BRPI0616374B1 - Forma i do sal de fosfato de um composto pirrol substituído 2-indolinona, composição farmacêutica, usos e método de preparação da forma i - Google Patents

Abstract

formas de sal sólido para um pirrol substituido 2-indolinona, composição farmacêutica compreendendo as mesmas, método para modulação de atividade catalitica de proteina quinase, proteina quinase, métodos para preparação de cristais e de polimorfos e uso. a presente invenção refere-se a formas de saí sólido de um composto 3-pirrol substituído 2-indolinona, (2-pirroíidina-1-ii-etil)-amida de ácido 5-[5-fíúor-2-oxo-1 ,2-di-h idro-indol-(3z)-iíidenometiíjl-2 ,4-d imetil- 1 h-pirroí-3- carboxílico. também refere-se a polimorfos do saí fosfato da amida. a invenção ainda refere-se ao uso dos sais e polimorfos no tratamento de distúrbios relacionados com proteína quinase.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para FORMA I DO SAL DE FOSFATO DE UM COMPOSTO PIRROL SUBSTITUÍDO

2-INDOLINONA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USOS E MÉTODO DE PREPARAÇÃO DA FORMA I.

CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção se refere a formas de sal sólido de um composto 3-pirrol substituído 2-indolinona, (2-pirrolidina-1 -il-etil)-amida de ácido 5-[5-flúor-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico. Os compostos antecedentes modulam a atividade de proteína quinases (PKs). Os compostos desta invenção são, por essa razão, úteis no tratamento de distúrbios relacionados com uma atividade anormal de PK. Composições farmacêuticas compreendendo sais deste composto e métodos de preparação das mesmas são descritos. A presente invenção também é direcionada a polimorfos da forma de sal de fosfato da amida.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] O que segue, é oferecido apenas como informação de antecedentes e não deve ser admitido como sendo técnica anterior para a presente invenção.

[003] Sólidos, incluindo fármacos, frequentemente têm mais de uma forma cristalina, e isso é conhecido como polimorfismo. Polimorfismo ocorre quando um composto cristaliza em uma multiplicidade de fases sólidas que diferem em uma compactação de cristal. Numerosos exemplos são citados nas referências padrão de propriedades em estado sólido de fármacos, Byrn, S. R., Solid-State Chemistry of Drugs, New York, Academic Press (1982); KuhnertBrandstatter, M., Thermomiscroscopy In The Analysis of Pharmaceuticals, New York, Pergamon Press (1971) e Haleblian, J. K. e McCrone, W. Pharmaceutical applications of polymorphism. J. Pharm.

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Sci., 58, 911 (1969). Byrn afirma que, em geral, polimorfos exibem características físicas diferentes incluindo solubilidade e estabilidade física e química.

[004] Devido a diferenças na compactação molecular, polimorfos podem diferir nas formas que influenciam a liberação de fármacos, estabilidade no estado sólido, e produção farmacêutica. A estabilidade relativa e as interconversões dos polimorfos são particularmente importantes para a seleção do fármaco comercializado. Um polimorfo adequado pode articular a questão da estabilidade física. Por exemplo, a seleção do fármaco comercializa-do pode depender da disponibilidade e seleção de um polimorfo adequado possuindo características desejáveis, tais como uma excelente estabilidade física ou uma habilidade para ser produzido em larga escala. O desempenho da forma de dosagem do sólido não deve ser limitado a transformações polimórficas durante a vida na prateleira do produto. É importante observar que não existe método confiável para predizer as estruturas de cristal observáveis de um fármaco dado ou para prever a existência de polimorfos com propriedades físicas desejáveis.

[005] Pks são enzimas que catalisam a fosforilação dos grupos hidróxi na tirosina, serina, e resíduos de treoninas das proteínas. As consequências desta atividade aparentemente simples são surpreendentes, uma vez que virtualmente todos os aspectos da vida celular (por exemplo, crescimento celular, diferenciação, e proliferação) em uma forma ou outra dependem da atividade de PK. Além disso, atividade anormal de PK foi relatada para uma série de distúrbios, variando de doenças relativamente não fatais tais como psoríase para doenças extremamente mortais tais como glioblastoma (câncer cerebral).

[006] Receptores de tirosina quinase (RTKs), uma classe de PK, são excelentes candidatos para terapia molecular direcionada, porque

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3/51 eles desempenham papéis-chave no controle da proliferação celular e da sobrevivência e são frequentemente desregulados em várias malignidades. Os mecanismos de desregulação incluem superexpressão (Her2/neu no câncer de mama, receptor de fator de crescimento epidérmico em câncer pumonar células não-pequenas), mutações ativadoras (KIT em tumores de estroma gastrointestinal, tirosina quinase3/Flk2 (FLT3) relacionada com fms em leucemia mielogênica aguda), e laços autócrinos de ativação (receptor VEGF de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF/VEGFR) em melanoma, receptor PDGF/fator de crescimento de derivado de plaquetas (PDGF/ PDGFR) em sarcoma).

[007] RTKs aberrantemente reguladas foram descritas em câncer humano e canino comparáveis. Por exemplo, expressão anômala do oncogene Met ocorre tanto no osteosarcoma humano quanto no canino. De maneira interessante, mutações de ativação comparáveis no domínio da justamembrana (JM) do c-kit são vistas em 50 a 90% tumores de estroma gastrointestinal de humano (GISTs) e em 30 a 50% de MCTs caninos avançados (tumores de mastócitos). Embora as mutações em GISTs humanos consistam em deleções no domínio de JM e aqueles em MCTs caninos consistam em duplicações em tandem internas (ITDs) no domínio de JM, ambos levando a fosforilação constitutiva de KIT na ausência de ligação de ligando. As RTKs e seus ligandos, VEGF, PDGF, e FGF mediam a neovascularização, conhecida como angiogenese, em tumores sólidos. Consequentemente, por inibição de RTKs, o crescimento de novos vasos sanguíneos dentro do tumor pode ser inibido.

[008] Agentes de antiangiogenese, uma classe de moléculas que inibe o crescimento de vasos sanguíneos dentro do tumor, têm muito baixa toxidade para o corpo comparada com fármacos anticâncer convencionais. Patente US 6,573,293, incorporada aqui por referência,

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4/51 descreve, dentre outros compostos, (2-pirrolidina-1-il-etil)-amida de ácido 5-[5-flúor-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil1H-pirrol-3-carboxílico (em seguida composto I). Tem a seguinte estrutura:

Composto I [009] Composto I é uma molécula pequena que apresenta a habilidade de modulação de PK. O composto é consequentemente útil no tratamento de distúrbio relacionado com a atividade anormal de PK. É um inibidor de RTKs, PDGFR, VEGFR, KIT, e FLT3. Composto I foi mostrado para inibir a fosforilação de KIT, deter a proliferação celular, e induzir a parada do ciclo celular e apoptose em linhagens de células tronco malignas in vitro expressando várias formas do KIT mutante. Composto I e moléculas relacionadas são eficazes em modelos préclínicos contra xenoenxertos de tumor originando-se das linhagens celulares de diversas origens de tumor humano.

[0010] Composto I é útil no tratamento de cânceres em animais domésticos, principalmente cães, e também é útil no tratamento de, inter alia, câncer em humanos. Tais cânceres incluem, mas não estão limitados a, leucemia, câncer de cérebro, câncer de pulmão nãopequenas células, carcinoma celular escamoso, astrocitoma, sarcoma de Kaposi, glioblastoma, câncer pulmonar, câncer de bexiga, câncer de pescoço e cabeça, câncer pulmonar células pequenas, glioma, câncer colorretal, câncer geniturinário, e câncer de estroma gastrointestinal. Também, o composto I é útil para tratamento de doenças relacionadas

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5/51 com a superexpressão das células-tronco, incluindo mas não limitadas a, mastocitose em humanos e tumores de mastócitos em cães.

[0011] Composto I foi recentemente mostrado como sendo eficaz contra um número de malignidades espontâneas em cães. No estudo, 11 de 22 MCTs caninos mostraram respostas objetivas duráveis (respostas parciais e respostas completas) para tratamento com composto I, 9 destes MCTs possuíam ITDs no domínio JM de c-kit.

[0012] Composto I prontamente cristaliza. Sua solubilidade é de cerca de 10 μg/mL em pH 6 de tampão fosfato a 25°C. Quando o composto foi sintetizado, partículas muito finas precipitaram-se da solução durante a última etapa da síntese. Subsequente isolamento destas partículas finas por filtração foi lento, e um bolo duro resultou após filtração. Existe uma necessidade para um sal do composto I que tenha estabilidade física e propriedades físicas desejáveis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0013] A invenção compreende formas de saisdo composto I. Cinco diferentes formas de sal do composto I foram sintetizadas e estão descritas aqui. (Vide tabela I). Estes incluem os sais de cloridrato, fumarato, citrato, fosfato, e ascorbato do composto I. Baseado na caracterização destes sais, o sal de fosfato 1:1, fosfato de composto I, foi identificado como uma forma de sal com características altamente desejáveis. A triagem de polimorfos relevou a existência de 10 polimorfos do fosfato de composto I, aqui nomeadas de formas I até X.

[0014] Em um aspecto, esta invenção provê duas formas de sais do composto I, onde a forma de sal é selecionada dentre sais de citrato e de fosfato, e solvatos e polimorfos dos mesmos. Em uma forma de concretização, a forma de sal de fosfato com uma fórmula molecular de C22H25FN4O2H3O4P é selecionada. Em outra forma de concretização, a forma de sal de fosfato com um ponto de fusão de cerca de 285 a cerca de 290°C é selecionada. Fosfato de composto I tem uma estrutura de

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fosfato de composto I [0015] Em outra forma de concretização, o sal de citrato, citrato de composto I, que tem uma fórmula molecular de C22H25FN4O2O6H8O7 é selecionado. Em ainda outra forma de concretização, a forma de sal de citrato com um ponto de fusão de cerca de 178 a cerca de 183° C é selecionada. Citrato do composto I tem uma estrutura de

Citrato do composto I [0016] Um segundo aspecto da invenção é uma composição farmacêutica incluindo o sal de fosfato ou o sal de citrato de composto I, ou solvatos ou polimorfos dos mesmos, e um veículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente.

[0017] Um terceiro aspecto da invenção é um método de modulação da atividade catalítica de proteína quinases incluindo contatar a referida proteína quinase com os sais de fosfato ou citrato de composto I, ou solvatos ou polimorfos dos mesmos. A proteína quinase pode ser selecionada dentre o grupo consistindo em receptores de tirosina quinase, não receptores de proteína tirosina quinase, e serina/treonina

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7/51 proteína quinases.

[0018] Um quarto aspecto da invenção é um método para prevenção ou tratamento de um distúrbio relacionado com a proteína quinase em um organismo incluindo administrar ao referido organismo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo o sal de fosfato ou o sal de citrato de composto I, ou solvatos ou polimorfos dos mesmos, e um veículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente. Em uma forma de concretização, o organismo é de um ser humano. Em outra forma de concretização,o organismo é de um animal doméstico. Em também outra forma de concretização, o animal doméstico é um gato ou um cão. O distúrbio relacionado com a proteína quinase pode ser selecionado dentre o grupo consistindo em um distúrbio relacionado com receptor de tirosina quinase, um distúrbio relacionado com não receptor de proteína tirosina quinase, e um distúrbio relacionado com proteína serina/treonina quinase. O distúrbio relacionado com proteína quinase pode ser selecionado dentre o grupo consistindo em um distúrbio relacionado com EGFR, um distúrbio relacionado com PDGFR, um distúrbio relacionado com IGFR, um distúrbio relacionado com c-kit, e um distúrbio relacionado com FLK. Tais distúrbios incluem, a título de exemplos e não-limitação, leucemia, câncer de cérebro, câncer pulmonar em células não-pequenas, carcinoma celular escamoso, astrocitoma, sarcoma de Kaposi, glioblastoma, câncer pulmonar, câncer de bexiga, câncer de cabeça, câncer de pescoço, melanoma, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de mama, câncer pulmonar células pequenas, glioma, mastocitose, tumor de mastócitos, câncer de colorretal, câncer geniturinário, câncer gastrointestinal, diabetes, uma doença autoimune, uma doença de hiperproliferação, restenose, fibrose, psoríase, doença de von Heppel-Lindau, osteoartrite, artrite reumatoide, angiogênese, um distúrbio inflamatório, um distúrbio

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8/51 imunológico, e um distúrbio cardiovascular.

