CN103601720A - 经吡咯取代的2-吲哚酮的固态盐形式 - Google Patents

Abstract

本申请一般性地涉及经吡咯取代的2-吲哚酮的固态盐形式。具体地，本发明涉及经3-吡咯取代的2-吲哚酮化合物5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)-酰胺的固体盐形式。本发明还涉及该酰胺的柠檬酸盐的同质多晶形体。本发明还涉及所述盐和同质多晶形体在治疗蛋白激酶相关病症中的用途。

Description

经吡咯取代的2-吲哚酮的固态盐形式

本申请是申请日为2006年9月8日、题目为“经吡咯取代的2-吲哚酮的固态盐形式”的中国专利申请No.200680034505.3的分案申请。

技术领域

本发明涉及经3-吡咯取代的2-吲哚酮化合物，5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)-酰胺。前述化合物能调节蛋白激酶(“PK”)的活性。本发明的所述化合物因此可用于治疗与异常的PK活性相关的病症。本发明公开了包含该化合物的盐的药物组合物和制备它们的方法。本发明还涉及所述酰胺的磷酸盐形式的同质多晶形体(polymorph)。

发明背景

下文仅作为背景信息提供，其不被认为是本发明的现有技术。

固体，包括药物，通常具有不止一种晶形，这是人们已知的同质多晶形现象。当化合物以晶体堆积形式有所不同的多种固相结晶时，就会发生同质多晶形现象。在药物固态性质的标准参考文献中提到了许多例子，如Byrn，S.R.，Solid-State Chemistry of Drugs，New York，Academic Press(1982)、Kuhnert-Brandstatter，M.，Thermomiscroscopy In The Analysis ofPharmaceuticals，New York，Pergamon Press(1971)and Haleblian，J.K.andMcCrone，W.Pharmaceutical applications of polymorphism.J.Pharm.Sci.，58，911(1969)。Byrn提出，通常同质多晶形体显示出不同的物理性质，包括溶解度和物理与化学稳定性。

因为分子堆积的差别，同质多晶形体在影响药品释放的方式、固态稳定性的方式和药物制造的方式上可能有所不同。同质多晶形体的相对稳定性和同质多晶形体的相互转变对对于上市药品的选择来说特别重要。合适的同质多晶形体的选择可能取决于物理稳定性。例如，对上市药品的选择可取决于对具有想要的特性(例如优秀的物理稳定性或可被大规模制造的能力)的合适同质多晶形体的选择和其可获得性。在该产品的保质期内，该固体剂量形式的性能不应受到同质多晶形体转变的限制。需要特别注意的是：没有可靠的方法来预测给定药品的可见的晶体结构或预测具有想要的物理性质的同质多晶形体的存在。

PK是能催化蛋白质酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基上的羟基的磷酸化反应的酶。这种看似简单的活性的结果是令人惊愕的，因为事实上细胞生命的几乎所有方面(例如细胞生长、分化和增殖)都以这样或那样的途径依赖于PK活性。此外，异常的PK活性已与许多病症联系起来，这些病症的范围从相对没有生命威险的疾病(例如牛皮癣)到非常致命的疾病，例如，成胶质细胞瘤(脑癌)。

受体酪氨酸激酶(RTK)是一类PK，它们是分子靶向治疗技术的优秀候选物，因为它们在控制细胞增殖和存活的方面起了关键作用，并且，在多种恶性肿瘤中经常被失调。失调的机制包括过量表达(乳腺癌中的Her2/neu、非小细胞肺癌中的表皮生长因子受体)、激活突变(胃肠间质瘤中的KIT、急性骨髓性白血病中的fms相关的酪氨酸激酶3/Flk2(FLT3))以及活化的自分泌环(黑色素瘤中的血管内皮生长因子/VEGF受体(VEGF/VEGFR)、肉瘤中的血小板衍生的生长因子/PDGF受体(PDGF/PDGFR))。

被异常调节的RTK已被描述于可相比较的人类癌和犬类癌中。例如，Met致癌基因的异常表达在人类肉骨瘤和犬类骨肉瘤中都会发生。有趣的是，c-kit的近膜(JM)结构域的可相比较的激活突变见于50％-90％的人类胃肠间质瘤(GIST)中以及及30％-50％的晚期(advanced)犬类MCT中(肥大细胞肿瘤)。尽管在人类GIST中的突变由在该JM结构域的缺失构成，而犬MCT中的突变由在该JM结构域的内源性串联复制(ITD)构成，但在缺少配体结合的情况下，这二者都产生组成型的KIT磷酸化。RTK和它们的配体，VEGF、PDGF和FGF调节在实质瘤中的新生血管(作为血管形成已知)。因此，可通过抑制RTK来抑制新的血管生长进肿瘤中。

抗血管形成剂是抑制血管生长进肿瘤内的分子，其与传统抗癌药物相比对身体的毒性要少得多。在此通过引用并入本文的美国专利6,573,293公开了5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基-乙基)-酰胺(下文称为“化合物I”)等化合物。它具有如下结构：

化合物I

化合物I是显示出PK调节能力的小分子。该化合物因此可用于治疗与异常PK活性相关的病症。它是RTK、PDGFR、VEGFR、KIT和FLT3的抑制剂。化合物I已显示出能抑制KIT磷酸化、阻止细胞增殖，以及在表达多种突变体KIT形式的恶性肥大细胞系中体外诱导细胞周期的中止和凋亡。化合物I和相关分子在临床前模型中对由不同人类肿瘤来源的细胞系引起的肿瘤异体移植物(xenograft)有效。

化合物I用于治疗伴侣动物(主要是狗)的癌症，也可用于治疗尤其是人的癌症。这些癌包括但不限于白血病、脑癌、非小细胞肺癌、鳞状上皮细胞瘤、星状细胞瘤、Kaposi氏肉瘤、成胶质细胞瘤、肺癌、膀胱癌、头颈癌、小细胞肺癌、神经胶质瘤、结直肠癌、泌尿道癌和胃肠间质癌。化合物I可用于治疗与肥大细胞过量表达相关的疾病，这包括但不限于人的肥大细胞增多症和犬的肥大细胞瘤。

化合物I近来显示对狗中自发产生的多种恶性肿瘤临床有效。在该研究中，22个犬MCT中的11个显示出对化合物I治疗的可持续客观应答(部分应答和完全应答)；这些MCT中的9个具有在c-kit的JM结构域中的ITD。

化合物I易于结晶。25℃时其在pH6的磷酸盐缓冲液中的溶解度约为10μg/ml。当该化合物是合成的时，在合成的最后步骤中，非常细的颗粒从溶液中沉淀出来。随后通过过滤进行的对这些细颗粒的分离很慢，并且在过滤后产生硬的滤渣。人们对具有物理稳定性和想要的物理性质的化合物I的盐有需求。

发明内容

本发明包含化合物I的盐的形式。本文中合成及描述了化合物I的五种不同的盐形式(见表1)。其包括化合物I的盐酸盐、反丁烯二酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和抗坏血酸盐。基于这些盐的特征，1∶1的磷酸盐——化合物I的磷酸盐被鉴定为具有高度想要的特征的盐形式。同质多晶形体筛选揭示了化合物I磷酸盐的10种同质多晶形体的存在，它们本文被命名为形式I至形式X。

在一个方面，这个发明提供了化合物I的两种盐形式，其中所述盐形式选自柠檬酸盐和磷酸盐，及它们的溶剂化物和同质多晶形体。在一种实施方式中，选用具有C₂₂H₂₅FN₄O₂·H₃PO₄的分子式的磷酸盐形式。在另一实施方式中，选用具有从约285℃至约290℃的熔点的磷酸盐形式。化合物I磷酸盐具有下述结构：

化合物I磷酸盐

在另一实施方式中，选用具有C₂₂H₂₅FN₄O₂·C₆H₈O₇的分子式的柠檬酸盐(化合物I柠檬酸盐)。在再另一实施方式中，选用具有从约178℃至约183℃的熔点的柠檬酸盐形式。化合物I柠檬酸盐具有如下结构：

化合物I柠檬酸盐

本发明的第二方面是药物组合物，其包含化合物I磷酸盐或化合物I柠檬酸盐，或它们的溶剂化物或同质多晶形体，及药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明的第三方面是用来调节蛋白激酶的催化活性的方法，所述方法包括：使该蛋白激酶与化合物I磷酸盐或化合物I柠檬酸盐，或它们的溶剂化物或同质多晶形体接触。蛋白激酶可选自由受体酪氨酸激酶、非受体蛋白酪氨酸激酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶构成的组。

