ES2333334T3 - Lawsonia intracellularis de origen europeo y vacunas, agentes de diagnostico y metodos de uso de la misma. - Google Patents
Lawsonia intracellularis de origen europeo y vacunas, agentes de diagnostico y metodos de uso de la misma. Download PDFInfo
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Abstract
Una cepa clínica virulenta de Lawsonia intracellularis, en la que dicha cepa clínica virulenta es la cepa clínica de Lawsonia intracellularis depositada en la ATCC con el nº PTA-4927 o cualquier cepa clínica avirulenta de Lawsonia intracellularis de origen europeo, caracterizada porque dicha Lawsonia intracellularis avirulenta no provoca la presencia en heces el día 14 después de la vacunación.
Description
Lawsonia intracellularis de origen
europeo y vacuna, agentes de diagnóstico y métodos de uso de la
misma.
La presente invención trata de vacunas de
Lawsonia intracellularis y describe métodos para proteger
frente a, y diagnosticar, una infección por L.
intracellularis. Los productos y procesos de la invención son
posibles, en parte, como resultado de un método mejorado para
cultivar provisiones a gran escala de L. intracellularis,
incluyendo tanto una nueva cepa clínica de L. intracellularis
de origen europeo como un método para preparar un producto
liofilizado que contiene la cepa clínica europea atenuada como un
producto de vacuna.
L. intracellularis, el agente causal de
la enteropatía proliferativa porcina ("PPE"), afecta
prácticamente a todos los animales, incluyendo: conejos, hurones,
hámsters, zorros, caballos y otros animales tan distintos como
avestruces y emus. L. intracellularis es una causa
particularmente grande de pérdidas en el ganado porcino de Europa,
así como de los Estados Unidos.
Una característica uniforme de la PPE es la
aparición de bacilos curvados intracitoplasmáticos no unidos a la
membrana dentro de los enterocitos de las porciones afectadas del
intestino. La bacteria asociada con la PPE se ha denominado
"organismos de tipo Campylobacter". S. McOrist y col.,
Vet. Pathol., Vol. 26, 260-264 (1989).
Posteriormente, se ha identificado la bacteria causal como un nuevo
género y especie taxonómicos, comúnmente denominada Ileal
symbiont (IS) intracellularis. C. Gebhart y col.,
Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 43, nº 3,
533-538 (1993). Más recientemente, estas nuevas
bacterias han recibido el nombre taxonómico de Lawsonia
(L.) intracellularis. S. McOrist y col., Int'l.
J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, nº 4, 820-825
(1995). Estos tres nombres se han usado de forma intercambiable para
referirse al mismo organismo, según se identificará y describirá
adicionalmente en este documento.
L. intracellularis es una bacteria
intracelular obligada que no puede cultivarse mediante los métodos
bacteriológicos normales en un medio acelular convencional, y se ha
creído que requiere de células epiteliales adheridas para su
crecimiento. S. McOrist y col., Infection and Immunity, Vol.
61, nº 19, 4286-4292 (1993) y G. Lawson y
col., J. of Clinical Microbiology, Vol. 31, nº 5,
1136-1142 (1993) discuten sobre el cultivo de L.
intracellularis usando monocapas de células
IEC-18 epiteliales intestinales de rata en matraces
de cultivo tisular convencionales. Además, H. Stills, Infection and
Immunity, Vol. 59, nº 9, 3227-3236 (1991) discuten
el uso de monocapas de células Intestine 407 intestinales
embrionarias humanas y monocapas de células colónicas de
adenocarcinoma GPC-16 de cobaya en matraces de
cultivo tisular convencionales.
Recientemente se ha aprobado una vacuna de L.
intracellularis para su uso en los Estados Unidos, vacuna que
está basada en las cepas clínicas de L. intracellularis
descritas y reivindicadas en las patentes de Estados Unidos
n^{os} 5.714.375 y 5.885.823. La vacuna descrita anteriormente es
comercializada por Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc., 2621 North
Belt Highway, St. Joseph, Missouri 64506-2002, con
el nombre comercial ENTERISOL® Ileitis e incluye bacterias L.
intracellularis vivas atenuadas de origen norteamericano.
Un objeto de la invención es proporcionar una
vacuna mejorada de L. intracellularis usando una cepa clínica
de origen europeo.
Otro objeto de la invención es proporcionar un
método de cultivo mejorado de L. intracellularis a gran
escala y técnicas mejoradas para la producción de vacunas de L.
intracellularis.
Para conseguir estos y otros objetos, y según el
propósito de la invención, según se ejemplifica y se describe
ampliamente en este documento, la presente invención proporciona una
nueva cepa clínica de L. intracellularis de Europa, un
método para atenuar dicha cepa clínica y la cepa clínica atenuada
del mismo. En este documento también se proporciona una vacuna que
comprende la cepa clínica atenuada. En este documento también se
proporciona un método para producir una vacuna que comprende la
cepa clínica atenuada en forma liofilizada para su reconstitución
en el momento de su administración y el producto liofilizado de la
misma.
En una forma de realización, la nueva cepa
clínica L. intracellularis de Europa, la cepa clínica DK
15540, es la cepa clínica depositada en la ATCC con el nº de acceso
PTA-4927. En otra forma de realización, la cepa
clínica atenuada derivada de la cepa clínica DK 15540, se denomina
cepa clínica B3903, con el nº de acceso de la ATCC
PTA-4926.
Según se usa en este documento, el término
"L. intracellularis" significa la bacteria intracelular
curvada gram-negativa descrita detalladamente por
C. Gebhart y col., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol.
43, nº 3, 533-538 (1993) y S. McOrist y col.,
Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, nº 4,
820-825 (1995), cada uno de las cuales se incorpora
al presente documento como referencia en su totalidad, e incluye,
pero no se limita a, la cepa clínica denominada DK 15540 que se
depositó bajo el Tratado de Budapest con la American Type Culture
Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia
20110-2209 el 9 de enero de 2003 y se le asignó el
número de acceso de la ATCC PTA-4927; bacteria
causal que puede obtenerse a partir de cerdos o de otros animales
infectados por PPE por todo el mundo dados los conocimientos en la
materia y las enseñanzas de este documento; y variantes o mutantes
de cualquiera de las anteriores bacterias, obtenidas tanto
espontánea como artificialmente.
Según se usa en este documento, la expresión
"cepa clínica atenuada" significa cualquier cepa clínica de
L. intracellularis que se prepara según las técnicas de
cultivo y de pase enseñadas en este documento para conseguir la
avirulencia manteniendo a la vez las propiedades inmunógenas cuando
se administra a un animal hospedador, incluyendo, pero no
limitándose a, la cepa clínica atenuada denominada
B-3903 que se depositó bajo el Tratado de Budapest
con la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard,
Manassas, Virginia 20110-2209 el 9 de enero de 2003
y se le asignó el número de acceso PTA-4926.
La cepa clínica atenuada de la invención puede
usarse como inmunógeno en vacunas antimicrobianas para animales,
incluyendo aves, peces y mamíferos tales como vacas, cerdos,
caballos y primates. Dichas vacunas pueden prepararse mediante las
técnicas conocidas por los expertos en la materia y dadas las
enseñanzas contenidas en este documento. Dicha vacuna comprendería
una cantidad inmunológicamente eficaz de la cepa clínica atenuada en
un vehículo farmacéuticamente aceptable. La vacuna podría ser
administrada en una o más dosis. Una cantidad inmunológicamente
eficaz se determina mediante los medios conocidos en la materia sin
una experimentación ilícita, dadas las enseñanzas contenidas en
este documento. La cantidad de bacterias avirulentas debería ser
suficiente para estimular una respuesta inmune en animales
susceptibles a la enfermedad siendo todavía avirulentas. Esto
dependerá del animal en particular, de las bacterias y de la
enfermedad implicada. La dosis recomendada a administrar al animal
susceptible es preferiblemente de aproximadamente una TCID_{50}
(dosis infectiva del cultivo tisular al 50% del punto final)/dosis
de 3,0 hasta aproximadamente una TCID_{50}/dosis de 6,0, y más
preferiblemente de aproximadamente una TCID_{50}/dosis de 4,0
hasta aproximadamente una TCID_{50}/dosis de 5,0. En una forma de
realización preferible, el título de la vacuna es de aproximadamente
una TCID_{50}/dosis de 4,9, según se determina mediante el ensayo
de Dosis Infectiva Del Cultivo Tisular al 50% de dilución del punto
final (TCID_{50}). Los vehículos son conocidos por los expertos en
la materia, e incluyen estabilizantes y diluyentes. Dicha vacuna
también puede contener un coadyuvante apropiado. Las vacunas de la
invención pueden usarse en combinación con otras vacunas, por
ejemplo, como diluyente de otra vacuna. Las preparaciones de la
vacuna también pueden desecarse, por ejemplo, mediante
liofilización, con el propósito de su almacenamiento o para su
subsiguiente formulación en vacunas líquidas.
Consecuentemente, la descripción también
comprende un método para inducir una respuesta inmune ante bacterias
virulentas naturales de L. intracellularis en un hospedador
animal con el propósito de proteger a ese hospedador de dichas
bacterias. El método comprende la administración de una cantidad
inmunológicamente eficaz de bacterias atenuadas de la invención al
hospedador, y preferiblemente, la administración de la vacuna de la
invención al hospedador.
Según se usa en este documento, la expresión
"cultivo a gran escala" significa un nivel de cultivo de L.
intracellularis mayor de aproximadamente 2,0 a 3,0 litros, e
incluye la producción a una escala de 100 litros o más.
"Cultivo" según se usa en este documento, significa el proceso
de promover el crecimiento, la reproducción y/o la proliferación de
L. intracellularis.
L. intracellularis puede ser cultivada
mediante los métodos conocidos en la materia, preferiblemente según
las patentes de Estados Unidos n^{os} 5.714.375 y 5.885.823. Por
ejemplo, las células del cultivo pueden ser inoculadas en primer
lugar con un inóculo que comprende bacterias de L.
intracellularis de forma que las células se infecten con las
bacterias. Pueden usarse numerosas líneas celulares en la práctica
de la invención, incluyendo, pero no limitándose a,
IEC-18 (ATCC 1589)-células
epiteliales intestinales de rata, HEp-2 (ATCC
23)-células de carcinoma epidermoide humano, McCoys
(ATCC 1696)-células del ratón (no especificadas),
BGMK (Biowhittaker #71-176)-células
de riñón de mono verde africano, y células epiteliales intestinales
porcinas. Las células del cultivo preferibles son células
HEp-2, McCoys o IEC-18.
Si se usan células de cultivo, antes de ser
inoculadas, las células deben estar en forma de una monocapa. Para
formar una monocapa, las células pueden sembrarse en matraces
convencionales. Cada matraz se siembra generalmente con entre
aproximadamente 1 x 10^{5} células hasta aproximadamente 10 x
10^{5} células por 25, 75, 150, 850 cm^{2} de matraz o frasco
rotatorio mezcladas con medio de crecimiento. El medio de
crecimiento puede ser cualquier medio para el cultivo celular que
incluya una fuente de nitrógeno, los factores de crecimiento
necesario para las células del cultivo elegidas y una fuente de
carbono, tal como glucosa o lactosa. El medio preferible es DMEM
reforzado con Ham F 12 con un 1-5% de suero bovino
fetal, aunque puede usarse otro medio disponible comercialmente con
buenos resultados.
El cultivo satisfactorio de L.
intracellularis se mejora manteniendo las células del cultivo en
un estado de constante crecimiento. Por lo tanto, la monocapa de
células del cultivo debería de estar en aproximadamente el 20 por
ciento hasta aproximadamente el 50 por ciento de confluencia en el
momento de la inoculación. Preferiblemente, las células deberían
estar en aproximadamente el 30 por ciento hasta aproximadamente en
40 por ciento de confluencia en el momento de la inoculación, muy
preferiblemente a aproximadamente el 30 por ciento de
confluencia.