[0019] Um quinto aspecto da invenção é um método de preparação de cristais de sal de fosfato de base de (2-pirrolidina-1-il-etil)-amida de ácido 5-[5-flúor-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil1H-pirrol-3- carboxílico que inclui a introdução de uma quantidade estequiométrica de ácido fosfórico para a base na solução incluindo um solvente ou uma mistura de solventes, forçando o sal de fosfato em solução a cristalizar, separando os cristais de sal de fosfato da solução solvente, e secando os cristais. O ácido fosfórico pode ser introduzido em uma quantidade que é 40% de excesso molar para a base. O solvente pode incluir isopropanol. A etapa de separação dos cristais da solução solvente pode incluir adição de acetonitrila para a solução e submetendo a solução a evaporador rotativo. A etapa de separação dos cristais da solução de solvente pode incluir também filtração.

[0020] Um sexto aspecto da invenção é um método de preparação de cristais de sal de citrato da base de (2-pirrolidina-1-il-etil)-amida de ácido 5-[5-flúor-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil1H-pirrol-3- carboxílico que inclui a introdução de uma quantidade estequiométrica de ácido cítrico para a base em uma solução incluindo um solvente ou uma mistura de solventes, forçando o sal de citrato em solução a cristalizar, separando os cristais de sal de citrato da solução solvente, e secando os cristais.O ácido cítrico pode também ser introduzido em cerca de 40% de excesso molar para a base. O solvente pode incluir metanol. A etapa de separação dos cristais da solução do solvente pode incluir a adição de acetonitrila para a solução e submetendo a solução a evaporador rotativo. A etapa de separação dos cristais da solução do solvente pode incluir filtração.

[0021] Em um sétimo aspecto, a invenção provê os polimorfos formas I-X (como descritos aqui) do sal de fosfato de composto I. Em uma forma de concretização, forma I é provida.

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9/51 [0022] Um oitavo aspecto da invenção é uma composição farmacêutica incluindo o polimorfo de forma I do fosfato de composto I e um veículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente.

[0023] Um nono aspecto da invenção é um método para a modulação da atividade catalítica da proteína quinase incluindo contatar a referida proteína quinase com o polimorfo de forma I do fosfato de composto I.

[0024] Um décimo aspecto da invenção é um método de prevenção ou tratamento de um distúrbio relacionado com proteína quinase em um organismo, administrando ao referido organismo uma quantidade terapeuticamente eficaz de polimorfo de forma I de fosfato de composto

I. Em uma forma de concretização, o organismo é de um ser humano ou de um animal doméstico. Em outra forma de concretização, o animal doméstico é um gato ou um cão. Estes distúrbios incluem, a título de exemplo, e não-limitação, tumor de mastócitos e mastocitose.

[0025] Um décimo primeiro aspecto da invenção é um método de preparação de polimorfos do fosfato de composto I, que inclui introduzir o sal de fosfato a uma solução incluindo um solvente ou uma mistura de solventes, opcionalmente, adicionando um solvente de ligação em ponte a solução, e separando os cristais polimorfos da solução de solvente. A solução pode incluir água mais acetonitrila. A solução pode compreender metanol. O solvente de ligação em ponte pode ser metanol.

[0026] Um décimo segundo aspecto da invenção é o uso dos sais de fosfato ou citrato de composto I ou o polimorfo de forma I do sal de fosfato na preparação de um medicamento que é útil no tratamento de uma doença mediada por uma atividade anormal de PK.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0027] Figura 1. Dados de sorção de umidade para sais do composto I.

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10/51 [0028] Figura 2. Padrões de difração de raios X do pó do citrato de composto I e fosfato de composto I.

[0029] Figura 3. Padrões de difração de raios X do pó dos dez únicos sólidos obtidos do estudo de triagem de polimorfos (Vide exemplo 5). Da forma I até forma X como designado nas Tabelas 5 e 6 são apresentadas.

[0030] Figura 4. Curvas de TGA de sólidos de CH2Cb (Forma VI, imediatamente após precipitação), Hexano (Forma VII, após permanecer durante a noite), e acetonitrila (Forma VIII, após permanecer por 3 dias).

[0031] Figura 5. Resultados de eletroforese em gel de agarose de produtos de PCR de MCTs avaliados no exemplo 7. Trilhas de 1 a 5 correspondem a pacientes de 1 a 5 na tabela 8; Trilhas de 6 a 14 correspondem a pacientes 6-14 na Tabela 8. Controles consistidos em produtos de PCR gerados da linhagem de células-tronco caninas C2 contendo um ITD 48-pb (Trilha 15) e de cerebelo canino normal (tipo selvagem; Trilha 16).

[0032] Figura 6. Reduções em MCT fosforilado KIT e quinase regulada de sinal regulado extracelular fosforilado (ERK)1/2 após uma dose única de fosfato de composto I.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0033] Definições. Salvo indicado os seguintes termos utilizados no relatório e reivindicações têm os significados discutidos abaixo:

[0034] O termo C quando usado em referência à temperatura significa centígrados ou Celsius.

[0035] O termo atividade catalítica se refere a taxa de fosforilação da tirosina sob a influência, direta ou indireta, de RTKs e/ou CTKs ou a fosforilação da serina e treonina sob a influência, direta ou indireta, de STKs.

[0036] O termo animal doméstico se refere a animais

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11/51 domesticados oferecendo companhia a seres humanos, e inclui, mas não é limitado a, gatos e cães.

[0037] O termo contatar se refere a levar um composto da presente invenção e um PK alvo juntos de tal maneira que o composto possa afetar a atividade catalítica de PK, quer diretamente, isto é, por interação com a própria quinase, ou indiretamente, isto é, por interação com outra molécula em que a atividade catalítica da quinase é dependente.

[0038] O termo IC50 significa a concentração de um composto de teste que realiza uma inibição meia-máxima da atividade de PK.

[0039] O termo modulação ou modulando se refere à alteração na atividade catalítica de RTKs, CTKs, e STKs. Em particular, modulação se refere à ativação ou inibição da atividade catalítica de RTKs, CTKs, e STKs, preferivelmente a ativação da atividade catalítica de RTKs, CTKs, e STKs, dependendo da concentração dos compostos ou sal aos quais RTK, CTK, ou STK são expostos ou, mais preferivelmente, a inibição da atividade catalítica de RTKs, CTKs, e STKs.

[0040] O termo PK se refere ao receptor de proteína tirosina quinase (RTKs), ou não receptor de tirosina quinase celular (CTKs) e serina-treonina quinases (STKs).

[0041] O termo polimorfo se refere à fase sólida de uma substância, que ocorre em várias formas distintas devido às diferentes modalidades e/ou confirmações da molécula em retículo de cristal. Polimorfos tipicamente têm diferentes propriedades físicas e químicas.

[0042] O termo excipiente farmaceuticamente aceitável se refere a qualquer substância diferente de um composto da invenção, adicionado a uma composição farmacêutica.

[0043] O termo composição farmacêutica se refere à mistura de um ou mais dos sais da presente invenção ou os polimorfos dos tais

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12/51 sais, como descrito aqui, com outros componentes químicos, tais como veículos fisiologicamente/farmaceuticamente aceitáveis e excipientes. O propósito da composição farmacêutica é facilitar a administração de um composto a um organismo.

[0044] O termo veículo fisiologicamente/farmaceuticamente aceitável se refere a um veículo ou diluente que não causa irritação significante a um organismo e não anula a atividade biológica ou propriedade do composto administrado.

[0045] O termo polimorfo pode também ser definido como diferentes formas do cristal não-solvatado de um composto. O termo também inclui solvatos (isto é, formas contendo solvente, ou água), formas amorfas (isto é, formas não-cristalinas), e solvatos dessolvatados (isto é, formas que podem apenas ser feitas por remoção do solvente de um solvato).

[0046] O termo ‘solvato’ é usado para descrever um complexo molecular incluindo um composto da invenção e uma ou mais moléculas do solvente farmaceuticamente aceitável, por exemplo, etanol. O termo ‘hidrato’ é empregado quando o referido solvente é água.

[0047] O termo substancialmente livre em relação à quantidade de um certo polimorfo em uma amostra significa que outros polimorfos estão presentes em uma quantidade inferior a cerca de 15% em peso. Em outra forma de concretização, substancialmente livre significa inferior a cerca de 10% em peso. Em outra forma de concretização, substancialmente livre significa inferior a cerca de 5% em peso. Em ainda outra forma de concretização, substancialmente livre significa inferior a cerca de 1% em peso. O versado na técnica deve entender que a frase em uma quantidade inferior a cerca de 15% em peso significa que o polimorfo de interesse está presente em uma quantidade de mais que cerca de 85% em peso. Do mesmo modo, a frase inferior a cerca de 10% em peso significa que o polimorfo de interesse está

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13/51 presente em uma quantidade de mais do que cerca de 90% em peso, e assim por diante.

[0048] O termo quantidade terapeuticamente eficaz se refere à quantidade do composto que foi administrada que irá impedir, aliviar, ou melhorar um ou mais dos sintomas do distúrbio que foi tratado, ou prolongar a sobrevivência do indivíduo que foi tratado. Em referência ao tratamento do câncer, uma quantidade terapeuticamente eficaz se refere a que quantidade que tem o efeito de:

(1) reduzir o tamanho do tumor;

(2) inibir (isto é, retardar em alguma extensão, ou parar) a metástase do tumor;

(3) inibir (isto é, retardar em alguma extensão, ou parar) o crescimento do tumor, e/ou, (4) aliviar, em alguma extensão (ou eliminar) um ou mais sintomas associados com o câncer.

[0049] Formas de sal diferentes do composto I podem ser sintetizadas para obter uma forma com melhores propriedade físicas. O composto de base pode estar em solução. A solução é geralmente um solvente. Em uma forma de concretização, a solução é um álcool. Em outra forma de concretização, o solvente pode ser isopropanol, metanol, acetonitrila, ou água mais acetonitrila. A solução pode incluir também uma mistura de solventes.

[0050] Os sais podem ser cristalizados utilizando uma técnica de adição/cristalização estequiométrica. Uma quantidade estequiométrica do contraíon é introduzida para a base em solução. Em uma forma de concretização, a quantidade de contraíon está em uma relação de 1:1 para a base. Em outra forma de concretização, a quantidade de contraíon é de 0% a cerca de 60% de excesso molar para a base. Em outra forma de concretização, a quantidade de contraíon é de cerca de 10% a cerca de 50% de excesso molar para a base. Em ainda outra

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14/51 forma de concretização, a quantidade de contraíon é de cerca de 40% de excesso molar para a base. Os contraíons podem incluir íons de: cloridrato, fumarato, citrato, fosfato, e ascorbato. Em uma forma de concretização, o contraíon é o íon fosfato. Em outra forma de concretização o contraíon é o íon citrato.

[0051] O sal em solução é então forçado a cristalizar por uma variedade de técnicas comuns incluindo resfriamento, evaporação, imersão, etc., conhecidos de um versado na técnica. Excesso de solventes pode ser removido das amostras por métodos conhecidos por um versado na técnica. Em uma forma de concretização os solventes são removidos da solução por adição de acetonitrila (ACN) e submetendo a evaporador rotativo a solução. A solução pode ser submetido a evaporador rotativo de cerca de 40°C a cerca de 60°C.Em outra forma de concretização, solventes adicionais podem ser adicionados para a solução (por exemplo, isopropanol e metil etil cetona) antes de submeter a rotovap (evaporador rotativo). As cristalizações podem ser conduzidas no escuro para prevenir isomerização induzida por luz. Em uma forma de concretização, os cristais são removidos por filtração. Em outra forma de concretização, filtração pode ser realizada em atmosfera ambiente de laboratório.