本发明的第四方面是预防或治疗生物体中与蛋白激酶相关的病症的方法，所述方法包括：对该生物体施用以治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含化合物I磷酸盐或化合物I柠檬酸盐，或它们的溶剂化物或同质多晶形体，及药学上可接受的载体或赋形剂。在一种实施方式中，该生物体是人。在另一实施方式中，该生物体是伴侣动物。在又另一实施方式中，该伴侣动物是猫或狗。蛋白激酶相关病症可选自由受体酪氨酸激酶相关病症、非受体蛋白酪氨酸激酶相关病症及与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶相关病症构成的组。蛋白激酶相关病症可选自由EGFR相关病症、PDGFR相关病症、IGFR相关病症、c-kit相关病症及FLK相关病症构成的组。这些病症包括(举例而言，其不限于)白血病、脑癌、非小细胞肺癌、鳞状上皮细胞瘤、星状细胞瘤、Kaposi氏肉瘤、成胶质细胞瘤、肺癌、膀胱癌、头癌、颈癌、黑色素瘤、卵巢癌、***癌、乳腺癌、小细胞肺癌、神经胶质瘤、肥大细胞增多症、肥大细胞瘤、结直肠癌、泌尿道癌、胃肠癌、糖尿病、自身免疫性病症、过度增殖(hyperproliferation)病症、再狭窄、纤维化、牛皮癣、von Heppel-Lindau病、骨关节炎、风湿性关节炎、血管形成、炎性病症、免疫病症及心血管病症。

本发明的第五方面是制备碱5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-吡咯烷-1-基乙基)-酰胺的磷酸盐晶体的方法，该方法包括：在包含溶剂或溶剂混合物的溶液中，向该碱引入符合化学计量的量(stoichiometric amount)的磷酸，使磷酸盐在溶液中结晶，从该溶剂溶液中分离出磷酸盐晶体，及干燥该晶体。磷酸可以以相对碱而言40％摩尔过量的量被引入。该溶剂可包含异丙醇。从溶剂溶液中分离晶体的步骤可包括向该溶液中加入乙腈以及旋蒸(rotovapping)该溶液。从溶剂溶液中分离晶体的步骤也可包含过滤。

本发明的第六方面是制备碱5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-吡咯烷-1-基乙基)-酰胺的柠檬酸盐晶体的方法，该方法包括：在包含溶剂或溶剂混合物的溶液中，向该碱引入符合化学计量的量的柠檬酸，使柠檬酸盐在溶液中结晶，从溶液中分离出柠檬酸盐晶体，及干燥该晶体。柠檬酸可以以相对碱而言40％摩尔过量的量被引入。该溶剂可包含甲醇。从溶剂溶液中分离晶体的步骤可包括向该溶液加入乙腈和旋蒸该溶液。从溶剂溶液中分离晶体的步骤可包含过滤。

在第七方面中，本发明提供了化合物I的磷酸盐的同质多晶形体形式I-X(如本文所描述的)。在一种实施方式中，提供了形式I。

本发明的第八方面是包含化合物I磷酸盐的形式I同质多晶形体和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。

本发明的第九方面是用于调节蛋白激酶的催化活性的方法，所述方法包括使所述蛋白激酶与化合物I磷酸盐的形式I同质多晶形体接触。

本发明的第十方面是预防或治疗生物体中与蛋白激酶相关的病症方法，该方法包括对所述生物体施用治疗有效量的化合物I磷酸盐的形式I同质多晶形体。在一种实施方式中，生物体是人或伴侣动物。在另一实施方式中，伴侣动物是猫或狗。这些病症包括(举例而言，并不限于)肥大细胞瘤和肥大细胞增多症。

本发明的第十一方面是制备化合物I磷酸盐的同质多晶形体的方法，所述方法包括：向包含溶剂或溶剂混合物的溶液引入该磷酸盐，可选地，向该溶液加入桥连(bridging)溶剂，从该溶剂溶液中分离出同质多晶形体晶体。该溶液可包含水加上乙腈。该溶液可包含甲醇。该桥连溶剂可以是甲醇。

本发明的第十二方面是化合物I磷酸盐或化合物I柠檬酸盐或磷酸盐形式I同质多晶形体在制备药剂中的用途，所述药剂用于治疗通过异常PK活性介导的疾病。

附图说明

图1是化合物I的盐的水气吸着(sorption)数据。

图2是化合物I柠檬酸盐和化合物I磷酸盐的粉末X射线衍射图。

图3是从同质多晶形体筛选研究(见实施例5)得到的十种独特的固体粉末的X射线衍射图。展示了表5和表6中命名的形式I至形式X。

图4是来自CH₂Cl₂(形式VI，在沉淀之后立即进行)、己烷(形式VII，在静置一夜后)和乙腈(形式VIII，在静置3天后)的固体的TGA曲线。

图5是来自实施例7中评估的MCT的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。道1-5对应表8中的患者1-5；道6-14对应表8中的患者6-14。由PCR产物构成的对照组是从含有48-bp ITD(道15)的C2犬肥大细胞系和从正常犬小脑(野生型；道16)产生的。

图6是在化合物I磷酸盐的单一剂量之后，MCT磷酸化的KIT和磷酸化的细胞外信号调节激酶(ERK)1/2中的减少。

发明详述

定义：除非另外声明，说明书和权利要求中使用的下述术语具有下文讨论的含义：

当提到温度时，术语“C”指摄氏温度或摄氏度。

术语“催化活性”是指在RTK及/或CTK直接或间接的影响下的酪氨酸的磷酸化速率，或在STK直接或间接的影响下的丝氨酸和苏氨酸的磷酸化速率。

术语“伴侣动物”指为人提供陪伴的被驯化的动物，其包括但不于猫和狗。

术语“接触”指把本发明的化合物与靶PK以下述方式放在一起，所述方式使得该化合物能直接影响(即，通过与该激酶本身的相互作用)或间接影响(通过与该激酶的催化活性所依赖的另一分子的相互作用)该PK的催化活性。

术语“IC₅₀”指测试化合物的浓度达到对该PK活性的最大抑制的一半的浓度。

术语“调节(modulation)”或“调节(modulating)”指改变RTK、CTK和STK的催化活性。特别地，调节(modulating)指对RTK、CTK和STK的催化活性的活化或抑制，优选地，对RTK、CTK和STK的催化活性的活化，这取决于RTK、CTK和STK所被暴露给的化合物或盐的浓度，或更优选地，对RTK、CTK和STK的催化活性的抑制。

术语“PK”指受体蛋白酪氨酸激酶(RTK)、非受体或“细胞”酪氨酸激酶(CTK)和丝氨酸-苏氨酸激酶(STK)。

术语“同质多晶形体”指物质的下述固相，由于分子在晶格中的不同排列及/或构象(confirmation)，所述固相以若干种有区别的形式存在。典型地，同质多晶形体具有不同的化学性质和物理性质。

术语“药学上可接受的赋形剂”指加入药物组合物中的、不同于本发明的化合物的任何物质。

术语“药物组合物”指如本文所述的、一种或多种本发明的盐或这些盐的同质多晶形体，和其它化学成分(例如生理上/药学上可接受的载体和赋形剂)的混合物。药物组合物的目的是协助向生物体施用化合物。

术语“生理上/药学上可接受的载体”指不会导致对生物体的显著刺激及不会消除将被施用的化合物的生物学活性与性质的载体或稀释剂。

术语“同质多晶形体”也可被定义为化合物的不同的非溶剂化晶体形式。该术语也包括溶剂化物(即，含有溶剂或水的形式)、无定形形式(即，非晶体形式)及去溶剂化的溶剂化物(即，只通过除去溶剂化物中的溶剂而产生的形式)。

术语“溶剂化物”被用来描述这样的分子复合物，该分子复合物包含本发明的化合物和一种或多种药学上可接受的溶剂分子，例如乙醇。当所述溶剂是水时，所使用的术语是“水合物”。

术语“基本不含”在关于样品中某同质多晶形体的量时，指其它同质多晶形体以小于约15wt％的量存在。在另一实施方式中，“基本不含”指小于约10wt％。在另一实施方式中，“基本不含”指小于约5wt％。在又另一实施方式中，“基本不含”指小于约1wt％。普通技术人员将理解，短语“以小于约15wt％的量存在”是指感兴趣的同质多晶形体以大于约85wt％的量存在。同样地，短语“小于约10wt％”是指感兴趣的同质多晶形体以大于约90wt％的量存在，以此类推。

术语“治疗有效量”指下述量的将施用化合物，所述的量能预防、减轻或改善被治疗病症的一种或多种症状，或延长被治疗的受试者的存活。在关于癌症治疗的方面，治疗有效量指具有以下作用的量：

(1)降低肿瘤的大小；

(2)抑制(即，减缓至某种程度，或停止)肿瘤转移；

(3)抑制(即，减缓至某种程度，或停止)肿瘤生长；和/或

(4)将与癌相关的一种或多种症状减轻至某种程度(或使其消除)。

为得到具有更好物理性质的形式，可合成化合物I的不同盐的形式。该碱化合物可处于溶液中。溶液通常是溶剂。在一种实施方式中，溶液是醇。在另一实施方式中，溶剂可以是异丙醇、甲醇、乙腈或水加乙腈。溶液还可包含溶剂混合物。