Alternativamente, las células, antes de ser
inoculadas, pueden hacerse crecer en suspensión, según se describe
a continuación. Preferiblemente, las células se hacen crecer en
primer lugar hasta una confluencia del 100% en forma de una
monocapa en un sistema de tipo adherente, por ejemplo, un sistema de
frasco rotatorio, y después se transfieren a 3-3000
litros y se hacen crecer en suspensión. Alternativamente, las
células pueden hacerse crecer en suspensión hasta la densidad
celular deseada, por ejemplo, de 2 x 10^{5} células/ml, dentro del
depósito de 3-3000 litros (biorreactor,
fermentador, matraz de agitación, etc.) usando los parámetros
adecuados para el crecimiento dentro de este sistema antes de la
inoculación.
El inóculo puede ser un cultivo puro de L.
intracellularis obtenido a partir de cerdos o de otros animales
infectados. Preferiblemente el inóculo puede ser un cultivo puro de
L. intracellularis obtenido del nº de acceso de la
ATCC
PTA-4927.
PTA-4927.
El inóculo puede ser un homogeneizado intestinal
preparado mediante el raspado de la mucosa del íleon de un cerdo o
de otro animal infectado con PPE. Cuando se prepara un homogeneizado
intestinal, las secciones del íleon elegidas para el cultivo
deberían mostrar lesiones graves con un engrosamiento macroscópico
del intestino. Debido a la naturaleza frágil de las bacterias, las
muestras deberían almacenarse preferiblemente a -70ºC tan rápido
como sea posible tras la necropsia. Preferiblemente se añade un
antibiótico al cual sea resistente L. intracellularis tal
como vancomicina, anfotericina B o miembros del grupo de
antibióticos aminoglucósidos, incluyendo gentamicina y neomicina,
por nombrar algunos, al inóculo para eliminar las bacterias
contaminantes a la vez que se permite el crecimiento de L.
intracellularis. Tanto si el inóculo es un cultivo puro como si
es un homogeneizado intestinal, la inoculación de las células
del cultivo puede realizarse mediante varias técnicas conocidas en la materia, dadas las enseñanzas de este documento.
del cultivo puede realizarse mediante varias técnicas conocidas en la materia, dadas las enseñanzas de este documento.
Las bacterias y/o las células del cultivo
inoculadas se incuban entonces con una concentración reducida de
O_{2} disuelto. Con concentraciones de oxígeno disuelto mayores
del 10% el crecimiento de L. intracellularis es inferior al
óptimo, produciéndose finalmente el cese del crecimiento con unas
concentraciones de oxígeno fuera de este intervalo.
Preferiblemente, las bacterias y/o las células del cultivo
inoculadas se incuban con una concentración de oxígeno disuelto en
el intervalo de aproximadamente el 0% hasta aproximadamente el 10%.
Más preferiblemente, las bacterias y/o las células del cultivo se
incuban con una concentración de oxígeno en el intervalo de
aproximadamente el 0% hasta aproximadamente el 8%, siendo muy
preferible una concentración de oxígeno de aproximadamente el 0%
hasta aproximadamente el 3,0%.
La concentración apropiada de dióxido de carbono
también es importante para un adecuado crecimiento de L.
intracellularis. Con concentraciones de dióxido de carbono
mayores del 0% y menores del 4%, se produce un crecimiento no
óptimo, produciéndose finalmente el cese del crecimiento con unas
concentraciones de dióxido de carbono fuera de este intervalo.
Preferiblemente, la concentración de dióxido de carbono está en el
intervalo de desde aproximadamente el 6% hasta aproximadamente el
10%, siendo muy preferible una concentración de dióxido de carbono
de aproximadamente el 8,8%.
Además, las células se incuban preferiblemente
con una concentración de hidrógeno en el intervalo de desde
aproximadamente el 4% hasta aproximadamente el 10%. Muy
preferiblemente, las células se incuban en aproximadamente el 0
hasta aproximadamente el 8,0% de O_{2}, aproximadamente el 8,8% de
CO_{2}, y aproximadamente el 4% de H_{2}. El nitrógeno se usa
como "compensador" en la mezcla de gases, que contiene
nitrógeno (96%) e hidrógeno (4%) o nitrógeno (80%), dióxido de
carbono (10%) e hidrógeno (10%) para el crecimiento de este
organismo. Las células se incuban preferiblemente con una
concentración de nitrógeno en el intervalo de desde aproximadamente
el 80% hasta el 96%. Por lo tanto, las células se incuban muy
preferiblemente en aproximadamente el 0 hasta aproximadamente el
8,0% de O_{2}, aproximadamente el 8,8% de CO_{2},
aproximadamente el 4% de H_{2} y aproximadamente el 96% de
N_{2}.
Las células inoculadas pueden incubarse en un
incubador gaseoso doble o en otras cámaras de gas que contengan las
concentraciones apropiadas de hidrógeno, oxígeno y dióxido de
carbono y que permitan a las células estar suspendidas durante la
incubación. La cámara debería comprender un medio para mantener las
células inoculadas en suspensión, y un monitor de gases y una
fuente de suministro para suministrar y mantener las concentraciones
apropiadas de gases. La temperatura de incubación debería estar en
el intervalo de desde 30ºC hasta aproximadamente 45ºC y más
preferiblemente está en el intervalo de desde aproximadamente 36ºC
hasta aproximadamente 38ºC. Muy preferiblemente, la temperatura es
de aproximadamente 37ºC. El equipo necesario para el cultivo y la
atenuación es fácilmente accesible para los expertos habituales en
la materia, dadas las enseñanzas de este documento. Un ejemplo de
un equipo adecuado para llevar a cabo la presente invención es un
incubador gaseoso doble, por ejemplo, el modelo 480
(Lab-Line, Melrose Park, IL) junto con matraces de
agitación para mantener las células en suspensión. El equipo
actualmente preferible comprende un fermentador, un biorreactor, una
placa vibradora o un agitador rotatorio que contiene al menos
aproximadamente 2 litros de medio y que es capaz de mantener las
células del cultivo en suspensión mediante el rociado de un gas a la
concentración apropiada, u otros medios de agitación mecánica, y
una monitorización continua de los niveles de O_{2} disuelto en el
medio. New Brunswick, Braun y otras compañías fabrican
fermentadores y biorreactores adecuados para este propósito.
Manteniendo las células inoculadas en un estado
de suspensión durante la incubación, se obtiene un crecimiento
máximo de las células, y por tanto, de L. intracellularis,
aumentando la exposición de cada célula individual al medio de
crecimiento y a la mezcla adecuada de hidrógeno, oxígeno y dióxido
de carbono. Las células del cultivo pueden agitarse y mantenerse en
suspensión mediante una variedad de métodos conocidos en la materia,
incluyendo, por ejemplo, matraces del cultivo, frascos rotatorios,
cultivos de membrana, BioBags, sistemas de biorreactor WAVE^{TM},
fermentadores y matraces de agitación. Las células pueden mantenerse
en suspensión durante la incubación incubando las células en un
matraz de agitación dentro de un incubador gaseoso doble o un
aparato similar. El término "matraz de agitación", según se usa
en este documento, significa un matraz u otro recipiente que emplea
una pala, una hélice u otro medio para agitar el cultivo y mantener
las células contenidas en el mismo en suspensión.
En una forma de realización preferible, las
células inoculadas se incuban hasta que las células alcanzan la
confluencia, y entonces las células se colocan en un matraz de
agitación que contiene medio de crecimiento y se incuban en un
incubador gaseoso doble mientras se hace girar el matraz.
Preferiblemente, las células inoculadas se raspan o se tripsinizan
y se pasan al matraz de agitación. Esto puede conseguirse mediante
una variedad de métodos conocidos en la materia, tal como usar un
raspador celular para desprender las células. Una vez que las
células han sido introducidas en el matraz de agitación, la pala del
matraz de agitación se hace girar típicamente en el intervalo de
desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 500 rpm sobre una
placa de agitación magnética con objeto de mantener las células
infectadas en suspensión.
Una porción de la L. intracellularis
cultivada se pasa entonces a un cultivo nuevo para aumentar la
producción de las bacterias L. intracellularis. El término
"pasar" o variaciones del mismo en este documento significa el
proceso de transferir una porción de la L. intracellularis
cultivada a células de cultivo nuevo con objeto de infectar las
células nuevas con la bacteria. El término "nuevas", según se
usa en este documento, significa células que todavía no han sido
infectadas por L. intracellularis. Preferiblemente dichas
células tienen una media de no más de aproximadamente un día de
edad.
El pase de L. intracellularis en cultivos
en suspensión puede conseguirse retirando una porción del cultivo
original y añadiéndola a un nuevo matraz que contiene células de
cultivo nuevas. Si el cultivo original tiene un elevado número de
bacterias/ml, por ejemplo, mayor de aproximadamente 10^{4}
bacterias/ml, es preferible añadir entre aproximadamente el 1 y el
10% (volumen en volumen) de cultivo desde el matraz infectado a un
nuevo matraz que contiene células nuevas. Esto se realiza
preferiblemente cuando el 50-100% de las células
están infectadas. Si hay menos del 50% de células infectadas, el
pase se realiza preferiblemente dividiendo el cultivo en 1:2 en un
nuevo matraz y completando el volumen añadiendo células de cultivo
tisular y medio nuevos. En cualquier caso, no son necesarias las
etapas de lisis celular ni otras etapas, en contraste directo con
el pase de cultivos en monocapa, como en la técnica anterior.
Después de un crecimiento suficiente de las
células del cultivo y de la subsiguiente infección por L.
intracellularis, según se determina mediante una tinción con
anticuerpos por fluorescencia indirecta (IFA), mediante la
TCID_{50} u otro método comparable, se recolecta después al menos
una porción de las bacterias L. intracellularis cultivadas.
La recolección se realiza típicamente a una infectividad celular de
aproximadamente 60% o mayor; sin embargo, el experto en la materia
sabe que la recolección podría realizarse a una infectividad celular
de menos del 60%. La etapa de recolección puede realizarse
separando las bacterias de la suspensión mediante varias técnicas
conocidas por los expertos habituales una materia, dadas las
enseñanzas de este documento. Preferiblemente, las bacterias L.
intracellularis se recolectan centrifugando el contenido de
todos o de una porción de la suspensión para sedimentar las células
del cultivo, resuspendiendo los sedimentos celulares resultantes y
lisando las células infectadas. Típicamente, al menos una porción
del contenido se centrifuga a aproximadamente 3000 x g durante
aproximadamente 20 minutos con objeto de sedimentar las células y
las bacterias. Entonces el sedimento puede resuspenderse en, por
ejemplo, una disolución de
sacarosa-fosfato-glutamato (SPG) y
hacerse pasar aproximadamente 20 veces a través de una aguja de
calibre 25 con objeto de lisar las células. Si se desea una
purificación adicional, las muestras pueden centrifugarse a
aproximadamente 145 x g durante aproximadamente cinco minutos para
eliminar los núcleos y los desechos celulares. Entonces el
sobrenadante puede centrifugarse a aproximadamente 3000 x g durante
aproximadamente veinte minutos, y el sedimento resultante
resuspenderse en un diluyente apropiado, tal como SPG con suero
bovino fetal (para preparar las bacterias recolectadas
adecuadamente para su liofilización, congelación o para su uso como
inoculante) o medio de crecimiento (para preparar las bacterias
recolectadas más adecuadamente para su pase a células nuevas).
Según se mencionó previamente, el crecimiento
eficaz de L. intracellularis para su producción a gran escala
se mejora manteniendo las células del tejido creciendo activamente.
Con las monocapas, cuando los cultivos se hacen confluyentes, la
tasa de división celular disminuye considerablemente. Los intentos
de hacer crecer L. intracellularis en cultivos tisulares
monocapa han tenido un éxito limitado y el aumento de escala no ha
sido posible. Sin embargo, el uso de cultivos en suspensión facilita
enormemente el mantenimiento de las células en crecimiento activo y
permite una expansión continua del cultivo y el aumento de escala.