[0052] Por estes métodos, o sal ascorbato, citrato, fumarato, cloridrato, e fosfatos do composto I foram cristalizados. Exemplos específicos de métodos de cristalização são providos abaixo. Análise HPLC pode ser usada para determinar por teste conhecido para um versado na técnica, incluindo determinação do ponto de fusão, difração do pó de raio X, e gravimetria dinâmica de sorção de umidade. Parâmetros para estes testes estão descritos abaixo.

[0053] Essas cinco formas de sal estão descritas aqui (Ver tabela

1). Estes sais do composto I são frequentemente higroscópicos. Por exemplo, como pode ser visto na tabela 1, a 80 por cento de umidade,

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15/51 o sal de cloridrato foi cerca de 20 por cento de água, o sal de fumarato foi cerca de 9 por cento de água, e o sal de ascorbato foi cerca de 6,5 por cento de água. Essa característica pode fazer uso do sal em uma formulação farmacêutica difícil e podem encurtar o período de vida útil na prateleira de uma formulação. Entretanto, dois sais, os sais de fosfato e de citrato, foram verificados como contendo inesperadamente uma absorção de umidade baixa, contendo cerca de 1 por cento de e cerca de 3,8 por cento de água a 80 por cento de umidade relativa, respectivamente.

[0054] Baseado na caracterização destes sais, o sal de fosfato 1:1, fosfato de composto I, foi identificado como uma forma de sal com características altamente desejáveis, incluindo boa cristalinidade, baixa absorção de umidade, facilidade de cristalização, boa pureza, e falta de hidrato. Dez polimorfos do fosfato de composto I, aqui chamados de formas de I até X, são também descritos. O sal de citrato também demonstrou características desejáveis, tais como baixa absorção de umidade e boa cristalinidade.

[0055] Polimorfos dos compostos da presente invenção são desejáveis porque um polimorfo particular do composto pode ter melhores propriedade físicas e químicas que outras formas polimórficas do mesmo composto. Por exemplo, um polimorfo pode ter aumento de solubilidade em certos solventes. Tal adição de solubilidade pode facilitar a formulação ou administração dos compostos da presente invenção. Polimorfos diferentes podem também ter diferentes propriedades mecânicas (por exemplo, diferente compressibilidade, compactação, capacidade de formação dos comprimidos), que podem influenciar o desempenho de formação em comprimidos do fármaco, e deste modo influenciar a formulação do fármaco. Um polimorfo particular pode também exibir diferentes taxas de dissolução em um mesmo solvente, relativa a outro polimorfo. Polimorfos diferentes podem

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16/51 também ter diferentes estabilidades físicas (estado sólido de conversão de polimorfo metaestável para um polimorfo mais estável) e químicas (reatividade). Uma forma de concretização da presente invenção contempla o polimorfo de forma I do fosfato de composto I, como descrito aqui.

[0056] Em formas de concretização da presente invenção, polimorfos simples, puros, bem como misturas incluindo dois ou mais diferentes polimorfos são contemplados. Um polimorfo simples, puro, pode ser substancialmente livre de outros polimorfos.

[0057] Algumas formas de concretização da presente invenção contemplam composições farmacêuticas incluindo um ou mais dos sais do composto I ou os polimorfos de tais sais, como descrito aqui, e um veículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente.

[0058] Polimorfos foram gerados a partir de soluções concentradas de fosfato de composto I. As soluções concentradas podem estar em uma taxa de 60 a 100 mg de fosfato de composto I por ml de solução. Em uma forma de concretização, cerca de 70 mg do composto I podem ser dissolvidos em 1 ml de ácido fosfórico.

[0059] Os cristais de polimorfos podem ser precipitados de um solvente por vários métodos incluindo, por exemplo, evaporação lenta, resfriando uma solução supersaturada, precipitação de antissolventes, etc., que são conhecidos de um versado na técnica. Em uma forma de concretização, os cristais de polimorfos são gerados por adição da solução para um antissolvente. O antissolvente pode ser água mais acetonitrila (ANC), etanol, metanol, acetona, acetonitrila, THF, acetato de etila, hexano, cloreto de metileno (CH2CD, álcool isopropílico (IPA), metil etil cetona (MEK), e dioxano. Em uma forma de concretização, um solvente adicional (por exemplo, metanol) pode ser adicionado. Em outra forma de concretização, as amostras são deixadas permanecer em suspensão durante a noite antes de remover os cristais. Em outra

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17/51 forma de concretização, as amostras são deixadas permanecer por três dias antes de remover os cristais.

[0060] Os cristais podem ser caracterizados utilizando métodos padrão conhecidos por um versado na técnica, incluindo gravimetria dinâmica de sorção de umidade de PXRD, calorimetria diferencial de varredura, análise gravimétrica térmica, e microscopia ótica. Estas técnicas estão descritas abaixo.

[0061] Composições farmacêuticas adequadas para a distribuição dos compostos da presente invenção e métodos para suas preparações vão ser prontamente visíveis para os versados na técnica. Tais composições e métodos de suas preparações podem ser encontrados, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a. ed. (Mack Publishing Company, 1995).

[0062] A escolha de um excipiente farmaceuticamente aceitável será, em grandes medidas, dependente de fatores tais como o modo particular de administração, o efeito do excipiente na solubilidade e estabilidade, e a natureza da forma de dosagem. Exemplos de excipientes incluem, sem limitação, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares e tipos de amidos, derivados de celulose, gelatina, óleos vegetais, e polietileno glicóis.

[0063] Veículos e excipientes para formulação de composições farmaceuticamente aceitáveis incluindo composto I são bemconhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, na Patente US 6.573.293, que é incorporada aqui em sua totalidade. Métodos de administração para tais são também conhecidos na técnica e também descritos, por exemplo, na Patente US 6.573.293. Métodos similares poderiam também ser usados para formular e administrar as composições farmaceuticamente aceitáveis dos sais do composto I, ou os polimorfos de tais sais, desta invenção.

[0064] Adequada formulação é dependente da via de administração

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18/51 escolhida. Por injeção, os compostos da presente invenção podem ser formulados em soluções aquosas, preferivelmente em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hank, solução de Ringer, ou tampão salino fisiológico. Para administração transmucosal, agentes de penetração apropriados para a barreira ser permeada são usados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica. Para administração parenteral, por exemplo, por injeção de bolo ou infusão contínua, formulações podem ser apresentadas em unidade de formas de dosagem, tais como em ampolas ou em recipientes de várias doses. As composições podem tomar tais formas como suspensões, soluções, ou emulsões em veículo oleoso ou aquoso, e pode conter materiais de formulação tais como agentes de colocação em suspensão, de estabilização ou dispersantes.

[0065] Os compostos da invenção podem ser administrados diretamente dentro da corrente sanguínea, dentro do músculo, ou dentro do órgão interno. Adequados meios para administração parenteral incluem, intravenoso, intra-arterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal, intracranial, intramuscular, intrassinovial e subcutâneo. Dispositivos adequados para uma administração parenteral incluem: agulhas injetoras (incluindo microagulhas), injetores livres de agulha e técnicas de infusão. Formulações parenterais são tipicamente soluções aquosas que podem conter excipientes tais como sais, carboidratos e agentes de tampão (preferivelmente ajustando a um pH de 3 a 9), mas, para algumas aplicações, eles podem ser adequadamente formulados como uma solução não aquosa estéril ou como uma forma seca a ser usada em conjunto com um veículo adequado tal como água estéril livre de pirogênios. Adicionalmente, suspensões dos compostos da presente invenção podem ser preparadas em um veículo lipofílico. Veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos tais como óleo de sésamo,

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19/51 ésteres de ácidos graxos sintéticos, tais como oleato de etila e triglicerídeos, ou materiais tais como lipossomas.

[0066] Os compostos da invenção podem ser administrados oralmente. Administração oral pode envolver a ingestão, de modo que o composto entre no trato gastrointestinal, e/ou administração bucal, lingual, ou sublingual para que o composto entre na corrente sanguínea diretamente a partir da boca. Para administração oral, os compostos podem ser formulados por combinação de compostos da presente invenção com veículos farmaceuticamente aceitáveis bem-conhecidos na técnica. Formulações adequadas para administração oral incluem: sistemas sólidos, semissólidos e líquidos tais como comprimidos; cápsulas macias ou duras contendo múltiplas ou nanopartículas, líquidos, ou pós; pastilhas expectorantes (incluindo carregadas com líquido); mastigáveis; géis; formas de dosagem de dispersão rápida; membranas; óvulos; pulverizantes; e curativos bucais/mucoadesivos.

[0067] Os compostos da invenção podem ser administrados topicamente, (intra) dermicamente, transdermicamente à pele ou mucosa. Formulações típicas para esse fim incluem: géis, hidrogéis, loções, soluções, cremes, unguentos, pós de polvilhamento, curativos, espumas, membranas, curativos da pele, hóstias wafers, implantes, esponjas, fibras, bandagens e microemulsões. Lipossomas podem também ser usados. Veículos típicos incluem álcool, água, óleo mineral, petróleo líquido, petrolato, glicerina, polietileno glicol e propileno glicol. Melhoradores de penetração podem ser incorporados - vide, por exemplo, J Pharm Sci, 88 (10), 955-958, por Finnin e Morgan (October 1999). Outros meios de administração tópica incluem a distribuição por eletroporação, iontoforese, fonoforese, sonoforese e injeções de microagulhas ou livre de agulhas (por exemplo Powderject®, Bioject®, etc.).

[0068] Os compostos da presente invenção podem ser formulados

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20/51 para administração retal, tal como supositórios ou utilizando enemas de retenção, por exemplo, bases de supositório convencional tais como manteiga de cacau e outros glicerídeos.

[0069] Os compostos da presente invenção podem também existir em formas não-solvatadas e solvatadas.

[0070] As formas de concretização da presente invenção também contemplam um método para a modulação da atividade catalítica de um PK incluindo contatar o referido PK com um ou mais sais do composto I ou os polimorfos de tais sais da presente invenção. Tal contato pode ser realizado in vitro, isto é, em um tubo de teste, uma placa de Petri, ou outros. Em um tubo de teste, o contato pode envolver apenas um composto e uma PK de interesse ou pode envolver todas células. Células podem também ser mantidas ou cultivadas em pratos de cultura e contatadas com um composto nessa forma de concretização. Nesse contexto, a habilidade de um composto particular em afetar uma distúrbio relacionado com PK, isto é, um IC50 do composto, definida abaixo, pode ser determinado antes do uso dos compostos ser empreendida in vivo com organismos vivos mais complexos. Para células fora do organismo, vários métodos existem, e são bemconhecidos dos versados na técnica, para levar PKs em contato com compostos incluindo, mas não limitados a, microinjeção direta de células e várias técnicas de transporte de transmembrana.

[0071] Formas de concretização da presente invenção contemplam um método para tratamento ou prevenção do distúrbio relacionado com proteína quinase em um organismo (por exemplo, animal doméstico ou um ser humano) incluindo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica incluindo um ou mais sais do composto I ou os polimorfos de tais sais da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente para o organismo.

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21/51 [0072] Em uma forma de concretização da presente invenção, o distúrbio relacionado com proteína quinase é selecionado dentre o grupo consistindo em um distúrbio relacionado com receptor de tirosina quinase, um distúrbio relacionado com não receptor de tirosina quinase, e um distúrbio relacionado com serina-treonina quinase. Em outra forma de concretização da presente invenção, o distúrbio relacionado com proteína quinase é selecionado do grupo consistindo em um distúrbio relacionado com EGFR, um distúrbio relacionado com PDGFR, um distúrbio relacionado com IGFR, e um distúrbio relacionado com FLK.