可使用符合化学计量的添加/结晶技术，来对盐进行结晶。符合化学计量的量的相对离子(counterion)被引向溶液中的碱。在一种实施方式中，相对离子的量是对于碱来说1∶1的比例。在另一实施方式中，相对离子的量是相对碱来说过量0％至约60％摩尔。在另一实施方式中，相对离子的量是相对碱来说过量10％至约50％摩尔。在另一实施方式中，相对离子的量是相对碱来说过量约40％摩尔。相对离子可包括盐酸根、反丁烯二酸根、柠檬酸根、磷酸根和抗坏血酸根离子。在一实施方式中，相对离子是磷酸根离子。在另一实施方式中，相对离子是柠檬酸根离子。

可通过本领域技术人员已知的多种普通技术(包括冷却、蒸发、浸湿等)来使溶液中的盐结晶。可通过本领域技术人员已知的方法，从样品中除去过量的溶剂。在一种实施方式中，通过加入乙腈(ACN)和对溶液加以旋蒸，从溶液中除去溶剂。可在约40℃至约60℃对溶液进行旋蒸。在另一实施方式中，在旋蒸之前可向溶液中加入额外的溶剂(例如，异丙醇和甲基乙基酮)。为防止光诱导的异构化，结晶可在黑暗中进行。在一种实施方式中，通过过滤来移出晶体。在另一实施方式中，过滤可在环境实验室氛围下进行。

通过这些方法，结晶出化合物I的抗坏血酸盐、柠檬酸盐、反-丁烯二酸盐、氢氯化物和磷酸盐。下面提供了结晶方法的具体例子。可用HPLC分析来测量得到的样品的纯度。可通过本领域技术人员已知的测试，包括熔点测定、粉末X射线衍射和动态水气吸着重量测量法，来测量化合物的物理性质。下文描述了这些测试的参数。

本文描述了五种盐的形式(见表1)。化合物I的这些盐常常是吸湿的。例如，如表1中所示，在80％的湿度时，盐酸盐约含20％的水，反丁烯二酸盐约含9％的水，抗坏血酸盐约含6.5％的水。这些特征使得在药物配方中对盐的利用变得困难，并且会缩短配方的保质期。可是，有两种盐，磷酸盐和柠檬酸盐，被意外地发现具有低的吸水性——在80％的相对湿度时分别含有约1％的水和约3.8％的水。

基于这些盐的特征，1∶1的磷酸盐——化合物I磷酸盐被鉴定为是具有高度想要的特点的盐形式，所述特点包括：良好的结晶度、低吸水性、易于结晶、良好的纯度和水合物的缺少。在本文中被命名为形式I至X的化合物I磷酸盐的十种同质多晶形体也被描述了。柠檬酸盐也展示出想要的特点，诸如低吸水性和良好的结晶度。

本发明的化合物的同质多晶形体是人们想要的，因为化合物的特定同质多晶形体可能具有比相同化合物的其它同质多晶形体形式更好的物理性质和化学性质。例如，一种同质多晶形体具有在某些溶剂中的增加的溶解度。这种增加的溶解度可使得本发明的化合物的配制或施用更容易。不同的同质多晶形体也可能具有不同的机械性质(例如不同的可压缩性、可压实性和可成片剂性(tabletability))，它们可影响该药的成片剂性能，因此影响到该药品的配制。特定同质多晶形体还可能显示出不同于其它同质多晶形体的、在相同的溶剂中的溶解速度。不同的同质多晶形体还可能具有不同的物理(从亚稳性的同质多晶形体到更稳定的同质多晶形体的固态转变)和化学(反应性)稳定性。本发明的一种实施方式考虑化合物I磷酸盐的形式I同质多晶形体，如本文所述。

在本发明的一些实施方式中，考虑了纯的、单种同质多晶形体及包含两种或多种不同同质多晶形体的混合物。纯的、单种同质多晶形体可能基本不含其它同质多晶形体。

本发明的一些实施方式考虑了包含如本文所述的化合物I的一种或多种盐或这些盐的同质多晶形体，及药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。

同质多晶形体从化合物I磷酸盐的浓缩溶液产生。浓缩溶液可每mL溶液含有60mg至100mg范围内的化合物I磷酸盐。在一种实施方式中，约70mg的化合物I被溶解于1mL磷酸中。

可通过本领域技术人员已知的多种方法(包括例如缓慢蒸发、冷却过饱和溶液、从反溶剂(anti-solvent)中沉淀等等)，从溶剂中沉淀同质多晶形体的晶体。在一种实施方式中，通过把溶液加入反溶剂中来产生等同质多晶形体的晶体。反溶剂可是水加上乙腈(ANC)、乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、THF、乙酸乙酯、己烷、二氯甲烷(CH₂Cl₂)、异丙醇(IPA)、甲基乙基酮(MEK)和二恶烷。在一种实施方式中，可加入额外的溶剂(例如，甲醇)。在另一实施方式中，在移出晶体之前令样品静置一夜。在又另一实施方式中，在移出晶体之前令样品静置三天。可使用本领域技术人员已知的标准方法(包括PXRD动态水气吸着重量测量法、差示扫描量热法、热重量分析和光学显微术)，来表征晶体的特征。这些技术被描述于下文中。

适合于递送本发明的化合物的药物组合物以及制备它们的方法对本领域技术人员来说显而易见。此类组合物和制备它们的方法可在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，19th Edition(Mack Publishing Company，1995)中找到。

对药学上可接受的赋形剂的选择将在很大程度上取决于下述因素，例如，特定的施用模式、赋形剂对溶解度和稳定性的影响以及剂量形式的本质。赋形剂的例子包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、多种糖和多类淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

用于配制包含化合物I的、药学上可接受的组合物的载体与赋形剂是本领域已知的，其被公开于，例如，美国专利No.6,573,293中，该专利通过引用整体并入本文。用于此的施用方法在本领域中也是已知的，并也被描述于，例如，美国专利No.6,573,293中。类似的方法还可用于配制和施用由本发明的化合物I的盐或这些盐的同质多晶形体构成的药学上可接受的组合物。

适当的配方取决于所选择的施用途径。对于注射而言，本发明的化合物可被配制于水溶液中，优选地，生理上相容的缓冲液中，诸如Hanks′溶液、Ringer′s溶液或生理盐水缓冲液。对于经黏膜施用而言，适于透过障壁的渗透剂(penetrant)被用于配方中。这些渗透剂通常在本领域中已知。对于非肠道施用(举例来说，通过推注(bolus injection)或连续输注)而言，配方可以以单位剂量形式存在，例如在安瓿中或多剂量容器中。组合物可以采用下述形式，例如，在油性或水性介载体中的悬浮液、溶液或乳液，其可含有配方材料，例如悬浮剂、稳定剂或分散剂。

本发明的化合物可直接施用至血流中、肌肉中或内部器官中。用于非肠道施用的适当方式包括：静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内、滑膜腔内及皮下。用于非肠道施用的适当装置包括：针头(包括微型针头)注射器、无针注射器及输注技术。非肠道配方典型地是水溶液，它可含有赋形剂，例如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选地，调节到从3至9的pH值)，但是对一些应用来说，它们可能更适合被配制成灭菌非水溶液或经干燥的形式配方，用于与适当的介载体(例如灭菌、无热原(pyrogen)的水)一起使用。此外，可在亲脂性介载体中制备本发明的化合物的悬浮液。合适的亲脂性载体包括脂肪油(例如芝麻油)、合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯和甘油三酸酯)或诸如脂质体的材料。

本发明的化合物可口服。口服可包括吞咽(化合物藉此进入胃肠道)及/或经颊、经舌或舌下施用(化合物从而直接从口进入血流)。对于口服而言，可通过将本发明的化合物与本领域中公知的药学上可接受的载体组合起来，来配制化合物。适于口服的配方包括固体、半固体和液体***，例如片剂；含有多颗粒或纳米颗粒、液体或粉末的软或硬胶囊；锭剂(包括液体填充的)；咀嚼片；凝胶；快速分散剂量形式；膜；珠剂(ovules)；喷雾；及颊/黏膜贴片。

本发明的化合物还可向皮肤或黏膜局部施用、皮肤(皮内)施用或经皮施用。用于该用途的典型配方包括凝胶、水凝胶、洗剂、溶液、乳剂、膏剂、隔离剂(dusting poweder)、敷料、泡沫、膜、皮肤贴片、包药干糊片(wafers)、植入剂、海绵、纤维、绷带和微乳液。也可使用脂质体。典型的载体包括醇、水、矿物油、液态石蜡、白石蜡脂、甘油、聚乙二醇和丙二醇。透皮促进剂可包括进来，见，例如J Pharm Sci，88(10)，955-958，by Finnin and Morgan(October1999)。其它局部施用方式包括通过电穿孔、电泳、超声波透入(phonophoresis)、超声波导入(sonophoresis)和微型针头或无针(例如，Powderject^TM、Bioject^TM等等)注射的递送。