Usando un fermentador y entre aproximadamente el 0 y el 3% de
O_{2} disuelto, según se explicó anteriormente, se permite el
crecimiento de hasta y más de 10^{8} bacterias/ml.
Cuando se usan células IEC-18,
es preferible añadir gelatina, agarosa, colágeno, acrilamida o
perlas de sílice, tales como microvehículos porosos
Cultisphere-G (HyClone Laboratories, Logan Utah),
junto con el medio de crecimiento. Sin embargo, las células
HEp-2 y otras no requieren microvehículos según los
métodos usados en este documento.
Con el propósito de mantenimiento del cultivo,
en cultivos de HEp-2, se elimina preferiblemente del
25% al 50% del cultivo y se sustituye por medio nuevo en intervalos
semanales. Para los cultivos celulares con microvehículos o perlas,
se elimina preferiblemente del 25% al 50% del cultivo y se sustituye
por medio nuevo 1-2 veces por semana. Con el
propósito de aumentar la escala, puede añadirse al cultivo del 25%
al 50% de medio adicional, o de medio con microvehículos.
Dependiendo de la tasa a la que las células del
cultivo se infectan, el pase de células nuevas se produce
generalmente entre aproximadamente cada 2 hasta aproximadamente 7
días. Suponiendo que las células del cultivo se infecten al menos
al 70% cada 2 a 7 días, el pase se produce preferiblemente entre
aproximadamente cada 5 a 7 días.
La presente invención también proporciona
vacunas y métodos para producir vacunas frente a la nueva cepa
clínica de L. intracellularis de origen europeo.
Preferiblemente, tras mantener las células infectadas en suspensión
durante un tiempo prolongado (por ejemplo, 6-8
meses), al menos una porción de las bacterias L.
intracellularis cultivadas se recolectan y se monitorizan para
comprobar la potencial atenuación. Dicha monitorización se consigue
preferiblemente mediante la exposición de animales hospedadores o de
modelos animales para seleccionar una cepa clínica atenuada. Dichas
cepas clínicas atenuadas se usan en vacunas según los métodos
enseñados en este documento.
La presente invención permite una rápida
expansión del cultivo y un aumento en el rendimiento de
100-1000 veces, y reduce los costos para la
producción de L. intracellularis de origen europeo. Como
resultado, el abundante suministro de bacterias L.
intracellularis producido se atenúa fácilmente con el propósito
de la producción de vacunas. El método de hacer crecer L.
intracellularis en suspensión aumenta en gran medida la
facilidad, la velocidad y el número de bacterias disponibles para
este propósito. Cuántas más células y divisiones celulares se
produzcan, mayor será el nivel de mutaciones que se produzca, que
son ventajosas para el desarrollo de la vacuna. Por lo tanto, el
crecimiento en suspensión aumenta la expresión de importantes
inmunógenos controlados por genes regulados ambientalmente, y sus
productos de expresión.
Las cepas clínicas atenuadas resultantes pueden
cultivarse en cultivos tisulares en monocapas, pero preferiblemente
se cultivan en cultivos en suspensión. Otros medios de atenuación
pueden incluir la atenuación química mediante el uso de, por
ejemplo, N-metilnitrosoguanidina y otros conocidos
en la materia. Tanto mediante el pase múltiple como por medios
químicos, se produce una L. intracellularis atenuada, y se
selecciona para la preparación de vacunas. En una forma de
realización preferible, la cepa clínica atenuada resultante es el nº
de acceso de la ATCC PTA-4926.
El antígeno de la vacuna puede recolectarse
mediante centrifugación o microfiltración, según se describió
anteriormente. Entonces el antígeno se estandariza a un nivel
definido basado en la respuesta inmune óptima del animal
hospedador, determinada mediante un ajuste de la dosis en las
especies animales hospedadoras. Las bacterias pueden inactivarse
mediante los métodos conocidos en la materia, por ejemplo, usando
formalina al 0,3% u otros agentes inactivantes para preparar una
vacuna muerta. Entonces se incorpora el antígeno en un coadyuvante
adecuado, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral, para
incrementar la respuesta inmune. Entonces se usa el antígeno para
vacunar al hospedador por vía intramuscular o mediante infección
subcutánea, en el caso de cerdos de aproximadamente
3-4 semanas de edad, con una dosis de refuerzo si
fuera necesario.
Preferiblemente, las bacterias se pasan
sucesivamente para inducir y seleccionar un cultivo vivo avirulento
atenuado. El cultivo se prueba en el animal hospedador para
comprobar los signos de atenuación. El cultivo se recolecta según
se describió anteriormente y se liofiliza. Los cerdos, por ejemplo,
se vacunan por vía oral con de 1 x 10^{4} a 1 x 10^{6}
bacterias. Aproximadamente veintiocho días después de la vacunación,
los cerdos son inoculados por vía oral con aproximadamente 1 x
10^{7} organismos de un cultivo virulento menos pasado (menos de
30 pases in vitro más allá de la cepa clínica original
procedente del homogenizado intestinal) de L.
intracellularis. Las necropsias de los animales infectados se
realizan 21 días después de la exposición, y se observaron los
intestinos delgados para evaluar las lesiones macroscópicas así como
las lesiones microscópicas. También debería realizarse una PCR, una
fluorescencia indirecta con anticuerpos (IFA) o una
inmunohistoquímica (IHC). Aproximadamente el ochenta por ciento de
los animales de control mostrarán lesiones macroscópicas o
microscópicas y una prueba positiva de presencia de L.
intracellularis en las células mucosas del intestino usando
cualquiera de los métodos de prueba PCR, IFA o IHC. Los animales
vacunados tendrán superficies mucosas normales, según se determina
mediante observaciones histológicas, y serán negativos mediante una
prueba de PCR entre 3 y 4 semanas tras la inoculación.
Generalmente, una cepa clínica atenuada
inmunogénica de L. intracellularis se produce después de un
cultivo continuó durante aproximadamente 150 días hasta
aproximadamente 250 días, tiempo durante el cual el cultivo se pasa
aproximadamente 50-100 veces. Sin embargo, el
experto en la materia sabe que pueden producirse otros cultivos
atenuados modificando estas cifras.
El producto de vacuna de la invención puede ser
liofilizado. Tras la recolección, la cepa clínica puede concentrarse
mediante varios métodos conocidos en la materia, y puede mezclarse
con un estabilizante, por ejemplo, un estabilizante de gelatina de
sacarosa. El producto de vacuna puede someterse entonces a una
congelación y desecación (liofilización). Generalmente, la etapa de
congelación comprende descender bruscamente hasta aproximadamente
-45ºC \pm 3ºC y mantener durante desde aproximadamente 150
minutos hasta aproximadamente 480 minutos. La etapa de secado puede
comprender etapas primarias y secundarias de secado. Por ejemplo, la
etapa primaria de secado puede comprender: (a) descender
bruscamente hasta entre aproximadamente -30ºC y aproximadamente -5ºC
y mantener durante entre aproximadamente 120 minutos hasta
aproximadamente 1000 minutos y, opcionalmente (b) descender
bruscamente hasta entre aproximadamente -5ºC y aproximadamente 5ºC y
mantener durante entre aproximadamente 150 minutos hasta
aproximadamente 2000 minutos. La etapa secundaria comprende
generalmente descender bruscamente hasta aproximadamente 27ºC \pm
5ºC y mantener durante entre aproximadamente 330 minutos hasta
aproximadamente 1120 minutos. El experto en la materia sabe que
estos intervalos pueden ajustarse dependiendo de las condiciones,
por ejemplo, del volumen de partida.
Entonces se prepara una vacuna que comprende una
cantidad inmunológicamente eficaz de L. intracellularis
atenuada en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una forma de
realización preferible, una vacuna comprende el nº de acceso de la
ATCC PTA-4926 en un vehículo farmacéuticamente
aceptable. El inmunógeno y el vehículo combinados pueden estar en
una disolución acuosa, en emulsión o en suspensión. Una cantidad
inmunológicamente eficaz es determinable mediante los medios
conocidos en la materia sin una experimentación ilícita, dadas las
enseñanzas contenidas en este documento. En general, la cantidad de
inmunógeno estará entre 5 y 5000 microgramos, y entre una
TCID_{50} de 10^{2,0} y 10^{9,0}, preferiblemente entre una
TCID_{50} de 10^{3,0} y 10^{6,0}, más preferiblemente entre
una TCID_{50} de 10^{4,0} y 10^{5,0}, cuando se usan bacterias
purificadas.
La presente invención también engloba vacunas de
combinación que comprenden la cepa clínica atenuada de L.
intracellularis denominada con el nº de acceso de la ATCC
PTA-4926 y material antigénico procedente de al
menos otro patógeno, incluyendo, pero no limitándose a: especies del
género Salmonella (por ejemplo, Salmonella
choleraesuis, Salmonella typhimurium), especies del género
Erysipelothrix (por ejemplo, Erysipelothrix
rhusiopathiae), especies del género Haemophilus (por
ejemplo, Haemophilus parasuis), especies del género
Mycoplasma (por ejemplo, Mycoplasma hyopneumonia),
especies del género Leptospira, especies del género
Clostridium (por ejemplo, Clostridium perfingens,
Clostridium difficile), especies del género
Streptococcus (por ejemplo, Streptococcus suis),
especies del género Brachyspira (por ejemplo, Brachyspira
hyodysenteriae), especies del género Bordetella (por
ejemplo, Bordetella bronchiseptica), especies del género
Pasteurella (por ejemplo, Pasteurella multocida),
circovirus (por ejemplo, circovirus porcino de tipo 2), virus del
síndrome reproductor y respiratorio porcino (PRRS), virus de la
gripe porcina (SIV), coronavirus (por ejemplo, virus transmisible
de gastroenteritis (TGE), coronavirus respiratorio porcino),
parvovirus o Escherichia coli; y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
En una forma de realización, la vacuna de
combinación comprende la cepa clínica atenuada de L.
intracellularis denominada con el nº de acceso de la ATCC
PTA-4926 y material antigénico de Salmonella
choleraesuis, de especies del género Erysipelothrix,
de especies del género Clostridium, de especies del género
Brachyspira, del virus transmisible de gastroenteritis (TGE),
y de Escherichia coli; y un vehículo farmacéuticamente
aceptable. El material antigénico de las especies del género
Clostridium puede incluir, pero no se limita a,
Clostridium perfingens y Clostridium difficil. El
material antigénico de las especies del género
Erysipelothrix puede incluir, pero no se limita a,
Erysipelothrix rhusiopathiae.
En otra forma de realización, la vacuna de
combinación comprende la cepa clínica atenuada de L.
intracellularis denominada con el nº de acceso de la ATCC
PTA-4926 y material antigénico de Salmonella
choleraesuis y de especies del género Erysipelothrix;
y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra forma de
realización, la vacuna de combinación comprende la cepa clínica
atenuada de L. intracellularis denominada con el nº de
acceso de la ATCC PTA-4926 y material antigénico de
Salmonella choleraesuis y de Erysipelothrix
rhusiopathiae; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otra forma de realización, la vacuna de
combinación comprende la cepa clínica atenuada de L.
intracellularis denominada con el nº de acceso de la ATCC
PTA-4926 y material antigénico procedente de al
menos otro patógeno, incluyendo, pero no limitándose a: especies
del género Clostridium (por ejemplo, Clostridium
tetani), virus de la gripe equina (EIV) (por ejemplo,
EIV-1, EIV-2), virus del herpes
equino (EHV) (por ejemplo, EHV-1,
EHV-2, EHV-3, EHV-4,
EHV-5, EHV-6,
EHV-7), alfavirus (por ejemplo, virus de la
encefalitis oriental, virus de la encefalitis occidental, virus de
la encefalitis de Venezuela), o virus del Nilo occidental; y un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
Las vacunas según la invención se administran
generalmente a animales susceptibles, preferiblemente cerdos, en
una o más dosis. La vacuna viva o muerta puede administrarse 1 ó 2
veces en intervalos de 2 semanas. Para las vacunas vivas atenuadas
es preferible una dosis. Las vías de administración preferibles de
las cepas clínicas vivas atenuadas son intramuscular, oral o
intranasal, pero las vías de inyección intramuscular y subcutánea
son muy preferibles para la vacuna muerta.