[0073] O receptor de proteína quinase de que a atividade catalítica é modulada por um composto da invenção é selecionada do grupo consistindo em EGF, HER2, HER3, HER4, IR, IGF-1R, IRR, PDGFRa, PDGFRp, CSFIR, C-Kit, C-fms, Flk-1R, Flk4, KDR/Flk-1, Flt-1, FGFR1R, FGFR-2R, FGFR-3R e FGFR-4R. A tirosina quinase celular de que a atividade catalítica é modulada por um composto da invenção é selecionada do grupo consistindo em Src, Frk, Btk, Csk, Abl, ZAP70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr e Yrk. A serinatreonina proteína quinase de que a atividade catalítica é modulada por um composto da invenção é selecionada do grupo consistindo em CDK2 e Raf.

[0074] Em ainda outra forma de concretização da presente invenção, o distúrbio relacionado com proteína quinase é selecionado do grupo consistindo em carcinoma celular escamoso, astrocitoma, sarcoma de Kaposi, glioblastoma, câncer pulmonar, câncer de bexiga, câncer de colo e cabeça, melanoma, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de mama, câncer pulmonar pequenas células, glioma, câncer colorretal, câncer geniturinário, câncer gastrointestinal, mastocitose, e tumores de mastócitos. Em uma forma de concretização da presente invenção, o distúrbio relacionado com proteína quinase é selecionado do grupo consistindo em diabetes, uma doença autoimune,

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22/51 uma doença de hiperproliferação, restenose, fibrose, psoríase, doença von Heppel-Lindau, osteoartrite, artrite reumatoide, angiogênese, uma doença inflamatória, uma doença imunológica, e uma doença cardiovascular.

[0075] Composições farmacêuticas adequadas para o uso na presente invenção incluem composições onde os ingredientes ativos estão contidos em uma quantidade suficiente para atingir o fim pretendido, por exemplo, a modulação da atividade de PK ou o tratamento ou prevenção de um distúrbio relacionado com PK.

[0076] Determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está bem dentro da capacidade daqueles versados na técnica, especialmente à luz da descrição detalhada provida aqui. Para qualquer composto utilizado nos métodos da invenção, uma quantidade terapeuticamente eficaz ou dosagem podem ser estimadas inicialmente a partir das análises de cultura celular. Então, a dosagem pode ser formulada para uso em modelos de animais de modo a atingir uma taxa de concentração circulante que inclui IC50 como determinado na cultura celular. Tal informação pode então ser utilizada para determinar mais corretamente as dosagens úteis em seres humanos ou animais domésticos.

[0077] Em prática, a quantidade do composto a ser administrado varia de cerca de 0,001 a cerca de 100 mg por kg do peso corporal, tal dosagem total é dada de uma só vez ou em dosagens divididas. A quantidade de composição administrada irá depender, como evidente, do paciente a ser tratado, da severidade da aflição, da maneira de administração, do julgamento do médico ou veterinário, etc. Em casos da administração local ou absorção seletiva, a concentração local eficaz do fármaco não pode estar relacionada com a concentração de plasma e outros procedimentos conhecidos na técnica podem ser empregados para determinar a quantidade de dosagem e intervalo corretos.

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23/51 [0078] Formas de concretização da presente invenção também contemplam um método de tratamento de câncer em animais domésticos incluindo administrar uma composição farmacêutica incluindo um ou mais dos sais do composto I ou os polimorfos de tais sais da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente.

[0079] Adicionalmente, contempla-se que os sais do composto I ou os polimorfos de tais sais, como descrito aqui, sejam metabolizados por enzimas no corpo de um organismo tal como um animal doméstico ou um ser humano de modo a gerar um metabólito que poderia modular a atividade das proteínas quinases. Estes metabólitos estão dentro do escopo da presente invenção.

[0080] Compostos da invenção podem ser administrados sozinhos ou em combinação com um ou mais outros compostos da invenção ou em combinação com um ou mais outros fármacos (ou como qualquer combinação deles). É também contemplado que os sais do composto I ou os polimorfos de tais sais, como descrito aqui, possam ser combinados com outros agentes quimioterápicos para tratamento das doenças e distúrbios discutidos acima. Por exemplo, um composto da presente invenção pode ser combinado com fluorouracil sozinho ou em combinação com mais dentre leucovorin ou outros agentes alquilantes. Um composto da presente invenção pode ser utilizado em combinação com outros agentes quimioterápicos antimetabólicos tais como, sem limitação, análogos de ácido fólico ou análogos de purina. Um composto também pode ser usado em combinação com um produto natural baseado em agentes quimioterápicos, agentes quimioterápicos antibióticos, agentes quimioterápicos enzimáticos, complexos de coordenação de platina, e hormônio e antagonista de hormônio.Também é contemplado que um composto da presente invenção possa ser utilizado em combinação com mitoxantrona ou

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24/51 paclitaxel para o tratamento do câncer de tumor sólido ou leucemias. [0081] Sem mais elaboração, acredita-se que um versado na técnica, utilizando a descrição precedente, pratique a invenção na sua extensão máxima. Os seguintes exemplos detalhados descrevem como preparar os vários compostos e/ou realizar os vários processos da invenção e devem ser interpretados como meramente ilustrativos, e não limitações da descrição precedente de qualquer forma. Aqueles versados na técnica irão prontamente reconhecer variações apropriadas de ambos os procedimentos tanto para reagentes como para as condições de reação e técnicas.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Síntese do composto I, isto é, (2-pirrolidina-1-il-etil)-amida de ácido 5-(5-flúor-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil1H-pirrol-3- carboxílico [0082] Como descrito na Patente US 6.574.293 (exemplo 129) 5flúor-1,3-di-hidro-indol-2-ona foi condensada com 5-formil-2,4-dimetil1H-pirrol-3-ácido carboxílico (2-pirrolidina-1-il-etil)-amida para resultar o composto I.

[0083] Procedimento de escalonamento. Ácido 5-Formil-2,4-dimetil1H-pirrol-3- carboxílico (61 g), 5-flúor-1,3-di-hidro-indol-2-ona (79 g), etanol (300 ml) e pirrolidina (32 ml) foram refluxados por 4,5 horas. Ácido acético (24 ml) foi adicionado a mistura e refluxo foi continuado por 30 minutos. A mistura foi resfriada para temperatura ambiente e os sólidos coletados por filtração a vácuo e lavados duas vezes com etanol. Os sólidos foram agitados por 130 minutos em 40% de acetona em água (400 ml) contendo ácido clorídrico a 12 N (6,5 ml).Os sólidos foram coletados por filtração a vácuo e lavados duas vezes com 40% de acetona em água. Os sólidos foram secos a vácuo para resultar ácido

5-[5-flúor-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1Hpirrol-3- carboxílico (86 g, 79% de rendimento) como um sólido laranja.

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25/51 [0084] Ácido 5-[5-flúor-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (100 g) e dimetilformamida (500 ml) foram agitados e hexafluorofosfato de benzotriazol-1iloxitris(dimetilamino)fosfônio (221 g), 1-(2-aminoetil)pirrolidina (45,6 g) e trietilamina (93 ml) foram adicionados. A mistura foi agitada por 2 horas à temperatura ambiente. O produto sólido foi coletado por filtração a vácuo e lavado com etanol. Os fluidos sólidos foram lavados por agitação em etanol (500 ml) por uma hora a 64°C e resfriados para temperatura ambiente. Os sólidos foram coletados por filtração a vácuo, lavados com etanol, e secos sob vácuo para resultar(2-pirrolidina-1-iletil)-amida de ácido 5-[5-flúor-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3Z)ilidenometil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3- carboxílico (101,5 g, 77% de rendimento).

Exemplo 2. Síntese dos sais do composto I.

Exemplo 2A. fosfato de composto I.

[0085] 2,67 mmols do composto I foram adicionados ao frasco com ml de ácido fosfórico a 0,092 M (cerca de 40% de excesso molar assumindo um sal 1:1) e 40 ml de isopropanol. Então, acetonitrila foi continuamente adicionada à solução aquosa em alíquotas de 30 ml, como a solução foi submetida ao evaporador rotativo a 60°C para remover a água. No todo, 120 ml de acetonitrila foram utilizados para remover a água da solução. Os cristais foram filtrados e secos em ar. Cristais foram de escoamento livre e de cor laranja; 1,0 9 grama foi coletado para um rendimento de 83%.

Exemplo 2B. Citrato do composto I.

[0086] 2,64 mmols do composto I foram adicionados ao fraco com ml de ácido cítrico a 0,1M (3,4 mmols) e 35 ml de metanol. Essa solução foi submetida ao evaporador rotativo a 50°C. Reduzindo o volume desta solução produz-se cristais de cristalinidade pobre, então 20 ml de isopropanol e 10 ml de metil etil cetona foram adicionados para

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26/51 dissolver o sólido. Essa mistura foi submetida ao evaporador rotativo a 60°C e produziu cristais laranjas. Os cristais foram filtrados e secos em ar. O rendimento para esse processo foi de cerca de 60%, e poderia ter sido ainda melhorado, através da redução do volume de solvente antes da filtração.

Exemplo 3. Propriedades físicas dos sais do composto I.

[0087] Métodos. Testes para determinar as propriedades físicas dos sais do composto I incluindo a determinação do ponto de fusão, pureza de HPLC, difração do pó de raio X, e gravimetria dinâmica de sorção de umidade.

[0088] Difração de pó de raio X (PXRD). XRD do pó foi realizado utilizando um Scintag X2 Advanced Diffraction System (lab 259-1088, controlado por Scintag DMS/NT 1.30a e software Microsoft Windows NT 4.0. O sistema utiliza uma fonte de raios X Copper (45 kV e 40 mA) para prover emissão de CuK«i de 1,5406Â e um detector resfriado tipo Peltier em estado sólido. A abertura do feixe foi controlada utilizando fendas de divergência de tubo e antidispersão de 2 e 4 mm e fendas de detector antidispersão e de recepção de 0,5 e 0,2 mm de extensão. Dados foram coletados de 2 a 35^o dois theta, utilizando uma etapa de varredura de 0,03o/etapa com um tempo de contagem de um segundo por etapa. Suportes de amostra de aço inoxidável, de carregamento no tipo, redondos, Scintag, com insertos de 9 mm de diâmetro foram utilizados para os experimentos. Pós foram embalados dentro do suporte e foram gentilmente pressionados por uma superfície lisa de vidro para assegurar coplanaridade entre a superfície da amostra e a superfície do suporte.

[0089] Gravimetria dinâmica de sorção de umidade (DMSG).

Isoterma de DMSG foi coletada em uma temperatura controlada por microbalança atmosférica. Amostras de aproximadamente 10 mg foram colocadas nos pratos de amostras da balança. A umidade foi

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27/51 sequencialmente variada de umidade relativa ambiente (umidade relativa) a 0% de umidade relativa e foi então aumentada a 90% de umidade relativa seguido por uma diminuição de umidade relativa a 0% de novo em 3% de etapas de umidade relativa. A massa foi então medida a cada dois minutos. A umidade relativa foi escalonada para o próximo valor-alvo quando a mudança da amostra de massa foi inferior a 0,5 pg em 10 min. O programa Visual Basic dmsgscn2.exe foi usado para controlar a coleta de dados e exportar a informação para planilha de Excel.

[0090] Resultados. A tabela 1 mostra um sumário dos dados de sais ascorbato, citrato, fumarato, cloridrato, e fosfato de composto I. Análise de HPLC sugere que sais foram de pureza relativamente alta, e nenhuma mudança significante na pureza foi induzida através de processo de formação de sal.

