com um polipeptídeo de Ztnfrl234 imunoglobulina. Exemplos de heterotrímeros incluem um polipeptídeo de TACI-imunoglobulina com dois polipeptídeos de BCMA-imunoglobulina, um polipeptídeo de TACI-imunoglobulina com dois polipeptídeos de Ztnffl2imunoglobulina, um polipeptídeo de BCMA-imunoglobulina com dois polipeptídeos de Ztnfrl2-imunoglobulina, dois polipeptídeos de TACIimunoglobulina com um polipeptídeo de BCMA-imunoglobulina, dois polipeptídeo de TACI-imunoglobulina com um polipeptídeo de Ztnffl2imunoglobulina, dois polipeptídeos de BCMA-imunoglobulina com um polipeptídeo de ZtnfiT2-imunoglobulina, e um trímero de um polipeptídeo de TACI-imunoglobulina, um polipeptídeo de BCMA-imunoglobulina e um polipeptídeo de Ztnfrl2-imunoglobulina.

Em tais proteínas de fusão, a porção do receptor de TACI pode compreender pelo menos uma das seguintes seqüências de aminoácido da SEQ ID NO: 2: resíduos de aminoácido de 30 a 154, resíduos de aminoácido de 34 a 66, resíduos de aminoácido de 71 a 104, resíduos de aminoácido de 47 a 62 e resíduos de aminoácido de 86 a 100. A porção do receptor de BCMA pode compreender pelo menos uma das seguintes seqüências de aminoácidos da SEQ ID NO: 27: resíduos de aminoácido de 1 a 48, resíduos de aminoácido de 8 a 41 e resíduos de aminoácido de 21 a 37. A porção do receptor ZtnfiT2 pode compreender pelo menos uma das seguintes seqüências de aminoácidos da SEQ ID NO: 60: resíduos de aminoácido de 1 a 69 e resíduos de aminoácido de 19 a 35.

As proteínas de fusão podem ser produzidas usando-se os métodos de PCR usados para construir as moléculas ilustrativas de TACI-Fc, que são descritas nos Exemplos. Entretanto, aqueler de experiência na técnica podem usar outras abordagens padrão. Por exemplo, as moléculas de ácido nucleico que codificam TACI, BCMA, Ztnfrl2, ou os polipeptídeos de imunoglobulina, podem ser obtidos mediante triagem do cDNA humano ou de bibliotecas genômicas usando sondas de polinucleotídeos com base nas • V • « »»·* «· ;· seqüências aqui apresentadas. Estas técnicas são padrão e bem estabelecidas {ver, por exemplo, Susubel et al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3~ Edição, páginas 4-1 a 4-6 (John Wiley & Sons 1995) [“Ausubel (1995)”]; Wu et al., Methods in Gene Biotechnology, páginas 33-41 (CRC Press, Inc. 1997) [Wu (1997)”]; Ausubel (1995) às páginas 5-1 a 5-6; Wu (1997) às páginas 307-327}.

Altemativamente, as moléculas para construir proteínas de fusão de imunoglobulina podem ser obtidas por sintetização das moléculas de aminoácidos usando-se oligonucleotídeos longos de preparação mútua e as seqüências de nucleotídeos aqui descritas [ver, por exemplo, Ausubel (1995) às páginas 8-8 a 8-9]. Técnicas estabelecidas usando a reação em cadeia da polimerase fornecem a capacidade de sintetizar molécular de DNA de pelo menos duas quilobases de comprimento [Adang et al., Plant Molec. Biol. 21\ 1131 (1993), Bambot et al., PCR Methods and Applications 2\ 266 (1993), Dillon et al., “Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes f em Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), páginas 263268 (Humana Press, Inc. 1993), e Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4\ 299(1995)].

As moléculas de ácido nucleico da presente invenção também podem ser sintetizadas com “máquinas de genes” usando-se protocolos tais como o método de fosforamidita. Se o DNA de filamento duplo quimicamente sintetizado por requerido para uma aplicação tal como a síntese de um gene ou de um fragmento de gene, então cada filamento complementar é produzido separadamente. A produção de genes curtos (60 a 80 pares de base) é tecnicamente direta e pode ser realizada sintetizando-se os filamentos complementares então tratando-os pelo calor. Para a produção de genes mais longos (> 300 pares de base), entretanto, estratégias especiais podem ser necessárias, porque a eficiência de acoplamento de cada ciclo durante a

síntese química do DNA é raramente de 100%. Para superar este problema, genes sintéticos (de filamento duplo) são montados na forma modular a partir de fragmentos de filamento único que sejam de 20 a 100 nucleotídeos de comprimento. Para um retrospecto da síntese de polinucleotídeos, ver, por exemplo, Glick e Pastemak, Molecular Biotechnology, Principies and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53: 323 (1984), e Climie et al., Proc. Nat’l Acad. Sei. USA 87: 633 (1990).

4. Produção de Polipeptídeos de TACI-imunoglobulina

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser produzidos em células hospedeiras recombinantes, seguindo-se técnicas convencionais. Para expressar uma seqüência que codifique TACI-imunoglobulina, uma molécula de ácido nucleico codificando o polipeptídeo deve ser operavelmente articulada a seqüências reguladoras que controlem a expressão transcripcional em um vetor de expressão e, então, introduzida em uma célula hospedeira. Além das seqüências reguladores transcricionais, tais como as promotoras e intensificadores, os vetores de expressão podem incluir seqüências reguladores translacionais e um gene marcador, o que é adequado para a seleção de células que carregam o vetor de expressão.

Os vetores de expressão que são adequados para a produção de uma proteína estranha em células eucarióticas tipicamente contêm (1) elementos de DNA procarióticos codificando para uma origem de replicação bacteriana e um marcador de resistência a antibióticos para proporcionar o crescimento e a seleção do vetor de expressão em um hospedeiro bacteriano;

(2) elementos de DNA eucarióticos que controlam a iniciação da transcrição, tais como um promotor; e (3) elementos de DNA que controlam o processamento de transcritos, tais como uma seqüência de terminação/poliadenilação da transcrição.

Os vetores de expressão também podem incluir seqüências de ···· ···· ·· ·&

nucleotídeos que codifiquem uma seqüência secretária que dirija o polipeptídeo heterólogo para a via secretária de uma célula hospedeira. Por exemplo, um vetor de expressão pode compreender uma seqüência de nucleotídeos que codifique a TACI-imunoglobulina e uma seqüência secretóris de qualquer gene secretado. Como examinado acima, uma seqüência de sinal adequada é uma seqüência de sinal tPA. Um exemplo de seqüência de sinal tPA é fornecido pela SEQ ID NO: 25. Outra seqüência de sinal adequada é uma seqüência de sinal de 26-10 V_H de murinos. O anticorpo de 26-10 de murinos é descrito, por exemplo, por Near et al., Mol. Immunol. 27: 901 (1990). Seqüências de aminoácidos e nucleotídeos ilustrativas de uma seqüência de sinal de 26-10 V_H são fornecidas pelas SEQ ID NO: 61 e SEQ ID NO: 65, respectivamente. A SEQ ID NO: 62 apresenta a seqüência de aminoácidos de uma proteína de fusão de TACI-Fc5 que compreende uma seqüência de sinal de 26-10 Vr.

As proteínas de TACI-imunoglobulina da presente invenção podem ser expressas em células de mamíferos. Exemplos de células hospedeiras de mamífero adequadas incluem as células de rim do macaco verde africano (Vero; ATCC CRL 1587), células de rim de embrião humano (293-HEK; ATCC CRL 1573), células de rim de filhote de hamster (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), células de rim canino (MDCK; ATCC CCL 34), células de ovário de hamister chinês [CHO-K1; ATCC CCL 61; CHO DG 44 (Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555, 1986)], células pituitárias de ratos (GH1; ATCC CCL 82), células S3 HeLa (ATCC CCL 2.2), células de hepatoma de ratos (H-4-II-E; ATCC CRL 1548), células de rim de macaco transformadas em SV-40 (COS-1; ATCC CRL 1650) e células embriônicas de murino (NIH-3T3; ATCC CRL 1658).

Para um hospedeiro mamífero, os sinais reguladores transcricionais e tralacionais podem ser derivados de fontes virais, tais como adenovírus, papilomavírus bovino, vírus símio, ou coisa parecida, em que os

sinais reguladores são associados com um gene particular que tem um alto nível de expressão. Seqüências reguladoras transcricionais e translacionais adequadas também podem ser obtidas de genes de mamíferos, tais como os genes de actina, colágeno, miosina e metalotioneína.

As seqüências transcricionais reguladoras incluem uma região promotora suficiente para dirigir a iniciação da síntese do RNA. Promotores eucarióticos adequados incluem o promotor do gene da metalotioneína I de camundongos [Hamer et al., J. Molec. Appl. Genet. 1: 273 (1982)], o promotor TK do vírus Herpes [McKnigkt, Cell 31: 355 (1982)], o promotor prematuro SV40 [Benoist et al., Nature 290: 304 (1981)], o promotor do vírus do sarcoma de Rous [Gorman et al., Proc. Nat 7 Acad. Sei. USA 79:

6ΊΊΊ (1982)], o promotor do citomegalovírus [Foecking et al., Gene 45: 101 (1980)], e o promotor do vírus de tumor mamário de camundongo [ver, em geral, Etcheverry, “Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture”, em Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)]. Uma combinação útil de um promotor e intensificador é provida por um promotor do vírus do sarcoma mieloproliferativo e um intensificador do citomegalovírus humano.

Altemativamente, um promotor procariótico, tal como o promotor da RNA polimerase do bacteriófago T3, pode ser usado para controlar a produção de proteínas de TACI-imunoglobulina em células de mamíferos, de o promotor procariótico for regulado por um promotor eucariótico [Zhou et al., Mol. Cell. Biol. 10: 4529 (1990) e Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 19: 4485 (1991)].

Um vetor de expressão pode ser introduzido nas células hospedeiras usando-se uma variedade de técnicas padrão, incluindo a transfecção de fosfato de cálcio, a transfecção mediada por lipossoma, a liberação mediada por microprojéteis, a eletroporação, e outras. As células transfectadas podem ser selecionadas e propagadas para prover células hospedeiras recombinantes que compreendam o vetor de expressão estavelmente integrado no genoma das células hospedeiras. As técnicas para introduzir vetores nas células eucarióticas e as técnicas para selecionar tais transformantes estáveis usando um marcador selecionável dominante, são descritas, por exemplo, por Ausubel (1995) e por Murray (ed.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991).

Por exemplo, um marcador selecionável adequado é um gene que fornece resistência ao antibiótico neomicina. Neste caso, a seleção é realizada na presença de um medicamento do tipo neomicina, tal como G-418 ou coisa parecida. Os sistemas de seleção podem também ser usados para aumentar o nível de expressão do gene de interesse, um processo referido como “amplificação”. A amplificação é realizada mediante cultura de transfectantes na presença de um baixo nível do agente seletivo e, depois, aumentando-se a quantidade de agente seletivo para selecionar quanto às células que produzem altos níveis dos produtos dos genes introduzidos. Um marcador selecionável amplificável adequado é a diidrofolato redutase, que confere resistência ao metotrexato. Outros genes de resistência aos medicamentos (por exemplo, resistência à higromicina, resistência a múltiplos medicamentos, a puromicina acetiltransferase) podem também ser usados. Altemativamente, os marcadores que introduzem um fenótipo alterado, tais como a proteína fluorescente verde, ou proteínas da superfície celular, tais como CD4, CD8, MHC Classe I, fosfatase alcalina placentária, podem ser usados para separar as células transfectadas das células não transfectadas por tais meios, como a separação de FACS ou a tecnologia de separação de contas magnéticas.

Os polipeptídeos de TACI-imunoglobulina também podem ser produzidos pelas células de mamíferos cultivadas usando-se um sistema de liberação viral. Vírus de exemplo para esta finalidade incluem o adenovírus, o vírus herpes, o vírus da vacínia e o vírus adeno-associado (AAV). O ·· ····

7.

adenovírus, um vírus do DNA de filamento duplo, é presentemente o vetor de transferência de genes mais bem estudado para liberação de ácido nucleico heterólogo [para um exame, ver Becker et al., Meth. Cell Biol. 43: 161 (1994), e Douglas e Curiel, Science & Medicine 4: 44 (1997)]. As vantagens do sistema de adenovírus incluem a acomodação de insertos de DNA relativamente grandes, a capacidade de crescer até alto título, a capacidade de infectar uma ampla faixa de tipos celulares de mamíferos, e a flexibilidade que permite o uso com um grande número de vetores disponíveis contendo promotores diferentes.

Mediante deleção de porções do genoma de adenovírus, insertos maiores (até 7 kb) de DNA heterólogo podem ser acomodados. Estes insertos podem ser incorporados no DNA viral por ligação direta ou por recombinação homóloga com um plasmídeo cotransfectado. Uma opção é deletar o gene El essencial do vetor viral, o que resulta na incapacidade de replicar, a menos que o gene El seja fornecido pela célula hospedeiro. 293 células humanas infectadas com o vetor do adenovírus (ATCC n~ CRL-1573, 45504, 45505), por exemplo, puderam ser cultivadas como células aderentes ou em cultura de suspensão em densidade celular relativamente elevada para produzir quantidades significativas de proteína [ver Gamier et al., Cytotechnol. 15: 145 (1994)].

Aqueles de experiência na técnica podem planejar vetores de expressão adequados para produzir as proteínas de fusão aqui descritas com células de mamíferos. O Exemplo 4 descreve aspectos de um vetor de expressão. Como outro exemplo, um vetor de expressão pode compreender um cassete de expressão bicistrônico que inclua uma porção do intensificador de citomegalovírus humano, o promotor do vírus do sarcoma mieloproliferativo, uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteína de fusão, os sítios de entrada ribossômica interna do poliovírus, uma seqüência de nucleotídeos codificando a diidrofolato redutase murina, seguida ··

pela seqüência de adição poli A SV40. A seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 69 apresenta uma construção do promotor de LTR do intensificador do citomegalovírus/vírus do sarcoma mieloproliferativo, em que o intensificador do citomegalovírus se estende do nucleotídeo 1 ao 407. O promotor LTR do vírus do sarcoma mieloproliferativo, ausente da região de controle negativo se estende do nucleotídeo 408 ao nucleotídeo 884 da SEQ ID NO: 69. Uma seqüência de nucleotídeos para o promotor de LTR do vírus do sarcoma mieloproliferativo sem a região de controle negativo é provida na SEQ ID NO: 70.

O Exemplo 1 descreve um vetor de expressão que compreende um promotor do citomegalovírus para dirigir a expressão do transgene protéico recombinante, um íntron de imunoglobulina, e uma seqüência de sinal ativadora do plasminogênio tecidual. Um íntron de imunoglobulina adequado é um íntron de 26-10 V_H de murino. a SEQ ID NO: 66 provê uma seqüência ilustrativa de nucleotídeos de um íntron 26-10 V_H de murinos. Um vetor de expressão pode também incluir uma região não transladada de 5’ (UTR) localizada a montante da seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína de TACI-imunoglobulina. Uma 5’-UTR adequada pode ser derivada do gene de 26-10 V_H. A SEQ ID NO: 63 apresenta a seqüência de nucleotídeos de uma 5’-UTR nativa de murino de 26-10 V_H, que foi otimizada na extremidade 3’.

Como uma ilustração, a SEQ ID NO: 67 provê uma seqüência de nucleotídeos que inclui os seguintes elementos: uma 51-UTR de murino nativa de 26-10 V_H (nucleotídeos de 1 a 51), uma seqüência de sinal de 26-10 V_H de murino (nucleotídeos de 52 a 97 e de 182 a 192), um íntron de murino de 26-10 V_H (nucleotídeos de 98 a 181), uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma porção de TACI (nucleotídeos de 193 a 435), e uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma porção de Fc5 (nucleotídeos de 436 a 1131). A seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 68 difere da SEQ ID NO:

• · por causa da substituição de uma seqüência nativa pela 5’-UTR murina de 26-10 Vh otimizada (nucleotídeos de 1 a 51).

As proteínas de TACI-imunoglobulina também podem ser expressas em outras células eucarióticas superiores, tais como as células aviárias, fungicas, de insetos, de levedura ou de plantas. O sistema de baculovírus provê um meio eficiente para introduzir genes clonados nas células de insetos. Os vetores de expressão adequados se baseiam no vírus de poliedrose nuclear múltipla de Autographa californica (AcMNPV), e contêm promotores bem conhecidos tais como o promotor 70 da proteína de choque térmico (hsp) de Drosofilas, promotor do gene prematuro imediato do vírus de poliedrose nuclear de Autographa californica (ie-1) e o promotor 39K prematuro prematuro retardado, o promotor plO do baculovírus, e o promotor da metalotioneína de Drosófila. Um segundo método de produzir baculovírus recombinante utiliza um sistema com base no transpóson descrito por Luckow [Luckow et al., J. Virol. 67: 4566 (1993)]. Este sistema, que utiliza vetores de transferência, é vendido no kit BAC-to-BAC (Life Technologies, Rockville, MD). Este sistema utiliza um vetor de transferência, o PFASTBAC (Life Technologies) contendo um transpóson Tn7 para mover o DNA codificando o polipeptídeo de TACI-imunoglobulina para umgenoma de baculovírus mantido em E. coli como um plasmídeo grande denominado de um “bacmid”. Ver Hill-Perkins e Possee, J. Gen. Virol. 71: 971 (1990), Bonning et al., J. Gen. Virol. 75: 1551 (1994), e Chazenbalk e Rapoport, J. Biol. Chem. 270: 1543 (1995). Além disso, os vetores de transferência podem incluir uma fusão na matriz com o DNA codificando um rótulo de epítopo no término C ou N do polipeptídeo expresso de TACI-imunoglobulina, por exemplo um rótulo de epítopo Glu-Glu [Grussenmeyer et al, Proc. Nat’l Acad. Sei. 82: 7952 (1985)]. Usando uma técnica conhecida na prática, um vetor de transferência contendo uma seqüência de nucleotídeos que codifique uma proteína de TACI-imunoglobulina é transformado em E. coli, e triado ·*· quanto aos “bacmids”, os quais contêm um gene lacZ interrompido indicativo de baculovírus recombinante. O DNA de bacmid contendo o genoma do baculovírus recombinante é então isolado usando-se técnicas comuns.

O vetor PFASTBAC ilustrativo pode ser modificado a um grau considerável. Por exemplo, o promotor de poliedrina pode ser removido e substituído pelo promotor da proteína básica de baculovírus (também conhecido como promotor Pcor, p6.9 ou MP), que é expresso mais precocemente na infecção do baculovírus, e foi mostrado ser vantajoso para expressar proteínas secretadas (ver, por exemplo, Hill-Perkins e Possee, J. Gen. Virol. 71: 971 (1990), Bonning et al.,J. Gen. Virol. 75: 1551 (1994), e Chazenbalk e Rapoport, J. Biol. Chem. 270: 1543 (1995). Em tais construções de vetores de transferência, uma versão curta e longa do promotor da proteína básica pode ser usada. Além disso, os vetores de transferência podem ser construídos com seqüências de sinal secretárias derivadas de proteínas de insetos. Por exemplo, uma seqüência de sinal secretária de Ecdisteróides Glicosiltransferase (EGT), Melitina de abelha de mel (Invitrogen Corp; Carlsbad, CA) ou gp67 de baculovírus (PharMingen, San Diego, CA) pode ser usada em tais construções.