El diagnóstico eficaz de la PPE también se ha
visto obstaculizado por el tiempo requerido para cultivar la
bacteria causal. Como resultado de la presente invención, ahora es
posible el desarrollo de herramientas diagnósticas que promuevan
unos ensayos rápidos y precisos para comprobar la presencia de L.
intracellularis en muestras biológicas tomadas de cerdos y
otros animales susceptibles a la PPE.
Las bacterias L. intracellularis de
origen europeo de la actual invención, o los componentes derivados
de dichas bacterias, pueden usarse como antígeno en un ELISA u otro
inmunoensayo, tal como una prueba de anticuerpos
inmunofluorescentes ("IFA"), para detectar anticuerpos contra
L. intracellularis en el suero y en otros fluidos corporales
de animales sospechosos de estar infectados con la bacteria. El
inmunoensayo actualmente preferible es una IFA, según se describe
en el ejemplo a continuación. Alternativamente, las bacterias de
la actual invención pueden usarse en un ensayo de
inmunotransferencia Western.
El protocolo preferible de ELISA según la
invención es como sigue:
- 1.
- Añadir 0,1 ml/pocillo de antígeno diluido en tampón de cobertura. Incubar durante 18 horas a 4ºC.
- 2.
- Lavar 3 veces con PBS.
- 3.
- Añadir 0,25 ml de tampón de bloqueo a cada pocillo de la placa. Incubar de 1 a 2 horas a 37ºC.
- 4.
- Lavar 3 veces con tampón de lavado.
- 5.
- Diluir el suero en tampón de bloqueo y añadir 0,1 ml al primero de los pocillos de la placa. Realizar diluciones sucesivas 1:2 por toda la placa. Incubar durante 1 hora a 37.
- 6.
- Lavar de 3 a 5 veces con tampón de lavado.
- 7.
- Diluir el conjugado en tampón de bloqueo y añadir 0,1 ml a los pocillos de la placa, e incubar durante 1 hora a 37ºC.
- 8.
- Lavar de 3 a 5 veces con tampón de lavado.
- 9.
- Añadir sustrato.
- 10.
- Medir la absorbancia de la luz con un espectrofotómetro.
- 11.
- Los pocillos a los que no se ha añadido antígeno se usan como blancos.
- 12.
- Además deberían usarse controles positivos y negativos de suero porcino en cada prueba.
\vskip1.000000\baselineskip
El protocolo preferible de inmunotransferencia
Western es como sigue:
- 1.
- Analizar el antígeno en SDS-PAGE al 12% y transferirlo a una membrana de nitrocelulosa.
- 2.
- Colocar la membrana en tampón de bloqueo durante 2 horas.
- 3.
- Eliminar el tampón de bloqueo y aclarar con PBS durante 1 minuto.
- 4.
- Diluir el suero en tampón de bloqueo y añadirlo a la membrana. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente.
- 5.
- Lavar 3 veces con tampón de lavado (5 minutos para cada lavado).
- 6.
- Diluir el conjugado en tampón de bloqueo y añadirlo a la membrana. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.
- 7.
- Lavar 3 veces con tampón de lavado.
- 8.
- Añadir sustrato durante 10 minutos o hasta que aparezca una banda intensa.
- 9.
- Aclarar con PBS.
- 10.
- Secar al aire y almacenar en la oscuridad.
\vskip1.000000\baselineskip
Las bacterias L. intracellularis de
origen europeo de la actual invención, o los componentes derivados
de dichas bacterias, también pueden usarse para preparar antisuero o
anticuerpos para uso diagnóstico, profiláctico o terapéutico. Las
bacterias L. intracellularis de origen europeo de la actual
invención, o los componentes derivados de dichas bacterias, pueden
administrarse a un animal no humano en una cantidad eficaz para
desencadenar una respuesta inmune, y el antisuero o el plasma que
contienen los anticuerpos contra las bacterias L.
intracellularis, o los componentes derivados de dichas
bacterias, pueden recogerse según los métodos conocidos en la
materia y descritos en este documento.
La presente invención se describe adicionalmente
en los siguientes ejemplos, que se proporcionan únicamente con un
propósito ilustrativo y no deben ser interpretados como limitantes.
De hecho, otras variantes de la invención serán fácilmente
apreciables por el experto habitual en la materia.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa clínica virulenta de L.
intracellularis DK 15540 (DK 15540, DK-15540 y
15540 se usan de forma intercambiable en este documento) fue
aislada por la University of Minnesota a partir de un homogeneizado
ileal de un cerdo danés infectado con enteropatía hemorrágica
porcina aguda. Esta cepa clínica se ha depositado bajo el Tratado
de Budapest con la American Type Culture Collection, 10801
University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209
el 9 de enero de 2003 y se le asignó el número de acceso
PTA-4927. El proceso de aislamiento incluyó el
raspado de la mucosa del íleon, una homogeneización, una
tripsinización durante 30 minutos, y el pase a través de una
trituradora de tejidos. El homogeneizado ileal se pasó entonces a
través de una serie de filtros consistentes en 5,0, 1,0 y 0,65
\mum. El homogeneizado se diluyó en tampón de sacarosa fosfato
glutamato con suero bovino fetal al 10% (FBS). Se realizaron
alícuotas (6 x 1 ml) del homogeneizado y se almacenaron a menos de
-70ºC. El homogeneizado se usó como inóculo para infectar matraces
en T de 75 cm^{2} de células McCoy. Los cultivos se monitorizaron
diariamente para controlar la infección de las células McCoy
raspando las monocapas de células McCoy, lisando las células
mediante un tratamiento con cloruro potásico y colocando el
sedimento de células concentradas en portaobjetos para microscopio
teñidos mediante IFA, usando anticuerpos monoclonales específicos
para L. intracellularis. Después de once pases en cultivos
celulares dependientes de anclaje, el inóculo del pase once se
transfirió a un matraz de agitación de 250 ml que contenía células
McCoy y se hizo crecer en suspensión hasta su recolección. La cepa
clínica danesa de L. intracellularis (nº de acceso de la
ATCC PTA-4927) se atenuó mediante el pase continuo
in vitro en células McCoy durante 80 semanas, y se comprobó
su identidad mediante anticuerpos monoclonales. La cepa clínica
atenuada se denominó B3903 (B3903, B 3903 y B-3903
se usan de forma intercambiable en este documento). La cepa clínica
B3903 se depositó bajo el Tratado de Budapest con la American Type
Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia
20110-2209 el 9 de enero de 2003 y se le asignó el
número de acceso de la ATCC PTA-4926.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron los requerimientos de crecimiento
característicos, las reacciones de PCR y las reacciones con
anticuerpos monoclonales para identificar los materiales de las
Siembras Maestras y de Trabajo de L. intracellularis.
La pureza de la Siembra Maestra y de la Siembra
de Trabajo de L. intracellularis se determinó examinando los
cultivos mediante tinciones con anticuerpos monoclonales, pruebas
convencionales de agentes extraños para bacterias y virus y
mediante pruebas de esterilidad de micoplasma.
Las Siembras Maestras de L.
intracellularis no eran virulentas, según se demostró por la
ausencia de la capacidad de la Siembra Maestra y del inóculo del
retropase de producir los signos clínicos y las lesiones
macroscópicas que se observan en cerdos susceptibles tras la
exposición a L. intracellularis virulenta, según se
ilustra adicionalmente en el Ejemplo 2, a continuación.
El material final recolectado de la producción
de L. intracellularis no superó los once pases a partir de
la Siembra Maestra.
Se hicieron crecer Reservas Maestras de Células
McCoy europeas (MCS) y se mantuvieron en medio de Eagle modificado
por Dulbecco con Ham F12 reforzado (DMEM/F12) y un
1-10% (v/v) de suero bovino neonatal (NBS) o de
suero bovino fetal (FBS) (medio de crecimiento y mantenimiento
celular).
Las Siembras Maestras y de Trabajo se
almacenaron en DMEM/F12 con un 1-10% (v/v) de NBS o
de FBS y un 5-15% (v/v) de glicerol (medio de
almacenamiento de las siembras maestras y de trabajo).
El producto final recolectado se almacenó en
estabilizante de gelatina de sacarosa (SGS) (medio de almacenamiento
del producto final).
Los cultivos de las Siembras Maestras y de
Trabajo de L. intracellularis se propagaron en MCS McCoy
europeas usando medio de crecimiento y de mantenimiento celular
según se describió anteriormente, y se almacenaron a menos de o a
aproximadamente -35ºC.
Las siembras de L. intracellularis y los
organismos de producción se hicieron crecer en Reservas Maestras de
Células McCoy (nº de acceso de la ATCC CRL 1696, número de lote
F-10422). La reserva de mastocitos se identificó
como 3894MMCSS en el pase X. La reserva maestra de células se pasó
seis veces adicionales y se identificó como MCS McCoy europeas X+0.
El pase de McCoy MCS X+0 europeas se almacenó a -70ºC \pm 5ºC o
más frío. La producción de la vacuna se realizó en subcultivos de
la línea celular MCS McCoy europea a través del pase 40º.
\global\parskip0.930000\baselineskip
Las McCoy MCS europeas se propagaron en matraces
de cultivo tisular con un área superficial de 25-150
cm^{2}, en cubas de células Costar, en frascos rotatorios con
entre 850 cm^{2} y 2, 2250 cm^{2}, en matraces de agitación de
hasta 40 l de capacidad, y en biorreactores con desde 3 l hasta 500
l de capacidad.
Los cultivos sembrados de L.
intracellularis se hicieron crecer en matraces de agitación de
250-40.000 ml, en frascos rotatorios de 850
cm^{2} a 2.250 cm^{2}, en matraces de cultivo tisular con un
área superficial de 25-150 cm^{2} o en
biorreactores con desde 3 l hasta 500 l de capacidad.
Los cultivos de producción de L.
intracellularis se hicieron crecer en matraces de agitación de 6
l hasta 40 l o en biorreactores con desde 3 l hasta 500 l de
capacidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Se descongelaron Siembras Maestras o expandidas
de Trabajo congeladas o frescas de L. intracellularis a
temperatura ambiente (25ºC \pm 3ºC) o a 37ºC \pm 2ºC. Los
biorreactores, los matraces de agitación o los frascos previamente
sembrados con células McCoy a una densidad celular de 50.000 a
500.000 células/ml se infectaron con L. intracellularis a
una concentración del 1 al 10% (v/v) o una MOI de 0,08 a 1,0. El
cultivo infectado se incubó con una concentración de oxígeno
reducida cubriéndolo con una mezcla de gases formada por un 86% de
N_{2}, un 4% de H_{2} y un 10% de CO_{2}. El cultivo se incubó
durante entre 3 y 10 días a 37ºC \pm 2ºC, a un pH de 6,7 a 7,3, y
con agitación continua (de 10 a 100 rpm) para mantener una mezcla
adecuada para que las células permanezcan en suspensión.
Se descongelaron Siembras Maestras o expandidas
de Trabajo congeladas o frescas de L. intracellularis a
temperatura ambiente (25ºC \pm 3ºC) o a 37ºC \pm 2ºC. Los
biorreactores o los matraces de agitación de 3 l a 500 l de
capacidad) previamente sembrados (de 0 a 7 días) con células McCoy a
una densidad celular de 50.000 a 500.000 células/ml se infectaron
con L. intracellularis a una concentración del 1 al 10% (v/v)
o una MOI de 0,08 a 1,0. El cultivo infectado se incubó con una
concentración de oxígeno reducida cubriéndolo o rociándolo con una
mezcla de gases formada por un 96% de N_{2}, un 4% de H_{2}. El
cultivo se incubó durante entre 3 y 8 días a 37ºC \pm 2ºC, a un
pH de 6,7 a 7,3, y con agitación
continua (de 10 a 100 rpm) para mantener una mezcla adecuada para que las células permanezcan en suspensión.
continua (de 10 a 100 rpm) para mantener una mezcla adecuada para que las células permanezcan en suspensión.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inocula hasta el 10% (v/v) de Siembra Maestra
o de Trabajo (MOI = de 0,08 a 1,0) en biorreactores, matraces de
agitación o frascos sembrados con células McCoy de
0-7 días en medio de crecimiento.
