ES2268791T3 - Metodos para modular la funcion de la proteina cinasa de serina/treonina con compuestos basados en 5-azaquinoxalina. - Google Patents
Metodos para modular la funcion de la proteina cinasa de serina/treonina con compuestos basados en 5-azaquinoxalina. Download PDFInfo
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Abstract
Un compuesto sobre las base de la 5-azaquinoxalina que tiene una estructura expuesta en la fórmula I: (Ver fórmula) en la que a) R1, R2, y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: i. hidrógeno; ii. alquilo saturado o insaturado opcionalmente sustituido con un resto de anillo de heteroarilo o arilo de cinco o seis eslabones, en la que dicho resto de anillo está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independiente del grupo que consiste en los restos alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster; iii. una amina de la fórmula NX2X3, en la que X2 y X3 se seleccionan independiente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo saturado o insaturado y restos de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones; iv. halógeno o trihalometilo; v. una cetona de fórmula -CO-X4, en la que X4 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo y restos arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones; vi. un ácido carboxílico de fórmula -(X5)n-COOH o un éster de fórmula -(X6)n-COO-X7, en las que X5, X6 y X7 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo y restos arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones, y en las que n es 0 ó 1; vii. un alcohol de fórmula (X8)n-OH o un resto alcoxi de fórmula -(X8)n-O-X9 en las que X8 y X9 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo saturado o insaturado, y restos de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones, en las que dicho anillo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster, y en las que n es 0 ó 1; viii. una amida de fórmula -NHCOX10, en la que X10 se selecciona del grupo que consiste en alquilo, hidroxilo y restos de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones, en la que dicho anillo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro o éster; ix. -SO2NK11X12, en la que X11 y X12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo y restos de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones; x. un resto de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en los restos de alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster; xi. un aldehído de fórmula -CO-H; xii. una sulfona de fórmula SO2-X13, en la que X13 se selecciona del grupo que consiste en alquilo saturado o insaturado y restos arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones; y i. una amina de fórmula NK2X3, en la que X2 y X3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo saturado o insaturado y restos de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones; b) R6 seselecciona del grupo que consiste en: i. una amina de fórmula NK2X3, en la que X2 y X3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo saturado o insaturado y restos de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones;
Description
Métodos para modular la función de la proteína
cinasa de serina/treonina con compuestos basados en
5-azaquinoxalina.
La siguiente descripción de los antecedentes de
la invención se proporciona para ayudar a comprender la invención,
pero no se acepta que sea una técnica previa para la invención.
La transducción de señales celular es un
mecanismo fundamental mediante el cual los estímulos externos que
regulan los diversos procesos celulares se retransmiten al interior
de las células. Uno de los mecanismos bioquímicos clave de la
transducción de señales implica la fosforilación reversible de las
proteínas, lo que permite la regulación de la actividad de las
proteínas maduras al alterar su estructura y su función.
Las proteínas cinasas mejor caracterizadas en
los eucariotas fosforilan las proteínas en el resto alcohol de los
residuos de serina, treonina y tirosina. Estas cinasas se clasifican
principalmente en dos grupos: las que fosforilan específicamente
serina y treonina, y las que fosforilan específicamente la tirosina.
Algunas cinasas, citadas como cinasas de "especificidad dual",
pueden fosforilar la tirosina así como los restos serina o
treonina.
Las proteínas cinasas también se pueden
caracterizar por su ubicación dentro de la célula. Algunas cinasas
son proteínas receptoras transmembranarias capaces de unir ligandos
externos a la membrana celular. La unión de los ligandos altera la
actividad catalítica de la proteína cinasa receptora. Otras son
proteínas no receptoras que carecen de un dominio transmembranario.
Las proteínas cinasas no receptoras se pueden encontrar en numerosos
compartimentos celulares, desde la superficie interior de la
membrana celular hasta el núcleo.
Muchas cinasas participan en las cascadas
reguladoras en las que sus sustratos pueden incluir otras cinasas
cuyas actividades están reguladas por su estado de fosforilación.
Por último, la actividad de un efector vía abajo está modulada por
la fosforilación que resulta de la activación de tal vía.