O vírus ou bacmid recombinante é usado para transfectar células hospedeiras. Células hospedeiras de inseto adequadas incluem as linhagens celulares derivadas de IPLB-5/^L21, uma linhagem celular ovariana pupal de Spodoptera frugiperda, tal como Sf9 (ATCC CRL 1711), 5/21AE e 5/21 (Invitrogen Corporation; San Diego, CA), bem como células de Schneider-2 de Drosófila, e a linhagem celular HIGH FIVEO (Invitrogen) derivada de Trichoplusia ni (Patente U.S 5.300.435). Os meios isentos de soro comercialmente disponíveis podem ser usadospara cultivar e manter as células. Meios adequados são o SÍ900 II® (Life Technologies) ou o ESF 921® (Expression Systems) para as células Sf9; e Ex-cellO405® (JRH Biosciences, Lenexa, KS) ou Express FiveO® (Life Technologies) para as células T. ni.

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Quando ο vírus recombinante é usado, as células são tipicamente desenvolvidas a partir de uma densidade de inoculação de aproximadamente 2 a 5 x 10⁵ células até uma densidade de 1 a 2 x 10⁶ células, em cujo tempo um estoque viral recombinante é acrescentado em uma multiplicidade de infecções (MOI) de 0,1 a 10, mais tipicamente perto de 3.

Técnicas estabelecidas para produzir proteínas recombinantes em sistemas de baculovírus são providas por Bailey et al., “Manipulation of Baculovírus Vectors” em Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.) páginas 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991) por Patel et al., “The baculovírus expression system” em DNA Cloning 2: Expression Systems, 2~ edição, Glover et al. (eds), páginas 205-244 (Oxford University Press 1995), por Ausubel 1995) às páginas 16-37 a 16-57, por Richardson (ed.), Baculovírus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995), e por Lucknow, “Insect Cell Expression Thecnology” em Protein Engineeering: Principies and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996).

As células fungicas, incluindo as células de levedura, também podem ser usadas para expressar os genes aqui descritos. As espécies de levedura de interesse particular a este respeito incluem Saccharomyces cervisiae, Pichia pastoris e Pichia methanolica. Promotores adequados para expressão em levedura incluem promotores de GAL1 (galactose), PKG (fosfoglicerato cinase), ADH (álcool desidrogenase), AOX1 (álcool oxidase), HIS4 (histidinol desidrogenase) e outros. Muitos vetores de clonagem de levedura foram projetados e são facilmente disponíveis. Um vetor pode ser projetado para gerar construções que utilizem os elementos necessários para realizar a recombinação homóloga na levedura [ver, por exemplo, Raymond et al., BioTechniques 26\ 134 (1999)]. Por exemlo, um tal vetor de expressão pode incluir as sequências URA3 e CEN-ARS (seqüência autonomamente replicante) necessárias para a seleção e replicação em S. cerevisiae. Outros • ·· ···♦ ····

vetores adequados incluem os vetores com base em YIp, tais como o YIp5, vetores YRp, tais como YRpl7, vetores YEp, tais como os vetores YEp 13, e vetores YCp, tais como YCpl9. Métodos para transformar células de S. cerevisiae com DNA exógeno e produzir polipeptídeos recombinantes destas células são apresentados, por exemplo, por Kawasaki, Patente U.S 4.599.311, Kawasaki et al., Patente U.S 4.931.373, Brake, Patente U.S 4.870.008, Welch et al., Patente U.S 5.037.743 e Murray et al., Patente U.S 4.845.075. As células transformadas são selecionadas por fenótipo determinado pelo marcador selecionável, comumente resistência ao medicamento ou a capacidade de crescimento na ausência de um nutriente particular (por exemplo, leucina). Um sistema de vetor adequado para uso em Saccharomyces cerevisiae é o sistema de vetores POTI apresentado por Kawasaki et al. (Patente U.S 4.931.373), o qual permite que as células transformadas sejam selecionadas por cultivo em meio contendo glicose. Promotores e terminadores adicionais adequados para uso em levedura incluem aqueles dos genes de enzimas glicolíticas (ver, por exemplo, Kawasaki, Patente U.S 4.599.311, Kingsman et al., Patente U.S 4.615.974, e Bitter, Patente U.S 4.977.092) egenes de álcool desidrogenase. Ver também as Patentes U.S. n~ 4.990.446, 5.063.154, 5.139.936 e 4.661.454.

Os sistemas de transformação para outras leveduras, incluindo Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii e Candida maltosa, são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459 (1986) e Cregg, Patente U.S 4.882.279. As células de Aspergillus podem ser utilizadas em conformidade com os métodos de McKnight et al., Patente U.S 4.935.349. Métodos para transformar Acremonium chrysogenum são apresentados por Sumino et al., Patente U.S 5.162.228. Métodos para transformar Neurospora são apresentados por Lambowitz, Patente U.S

• · ·· ···

4.486.533.

Por exemplo, o uso de Pichia methanolica como hospedeiro para a produção de proteínas recombinantes é apresentado por Raymond, Patente U.S 5.716.808, Raymond, Patente U.S 5.736.383, Raymond et al., Yeast 14\ 11-23 (1998), e nas publicações internacionais n— WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 e WO 98/02565. As moléculas de DNA para uso em transformar P. methanolica comumente serão preparadas como plasmídeos circulares de filamento duplo, que são preferivelmente linearizados antes da transformação. Para a produção de polipeptídeos em P. methanolica, o promotor e o terminador no plasmídeo podem ser aqueles de um gene de P. methanolica, tal como um gene de utilização de álcool de P. methanolica (AUG1 ou AUG2). Outros promotores úteis incluem aqueles dos genes da diidroxiacetona sintase (DHAS), da formiato desidrogenase (FMD), e da catalase (CAT). Para facilitar a integração do DNA no cromossoma hospedeiro, é preferível ter o segmento de expressão inteiro do plasmídeo flanqueado em ambas as extremidades pelas seqüências de DNA do hospedeiro. Um marcador selecionável adequado para uso em Pichia methanolica é um gene ADE2 de P. methanolica, que codifique a fosforribosil-5-aminoimidazol carboxilase (AIRC; EC 4.1.1.21), e que permita que as células hospedeiras ade2 cresçam na ausência de adenina. Para processos industriais de larga escala em que seja desejável minimizar o uso do metanol, as células hospedeiras podem ser usadas, nas quais ambos os genes de utilização do metanol (AUG1 e AUG2) são deletados. Para a produção de proteínas secretadas, as células hospedeiras podem ser deficientes em genes de proteases vacuolares (PEP4 e PRB1). A eletroporação é usada para facilitar a introdução de um plasmídeo contendo DNA codificando um polipeptídeo de interesse em células de P. methanolica. As células de P. methanolica pode ser transformadas por eletroporação usando um campo elétrico pulsado de decaimento exponencial tendo uma intensidade de campo

de 2,5 a 4,5 kV/cm, preferivelmente de cerca de 3,75 kV/cm, e uma constante de tempo (t) de 1 a 40 milissegundos, mais preferivelmente de cerca de 20 milissegundos.

Os vetores de expressão também podem ser introduzidos nos protoplastos de plantas, nos tecidos intactos de plantas, ou nas células isoladas de plantas. Métodos para introduzir vetores de expressão no tecido de plantas incluem a infecção direta ou a co-cultura do tecido da planta com Agrobacterium tumefaciens, a liberação mediada por microprojéteis, a injeção de DNA, a eletroporação, e outros. Ver, por exemplo, Horsch et al., Science 227\ ΥΏ& (1985), Klein et al., Biotechnology 10: 268 (1992), e Miki et al., “Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants”, em Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (eds.), páginas 67-88 (CRC Press, 1993).

Altemativamente, as proteínas de TACI-imunoglobulina podem ser produzidas em células hospedeiras procarióticas. Promotores adequados que podem ser usados para produzir os polipeptídeos de TACIimunoglobulina em um hospedeiro procariótico são bem conhecidos daqueles versados na técnica, e incluem promotores capazes de reconhecer as T4, T3, Sp6 e T7 polimerases, os promotores P_R e P_L do bacteriófago lambda, os promotores trp, recA, choque térmico, lacUV5, tac, Ipp-lacSpr, phoA e lacZ de E. coli, os promotores de B. subtilis, os promotores dos bacteriófagos de Bacillus, os promotores de Streptomyces, o promotor int do bacteriófago lambda, o promotor bla de pBR322, e o promotor CAT do gene de cloranfenicol acetil transferase. Os promotores procarióticos foram examinados por Glick, J. Ind. Microbiol. 1: 277 (1987), Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4~ Ed. (Benjamin Cummins 1987), e por Ausubel et al. (1995).

Hospedeiros procarióticos adequados incluem E. coli e Bacillus subtilus. Cepas adequadas de E. coli incluem BL21(DE3),

···

BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF, DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451 e ER1647 [ver, por exemplo, Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)]. Cepas adequadas de Bacillus subtilus incluem BR151, YB886, MI 119, MI 120 e BI70 [ver, por exemplo, Hardy, “Bacillus Cloning Methods”, em DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)].

Quando expressando uma proteína de TACI-imunoglobulina em bactérias tais como E. coli, o polipeptídeo pode ficar retido no citoplasma, tipicamente como grânulos insolúveis, ou pode ser dirigido ao espaço periplasmático por uma seqüência de secreção bacteriana. No caso anterior, as células são lisadas e os grânulos são recuperados e desnaturados usando-se, por exemplo, isotiocianato de guanidina ou uréia. O polipeptídeo desnaturado pode então ser reduplicado e dimerizado mediante diluição do desnaturante, tal como por diálise em relação a uma solução de uréia e uma combinação de glutationa reduzida e oxidada, seguida por diálise em relação a uma solução salina tamponada. No último caso, o polipeptídeo pode ser recuperado do espaço periplasmático em uma forma solúvel e funcional pela disrupção das células (por exemplo, porsonicação ou choque osmótico) para liberar os conteúdos do espaço periplasmático e recuperar a proteína, dessa forma removendo a necessidade de desnaturaão e reduplicação.

Os métodos para expressar proteínas em hospedeiros procarióticos são bem conhecidos daqueles habilitados na técnica [ver, por exemplo, Williams et al., “Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies”, em DNA Cloning 2: Expression Systems, 2~ Edição, Glover et al. (eds.), página 15 (Oxford University Press 1995, Ward et al., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies”, em Monoclonal Antibodies: Principies and

Applications, página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995), e Georgiou, “Expression of Protein in Bactéria” em Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et al. (eds.), página 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)].

Métodos padrão para introduzir vetores de expressão em células bacterianas, de levedura, de inseto e de plantas, são fornecidos, por exemplo, por Ausubel (1995).

Métodos gerais para expressar e recuperar proteína estranha produzida por um sistema de célula de mamífero são fornecidos, por exemplo, por Etcheverry, “Expression of Engineered Proteins em Mammalian Cell Culture,” em Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996). Técnicas padrão para recuperar a proteína produzida por um sistema bacteriano são fornecidas, por exemplo, por Grisshammer et al., “Purification of over-produced proteins from E. coli cells,” em DNA Cloning 2: Expression Systems, 2^a Edição, Glover et al. (eds.), páginas 59 a 92 (Oxford University Press 1995). Métodos estabelecidos para isolar proteínas recombinantes a partir de um sistema de baculovírus são descritos por Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995).

Como uma alternativa, os polipeptídeos da presente invenção podem ser sintetizados pela síntese de fase sólida exclusiva, métodos de fase sólida parcial, condensação de fragmento ou síntese em solução clássica. Estes métodos de síntese são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica (ver, por exemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963), Stewart et al., “Solid Phase Peptide Synthesis” (2^a Edição), (Pierce Chemical Co. 1984), Bayer e Rapp, Chem. Pept. Prot. 3: 3 (1986), Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989), Fields e Colowick, “Solid-Phase Peptide Synthesis,” Methods em Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997), e Lloyd-Williams et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc.

1997)). Variações nas estratégias de síntese química total, tais como a “ligação química nativa” e a “ligação de proteína expressada” também são padrões (ver, por exemplo, Dawson et al., Science 266: 776 (1994), Hackeng et al., Proc. Nat’l Acad. Sei. USA 94: 7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol. 287: 34 (1997), Muir et al, Proc. Nat’l Acad. Sei. USA 95: 6705 (1998), e Severinov e Muir, J. Biol. Chem. 273: 16205 (1998)).

5. Ensaios para Proteínas de Fusão de TACIImunoglobulina

A função das proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina pode ser examinada usando uma variedade de métodos para avaliar a capacidade das proteínas de fusão para ligar ZTNF4 ou ZTNF2. Como uma ilustração, o Exemplo 4 fornece métodos para medir a afinidade de ligação e a capacidade de ligação de ZTNF4.

Altemativamente, as proteínas de fusão de TACIimunoglobulina podem ser caracterizadas pela capacidade para inibir o estímulo de células B humanas pelo ZTNF4 solúvel, como descrito por Gross et al., publicação internacional N^s WO 00/40716. Em resumo, as células B humanas são isoladas a partir de células mononucleares do sangue periférico usando pérolas magnéticas CD 19 e o sistema de separação magnética VarioMacs (Miltenyi Biotec Aubum, CA) de acordo com as instruções do fabricante. As células B purificadas são misturadas com ZTNF4 solúvel (25 ng/ml) e IL-4 humana recombinante (10 ng/ml Pharmingen) e as células são colocadas em placa em placas de 96 reservatórios de fundo redondo a 1 x 10⁵células por reservatório.

As proteínas TACI-imunoglobulina solúveis podem ser diluídas de cerca de 5 μg/ml a cerca de 6 ng/ml e incubadas com as células B durante cinco dias, pulsando durante a noite no quarto dia com 1 pCi de ³Htimidina por reservatório. Como um controle, a proteína TACIimunoglobulina também pode ser incubada com células B e IL-4, sem

• * «·« ·»ί·

ZTNF4. As placas são colhidas usando a colhedora de placa Packard e contadas usando a leitora Packard.

Este método geral foi usado para examinar três proteínas de fusão TACI-Fc. Embora todas as proteínas de fusão inibissem a proliferação de célula B, construções TACI (d 1-29, dl 11-154)-Fc5 e TACI (dl-29, d 120154)-Fc5 foram mais potentes do que a TACI (dl-29, dlO7-154)-Fc5.

Modelos de animal bem estabelecidos estão disponíveis para testar em vivo a eficácia de proteínas TACI-imunoglobulina em certos estados de doença. Por exemplo, as proteínas TACI-imunoglobulina podem ser testadas em vários modelos de animal de doença autoimune, tais como as cepas de camundongo congênito MKL-lpfllpr ou NZB x NZW Fl, que servem como um modelo de SLE (lúpus eritematoso sistêmico). Tais modelos de animal são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Cohen e Miller (Eds.), Autoimmune Disease Models: A Guidebook (Academic Press, Inc. 1994).

A progênie de um cruzamento entre camundongos New Zealand Black (NZB) e New Zealand White (NZW) desenvolve uma forma espontânea de SLE que estreitamente se parece com a SLE em seres humanos. Os camundongos da progênie, conhecidos como NZBW começam a desenvolver autoanticorpos IgM contra células T em 1 mês de idade e pelos 5 a 7 meses de idade, os autoanticorpos anti-DNA são a imunoglobulina dominante. A hiperatividade de célula B policlonal leva à super produção de autoanticorpos. A deposição destes autoanticorpos, particularmente aqueles direcionados contra o DNA de filamento único está associada com o desenvolvimento da glomeruloneffite, que se manifesta clinicamente como proteinúria, azotemia e morte a partir da insuficiência renal.

A insuficiência renal é a causa principal da morte em camundongos afetados com a SLE espontânea e na cepa NZBW, este processo é crônico e obliterativo. A doença é mais rápida e grave em fêmeas do que em machos, com sobrevivência média de apenas 245 dias quando ···* • · comparado a 406 dias para os machos. Embora muitos dos camundongos fêmea serão sintomáticos (proteinúria) em 7 a 9 meses de idade, alguns podem ser mais jovens ou mais velhos quando eles desenvolvem sintomas. A nefrite imune fatal observada nos camundongos NZBW é muito similar à glomerulonefrite observada na SLE humana, tomando este modelo de murino espontâneo muito atraente para o teste dos produtos terapêuticos SLE potenciais. (Putterman e Naparstek, “Murine Models of Spontaneous Systemic Lupus Erythematosus,” em Autoimmune Disease Models: A Guidebook, páginas 217 a 234 (Academic Press, Inc., 1994); Mohan et al., J. Immunol. 154: 1470 (1995); e Daikh et al., J. Immunol. 159: 3104 (1997)).

Como descrito por Gross et al., publicação internacional N²WO 00/40716, as proteínas TACI-imunoglobulina podem ser administradas aos camundongos NZBW para monitorar o seu efeito supressivo sobre as células B no período de cinco semanas quando acredita-se que, em média, a produção de autoanticorpo célula B esteja em níveis altos nos camundongos NZBW. Em resumo, 100 camundongos fêmeas de 8 semanas de idade (NZB x NZW)F1 podem ser divididos em seis grupos de 15 camundongos. Antes do tratamento, os camundongos são monitorados uma vez ao mês quanto proteína na urina e o sangue é retirado para a construção de bancos de CBC e soro. O soro pode ser triado quanto a presença de autoanticorpos. Porque a proteinúria é o sinal característico da glomerulonefrite, os níveis de proteína na urina são monitorados por vareta medidora em intervalos regulares durante o curso do estudo. O tratamento pode começar quando os camundongos estão com aproximadamente cinco meses de idade. Os camundongos recebem injeções intraperitoneais apenas de veículo (solução salina tamponada com fosfato) ou TACI-imunoglobulina humana (proteína de controle) ou proteína TACI-imunoglobulina (por exemplo, 20 a 100 pg da proteína de teste por dose) três vezes por semana durante cinco semanas.

O sangue é coletado duas vezes durante o tratamento e será

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coletado pelo menos duas vezes a seguir do tratamento. Os valores da vareta medidora de urina para proteinúria e os pesos corpóreos são determinados a cada duas semanas depois que o tratamento começa. O sangue, o valor da vareta medidora de urina e o peso corpóreo são coletados no momento da eutanásia. O baço e o timo são divididos para a análise de classificação de célula ativada fluorescente e histologia. As glândulas salivares submandibulares, a cadeia de linfonodo mesentérico, o lobo hepático com a vesícula biliar, o ceco e o intestino grosso, o estômago, o intestino delgado, o pâncreas, o rim direito, a glândula adrenal, a língua com a traquéia e o esôfago, o coração e os pulmões também são coletados para a histologia.