Tabela 1. Sumário dos sais sintetizados para composto I

Contraíon	Sal Cristalizado	Ponto de fusão (°C)	% de água 80% de umidade relativa	Pureza HPLC *	% Isômero*
sem (base livre)	NA	257	~ 1%	97,8	0,63
cloridrato	Sim	96	~ 20%	97,7	2,29
fumarato	Sim	NA	~ 9%	97,3	1,96
citrato	Sim	181	~ 3,8%	98,2	1,38
fosfato	Sim	288	~ 1%
ascorbato	Sim	245	~ 6,5%

* porcentagem de área sob os picos no HPLC [0091] O sais de cloridrato, fumarato, e ascorbato foram muito higroscópicos (vide figura 1). Os outros dois sais (citrato e fosfato) tiveram perfil de baixa absorção da umidade, absorvendo menos que 3% de água a 70% umidade relativa.

[0092] Os padrões de pó de raio X indicam que os sais de fosfato e citrato foram de cristalinidade relativamente alta. (Vide tabelas 2 e 3; e figura 2).

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Tabela 2 [0093] Picos de PXRD do fosfato de composto I

Ângulo Dois- Teta*	** Intensidade relativa
(graus)	(arbitrária)
11,1	23,5
11,5	24,0
11,6	19,9
12,0	8,9
13,0	22,0
14,0	25,9
14,5	7,0
15,4	15,0
16,5	7,5
17,2	27,7
17,8	9,5
18,3	16,6
19,4	11,6
19,6	11,2
19,8	9,8
20,8	58,2
21,6	11,8
22,0	9,5
22,7	9,2
22,9	12,4
23,2	12,8
23,4	10,3
24,4	48,8
25,8	30,4
27,0	100,0
29,2	7,4
29,2	7,4
33,5	5,1

*: ± 0,1° **: a intensidade relativa para cada pico é determinada por normalização de sua intensidade onde o pico mais alto é o ângulo de 27,0° como 100 Tabela 3 [0094] Picos de PXRD do Citrato do composto I

Ângulo dois-Teta*	** Intensidade relativa
(graus)	(arbitrária)
3,2	20,4
7,3	17,7
9,2	14,4
9,5	39,1
10,8	9,5
12,7	23,5

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Ângulo dois-Teta*	** Intensidade relativa
(graus)	(arbitrária)
13,2	19,6
14,3	23,5
14,8	16,7
15,9	11,3
17,2	8,3
17,8	11,9
18,2	19,8
18,3	19,5
19,6	6,8
20,9	11,1
21,6	8,9
21,7	10,5
21,8	8,9
23,2	13,2
24,2	20,3
24,9	15,9
25,5	100,0
26,4	20,9
26,8	26,5
27,1	10,8
32,0	6,3
34,4	8,1

*: ± 0,1° **: a intensidade relativa para cada pico é determinada por normalização de sua intensidade onde o pico mais alto é o ângulo de 25,5° como 100 Exemplo 4. Preparação e caracterização de fosfato de composto I. Exemplo 4A. Preparação do fosfato de composto I.

[0095] Base livre do composto I foi usada para preparar o sal de fosfato. A amostra (número de lote 35282-CS-51) do fosfato de composto I foi preparada como descrito acima. 4 ml de ácido fosfórico a 0,977 M foram adicionados a 1,0 95 g de base livre no frasco imediatamente seguido por adição de 4 ml de acetonitrila. Uma suspensão foi obtida. A suspensão foi aquecida ligeiramente em uma placa quente. Adicionando 40 ml de água e aquecendo enquanto agitando por cerca de uma hora não dissolveu completamente o sólido. O sólido foi filtrado e lavado com 10 ml de acetonitrila. PXRD mostrou que era o sal de fosfato de composto I.)

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Exemplo 4B.Caracterização do fosfato de composto I.

[0096] Lote 35282-CS-51 foi chamado polimorfo forma I do fosfato de composto I. Apresentou alta cristalinidade, boa escoabilidade, e cristal de tamanho grande. Tanto a ausência de evento de fusão na temperatura de fusão da base livre do composto I (polimorfo de base livre forma A, 256°C; polimorfo de base livre forma B, 259°C) e a presença de pontos de fusão elevados (281 - 297°C) dos sólidos sugerem que os cristais do Lote 35282-CS-51 sejam uma forma de sal diferente e não uma base livre do composto I. A pureza do lote foi 99,6% por HPLC.

Exemplo 4C. Estimativa de solubilidade do fosfato de composto I.

[0097] Amostras de 1 a 2 mg do fosfato de composto I (lote 35282CS-51) foram transferidas para frascos de vidro de 10 ml (dosados com tara) e foram pesados (precisão até 0,1 mg). Solventes foram adicionados aos frascos (um solvente para cada frasco) em uma forma de etapa cuidadosa, com 0,5mL do solvente adicionado a cada etapa. Solventes utilizados foram: tampão (pH = 2), tampão (pH = 5), água, metanol, tetra-hidrofurano (THF), acetonitrila, e acetona. Após cada adição, o frasco foi nivelado e agitado. A dissolução do sólido foi visualmente observada. Se uma óbvia dissolução não foi observada, mais solvente foi adicionado imediatamente. Se a dissolução foi aparente, o frasco foi deixado na bancada por pelo menos 30 minutos antes da próxima adição de solvente. Essa etapa foi repetida até não existirem mais cristais visíveis contra um fundo preto e um branco. A solubilidade foi então agrupada por uma divisão do peso do composto pelo volume final e o volume antes da última adição. Se um sólido sobrou após adição de 10 ml de solvente, a solubilidade foi expressada como inferior ao peso dividido pelo volume final.Se o sólido foi dissolvido completamente após a primeira adição de solvente, a solubilidade foi expressada como maior do que o peso dividido pelo volume solvente.

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Todos os experimentos foram conduzidos à temperatura ambiente. [0098] As solubilidades estimadas do fosfato de composto I em vários solventes são apresentadas na tabela 4 juntamente com as solubilidades das bases livres, expressadas como mg/ml. A solubilidade do fosfato de composto I é inferior à da base livre do composto I no mesmo solvente, exceto em água (em vários níveis de pH). A solubilidade do fosfato de composto I depende do valor do pH de uma solução, e torna-se consideravelmente mais elevada (> 3 mg/ml) em pH=2 ou inferior. O ponto de fusão do fosfato de composto I (lote 35282CS-51) é de cerca de 281 a 297°C, que é substancialmente mais elevado que o ponto de fusão da base livre do composto I (polimorfo de base livre forma A, 256°C; polimorfo de base livre forma B, 260°C). Um importante resultado é que a molhabilidade do fosfato de composto I com água é muito melhor do que a da base livre do composto I.

Tabela 4. Solubilidade estimada da base livre do composto I e fosfato de composto I em vários solventes a 23°C.

	Solvente	Solubilidade da base livre do composto I (polimorfo forma A) (mg/mL)	Solubilidade do fosfato de composto I (mg/mL)d
1	tampão (pH = 2) a	3,11	De 5,9 a 7,4
2	tampão (pH = 5)b	0,005
3	água	NAc	~0,29 e (algumas partículas presas na parede do frasco não dissolveram)
4	metanol	0,21 - 0,31	~0,14
5	THF	0,32 - 0,4	<<< 0,19
6	Acetonitrila	<< 0,08	<<< 0,13
7	Acetona	<< 0,16	<<< 0,2

^a pH = 2 tampão é feito de HCl e KCl ^b pH = 5 tampão é feito de ftalato de ácido de potássio e hidróxido de sódio.

^c Não disponível mas esperado < 0,005 mg/ml.

^d 1 g do fosfato de composto I é equivalente a 0,802 g da base livre do composto I.

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32/51 ^e O valor do pH da solução final é 4,91.

Exemplo 5. Geração de polimorfos do fosfato de composto I.

[0099] As baixas solubilidades do fosfato de composto I vistas no exemplo 4C indicaram que as soluções altamente concentradas (60 a 100 mg/ ml, vermelho laranja escuro) de fosfato de composto I seriam benéficas para precipitar os polimorfos do fosfato de composto I de vários solventes. Tais soluções concentradas foram preparadas por dissolução de base livre do composto I em cerca de ácido fosfórico a 1 M. Por exemplo, cerca de 70 mg de Base livre do composto I poderiam ser dissolvidos em 1 ml de ácido fosfórico a 1M. Entretanto, a quantidade de base livre do composto I e ácido fosfórico utilizada depende da concentração desejada e da quantidade de solução. No exemplo em que o precipitado foi filtrado a vácuo imediatamente após precipitação, cerca de 1 ml da solução desejada foi então gotejado em cerca de 10 ml de dez antissolventes para precipitar os cristais de sais. Estes solventes incluíam água mais acetonitrila (ANC), etanol, metanol, acetona, acetonitrila, THF, acetato de etila, hexano, cloreto de metileno (CH2Cl2), e álcool isopropílico (IPA). No exemplo em que o precipitado foi filtrado a vácuo após ser colocado em suspensão durante a noite ou por três dias, os solventes adicionais de metil etil cetona (MEK) e dioxano foram usados. Alguns solventes orgânicos, por exemplo, acetato de etila, hexano, CH2Cl2, não são miscíveis com água e duas camadas de solventes foram observadas. Apenas uma pequena precipitação foi vista na superfície alguns minutos após adição. Nestes casos cerca de 1 ml de metanol foi adicionado como um solvente de ligação em ponte, para aumentar a miscibilidade entre as duas camadas. Metanol pareceu trabalhar bem no aumento da miscibilidade porque a camada orgânica incolor tornou-se amarela logo após a adição de metanol. O frasco foi então agitado vigorosamente à mão por cerca de um minuto. Ambos os sólidos dos solventes orgânicos foram filtrados

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33/51 a vácuo imediatamente após precipitação (em 20 min) e após colocação em suspensão durante a noite ou por três dias a fim de isolar ambos os dois polimorfos metaestáveis e estáveis.O pó foi então analisado. Os diferentes sólidos foram numerados na ordem de descoberta.

Exemplo 6. Caracterização dos polimorfos do fosfato de composto I. Exemplo 6A. Métodos de caracterização.

[00100] T odos os pós obtidos a partir da análise dos procedimentos dos polimorfos acima foram analisados por PXRD, como descrito no exemplo 3 acima. Quando um novo padrão PXRD foi observado, técnicas complementares também foram usadas para caracterizar os sólidos, incluindo gravimetria dinâmica de sorção de umidade (também descrita no exemplo 3), calorimetria diferencial de varredura, análise gravimétrica térmica (quando necessário), e microscopia óptica.

[00101] Calorimetria diferencial de varredura (DSC). Dados de DSC foram obtidos utilizando um calorímetro de DSC (TA Instruments 2920). Pó (de 1 a 5 mg) foi compactado em um prato de alumínio de DSC. Uma tampa de alumínio foi colocada no topo do prato e foi pregada. O prato pregado foi colocado na célula de amostragem juntamente com um prato vazio como uma referência. Temperaturas foram aumentadas a 300 ou 350°C de 30°C a uma taxa de 10°C/min. salvo especificado em contrário.

[00102] Termogravimetria (TGA). Experimentos de TGA foram realizados utilizando um analisador de alta resolução (TA Instruments modelo 2950). O TA Instruments Thermal Solutions® para NT (versão 1.3L) foi utilizado na coleta de dados, e o Universal Analysis® para NT (versão 2.4F) foi utilizado para análise de dados. Amostras (5-10 mg) foram colocadas dentro do prato de alumínio que foi ainda colocado em um prato de balança de platina antes de serem aquecidas. Os pesos dos pratos de alumínio e platina foram tarados antes de carregar as amostras. As temperaturas foram aumentadas de 30^oC a 300^oC

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34/51 linearmente a uma taxa de 10^oC/min. Purga de nitrogênio seco foi utilizada.

[00103] Microscopia de Luz Polarizada. Microscopia foi realizada em um microscópio de luz polarizada Olympus BHSP. Pó foi colocado em suspensão em óleo de silicone e disperso entre uma superfície lisa de microscopia e uma cobertura de tira estreita. Antes de observação, a cobertura de tira estreita foi gentilmente esfregada contra a superfície lisa para tornar boa a dispersão das partículas.