本发明的化合物可被配制为用于直肠施用，例如使用传统栓剂基质(例如可可脂或其它甘油酯)的栓剂或闭尿灌肠剂。

本发明的化合物还可以非溶剂化的和溶剂化的形式存在。

本发明的实施方式还包括下述方法，所述方法用于对PK催化活性进行调节，所述方法包括：使所述PK与本发明的化合物I的一种或多种盐或这些盐的同质多晶形体接触。这种“接触”可“在体外”实现，即，在试管，培养皿等中实现。在试管中，接触可仅涉及仅化合物和感兴趣的PK，或可涉及整个细胞。还可在细胞培养皿中保持细胞或使细胞生长，及在那种环境下使细胞与化合物接触。在上下文中，下文定义的、特定化合物影响PK相关病症的能力，即，该化合物的IC₅₀，可在该化合物被尝试以体内方式用于复杂的活生物体之前即被测量。对于生物体外的细胞而言，为获得与化合物接触的PK，存在多种方法，这些方法是本领域技术人员公知的，其包括但不限于，直接细胞显微注射和多种跨膜载体技术。

本发明的实施方式包括下述方法，该方法用于治疗和预防生物体中(例如，伴侣动物或人)的蛋白激酶相关病症，所述方法包括施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含本发明的化合物I的一种或多种盐或这些盐的同质多晶形体，及对该生物体而言药学上可接受的载体或赋形剂。

在本发明的一种实施方式中，蛋白激酶相关病症选自由受体酪氨酸激酶相关病症、非受体酪氨酸激酶相关病症和丝氨酸-苏氨酸激酶相关病症构成的组。在本发明的另一实施方式中，蛋白激酶相关病症选自由EGFR相关病症、PDGFR相关病症、IGFR相关病症和FLK相关病症构成的组。

其催化活性受本发明的化合物调节的受体蛋白激酶选自由EGF、HER2、HER3、HER4、IR、IGF-1R、IRR、PDGFRα、PDGFRβ、CSFIR、C-kit、C-fms、Flk-1R、Flk4、KDR/Flk-1、Flt-1、FGFR-1R、FGFR-2R、FGFR-3R和FGFR-4R构成的组择。其催化活性受本发明的一化合物调节的细胞酪氨酸激酶选自由Src、Frk、Btk、Csk、Abl、ZAP70、Fes/Fps、Fak、Jak、Ack、Yes、Fyn、Lyn、Lck、Blk、Hck、Fgr和Yrk构成的组。其催化活性受本发明的化合物调节的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶选自由CDK2和Raf构成的组。

在本发明的又另一实施方式中，蛋白激酶相关病症选自由鳞状上皮细胞瘤、星状细胞瘤、Kaposi氏肉瘤、成胶质细胞瘤、肺癌、膀胱癌、头颈癌、黑色素瘤、卵巢癌、***癌、乳腺癌、小细胞肺癌、神经胶质瘤、结直肠癌、泌尿道癌、胃肠癌、肥大细胞增多症和肥大细胞瘤构成的组。在本发明的一种实施方式中，蛋白激酶相关病症选自由糖尿病、自身免疫性病症、过度增殖病症、再狭窄、纤维化、牛皮癣、von Heppel-Lindau病、骨关节炎、风湿性关节炎、血管形成、炎性病症、免疫病症和心血管病症构成的组。

适用于本发明的药物组合物包括这样的组合物，其中含有以足以达到想要的目的的量存在的活性成分，该想要的目的例如，对PK活性的调节或对PK相关病症的治疗或预防。

对治疗有效量的确定对本领域技术人员而言是已知的，尤其是在有本文提供的详细的公开内容的情况下。对本发明的方法中使用的任何化合物而言，起初可从细胞培养检测来估计治疗有效量或剂量。因而，该剂量可被配制以用于动物模型中，从而获得包括细胞培养中测量的IC₅₀在内的循环浓度范围。这些信息然后可用于在人或伴侣动物中更准确地确定使用剂量。

实践中，施用的该化合物的量是每kg体重约0.001mg至约100mg，此类总剂量可一次给完或以分开的剂量给完。所施用的组合物的量当然将取决于接受治疗的受试者、病痛严重性、施用的方式、开药方的医生或兽医的判断等等。在局部施用或选择性摄取的情形中，药品的有效局部浓度可能与血浆浓度无关，可使用本领域中已知的其它流程来判断正确的剂量的量和时间间隔。

本发明的实施方式还包括治疗伴侣动物的癌症的方法，该方法包括：施用包含本发明的化合物I的一种或多种盐，或这些盐的同质多晶形体，及药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。

此外，本发明考虑到：化合物I的盐或这些盐的同质多晶形体(如本文所描述的)可能会通过生物体(例如伴侣动物或人)体内的酶被代谢，以产生能调节蛋白激酶活性的代谢物。这些代谢物也在本发明的范围之内。

本发明的化合物可单独施用或与本发明的一种或多种其它化合物组合施用，或与一种或多种其它药品(或它们的任何的组合)组合施用。还考虑到，如本文所描述的化合物I的盐或这些盐的同质多晶形体可与用于治疗上文讨论的疾病和病症的其它化学治疗剂组合。例如，本发明的化合物可与氟尿嘧啶单独组合，或与菊白叶酸或其它烷化剂进一步组合。本发明的化合物可与其它抗代谢物化学治疗剂(例如但不限于，叶酸类似物或嘌呤类似物)组合使用。化合物也还可与基于天然产物的化学治疗剂、抗生素化学治疗剂、酶化学治疗剂、铂配位复合物和激素及激素拮抗剂组合使用。还考虑到，本发明的化合物可与治疗实质癌或白血病的米托蒽醌(mitoxantrone)或太平洋紫杉醇(paclitaxel)组合使用。

在没有进一步阐述的情况下，应当相信，本领域技术人员能使用前面的描述来将本发明实施至其最大范围。下面详细的实施方式描述了如何制备本发明的多种化合物和/或如何开展本发明的多种方法，它们只应被解释为示例性的，而不以任何方式对前述公开内容造成限制。本领域技术人员将迅速知道关于反应物以及关于反应条件和技术的流程中的适当变化。

实施例

实施例1.合成化合物I，即，5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]- 2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)-酰胺

如在美国专利6,574,293(实施例129)中所描述的，缩合5-氟-1，3-二氢-吲哚-2-酮与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)-酰胺，得到化合物I。

扩大规模的流程：5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(61g)、5-氟-1，3-二氢-吲哚-2-酮(79g)、乙醇(300mL)和吡咯烷(32mL)被回流4.5小时。向混合物中加入乙酸(24mL)，回流持续30分钟。该混合物被冷却至室温，通过真空过滤收集固体，固体用乙醇洗涤两次。在含有12N盐酸(6.5mL)的40％丙酮水溶液中(400mL)对固体进行130分钟搅拌。通过真空过滤收集固体，并用40％丙酮水溶液洗涤两次。在真空下干燥固体，得到橙色固体5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(86g，79％的产率)。

5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(100g)和二甲基甲酰胺(500mL)被搅拌，加入苯并***-1-基氧三(二甲基胺基)膦六氟磷酸盐(221g)、1-(2-胺乙基)吡咯烷(45.6g)和三乙胺(93mL)。在环境温度下对混合物进行2小时的搅拌。通过真空过滤收集固体产物，并用乙醇洗涤。通过在64℃下于乙醇中(500mL)搅拌一小时来对固体进行浆体-洗涤，将其冷却至室温。通过真空过滤收集固体，用乙醇洗涤，并在真空下干燥得到5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-吡咯烷-1-基乙基)-酰胺(101.5g，77％产率)。

实施例2.合成化合物I的盐

实施例2A.化合物I磷酸盐

将2.67毫摩尔化合物I与40mL0.092M磷酸(相对假定1∶1的盐来说过量约40％摩尔)和40mL异丙醇加入烧瓶中。然后，以30mL的等份试样向该水溶液中持续加入乙腈，60℃对该溶液进行旋蒸，以除去水。总共使用了120mL乙腈来除去该溶液中的水。对晶体进行过滤，并且进行空气干燥。晶体是自由流动的，呈现为橙色；收集到1.09g，获得83％的产率。

实施例2B.化合物I柠檬酸盐

将2.64毫摩尔化合物I与34mL0.1M柠檬酸(3.4毫摩尔)和35mL甲醇加入烧瓶中。50℃下对该溶液进行旋蒸。减少该溶液的体积，产生了结晶度不良的晶体，所以加入20mL异丙醇和10mL甲基乙基酮来溶解该固体。在60℃下对该混合物进行旋蒸，产生橙色晶体。过滤晶体并进行空气干燥。该方法的产率约是60％，可通过进一步在过滤之前减少溶剂体积来改进该方法。