Os modelos de murino para a encefalomielite alérgica experimental foram usados como uma ferramenta para investigar tanto os mecanismos da doença mediada por imune quanto os métodos de intervenção terapêutica potencial. O modelo se parece com a esclerose múltipla humana e produz a desmielinização como um resultado da ativação da célula T para neuroproteínas tais como a proteína básica da mielina ou proteína proteolipídica. A inoculação com antígeno leva à indução de células T restritas à MHC da classe II (Thl) CD4+. Mudanças no protocolo para a encefalomielite alérgica experimental pode produzir variantes de transferência aguda, recorrente crônica ou passiva do modelo (Weinberg et al., J. Immunol. 162: 1818 (1999); Mijaba et al., Cell. Immunol. 186: 94 (1999); e Glabinski, Meth. Enzym. 288: 182 (1997)).

Gross et al., publicação internacional N^s WO 00/40716, descreve um método para avaliar a eficácia de proteínas TACIimunoglobulina na melhora de sintomas associados com a encefalomielite alérgica experimental. Em resumo, a 25 camundongos fêmeas PLxSJL F1 (12 semanas de idade) são é administrada uma injeção subcutânea de 125 pg/camundongo de antígeno (Proteína Protelipídica de mielina, PLP, resíduos 139 a 151), formulada em Adjuvante de Freund completo. Os camundongos

··

são divididos em cinco grupos de cinco camundongos. Injeções intraperitoneais da toxina da coqueluche (400 ng) são administradas nos Dias 0 e 2. Os grupos são administrados com uma dose de lx, lOx ou lOOx da proteína TACI-imunoglobulina, um grupo receberá apenas veículo e um grupo não receberá nenhum tratamento. A terapia de prevenção começa no Dia 0, a terapia de intervenção começa no dia 7 ou no início dos sinais clínicos. Os sinais de doença, a perda de peso e a paralisia manifestam-se em aproximadamente 10 a 14 dias e duram por cerca de uma semana. Os animais são avaliados diariamente coletando-se os pesos corpóreos e avaliando-se uma pontuação clínica que corresponde ao grau de seus sintomas. Os sinais clínicos de encefalomielite alérgica experimental aparecem dentro de 10 a 14 dias de inoculação e persistem durante aproximadamente uma semana. No final do estudo, todos os animais são submetidos à eutanásia por dose excessiva de gás e necropsiados. O cérebro e a coluna espinhal são coletados para a histologia ou congelados para a análise de mRNA. Os dados de peso corpóreo e pontuação clínica são plotados por indivíduo e por grupo.

No modelo da artrite induzida pelo colágeno, camundongos desenvolvem a artrite inflamatória crônica, que estreitamente se parece com a artrite reumatóide humana (RA). Visto que a artrite induzida pelo colágeno compartilha características imunológicas e patológicas similares com a artrite reumatóide, isto a toma um modelo ideal para triar compostos antiinflamatórios humanos potenciais. Uma outra vantagem no uso do modelo de artrite induzida pelo colágeno é que os mecanismos de patogênese são conhecidos. Os epítopos de célula T e B no colágeno do tipo II foram identificados e vários parâmetros imunológicos (hipersensibilidade do tipo retardado e anticorpo anti-colágeno) e inflamatórios (citocinas, quimiocinas e enzimas que degradam matriz) que dizem respeito à artrite mediada por imune foram determinados e podem ser usados para avaliar a eficácia do composto de teste nos modelos. (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3: 407 (1999);

• ·

Williams et al., Immunol. 89: 9784 (1992); Myers et al., Life Sei. 61: 1861 (1997); e Wang et al., Immunol. 92: 8955 (1995)).

Gross et al., publicação internacional N^fi WO 00/40716, descreve um método para avaliar a eficácia de proteínas TACIimunoglobulina na melhora de sintomas associados com a artrite induzida pelo colágeno. Em resumo, camundongos DBA/1J machos de oito semanas de idade (Jackson Labs) são divididos em grupos de cinco camundongos/grupo e são administrados com duas injeções subeutâneas de 50 a 100 μΐ de colágeno a 1 mg/ml (origem de pinto ou bovina), em intervalos de três semanas. Um controle não recebe as injeções de colágeno. A primeira injeção é formulada em Adjuvante de Freund Completo e a segunda injeção é formulada em Adjuvante de Freund Incompleto. A proteína TACI-imunoglobulina é administrada profilaticamente junto ou antes da segunda injeção ou depois que o animal desenvolve uma pontuação clínica de dois ou mais que persista pelo menos 24 horas. Os animais começam a apresentar sintomas de artrite a seguir da segunda injeção de colágeno, usualmente dentro de duas a três semanas. Por exemplo, TACI-Fc, uma proteína de controle, IgFc humana ou solução salina tamponada com fosfato (veículo) podem ser administradas profilaticamente começando sete dias antes da segunda injeção (dia 7). As proteínas podem ser administradas a 100 pg, administradas três vezes por semana como uma injeção intraperitoneal de 200 μΐ e continuada durante quatro semanas.

No modelo de artrite induzida pelo colágeno, o grau da doença é avaliado em cada pata usando um calibre para medir a espessura da pata e avaliar uma pontuação clínica para cada pata. Por exemplo, uma pontuação clínica de “0” indica um camundongo normal, uma pontuação de “1” indica que um ou mais dedos do pé estão inflamados, uma pontuação de “2” indica inflamação da pata branda, uma pontuação de “3” indica inflamação da pata moderada e uma pontuação de “4” indica inflamação da pata grave. Os • · animais são submetidos à eutanásia depois que a doença foi estabelecida por um período estabelecido de tempo, usualmente sete dias. As patas são coletadas para a histologia ou análise de mRNA e o soro é coletado para os ensaios de imunoglobulina e citocina.

A miastenia grave é uma outra doença autoimune para a qual os modelos de murino estão disponíveis. A miastenia grave é um distúrbio de transmissão neuromuscular envolvendo a produção de autoanticorpos direcionados contra o receptor nicotínico da acetilcolina. Esta doença é adquirida ou herdada com características clínicas que incluem fraqueza e fadiga anormais no esforço.

Um modelo de murino de miastenia grave foi estabelecido. (Christadoss et al., “Establishment of a Mouse Model of Myasthenia gravis Which Mimics Human Myasthenia gravid Pathogenesis for Immune Intervention,” em Immunobiology of Proteins and Peptides VIII, Atassi e Bixler (Eds.), páginas 195 a 199 (1995)). A miastenia grave experimental autoimune é uma doença mediada por anticorpo caracterizada pela presença de anticorpos para o receptor de acetilcolina. Estes anticorpos destroem o receptor levando aos impulsos elétricos neuromusculares defeituosos, que resultam em fraqueza muscular. No modelo da miastenia grave experimental autoimune, os camundongos são imunizados com o receptor nicotínico da acetilcolina. Os sinais clínicos da miastenia grave tomam-se evidentes semanas depois da segunda imunização. A miastenia grave experimental autoimune é avaliada por diversos métodos incluindo a medição de níveis séricos dos anticorpos do receptor de acetilcolina pelo radioimunoensaio (Christadoss e Dauphinee, J. Immunol. 136: 2437 (1986); Lindstrom et al., Methods Enzymol. 74: 432 (1981)), a medição do receptor de acetilcolina muscular ou eletromiografia (Coligan et al. (Eds.), Protocols in Immunology. Vol. 3, página 15.8.1 (John Wiley & Sons, 1997)).

O efeito da TACI-imunoglobulina na miastenia grave • · experimental autoimune pode ser determinado administrando-se proteínas de fusão durante o progresso da miastenia grave clínica em camundongos B6. Por exemplo, 100 camundongos B6 são imunizados com 20 pg de receptor de acetilcolina em Adjuvante de Freund Completo nos dias 0 e 30. Aproximadamente 40 a 60 % dos camundongos desenvolverão a miastenia grave clínica de moderada (grau 2) a grave (grau 3) depois do reforço com o receptor de acetilcolina. Camundongos com a doença clínica de grau 2 e 3 são divididos em três grupos (com graus iguais de fraqueza) e pesados (camundongos com fraqueza também perdem peso, visto que eles têm dificuldade em consumir alimento e água) e sangrados quanto ao soro (para nível de anticorpo anti-receptor de acetilcolina e isotipo no pré tratamento). O grupo A é injetado I.P. com solução salina tamponada com fosfato, o grupo B é injetado intraperitonealmente com IgG-Fc humana como uma proteína de controle (100 pg) e o grupo C é injetado com 100 pg de TACI-Fc três vezes por semana durante quatro semanas. Os camundongos são triados quanto a fraqueza muscular clínica duas vezes na semana e pesados e sangrados quanto ao soro 15 e 30 dias depois do começo do tratamento. O sangue integral é coletado no dia 15 para determinar a relação de célula T/B pela análise de classificação de célula ativada por fluorescência usando marcadores B220 e CD5. Os camundongos sobreviventes são mortos 30 a 45 dias depois do início do tratamento e as suas carcassas são congeladas para a extração posterior do receptor de acetilcolina muscular para determinar a perda de receptor de acetilcolina muscular, a patologia primária em miastenia grave (ver, por exemplo, Coligan et al. (Eds.), Protocols in Immunology. Vol. 3, página 15.8.1 (John Wiley & Sons, 1997)).

Os anticorpos séricos para o receptor de acetilcolina muscular de camundongo podem ser determinados por um radioimunoensaio estabelecido e isotipos de anticorpo do anti-receptor de acetilcolina (IgM, IgGl, IgG2b e IgG2c) é medidos pelo ELISA. Tais métodos são conhecidos.

• ·

Os efeitos da TACI-imunoglobulina na miastenia grave clínica adiantada, o nível de anticorpo anti-receptor de acetilcolina e de isotipo e a perda de receptor de acetilcolina muscular são determinados.

Aproximadamente 100 camundongos podem ser imunizados com 20 pg de receptor de acetilcolina em Adjuvante de Freund Completo nos dias 0 e 30. Os camundongos com miastenia grave clínica são divididos em quatro grupos. O grupo A é injetado intraperitonealmente com 100 pg de Fc de controle, o grupo B é injetado com 20 pg de Fc de controle, o grupo C é injetado com 100 pg de TACI-Fc e o grupo D é injetado com 20 pg de TACIFc três vezes por semana durante quatro semanas. Os camundongos são pesados e sangrados quanto ao soro antes e 15 e 30 dias depois do início do tratamento. O soro é testado quanto ao anticorpo anti-receptor de acetilcolina e isotipos como descrito acima. A perda do receptor de acetilcolina muscular também pode ser medida.

Outros ensaios adequados de proteínas de fusão de TACIimunoglobulina podem ser determinados por aqueles de habilidade na técnica.

6. Produção de Conjugados de TACI-imunoglobulina

A presente invenção inclui composições de TACIimunoglobulina quimicamente modificadas, em que um polipeptídeo de TACI-imunoglobulina é ligado com um polímero. Tipicamente, o polímero é solúvel em água de modo que o conjugado TACI-imunoglobulina não precipite em um ambiente aquoso, tal como um ambiente fisiológico. Um exemplo de um polímero adequado é um que foi modificado para ter um grupo reativo único, tal como um éster ativo para a acilação ou um aldeído para a alquilação. Deste modo, o grau de polimerização pode ser controlado. Um exemplo de um aldeído reativo é o propionaldeído de polietileno glicol ou derivados de mono alcóxi (Ci-Ci₀) ou arilóxi deste (ver, por exemplo, Harris, et al., Patente U.S 5.252.714). O polímero pode ser ramificado ou não ramificado. Além disso, uma mistura de polímeros pode ser usada para • · ·» produzir conjugados de TACI-imunoglobulina.

Os conjugados de TACI-imunoglobulina usados para terapia podem compreender porções poliméricas solúveis em água farmaceuticamente aceitáveis. Os polímeros solúveis em água adequados incluem, polietileno glicol (PEG), monometóxi-PEG, mono-alcóxi (CjCio)PEG, arilóxi-PEG, poli-(N-vinil pirrolidona)PEG, tresil monometóxi PEG, PEG propionaldeído, carbonato de bis-sucinimidila PEG, homopolímeros de propileno glicol, um copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico, dextrano, celulose ou outros polímeros com base em carboidrato. PEG adequados podem ter um peso molecular de cerca de 600 a cerca de 60.000, incluindo, por exemplo, 5.000, 12.000, 20.000 e 25.000. Um conjugado de TACIimunoglobulina também pode compreender uma mistura de tais polímeros solúveis em água.

Um exemplo de um conjugado de TACI-imunoglobulina compreende uma porção de TACI-imunoglobulina e uma porção de óxido de polialquila ligada ao término N da TACI-imunoglobulina. O PEG é um óxido de polialquila adequado. Como uma ilustração, a TACI-imunoglobulina pode ser modificada com PEG, um processo conhecido como “PEGuilação.” A PEGuilação da TACI-imunoglobulina pode ser realizada por qualquer uma das reações de PEGuilação conhecidas na técnica (ver, por exemplo, a EP 0 154 316, Delgado et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249 (1992), Duncan e Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27: 290 (1994) e Francis et al., Int J Hematol 68: 1 (1998)). Por exemplo, a PEGuilação pode ser realizada por uma reação de acilação ou por uma reação de alquilação com uma molécula de polietileno glicol reativa. Em um método alternativo, os conjugados de TACI-imunoglobulina são formados pela condensação de PEG ativado, em que um grupo hidróxi ou amino terminal de PEG foi substituído por um ligador ativado (ver, por exemplo, Karasiewicz et • · al., Patente U.S 5.382.657).

A PEGuilação pela acilação tipicamente requer reagir um derivado de éster ativo de PEG com um polipeptídeo de TACIimunoglobulina. Um exemplo de um éster de PEG ativado é PEG esterificado a N-hidroxissuccinimida. Como aqui usado, o termo “acilação” inclui os seguintes tipos de ligações entre a TACI-imunoglobulina e um polímero solúvel em água: amida, carbamato, uretano e outros. Os métodos para preparar a TACI-imunoglobulina PEGuilada pela acilação compreenderá tipicamente as etapas de (a) reagir um polipeptídeo de TACI-imunoglobulina com PEG (tal como um éster reativo de um derivado de aldeído de PEG) sob condições por meio das quais um ou mais grupos PEG se ligam à TACIimunoglobulina e (b) obter o(s) produto(s) de reação. No geral, as condições de reação ótimas para as reações de acilação serão determinadas com base em parâmetros conhecidos e resultados desejados. Por exemplo, quanto maior a relação de PEG:TACI-imunoglobulina, maior a porcentagem de produto de TACI-imunoglobulina poliPEGuilada.

O produto da PEGuilação pela acilação é tipicamente um produto de TACI-imunoglobulina poliPEGuilado, em que os grupos de lisina ε-amino são PEGuilados por intermédio de um grupo de ligação de acila. Um exemplo de uma ligação conectora é uma amida. Tipicamente, a TACIimunoglobulina resultante será pelo menos 95 % mono, di ou tri-PEGuilada, embora algumas espécies com graus mais altos de PEGuilação possam ser formados dependendo das condições de reação. As espécies PEGuiladas podem ser separadas dos polipeptídeos de TACI-imunoglobulina não conjugados usando métodos de purificação padrão, tais como diálise, ultrafiltração, cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade e outros.

A PEGuilação pela alquilação no geral envolve reagir um derivado de aldeído terminal de PEG com TACI-imunoglobulina na presença • · *··· ·· ·«

de um agente redutor. Grupos PEG pode ser ligados ao polipeptídeo por intermédio de um grupo -CH₂-NH.

A derivatização por intermédio da alquilação redutiva para produzir um produto monoPEGuilado leva a vantagem da reatividade diferencial de tipos diferentes de grupos amino primários disponíveis para a derivatização. Tipicamente, a reação é realizada em um pH que permite que se tire vantagem das diferenças do pKa entre os grupos ε-amino dos resíduos de lisina e o grupo α-amino do resíduo de terminal N da proteína. Pela tal derivatização seletiva, a ligação de um polímero solúvel em água que contenha um grupo reativo tal como um aldeído, a uma proteína é controlada. A conjugação com o polímero ocorre predominantemente no término N da proteína sem modificação significante de outros grupos reativos tais como os grupos amino da cadeia lateral de lisina. A presente invenção fornece uma preparação substancialmente homogênea de conjugados monopoliméricos de TACI-imunoglobulina.

A alquilação redutiva para produzir uma população substancialmente homogênea de molécula conjugada de TACIimunoglobulina monopolimérica pode compreender as etapas de: (a) reagir um polipeptídeo de TACI-imunoglobulina com um PEG reativo sob condições de alquilação redutiva em um pH adequado para permitir a modificação seletiva do grupo α-amino no término amino da TACIimunoglobulina e (b) obter o(s) produto(s) de reação. O agente redutor usado para a alquilação redutiva deve ser estável em solução aquosa e capaz de reduzir apenas a base de Schiff formada no processo inicial da alquilação redutiva. Agentes redutores ilustrativos incluem boroidreto de sódio, cianoboroidreto de sódio, dimetilamina borano, trimetilamina borano e piridino borano.

Para uma população substancialmente homogênea de conjugados de TACI-imunoglobulina monopoliméricos, as condições de • 9 • · • ·« «* V · 9 reação de alquilação redutiva são aquelas que permitem a ligação seletiva da porção polimérica solúvel em água ao término N da TACI-imunoglobulina. tais condições de reação no geral fornecem diferenças de pKa entre os grupos amino da lisina e o grupo α-amino no término Ν. O pH também afeta a relação de polímero para proteína a ser usada. No geral, se o pH é mais baixo, um excesso maior de polímero para proteína será desejado porque quanto menos reativo o grupo ct do terminal N, mais polímero é necessário para se obter as condições ótimas. Se o pH é mais alto, a relação polímero:TACIimunoglobulina não precisa ser tão grande porque mais grupos reativos estão disponíveis. Tipicamente, o pH cairá dentro da faixa de 3 a 9 ou 3 a 6.

Um outro fator a considerar é o peso molecular do polímero solúvel em água. No geral, quanto maior o peso molecular do polímero, menor o número de moléculas poliméricas que podem ser ligadas à proteína. Para as reações de PEGuilação, o peso molecular típico é de cerca de 2 kDa a cerca de 100 kDa, de cerca de 5 kDa a cerca de 50 kDa ou de cerca de 12 kDa a cerca de 25 kDa. A relação molar de polímero solúvel em água para TACIimunoglobulina no geral estará na faixa de 1:1 a 100:1. Tipicamente, a relação molar de polímero solúvel em água para TACI-imunoglobulina será de 1:1 a 20:1 para a poliPEGuilação e de 1:1 a 5:1 para a monoPEGuilação.