Se inoculó hasta el 10% (v/v) de la Siembra de
Producción (MOI = de 0,08 a 1,0) en un volumen apropiado del medio
de crecimiento sembrado con células McCoy de 0 a 7 días con la
densidad de células McCoy apropiada en depósitos de 3 l a 500 l de
capacidad.
Los cultivos se incubaron a 37ºC \pm 2ºC
durante entre 3 y 10 días en una atmósfera de oxígeno reducida con
agitación para mantener la suspensión. Puede añadirse medio y/o
células McCoy adicionales para continuar el proceso de
crecimiento.
Los cultivos se observaron macroscópicamente
durante el periodo de incubación para buscar pruebas de un
crecimiento anormal o signos de contaminación.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cultivos se examinaron buscando signos de un
crecimiento bacteriano adecuado mediante una tinción con
anticuerpos por fluorescencia indirecta (IFA). Los cultivos que
estaban preparados para ser recolectados ejemplificaron del 60 al
100% de infectividad celular. El porcentaje de infectividad se
determinó mediante la observación de al menos tres campos,
conteniendo cada campo suficientes células McCoy para completar al
menos el 80% del área. Para que se considere como infectada,
aproximadamente el 50% de la célula está llena de bacterias.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La potencia del cultivo recolectado se comprueba
mediante valoración de la muestra en células McCoy que están
fijadas y teñidas usando anticuerpos monoclonales específicos
(anticuerpo monoclonal anti-L. intracellularis VPM 53 Lote
31599 o equivalente; conjugado de IgG
anti-ratón-fluoresceína (FITC) (ICN
nº 55499) después de 6 días de incubación a 37ºC \pm 2ºC.
Los cultivos se examinaron visualmente para
comprobar cualquier signo obvio de contaminación. La recolección se
produjo entre los 3 y los 10 días tras la inoculación.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células y los contenidos fluidos del
biorreactor, de los matraces de agitación y del frasco del cultivo
de producción se recolectaron parcial o completamente en un depósito
colector estéril. Cada biorreactor, matraz de agitación y frasco
del cultivo de producción se recolectó individualmente, o se agrupó
el contenido de varios depósitos con la adición de SGS y se
almacenaron a entre 1ºC y 7ºC o más frío. Se tomaron muestras del
cultivo de producción recolectados para comprobar la potencia
mediante la TCID_{50} y su identificación mediante una tinción
IFA.
Los cultivos de producción mostraron una
TCID_{50} de al menos 4,9/ml mediante una tinción IFA y no
presentaban ninguna prueba de contaminación tras su observación
microscópica.
\vskip1.000000\baselineskip
El producto de vacuna puede concentrarse
mediante varios métodos, por ejemplo, permitiendo sedimentar el
cultivo con la subsiguiente decantación del sobrenadante, mediante
filtración de membrana (0,22 \mum o menor), perfusión o mediante
centrifugación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara una disolución de gelatina
hidrolizada mezclando la gelatina con agua desionizada o agua para
inyección a aproximadamente el 25% del volumen final total del
tamaño del lote de SGS e hidrolizando en un autoclave durante 120
minutos a 121ºC.
La disolución de gelatina hidrolizada (40,0 g/l)
se mezcló entonces con agua desionizada o agua para inyección a
aproximadamente el 75% del volumen final total del tamaño del lote
de SGS. Se añadieron hidróxido potásico (AR) (0,548 g/l), ácido
L-glutámico (1,440 gl), fosfato dipotásico (AR)
(2,508 g/l), dihidrogenofosfato potásico (AR) (1,030 g/l), y
sacarosa (AR) (150,00 g/l) y la disolución se mezcló
exhaustivamente. Entonces se ajustó el pH del estabilizante a entre
6,8 y 7,0 con disoluciones de ácido clorhídrico o de hidróxido
sódico. Se añadió agua desionizada o agua para inyección hasta el
100% del volumen final deseado del SGS. El estabilizante completo
se mezcló exhaustivamente, y toda la disolución se esterilizó
mediante filtración a través de un filtro de 0,1 micrómetros.
En la Tabla 1 se muestra un ejemplo de Montaje
de Unidades para Hacer una Serie:
\vskip1.000000\baselineskip
El volumen de una serie media era de entre 50 l
y 500 l.
\vskip1.000000\baselineskip
El producto de vacuna se liofilizó según el
procedimiento esquematizado en la Tabla 2 para un ciclo de 10 dosis
(6,0 ml de llenado) o en la Tabla 3 para un ciclo de 50/100 dosis
(10,0 ml de llenado).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los objetivos de este estudio fueron dobles. El
primer objetivo de este estudio era observar y comparar la
incidencia de la enfermedad causada por tres cepas clínicas
diferentes de bajo pase (dos de origen estadounidense y una de
origen europeo) de L. intracellularis en cerdos a las 6 ½
semanas de edad. El segundo objetivo era observar la seguridad de
dos cepas clínicas de alto pase (ambas de origen europeo) de L.
intracellularis en cerdos a las 6 ½ semanas de edad.
\vskip1.000000\baselineskip
- 1.
- Cepa clínica estadounidense de bajo pase N343 de L. intracellularis
- 2.
- Cepa clínica estadounidense de bajo pase N101494 de L. intracellularis.
- 3.
- Cepa clínica europea de bajo pase DK 15540 p20 de L. intracellularis
- 4.
- Cepa clínica europea de alto pase DK 15540 p60 de L. intracellularis
- 5.
- Cepa clínica europea de alto pase DK 15540 p80 (denominación de la Siembra Maestra B3903) de L. intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas clínicas de bajo pase se hicieron
crecer de forma continua durante 10-20 semanas tras
su aislamiento en una suspensión de células McCoy. Las cepas
clínicas de alto pase se hicieron crecer de forma continua durante
60-80 semanas tras su aislamiento en una suspensión
de células McCoy. Todos los cultivos se recolectaron mediante
centrifugación a 10.000 RPM durante 15 minutos. Los sedimentos del
cultivo celular McCoy que contenían la Lawsonia se resuspendieron
en una disolución de
Sacarosa-Fosfato-Glutamina (SPG) con
un 10% de FBS.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cultivos recolectados se almacenaron a -70ºC
hasta el día de la exposición. Los cultivos de exposición de la
misma cepa clínica pero de diferentes fechas de recolección se
descongelaron y se combinaron en frascos de plástico de vacunas, se
etiquetaron y se almacenaron a 4ºC o en hielo hasta el momento de la
exposición.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó una TCID_{50} en todas las cepas
clínicas expuestas agrupadas en el momento de la exposición (día
0). Los títulos medios (n=3) (TCID_{50}/ml) fueron como sigue en
la Tabla 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El estudio consistió en cinco grupos
experimentales y un grupo de control. En el día 0 del estudio, el
Grupo 1 (10 cerdos, 6 ½ semanas de edad) recibió una dosis
intragástrica (IG) de 10 ml o equivalente de la cepa clínica
estadounidense de bajo pase N343 de L.
intracellularis. El grupo 2 (10 cerdos, 6 ½ semanas de edad)
recibió una dosis IG de 10 ml o equivalente de la cepa clínica
estadounidense de bajo pase N101494 de L. intracellularis.
El grupo 3 (10 cerdos, 6 ½ semanas de edad) recibió una dosis IG de
10 ml o equivalente de la cepa clínica europea de bajo pase DK15540
p20 de L. intracellularis. El grupo 4 (10 cerdos, 6 ½
semanas de edad) recibió una dosis IG de10 ml o equivalente de la
cepa clínica europea de alto pase DK15540 60 semanas de L.
intracellularis. El grupo 5 (20 cerdos, 6 semanas de edad)
recibió una dosis de 10 ml o equivalente de la cepa clínica europea
de alto pase DK 15540 p80 de L. intracellularis. El grupo 6
(10 cerdos, 6 ½ semanas de edad) denominado "Controles
Estrictos" no recibió
tratamiento.
tratamiento.
Se realizaron observaciones diarias de la salud
desde el inicio del estudio hasta el día de la exposición de los
animales de prueba apropiados. La salud clínica (comportamiento,
apetito, estado corporal, capa pilosa y consistencia de las
deposiciones se puntuaron diariamente en una escala de 1 a 4 desde
el día de la exposición (día 0) hasta la finalización del estudio
(día 21). Las ganancias de peso medias diarias (ADWG) se calcularon
desde el día de la exposición (día 0) hasta la finalización del
estudio (día 21). Se evaluó la presencia en heces de L.
intracellularis en los días 0, 7, 14 y 21. El único animal que
murió (del Grupo 1) a lo largo del estudio se examinó para
comprobar las lesiones macroscópicas y microscópicas. Se determinó
que la muerte era debida a lesiones asociadas con la PPE
confirmadas mediante histología y un análisis por PCR; el animal no
se remplazó. El análisis cualitativo del contenido de Lawsonia en
heces se evaluó mediante PCR junto con una evaluación histológica
de L. intracellularis en el íleon y el colon. Se recogió
suero en los días 0, 7, 14 y 21 del estudio.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron observaciones diarias de la salud
hasta la exposición. Se evaluó el estado clínico de los animales
diariamente tras la exposición durante la duración del estudio. Las
observaciones incluyeron: comportamiento, apetito, estado corporal,
capa pilosa y consistencia de las deposiciones. El estado clínico de
estos animales se evaluó en base a un sistema de puntuación
numérico, que refleja la gravedad de la enfermedad. Las puntuaciones
variaban desde 1 hasta 4 para cada parámetro. Se dio una puntuación
de 1 a un animal con un aspecto normal y saludable, una puntuación
de 3 a un animal que mostraba signos clínicos graves y una
puntuación de 4 a un animal que había fallecido. La puntuación
diaria media de los controles estrictos, DK15540 p60 y DK15540 p80
era de 5,0. Las puntuaciones diarias medias del material de bajo
pase fueron N343 (5,23), N101494 (5,15) y DK15540 p20 (5,01). El
análisis estadístico de estos resultados no indicó diferencias entre
los grupos de tratamiento y de control usando la prueba de la suma
por rangos de Kruskal-Wallis.
Las ganancias de peso medias diarias se
calcularon a partir del momento de la exposición (día 0) hasta la
finalización del estudio (día 21). La ganancia de peso media por día
del grupo de control estricto fue de 0,408 kg. La ganancia de peso
media de los grupos de tratamiento de bajo pase fue de sólo 0,272
(N343), 0,363 (N101494) y 0,39 (DK15540 p20) kg/día. Los grupos de
tratamiento de alto pase revelaron la misma ganancia de peso por
día, o aumentada, en comparación con el grupo de control estricto
que no fue expuesto, con 0,408 kg/día (DK15540 p60) y 0,476 kg/día
(DK15540 p80) respectivamente. La diferencia media en las ganancias
de peso medias diarias fue significativamente menor en el grupo de
tratamiento N343 en comparación con los grupos de tratamiento de
alto pase (DK15540 p60 y p80) y los grupos de control estricto en el
día 21 del estudio. (Prueba de la \chi^{2} de Pearson
p<0,05).
Se midió la seroconversión tras la exposición a
Lawsonia en cerdos comprobando la presencia de anticuerpos
anti-Lawsonia usando un ensayo IFAT. En el día 0,
sólo en el grupo de tratamiento N343 se observó una seroconversión
detectable en 2/10 cerdos. En el día 7 se observó en 2/9 cerdos
(N343) y en 1/10 cerdos (DK15540 p20) un IFA positivo para los
anticuerpos de Lawsonia. En el día 14, 2/9 cerdos eran positivos en
el IFA en el grupo de tratamiento N343, 1/10 en DK15540 p20 y p60
respectivamente. El día 21 reveló 1/10 cerdos (N343), 4/10 cerdos
(N101494) y 6/10 cerdos (DK15540 p20) que eran positivos en el IFA,
mientras que los grupos de tratamiento de alto pase (DK15540 p60 y
p80) no mostraban una seroconversión detectable. La seroconversión
tras la exposición a Lawsonia aumentó en los grupos de tratamiento
que recibían L. intracellularis de bajo pase tanto de las
cepas clínicas estadounidenses como europeas en el día 21 del
estudio.