Exemplo 6B. Caracterização imediatamente após precipitação [00104] Os resultados foram resumidos na tabela 5. Precipitação teve lugar logo que a solução ácida foi misturada com os antissolventes. Primeiro, os precipitados eram flocos soltos. As cores foram amarelo e laranja claro em geral. O sólido resultante era pegajoso. A observação microscópica destes sólidos indicaram que eles eram constituídos de cristais muito pequenos, com boa birrefração sob luz polarizada. Pelo menos seis diferentes padrões de PXRD foram observados nos sólidos obtidos dos nove sistemas solventes. (Vide figura 3). A cadeia lateral de amida nesta molécula é flexível e sofre diferentes conformações forma B de base livre e no seu sal de cloridrato.Consequentemente, a molécula nas diferentes formas sólidas podem ser polimorfos conformacionais. Os padrões de PXRD dos sólidos precipitados do acetato de etila, hexano, e IPA pareciam os mesmos. Entretanto, uma comparação detalhada com outros padrões de PXRD foi difícil devido aos baixos sinais de refração dos sólidos destes três solventes. Consequentemente, eles não foram designados como uma forma nova. O precipitado do metanol é o mesmo que o lote de referência 35282CS-51 (designado como forma I). Dados de TGA de todos os precipitados indicaram resíduos de solvente a um nível de 1,7 a 4,7%. Dentre estes sólidos, um de CH₂Ch parecia ser um sólido com solvente retido em cristais. A curva de TGA mostrou uma diminuição abrupta do

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35/51 peso da amostra a uma temperatura de cerca de 125^oC (vide figura 4). Este evento é registrado como uma endoterma mais ou menos na mesma temperatura por DSC. Em adição, esse pó foi constituído de cristais de morfologia bem definida e foi de livre escoamento, uma propriedade muito diferente da dos outros lotes de precipitado. O pó exibiu cristalinidade média por PXRD mas boa cristalinidade quando observado por microscópio de luz polarizada. Outros lotes foram constituídos de cristalitos muito finos. Na curva de DSC destes pós, uma endoterma ampla e superficial foi vista logo que a amostra foi carregada na célula de amostra. Essa observação é refletida por TGA como uma perda de peso gradual do início do aquecimento em TGA. Por essa razão, para estes lotes, os solventes residuais foram provavelmente solventes adsorvidos na superfície e não foram solventes no retículo de cristal.

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Tabela 5. Características físicas dos sólidos isolados imediatamente após precipitação

Nome designado para padrão de PXRD	Solvente orgânico	Cristalinidade de PXRD	Observação microscópica	perda a de% em peso de TGA	Eventos térmicos por DSC (°C)fe	Cor do sólido	Escoamento livre ? (S=sim; N=não)
Forma I	Água + ACN	Alta	Irregular	0,3	296	Laranja	S
Forma II	EtOH	Pobre	Agregada	2,5	81c, 226, 293	Amarela	N (pegajoso)
Forma I	MeOH	Alta	Irregular	1,7	298	Laranjavermelho	S
Forma III	Acetona	Média	Agregadae	2,5	88 c, 155, 222, 228, 286	Amarela	N (pegajoso)
Forma IV	Acetonitrila (ACN)	Alta	Agregadae	2,9	97 c, 142, 156, 172, 227, 230, 281	Amarela	N (pegajoso)
Forma V	THF	Alta	Agregadae	2,5	82 c, 161, 175, 227, 292	Amarela	N (pegajoso)
NDf	Acetato de etila	Pobre	Partículas finas	4,7	98 c, 196, 222	Laranja claro	N (pegajoso)
NDf	Hexano	Pobre	Agregadae			Laranja claro	N (pegajoso)
Forma VI 9	CH2O2	Média	Placa + equant + fino	3,3	123 d, 164, 228, 296	Laranjavermelho	S
NDf	IPA	Pobre	Agregadae	1,9	76 c, 222, 229, 296	Amarela	N (pegajoso)

36/51 ^a Perda de peso a 160°C. ^b Para maior compreensão, as temperaturas listadas na tabela são somente temperatura de pico. ^c temperaturas de pico de um amplo evento endotérmico da temperatura a partir de um ciclo de DSC. Estes eventos são também refletidos por uma perda de peso gradual em TGA. Esse tipo de evento de aquecimento é típico de perda de solvente adsorvido na superfície. ^d Temperaturas de pico de um evento endotérmico relativamente brusco em DSC. Esse evento é também registrado por TGA como uma perda repentina de peso na temperatura de pico correspondente. Esse tipo de evento de aquecimento é típico de uma dessolvatação de um solvato. ^e Os agregados são constituídos de partículas muito finas. ^f nD significa que nenhuma forma definida pode ser apontada por causa do sinal baixo dos picos de difração dos padrões correspondentes de PXRD confundiram uma comparação detalhada com padrões de PXRD de outras formas. ⁹ forma VI, é um sólido contendo solvente.

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Exemplo 6C. Precipitação após permanecer por três dias em solvente. [00105] Estes resultados estão sumarizados na tabela 6. Depois de um tempo de permanência de até três dias no solvente, uma nova fase sólida não macia laranja-vermelha apareceu. Os precipitados fofos obtidos de todos os solventes orgânicos, exceto o precipitado de metanol, sofreram transformação. Aparentemente, os sólidos precipitados imediatamente após precipitação foram metaestáveis nestes casos em que eles converteram-se em formas sólidas mais estáveis (forma I) ao longo do tempo. Esta conversão parecia estar concluída em um par de horas na maioria dos sistemas de so lvente. No entanto, eles foram deixados permanecer por um período de tempo bem mais longo para garantir a conclusão do processo, a fim de evitar colher uma mistura de duas formas sólidas. A curva de TGA mostrou perda de peso abrupta em cerca de 124°C e 153°C para os sólidos obtidos a partir de hexano e acetonitrila respectivamente, acoplados por uma endoterma a uma temperatura similar em DSC. Portanto, eles também pareceram conter solvente contido em retículo de cristal. As estequiometrias dos solventes retidos são de cerca de 0,6 para acetonitrila e cerca de 0,14 para hexano. Cristais em forma de agulha foram cultivados a partir de acetonitrila após suspensão por três dias. Os Padrões de PXRD do sólido retendo acetonitrila foram únicos enquanto o Padrão de PXRD do solvato de hexano é similar ao do sólido retendo CH₂Cl₂ identificado anteriormente (figura 3). Ambos sólidos retendo solvente (hexano e acetonitrila) perderam peso em um prato de TGA. Padrões PXRD únicos de ambos os sólidos foram observados após a retirada correspondente do solvente que foi removido por aquecimento (tabela 7, figura 3), indicando que a remoção das moléculas de solvente dos sólidos ocasionou mudanças estruturais dos cristais de solvato (consequentemente, as moléculas de solvente estão em retículo de cristal não apenas em superfície de cristal). Entretanto, o

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38/51 padrão PXRD do dessolvato de acetonitrila foi baixo em intensidade de sinal. Perfil de DSC do dessolvato de acetonitrila exibiu dois eventos de aquecimento adicionais a 74^o C e 174^o C, quando comparado com o perfil de DSC do solvato de acetonitrila, enquanto o evento de dessolvatação a 153°C estava ausente. Resfriamento da amostra após dessolvatação pode ter mudado o sólido que sofreu uma mudança enérgica a 174^o C.

[00106] Quando os solventes orgânicos foram utilizados, o período de permanência mais longo dos precipitados tornou os sólidos do mesmo padrão PXRD como o da forma I (Lote 35282-CS-51) embora a morfologia dos cristais fosse diferente (tabela 6). O mesmo padrão PXRD indicou que aqueles sólidos têm a mesma estrutura de retículo de cristal.

[00107] A morfologia deve ser diferente devido aos efeitos do solvente. É aparente que a forma I é a fase sólida mais estável dentre todos os polimorfos não-solvatados relatados aqui. Outras formas sólidas livres do solvente foram metaestáveis e convertidas para forma I rapidamente quando em contato com solvente. O sólido de CH₂Cl₂ pareceu fluir mais facilmente que o sólido de hexano. O TGA, morfologia, e a escoabilidade indicaram que eles são dois sólidos diferentes.

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Tabela 6. Caracterização física dos sólidos isolados após varios períodos de permanência após precipitação

Nome designado para Padrão PXRD	Solvente orgânico (período de permanência )	Cristalin idade PXRD	Observação microscópica	perdaa de peso%	Eventos termais por DSC (°C)d	Cor do sólido	Escoamento livre ? (S=sim; N=não)
Forma I	Água + ACN	Alta	irregular	0,3	296	Laranja	S
Forma I	Acetato de etila (durante a noite)	Alta	Comprimidos			Laranja-vermelho	S
Forma VII g	Hexano (durante a noite)	Média	placas	2,4	124 c, 228, 295	Laranja-vermelho	N
Forma I	IPA (durante a noite)	Alta	equant (25 um) + fina	0,4	297	Laranja-vermelho	S
Forma I	CH2O2 (durante a noite)	Alta	equant (25 um) + fina	0,6	293	Laranja-vermelho	S
Forma I	EtOH (3 dias)	Alta	Agregadae			Laranjavermelhod	S
Forma I	Acetona(3 dias)	Alta	placas			Laranjavermelhod	S
Forma VIII g	Acetonitrila (3 dias)	Média	agulhas	4,9	153 c, 229, 231, 239, 291	Laranjavermelhoe	N
Forma I	THF (3 dias)	Alta	Cabeça de lança	0,3	295	Laranja clarof	N
Forma I	MeOH (durante a noite)	Alta				Laranja-vermelho	S
Forma I	MEK (durante a noite)	Alta	varetas	0,6	297	Laranja	N
Forma I	dioxano (durante a noite)	Alta	placas		295	Laranja	N

39/51 ^a Perda de peso a 160^oC^.por TGA. ^b Para melhor compreensão, as temperaturas listadas na tabela são apenas picos de temperatura. ^c Picos de temperatura de um evento endotérmico relativamente acentuado em DSC. Esse evento é também registrado por TGA como uma perda de peso repentina no correspondente pico de temperatura. ^d Conversão foi completa em 5 horas (do amarelo para o laranja-vermelho). ^e Conversão não foi óbvia em 5 horas mas foi completada a maioria das vezes em três dias (amarelo solta precipitado para cristais em forma de agulha laranja-vermelho bem formados laranja-vermelho). ^f Conversão foi completa em 5 horas. A mudança de cor não foi óbvia (de amarelo para laranja claro). ^g formas VII e VIII são solventes incluindo sólidos.

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Tabela 7. Caracterização física dos sólidos produzidos após dessolvatação.

Nome designado para Padrão PXRD	Método de geração de cristal	Cristalinida de PXRD	Eventos termais por DSC (oC)	Cor do sólido
Forma IX	Dessolvatação de solvato de AcN	Pobre	74, 174, 229, 231, 239, 291	laranja
Forma X	Dessolvatação de solvato de hexano	Média		laranja

Exemplo 7. Inibição de fosforilação de KIT em tumores de mastócitos caninos.

[00108] Propósito. O desenvolvimento de terapias direcionadas ao alvo para câncer oferece a oportunidade de avaliar diretamente os efeitos dos fármacos nos alvos moleculares e correlacionar estes efeitos com a biologia do tumor e farmacocinética do fármaco. Isso pode ser instrumental no desenvolvimento da oncologia do fármaco porque estabelece um relacionamento farmacodinâmico/farmacocinético e provê informações críticas em respeito ao impacto terapêutico de um agente alvo. O propósito deste estudo foi avaliar o efeito de uma dosagem simples do inibidor de receptor de tirosina quinase do fosfato de composto I na atividade de seu KIT de alvo molecular em tumores de mastócitos caninos (MCT), em pacientes caninos com MCTs avançados utilizando fosforilação de KIT como um marcador de inibição direta do alvo. Também foi estudada a fosforilação de ERK1/2 (uma proteína quinase ativada por mitogênios (MAPK) a jusante da sinalização de KIT), concentração de plasma do fosfato de composto I, e o estado mutacional de c-kit para determinar como estes parâmetros correlacionam-se com o estado de fosforilação de KIT após tratamento com fosfato de composto I.