Os métodos gerais para produzir conjugados que compreendam um polipeptídeo e porções poliméricas solúveis em água são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Karasiewicz et al., Patente U.S 5.382.657, Greenwald et al., Patente U.S 5.738.846, Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther. 59: 636 (1996), Monkarsh et al., Anal. Biochem. 247: 434 (1997)).

A presente invenção considera composições que compreendem um peptídeo ou polipeptídeo aqui descrito. Tais composições podem ainda compreender um carregador. O carregador pode ser um carregador orgânico ou inorgânico convencional. Os exemplos de carregadores incluem água, ««·« w·.^· solução tampão, álcool, propileno glicol, macrogol, óleo de gergelim, óleo de milho e outros.

7. Isolação de Polipeptídeos TACI-imunoglobulina

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificados até pelo menos cerca de 80 % de pureza, até pelo menos cerca de 90 % de pureza, até pelo menos cerca de 95 % de pureza ou mais do que 95 % de pureza com respeito às macromoléculas contaminantes, particularmente outras proteínas e ácidos nucleicos e livre de agentes infecciosos e pirogênicos. Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser purificados até um estado farmaceuticamente puro, que é maior do que 99,9 % puro. Em certas preparações, o polipeptídeo purificado é substancialmente livre de outros polipeptídeos, particularmente outros polipeptídeos de origem animal.

O ffacionamento e/ou métodos de purificação convencionais podem ser usados para se obter preparações de polipeptídeos de TACIimunoglobulina sintéticos e polipeptídeos de TACI-imunoglobulina recombinantes purificados a partir de células hospedeiras recombinantes. No geral, a precipitação com sulfato de amônio e a extração ácida ou caotrópica podem ser usadas para o ffacionamento de amostras. As etapas de purificação exemplares podem incluir a hidroxiapatita, exclusão por tamanho, FPLC e cromatografia líquida de fase reversa de alto desempenho. Os meios cromatográficos adequados incluem dextranos derivatizados, agarose, celulose, poliacrilamida, sílicas de especialidade e outros. Os derivados de PEI, DEAF, QAE e Q são adequados. Os meios cromatográficos exemplares incluem aqueles meios derivatizados com grupos fenila, butila ou octila, tais como Fenil-Sefarose FF (Pharmacia), Toyopearl butil 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octil-Sefarose (Pharmacia) e outros; ou resinas poliacrílicas, tais como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) e outros. Os suportes sólidos adequados incluem pérolas de vidro, resinas com base em

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Λ ♦ · *·· · * ·3» • · sílica, resinas celulósicas, pérolas de agarose, pérolas de agarose reticuladas, pérolas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticuladas e outros que são insolúveis sob as condições em que elas devam ser usadas. Estes suportes podem ser modificados com grupos reativos que permitem a ligação de proteínas pelos grupos amino, grupos carboxila, grupos sulfidrila, grupos hidroxila e/ou porções de carboidrato.

Os exemplos das químicas de ligação incluem a ativação de brometo de cianogênio, ativação de N-hidroxissuccinimida, ativação de epóxido, ativação sulfidrila, ativação de hidrazida e carboxila e derivados de amino para as químicas de ligação de carbodiimida. Estes e outros meios sólidos são bem conhecidos e amplamente usados na técnica e são disponíveis de fornecedores comerciais. A seleção de um método particular para a isolação e purificação de polipeptídeo é uma questão de planejamento de rotina e é determinada em parte pelas propriedades do suporte escolhido. Ver, por exemplo, Affinity Chromatography: Principies & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988) e Doonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996).

Variações adicionais na isolação e purificação da TACIimunoglobulina podem ser planejadas por aqueles de habilidade na técnica. Por exemplo, anticorpos anti-TACI ou anti-Fc podem ser usados para isolar quantidades grandes de proteína pela purificação de imunoafinidade.

Os polipeptídeos da presente invenção também podem ser isolados pela exploração de propriedades particulares. Por exemplo, a cromatografia de adsorção de íon metálico imobilizado (IMAC) pode ser usada para purificar proteínas ricas em histidina, incluindo aqueles que compreendem rótulos de poliistidina. Em resumo, um gel é primeiro carregado com íons metálicos bivalentes para formar um quelato (Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1 (1985)). As proteínas ricas em histidina serão adsorvidas por esta matriz com afinidades diferentes, dependendo do íon

• · • · »· ·· ·· ·· • · · · · · * · · ·· ·· » · · • · · ·· ·· · · metálico usado e será eluída pela elução competitiva, pela diminuição do pH ou uso de agentes queladores fortes. Outros métodos de purificação incluem a purificação de proteínas glicosiladas pela cromatografia de afinidade de lectina, a cromatografia de proteína A e cromatografia de troca iônica (M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol. 182: 529 (1990)).

Os polipeptídeos de TACI-imunoglobulina ou fragmentos destes também podem ser preparados através da síntese química, como descrito acima. Os polipeptídeos de TACI-imunoglobulina podem ser monômeros ou multímeros; glicosilados ou não glicosilados; PEGuilados ou não PEGuilados; e podem ou não incluir um resíduo de aminoácido de metionina inicial. Uma proteína de fusão de TACI-imunoglobulina pode ser não glicosilada, glicosilada ou glicosilada apenas na porção ou na porção da imunoglobulina. A porção da imunoglobulina pode ser obtida a partir de um anticorpo humano, um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado.

8. Usos Terapêuticos de Polipeptídeos de TACIimunoglobulina

As proteínas de TACI-imunoglobulina podem ser usadas para modular o sistema imune pela ligação de ZTNF4 ou ZTNF2 e assim, impedir a ligação destes ligandos com receptores TACI ou BCMA endógenos. Consequentemente, a presente invenção inclui o uso de proteínas TACIimunoglobulina em um paciente, que careça de uma quantidade adequada de receptores TACI ou BCMA ou que produza um excesso de ZTNF4 ou ZTNF2. Estas moléculas podem ser administradas a qualquer paciente em necessidade de tratamento e a presente invenção considera os usos terapêuticos tanto veterinários quanto humanos. Os pacientes ilustrativos incluem pacientes mamíferos, tais como animais de fazenda, animais domésticos e pacientes humanos.

Os polipeptídeos de TACI-imunoglobulina podem ser usados para o tratamento de doenças autoimunes, canceres de célula B,

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imunomodulação, IBD e quaisquer patologias mediadas por anticorpo (por exemplo, ITCP, miastenia grave e outros), doenças renais, resposta imune de célula T indireta, rejeição de enxerto e doença de enxerto versus hospedeiro. Os polipeptídeos da presente invenção podem ser alvejados para regular especificamente as resposta de célula B durante a resposta imune. Adicionalmente, os polipeptídeos da presente invenção podem ser usados para modular o desenvolvimento de célula B, o desenvolvimento de outras células, a produção de anticorpo e a produção de citocina. Os polipeptídeos da presente invenção também podem modular a comunicação de célula T e B pela neutralização dos efeitos proliferativos de ZTNF4.

Os polipeptídeos de TACI-imunoglobulina da presente invenção podem ser úteis para neutralizar os efeitos de ZTNF4 para tratar leucemias de célula pré B ou B, tais como a leucemia de célula plasmática, a leucemia linfocítica crônica ou aguda, mielomas tais como o mieloma múltiplo, mieloma de célula plasmática, mieloma endotelial e mieloma de célula gigante e linfomas tais como linfoma que não de Hodgkins, para os quais um aumento nos polipeptídeos ZTNF4 está associado.

O ZTNF4 é expressado em células CD8+, monócitos, células dendríticas, monócitos ativados, o que indica que, em certos distúrbios autoimunes, as células T citotóxicas podem estimular a produção de célula B através da produção em excesso de ZTNF4. Proteínas imunossupressoras que seletivamente bloqueiam a ação dos linfócitos B podem ser de uso no tratamento de doença. A produção de autoanticorpo é comum para diversas doenças autoimunes e contribui para a destruição de tecido e exacerbação da doença. Os autoanticorpos também podem levar à ocorrência de complicações da deposição de complexo imune e levar a muitos sintomas de lúpus eritematoso sistêmico, incluindo a insuficiência renal, sintomas neurálgicos e morte. A modulação da produção de anticorpo independente da resposta celular também pode ser benéfica em muitos estados de doença. As células B ···· ···· *

também mostraram desempenhar um papel na secreção de imunoglobulinas artritogênicas na artrite reumatóide. Como tal, a inibição da produção de anticorpo ZTNF4 pode ser benéfica no tratamento de doenças autoimunes tais como a miastenia grave, a artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil de curso poliarticular e artrite psoriática. Os produtos terapêuticos imunossupressores tais como as proteínas de TACI-imunoglobulina que seletivamente bloqueiam ou neutralizam a ação dos linfócitos B podem ser úteis para tais propósitos.

A invenção fornece métodos que utilizam as proteínas de TACI-imunoglobulina para bloquear ou neutralizar seletivamente as ações das células B em associação com doenças renais de estágio final, que podem estar ou não associadas com doenças autoimunes. Tais métodos também podem ser úteis para tratar doenças renais imunológicas. Tais métodos podem ser úteis para tratar a glomeruloneffite associada com doenças tais como a neffopatia membranosa, a nefropatia de IgA ou a Doença de Berger, a neffopatia IgM, a Doença de Goodpasture, a glomeruloneffite pós infecciosa, a doença mesangioproliferativa, a leucemia linfóide crônica, a síndrome neffótica de mudança mínima. Tais métodos também podem servir como aplicações terapêuticas para tratar a glomeruloneffite secundária ou a vasculite associada com doenças tais como lúpus, poliarterite, Henoch-Scbonlein, Escleroderma, doenças relacionadas com o HIV, amiloidose ou síndrome urêmica hemolítica. Os métodos da presente invenção também podem ser úteis como parte de uma aplicação terapêutica para tratar a nefrite intersticial ou pieloneffite associada com pieloneffite crônica, abuso de analgésico, neffocalcinose, neffopatia causada por outros agentes, neffolitiase ou nefrite intersticial crônica ou aguda.

Os métodos da presente invenção também incluem o uso de proteínas de TACI-imunoglobulina no tratamento de doenças hipertensivas ou de vaso grande, incluindo a estenose ou oclusão de artéria renal e êmbolos de colesterol ou êmbolos renais.

A presente invenção também fornece métodos para o tratamento de neoplasmos renais ou urológicos, mielomas múltiplos, linfomas, neuropatia de cadeia leve ou amiloidose.

A invenção também fornece métodos para bloquear ou inibir células B ativadas usando proteínas de TACI-imunoglobulina para o tratamento da asma e outras doenças das vias aéreas crônicas tais como bronquite e enfisema. As proteínas de TACI-imunoglobulina aqui descritas também podem ser usadas para tratar a Síndrome de Sjõgren.

Também são fornecidos métodos para inibir ou neutralizar uma resposta de célula T efetora usando proteínas de TACI-imunoglobulina para o uso na imunossupressão, em particular para tal uso terapêutico como para a doença de enxerto versus hospedeiro e rejeição de enxerto.

Além disso, as proteínas de TACI-imunoglobulina podem ser úteis em protocolos terapêuticos para o tratamento de tais doenças autoimunes como a diabete rneliív dependente de insulina (1DDM) e a Doença de Crohn. Os métodos da presente invenção podem ter valor terapêutico adicional para tratar as doenças inflamatórias crônicas, em particular para diminuir a dor e o intumescimento das juntas, anemia e outros sintomas associados assim como tratar o choque séptico.

Modelos de animal bem estabelecidos são disponíveis para testar a eficácia in vivo de proteínas de TACI-imunoglobulina da presente invenção em certos estados de doença. Em particular, as proteínas de TACIimunoglobulina podem ser testadas in vivo em vários modelos de animal de doença autoimune, tais como cepas de camundongos congênitos M&L-lpr/lpr ou NZB x NZW F1 que servem como um modelo de SLE (lúpus eritematoso sistêmico). Tais modelos de animal são conhecidos na técnica.

A progênie de um cruzamento entre camundongos New Zealand Black (NZB) e New Zealand White (NZW) desenvolve uma forma

espontânea de SLE que estreitamente se parece com a SLE em seres humanos. Os camundongos da progênie, conhecidos como NZBW começam a desenvolver anticorpos IgM contra células T em 1 mês de idade e pelos 5 a 7 meses de idade, os anticorpos Ig anti-DNA são a imunoglobulina dominante. A hiperatividade de célula B policlonal leva à super produção de autoanticorpos. A deposição destes autoanticorpos, particularmente aqueles direcionados contra o DNA de filamento único está associada com o desenvolvimento da glomerulonefrite, que se manifesta clinicamente como proteinúria, azotemia e morte a partir da insuficiência renal. A insuficiência renal é a causa principal da morte em camundongos afetados com a SLE espontânea e na cepa NZBW, este processo é crônico e obliterativo. A doença é mais rápida e grave em fêmeas do que em machos, com sobrevivência média de apenas 245 dias quando comparado a 406 dias para os machos. Embora muitos dos camundongos fêmea serão sintomáticos (proteinúria) em 7 a 9 meses de idade, alguns podem ser mais jovens ou mais velhos quando eles desenvolvem aiuíuums. A neírire imune tatal observada nos camundongos NZBW é muito similar à glomerulonefrite observada na SLE humana, tomando este modelo de murino espontâneo útil para testar os produtos terapêuticos SLE potenciais.

Modelos de camundongo para a encefalomielite alérgica experimental (EAE) foram usados como uma ferramenta para investigar tanto os mecanismos de doença mediada por imune quanto métodos de intervenção terapêutica potencial. O modelo se parece com a esclerose múltipla humana e produz desmielinização como um resultado da ativação da célula T para neuroproteínas tais como a proteína básica da mielina (MBP) ou proteína proteolipídica (PLP). A inoculação com antígeno leva à indução de CD4+, células T restritas á MHC da classe II (Thl). Mudanças no protocolo para EAE pode produzir variantes de transferência aguda, recorrente crônica ou passiva do modelo.

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No modelo da artrite induzida pelo colágeno (CIA), camundongos desenvolvem a artrite inflamatória crônica, que estreitamente se parece com a artrite reumatóide humana (RA). Visto que a CIA compartilha características imunológicas e patológicas similares com a RA, isto a toma um modelo ideal para triar compostos anti-inflamatórios humanos potenciais. Uma outra vantagem no uso do modelo de CIA é que os mecanismos de patogênese são conhecidos. Os epítopos de célula T e B no colágeno do tipo II foram identificados e vários parâmetros imunológicos (hipersensibilidade do tipo retardado e anticorpo anti-colágeno) e inflamatórios (citocinas, quimiocinas e enzimas que degradam matriz) que dizem respeito à artrite mediada por imune foram determinados e podem ser usados para avaliar a eficácia do composto de teste nos modelos.

A miastenia grave (MG) é uma outra doença autoimune para a qual os modelos de murino estão disponíveis. A MG é um distúrbio da transmissão neuromuscular envolvendo a produção de autoanticorpos direcionados cnntrn n rpppnt^r nicotínico da acetilcolina (AChR). A MG é adquirida ou herdada com características clínicas que incluem fraqueza e fadiga anormais no esforço. Um modelo de camundongo de MG foi estabelecido. A miastenia grave autoimune experimental (EAMG) é uma doença mediada por anticorpo caracterizada pela presença de anticorpos para AChR. Estes anticorpos destroem o receptor que leva aos impulsos elétricos neuromusculares defeituosos, que resultam em fraqueza muscular. No modelo de EAMG, os camundongos são imunizados com o receptor nicotínico da acetilcolina. Os sinais clínicos da MG tomam-se evidentes semanas depois da segunda imunização. A EAMG é avaliada por diversos métodos incluindo a medição dos níveis séricos de anticorpos AChR pelo radioimunoensaio, medição do AChR muscular ou eletromiografia.

No geral, a dosagem da proteína TACI-imunoglobulina administrada variará dependendo de fatores tais como a idade do paciente, peso, altura, sexo, condição médica geral e história médica anterior. Tipicamente, é desejável prover o receptor com uma dosagem da proteína TACI-imunoglobulina, que esteja na faixa de cerca de 1 pg/kg a 10 mg/kg (quantidade de agente/peso corpóreo do paciente), embora uma dosagem mais baixa ou mais alta também possa ser administrada conforme as circunstâncias imponham.

A administração de uma proteína TACI-imunoglobulina a um paciente pode ser intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intrapleural, intratecal, pela perfusão através de um cateter regional ou pela injeção intralesional direta. Quando da administração de proteínas terapêuticas por injeção, a administração pode ser pela infusão contínua ou pelos bolos únicos ou múltiplos.

Vias adicionais de administração incluem a oral, membrana mucósica, pulmonar e transcutânea. A liberação oral é adequada para microesferas de poliéster, microesferas de zeína, microesferas proteinóides,

1111V1 WUXVl WU V4V Vil VIUII VUVi 11UI. V V* OlOlUmUO Wlll UUOV V±±JL np/iuwo y V VA ₉ J/'-'¹· exemplo, DiBase e Morrei, “Oral Delivery of Microencapsulated Proteins,” em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 255 a 288 (Plenum Press 1997)). A praticabilidade de uma liberação intranasal é exemplificada por um tal modo de administração de insulina (ver, por exemplo, Hinchcliffe e Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 199 (1999)). Partículas secas ou líquidas que compreendem a TACI-imunoglobulina podem ser preparadas e inaladas com a ajuda de dispersadores de pó seco, geradores ou nebulizadores de aerossol líquido (por exemplo, Pettit e Gombotz, TIBTECH 16: 343 (1998); Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 235 (1999)). Este método é ilustrado pelo sistema de manejo da diabete AERX, que é um inalador eletrônico manual que libera insulina aerossolizada nos pulmões. Estudos mostraram que as proteínas tão grandes quanto 48.000 kDa foram liberadas através da pele em concentrações terapêuticas com a • J· ··»· »*'·

ajuda de ultra-som de baixa freqüência, que ilustra a praticabilidade da administração transcutânea (Mitragotri et al., Science 269: 850 (1995)). A liberação transdérmica usando a eletroporação fornece um outro meio para administrar uma proteína de TACI-imunoglobulina (Potts et al., Pharm. Biotechnol. 10: 213 (1997)).

Uma composição farmacêutica que compreende uma proteína de TACI-imunoglobulina pode ser formulada de acordo com métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, por meio das quais as proteínas terapêuticas são combinadas em uma mistura com um carregador farmaceuticamente aceitável. Uma composição é dita ser um “carregador farmaceuticamente aceitável” se a sua administração pode ser tolerada por um paciente receptor. A solução salina tamponada com fosfato estéril é um exemplo de um carregador farmaceuticamente aceitável. Outros carregadores adequados são bem conhecidos por aqueles na técnica. Ver, por exemplo, Gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19^a Edição (Mack ruDiisnmg company i99o;.