Las pruebas de PCR en las heces demostraron la
presencia de L. intracellularis comenzando el día 14, en el
que 4/ 9 en el N343, 4/10 en el N101494 y 5/10 en el DK15540 p20 de
animales de bajo pase dieron positivo. Tanto los grupos de
tratamiento de alto pase como de control estricto eran negativos en
la PCR el día 14. En el día 21, el grupo de tratamiento DK15540 p20
tuvo 1 animal positivo en la PCR, mientras que el resto de los
grupos de tratamiento de control dieron negativo en la PCR. No se
observó ninguna prueba de la presencia en los grupos de cepas
clínicas de alto pase (DK15540 p60 y p80) usando una PCR a lo largo
del estudio. Los animales positivos en la PCR, que indicaba una
presencia activa de Lawsonia en sus heces, eran más significativos
en los grupos de cepas clínicas de bajo pase (N343, N101494 y
DK15540 p20) en el día 14 del estudio que los grupos de cepas
clínicas de alto pase los controles estrictos (Prueba de la
\chi^{2} de Pearson p<0,05).
La prueba de PCR de los raspados de mucosa del
íleon y el colon se realizó tras la necropsia (día 21). Las
muestras que fueron positivas en la PCR para la colonización por
L. intracellularis eran (2/10 colon) en los grupos de cepas
clínicas de bajo pase N101494 y (2/10 íleon y 4/10 colon) en DK
15540 p20. Todos los demás grupos de tratamiento y de control
fueron negativos en la PCR de los tejidos el día 21 del estudio.
Los resultados indicaron que el íleon y el colon de los cerdos de
DK15540 p20 estaban significativamente más colonizados por L.
intracellularis en comparación con todos los grupos de
tratamiento de control (* Prueba de la \chi^{2} de Pearson
p<0,05).
Se recogieron secciones del íleon terminal y del
colon en la necropsia (día 21) y se colocaron en formalina
tamponada para su análisis histológico. Se observó la presencia de
bacterias intracelulares y una hiperplasia de las criptas en los
tejidos teñidos con hematoxilina y eosina (H&E) y reactivos de
plata de Warthin-Starry de 4/9 cerdos (N343), 3/10
cerdos (N101494), 2/10 cerdos (DK15540 p60) y 1/20 cerdos (DK15540
p80). El desarrollo de lesiones fue confirmado mediante una tinción
con anticuerpos fluorescentes usando anticuerpos monoclonales
contra Lawsonia intracellularis en 1/9 cerdos (N343), 3/10
cerdos (N101494) y 1/10 cerdos (DK15540 p60). La FA no detectó
lesiones causadas por Lawsonia en el colon de ninguno de los grupos
de tratamiento ni de control. Los resultados de la FA indicaron el
desarrollo de una lesión significativa en el íleon de cerdos del
grupo de tratamiento N101494 en comparación con todos los grupos de
tratamiento y de control. La tinción H&E / plata mostró el
desarrollo de una lesión significativa asociada a la PPE en el grupo
de tratamiento N343 en comparación con todos los grupos de
tratamiento y de control. (Prueba de la \chi^{2} de Pearson
p<0,05).
Se puntuaron el íleon y el colon en el momento
de la necropsia (día 21) para evaluar las lesiones asociadas con la
PPE. A los tejidos se les dio una puntuación de 1 para un aspecto
normal (sin desarrollo de lesiones), una puntuación de 2 para las
lesiones que mostraban un engrosamiento leve, de 3 para un
engrosamiento moderado y una puntuación de 4 para un engrosamiento
grave. Los controles estrictos tenían una puntuación clínica media
de 1,05, N343 (1,0), N101494 (1,2), DK15540 p20 (1,2) y DK15540 p60
y p80 (1,0). La puntuación de las lesiones macroscópicas medias no
indicó una diferencia estadística entre los grupos de control y de
tratamiento usando la prueba del análisis de la variancia para
comparaciones múltiples.
Basándonos en los datos recogidos, este estudio
demuestra que los cerdos expuestos a una dosis de pase baja de
N343, N101494 y DK15540 con una TCID_{50} mayor de 1 x 10^{7}
bacterias/dosis aumenta la incidencia de la PPE en estos animales.
Las cepas clínicas de alto pase (DK15540 p60 y p80) dadas a los
cerdos de la misma edad con una TCID_{50} mayor de 1 x 10^{7}
demostraron ser seguras y mostraron una reducción de la
colonización y del desarrollo de lesiones asociadas con la PPE. Esta
conclusión se basó en la PCR de la mucosa del íleon, la
histopatología y las tinciones FA de las secciones tisulares.
Se hizo evidente una reducción de la presencia
de L. intracellularis en las heces determinada mediante PCR
en las cepas clínicas de alto pase en comparación con las cepas
clínicas de bajo pase. Las ganancias de peso medias diarias
calculadas para todos los grupos de tratamiento de control apoyan
esta conclusión, mostrando una ganancia de peso diaria uniforme
positiva en los grupos que recibieron la cepas clínicas de alto pase
y en los controles estrictos en comparación con los grupos que
recibieron cepas clínicas de bajo pase, especialmente los animales
del grupo de tratamiento N343. Esta observación indica una reducción
en las ganancias de peso en los animales que recibieron material de
bajo pase, que apoya un rendimiento de crecimiento adecuado y
similar de los animales que recibieron material de alto pase con
los animales que no recibieron ningún material de exposición. En
comparación con los controles estrictos, las cepas clínicas de alto
pase no mostraron un impacto negativo en la ganancia de peso ni en
la salud global basándonos en las puntuaciones clínicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los objetivos de este estudio eran determinar el
título protector mínimo de una vacuna que comprende la cepa clínica
B3903 (liofilizada) (DK 15540, pase 80) ("vacuna B3903
(liofilizada)" y "vacuna B3903" se usan de forma
intercambiable en este documento) administrada mediante enjuagues
orales a cerdos de 3 semanas de edad y para demostrar su eficacia
frente a una exposición virulenta de un cultivo puro heterólogo de
bajo pase de L. intracellularis, el agente causal de la
Enteropatía Proliferativa Porcina (PPE) en cerdos.
\vskip1.000000\baselineskip
Sustancia de prueba: cultivo vivo atenuado de
L. intracellularis, cepa clínica B3903
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas clínicas DK 15540 se hicieron crecer
de forma continua durante 80 semanas tras su aislamiento en una
suspensión de células McCoy. Todos los cultivos se recolectaron
mediante centrifugación a 10.000 RPM durante 15 minutos. Los
sedimentos del cultivo de células McCoy que contenían la Lawsonia se
resuspendieron en una disolución de
Sacarosa-Fosfato-Glutamina (SPG) con
un 10% de FBS. La desecación se realizó según se describe en el
Ejemplo 1, anteriormente. El producto liofilizado es reconstituido
en agua, c.s.p. 2,0 ml, para inyección.
\vskip1.000000\baselineskip
La vacuna se almacenó a 2ºC-8ºC
hasta que estuviera lista para su uso. Después de la resuspensión,
la vacuna se almacenó en hielo hasta su administración.
\vskip1.000000\baselineskip
- 1.
- Dosis alta (grupo de tratamiento 1): 1 x 2 ml (6,0 logs/dosis) mediante un enjuague oral directo en el día 0 del estudio.
- 2.
- Dosis media (grupo de tratamiento 2): 1 x 2 ml (4,9 logs/dosis) mediante un enjuague oral directo en el día 0 del estudio.
- 3.
- Dosis baja (grupo de tratamiento 3): 1 x 2 ml (3,8 logs/dosis) mediante un enjuague oral directo en el día 0 del estudio.
\vskip1.000000\baselineskip
Se administró un placebo consistente en células
del cultivo tisular McCoy no infectadas suspendidas en medio de
crecimiento DMEM/F12 reforzado con NBS al 5% a los grupos de
tratamiento 4 (control de exposición) y 5 (control negativo) en el
día 0 del estudio. Esta sustancia se administró a los lechones del
grupo de tratamiento 4 mediante un enjuague oral directo, y se
administraron 1 x 2 ml de placebo por animal de prueba.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo L. intracellularis N101494 del
intestino de un cerdo de 12 semanas de edad de una granja de
Indiana (patente de Estados Unidos 5.714.375).
\vskip1.000000\baselineskip
El material de exposición de L.
intracellularis se hizo crecer de forma continua en una
suspensión de células McCoy no más de 30 pases tras el aislamiento
inicial a partir del tejido intestinal infectado. Los cultivos
activos (2 x 3 l) identificados como SF 1422 y SF 1423, además de (1
l) SF 1421, se hicieron crecer en una suspensión de células McCoy
durante 7 días hasta una infección de las células McCoy del
15-30%. El día de la exposición (día 21), los
cultivos activos se recolectaron mediante centrifugación a 10.000
rpm durante 15 minutos, y los sedimentos celulares se
resuspendieron en 350 ml de volumen total con estabilizante SPG. El
cultivo activo recolectado se agrupó con 300 ml de reservas de
exposición N101494concentradas de 10X a 20X congeladas de bajo pase
a varios pases (pase 24 a 27 tras el aislamiento).
\vskip1.000000\baselineskip
Las formulaciones finales preparadas para la
exposición se almacenaron a entre 2ºC y 8ºC o en hielo hasta la
inoculación.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados del ensayo de la TCID_{50}
verificaron la cantidad de L. intracellularis viva
administrada a cada animal de prueba por dosis durante la
vacunación y la exposición. Los títulos medios (n=5) de las pre y
post titulaciones para la vacuna B3903 y el material de exposición
(L. intracellularis N101494) eran como sigue en la Tabla
6:
Sesenta y cinco lechones destetados sanos
negativos para L. intracellularis de 3 semanas de edad se
dividieron aleatoriamente en 5 grupos de tratamiento y se alojaron
por separado a lo largo de todo el estudio. En el día 0, el grupo
de tratamiento 1 (15 cerdos) recibió una dosis de 2 ml (6,0
logs/dosis) de vacuna de B3903 mediante un enjuague oral directo.
El grupo de tratamiento 2 (15 cerdos) recibió una dosis de 1 x 2 ml
de vacuna de B3903 con un título de 4,9 logs/dosis mediante un
enjuague oral directo. El grupo de tratamiento 3 (15 cerdos)
recibió una dosis de 1 x 2 ml de vacuna de B3903 con un título de
3,8 logs/dosis mediante un enjuague oral directo.
Los grupos de tratamiento 4 y 5 (10
cerdos/grupo) recibieron una dosis de 1 x 2 ml de placebo mediante
un enjuague oral directo.
En el día 21 del estudio (3 semanas después de
la vacunación), los cerdos de prueba de los grupos de
tratamiento
1 - 4 recibieron una dosis de 1 x 10 ml de un cultivo puro virulento de bajo pase de la cepa clínica heteróloga N101494 de L. intracellularis mediante cebado gástrico.
1 - 4 recibieron una dosis de 1 x 10 ml de un cultivo puro virulento de bajo pase de la cepa clínica heteróloga N101494 de L. intracellularis mediante cebado gástrico.
En el día 42 del estudio (3 semanas después de
la exposición), todos los grupos de tratamiento (1 - 5) fueron
sacrificados, y se les realizó una necropsia para un análisis
macroscópico y microscópico de las lesiones de la PPE.