实施例3.化合物I的盐的物理性质

方法：用于测量化合物I的盐的物理性质的测试包括熔点测定、HPLC纯度、粉末X射线衍射和动态水气吸着重量测量法。

粉末X射线衍射(PXRD)：使用Scintag X2Advanced DiffractionSystem(lab259-1088，由Scintag DMS/NT1.30a和Microsoft Windows NT4.0软件控制)来进行粉末XRD。该***使用铜X射线源(45kV和40mA)来提供

的CuKαl的发射，还使用固态Peltier冷却检波器。使用管发散和2mm及4mm的抗散射开缝及检波器抗散射与0.5mm与0.2mm宽度的接收缝来控制射束孔径。使用0.03°/步的步扫描与每步1秒的计数时间，从2°至35°的2θ角度收集数据。该实验使用Scintag圆的、顶端装料的不锈钢样品支架(具有9mm直径的***物)。粉末被装进该支架，通常通过载玻片对其轻轻地挤压，以确保样品表面和支架表面之间的共面性。

动态水气吸着重量测量法(DMSG)：在温控的大气微量天平上收集DMSG等温线。在该天平的样品盘上放入约10mg样品。湿度以3％RH的步长从室内相对湿度(RH)顺序变化至0％RH，增加至90％RH，接着RH再减少至0％。然后每两分钟对该质量进行测量。当样品质量的改变在10分钟内小于0.5μg时，将该RH转换至下一个目标值。使用Visual Basic程序dmsgscn2.exe控制数据收集，将信息输出至Excel电子表格。

结果：表1展示了对化合物I的抗坏血酸盐、柠檬酸盐、反丁烯二酸盐和磷酸盐的数据总结。HPLC分析显示，这些盐具有相对高的纯度，并且，盐的形成过程未引起纯度的显著变化。

表1.对针对化合物I合成的盐的总结

*HPLC峰下的面积百分比

盐酸盐、反丁烯二酸盐和抗坏血酸盐是非常吸湿的(见图1)。其它两种盐(柠檬酸盐和磷酸盐)具有较低的水气吸着情况，在70％相对湿度时仅吸收小于3％的水。

粉末X射线图表明，磷酸盐和柠檬酸盐具有相对高的结晶度(见表2和表3；及图2)。

表2.化合物I磷酸盐的PXRD峰

*：±0.1°

**：通过将其强度相对其在27.0°角的最强峰的强度(作为100)归一化，来确定每个峰的相对强度。

表3.化合物I柠檬酸盐的PXRD峰

*：±0.1°

**：通过将其强度相对其在25.5°角的最强峰的强度(作为100)归一化，来确定每个峰的相对强度。

实施例4.对化合物I磷酸盐的制备和分析

实施例4A.对化合物I磷酸盐的制备

用化合物I游离碱来制备磷酸盐。按上文所述，制备化合物I磷酸盐的样品(批号35282-CS-51)。将4mL的0.977M磷酸加入至烧瓶中的1.059g游离碱中，接着马上加入4mL乙腈。得到悬浮液。在热的平板上轻微加热该悬浮液。加入40mL水以及在搅拌约一小时的同时进行加热并未使固体完全溶解。过滤该固体并用10mL乙腈洗涤。PXRD显示这是化合物I的磷酸盐。

实施例4B.对化合物I磷酸盐的分析

批号35282-CS-51被命名为化合物I磷酸盐的同质多晶形体形式I。它具有高的结晶度、良好的流动性和大的晶体尺寸。在化合物I游离碱(游离碱同质多晶形体形式A，256℃；游离碱同质多晶形体形式B，259℃)的熔融温度下不发生熔融，并且固体的高熔点(281℃-297℃)的存在显示：批号35282-CS-51的晶体是不同的盐形式，其并非游离碱化合物I。通过HPLC测试，该批的纯度是99.6％。

实施例4C.对化合物I磷酸盐溶解度的估算

将化合物I磷酸盐(批号35282-CS-51)的样品1mg-2mg转移至10mL的玻璃小瓶(已经扣皮重(tared))并称重(准确至0.1mg)。以逐步方式向小瓶中加入溶剂(每一小瓶加入一种溶剂)，每步加入0.5mL溶剂。使用的溶剂是缓冲液(pH＝2)、缓冲液(pH＝5)、水、甲醇、四氢呋喃(THF)、乙腈和丙酮。每次加入后，盖上小瓶，并进行摇动。固体的溶解可视觉观察到。如果没有观察到明显的溶解，立即加入更多的溶剂。如果溶解很明显，在溶剂的下一次加入之前，将该小瓶在台上放置至少30分钟。这个步骤重复进行，直到对着黑色背景和白色背景都没有晶体可见为止。然后，溶解度等于化合物的重量除以最终体积和最后一次加入前的体积。如果在加入10mL溶剂后固体仍然存在，那么该溶解度被表示为：小于该重量除以最终体积的商。如果在第一次加入溶剂后该固体就完全溶解，那么溶解度被表示为大于该重量除以溶剂体积的商。所有实验都在室温下进行。

估算的化合物I磷酸盐的溶解度连同游离碱的溶解度被展示于表4中，以mg/mL表示。除了在水中(在不同的pH水平下)，在相同溶剂中化合物I磷酸盐的溶解度低于化合物I游离碱的溶解度。化合物I磷酸盐的溶解度取决于溶液的pH值，其在pH是2或更低时变得相当高(3mg/mL)。化合物I磷酸盐(批号35282-CS-51)的熔点约是281-297℃，它大大高于化合物I游离碱的熔点(游离碱同质多晶形体形式A，256℃；游离碱同质多晶形体形式B，260℃)。一个重要的结果是化合物I磷酸盐与水的可湿性比化合物I游离碱的更好。

表4.23℃时不同溶剂中的化合物I游离碱和化合物I磷酸盐的估算的溶解度

^apH＝2的缓冲液由HCl和KCl构成

^bpH＝5的缓冲液由邻苯二甲酸钾和氢氧化钠构成

^c无法获得，但预计<0.005mg/mL

^d1g化合物I磷酸盐相当于0.802g化合物I游离碱

^e最终溶液的pH值是4.91。

实施例5.化合物I磷酸盐同质多晶形体的产生

在实施方式4C中可见的化合物I磷酸盐的低溶解度表明，经高浓缩的化合物I磷酸盐溶液(60-100mg/mL，深橙红色)将有助于从不同的溶剂中沉淀化合物I磷酸盐的同质多晶形体。通过在约1M磷酸中溶解游离碱的化合物I来制备这样的经浓缩溶液。例如，约70mg游离碱的化合物I能溶解于1mL的1M磷酸中。可是，使用的游离碱的化合物I和磷酸的量取决于想要的溶液浓度和溶液的批次大小。在其中在沉淀之后立即真空过滤该沉淀物的实施例中，将约1mL的想要的溶液然后滴入十种约10mL的反溶剂中，来沉淀出盐的晶体。这些溶剂是水加上乙腈(ACN)、乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、THF、乙酸乙酯、二氯甲烷(CH₂Cl₂)和异丙醇(IPA)。在其中在静置整夜或三天后真空过滤沉淀物的实施例中，使用甲基乙基酮(MEK)和二恶烷的额外溶剂。一些有机溶剂(例如，乙酸乙酯、己烷、CH₂Cl₂)不易与水混合，并且能观察到两层溶剂。甚至在加入后数几分钟内，都仅在界面可见少量的沉淀物。在这样的情况下，加入约1mL甲醇作为桥连溶剂，来增加在两层之间的可混溶性。甲醇看起来能很好地增加可混溶性，因为只要加入甲醇，无色的有机层就开始变黄。然后用手用力振荡该小瓶约一分钟。在沉淀(20分钟之内)之后立即对从有机溶剂中沉淀的固体进行真空过滤，以及为分离亚稳定和稳定的同质多晶形体，在静置整夜或三天之后对从有机溶剂中沉淀的固体进行真空过滤。然后分析该粉末。对不同的固体按发现的顺序加以编号。

实施例6.对化合物I磷酸盐同质多晶形体的分析

实施例6A.分析方法

如上面的实施例3中所描述的，通过PXRD来分析所有由上述同质多晶形体筛选步骤得到的粉末。当观察到新的PXRD图时，使用补充技术来表征固体，包括动态水气吸着重量测量法(也在实施例3中描述)、差示扫描量热法、热重量分析(当必要时)和光学显微术。

差示扫描量热法(DSC)：使用一DSC量热器(TA Instruments2920)得到DSC数据。在铝DSC盘内装入粉末(1-5mg)。将铝盖放在盘顶，并使其卷曲。该被卷曲的盘被连同作为参考的空盘一起被放在样品管内。除非另外指明，温度以10℃/min的速度从30℃增加至300℃或350℃。