Para os propósitos de terapia, as proteínas de TACIimunoglobulina são administradas a um paciente em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Uma proteína de TACI-imunoglobulina e um carregador farmaceuticamente aceitável são ditos serem administrados em uma “quantidade terapeuticamente eficaz” se a quantidade administrada é fisiologicamente significante. Um agente é fisiologicamente significante se a sua presença resulta em uma mudança detectável na fisiologia de um paciente receptor. Por exemplo, um agente usado para tratar a inflamação é fisiologicamente significante se a sua presença alivia a resposta inflamatória. Como um outro exemplo, um agente usado para inibir o desenvolvimento de células de tumor é fisiologicamente significante se a administração do agente resulta em uma diminuição no número de células de tumor, metástase diminuída, uma diminuição no tamanho de um tumor sólido ou necrose ··· »· ···· ••“'β / % <·«· · « · · η ♦ v * ·

Z J * μ ·· ♦·«· CJ ·«» ** ·· ·· * ··· aumentada de um tumor. Além disso, um agente usado para tratar lúpus eritematoso sistêmico é fisiologicamente significante se a administração do agente resulta em uma diminuição de anticorpos anti-DNA de filamento duplo em circulação ou uma diminuição em pelo menos um dos seguintes sintomas: febre, dor na junta, lesões cutâneas eritematosas ou outras características do lúpus eritematoso sistêmico. Um exemplo de uma indicação geral em que uma proteína de TACI-imunoglobulina é administrada em uma quantidade terapeuticamente eficaz é que, seguindo a administração a um paciente, existe uma diminuição nos níveis em circulação de ZTNF4 (BLyS).

Uma composição farmacêutica que compreende uma proteína TACI-imunoglobulina pode ser fornecida na forma líquida, em um aerossol ou na forma sólida. As Formas líquidas, são ilustradas por soluções injetáveis e suspensões orais. As formas sólidas exemplares incluem cápsulas, tabletes e formas de liberação controlada. A última forma é ilustrada pelas bombas miniosmóticas e implantes (Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10: 239 (1997); Ranade, “Implants ín Drug Delivery,” em Drug Delivery Systems, Kanade e Hollinger (eds.), páginas 95 a 123 (CRC Press 1995); Bremer et al., “Protein Delivery with Infusion Pumps,” em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 239 a 254 (Plenum Press 1997); Yewey et al., “Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant,” em Protein, Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 93 a 117 (Plenum Press 1997)).

Os lipossomas fornecem um meio para liberar polipeptídeos terapêuticos a um paciente intravenosa, intraperitoneal, intratecal, intramuscular, subcutaneamente ou por intermédio da administração oral, inalação ou administração intranasal. Os lipossomas são vesículas microscópicas que consistem de uma ou mais bicamadas lipídicas que circundam compartimentos aquosos (ver, no geral, Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Supl. 1): 561 (1993), Kim, Drugs 46:

618 (1993) e Ranade, “Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers,” em Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (eds.), páginas 3 a 24 (CRC Press 1995)). Os lipossomas são similares em composição às membranas celulares e como um resultado, os lipossomas podem ser administrados com segurança e são biodegradáveis. Dependendo do método de preparação, os lipossomas podem ser unilamelares ou multilamelares e os lipossomas podem variar em tamanho com diâmetros que variam de 0,02 pm a mais do que 10 pm. Uma variedade de agentes podem ser encapsulados em lipossomas: separação de agentes hidrofóbicos nas bicamadas e separação de agentes hidrofílicos dentro de espaço(s) aquoso(s) intemo(s) (ver, por exemplo, Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987) e Ostro et al., American J. Hosp. Pharm. 46: 1576 (1989)). Além disso, é possível controlar a disponibilidade terapêutica do agente encapsulado variando-se o tamanho do lipossoma, o número de bicamadas, a composição lipídica, assim como as características de carga e superfície dos lipossomas.

Os lipossomas podem absorver virtualmente qualquer tipo de célula e depois lentamente liberar o agente encapsulado. Altemativamente, um lipossoma absorvido pode sofre endocitose pelas células que são fagocíticas. A endocitose é seguida pela degradação intralisossômica de lipídeos lipossômicos e liberação dos agentes encapsulados (Scherphof et al., Ann. N. Y. Acad. Sei. 446: 368 (1985)). Depois da administração intravenosa, os lipossomas pequenos (0,1 a 1,0 pm) são tipicamente absorvidos pelas células do sistema reticuloendotelial, localizadas principalmente no fígado e no baço, ao passo que lipossomas maiores do que 3,0 pm são depositados no pulmão. Esta absorção preferencial de lipossomas menores pelas células do sistema reticuloendotelial foi usada para liberar agentes quimioterapêuticos aos macrófagos e aos tumores do fígado.

O sistema reticuloendotelial pode ser enganado por diversos ,ι

métodos incluindo a saturação com doses grandes de partículas lipossômicas ou inativação de macrófagos seletivos pelos meios farmacológicos (Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802: 428 (1984)). Além disso, a incorporação de fosfolipídeos derivatizados por glicolipídeos ou polietileno glicol em membranas lipossômicas mostrou resultar em uma absorção significantemente reduzida pelo sistema reticuloendotelial (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068: 133 (1991); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150: 9(1993)).

Os lipossomas também podem ser preparados para alvejar células ou órgãos particulares variando-se a composição fosfolipídica ou inserindo-se receptores ou ligandos nos lipossomas. Por exemplo, lipossomas, preparados com um alto teor de um tensoativo não iônico, foram usados para alvejar o fígado (Hayakawa et al., Patente Japonesa 04-244.018; Kato et al., Biol. Pharm. Bull. 16: 960 (1993)). Estas formulações foram preparadas misturando-se fosfatidilcolina de soja, α-tocoferol e óleo de mamona eioxiíado hidrogenaao (Hiu-ou) em metanol, concentrando a mistura sob vácuo e depois reconstituindo a mistura com água. Uma formulação lipossômica de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) com uma mistura de estearilglicosídeo derivado de soja (SG) e colesterol (Ch) também mostrou alvejar o fígado (Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20: 881 (1997)).

Altemativamente, vários ligandos alvej adores pode ser ligados à superfície do lipossoma, tal como anticorpos, fragmentos de anticorpo, carboidratos, vitaminas e proteínas de transporte. Por exemplo, os lipossomas podem ser modificados com derivados galactosillipídicos do tipo ramificado para alvejar receptores de asialoglicoproteína (galactose), que são exclusivamente expressados na superfície de células hepáticas (Kato e Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14: 287 (1997); Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20: 259 (1997)). Similarmente, Wu et al., Hepatology 27: 772 (1998), mostrou que rotular lipossomas com asialofetuína leva a uma

ΠΖ ·« ··· · · · ·· ··· · · /Ο ··· · ·_ββ· ·_>#· _βφ ..· ·..· ·_ββ • ··· meia vida plasmática de lipossoma encurtada e absorção enormemente realçada de lipossoma rotulado pela asialofetuína pelos hepatócitos. Por outro lado, o acúmulo hepático de lipossomas compreendendo derivados galactosillipídicos do tipo ramificado pode ser inibido pela pré injeção de asialofetuína (Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20: 259 (1997)). Lipossomas de albumina sérica humana poliaconitilada fornecem um outro método para alvejar lipossomas às células hepáticas (Kamps et al., Proc. Nat’l Acad. Sei. USA 94: 11681 (1997)). Além disso, Geho, et al. Patente U.S 4.603.044, descreve um sistema de liberação de vesícula lipossômica direcionado a hepatócito, que tem especificidade para receptores hepatobiliares associados com as células metabólicas especializadas do fígado.

Em um método mais geral para alvejar tecido, as células alvo são pré rotuladas com anticorpos biotinilados específicos para um ligando expressado pela célula alvo (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32: 99 (ivysj). Depois da eliminação plasmática de anticorpo livre, lipossomas conjugados à estreptavidina são administrados. Em um outro método, anticorpos alvejadores são diretamente ligados aos lipossomas (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32: 99 (1998)).

As proteínas de TACI-imunoglobulina podem ser encapsuladas dentro de lipossomas usando técnicas padrão de microencapsulação de proteína (ver, por exemplo, Anderson et al., Infect. Immun. 31: 1099 (1981), Anderson et al., Câncer Res. 50: 1853 (1990) e Cohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063: 95 (1991), Alving et al. “Preparation and Use of Lipossomes in Immunological Studies,” em Lipossome Technology, 2^a Edição, Vol. III, Gregoriadis (ed.), página 317 (CRC Press 1993), Wassef et al., Meth. Enzymol. 149: 124 (1987)). Como mencionado acima, os lipossomas terapeuticamente úteis podem conter uma variedade de componentes. Por exemplo, os lipossomas podem compreender derivados lipídicos de poli(etileno glicol) (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150: 9 (1993)).

Microesferas poliméricas degradáveis foram planejadas para manter níveis sistêmicos altos de proteínas terapêuticas. As microesferas são preparadas a partir de polímeros degradáveis tais como poli(lactídeo-coglicolídeo) (PLG), polianidridos, poli (orto ésteres), polímeros de acetato etilvinílico não biodegradáveis, nos quais as proteínas são aprisionadas no polímero (Gombotz e Pettit, Bioconjugate Chem. 6: 332 (1995); Ranade, “Role of Polimers in Drug Delivery,” em Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (eds.), páginas 51 a 93 (CRC Press 1995); Roskos e Maskiewicz, “Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery,” em Proteína Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 45 a 92 (Plenum Press 1997); Bartus et al., Science 281: 1161 (1998); Putney e Burke, Nature Biotechnology 16: 153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 548 (1998)). Nanoesferas revestidas de polietileno glicol (PEG) lambém podem fornecer carregadores para a administração intravenosa de proteínas terapêuticas (ver, por exemplo, Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10: 167 (1997)).

A presente invenção também considera proteínas de TACIimunoglobulina quimicamente modificadas em que o polipeptídeo é ligado com um polímero, como debatido acima.

Outras formas de dosagem podem ser planejadas por aqueles habilitados na técnica, como apresentado, por exemplo, por Ansel e Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5 ^a Edição (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19^aEdição (Mack Publishing Company 1995) e por Ranade e Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996).

Como uma ilustração, as composições farmacêuticas podem ser fornecidas como um conjunto compreendendo um recipiente que

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compreenda uma proteína de TACI-imunoglobulina. Polipeptídeos terapêuticos podem ser fornecidos na forma de uma solução injetável para doses únicas ou múltiplas ou como um pó estéril que será reconstituído antes da injeção. Altemativamente, um tal conjunto pode incluir um dispensador de pó seco, gerador ou nebulizador de aerossol líquido para a administração de um polipeptídeo terapêutico. Um tal conjunto pode ainda compreender informação escrita sobre indicações e uso da composição farmacêutica. Além disso, tal informação pode incluir uma declaração de que a composição de proteína de TACI-imunoglobulina é contra indicada em pacientes com hipersensibilidade conhecida à porção do receptor de TACI ou à porção de imunoglobulina.

9. Usos Terapêuticos das Seqüências de Nucleotídeo de TACI-imunoglobulina

A presente invenção inclui o uso de moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina para fornecer estas proteínas de fusão a um paciente em necessidade de tal tratamento. Quanto ao uso terapêutico veterinário ou uso terapêutico humano, tais moléculas de ácido nucleico podem ser administradas a um paciente tendo um distúrbio ou doença, como debatido acima. Como um exemplo debatido no princípio, as moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína de fusão de TACI-imunoglobulina podem ser usadas para o tratamento de longa duração de lúpus eritematoso sistêmico.

Existem numerosos métodos para introduzir um gene da TACI-imunoglobulina em um paciente, incluindo o uso de células hospedeiras recombinantes que expressam a TACI-imunoglobulina, a liberação de ácido nucleico nu que codifica a TACI-imunoglobulina, o uso de um carregador lipídico catiônico com uma molécula de ácido nucleico que codifica a TACI-imunoglobulina e o uso de vírus que expressam a TACIimunoglobulina, tal como retrovírus recombinantes, os vírus associados a ·· • ·

adeno recombinantes, adenovírus recombinantes e vírus do Herpes simples recombinantes (ver, por exemplo, Mulligan, Science 260: 926 (1993), Rosenberg et al., Science 242: 1575 (1988), LaSalle et al., Science 259: 988 (1993), Wolff et al., Science 247: 1465 (1990), Breakfield e Deluca, The New Biologist 3: 203 (1991)). Em um método ex vivo, por exemplo, as células são isoladas de um paciente, transfectadas com um vetor que expresse um gene da TACI-imunoglobulina e depois transplantadas no paciente.

De modo a efetuar a expressão de um gene da TACIimunoglobulina, um vetor de expressão é construído em que uma seqüência de nucleotídeo que codifica um gene da TACI-imunoglobulina é operavelmente ligado a um promotor de núcleo e opcionalmente um elemento regulador, para controlar a transcrição de gene. As exigências gerais de um vetor de expressão estão descritas acima.

Altemativamente, um gene da TACI-imunoglobulina pode ser liberado usando-se vetores virais recombinantes, incluindo por exemplo, vetores adenovirais (por exemplo, Kass-Eisler et al., Proc. Nat’l Acad Sei. USA 90: 11498 (1993), Kolls et al., Proc. Nat’l Acad Sei. USA 91: 215 (1994), Li et al., Hum. Gene Ther. 4: 403 (1993), Vincent et al., Nat. Genet. 5: 130 (1993) e Zabner et al., Cell 75: 207 (1993)), vetores virais associados a adenovírus (Flotte et al., Proc. Nat’l Acad. Sei. USA 90: 10613 (1993)), alfavírus tais como o Vírus Semliki Forest e o Vírus Sindbis (Hertz e Huang, J. Vir. 66: 857 (1992), Raju e Huang, J. Vir. 65: 2501 (1991) e Mong et al., Science 243: 1188 (1989)), vetores virais do herpes (por exemplo, Patentes U.S. N— 4.769.331, 4.859.587, 5.288.641 e 5.328.688), vetores de parvovírus (Koering et al., Hum. Gene Therap. 5: 457 (1994)), vetores de pox vírus (Ozaki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 193:653 (1993), Panicali e Paoletti, Proc. Nat’l Acad. Sei. USA 79: 4927 (1982)), pox vírus, tais como o vírus da varíola do canário ou o vírus da vacínia (Fisher-Hoch et al., Proc. Nat’l Acad. Sei. USA 86: 317 (1989) e Flexner et al., Ann. N. Y. Acad. Sei.

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569: 86 (1989)) e retrovírus (por exemplo, Baba et al., J. Neurosurg 79: 729 (1993), Ram et al., Câncer Res. 53: 83 (1993), Takamiya et al., J. Neurosci. Res 33: 493 (1992), Vile e Hart, Câncer Res. 53: 962 (1993), Vile e Hart, Câncer Res. 53: 3860 (1993) e Anderson et al., Patente U.S 5.399.346). Dentro de várias formas de realização, o próprio vetor viral ou uma partícula viral, que contenha o vetor viral podem ser utilizados nos métodos e composições descritas abaixo.

Como uma ilustração de um sistema, adenovírus, um vírus de DNA de filamento duplo é um vetor de transferência de gene bem caracterizado para a liberação de uma molécula de ácido nucleico heteróloga (para uma revisão, ver Becker et al., Meth. Cell Biol. 43: 161 (1994); Douglas e Curiel, Science & Medicine 4: 44 (1997)). O sistema de adenovírus oferece diversas vantagens incluindo: (i) a capacidade para acomodar insertos de DNA relativamente grandes, (ii) a capacidade para ser cultivado em título alto, (iii) a capacidade para infectar uma ampla faixa de tipos de célula de mamífero e (iv) a capacidade para ser usado com muitos promotores diferentes incluindo promotores ubíquos, específicos de tecido e reguláveis. Além disso, os adenovírus podem ser administrados pela injeção intravenosa, porque os vírus são estáveis na corrente sangüínea.

Usando vetores de adenovírus onde porções do genoma do adenovírus são suprimidas, insertos são incorporados no DNA viral pela ligação direta ou pela recombinação homóloga com um plasmídeo cotransfectado. Em um sistema exemplar, o gene El essencial é suprimido do vetor viral e o vírus não replica a menos que o gene El seja fornecido pela célula hospedeira. Quando intravenosamente administrado a animais intactos, o adenovírus primariamente alveja o fígado. Embora um sistema de liberação adenoviral com uma supressão do gene El não possa replicar nas células hospedeiras, o tecido do hospedeiro expressará e processará uma proteína heteróloga codificada. As células hospedeiras também secretarão a proteína

···· ···· ··* heteróloga se o gene correspondente inclui uma seqüência de sinal secretora. As proteínas secretadas entrarão na circulação a partir do tecido que expressa o gene heterólogo (por exemplo, o fígado altamente vascularizado).

Além disso, vetores adenovirais contendo várias supressões de genes virais podem ser usados para reduzir ou eliminar respostas imunes para o vetor. Tais adenovírus são suprimidos no El e além disso, contém supressões de E2A ou E4 (Lusky et al., J. Viral. 72: 2022 (1998); Raper et al., Human Gene Therapy 9: 671 (1998)). A supressão de E2b também foi relatada reduzir as respostas imunes (Amalfitano et al., J. Viral. 72: 926 (1998)). Suprimindo-se o genoma do adenovírus inteiro, insertos muito grandes de DNA heterólogo podem ser ajustados. A geração do chamado adenovírus “sem intestino”, onde todos os genes virais são suprimidos, são particularmente vantajosos para a inserção de insertos grandes de DNA heterólogo (para uma revisão, ver Yeh. e Perricaudet, FASEB J. 11: 615 (1997)).

Estoques de título alto de vírus recombinantes capazes de expressar um gene terapêutico podem ser obtidos a partir de células de mamífero infectadas usando-se métodos padrão. Por exemplo, o vírus simples do herpes recombinante pode ser preparado em células Vero, como descrito por Brandt et al., J. Gen. Viral. 72: 2043 (1991), Herold et al., J. Gen. Viral. 75: 1211 (1994), Visalli e Brandt, Virology 185: 419 (1991), Grau et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 30: 2474 (1989), Brandt et al., J. Viral. Meth. 36: 209 (1992) e por Brown e MacLean (eds.), HSV Virus Protocols (Humana Press 1997).

Altemativamente, um vetor de expressão que compreenda um gene da TACI-imunoglobulina pode ser introduzido em uma célula do paciente pela lipofecção in vivo usando lipossomas. Lipídeos catiônicos sintéticos podem ser usados para preparar lipossomas para a transfecção in vivo de um gene que codifica um marcador (Felgner et al., Proc. Nat’l Acad.

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Sei. USA 84: 7413 (1987); Mackey et al., Proc. Nat’l Acad. Sei. USA 85: 8027 (1988)). O uso da lipofecção para introduzir genes exógenos em órgãos específicos in vivo tem certas vantagens práticas. Os lipossomas podem ser usados para direcionar a transfecção a tipos de célula particulares, o que é particularmente vantajoso em um tecido com heterogeneidade celular, tal como o pâncreas, fígado, rim e cérebro. Os lipídeos podem ser quimicamente ligados a outras moléculas com o propósito de alvejamento. Peptídeos alvejados (por exemplo, hormônios ou neurotransmissores), proteínas tais como anticorpos ou moléculas não peptídicas podem ser ligadas a lipossomas quimicamente.