Se realizaron observaciones diarias de la salud
desde el día del inicio del estudio hasta el día de la exposición
de cada animal de prueba. Se puntuó la salud clínica (diarrea,
comportamiento y estado corporal) diariamente desde el día de la
exposición (día 21) hasta la finalización del estudio (día 42). Los
pesos se tomaron el día de la vacunación (día 0), el día de la
exposición (día 21) y el día de finalización del estudio (día 42)
para calcular las ganancias de peso medias diarias de cada grupo de
tratamiento. La presencia en heces de L. intracellularis se
evaluó mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
comprobando los exudados fecales (f-PCR) en los
días 0, 7, 14, 21, 28, 35 y 42 del estudio. Todos los animales
sacrificados al finalizar el estudio (día 42) fueron examinados
para comprobar las lesiones macroscópicas y microscópicas. El
análisis cualitativo del contenido bacteriano en los tejidos se
evaluó mediante PCR (t-PCR) junto con una evaluación
histológica de L. intracellularis en el íleon, el colon, la
amígdala y el nódulo linfático mesentérico el día 42 del estudio.
El suero se recogió los días 0, 7, 14, 21, 28, 35 y 42 del estudio.
El suero se probó usando la prueba indirecta de anticuerpos
fluorescentes (IFAT) para detectar anticuerpos
anti-Lawsonia en los animales de prueba. Las
comparaciones en el grupo de tratamiento se realizaron mediante el
análisis de los datos de las ganancias de peso medias diarias tras
la vacunación y tras la exposición, las puntuaciones clínicas, las
tasas de seroconversión (IFAT), la colonización
(t-PCR), la presencia en heces
(f-PCR), y el desarrollo de lesiones macroscópicas
y microscópicas mediante inmunohistoquímica (IHC).
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados finales de las pruebas para cada
grupo de tratamiento revelaron el desarrollo de lesiones
macroscópicas y microscópicas significativas en el íleon y el colon
en cerdos de control expuestos no vacunados (grupo 4) en
comparación con los cerdos vacunados independientemente de la dosis
(alta, media y baja) en los grupos 1, 2 y 3 (p<0,05). Las
puntuaciones medias de las lesiones macroscópicas del colon con una
dosis baja de vacuna no eran significativamente diferentes a los
controles expuestos. El grupo con una dosis baja de vacuna (grupo
3) es el único grupo de tratamiento que recibió vacuna y tuvo un
desarrollo de lesiones significativo (macroscópicas y
microscópicas) en comparación con el grupo de control estricto que
no recibió una vacunación, placebo ni exposición a lo largo del
estudio.
\vskip1.000000\baselineskip
Se registraron diariamente las puntuaciones
clínicas de cada animal desde el día de la exposición (día 21)
hasta la necropsia (día 42). Las puntuaciones clínicas se calcularon
para obtener una puntuación clínica diaria media que reflejara la
gravedad y la duración de la afección entre los grupos de
tratamiento debido a la recepción de una exposición virulenta a
L. intracellularis. Las puntuaciones clínicas medias de cada
grupo de tratamiento se resumen en la
Tabla 8.
Tabla 8.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis estadístico de las puntuaciones
clínicas se consiguió revisando los datos relacionados con los
grupos de tratamiento que recibieron las puntuaciones clínicas
medias usando un análisis de la variancia unifactorial. No hubo
pruebas de diferencias significativas entre los grupos de control
expuestos no vacunados y los controles estrictos en comparación con
los grupos vacunados con dosis altas, medias o bajas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las ganancias de peso medias diarias (ADWG) se
calcularon desde el momento de la administración de la vacuna (día
0), hasta la administración de la exposición (día 21), hasta la
finalización del estudio (día 42). El análisis estadístico de las
diferencias en la ganancia de peso entre los grupos de tratamiento
de control expuestos vacunados con dosis altas y no vacunados
reveló pruebas de una diferencia significativa desde el momento de
la administración de la exposición hasta la necropsia (p<0,05).
Los datos del peso se resumen en la Tabla 9.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogieron semanalmente muestras de suero de
todos los animales de prueba en cada grupo de tratamiento y se
comprobó la presencia de anticuerpos IgG
anti-Lawsonia en los días 0, 7, 14, 21, 28, 35 y 42
del estudio. Las muestras de control IFAT positivas y negativas
fueron 100% precisas en todos los ensayos realizados en este
estudio. En los días 0 hasta 21 (3 semanas después de la
vacunación), todos los animales de prueba de cada grupo de
tratamiento dieron negativo en el IFA. En el día 28 (1 semana
después de la exposición) del estudio, 1/15 (6,7%) de los animales
de prueba del grupo de tratamiento con una dosis alta de vacuna
dieron positivo en el IFA mientras que todos los demás dieron
negativo en el IFA. En el día 35 (2 semanas después de la
exposición) del estudio, 4/15 (26,7%) de los cerdos de los grupos de
tratamiento con dosis altas y dosis medias de vacuna y 1/10 (10%)
de los cerdos del grupo de tratamiento de control expuestos no
vacunados dieron positivo en el IFA para los anticuerpos de
Lawsonia. Ambos grupos de tratamiento con una dosis baja de vacuna
y de control estricto dieron negativo en el IFA en el día 35. En el
día 42 (3 semanas después de la exposición) del estudio, 8/10 (80%)
de los cerdos del grupo de control expuesto, 6/15 (40%) de los
cerdos del grupo con una dosis media de vacuna, 5/15 (33,3%) de los
cerdos del grupo con una dosis baja de vacuna y 3/15 (20%) de los
cerdos del grupo con una dosis alta de vacuna dieron positivo en el
IFA. El grupo de tratamiento de control estricto dio negativo en el
IFA al finalizar el estudio (día 42).
Los datos de seroconversión se analizaron usando
la estadística de \chi^{2}. Para los resultados obtenidos en el
grupo de tratamiento de control estricto no se tuvo en cuenta una
estadística de \chi^{2} debido al 100% de respuestas negativas
encontradas para cada animal de prueba a lo largo del estudio. En
los grupos de tratamiento que recibieron una vacuna o placebo, los
resultados del IFAT se compararon usando una estadística de
\chi^{2} con una estimación del valor exacto de p
(Monte-Carlo). Los resultados positivos del IFAT
obtenidos de los grupos expuestos que recibieron una exposición a
un cultivo puro virulento eran significativamente mayores que los
que recibieron una dosis alta de vacuna y una dosis baja de vacuna
(p<0,05) en el día 42 (3 semanas después de la exposición) del
estudio.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recogieron semanalmente los exudados fecales
de todos los animales de prueba de cada grupo de tratamiento y se
comprobó la presencia de L. intracellularis mediante PCR en
los días 0, 7, 14, 21, 28, 35 y 42 del estudio. La extracción
positiva y negativa de ADN y los controles de la reacción de PCR
fueron 100% precisos para cada ensayo realizado en este estudio.
Todos los animales de prueba de cada grupo de tratamiento dieron
negativo en heces mediante PCR para L. intracellularis desde
el día 0 (vacunación) hasta el día 21 (exposición). Los cerdos del
grupo de control estricto permanecieron negativos en heces mediante
PCR para L. intracellularis en sus heces a lo largo del
estudio. La presencia en heces de L. intracellularis (PCR
fecal positiva) fue evidente en varios grupos de tratamiento cada
semana tras la inoculación de la exposición. Estos resultados se
resumen en la Tabla 10.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis estadístico usando una estadística
de \chi^{2} con una estimación del valor exacto dep (Monte
Carlo) comparó las respuestas positivas de cada grupo de tratamiento
vacunado sólo con el grupo de control expuesto no vacunado. Los
resultados del grupo de control estricto se retiraron de las
comparaciones de grupo porque cada cerdo era 100% negativo en heces
mediante PCR para L. intracellularis a lo largo del estudio.
En el día 28 (1 semanas después de la exposición), los cerdos que
recibieron una dosis alta de vacuna tuvieron una presencia en heces
de L. intracellularis significativamente menor que los cerdos
expuestos no vacunados (p = 0,017). En el día 35 (2 semanas después
de la exposición), los cerdos que recibieron una dosis alta (p =
0,0024) y una dosis media (p = 0,041) de vacuna tenían una presencia
en heces de L. intracellularis significativamente menor que
los cerdos expuestos no vacunados. En el día 42 (finalización del
estudio), de nuevo, los cerdos que recibieron una dosis alta y
media de vacuna (p = 0,017) tuvieron una presencia en heces de
L. intracellularis significativamente menor en comparación
con los cerdos expuestos no vacunados. Los cerdos del grupo con una
dosis baja no eran significativamente menos positivos en la PCR que
los controles expuestos en cualquier día después de la
exposición.
\vskip1.000000\baselineskip
Las pruebas de la Reacción en Cadena de la
Polimerasa de las secciones tisulares el íleon terminal, el colon,
la amígdala y el nódulo linfático mesentérico se realizaron después
de la necropsia (día 42 del estudio). En el grupo con una dosis
alta de vacuna, 1/15 (6,7%) de los cerdos dieron positivo en la PCR
para la colonización por L. intracellularis en la amígdala,
mientras que todos los demás grupos de tratamiento dieron negativo
en la PCR. La prueba de ileítis mediante PCR del tejido linfático
mesentérico reveló que 3/10 (30%) de los cerdos de los controles
expuestos no vacunados dieron positivo para la colonización por
L. intracellularis, mientras que todos los demás grupos de
tratamiento dieron negativo en la PCR. La prueba de ileítis mediante
PCR de los raspados de la mucosa del íleon terminal revelaron que
4/10 (40%) de los cerdos de los controles expuestos, 4/15 (26,7%)
de los cerdos del grupo con una dosis baja de vacuna, 2/15 (13,3%)
de los cerdos del grupo con una dosis media de vacuna y 1/15 (6,7%)
de los cerdos con una dosis alta de vacuna dieron positivo en la
PCR para la colonización por L. intracellularis. La prueba de
ileítis mediante PCR del colon reveló que 3/10 (30%) de los cerdos
de los controles expuestos, 5/15 (33,3%) de los cerdos del grupo con
una dosis baja de vacuna, 1/15 (6,7%) de los cerdos del grupo con
una dosis media de vacuna y 2/15 (13,3%) de los cerdos con una
dosis alta de vacuna eran positivos mediante PCR para la
colonización por L. intracellularis. No se observaron
pruebas de colonización por L. intracellularis en los tejidos
del grupo de control estricto.
El análisis estadístico de los resultados
positivos de la ileítis mediante PCR se comparó con los grupos de
tratamiento usando la estadística de \chi^{2} con una
aproximación de Monte Carlo del valor exacto de p. Los resultados
mediante PCR del nódulo linfático mesentérico indicaron pruebas de
una diferencia significativa entre los controles expuestos no
vacunados y todos los grupos de tratamiento que recibieron un
tratamiento con vacuna (p = 0,054). No hubo ninguna significación
estadística evidente entre los grupos de tratamiento en la
colonización por L. intracellularis del íleon, el colon o la
amígdala en el día 42 del estudio.
\vskip1.000000\baselineskip
En la necropsia (día 42) se recogieron secciones
de 2 a 4 cm de longitud de la amígdala, el nódulo linfático
mesentérico, el íleon terminal y el colon, y se colocaron en
formalina tamponada al 10% para su análisis histológico.
Lawsonia intracellularis no se detectó mediante una tinción
por IHC de las secciones de la amígdala en todos los grupos de
tratamiento en la necropsia. El grupo de control estricto dio
negativo para L. intracellularis mediante IHC en todas las
muestras de tejido tomadas en la necropsia. Se encontró la presencia
de L. intracellularis y de lesiones microscópicas asociadas
con la PPE en el íleon de 9/10 (90%) de los cerdos de los controles
expuestos no vacunados, en 6/15 (40%) de los cerdos del grupo con
una dosis baja de vacuna, en 3/15 (20%) de los cerdos del grupo con
una dosis media de vacuna y en 1/15 (6,7%) de los cerdos del grupo
con una dosis alta de vacuna, respectivamente. Las lesiones
microscópicas eran evidentes en el colon de 8/10 (80%) de los
cerdos del grupo de control expuesto, en 3/15 (20%) de los cerdos
del grupo con una dosis baja de vacuna y en 1/15 (6,7%) de los
cerdos del grupo con una dosis alta de vacuna. El grupo vacunado que
recibió una dosis media dio negativo mediante IHC para L.
intracellularis en el colon. Las secciones teñidas del nódulo
linfático mesentérico sólo se produjeron en 1/10 (10%) de los cerdos
del grupo de control expuesto que tenían L. intracellularis.