La familia de las serina/treonina cinasas
incluye miembros que regulan muchas etapas de las cascadas
señalizadoras, incluidas las cascadas que controlan el crecimiento
celular, la migración, la diferenciación, la expresión génica, la
contracción muscular, el metabolismo de la glucosa, la síntesis de
las proteínas celulares y la regulación del ciclo celular.
Un ejemplo de una proteína cinasa no receptora
que fosforila dianas proteicas en los restos de serina y treonina
es RAF. La RAF modula la actividad catalítica de otras proteínas
cinasas, como la proteína cinasa que fosforila y, por lo tanto,
activa la proteína cinasa activada por mitógenos (MAPK). La propia
RAF es activada por la proteína anclada en la membrana RAS que, a
su vez, se activa en respuesta a proteínas cinasas de tirosina
receptoras activadas por ligandos como el receptor del factor del
crecimiento epidérmico (RFCE) y el receptor del factor del
crecimiento derivado de las plaquetas (RFCDP). La importancia
biológica de la RAF a la hora de controlar los procesos celulares
está acentuada por el descubrimiento de que las formas alteradas de
la RAF pueden causar cáncer en los organismos. Las pruebas de la
importancia de la RAF en los cánceres se proporcionan en Monia
et al., 1996, Nature Medicine, 2: 668, incorporada en
la presente memoria por referencia en su totalidad, incluidas todas
las figuras y las tablas.
En un esfuerzo por descubrir nuevos tratamientos
contra el cáncer y otras enfermedades, los investigadores
biomédicos y químicos han diseñado, sintetizado y probado moléculas
que inhiben la función de las proteína cinasas. Algunas moléculas
orgánicas pequeñas forman una clase de compuestos que modulan la
función de las proteína cinasas. Ejemplos de moléculas que se han
descrito que inhiben la función de las proteínas cinasas son los
compuestos de arilo bis monocíclicos, bicíclicos o heterocíclicos
(patente internacional PCT WO 92/20642), derivados del
vinileno-azaindol (patente internacional PCT WO
94/14808),
1-ciclopropil-4-piridil-quinolonas
(patente de los EE. UU. n.º 5 330 992), compuestos de estirilo (por
Levitzki et al., patente de los EE. UU. n.º 5 217 999 y
titulada "Styryl compounds which inhibit EGF receptor protein
tyrosine kinase", Lyon & Lyon Docket n.º 208/050),
compuestos de piridilo sustituido con estirilo (patente de los EE.
UU. n.º 5 302 606), algunos derivados de la quinazolina (solicitud
de patente europea EP n.º 0 566 266 A1), selenoindoles y seleniuros
(patente internacional PCT WO 94/03427), compuestos polihidroxílicos
tricíclicos (patente internacional PCT WO 92/21660) y compuestos
del ácido bencilfosfónico (patente internacional PCT WO
91/15495).
Los compuestos que pueden atravesar las
membranas celulares y que son resistentes a la hidrólisis ácida son
fármacos potencialmente ventajosos ya que se hacen muy
biodisponibles después de haberse administrado oralmente a los
pacientes. Sin embargo, muchos de estos inhibidores de las proteína
cinasas sólo inhiben débilmente la función de las proteína cinasas.
Además, muchos inhiben numerosas proteína cinasas y, por lo tanto,
causarán muchos efectos secundarios si se usan como fármacos contra
enfermedades.
A pesar del avance significativo que se ha
realizado en el desarrollo de compuestos para el tratamiento del
cáncer, en la técnica sigue necesitándose identificar las
estructuras específicas y los patrones de sustitución que forman
los compuestos capaces de modular la función de determinadas
proteína cinasas.
La presente invención se refiere, en parte, a
los métodos para modular la función de las cinasas de proteínas con
serina o treonina con compuestos sobre la base de la
5-azaquinoxalina. Los métodos incorporan células
que expresan una cinasa de proteínas con serina o treonina, como la
RAF. Además, la invención describe métodos para prevenir y tratar,
en los organismos, los estados anormales relacionados con las
cinasas de proteínas con serina o treonina con un compuesto
identificado mediante los métodos descritos en la presente
invención. Además, la invención concierne a las composiciones
farmacéuticas que comprenden compuestos identificados por los
métodos de la invención.