[00109] Fármaco de estudo. fosfato de composto I foi utilizável em comprimidos divididos de 20 mg.

[00110] Projeto do estudo. Este estudo foi uma prova de estudo de modulação de alvo em cães com grau recorrente ou metaestático de

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MCTs II/III. Pacientes receberam uma dose única oral do fosfato de composto I a 3,25 mg/kg. Utilizando um instrumento de biópsia perfurador de 6 mm, amostras foram obtidas do tumor antes da administração de fosfato de composto I e 8 horas (h) após tratamento. Quando possível, múltiplas biópsias foram obtidas. Cada amostra foi congelada instantaneamente em nitrogênio líquido e armazenada a -70° centígrados (C) antes de análise. Amostras de sangue para análises de níveis de plasma de fosfato de composto I foram obtidas ao mesmo tempo que as biópsias de tumor (vide abaixo).

[00111] Níveis de plasma do fosfato de composto I. Amostras de sangue foram retiradas da veia jugular e colocadas dentro de um tubo de vidro de coleta de soro a vácuo red-top. Espécimes foram retirados à temperatura ambiente, deixados coagular, centrifugados a 1500 rpm a 4°C por 10 minutos, transferidos para criofrascos, e análise pendente do plasma congelado a -70°C. Brevemente, amostras de plasma (20 μ!) ou padrões de fosfato de composto I no plasma canino foram misturados com metanol (200 μ]) incluindo cloridrato de DL-propranolol (padrão interno) em uma placa de 96 cavidades de polipropileno (Orochem Technology, Westmont, IL). A placa foi misturada por vórtice durante 1 min., e a amostra foi centrifugada por 10 min. a 4000 rpm. Dez microlitros de sobrenadante foram injetados dentro de sistema LC/MS/MS, em que ocorreu separação em uma coluna de cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa BataBasic C-18 (5 qm, 100 X 4,6 mm.) (Keystone Scientific, Foster City, CA). A quantidade de fosfato de composto I e o padrão interno em cada amostra de plasma canino foram quantificados baseados nas curvas padrão geradas utilizando quantidades conhecidas do composto variando de 0,2 a 500 ng/ml.

[00112] Análise de mutação de c-kit. Para a maioria das amostras, RNA foi extraído utilizando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo

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42/51 com as especificações do fabricante. cDNA foi então gerado do RNA utilizando dNTPs, iniciadores aleatórios, tampão 5X First Strand, 0,1 M de DTT, e polimerase de Superscript Taq (todos de Promega, Madison, WI). O cDNA foi quantificado para cada amostra. Para as amostras restantes, DNA genômico foi preparado como descrito previamente (Downing, S., Chien, M. B., Kass, P. H., Moore, P. F., e London, C. A. Prevalence and importance of internal tandem duplications in exons 11 and 12 of c-kit in mast cell tumors of dogs. Am. J. Vet. Res., 63: 17181723, 2002; que é incorporado por referência em sua totalidade). Para ambas reações, o PCR foi realizado por 40 ciclos consistindo em 94°C (1 min), 59°C (1 min), e 72°C (1 min), com uma extensão de 5 min. a 72°C no final da reação. Um cDNA de c-kit gerado da linha de célula mastro canino C2 e cDNA gerado de cerebelo canino normal foram usadas como controles.

[00113] Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em um gel de agarose a 4%; o esperado produto de PCR de c-kit de tipo livre tem um tamanho de 196 pb de PCR de cDNA e 190 pb no tamanho de PCR de DNA genômico. Para estes casos em que um ITD não foi óbvio (apenas uma pequena banda estava presente), os produtos de PCR foram purificados por gel utilizando o Promega PCR Wizard CleanUp kit (Promega) e sequenciados utilizando ambos iniciadores P1 (dianteiro) e P5 ou P2 (reverso) nas instalações de sequenciamento de núcleos na Universidade da California-Davis, para excluir a presença de ITDs muito pequenos, deleções, ou pontos de mutações. Alinhamento de sequência e comparação foram realizados utilizando o programa de análise de sequência DNASIS.

[00114] Análise de fosforilação de KIT e ERK. Biópsias de tumor foram congeladas em nitrogênio líquido e mais tarde pulverizadas utilizando crymorfor resfriado de nitrogênio líquido e trituradas, então armazenadas a -70°C até serem utilizadas. Para a análise de KIT,

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43/51 tumores pulverizados foram homogenizados, lisados, e imunoprecipitados de 1 mg de lisado de tumor de partida, como descrito previamente (Abrams, T. J., Lee, L. B., Murray, L. J., Pryer, N. K., Cherrington, J. M. SU11248 inhibits KIT e platelet-derived growth factor receptor beta in preclinical models of human small cell lung cancer. Mol. Cancer Ther. 2: 471-478, 2003; que incorporada por referência em sua totalidade) utilizando um anticorpo conjugado de agarose para KIT (SC1493AC; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Quando múltiplas biópsias foram obteníveis, repetir a imunoprecipitação/análise de Western blot foi realizada em biópsias separadas. A quantidade de KIT fosforilado em cada amostra foi determinada por Western blot utilizando um anticorpo para fosfotirosina 719 de KIT de murinos (3391; Cell Signaling Technology, Beverly, MA), que corresponde à tirosina 721 do KIT canino e é uma autofosforilação local e, deste modo, um substituto para atividade de quinase de KIT. Para análise do KIT total, os blots foram extraídos, bloqueados novamente, e ressondados com um anticorpo para KIT (A-4542; DAKO Corp., Carpinteria, CA). Para análise de p42/44 ERK, os mesmos lisados de tumor utilizados para análise de KIT foram sondados por Western blot com um anticorpo para fosfo-Thr 202/Tir 204 ERK1/2 (9101B; Cell Signaling Technology) e então extraídos e ressondados com um anticorpo para ERK total (9102; Cell Signaling Technology). Pares de biópsia para tumores para ambos KIT e ERK1/2 foram consideradas como aquelas para que a proteína total detectável estava presente em ambas as biópsias do par. Modulação alvo foi classificada a olho nu por três observadores cegos para estado de JM e concentração de plasma. Redução de > 50% em sinal de fosfoproteína relativo ao sinal de proteína total na amostra de biópsia tirada após tratamento comparada com a biópsia pré-tratamento foi pontuada como positiva para modulação alvo, considerando que a redução de <50% foi pontuada negativa.

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44/51 [00115] Resultados. Quatorze cães foram incluídos neste estudo clínico, com o principal objetivo de determinar se uma redução na fosforilação da KIT tirosina ocorreu após administração oral de uma dose única de fosfato de composto I. Fosforilação de KIT tirosina foi avaliada utilizando um anticorpo específico fosfodirecionado contra um local de autofosforilação em KIT, servindo como substituto para atividade de KIT quinase. Em adição, estado mutacional de c-kit JM (ITD+ ou ITD-) foi determinado pela biópsia de tumor basal, e concentrações de plasma de fosfato de composto I foram medidas 8 horas após dosagem para correlato destes parâmetros com inibição de fosforilação de KIT. Onze dos 14 cães foram avaliáveis para modulação do KIT alvo. Os três cães considerados não avaliáveis tiveram KIT proteína total não detectável ou fortemente reduzida em uma ou ambas biópsias e por isso não poderiam ser pontuadas por modulação alvo. Os dados para todos os cães incluídos neste estudo estão na tabela 8.

Tabela 8 Sumário de dados de todos os paciente envolvidos

Número do paciente	Grau do tumor	Presença de mutação em c-kit ITD	fosfato de composto I no Plasma pós dose (ng/ml)	Redução de P-KIT pós dosea	Redução de P-ERK1/2 pós dose
1	III	Sim	81,0	Sim	Não
2	III	Sim	33,2	Sim	Não
3	II	Sim	83,5	NE	Sim
4	III	Sim	98,0	Sim	Sim
5	III	Sim	116,0	Sim	Sim
6	III	Não	121,0	Sim	Sim
7	III	Não	186,0	NE	NE
8	III	Não	0,3	Sim	Não
9	II	Não	103,0	NE	NE
10	II	Não	111,0	Não	Sim
11	II	Não	158,0	Não	Sim
12	II	Não	65,3	Sim	Sim
13	II	Não	95,4	Não	Não
14	III	Não	119,0	Sim	NE

^a NE, Não avaliável, P-KIT, Fosfo-Tir721 KIT, P-ERK1/2, Fosfo-Thr202/

Tir204 ERK1/2 [00116] Dos 14 cães analisados, 5 (36%) tiveram um ITD por análise de PCR (figura 5, Trilhas de 1 a 5); todos os cinco tumores tiveram

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45/51 evidência de um ITD. De maneira interessante, o paciente 2 teve aparentemente perda do alelo de tipo selvagem c-kit. Os produtos de PCR dos nove cães restantes que não tiveram evidência de ITD (figura 5, Trilhas de 6 a 14) foram diretamente sequenciados, e nenhum demonstrou qualquer tipo de mutação (inserção, deleção, ou mutação de ponto). Para trilhas 3, 6, 8, e 9, DNA genômico foi usado da reação de PCR, resultando em um produto de tipo selvagem um pouco menor (190 pb ).

[00117] O nível de KIT total e fosforilado expressado no MCTs na linha de base variou entre animais. A maior expressão de KIT correlacionou com maior grau de tumor. Quatro de oito tumores de grau III tiveram alta expressão de KIT, comparados a um dos seis tumores de grau II (figura 6). Por exemplo, a expressão de KIT total no tumor do paciente 2 (grau III) foi marcadamente mais elevada do que no tumor do paciente 11 (grau II). Cães com tumores de grau III também tiveram uma alta incidência de altos níveis de KIT fosforilado na linha de base quanto aqueles com tumores de grau II, consistente com o aumento da frequência de mutações de c-kit ITD em tumores avançados e consequentemente níveis elevados de KIT fosforilado independente de ligando. Cinco dos sete cães avaliáveis com tumores de grau III tiveram altos níveis de KIT fosforilado na linha de base; quatro destes foram positivos para presença de um ITD em c-kit. Apenas 1 tumor de grau II teve significante KIT fosforilado; esse animal também expressou c-kit de ITD mudado.

[00118] Oito dos 11 cães avaliados pontuaram positivo para modulação alvo utilizando critério de uma redução > 50% em KIT fosforilado relativo ao KIT total na amostra da biópsia retirada após tratamento com fosfato de composto I quando comparado com a amostra do pré-tratamento. Exemplos de KIT fosforilado e KIT total em imunoprecipitados de biópsias de tumor retiradas antes e depois de

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46/51 tratamento com fosfato de composto I são mostrados na figura 6. Cinco tumores (figura 6, esquerda) foram marcados como positivos para modulação alvo, considerando que dois tumores (figura 6, direita) foram marcados como negativos. Pares de biópsia que foram marcados como negativos para inibição da fosforilação de KIT após tratamento com fosfato de composto I todos tinham KIT fosforilado menos acentuadamente na linha de base quanto aqueles que marcaram positivo (figura 6).

[00119] Para avaliar os efeitos de inibição do fosfato de composto I sobre vias de sinalização a jusante regulados por fosforilação de KIT, níveis de MAPK ERK1/2 fosforilado foram avaliados por análise de Western blot dos mesmos pares de biópsia utilizados por análise de KIT. Onze dos 14 tumores foram avaliados de modulação alvo de fosfoERK1/2 (dois destes não foram avaliáveis para modulação do KIT alvo). Destes 11 avaliáveis, 7 mostraram uma redução na relação de fosfoERK1/2 para ERK1/2 total em tumores amostrados após a administração do fosfato de composto I, comparado com amostras de tumor de linha de base (vide figura 6). Modulação alvo de ERK foi mais frequentemente detectada em MCTs com expressão de ERK de linha de base relativamente alta e fosforilação quanto naqueles com baixa ERK.