A eletroporação é um outro modo alternativo de administração. Por exemplo, Aihara e Miyazaki, Nature Biotechnology 16: 867 (1998), demonstraram o uso da eletroporação in vivo para a transferência de gene no músculo.

No geral, a dosagem de uma composição que compreende um vetor terapêutico tendo uma seqüência ácida de nucleotídeo de TACIimunoglobulina, tal como um vírus recombinante, variará dependendo de fatores tais como a idade, peso, altura, sexo, condição médica geral e história médica anterior do paciente. As vias adequadas de administração de vetores terapêuticos incluem a injeção intravenosa, a injeção intraarterial, a injeção intraperitoneal, a injeção intramuscular, a injeção intratumoral e a injeção em uma cavidade que contenha um tumor. Como uma ilustração, Horton et al., Proc. Nat’l Acad. Sei. USA 96: 1553 (1999), demonstraram que a injeção intramuscular de DNA plasmídico que codifica a interferona produz efeitos antitumores potentes em tumores primários e metastáticos em um modelo de murino.

Uma composição compreendendo vetores virais, vetores não virais ou uma combinação de vetores virais e não virais da presente invenção pode ser formulada de acordo com métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, por meio das quais vetores ou vírus são combinados em uma mistura com um carregador farmaceuticamente aceitável. Como mencionado acima, uma composição, tal como solução salina tamponada com fosfato é dita ser um “carregador farmaceuticamente aceitável” se a sua administração pode ser tolerada por um paciente receptor. Outros carregadores adequados são bem conhecidos por aqueles na técnica (ver, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19^a Ed. (Mack Publishing Co. 1995) e Gilman’s the Pharmacological Basis of Therapeutics, 7^a Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985)).

Para os propósitos de terapia, um vetor de expressão de gene terapêutico ou um vírus recombinante que compreendam um tal vetor e um carregador farmaceuticamente aceitável são administrados a um paciente em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Uma combinação de um vetor de expressão (ou vírus) e um carregador farmaceuticamente aceitável é dita ser administrada em uma “quantidade terapeuticamente eficaz” se a quantidade administrada é fisiologicamente significante. Um agente é fisiologicamente significante se a sua presença resulta em uma mudança detectável na fisiologia de um paciente receptor. Por exemplo, um agente usado para tratar a inflamação é fisiologicamente significante se a sua presença alivia a resposta inflamatória. Como um outro exemplo, um agente usado para inibir o crescimento de células de tumor é fisiologicamente significante se a administração do agente resulta em uma diminuição no número de células de tumor, metástase diminuída, uma diminuição no tamanho de um tumor sólido ou necrose aumentada de um tumor.

Quando o paciente tratado com um vetor de expressão de gene ou um vírus recombinante terapêuticos é um ser humano, então a terapia é preferivelmente a terapia de gene de célula somática. Isto é, o tratamento preferido de um ser humano com um vetor de expressão de gene ou um vírus recombinante terapêuticos não acarreta necessariamente introduzir nas células

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• ‘ * 4 ··*«·««« · * ^V v « * · '. -) · » ·· ·*« « · · · V ·· * · · * • < «* ···· ·· »» ·* ·· ** • *·· uma molécula de ácido nucleico que possa formar parte de uma linha germinativa humana e ser passada para gerações sucessivas (isto é, terapia de gene de linha germinativa humana).

10. Produção de Camundongos Transgênicos

Camundongos transgênicos podem ser engendrados para super expressar seqüências de ácido nucleico que codificam proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina em todos os tecidos ou sob o controle de um elemento regulador específico de tecido ou preferido por tecido. Estes super produtores de proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina podem ser usados para caracterizar o fenótipo que resulta da super expressão e os animais transgênicos podem servir como modelos para a doença humana causada pelo excesso da proteína do receptor de TACI. Camundongos transgênicos que super expressam proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina também fornecem biorreatores modelo para a produção de proteínas de fusão de TACI-imunoglobulina no leite ou sangue de animais maiores. Os métodos para produzir camundongos transgênicos são bem conhecidos por aqueles de habilidade na técnica (ver, por exemplo, Jacob, “Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice,” em Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), páginas 111 a 124 (Academic Press, Ltd. 1994), Monastersky e Robl (eds.), Strategies in Transgenic Animal Science (ASM Press 1995) e Abbud e Nilson, “Recombinant Protein Expression in Transgenic Mice,” em Gene Expression Systems: Using Nature _: for the Art of Expression, Femandez e Hoeffler (eds.), páginas 367 a 397 (Academic Press, Inc. 1999)).

Por exemplo, um método para produzir um camundongo transgênico que expresse uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão de TACI-imunoglobulina pode começar com machos adultos, férteis (reprodutor) (B6Dfl, 2 a 8 meses de idade (Taconic Farms, Germantown, NY)), machos vasectomizados (deficiente) (B6D2fl, 2 a 8 •u» * »· meses, (Taconic Farms)), fêmeas férteis pré pubescente (doadores) (B6C3fl, a 5 semanas, (Taconic Farms)) e fêmeas férteis adultas (receptores) (B6D2fl, 2 a 4 meses, (Taconic Farms)). Os doadores são aclimatizados durante uma semana e depois injetados com aproximadamente 8 IU/camundongo de gonadotropina de Soro de Égua Prenhe (Sigma Chemical Company; St. Louis, MO) I.P. e 46 a 47 horas mais tarde, 8 IU/camundongo de Gonadotropina Coriônica humana (hCG (Sigma)) I.P. para induzir a super ovulação. Os doadores são acasalados com os reprodutores subsequente às injeções de hormônio. A ovulação no geral ocorre dentro de 13 horas da injeção de hCG. A cópula é confirmada pela presença de um tampão vaginal na manhã seguinte ao acasalamento.

Os ovos fertilizados são coletados sob um escopo cirúrgico. Os ovidutos são coletados e os ovos são liberados em lâminas de urinálise contendo hialuronidase (Sigma). Os ovos são lavados uma vez em hialuronidase e duas vezes em meio W640 de Whitten (descrito, por exemplo, ρυι Menino e OCiaray, βίοι. Keprod. 77: 159 (1986) e Dienhart e Downs, Zygote 4: 129 (1996)) que foi incubado com 5 % de CO2, 5 % de O2 e 90 % de N₂ a 37° C. Os ovos são depois armazenados em um incubador a 37° C/5 % de CO₂ até a microinjeção.

Dez a vinte microgramas de DNA plasmídico contendo uma seqüência codificadora da proteína de fusão de TACI-imunoglobulina são linearizados, purificados em gel e recolocados em suspensão em 10 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 0,25 mM de EDTA (pH 8,0), a uma concentração final de a 10 nanogramas por microlitro para a microinjeção. Por exemplo, as seqüências que codificam a proteína de fusão da TACI-imunoglobulina podem codificar um polipeptídeo de TACI com a supressão de resíduos de aminoácido de 1 a 29 e de 111 a 154 da SEQ ID NO: 2 e uma porção da imunoglobulina Fc5.

O DNA plasmídico é microinjetado nos ovos colhidos ··· ·#» ··

contidos em uma gota de meio W640 revestida por óleo mineral equilibrado com CO2, quente. O DNA é puxado em uma agulha de injeção (puxada de um capilar de vidro de borossilicato 0,75 mm DI, 1 mm DE) e injetado em ovos individuais. Cada ovo é penetrado com a agulha de injeção, em um ou em ambos dos pronúcleos haplóides.

Picolitros de DNA são injetados nos pronúcleos e a agulha de injeção retirada sem entrar em contato com os nucléolos. O procedimento é repetido até que todos os ovos são injetados. Os ovos microinjetados com sucesso são transferidos em uma placa de cultura de tecido de órgão com meio W640 pré gaseificado para a armazenagem durante a noite em um incubador a 37° C/5 % de CO₂.

No dia seguinte, embriões de duas células são transferidos nos receptores pseudoprenhes. Os receptores são identificados pela presença de tampões de cópula, depois de copular com os deficientes vasectomizados. Os receptores são anestesiados e raspados no lado esquerdo dorsal e transferidos ραία um microscópio cirúrgico. Uma incisão pequena é feita na pele e através da parede muscular no meio da área abdominal salientada pelo caixa toráxica, a sela e a pata traseira, a meio caminho entre joelho e o baço. Os órgãos reprodutivos são exteriorizados sobre um pequeno pano cirúrgico. A almofada de gordura é estirada sobre o pano cirúrgico e uma serrefine de bebê (Roboz, Rockville, MD) é ligada à almofada de gordura e deixada pendurada sobre o dorso do camundongo, impedindo os órgãos de deslizar de volta para dentro.

Com uma pipeta de transferência fina contendo óleo mineral seguida pela alternância de W640 e bolhas de ar, 12 a 17 embriões de duas célula saudáveis da injeção do dia anterior são transferidos no receptor. A ampola intumescida é localizada e segurando o oviduto entre a ampola e a bolsa, um corte no oviduto é feito com uma agulha de 28 g próximo à bolsa, certificando-se de não rasgar a ampola ou a bolsa.

A pipeta é transferida para dentro do corte no oviduto e os

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embriões são soprados, deixando que a primeira bolha de ar escape da pipeta. A almofada de gordura é suavemente empurrada no peritônio e os órgãos reprodutivos deixados deslizar para dentro. A parede peritoneal é fechada com uma sutura e a pele fechada com um clipe de ferida. Os camundongos se recuperam em um aquecedor de lâmina a 37° C por um mínimo de quatro horas.

Os receptores são retomados para as gaiolas em pares e deixados de 19 a 21 dias de gestação. Depois do nascimento, 19 a 21 dias após o parto é deixado antes do desmame. Os animais recém desmamados são classificados pelo sexo e colocados em gaiolas separadas pelo sexo e uma biópsia de 0,5 cm (usada para a genotipagem) é cortada da cauda com tesouras limpas.

O DNA genômico é preparado a partir dos cortes na cauda usando, por exemplo, um conjunto QIAGEN DNEASY seguindo as instruções do fabricante. O DNA genômico é analisado pela PCR usando preparadores planejados para amplificar uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão de TACI-imunoglobulina ou um gene marcador selecionável que foi introduzido no mesmo plasmídeo. Depois que os animais são confirmados serem transgênicos, eles são retro-cruzados em uma cepa congênita colocando-se uma fêmea transgênica com um macho do tipo selvagem ou um macho transgênico com uma ou duas fêmeas do tipo selvagem. Conforme os filhotes nascem e são desmamados, os sexos são separados e as suas caudas cortadas para a genotipagem.

Para checar quanto a expressão de um transgene em um animal vivo, uma hepatectomia parcial é realizada. Uma preparação cirúrgica é feita do abdômen superior diretamente abaixo do processo zifóide. Usando técnica estéril, uma incisão pequena de 1,5 a 2 cm é feita abaixo do estemo e o lobo lateral esquerdo do fígado exteriorizado. Usando seda 4-0, um laço é feito em tomo do lobo inferior segurando-o fora da cavidade corpórea. Uma pinça

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atraumática é usada para segurar o laço enquanto uma segunda volta de Dexon absorvível (American Cyanamid; Wayne, N.J.) é colocada próxima ao primeiro laço. Um corte distai é feito a partir do laço de Dexon e aproximadamente 100 mg do tecido hepático excisado são colocados em uma placa de petri estéril. A seção de fígado excisado é transferida para um tubo de fundo redondo de polipropileno de 14 ml e subitamente congelados em nitrogênio líquido e depois armazenados em gelo seco. O local cirúrgico é fechado com sutura e clipes de ferimento e a gaiola do animal colocada em uma almofada de aquecimento a 37° C durante 24 horas pós operativamente. O animal é checado diariamente pós operativamente e os clipes de ferimento removidos 7 a 10 dias depois da cirurgia. O nível de expressão do mRNA da proteína de fusão de TACI-imunoglobulina é examinado para cada camundongo transgênico usando um ensaio de hibridização em solução de RNA ou reação de cadeia de polimerase.

Usando o método geral descrito acima, os camundongos j a · r* 1 · 1 r · · ♦ r* . ι . r uaudgunvud iviaiii piuuuziuuô que cajji eòòtun íuvciò aigiuiivauic& uc piviema de fusão de TACI-imunoglobulina no leite. Neste caso particular, a seqüência que codifica a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina codificou um polipeptídeo de TACI com a supressão dos resíduos de aminoácido de 1 a 29 e de 111 a 154 da SEQ ID NO: 2 e uma porção de imunoglobulina Fc5.

A presente invenção, assim no geral descrita, será entendida mais facilmente pela referência aos seguintes exemplos, que são fornecidos por via de ilustração e não é intencionada a ser limitante da presente invenção.

EXEMPLO 1

Construção de Moléculas de Ácido Nucleico Que Codificam Proteínas TACI-Fc

As moléculas de ácido nucleico que codificam a TACI humana foram obtidas durante a clonagem de expressão dos receptores para ZTNF4 como descrito por Gross et al., Nature 404: 995 (2000). As seqüências

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codificadoras contidas nas construções de expressão de TACI-Fc foram geradas pela PCR de sobreposição, usando técnicas padrão (ver, por exemplo, Horton et al., Gene 77: 61 (1989)). cDNA de TACI e cDNA de Fc humanos foram usados como padrões de partida para as amplificações por PCR. Preparadores de PCR foram planejados para produzir as extremidades 5’ e 3’ da seqüência codificadora desejada e para introduzir sítios de reconhecimento de enzima de restrição para facilitar a inserção destas seqüências codificadoras nos vetores de expressão. As seqüências codificadoras de TACI-Fc foram inseridas em vetores de expressão que incluíram um gene da diidrofoliato reductase de murino funcional. Um vetor de expressão também conteve um promotor de citomegalovírus para direcionar a expressão do transgene de proteína recombinante, um intron de imunoglobulina, uma seqüência de sinal ativadora de plasminogênio de tecido, uma seqüência de entrada de ribossoma interno, um cistron CD8 suprimido para a seleção de superfície de células transfectadas e elementos de expressão de levedura para o desenvolvimento ao piasmiaeo em ceiuias ae leveaura.

Um método que foi usado para produzir proteínas de fusão TACI-Fc é ilustrado pelo método usado para construir TACI-Fc4. Outras proteínas de fusão TACI-Fc foram produzidas inserindo-se as seqüências de nucleotídeo que codificam uma proteína de fusão de TACI-Fc em um vetor de expressão de mamífero e introduzindo este vetor de expressão em células de mamífero.

A. Construção do Fragmento Ig γΐ Fc4

Para preparar a proteína de fusão TACI-Fc4, a região Fc da IgGl humana (a região de junta e os domínios CH₂ e CH₃) foi modificada para remover o receptor Fcyl (FcyRI) e as funções de ligação de complemento (Clq). Esta versão modificada da IgGl Fc humana foi designada “Fc4.”

A região Fc foi isolada a partir de uma PCR de biblioteca de

fígado fetal humano (Clontech) usando preparadores oligo 5’ ATCAGCGGAA TTCAGATCTT CAGACAAAAC TCACACATGC CCAC 3’ (SEQ ID NO: 7) e 5’ GGCAGTCTCT AGATCATTTA CCCGGAGACA GGGAG 3’ (SEQ ID NO: 8). As mutações dentro da região Fc foram introduzidas pela PCR para reduzir a ligação FcyRI. O sítio de ligação de FcyRI (Leu-Leu-Gly-Gly; resíduos de aminoácido de 38 a 41 da SEQ ID NO: 6, que corresponde às posições de 234 a 237 do índex EU) foi mutado para Ala-Glu-Gly-Ala para reduzir a ligação de FcyRI (ver, por exemplo, Duncan et al., Nature 332: 563 (1988); Baum et al., EMBO J. 13: 3992 (1994)). Preparadores de oligonucleotídeo 5’ CCGTGCCCAG CACCTGAAGC CGAGGGGGCA CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC C 3’ (SEQ ID NO: 9) e 5’ GGATTCTAGA TTATTTACCC GGAGACAGGG A 3’ (SEQ ID NO: 10) foram usados para introduzir a mutação. Para um volume final de 50 μΐ foram adicionados 570 ng de padrão de IgFc, 5 μΐ de Tampão de reação lOx Pfu (Stratagene), 8 μΐ de dNTPs a 1,25 mM, 31 μΐ de água destilada, 2 μΐ de preparadores de oligonucleotídeo a zu mivi. Um voiunic igual uc óleo mineral foi adicionado e a reação foi aquecida a 94° C durante 1 minuto. A Pfu polimerase (2,5 unidades, Stratagene) foi adicionada seguida por 25 ciclos a 94° C durante 30 segundos, 55° C durante 30 segundos, 72° C durante 1 minuto seguido por uma extensão de 7 minutos a 72° C. Os produtos de reação foram fracionados pela eletroforese e a faixa correspondente ao tamanho prognosticado de cerca de 676 pares de base foi detectada. Esta faixa foi excisada a partir do gel e recuperada usando um Conjunto de Extração de Gel QIAGEN QIAquick® (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante.

A PCR também foi usada para introduzir uma mutação de Ala para Ser (resíduo de aminoácido 134 da SEQ ID NO: 6, que corresponde à posição 330 do índex EU) e de Pro para Ser (resíduo de aminoácido 135 da SEQ ID NO: 6, que corresponde à posição 331 do índex EU) para reduzir a ligação do complemento Clq ou fixação de complemento (Duncan e Winter, ··

Na.ture 332: 788 (1988)). As duas reações da primeira rodada foram realizadas usando a seqüência de IgFc mutada no lado da ligação FcyRI como um padrão. Para um volume final de 50 μΐ foram adicionados 1 μΐ do padrão de IgFc mutado no sítio de ligação de FcyRI, 5 μΐ de Tampão de Reação lOx Pfu (Stratagene), 8 μΐ de dNTPs a 1,25 mM, 31 μΐ de água destilada, 2 μΐ de 5’ GGTGGCGGCT CCCAGATGGG TCCTGTCCGA GCCCAGATCT TCAGACAAAA CTCAC 3’ (SEQ ID NO: 11) a 20 mM, um preparador 5’ começando no nucleotídeo 36 da SEQ ID NO: 5 e 2 μΐ de 5’ TGGGAGGGCT TTGTTGGA 3’ (SEQ ID NO: 12) a 20 mM, um preparador 3’ começando no complemento do nucleotídeo 405 da SEQ ID NO: 5. A segunda reação conteve 2 μΐ de cada um dos estoques de 20 mM dos preparadores de oligonucleotídeo 5’ TCCAACAAAG CCCTCCCATC CTCCATCGAG AAAACCATCT CC 3’ (SEQ ID NO: 13), um preparador 5’ começando no nucleotídeo 388 da SEQ ID NO: 5 e 5’ GGATGGATCC ATGAAGCACC TGTGGTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGGCTC CCAGA1G 3’ (SEQ ID NO: 14), um preparador J', para introduzir a mutação de Ala para Ser, o sítio de restrição Xbal e o códon de parada. Um volume igual de óleo mineral foi adicionado e as reações foram aquecidas a 94*° C durante 1 minuto. A Pfu polimerase (2,5 unidades, Stratagene) foi adicionada seguida pelos 25 ciclos a 94° C durante 30 segundos, 55° C durante 30 segundos, 72° C durante 2 minutos seguidos por uma extensão de 7 minutos a 72° C. Os produtos de reação foram fracionados pela eletroforese e as faixas que correspondem aos tamanhos prognosticados, de cerca de 370 e de cerca de 395 pares de base respectivamente, foram detectados. As faixas foiram excisadas a partir do gel e extraídas usando um Conjunto de Extração de Gel QIAGEN QIAquick® (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante.