Los métodos de la presente invención
proporcionan medios para modular la función de las cinasas de
proteínas con serina o treonina citosólicas y receptoras. Estos
métodos proporcionan medios para modular las enzimas tanto in
vitro como in vivo. Para las aplicaciones in
vitro, los métodos de la invención se refieren, en parte, al
método de identificar los compuestos que modulan la función de las
cinasas de proteínas con serina o treonina.
Así, en un primer aspecto, la invención ofrece
un método para modular la función de una cinasa de proteínas con
serina o treonina con un compuesto sobre la base del
azabencimidazol. El compuesto de azabencimidazol está opcionalmente
sustituido con grupos orgánicos. El método comprende poner en
contacto las células que expresan la cinasa de proteínas con serina
o treonina con el compuesto.
La terminología "función" se refiere al
papel celular de una cinasa de proteínas con serina o treonina. La
familia de las cinasas de proteínas con serina o treonina incluye
miembros que regulan muchas etapas de las cascadas de señalización,
entre ellas, las cascadas que controlan el crecimiento celular, la
migración, la diferenciación, la expresión génica, la contracción
muscular, el metabolismo de la glucosa, la síntesis de las
proteínas celulares y la regulación del ciclo celular.
La terminología "actividad catalítica", en
el contexto de la invención, define la velocidad a la que una
proteína cinasa fosforila un sustrato. La actividad catalítica se
puede medir, por ejemplo, determinando la cantidad de un sustrato
convertido a un producto en función del tiempo. La fosforilación de
un sustrato se produce en el sitio activo de una proteína cinasa.
El sitio activo normalmente es una cavidad en la que el sustrato se
une a la proteína cinasa y se fosforila.
La terminología "sustrato" tal y como se
usa en la presente invención se refiere a una molécula fosforilada
por una cinasa de proteínas con serina o treonina. El sustrato es,
preferiblemente, un péptido y, más preferiblemente, una proteína.
En relación con la proteína cinasa RAF, los sustratos preferidos son
MEK y MAPK, el sustrato de MEK.
La terminología "activa" se refiere a
aumentar la función celular de una proteína cinasa. La función de la
proteína cinasa es, preferiblemente, la interacción con un asociado
de unión natural y, más preferiblemente, la actividad
catalítica.
La terminología "inhibe" se refiere a
disminuir la función celular de una proteína cinasa. La función de
la proteína cinasa es, preferiblemente, la interacción con un
asociado de unión natural y, más preferiblemente, la actividad
catalítica.
La terminología "modula" se refiere a
alterar la función de una proteína cinasa aumentando o disminuyendo
la probabilidad de que se forme un complejo entre una proteína
cinasa y un asociado de unión natural. Un modulador preferiblemente
aumenta la probabilidad de que se forme tal complejo entre la
proteína cinasa y el asociado de unión natural dependiendo de la
concentración del compuesto expuesto a la proteína cinasa y, más
preferiblemente, disminuye la probabilidad de que se forme un
complejo entre la proteína cinasa y el asociado de unión natural.
Un modulador preferiblemente activa la actividad catalítica de una
proteína cinasa, más preferiblemente activa o inhibe la actividad
catalítica de una proteína cinasa dependiendo de la concentración
del compuesto expuesto a la proteína cinasa o, más preferiblemente,
inhibe la actividad catalítica de una proteína cinasa.
La terminología "complejo" se refiere al
ensamblaje de, al menos, dos moléculas que se unen la una a la otra.
A menudo, los complejos de transducción de señales contienen, al
menos, dos moléculas de proteínas unidas la una a la otra. Por
ejemplo, una proteína cinasa receptora de proteínas con tirosina,
GRB2, SOS, RAF y RAS se ensamblan para formar un complejo de
transducción de señales en respuesta a un ligando mitógeno.
La terminología "asociado de unión natural"
se refiere a los polipéptidos que se unen a una proteína cinasa en
las células. Los asociados de unión naturales pueden ser importantes
para propagar una señal en un proceso de transducción de señales
mediante proteína cinasas. Un cambio en la interacción entre una
proteína cinasa y un asociado de unión natural se puede manifestar
como un aumento o una disminución de la probabilidad de que se
forme la interacción, o como un aumento o una disminución de la
concentración del complejo entre la proteína cinasa y el asociado
de unión natural.