[00120] Com base em trabalhos pré clínicos em modelos de roedores, a taxa terapêutica do composto I à taxa de inibição do alvo foi considerada para ser de 50 a 100 ng/ml por 12 h de um período de dosagem de 24-h.A concentração de plasma do fosfato de composto I em 8 h (aproximadamente Cmax) após dose única a 3,25 mg/kg variou de 33,2 a 186 ng/ml, com uma média de 105 ± 9 ng/mL (tabela 8). Em um animal, a concentração no plasma do fosfato de composto I estava fora da taxa de outras amostras (0,3 ng/ml). Doze da 14 cães tiveram níveis de plasma considerados como estando em uma taxa terapêutica

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47/51 estabelecida em um estudo clínico da fase 1 do composto I. (London,

C. A., Hannah, A. L., Zadovoskaya, R., Chien M. B., Kollias-Baker, C., Rosenberg, M., Downing, S., Post, G., Boucher, J., Shenoy, N., Mendel,

D. B., e Cherrington, J. M. Phase I dose-escalating study of SU11654, a small molecule receptor tyrosine kinase inhibitor, in dogs with spontaneous malignancies. Clin. Cancer Res., 2755-2768, 2003). A concentração média de plasma para cães com evidência de modulação do alvo KIT (79,2 ± 41 ng/ml) e aqueles que não pontuaram para modulação de alvo KIT 137 ± 36 ng/ml) não foram significantemente diferentes (P = 0,08).

[00121] Discussão. Esse estudo correlativo foi projetado para investigar a modulação alvo em uma população clínica comparável para estudar os efeitos de uma única dose clinicamente eficaz de fosfato de composto I na fosforilação de KIT em MCTs caninos e o subsequente impacto na sinalização através de MAPKs. As concentrações no plasma do fosfato de composto I alcançadas neste estudo foram medidas próximo ao Cmax esperado, baseados em estudos pré-clínicos farmacocinéticos e foram consistentes com o nível de fármaco medidos no estudo clínico da fase I investigando a dose eficaz e regime do composto I (tabela 8).

[00122] Oito dos 11 (73%) pares avaliáveis de biópsia de MCT tiveram inibição detectável de ativação de KIT como medido pela redução em KIT fosforilado após uma dose oral simples de fosfato de composto I. Os três pacientes que não mostraram modulação do alvo de KIT detectável após tratamento tiveram MCTs que expressaram níveis baixos de KIT e fosfoKIT na linha de base. A falta de modulação alvo significativa nestes doentes pode ser atribuível aos limites técnicos nos métodos de detecção; a sensibilidade de anticorpo específico de fosfo em KIT fosforilado relativo a KIT não fosforilado pode ser insuficiente nas amostras com baixa expressão de KIT de linha de base.

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Inibição de atividade de KIT correlacionada mais proximamente com fosforilação de KIT de linha de base quanto com genótipo de c-kit ITD. Baseado em análises celulares, seria previsível que ambos KIT tipo selvagem e mutante de ITD seriam inibidos por fosfato de composto I in vivo, porque composto I in vitro bloqueou a fosforilação de KIT tipo selvagem e mutante de ITD com potência comparável.

[00123] O fosfato de composto I também afetou uma via de sinalização a jusante de KIT. Mutações em c-kit em GIST e malignidades hematopoiéticas têm sido relatadas para ativar diferentes vias de sinalização a jusante de cada outro e de KIT tipo selvagem. Em MCTs caninos, apenas uma amostra de tumor tinha ERK1/2 fosforilado detectável na linha de base. Em 7 dos 11 pares de biópsia de tumores avaliados, ERK1/2 foi inibido, como medido pela redução em ERK1/2 fosforilado após tratamento. Nem todos os tumores marcando positivo para inibição de ERK1/2 foram também positivos para inibição da fosforilação de KIT. Modulação alvo de ERK 1/2 não correlaciona-se com grau de tumor ou a presença ou ausência de mutação de c-kit ITD. Quanto a modulação do alvo de KIT, modulação alvo de ERK 1/2 foi detectada mais frequentemente em tumores que expressaram altos níveis de ERK1/2 e ERK1/2 fosforilado na linha de base.

[00124] A detecção da inibição de um alvo molecular do fosfato de composto I após tratamento de MCTs serve como prova de modulação alvo para fosfato de composto I neste cenário. A relevância clínica desta descoberta é apoiada pela correlação entre a inibição do alvo molecular e concentrações de fármaco no plasma na faixa terapêutica, e respostas objetivas clínicas anteriormente relatadas para composto I em pacientes caninos com MCTs expressando mutações ativadoras no gene alvo, fornecendo uma prova de conceito para fosfato de composto I nessa população de pacientes. Porque cães com outras malignidades (incluindo carcinoma mamário, sarcoma de tecidos mols, e mieloma

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49/51 múltiplo) também experimentaram respostas objetivas duráveis no tratamento com composto I, inibição de KIT nessa concentração de plasma pode ser razoavelmente extrapolada para o sucesso da inibição de outros alvos de tirosina quinase receptor proximamente relacionados com o composto I expressado por estes tumores, baseado em potência in vitro e in vivo do composto I, provendo uma racionalidade molecular para respostas objetivas nestes tumores. Porexemplo, tumores caninos mamários expressam VEGFR, que é inibido por inibidores de indolinona tirosina quinase nas concentrações comparáveis para KIT em análises celulares in vitro. (Liao, A. T., Chien, Μ. B., Shenoy, N., Mendel, D. B., McMahon, G., Cherrington, J. M., e London, C. A. Inhibition of constitutively active forms of mutant kit by multitargeted indolinone tyrosine kinase inhibitors. Blood, 100:585-593, 2002) Inibição de fosfato de composto I de ambos c-kit tipo selvagem e mutante de ITD em MCTs pode, deste modo, servir como um substituto para inibição dos alvos de RTK relatados do fosfato de composto I, VEGFR, e PDGFR, que são aberrantemente expressados e/ou regulados por muitos diferentes tipos de tumor. Finalmente, inibição de alvo molecular, ligada com respostas de objetivo clínico em tumores caninos, direciona o desenvolvimento de compostos relacionados em câncer humano na direção de populações clínicas expressando KIT, VEGFR, ou PDGFR ativados.

Exemplo 8 - Estudo de múltiplos centros, controlado por placebo, ceqoduplo, randomizado de fosfatode composto I oral no tratamento de cães com tumores mastócitos recorrentes [00125] Finalidade - A eficácia dos comprimidos orais de fosfatode composto I para o tratamento de tumores mastócitos em animais de propriedade dos clientes que tinham uma doença mensurável recorrente após cirurgia foi avaliada em um estudo controlado negativo, mascarado. O estudo avaliou a dosagem em intervalos de um dia de fosfatode composto I a 3,25 mg de equivalentes de base livre (FBE) kg

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50/51 peso corporal na resposta à doença usando critérios de resposta modificados (RECIST). A presença ou ausência de mutação c-kit em tumores de mastócitos foi avaliada como uma covariante neste estudo. Para fins de tomada de decisões, a duração do estudo foi de 6 semanas. [00126] Cento e cinquenta e três (152) cães foram randomizados em uma relação de 4:3 em um de dois grupos de tratamento: T01 (Placebo em que = 65) e T02 (fosfato decomposto I em que n = 88). Dez práticas de oncologia veterinária nos Estados Unidos foram selecionadas e os casos registrados. Para o alistamento, os cães precisavam ter tumores de mastócitos recorrentes (pelo menos uma lesão alvo que tinha um diâmetro mais longo mínimo de 20 mm) ± envolvimento de linfonodo regional. Um máximo de três lesões alvo (tumores de mastócitos mensuráveis) e todas as lesões não alvo (todas as lesões restantes, mensuráveis ou não) foram identificadas como a linha de base por dois avaliadores. A eficácia foi baseada na resposta objetiva (resposta completa ou resposta parcial) na visita da semana 6 onde a média da soma dos dois avaliadores do diâmetro mais longo das lesões alvo (LD de soma média) foi comparada com LD de soma média da linha de base para cálculo da redução ou aumento percentual. A avaliação das lesões não alvo foi subjetiva. Uma resposta completa (CR) foi definida como o desaparecimento de todas as lesões de alvo e não alvo e o não aparecimento de novas lesões; uma resposta parcial (PR) foi definida como pelo menos uma diminuição de 30% no LD de soma média de lesões alvo comparado com o LD de soma média de linha de base e a não progressão de lesões não alvo e o não aparecimento de novas lesões. As amostras de tecido do tumor e da pele normal distante foram coletadas antes da randomização e submetidas para avaliação do estado de mutação c-kit.

[00127] Oitenta e seis (86) animais T02 e 65 T01 foram incluídos na análise da eficácia. A análise de dados indicou uma melhora

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51/51 estatisticamente significante no ponto final primário (resposta objetiva) para fosfato de composto I (T02) comparado com placebo (T01). Os animais T02 tinha uma taxa de resposta objetiva significantemente maior (38,3%, 33/86) comparado com os animais T01 (7,9%; 5/63) (p<0,001). Quase duas vezes tantos animais T01 (66,7%; 42/63) experimentaram doença progressiva comparado com animais T02 (33,7%; 29/86). Os cães no grupo T02 que eram positivos para as mutações c-kit foram quase duas vezes mais prováveis de terem uma resposta objetiva comparado com os que foram negativos para a mutação c-kit. (60%, 12/20 vs. 32,8%, 21/64, respectivamente.

[00128] Em conclusão, este estudo demonstrou a eficácia de comprimidos orais de fosfato de composto I para o tratamento de tumores de mastócitos recorrentes em cães de propriedade dos clientes.

[00129] Numerosas modificações e variações na invenção como especificada nos exemplos ilustrativos acima são esperadas como ocorrendo para os versados na técnica. Consequentemente, somente estas limitações como aparecem nas reivindicações seguintes devem ser colocadas na invenção.

Claims (8)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Forma de sal de uma base, caracterizada pelo fato de que a base é (2-pirrolidina-1 -il-etil)-amida de ácido 5-[5-flúor-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico, e em que a forma de sal apresenta uma fórmula molecular de C22H25FN4O2 H3PO4 e um ponto de fusão de 285 a 290°C, que é a forma 1 do sal de fosfato cristalino de (2-pirrolidina-

   1-il-etil)-amida de ácido 5-[5-flúor-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3Z)ilidenometil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico, que apresenta um espectro de difração de raios X de pó compreendendo picos expressos em graus (± 0,1 grau) de ângulo de dois theta de 20,8, 24,5, 25,9, e 27,0 obtido usando emissão de CuKal (comprimento de onda= 1,5406 Angstroms).
2. 2. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende 0 sal de fosfato como definido na reivindicação 1 e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
3. 3. Uso de um sal de fosfato como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para a modulação da atividade catalítica de proteína quinases.
4. 4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a proteína quinase é selecionada do grupo que consiste em receptor de tirosina quinase, não receptor de proteína tirosina quinase, e serina/treonina proteína quinases.
5. 5. Uso de um sal de fosfato como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para prevenção ou tratamento de um distúrbio relacionado com proteína quinase em um organismo.
6. 6. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que 0 distúrbio relacionado com proteína quinase é um tumor de mastócitos ou mastocitose.

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   2/2
7. 7. Método de preparação de cristais de sal de fosfato como definido da reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (a) introduzir uma quantidade estequiométrica de ácido fosfórico à base em uma solução compreendendo um solvente;

   (b) cristalizar o sal de fosfato da solução; e (c) separar os cristais de sal de fosfato da solução de solvente;

   em que o solvente da etapa (a) compreende metanol.
8. 8. Método de preparação de polimorfos do sal de fosfato como definidos na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (a) introduzir o sal de fosfato a uma solução compreendendo um solvente;

   (b) opcionalmente adicionar um solvente de ligação em ponte à solução, e (c) separar os cristais de polimorfo da solução de solvente.