Los resultados positivos mediante IHC en las secciones del íleon y
del colon entre los grupos de tratamiento se correlacionaban bien
con la presencia de una acusada hiperplasia de las criptas
demostrada mediante una metodología de H&E.
El análisis estadístico de los datos
cuantitativos de IHC se consiguió usando las pruebas de análisis de
la variancia unifactorial y de la suma por rangos de
Kruskal-Wallis, seguidas de contrastes específicos
de los valores de p entre el grupo expuesto y los grupos de control
estricto con cada grupo de dosis de vacuna. El análisis estadístico
reveló pruebas del desarrollo de una lesión significativa debida a
L. intracellularis en el íleon y el colon del grupo de
control expuesto en comparación con los cerdos vacunados
independientemente de la dosis en el día 42 del estudio
(p<0,001). No hubo una significación estadística evidente en las
puntuaciones medias de las lesiones mediante IHC del íleon y del
colon en animales vacunados que recibieron una dosis alta o media
de la vacuna en comparación con el grupo de tratamiento de control
estricto (p>0,05). Los cerdos que recibieron una dosis baja de
vacuna tuvieron unas puntuaciones medias de las lesiones
microscópicas debidas a L. intracellularis
significativamente mayores en el íleon en comparación con el grupo
de control estricto (p< 0,05).
\vskip1.000000\baselineskip
El íleon y el colon de cada animal de prueba se
puntuaron en el momento de la necropsia (día 42) para las lesiones
macroscópicas asociadas con la PPE. Los tejidos de los cerdos de
prueba del control estricto eran normales, no contenían lesiones, y
recibieron unas puntuaciones medias de las lesiones de 1,1 (íleon) y
1,0 (colon). Los tejidos de los animales de prueba del grupo de
control expuesto no vacunados recibieron la puntuación media de las
lesiones macroscópicas más alta para el íleon (3,6) y el colon (2,0)
de entre los grupos de tratamiento. Los cerdos de prueba del grupo
con una dosis baja de vacuna recibieron unas puntuaciones medias de
las lesiones macroscópicas de 2,5 (íleon) y 1,5 (colon). Los cerdos
de prueba con una dosis media de vacuna recibieron unas
puntuaciones medias de las lesiones macroscópicas de 1,5 (íleon) y
1,0 (colon). Los tejidos del grupo con una dosis alta de vacuna
recibieron unas puntuaciones medias de las lesiones macroscópicas de
1,5 (íleon) y 1,2 (colon).
El análisis estadístico de las puntuaciones
medias de las lesiones macroscópicas entre los grupos de tratamiento
se consiguió usando un análisis de la variancia unifactorial. Las
puntuaciones medias de las lesiones macroscópicas indicaron pruebas
de una diferencia significativa entre el íleon del grupo de control
expuesto no vacunado y los grupos con una dosis media y alta de
vacuna, respectivamente (p<0,001). Se observaron pruebas de una
diferencia significativa entre las puntuaciones medias del íleon
macroscópico del control expuesto en comparación con el grupo con
una dosis baja de vacuna (p<0,01). Las puntuaciones medias de las
lesiones macroscópicas del colon fueron significativamente mayores
en el grupo de control expuesto en comparación con los grupos con
una dosis media y alta de vacuna, respectivamente (p<0,05).
Además, se observó el desarrollo de una significativa lesión
macroscópica en el íleon del grupo vacunado con una dosis baja en
comparación con el grupo de control estricto (p<0,001). No hubo
pruebas de una significación estadística en las puntuaciones medias
de las lesiones macroscópicas (íleon y colon) evidentes en los
grupos con una dosis media y alta de vacuna en comparación con el
grupo de tratamiento de control estricto.
\vskip1.000000\baselineskip
Este estudio demostró que la protección en
cerdos de 3 semanas de edad frente a la PPE se consiguió cuando se
administraba una dosis por vía oral de 2 ml de una vacuna de B3903
(liofilizada) que contiene un mínimo de 4,9 logs de L.
intracellularis vivas por dosis. Una protección similar, e
incluso ligeramente mejor, fue evidente en el grupo de tratamiento
con una dosis alta de vacuna que recibió 6,0 logs/dosis 3 semanas
antes de la exposición. El grupo con una dosis baja de vacuna (3,8
logs/dosis) no mostró una protección adecuada frente a una
exposición heteróloga de cultivo puro virulento en comparación con
los animales de prueba que recibieron una dosis alta o media de la
vacuna experimental. Las diferencias estadísticas fueron evidentes
entre el grupo con una dosis baja de vacuna y los controles
expuestos no vacunados con respecto a la gravedad de las lesiones
microscópicas en el íleon y el colon (p<0,001) y las puntuaciones
medias de las lesiones macroscópicas del íleon (p<0,01). Sin
embargo, se observaron unas lesiones de PPE significativas en el
íleon (lesiones microscópicas) y el colon (lesiones macroscópicas)
en este grupo en comparación con el grupo de control estricto que
no recibió vacuna ni exposición.
En resumen, los datos de este estudio demuestran
que: (1) el título protector mínimo de una administración oral
única de una vacuna de B3903 (liofilizada) a cerdos de 3 semanas de
edad es de 4,9 logs/dosis; (2) la vacuna B3903 (liofilizada) es
eficaz frente a un cultivo puro virulento de bajo pase de L.
intracellularis, cepa clínica heteróloga N101494; y (3) la
vacuna B3903 (liofilizada) contribuye a la reducción de las lesiones
macroscópicas y microscópicas, de la colonización tisular y de la
presencia en heces de L. intracellularis en cerdos vacunados
en comparación con cerdos no vacunados.
Claims (22)
1. Una cepa clínica virulenta de Lawsonia
intracellularis, en la que dicha cepa clínica virulenta es la
cepa clínica de Lawsonia intracellularis depositada en la
ATCC con el nº PTA-4927 o cualquier cepa clínica
avirulenta de Lawsonia intracellularis de origen europeo,
caracterizada porque dicha Lawsonia intracellularis
avirulenta no provoca la presencia en heces el día 14 después de la
vacunación.
2. Una vacuna para la inmunización de un animal,
que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de una
Lawsonia intracellularis avirulenta según la
reivindicación 1, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
3. La vacuna según la reivindicación 2, en la
que la cantidad farmacéuticamente eficaz de la cepa clínica
avirulenta de Lawsonia intracellularis es de una
TCID_{50} de 10^{3} hasta una TCID_{50} de 10^{6} por
dosis.
4. Una vacuna para la inmunización de un animal,
que comprende la cepa clínica avirulenta de Lawsonia
intracellularis según la reivindicación 1 y material antigénico
procedente de al menos uno de los siguientes patógenos: especies
del género Salmonella, especies del género
Erysipelothrix, especies del género Haemophilus,
especies del género Mycoplasma, especies del género
Leptospira, especies del género Clostridium, especies
del género Streptococcus, especies del género
Brachyspira, circovirus, virus del síndrome reproductor y
respiratorio porcino (PRRS), virus de la gripe porcina (SIV), virus
transmisible de gastroenteritis (TGE), parvovirus y Escherichia
coli; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
5. Una vacuna para la inmunización de un animal,
que comprende la cepa clínica avirulenta de Lawsonia
intracellularis según la reivindicación 1 y material antigénico
procedente de Salmonella choleraesuis, especies del género
Erysipelothrix, virus transmisible de gastroenteritis (TGE),
Escherichia coli, especies del género Clostridium y
especies del género Brachyspira; y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
6. Una vacuna para la inmunización de un animal,
que comprende la cepa clínica avirulenta de Lawsonia
intracellularis según la reivindicación 1 y material antigénico
procedente de Salmonella choleraesuis y especies del género
Erysipelothrix; y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
7. Una vacuna para la inmunización de un animal,
que comprende la cepa clínica avirulenta de Lawsonia
intracellularis según la reivindicación 1 y material antigénico
procedente de al menos uno de los siguientes patógenos: especies
del género Clostridium, virus de la gripe equina (EIV), virus
del herpes equino (EHV), alfavirus y virus del Nilo occidental; y
un vehículo farmacéuticamente aceptable.
8. La cepa clínica avirulenta de Lawsonia
intracellularis patógena según la reivindicación 1, para uso
como una vacuna.
9. La cepa clínica avirulenta de Lawsonia
intracellularis patógena según la reivindicación 8, para uso
como una vacuna para proteger a un animal frente a la enteropatía
proliferativa porcina.
10. Un método para elaborar una vacuna para
inducir una respuesta inmune ante bacterias de Lawsonia
intracellularis en un animal, que comprende las etapas de:
(a) incubar una cepa clínica de Lawsonia
intracellularis según la reivindicación 1 en células de
cultivo que están en suspensión con una concentración de oxígeno de
menos de aproximadamente el 10 por ciento para cultivar dichas
bacterias; y (b) mezclar dichas bacterias cultivadas con un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
11. Un método para cultivar Lawsonia
intracellularis según la reivindicación 1, que comprende:
- (a)
- infectar células cultivadas con un inóculo que comprende la cepa clínica avirulenta de Lawsonia intracellularis según la reivindicación 1,
- (b)
- incubar dichas células infectadas con una concentración de oxígeno de menos del 10 por ciento mientras se mantienen dichas células infectadas en suspensión mediante la agitación de dichas células, y
- (c)
- recolectar al menos una porción de dicha Lawsonia intracellularis.
\vskip1.000000\baselineskip
12. El método según la reivindicación 11, en el
que la concentración de oxígeno está en el intervalo del 0 por
ciento al 8 por ciento.
13. El método según la reivindicación 12, en el
que la concentración de oxígeno está en el intervalo del 0 por
ciento al 3 por ciento.
14. El método según la reivindicación 11, en el
que dicha incubación se produce con una concentración de dióxido de
carbono en el intervalo de 6 por ciento al 10 por ciento.
15. El método según la reivindicación 11, en el
que dichas células cultivadas se eligen del grupo formado por:
células HEp-2, McCoy e IEC-18.
16. El método según la reivindicación 11, en el
que dichas células IEC-18 se cultivan en
microvehículos.
17. El método según la reivindicación 11, en el
que las células infectadas se incuban según la etapa (c) durante un
periodo de 2 hasta 10 días.
18. El método según la reivindicación 11, que
comprende, además, una etapa (d) de liofilizar dichas bacterias
recolectadas.
19. El método según la reivindicación 18, en el
que dicha liofilización comprende una etapa primaria de secado y
una etapa secundaria de secado.
20. Un método para el diagnóstico de la
enteropatía proliferativa porcina, que comprende realizar un ensayo
para detectar anticuerpos contra Lawsonia intracelluris en
un sujeto animal no humano, que comprende:
- (a)
- poner en contacto una muestra del sujeto con la cepa clínica de Lawsonia intracellularis según la reivindicación 1 para formar un complejo antígeno-anticuerpo; y
- (b)
- detectar la formación de dicho complejo,
en el que la presencia de dicho complejo se
correlaciona positivamente con un diagnóstico de la enteropatía
proliferativa porcina.
21. El método según la reivindicación 20, en el
que el ensayo comprende un ensayo elegido del grupo formado por:
radioinmunoensayo, ensayo de inmunosorción enzimática (ELISA),
inmunoensayo de fluorescencia y ensayo de inmunoelectroforesis.
22. Un método para producir antisueros contra
Lawsonia intracelluris en un animal no humano, que
comprende:
- (a)
- administrar la cepa clínica de Lawsonia intracelluris de la reivindicación 1 a un animal no humano en una cantidad eficaz para desencadenar una respuesta inmune; y
- (b)
- recoger el antisuero o el plasma que contiene los anticuerpos contra dicha Lawsonia intracelluris.
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