热重量分析(TGA)：使用高分辨率分析仪(TA Instruments2950型)进行TGA实验。用TA Instruments Thermal Solutions^TM for NT(版本1.3L)进行数据收集，用Universal Analysis^TM for NT(版本2.4F)进行数据分析。将样品(5-10mg)放在铝盘上，在被加热之前，其还被放在铂称重盘上。在负载该样品之前，扣除铝盘和铂盘的皮重。温度以10℃/min的速度从30℃线性增加至300℃。使用干燥氮气冲洗。

偏光显微术：在Olympus BHSP偏光显微镜上进行显微术。粉末被悬浮在聚硅氧油中，将其分散于显微镜载玻片和盖玻片之间。在观察之前，轻轻地对着该载玻片摩擦该盖玻片，而使颗粒良好分散。

实施例6B.沉淀之后立即进行的分析

结果概括于表5中。酸性溶液一旦与反溶剂，沉淀就会发生。首先，沉淀物是松的絮凝物。通常颜色是黄色或淡橙色。得到的固体是黏性的。对这些固体的显微观察表明，它们由在偏光下具有良好双折射率的非常小的晶体构成。在由九种溶剂体系得到的固体上，至少观察到六种不同的PXRD图(见图3)。该分子上的酰胺侧链是可弯曲的，其在游离碱的形式B和其盐酸盐形式中采用不同构象。因此，该分子在不同的固体形式中可能是构象上的同质多晶形体。从乙酸乙酯、己烷和IPA中沉淀的固体的PXRD图看起来是相同的。但是，因为来自这三种溶剂的固体具有低衍射信号，难于将其与其它PXRD图进行详细比较。因此，它们并未被指定为新的形式。来自甲醇的沉淀物与参考批号35282-CS-51(被指定为形式I)相同。所有沉淀物的TGA数据表明剩余溶剂在1.7％-4.7％的水平。这些固体中，来自CH₂Cl₂的那种看起来是在晶体中具有保留的溶剂的固体。TGA曲线表明，在约125℃的温度下，样品重量急剧减少(见图4)。DSC在约相同温度下，将该结果记录为吸热。此外，该粉末由具明确形态的晶体构成并能自由流动，这是相对其它批的沉淀物而言非常不同的性质。该粉末通过PXRD显示出中等结晶度，但是通过偏光显微镜观察到其显示出良好的结晶度。其它批由非常细的晶体构成。在这些粉末的DSC曲线上，一旦该样品被装载进试样管，立即可见宽的和浅的吸热。这种观察被TGA反映为从TGA加热开始的逐步重量损失。因此，关于这些批而言，剩余溶剂可能是被表面吸附的溶剂，而不是在晶格中的溶剂。

(空白页)

表5对从沉淀后立即分离的固体的物理分析

^a至160℃的重量损失。^b为清楚的目的而言，表中列出的温度仅是峰温度。^c来自DSC运行的起始温度的宽吸热事件的峰温度。这些事件也被TGA上的逐步重量损失所反映。这种类型的热事件是表面吸附的溶剂损失的特征。^dDSC上相对尖锐的吸热事件的峰温度。该事件也被TGA作为相应峰温度处突然的重量损失记录下来。这种类型的热事件是溶剂化物的去溶剂化的特征。^e聚集物由非常细的颗粒组成。^fND表示不能指定为明确的形式，因为相应PXRD图的衍射峰信号过低，难于与其它形式的PXRD图进行详细比较。^g形式VI，是含溶剂的固体。

实施例6C.在溶剂中静置三天后的沉淀物

这些结果被概括于表7中。在溶剂中静置多达三天之后，出现新的非绒毛状的橙红色固相。除了从甲醇得到的沉淀物之外，从所有有机溶剂中得到的绒毛状沉淀物经历转化。明显地，在沉淀之后立即沉淀的固体在这些情况下是亚稳定的，因为随着时间的流逝它们转化为更稳定的固体形式(形式I)。在大多数溶剂***中该转化看起来在数小时内完成。但是，为了保证该过程的完成，令它们静置更长的时间段，以避免获得两种固体形式的混合物。TGA曲线显示，分别从乙烷和乙腈中得到的固体，在约124℃和153℃处出现突然的重量损失，这与在DSC上类似的温度处的吸热相关。因此，它们看起来也在晶格中含有受限的溶剂。残留溶剂的化学计量就乙腈而言是约0.6，就己烷而言是约0.14。在静置三天后从乙腈中生长出针状晶体。残留有乙腈的固体的PXRD图是独特的，而己烷溶剂化物的PXRD图类似于由较早确定的残留有CH₂Cl₂的固体(图3)。两种残留有溶剂(己烷和乙腈)的固体都在TGA盘上发生重量损失。在相应的残留溶剂通过加热被除去(表7，图3)后，观察到两种固体的独特的PXRD图，这表明，从固体中除去溶剂分子引起溶剂化物晶体的结构变化(因此，晶格中的溶剂分子不仅仅只在晶体表面)。但是，乙腈去溶剂化物的PXRD图信号强度低。当与该乙腈溶剂化物的DSC情形相比较时，乙腈去溶剂化物的DSC情形显示出在了74℃和174℃处的两处额外的热事件，而在153℃的去溶剂化事件却不存在。在去溶剂化之后的样品冷却可能已改变了在174℃经历能量变化的固体。

当使用其它有机溶剂时，沉淀物的较长的静置周期产生具有和形式I(批号35282-CS-51)相同的PXRD图的固体，尽管所述晶体的形态是不同的(表6)。相同的PXRD图表明这些固体具有相同的晶格结构。不同的形态则应当是由于溶剂的影响。很明显在这里报导的所有非溶剂化同质多晶形体中，形式I是最稳定的固相。其它不含溶剂的固体形式是亚稳的，当与溶剂接触时其迅速转变为形式I。从CH₂Cl₂得到的固体看起来比从己烷得到的更容易流动。TGA、形态学和流动性表示它们是两种不同的固体。

表6对从沉淀后静置不同时间后分离的固体的物理分析

^a至160℃的重量损失。^b为清楚的目的而言，表中列出的温度仅是峰温度。^cDSC上相对尖锐的热事件的峰温度。该事件也被TGA作为对应的峰温度上突然的重量损失所记录。^d转变在5小时内完成(从黄色至橙红色)。^e转变在5小时内不明显，但在3天内基本完成(黄色松散沉淀至橙红色良好形成的针型晶体)。^f转变在5小时内完成。颜色变化不明显(从黄色至淡橙色)。^g形式VII和VIII是含溶剂的固体。

表7.对去溶剂化后产生的固体的物理分析

实施例7.对犬肥大细胞瘤中KIT磷酸化的抑制作用

目的：针对癌的靶治疗发展提供了直接评价药品对于分子靶的效应的机会，及找出这些效应与肿瘤生物学和药品的药代动力学之间的关联的机会。这可能有助于肿瘤药品发展，因为其建立了药效学/药代动力学关系，并且提供了关于靶剂的治疗作用的关键信息。本研究的目的是评价犬肥大细胞瘤中受体酪氨酸激酶抑制剂化合物I磷酸盐的单剂量对其分子靶KIT活性的的影响，在具晚期(advanced)MCT的犬患者中使用KIT磷酸化作为直接靶抑制作用的标记。还研究了ERK1/2(KIT信号下游的有丝***原活化蛋白激酶(MAPK))的磷酸化、化合物I磷酸盐血浆浓度及c-kit的突变情况，以测量在化合物I磷酸盐治疗后，这些参数与KIT磷酸化情况是如何相关的。

研究药品：利用以20-mg药片形式的化合物I磷酸盐。

研究设计：本研究是在具有复发或转移级的II/III MCT的狗中进行对靶调节的验证。患者接受3.25mg/kg的化合物I磷酸盐单一口服剂量。使用6-mm的穿刺活检设备，在施用化合物I磷酸盐之前和治疗后8小时从肿瘤中得到样品。如果可能的话，获取多份活检样品。每一份样品在分析前于液氮中冷冻并在-70℃存储。用来对化合物I磷酸盐进行血浆水平分析的血液样品在得到肿瘤活检样品的同时得到(见下面)。