Un asociado de unión natural de las proteína
cinasas se puede unir a una región intracelular de la proteína
cinasa con gran afinidad. La gran afinidad representa una constante
de unión en equilibrio del orden de 10^{-6} M o menos. Además, un
asociado de unión natural puede interaccionar transitoriamente con
una región intracelular de una proteína cinasa y modificarla
químicamente. Los asociados de unión naturales de las proteína
cinasas se eligen de un grupo que incluye, pero sin limitarse a
ellos, dominios de homología SRC 2 (SH2) o 3 (SH3), otros dominios
de unión a fosforil-tirosinas (PTB), factores de
intercambio de nucleótidos de guanina, proteína fosfatasas y otras
proteína cinasas. Los métodos para determinar los cambios en las
interacciones entre las proteína cinasas y sus asociados de unión
naturales están disponibles fácilmente en la técnica.
La terminología "cinasa de proteínas con
serina o treonina" se refiere a una enzima con una secuencia de
aminoácidos con, al menos, una identidad de aminoácidos del 10% con
otras enzimas que fosforilan proteínas en restos de serina y
treonina. Una cinasa de proteínas con serina o treonina cataliza la
adición de fosfato sobre las proteínas en restos de serina y
treonina. Las cinasas de proteínas con serina o treonina pueden
existir como proteínas unidas a la membrana o proteínas
citosólicas.
La terminología "poner en contacto" tal y
como se utiliza en la presente memoria se refiere a mezclar una
disolución que comprende un compuesto de
5-azaquinoxalina de la invención con un medio
líquido que bañe las células de los métodos. La disolución que
comprende el compuesto también puede comprender otro componente,
como el dimetilsulfóxido (DMSO), que facilita la toma del compuesto
o los compuestos de 5-azaquinoxalina por las
células de los métodos. La disolución que comprende el compuesto de
5-azaquinoxalina se puede añadir al medio que baña
las células utilizando un aparato de dispensación, como un
dispositivo basado en una pipeta o un dispositivo basado en una
jeringuilla.
La terminología "compuesto sobre la base de la
5-azaquinoxalina" se refiere a un compuesto
orgánico de 5-azaquinoxalina sustituido con
sustituyentes químicos. Los compuestos de
5-azaquinoxalina son de la estructura general:
La terminología "sustituido", en referencia
a la invención, se refiere a un compuesto de
5-azaquinoxalina que se modifica con cualquier
número de sustituyentes químicos.
En una realización preferida, la invención se
refiere al método de modular la función de una cinasa de proteínas
con serina o treonina, en la que la proteína cinasa es la RAF.
La proteína cinasa RAF fosforila las dianas
proteicas en los restos de serina o treonina. Una diana proteica de
ésta es la proteína cinasa (MEK) que fosforila y, en consecuencia,
activa la proteína cinasa activada por mitógenos (MAPK). La propia
RAF es activada por la enzima unida a la membrana que hidroliza la
guanina-trifosfato, RAS, en respuesta a las
proteína tirosina cinasas receptoras estimuladas por mitógenos, como
el receptor del factor de crecimiento epidérmico (RFCE) y el
receptor del factor del crecimiento derivado de las plaquetas
(RFCDP).
Los métodos de la presente invención pueden
detectar compuestos que modulan la función de la proteína cinasa
RAF en las células. La RAF fosforila una proteína cinasa (MEK) que,
a su vez, fosforila la proteína cinasa activada por mitógenos
(MAPK). Los análisis que monitorizan sólo la fosforilación de la MEK
por la RAF no son sensibles porque los niveles de fosforilación de
la MEK no son significativos. Para superar este dilema de
sensibilidad, se sigue la fosforilación de la MEK y de la MAPK en
los análisis de la presente invención. La señal de fosforilación de
la MAPK amplifica la señal de fosforilación de la MEK y permite
seguir en los análisis la fosforilación dependiente de la RAF, como
el inmunoensayo enzimático. Además, el análisis de la invención se
realiza en un formato de gran producción de tal forma que se pueden
monitorizar muchos compuestos rápidamente en poco tiempo.