Uma reação da segunda rodada foi realizada para unir os fragmentos acima e adicionar o sítio de restrição 5’ BamHI e uma seqüência • ·· • ·

de sinal da região variável de cadeia pesada JBL 2’C_L da imunoglobulina humana (Cogne et al., Eur. J. Immunol. 18: 1485 (1988)). Para um volume final de 50 μΐ foram adicionados 30 μΐ de água destilada, 8 μΐ de dNTPs a 1,25 mM, 5 μΐ de Tampão de reação de lOx Pfu polimerase (Stratagene) e 1 μΐ de cada um dois primeiros produtos de PCR. Um volume igual de óleo mineral foi adicionado e a reação foi aquecida a 94° C durante 1 minuto. A

X Pfu polimerase (2,5 unidades, Stratagene) foi adicionada seguida por 5 ciclos <

a 94° C durante 30 segundos, 55° C durante 30 segundos e 72° C durante 2 minutos. A temperatura foi mais uma vez levada a 94° C e 2 μΐ de cada um dos estoques de 20 mM de 5’ GGATGGATCC ATGAAGCACC * TGTGGTTCTT CCTCCTGCTG GTGGCGGCTC CCAGATG 3’ (SEQ ID NO: 14), um preparador 5’ começando no nucleotídeo 1 da SEQ ID NO: 5 e 5’ GGATTCTAGA TTATTTACCC GGAGACAGGG A 3’ (SEQ ID NO: 10) foram adicionados seguidos por 25 ciclos a 94° C durante 30 segundos,

55° C durante 30 segundos e 72° C durante 2 minutos e uma extensão final de minutos a 72° C. Uma porção da reação toi visualizada usando a eletroforese em gel. Uma faixa de 789 pares de base correspondendo ao tamanho prognosticado foi detectada.

B. Construção do Vetor de Expressão TACI-Fc4 ) 20 Plasmídeos de expressão que compreendem uma região codificadora para a proteína de fusão TACI-Fc4 foram construídos por intermédio da recombinação homóloga em levedura. Um fragmento de cDNA de TACI foi isolado usando a PCR que incluiu a seqüência de polinucleotídeo do nucleotídeo 14 ao nucleotídeo 475 da SEQ ID NO: 1. Os dois preparadores usados na produção do fragmento de TACI foram: (1) um preparador contendo 40 pares de base da seqüência flanqueadora do vetor 5’ e 17 pares de base que correspondem ao término amino do fragmento de TACI (5’ CTCAGCCAGG AAATCCATGC CGAGTTGAGA CGCTTCCGTA GAATGAGTGG CCTGGGCCG 3’; SEQ ID NO: 15); (2) 40 pares de base

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da extremidade 3’ que correspondem à seqüência Fc4 flanqueadora e 17 pares de base que correspondem ao término carboxila do fragmento de TACI (5’ GCATGTGTGA GTTTTGTCTG AAGATCTGGG CTCCTTCAGC CCCGGGAG 3’; SEQ ID NO: 16). Para um volume final de 100 μΐ foram adicionados 10 ng de padrão de TACI, 10 μΐ de Tampão de Reação lOx Taq polimerase (Perkin Elmer), 8 μΐ de dNTPs 2,5 nM, 78 μΐ de água destilada, 2 μΐ de cada um dos estoques de 20 mM dos preparadores de oligonucleotídeo e Taq polimerase (2,5 unidades, Life Technology). Um volume igual de óleo mineral foi adicionado e a reação foi aquecida a 94° C durante 2 minutos, seguido por 25 ciclos a 94° C durante 30 segundos, 65° C durante 30 segundos, 65° C durante 30 segundos, 72° C durante 1 minuto seguido por uma extensão de 5 minuto a 72° C.

O fragmento contendo o cDNA que codifica o fragmento Fc4 foi construído em uma maneira similar. Os dois preparadores usados na produção do fragmento Fc4 foram (a montante e a jusante), um preparador de oligonucleotídeo contendo 40 nnrpe de bzse da seqüência franqucadui» 5' TACI e 17 pares de base que correspondem ao término amino do fragmento Fc4 (5’ GCACAGAGGC TCAGAAGCAA GTCCAGCTCT CCCGGGGCTG AAGGAGCCCA GATCTTCAGA 3’; SEQ ID NO: 17); e um preparador de oligonucleotídeo contendo 40 pares de base da extremidade

3’ que corresponde à seqüência de vetor flanqueador e 17 pares de base que correspondem ao término carboxila do fragmento Fc4 (5’ GGGGTGGGTA CAACCCCAGA GCTGTTTTAA TCTAGATTAT TTACCCGGAG ACAGGG 3’; SEQ ID NO: 18). Para um volume final de 100 μΐ foram adicionados 10 ng de padrão Fc4 descrito acima, 10 μΐ de Tampão de Reação lOx Taq polimerase (Perkin Elmer), 8 μΐ de dNTPs 2,5 nM, 78 μΐ de água destilada, 2 μΐ de cada um dos estoques de 20 mM dos oligonucleotídeos e Taq polimerase (2,5 unidades, Life Technology). Um volume igual de óleo mineral foi adicionado e a reação foi aquecida a 94° C durante 2 minutos,

A) depois 25 ciclos a 94° C durante 30 segundos, 65° C durante 30 segundos, 72° C durante 1 minuto seguido por uma extensão de 5 minutos a 72° C.

Dez microlitros de cada um dos 100 μΐ de reações de PCR descritas acima foram conduzidos em um gel de LPM agarose a 0,8 % (Seaplaque GTG) com tampão lx TBE para análise. Os 90 μΐ remanescentes de cada reação de PCR foram precipitados com a adição de 5 μΐ de cloreto de sódio 1 M e 250 ul de etanol absoluto. O plasmídeo pZMP6 foi clivado com Smal para linearizá-lo no poliligador. O plasmídeo pZMPó foi derivado do plasmídeo pCZR199 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, ATCC# 98668) e é um vetor de expressão de mamífero contendo um cassete de expressão tendo o promotor precoce imediato de citomegalovírus, um intron de consenso da região variável do local de cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo, sítios de restrição múltiplos para a inserção de seqüências codificadoras, um códon de parada e um terminador do hormônio do crescimento humano. O plasmídeo também tem uma origem da

E.

coli de renlicacãn uma nniHarU expressão _______J___--1 * ' ·« · muivuuut OVlWlVJlld.VCl C1C mamífero tendo um promotor, realçador e origem de replicação do SV40, um gene da diidrofoliato reductase e o terminador de SV40. O vetor pZMP6 foi construído a partir do pCZR199 pela substituição do promotor de metalotioneína com o promotor precoce imediato de citomegalovírus e as seqüências Kozac na extremidade 5’ da matriz de leitura aberta.

Cem microlitros de células de levedura competentes (S. cerevisiae) foram combinadas com 10 μΐ contendo aproximadamente 1 pg do domínio extracelular de TACI e os fragmentos de PCR de Fc4 e 100 ng do vetor pZMP6 digerido com Smal e transferidos para uma cubeta de eletroporação de 0,2 cm. As misturas de levedura/DNA foram eletropulsadas a 0,75 kV (5 kV/cm), oo ohms, 25 pF. A cada cubeta foram adicionados 600 μΐ de sorbitol 1,2 M e a levedura foi colocada em placa em duas alíquotas de 300 μΐ sobre placas URA-D e incubadas a 30° C.

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Depois de cerca de 48 horas, os transformantes de levedura Ura+ de uma única placa foram recolocados em suspensão em 1 ml de água e girados ligeiramente para pelotizar as células de levedura. A pelota de célula foi recolocada em suspensão em 1 ml de tampão de lise (2 % de Triton X-100, 1 % de SDS, 100 mm de NaCl, 10 mM de Tris, pH 8,0, 1 mM de EDTA). Quinhentos microlitros da mistura de lise foram adicionados a um tubo de Eppendorf contendo 300 μΐ de pérolas de vidro lavadas com ácido e 200 μΐ de fenol-clorofórmio, turbilhonados durante intervalos de 1 minuto duas ou três vezes, seguido por um giro de 5 minutos em uma centrífuga Eppendorf na velocidade máxima. Trezentos microlitros da fase aquosa foi transferida para um tubo novo e o DNA precipitado com 600 μΐ de etanol, seguido pela centrifugação durante 10 minutos a 4° C. A pelota de DNA foi recolocada em suspensão em 100 μΐ de água.

A transformação de células de E. coli eletrocompetentes (DH10B, GibcoBRL) foi realizada com 0,5 a 2 ml de prep de DNA de levedura e ΊΟ μ! de células DlIIGD. As células finam Gc impulsadas a 2,0 kv', 25 mF e 400 ohms. A seguir da eletroporação, 1 ml de SOC (2 % BactoTryptone (Difco, Detroit, MI), 0,5 % de extrato de levedura (Difco), 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KC1, 10 mM de MgCl₂, 10 mM de MgSO₄, 20 mM de glicose) foram colocadas em placa em alíquotas de 250 μΐ em quatro placas LB AMP (caldo LB (Lennox), 1,8 % de Bacto-Agar (Difco), 100 mg/1 de Ampicilina).

Os clones individuais que abrigam a construção de expressão correta para TACI-Fc4 foram identificados pela digestão de restrição para verificar a presença do inserto e para confirmar que as várias seqüências de DNA foram unidas corretamente umas às outras. O inserto de clones positivos foram submetidos á análise de seqüência. O DNA plasmídico em escala maior é isolado usando o conjunto Qiagen Maxi (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante.

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C. Construção de F65, Fc6 e F67

Em Fc5, o resíduo Arg na posição 218 do índex EU foi mudado de volta para um resíduo de Lys. A Ig yl humana do tipo selvagem contém uma lisina nesta posição. Em resumo, as moléculas de ácido nucleico que codificam Fc5 foram produzidas usando os preparadores de oligonucleotídeo 5’

GAGCCCAAATCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCA 3’ (SEQ ID NO: 19) e 5’ TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3’ (SEQ ID NO: 20). As condições da amplificação por PCR foram como segue. A um volume final de 50 μΐ foram adicionados 236 ng de padrão Fc4, 5 μΐ de tampão de reação lOx Pfu (Stratagene), 4 μΐ de dNTPs 2,5 mM, 1 μΐ de 20 μΜ de cada um dos oligonucleotídeos e 1 μΐ de Pfu polimerase (2,5 unidades, Stratagene). O perfil térmico da amplificação consistiu de 94° C durante 2 minutos, 5 ciclos a 94° C durante 15 segundos, 42° C durante 20 segundos, 72° C durante 45 segundos, 20 ciclos a 94° C durante 15 segundos, 72° C durante 1 mmutc e 20 segund^o, evguiuu ρυι uma caicusíiu uc / nuiiuius a 72° C. O produto de reação foi fracionado pela eletroforese em gel de agarose e a faixa que corresponde ao tamanho prognosticado de cerca de 718 pares de base foi detectada. A faixa foi excisada do gel e recuperada usando um Conjunto de Extração em Gel QIAGEN QIAquick (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante.

A Fc6 é idêntica à Fc5 exceto que o códon de lisina do terminal carboxila foi eliminado. Como em Fc4 e Fc5 acima, o códon de parada na seqüência Fc6 foi mudado para TAA. A Fc6 foi gerada a partir do DNA padrão que codificou a Fc5 usando preparadores de oligonucleotídeo 5’ GAGCCCAAAT CTTCAGACAA AACTCACACA TGCCCA 3’ (SEQ ID NO: 19) e 5’ GGCGCGCCTC TAGATTAACC CGGAGACAGG GAGAGGC 3’ (SEQ ID NO: 21).

A Fc7 é idêntica à yl Fc do tipo selvagem exceto quanto a uma

• * • · ·· · substituição de aminoácido na posição Asn 297 do índex EU localizado no domínio CH₂. A Asn 297 foi mutada para um resíduo Gin para impedir a ligação do carboidrato ligado em N naquela posição de resíduo. Como acima, o códon de parada na seqüência Fc7 foi mudado para TAA. A Fc7 foi gerada pela PCR de sobreposição usando um cDNA de IgGyl Fc humana do tipo selvagem como o padrão e preparadores de oligonucleotídeo 5’ GAGCCCAAATCTTGCGACAAAACTCACA 3’ (SEQ ID NO: 22) e 5’ GTACGTGCTTTGGTACTGCTCCTCCCGCGGCTT 3’ (SEQ ID NO: 23) para gerar a metade 5’ de Fc7 e preparadores de oligonucleotídeo 5’ CAGTACCAAAGCACGTACCGTGTGGTCA 3’ (SEQ ID NO: 24) e 5’ TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3’ (SEQ ID NO: 20) para gerar a metade 3’ de Fc7. Os dois produtos de PCR foram combinados e amplificados usando preparadores de oligonucleotídeo 5’ GAGCCCAAATCTTGCGACAAAACTCACA 3’ (SEQ ID NO: 22) e 5’ TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3’ (SEQ ID NO:

Todos os produtos de PCR resultantes foram purificados em gel, clonados e verificados pela análise de seqüência de DNA.

D. Construção de Proteínas de Fusão TACI-Fc Truncadas em

Amino

Quatro versões truncadas no terminal amino de TACI-Fc foram geradas. Todas as quatro tiveram uma seqüência de sinal do ativador de plasminogênio de tecido humano modificada (SEQ ID NO: 25) fundida ao resíduo de aminoácido número 30 da SEQ ID NO: 2. Entretanto, as quatro proteínas diferiram na localização do ponto no qual a Fc5 foi fundida à seqüência de aminoácido de TACI da SEQ ID NO: 2. A Tabela 3 resume as estruturas das quatro proteínas de fusão.

·** ·· ·· • ·· «··· ····

Tabela 3

Proteínas de Fusão TACI

Designação de TACI-Fc	Resíduos de aminoácido de TACI
TACI(dl-29)-Fc5	30 a 154 da SEQIDNO: 2
TACI(dl-29, dlO7-154)-Fc5	30 a 106 da SEQIDNO: 2
TACI(dl-29, dl 11-154)-Fc5	30 a 110 da SEQIDNO: 2
TACI(dl-29, dl20-154)-Fc5	30 a 119 da SEQIDNO: 2

Cassetes de expressão que codificam a proteína foram geradas pela PCR de sobreposição usando técnicas padrão (ver, por exemplo, Horton et al., Gene 77: 61 (1989)). Uma molécula de ácido nucleico que codifica TACI e uma molécula de ácido nucleico que codifica Fc5 foram usadas como padrões de PCR. Os preparadores de oligonucleotídeo são identificados nas Tabelas 4 e 5.

Tabela 4

Preparadores de Oligonucleotídeo Usados para Produzir Proteínas de Fusão de TACI

Designação de TACI-Fc	Designações de Oligonucleotídeo
5’ TACI	3’TACI	5’Fc5	3’ Fc5
<T* A TZ .1 t -»-> r	ZC24.903	ZC2^.yoo	Z.C24.	L£C24.y4(>
TACI(dl-29, dl07-154)-Fc5	ZC24.903	ZC24.951	ZC24.949	ZC24.946
TACI(dl-29, dl 11-154)-Fc5	ZC24.903	ZC28.978	ZC28.979	ZC24.946
TACI(dl-29, d!20-154)-Fc5	ZC24.903	ZC28.981	ZC28.980	ZC24.946

Tabela 5 Seqüências de Oligonucleotídeo

Preparador	Seqüência de Nucleotídeo	SEQED NO.
ZC24.903	5’ TATTAGGCCGGCCACCATGGATGCAATGA 3’	40
ZC24.955	5’ TGAAGATTTGGGCTCCTTGAGACCTGGGA 3’	41
ZC24.952	5’ TCCCAGGTCTCAAGGAGCCCAAATCTTCA 3’	42
ZC24.946	5’ TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA 3’	20
ZC24.951	5’ TGAAGATTTGGGCTCGTTCTCACAGAAGTA 3’	43
ZC24.949	5’ ATACTTCTGTGAGAACGAGCCCAAATCTTCA 3’	44
ZC28.978	5’ TTTGGGCTCGCTCCTGAGCTTGTTCTCACA 3’	45
ZC28.979	5’ CTCAGGAGCGAGCCCAAATCTTCAGACA 3’	46
ZC28.981	5’ TTTGGGCTCCCTGAGCTCTGGTGGAA 3’	47
ZC28.980	5’ GAGCTCAGGGAGCCCAAATCTTCAGACA 3’	48

A primeira rodada de amplificações por PCR consistiu de duas reações para cada uma das quatro versões truncadas no terminal amino. As 15 duas reações foram realizadas separadamente usando os oligonucleotídeos

·· r»»* « fc «*·· ··· * * ·· *

TACI 5’ e 3’ em uma reação e os oligonucleotídeos Fc5 5’ e 3’ em uma outra reação para cada versão. As condições da primeira rodada de amplificação por PCR foram como segue. Para um volume final de 25 μΐ foram adicionados aproximadamente 200 ng de DNA padrão, 2,5 μΐ de Tampão de reação lOx Pfu (Stratagene), 2 μΐ de dNTPs 2,5 mM, 0,5 μΐ de 20 μΜ de cada oligonucleotídeo 5’ e oligonucleotídeo 3’ e 0,5 μΐ de Pfu polimerase (2,5 unidades, Stratagene). O perfil térmico da amplificação consistiu de 94° C durante 3 minutos, 35 ciclos a 94° C durante 15 segundos, 50° C durante 15 segundos, 72° C durante 2 minutos, seguidos por uma extensão de 2 minutos a 72° C. Os produtos de reação foram fracionados pela eletroforese em gel de agarose e as faixas que correspondem aos tamanhos prognosticados foram excisados a partir do gel e recuperados usando um Conjunto de Extração em Gel QIAGEN QIAQUICK (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante.