化合物I磷酸盐的血浆水平：血液样品从颈静脉抽取，并放在红盖血清收集真空玻璃管中。样品放置于室温下，允许凝结，在4℃以1500rmp离心10分钟，转移至冷冻管，血浆被冷冻于-70℃以备后续分析。简言之，将血浆样品(20μl)或犬血浆中的化合物I磷酸盐标准物与含有DL-盐酸普荼洛尔(内标)的甲醇(200μl)混合于96-孔聚丙烯板(OrochemTechnology，Wesrmont，IL)上。通过旋转震荡对该板混合1分钟，以4000rmp对这些样品离心10分钟。取10微升上清液，注射到LC/MS/MS***上，其中，在BataBasic C-18(5μm，100×4.6mm)反相高效液相色谱柱(Keystone Scientific，Foster City，CA)上进行分离。对每一份犬血浆样品中的内标和化合物I磷酸盐的量的定量基于使用从0.2ng/ml至500ng/ml的已知化合物的量产生的标准曲线来进行。

c-kit调节分析：对于大多数样品而言，根据制造商的说明书使用TRIzol(Invitrogen，Carlsbad，CA)来提取RNA。然后使用dNTP、随机引物、5X第一链缓冲液、0.1M DTT及Superscript Taq聚合酶(全部来自Promega，Madison，WI)，从该RNA产生cDNA。测定每一份样品的cDNA的量。对于剩余的样品，如前文所述来制备基因组DNA(Downing，S.，Chien，M.B.，Kass，P.H.，Moore，P.F.，and London，C.A.Prevalence andimportance of internal tandem duplications in exons11and12of c-kit in mastcell tumors ofdogs.Am.J.Vet.Res.，63∶1718-1723，2002；其通过引用整体并入本文)。对于两种反应而言，PCR运行40个循环，每个循环由94℃(1分钟)、59℃(1分钟)和72℃(1分钟)构成，在该反应末尾有5分钟72℃的延伸。从犬C2肥大细胞系中产生的c-kit cDNA和从正常犬小脑中产生的cDNA用作为对照。

通过在4％琼脂糖凝胶上进行的电泳来分离PCR产物；对于从cDNA进行的PCR而言，预计的野生型c-kit PCR产物的大小是196bp，对于从基因组DNA进行的PCR而言，大小是190bp。对于其中ITD不明显的情况而言(只出现单条条带)，用Promega PCR Wizard Clean-up试剂盒(Promega)对PCR产物进行凝胶纯化，在University of California-Davis的核心测序设备上，使用P1(正向)和P5或P2(反向)引物进行测序，以排除非常小的ITD的存在、缺失或点突变。使用DNASIS序列分析程序，来进行序列比对和比较。

对KIT和ERK磷酸化的分析：在液氮中冷冻肿瘤活组织，并接着使用经液氮冷却的研钵(cryomortar)和杵研成粉末，然后在-70℃下保存直至使用。为对KIT进行分析，经研磨的肿瘤被均质、裂解，并使用与琼脂糖缀合的针对KIT的抗体(SC-1493AC；Santa Cruz Biotechnology，SantaCruz，CA)，从1mg的起始肿瘤裂解物来进行免疫沉淀，这按照前文所述来进行(Abrams，T.J.，Lee，L. B.，Murray，L. J.，Pryer，N.K.，Cherrington，J.M.SU11248inhibits KIT and platelet-derived growth factor receptor beta inpreclinical models of human small cell lung cancer.Mol.Cancer Ther.2∶471-478，2003；其通过引用整体并入本文)。当可获得多份活检样品时，在不同活检样品上进行重复免疫沉淀反应/Western杂交印迹分析。通过Western杂交印迹来测定每一份样品中经磷酸化的KIT的量，其中，使用针对鼠KIT磷酸化酪氨酸719的抗体(3391；Cell Signaling Technology，Beverly，MA)，该抗体对应于犬KIT酪氨酸721，其是自身磷酸化位点，并因此作为KIT激酶活性的代替。为对总KIT进行分析，将印迹条带切出，重新封闭，用针对KIT的抗体(A-4542；DAKO Corp.，Carpinteria，CA)再次进行杂交。为对p42/44ERK进行分析，用针对磷-Thr202/Tyr204ERK1/2的抗体(9101B；Cell Signaling Technology)，通过Western杂交印迹来探查与用于KIT分析相同的肿瘤裂解产物，然后切出条带，用针对总ERK的抗体(9102；Cell Signaling Technology)再次进行杂交。针对KIT和ERK1/2的可评估的肿瘤活检样品对儿被认为：其中，可探测到的总蛋白质出现于该对的两份活检样品中。通过三个观察者的肉眼对靶调节加以评分，而不考虑JM情况和血浆浓度。治疗后与治疗前的活检样品相比，在活检样品中磷化-蛋白质信号相对于全部蛋白质信号降低≥50％被评价为阳性(关于靶调节)，而<50％的降低被评价为阴性。

结果：十四只狗参加该临床研究，该研究的主要的目的是确定在口服施用单一剂量的化合物I磷酸盐后，是否发生KIT酪氨酸磷酸化的降低。使用直接针对KIT中的自身磷酸化位点的磷-特异抗体，来评估KIT酪氨酸的磷酸化，这作为KIT激酶活性的代替。此外，从基线肿瘤活检样品来测定c-kit JM突变情况(ITD+或ITD-)，并且在给予剂量后8小时，测量化合物I磷酸盐的血浆浓度，以将这些参数与对KIT磷酸化的抑制作用相关联起来。14只狗中的11只可供KIT靶调节评估。被认为不可评估的三只狗在一份或两份活检样品中，具有不可探测的或大幅降低的总KIT蛋白质，因此不能用于针对靶调节的评分。所有参与研究的狗的数据概括于表8中。

表8.所有参与的患者的概括数据

^aNE、无法评估、P-KIT、磷-Tyr721KIT、P-ERK1/2、磷-Thr202/Tyr204ERK1/2。

经分析的14只狗中，通过PCR分析(图5，道1-5)发现5只(36％)具有ITD全部五例肿瘤都具有ITD证据。有趣的是，患者2明显失去了野生型c-kit等位基因。来自剩余的九只狗的PCR产物不具有ITD证据(图5，道6-14)，PCR产物被直接测序，其没有显示任何种类的突变(***、缺失或点突变)。关于道3、6、8和9，用基因组DNA进行PCR反应，得到略小(190bp)的野生型产物。

在MCT中表达为基线的总KIT及经磷酸化KIT的水平在各动物间有所变化。较高的KIT表达与较高的肿瘤级别相关联。六例II级肿瘤中的一例具有高KIT表达，八例III级肿瘤中的四例具有高KIT表达(图6)。例如，在患者2(III级)肿瘤中的总KIT表达明显高于患者11(II级)肿瘤中的总KIT表达。具III级肿瘤的狗也具有比那些具II级肿瘤的狗更高的基线高水平经磷酸化KIT的发生率，这与晚期肿瘤中增加的c-kit突变频率以及由此升高的配体独立性经磷酸化KIT水平相符。可评估的七只具III级肿瘤的狗中的五只具有高水平的基线经磷酸化KIT；对于c-kit中ITD的存在而言，这些中的四只是阳性。只有1例II级肿瘤具有显著的经磷酸化KIT；该动物还表达了ITD突变的c-kit。

当与治疗前的样品相比，在化合物I磷酸盐治疗后，使用经磷酸化KIT的≥50％的降低(相对活检样品中总KIT而言)作为评估标准，可评估的十一只狗中的八只在靶调节的方面被评估为阳性。用化合物I磷酸盐治疗之前和之后，从肿瘤或检样品的免疫沉淀中采集的经磷酸化KIT和全部KIT的例子显示于图6中。五例肿瘤(图6，左)针对靶调节被评估为阳性，而两例肿瘤(图6，右)被评估为阴性。在化合物I磷酸盐治疗后，针对对KIT磷酸化的抑制被评估为阴性的活检样品对儿全部都具有比那些被评估为阳性的活检样品对儿显著更少的基线经磷酸化KIT(图6)。

为评估化合物I磷酸盐抑制对KIT磷酸化控制的下游信号途径的影响，通过对用于KIT分析的相同检样品对儿进行Western杂交印迹分析，来评估该经磷酸化MAPK ERK1/2的水平。十四例肿瘤中的十一例对于磷-ERK1/2靶调节来说是可评估的(这些中的两例就KIT靶调节而言也是无法评估的)。在可评估的十一例中，与基线肿瘤样品相比，在化合物I磷酸盐施用之后，7例显示出了磷-ERK1/2与肿瘤样品中全部ERK1/2的比率的减低(见图6)。与具有低ERK的那些相比，在具有相对高的基线ERK表达和磷酸化的MCT中更经常检测到ERK靶调节。

基于在啮齿类模型中进行的临床前工作，用于靶抑制的化合物I治疗范围被认为是在24小时给药周期的12小时中为50-100ng/mL。在一3.25mg/kg的单剂量之后，化合物I磷酸盐的血浆浓度在8小时(大约是Cmax)的范围为从33.2至186ng/mL，平均值为105±9ng/mL的(表8)。在一只动物中，化合物I磷酸盐的血浆浓度在其它样品的范围之外(0.3ng/mL)。十四只狗中的十二只具有的血浆水平被认为处于由对化合物I期临床研究建立的治疗范围内(London，C.A.，Hannah，A.L.，Zadovoskaya，R.，Chien M.B.，Kollias-Baker，C.，Rosenberg，M.，Downing，S.，Post，G.，Boucher，J.，Shenoy，N.，Mendel，D.B.，and Cherrington，J.M.Phase Idose-escalating study of SU11654，a sma11molecule receptor tyrosine kinaseinhibitor，in dogs with spontaneous malignancies.Clin.Cancer Res.，2755-2768，2003)。具KIT靶调节证据的狗的平均血浆浓度(79.2±41ng/ml)和那些没有被评估为KIT靶调节的狗的平均血浆浓度(137±36ng/ml)是相当不同的(P＝0.08)。