A segunda rodada de amplificação por PCR ou reação de ãiiipiifiuctçãu pur PCR áe sobreposição, foi realizada usando os fragmentos purificados em gel da primeira rodada de PCR como padrão de DNA. As condições da segunda rodada de amplificação por PCR foram como segue. Para um volume final de 25 μΐ foram adicionados aproximadamente 10 ng de DNA padrão de cada um do fragmento de TACI e do fragmento de Fc5, 2,5 μΐ de Tampão de reação lOx Pfu (Stratagene), 2 μΐ de dNTPs 2,5 mM, 0,5 μΐ de 20 pm de cada ZC24.903 (SEQ ID NO: 40) e ZC24.946 (SEQ ID NO: 20) e 0,5 μΐ de Pfu polimerase (2,5 unidades, Stratagene). O perfil térmico da amplificação consistiu de 94° C durante 1 minuto, 35 ciclos a 94° C durante 15 segundos, 55° C durante 15 segundos, 72° C durante 2 minutos, seguido por uma extensão de 2 minutos a 72° C. Os produtos de reação foram fracionados pela eletroforese em gel de agarose e as faixas que correspondem aos tamanhos prognosticados foram excisados a partir do gel e recuperados usando um Conjunto de Extração em Gel QIAGEN QIAQUICK (Qiagen), de

··»

100 tf » · ·»·*· *··· acordo com as instruções do fabricante.

Cada uma das quatro versões dos produtos de PCR de TACIFc truncados no terminal amino foram separadamente clonados usando o Conjunto de Clonagem ZEROBLUNT TOPO PCR da Invitrogen seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. A Tabela 6 identifica as seqüências de nucleotídeo e aminoácido destas construções de TACI-Fc.

Tabela 6 Seqüências de Variantes TACI-Fc

Designação de TACI-Fc	SEQ] Nucleotídeo	DbP Aminoácido
TACI(dl-29)-Fc5	49	50
TACI(dl-29, dlO7-154)-Fc5	51	52
TACI(dl-29, dlll-154)-Fc5	53	54
TACI(dl-29, dl20-154)-Fc5	55	56

Depois que as seqüências de nucleotídeo foram verificadas, os plasmídeos que compreendem cada uma das quatro versões das fusões de TACI-Fc truncadas no terminal amino foram digeridos com Fsel e Asei para liberar os segmentos que codificam aminoácido. Os fragmentos Fsel - Asei foram ligados em um vetor de expressão de mamífero cnntpnrtr» r.™ prometer CMV e um segmento poli A de SV40. Os vetores de expressão foram introduzidos em células do ovário de hamster chinês como descrito abaixo.

EXEMPLO 2

Produção de Proteínas TACI-Fc pelas Células do Ovário de Hamster Chinês

As construções de expressão TACI-Fc foram usadas para transfectar, por intermédio da eletroporação, células DG44 do ovário do hamster chinês (CHO) adaptadas em suspensão cultivadas em meio isento de proteína animal (Urlaub et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555 (1986)). As células CHO DG44 carecem de um gene da diidrofoliato reduetase funcional devido às supressões em ambas as localizações cromossômicas da diidrofoliato reduetase. O cultivo das células na presença de concentrações aumentadas de metotrexato resulta na amplificação do gene da diidrofoliato reduetase e o gene codificado pela proteína recombinante ligado na

101 ··· r ** • · ·· · • · • Β

Β· ··» ·« ···* ···· . · · · · • ··· * - ^Ί ·· construção de expressão.

As células CHO DG44 foram passadas em meio PFCHO (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 4 mM de L-Glutamina (JRH Biosciences) e suplemento de lx hipotanxina-timidina (Life Technologies) e as células foram incubada a 37° C e 5 % de CO₂ em frascos de agitação da Corning a 120 RPM em uma plataforma agitadora rotativa. As células foram transfectadas separadamente com plasmídeos de expressão linearizada. Para garantir a esterilidade, uma etapa de precipitação com etanol única foi realizada em gelo durante 25 minutos combinando-se 200 pg de DNA plasmídico em um tubo Eppendorf com 20 μΐ de DNA carregador de esperma de salmão cisalhado (5’ —> 3’ Inc. Boulder, CO, 10 mg/ml), 22 μΐ de NaOAc 3 M (pH 5,2) e 484 μΐ de 100 % de etanol (Gold Shield Chemical Co., Hayward, CA). Depois da incubação, o tubo foi centrifugado a 14.000 RPM em uma microcentrífuga colocada em um ambiente frio a 4° C, o sobrenadante removido e a pelota lavada duas vezes com 0,5 ml de etanol a 70 % e deixado secar ao ar.

As células CHO DG44 foram preparadas enquanto a pelota de DNA foi secada por centrifugação de 10⁶ células totais (16,5 ml) em um tubo de centrífuga cônico de 25 ml a 900 RPM durante 5 minutos. As células CHO DG44 foram recolocadas em suspensão em um volume total de 300 μΐ de meio de cultivo PFCHO e colocadas em uma Cubeta Gene-Pulser com um intervalo de elétrodo de 0,4 cm (Bio-Rad). O DNA, depois de aproximadamente 50 minutos de tempo de secagem, foi recolocado em suspensão em 500 μΐ de meio de cultivo PFCHO e adicionado às células na cubeta de modo que o volume total não excedesse 800 μΐ e foi deixado sedimentar na temperatura ambiente durante 5 minutos até a diminuição da formação de bolhas. A cubeta foi colocada em uma unidade BioRad Gene Pulser II ajustada a 0,296 kV (kilovolts) e 0,950 HC (capacitância alta) e imediatamente eletroporada.

As células foram incubadas 5 minutos na temperatura

102 • · ambiente antes de colocar em 20 ml de volume total de meio PFCHO em um frasco CoStar T-75. O frasco foi colocado a 37° C e 5 % de CO₂ durante 48 horas quando as células foram depois contadas pelo hemocitômetro utilizando exclusão em azul de tripan e colocado em meio de seleção PFCHO sem suplemento de hipotanxina-timidina e contendo 200 mM de metotrexato (Cal Biochem).

Na recuperação do processo de seleção de metotrexato, o meio condicionado contendo as proteínas TACI-Fc secretadas foram examinado pela análise de Western Blot.

EXEMPLO 3

Análise estrutural de Proteínas TACI-Fc

Em certos casos, as proteínas de fusão TACI-Fc foram parcialmente purificados antes da análise. O meio condicionado das culturas de ovário de hamster chinês foi filtrado estéril através de um filtro de 0,22 pm e a proteína TACI-Fc foi capturada em uma coluna de proteína A. O material ligado à proteína A fui ciuído e passado em uma coluna de exclusão de tamanho S-200 para a purificação final.

A análise de Western blot foi realizada tanto no meio de célula condicionada quanto na proteína purificada para avaliar a estabilidade estrutural das proteínas TACI-Fc. Em resumo, as amostras de proteína ou sobrenadante foram transferidas para membranas de nitrocelulose e as proteínas TACI-Fc foram detectadas usando IgG2a anti-camundongo de cabra conjugado a peroxidase (Boehringer Mannheim) ou antissoros específicos de IgG Fc anti-humano de cabra conjugado a peroxidase (Pierce).

As análises de seqüência de aminoácido do terminal amino foram realizadas em Sistemas de Seqüenciador de Proteína Modelos 476A e 494 da Perkin Elmer Applied Biosystems Division (Foster City, CA). A análise dos dados foi realizada com o Sistema de Análise de Dados para Seqüenciamento de Proteína Applied Biosystems Model 610A, versão 2.1a

103 • · • · (Applied Biosystems, Inc.). A maior parte dos suprimentos e reagentes usados foram da Applied Biosystems, Inc.

EXEMPLO 4

Análise Funcional de Proteínas TACI-Fc

Dois métodos foram usados para examinar as características de ligação de quatro proteínas TACI-Fc com ZTNF4. Um método mediu a capacidade das construções TACI-Fc para competir com as placas revestidas com TACI quanto a ligação de ZTNF4 rotulado com ¹²⁵I. No segundo método, concentrações crescentes de ZTNF4 rotulado com ¹²⁵I, foram incubadas com cada uma das construções TACI-Fc e a radioatividade associada com os complexos ZTNF4-TACI-Fc precipitados foi determinada. As proteínas de fusão TACI-Fc tiveram porções TACI que careceram dos primeiros 29 resíduos de aminoácido da seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. Uma das proteínas de fusão tiveram uma porção de TACI com uma região do pedículo intacta (TACI (dl-29)-Fc5), ao passo que três das proteínas Hp fúsãe dc TACI-Fv íivcram porções TACI com várias supressões na região do pedículo (TACI (dl-29, dlO7-154)-Fc5; TACI (d 1-29, dl 11154)-Fc5; TACI (dl-29, dl20-154)-Fc5).

A. Ensaio de Ligação Competitiva

ZTNF4 foi radiodado com Iodopérolas (Pierce), seguindo métodos padrão. Em resumo, 50 pg do ZTNF4 foi iodado com 4 mCi de ¹²⁵I usando uma Iodopérola única. A reação foi extinta com uma solução 0,25 % de albumina sérica bovina e o ¹²⁵I livre foi removido pela filtração em gel usando uma coluna PD-10 (Pierce). A radioatividade específica das preparações de I-ZTNF4 foi determinada pela precipitação com ácido tricloroacético antes e depois da etapa de dessalinização.

Um fragmento de terminal N do receptor de TACI, designado como “TACI-N,” foi adicionado às placas de 96 reservatórios (100 μΐ a 0,1 pg/ml) e incubadas durante a noite a 4° C. As placas foram lavadas,

104 • · bloqueadas com Superblock (Pierce) e lavadas novamente. As construções TACI-Fc, em várias concentrações que variam de 0 a 11,5 ng/ml, foram misturadas com uma concentração fixa de I-ZTNF4 (20 ng/ml) e incubadas durante 2 horas a 37° C na placa revestida com TACI-N. Os controles contiveram TACI-N em solução ou careceu de TACI-Fc. Depois da incubação, as placas foram lavadas e contadas, cada determinação foi realizada em triplicata.

Os resultados mostraram que todas as construções TACI-Fc inibiram a ligação I-ZTNF4 completamente em concentrações de cerca de 100 ng/ml ou maiores. As proteínas TACI-Fc, TACI (dl-29)-Fc5, TACI (dl29, dl 11-154)-Fc5 e TACI (dl-29, dl20-154)-Fc5, foram inibidores mais eficazes do que a construção TACI-Fc, TACI (dl-29, dlO7-154)-Fc5. Um fragmento Fc sozinho não inibe a ligação. Os valores IC₅₀ foram calculados para cada construção em três experimentos. Os valores médios para as construções foram: TACI (dl-29)-Fc5: 2,07 nM; TACI (dl-29, dl07-154)Fc5: 4.95 nM_: T_ACI (dl 29, dl 11-154)-Fc5: 2,31 nM; e TACI (dl-29, dl20154)-Fc5: 2,21 nM.

B. Ensaio de Ligação em Solução

A uma concentração de 0,05 nM, cada construção de TACI-Fc foi incubada com 0,4 pM a 1,5 nM de ¹²⁵I-ZTNF4 durante 30 minutos na temperatura ambiente em um volume total de 0,25 ml/tubo. Uma suspensão de Pansorbin (Staph A) foi adicionada a cada tubo e depois de 15 minutos, as amostras foram centrifugadas, lavadas duas vezes e as pelotas contadas. A ligação não específica foi determinada pela adição de 130 nM de ZTNF4 não rotulado à mistura ¹²⁵I-ZTNF4/TACI-Fc. A ligação específica foi calculada subtraindo-se a ligação cpm na presença de ZTNF4 não rotulado da ligação cpm total em cada concentração de ¹²⁵I-ZTNF4. Cada determinação foi realizada em triplicata. As constantes de ligação foram calculadas usando o software GraphPad Prism (Macintosh v. 3.0).

• ·

105 _ 1 A Figura 4 ilustra a ligação específica de I-ZTNF4 às várias construções de TACI-Fc. A ligação pareceu se aproximar da saturação com cada construção e foi significantemente mais alta para as construções TACI (dl-29)-Fc5, TACI (dl-29, dlll-154)-Fc5, TACI (dl-29, dl20-154)-Fc5, quando comparada com a ligação de TACI (dl-29, d!07-154)-Fc5. Os valores

Bmax e Kd foram calculados e os resultados estão resumidos na Tabela 7. Tabela 7

Ligação de ¹²⁵I-ZTNF4 às Construções de TACI-Fc

Construção de TACI-Fc	Kd(nM)	Bmax (nM)
TACI (dl-29)-Fc5	0,134	0,023
TACI (dl-29, dlO7-154)-Fc5	0,121	0,010
TACI (dl-29, dlll-154)-Fc5	0,115	0,018
TACI (dl-29, dl20-154)-Fc5	0,092	0,021

EXEMPLO 5

Medição de ZTNF4 Circulante

Os níveis de ZTNF4 em indivíduos com uma condição de doença (tal como SLE, artrite reumatóide por exemplo) em relação aos indivíduos normais foram determinados usando um ensaio de eletroquimioluminescência. Um curva padrão preparada a partir de ZTNF4 solúvel, humano a 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,01 ng/ml e 0 ng/ml foi preparada em tampão ORIGIN (Igen, Gaithersburg, MD). As amostras de soro foram diluídas em tampão ORIGIN. Os padrões e amostras foram incubadas na temperatura ambiente durante duas horas com anticorpo ZTNF4-NF BV anti-ser humano de coelho biotinilado diluído a 1 pg/ml em Tampão de Ensaio Origin (IGEN) e anticorpo policlonal ZTNF4-NF BV antiser humano de coelho rutenilado diluído a 1 pg/ml em Tampão de Ensaio Origin (IGEN). A seguir da incubação as amostras foram turbilhonadas e 0,4 mg/ml de Dynabeads estreptavidina (Dynal, Oslo, Norway) foi adicionado a cada um dos padrões e amostras a 50 μΐ/tubo e incubadas durante 30 minutos na temperatura ambiente. As amostras foram depois turbilhonadas e as amostras foram lidas em um Analisador Origin (Igen) de acordo com as

106 ··

instruções do fabricante. O ensaio da Origin está fundamentado na eletroquimioluminescência e produz uma leitura em ECL. Em um estudo, um nível elevado de ZTNF4 foi detectado nas amostras de soro tanto de camundongos NZBWF1/J quanto MRL/Mpj-Fas^lpr, que progrediram a estágios avançados de glomerulonefrite e doença autoimune.

O ENSAIO ORIGIN também foi usado para medir níveis de ZTNF4 no sangue de pacientes SLE, em relação aos níveis circulantes em indivíduos normais. Uma curva padrão preparada a partir de ZTNF4 solúvel, humano a 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,01 ng/ml e 0 ng/ml foi preparada em tampão ORIGIN (Igen). Todas as amostras de paciente foram conduzidas em triplicata com um volume final de 25 μΐ. Os padrões e amostras foram incubadas na temperatura ambiente durante duas horas com um anticorpo de captura, anticorpo policlonal ZTNF4-NF BV anti-humano de coelho biotinilado, diluídos a 1 pg/ml em Tampão de Ensaio Origin (IGEN) e um anticorpo de detecção, anticorpo policlonal ZTNF4-NF BV anti-humano de coclliv luicniladu, diiuído a i pg/mí em Tampao cie Ensaio Ongm (IGEN). A seguir da incubação as amostras foram turbilhonadas e 0,4 mg/ml de Dynabeads estreptavidina (Dynal) foi adicionado a cada um dos padrões e amostras a 50 μΐ/tubo e incubados durante 30 minutos na temperatura ambiente. As amostras foram depois turbilhonadas e analisadas usando um Analisador Origin 1.5 (Igen) de acordo com as instruções do fabricante.

Este ensaio incluiu 28 amostras de controle normais e amostras de 20 pacientes diagnosticados com SLE. Os níveis elevados de ZTNF4 foram observados no soro de pacientes diagnosticados com SLE, quando comparado com doadores de soro de controle normal. Os níveis de ZTNF4 foram calculados como um aumento de dobra de níveis de ZTNF4 nas amostras do paciente ou de controle quando comparado a uma amostra de soro de referência humano arbitrário. A média das 28 amostras de controle foi de 1,36 vezes além da amostra de referência humana e a média das 20 • ·

107

amostras de paciente SLE foi 4,92. Sete dos 20 pacientes SLE tiveram níveis de ZTNF4 que foram duas vezes acima da média da amostras de controle, ao passo que houve apenas um indivíduo de controle que teve um nível maior do que duas vezes acima da média de controle.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que compreende:

(a) uma porção do receptor de TACI que consiste em:

(i) resíduos de aminoácido 34 a 104 de SEQ ID NO: 2,

5 (ii) resíduos de aminoácido 30 a 110 de SEQ ID NO:2, ou (iii) resíduos de aminoácido 30 a 154 de SEQ ID NO: 2; em que a porção do receptor de TACI liga pelo menos um de

ZTNF2 ou ZTNF4, e (b) uma porção de imunoglobulina que compreende um 10 domínio de região constante de cadeia pesada de uma imunoglobulina.
2. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a porção do receptor de TACI consiste dos resíduos de aminoácido 34 a 104 de SEQ ID NO:2, e em que a proteína de fusão compreende ainda um segmento de pedículo (stalk) consistindo em uma

15 série contínua de 2 a 50 resíduos de aminoácidos consecutivos iniciando a partir do resíduo de aminoácido 105 de SEQ ID NO:2.
3. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a porção de imunoglobulina compreende um domínio de região constante de cadeia pesada humano.

20
4. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a região constante de cadeia pesada é um domínio de região constante de cadeia pesada de IgGl.
5. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o domínio de região constante de cadeia pesada

25 é um fragmento Fc de IgGl que compreende os domínios Ch2 e Ch3.
6. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o domínio de região constante de cadeia pesada é um fragmento Fc de IgGl que compreende a sequência de aminoácidos da

Petição 870180051926, de 18/06/2018, pág. 7/9

SEQ ID NO: 33.
7. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54.

5
8. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão de TACI-imunoglobulina compreende uma forma secretada da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54.
9. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, 10 caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão TACI-imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, em que a sequência líder tPA otimizada (otPA) (SEQ ID NO:25) foi removida.
10. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão de

15 TACI-imunoglobulina é um dímero.
11. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos de SEQIDNO:53.
12. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação

20 11, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico consiste na sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 53.
13. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 53, em que a sequência que

25 codifica a sequência líder tPA otimizada (otPA) (SEQ ID NO:25) foi removida.

Petição 870180051926, de 18/06/2018, pág. 8/9

1/7

10 20 30 _ 40 50

MSGLGRSRRG GRSRVDQEER FPQGLWTGVA MRSCPEEQYW _DPLLGTCMSC

60 ⁷⁰ _ 80 90 100

KTÍamQSQR^TCAÁFCRSLS CRKEQGKFYD HLLRDCISCA *SÍÇGQHPKQÇ | 110 120 130 140 150

AYFCENKLRS PVNLPPELRR QRSGEVENNS DNSGRYQGLE HRGSEASPAL

160

PGLKLSADQV

170

180

LGLC LCAVLCCFLV

AVACFL

190

KKRG

200

DPCSCQPRSR

210 220 ^30 zsu 250

SSQ jjhAMEAGSPV STSPEPVETC SFCFPECRAP TQESAVTPGT

260 270 280 290

PDPTCAGRWG chtrttvlqp cphipdsglg ivcvpaqegg pga