讨论：本相关性研究被设计来调查可相比较的种群中的靶调节，这通过研究化合物I磷酸盐的单一临床有效剂量对犬MCT中KIT磷酸化的影响，以及随后对经由MAPK的信号转导的影响来实现。在该研究中获得的化合物I磷酸盐的血浆浓度是在接近预计Cmax(基于临床前药物动力学研究)处测量的，其与调查化合物I的有效剂量和疗法的I期临床研究中测量的药品水平一致(表8)。

MCT活检样品对可评估的十一只中的八只(73％)具有可探测到的、对KIT活化的抑制，这是藉由在单一口服剂量的化合物I磷酸盐之后，经磷酸化的KIT降低来测量到的。在治疗之后，没有显示出可探测到的KIT靶调节的三例患者具有表达低水平KIT和处于基线的磷化-KIT的MCT。在这些患者中缺乏显著的靶调节可能归因于探测方法的技术限制；磷-特异性抗体对经磷酸化KIT的敏感性(相对于未经磷酸化KIT而言)在具有低的基线KIT表达的样品中可能是不足的。对KIT活性的抑制与低的基线KIT表达更为紧密相关(较之c-kit ITD基因型而言)。基于细胞测定，可预测到，野生型KIT和ITD突变KIT均会在体内被化合物I磷酸盐抑制，因为化合物I能以相当的效力在体外阻断野生型KIT和ITD突变KIT的磷酸化。

化合物I磷酸盐还影响KIT下游的信号转导途径。已有报道，在GIST和造血恶性肿瘤中c-kit中的突变能活化来自相互之间的和来自野生型KIT的不同信号通路。在犬MCT中，除一例肿瘤样品之外，所有样品都具有可探测到的基线经磷酸化ERK1/2。在十一例可评估的肿瘤活检样品对儿中的七例中，ERK1/2被抑制，这是通过治疗之后经磷酸化ERK1/2的降低来测量的。对于ERK1/2抑制而言被评估为阳性的肿瘤并非全部都是KIT磷酸化阳性的。ERK1/2靶调节与肿瘤级别或c-kit ITD突变的是否存在并不相关。就KIT靶调节来说，在表达高水平ERK1/2和基线经磷酸化ERK1/2的肿瘤中，可探测到更频繁的ERK1/2靶调节。

MCT治疗之后对化合物I磷酸盐的分子靶的抑制的探测被用作为该设定中针对化合物I磷酸盐的靶调节的证据。该发现的临床相关性由对分子靶的抑制和治疗范围中血浆药品浓度之间的关联，以及以前报道过的、在具有表达靶基因中的活化突变的MCT的犬患者中对化合物I的临床客观应答所支持，这提供了将化合物I磷酸盐用于该患者种群的概念的证据。因为具其它恶性肿瘤(包括乳癌、软组织肉瘤和多发性骨髓瘤)的狗也经历了持续的、对化合物I的治疗的客观应答，基于化合物I在体外和体内的效力，在该血浆浓度上的KIT抑制可合理地外推至对这些肿瘤表达的其它紧密相关的化合物I受体酪氨酸激酶靶的成功抑制，这提供了关于这些肿瘤中的客体应答的分子机理。例如，犬乳肿瘤表达VEGFR，其在体外测定中可被与针对细胞内KIT的浓度相当的浓度的吲哚酮酪氨酸激酶抑制剂抑制所抑制(Liao，A.T.，Chien，M.B.，Shenoy，N.，Mendel，D.B.，McMahon，G.，Cherrington，J.M.，and London，C.A.Inhibition ofconstitutively active forms of mutant kit by multitargeted indolinone tyrosinekinase inhibitors.Blood，100∶585-593，2002)。化合物I磷酸盐对MCT中野生型c-kit和ITD突变体c-kit的抑制因此都能用作为对化合物I磷酸盐的相关RTK靶，VEGFR和PDGFR(它们被多种不同的肿瘤类型异常表达和/或调节的)的抑制作用的代替。最后，在犬肿瘤中与临床客体应答相关的分子靶抑制作用指导了在人类癌症中针对表达活化的KIT、VEGFR和PDGFR的临床种群来发展相关化合物的过程。

实施例8.对具复发性肥大细胞瘤的狗的治疗中口服化合物I磷酸盐的多中 心、安慰剂对照、双盲、随机研究

目的：在经掩饰的(masked)、阴性对照研究中，评估化合物I磷酸盐口服片对治疗患有术后复发性可测到疾病的、客户所拥有的动物的肥大细胞肿瘤的有效性。该研究使用经修改的(RECIST)应答标准，评估每隔一天以3.25mg游离碱当量(FBE)/kg体重给予的化合物I磷酸盐剂量对于疾病的应答。在该研究中，肥大细胞瘤中c-kit突变的是否存在作为互变量(covariate)被评估。为做出决定目的而言，该研究持续6周。

一百五十三(153)只狗以4∶3的比率被随机分成两个治疗组：T01(安慰剂，其中n＝65)和T02(化合物I磷酸盐，其中n＝88)。选择十个美国的兽医肿瘤学实践(practices)并登记情况。就登记而言，狗必须具有复发性肥大细胞瘤(至少一处靶损害必须具有一最小长20mm的直径)±区域***转移。三处靶损害(可测量的肥大细胞瘤)及所有非靶损害(所有剩余的损害，可测量的或不可测量的)中的最大一处被两名评估者(evaluators)确定为基线。功效基于在第6周回访的客体应答(完全应答或部分应答)，其中，两名评估者得到的靶损害的最长直径的和的平均值(Mean Sum LD)与基线Mean Sum LD相比较，以计算百分比增加或减少。对非靶损害的估计是主观的。完全应答(CR)被定义为所有靶损害和非靶损害的消失及没有新损害的出现；部分应答(PR)被定义为与基线Mean Sum LD相比靶损害的Mean Sum LD减少至少30％，非靶损害的未恶化，及没有新损害出现。在随机化之前，收集来自肿瘤和远处正常皮肤的组织样品，并用来进行对c-kit突变情况的评估。

八十六(86)只T02和65只T01动物被包括进该功效分析中。数据分析指出，与安慰剂(T01)相比，采用化合物I磷酸盐(T02)时，主要端点具有统计学上显著的提高(客观应答)。与T01动物相比(7.9％；5/63)，T02动物具有显著更大的有效率(38.3％；33/86)(p<0.001)。T01动物中疾病有所发展的动物(66.7％；42/63)为T02动物(33.7％；29/86)的近两倍。T02组中c-kit突变阳性的狗可能具有客观应答的比例是c-kit突变是阴性的那些的几乎二倍(分别是60％，12/20对32.8％，21/64)。

总之，该研究表明了化合物I磷酸盐口服片对于客户拥有的狗的复发性肥大细胞瘤的治疗的有效性。

本领域技术人员能够预计到对上述阐述性实施例中示出的本发明的许多修改和变化。因此，仅对本发明做出所附权利要求中出现的那些限制。

Claims (11)

1.一种碱的柠檬酸盐，其中所述碱是5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)-酰胺。

2.如权利要求1所述的盐，其中该盐具有下述结构：

。

3.如权利要求1所述的盐，其具有C₂₂H₂₅FN₄O₂·C₆H₈O₇的分子式，及从约178℃至约183℃的熔点。

4.5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)-酰胺的柠檬酸盐的同质多晶形体(形式1)，其中，所述同质多晶形体具有使用CuKαl发射(波长＝1.5406埃)得到的下述粉末X射线衍射图，所述衍射图包含以9.1、9.4、14.2、25.4和26.8的2θ角的角度(±0.1度)表示的峰。

5.一种药物组合物，其包含如权利要求1所述的柠檬酸盐，及药学上可接受的载体或赋形剂。

6.权利要求1所述的柠檬酸盐用于生产用于调节蛋白激酶催化活性的药物的用途。

7.如权利要求6所述的用途，其中所述蛋白激酶选自由受体酪氨酸激酶、非受体蛋白酪氨酸激酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶构成的组。

8.治疗有效量的如权利要求5所述的药物组合物用于生产用于预防或治疗生物体中的蛋白激酶相关病症的药物的用途。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述蛋白激酶相关病症是肥大细胞瘤或肥大细胞增多症。

10.制备如权利要求1所述的碱的柠檬酸盐的方法，其包括：

(a)在包含溶剂或溶剂混合物的溶液中，向所述的碱引入符合化学计量的量的柠檬酸；

(b)从溶液中结晶出所述柠檬酸盐；及

(c)从所述溶剂溶液中分离出所述柠檬酸盐的晶体。

11.如权利要求1所述的柠檬酸盐在制备药剂中的用途，所述药剂用于治疗由异常PK活性介导的疾病。

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