En otro aspecto, la invención describe un método
para identificar los compuestos que modulan la función de la cinasa
de proteínas con serina o treonina, que comprende las etapas de
poner en contacto las células que expresan la cinasa de proteínas
con serina o treonina con el compuesto y monitorizar un efecto sobre
las células.
La terminología "monitorizar" se refiere a
observar el efecto de añadir el compuesto a las células del método.
El efecto se puede manifestar por un cambio en el fenotipo celular,
la proliferación celular, la actividad catalítica de la proteína
cinasa, o en la interacción entre una proteína cinasa y un asociado
de unión natural.
La terminología "efecto" describe un cambio
o la ausencia de un cambio en el fenotipo celular o la proliferación
celular. "Efecto" también puede describir un cambio o la
ausencia de un cambio en la actividad catalítica de la proteína
cinasa. "Efecto" también puede describir un cambio o la
ausencia de un cambio en una interacción entre la proteína cinasa y
un asociado de unión natural.
Una realización preferida de la invención se
refiere al método para identificar los compuestos que modulan la
función de la cinasa de proteínas con serina o treonina, en la que
el efecto es un cambio o una ausencia de un cambio en el fenotipo
celular.
La terminología "fenotipo celular" se
refiere a una apariencia exterior de una célula o tejido o a la
función de la célula o el tejido. Ejemplos de fenotipo celular son
el tamaño celular (reducción o aumento de tamaño), proliferación
celular (aumento o disminución del número de células),
diferenciación celular (un cambio o una ausencia de un cambio en la
forma celular), supervivencia celular, apoptosis (muerte celular), o
la utilización de un nutriente metabólico (p. ej., captación de
glucosa). Los cambios o la ausencia de cambios en el fenotipo
celular se miden fácilmente mediante los métodos conocidos en la
técnica.
En otra realización preferida, la invención se
refiere al método de identificar compuestos que modulan la función
de la cinasa de proteínas con serina o treonina, en la que el efecto
es un cambio o una ausencia de un cambio en la proliferación
celular.
La terminología "proliferación celular" se
refiere a la velocidad a la que se divide un grupo de células. El
número de células en crecimiento en un recipiente lo puede calcular
una persona experta en la técnica cuando esa persona cuenta
visualmente el número de células en un volumen definido utilizando
un microscopio óptico común. Alternativamente, se pueden calcular
las velocidades de proliferación celular mediante un aparato de
laboratorio que mide por óptica o conducción la densidad de las
células en un medio adecuado.
En otra realización preferida, la invención se
refiere al método para identificar los compuestos que modulan la
función de la cinasa de proteínas con serina o treonina, en la que
el efecto es un cambio o una ausencia de un cambio en la
interacción entre la cinasa de proteínas con serina o treonina con
un asociado de unión natural.
La terminología "interacción", en el
contexto de la invención, describe un complejo formado entre una
región intracelular de una proteína cinasa y un asociado de unión
natural o compuesto. La terminología "interacción" también
puede extenderse a un complejo formado entre un compuesto de la
invención con regiones intracelulares y regiones extracelulares de
la proteína cinasa en estudio. Aunque una proteína cinasa citosólica
no tendrá ninguna región extracelular, una proteína cinasa
receptora albergará tanto una región extracelular como una región
intracelular.
La terminología "región intracelular" tal y
como se utiliza en la presente invención se refiere a la porción de
una proteína cinasa que se sitúa dentro de una célula. La
terminología "región extracelular" tal y como se utiliza en la
presente memoria se refiere a una porción de una proteína cinasa que
se sitúa fuera de la célula.
En una realización preferida, la invención se
refiere al método para identificar los compuestos que modulan la
función de la cinasa de proteínas con serina o treonina que, además,
comprende las siguientes etapas: a) lisar las células para dar un
lisado que comprende una cinasa de proteínas con serina o treonina,
b) adsorber la cinasa de proteínas con serina o treonina a un
anticuerpo, c) incubar la cinasa de proteínas con serina o treonina
adsorbida con un sustrato o sustratos y d) adsorber el sustrato o
sustratos a un soporte sólido o anticuerpo. La etapa de monitorizar
el efecto sobre las células comprende medir la concentración de
fosfato del sustrato o sustratos.
La terminología "lisar", tal y como se
utiliza en la presente memoria, se refiere a un método para romper
la integridad de un célula de tal manera que se libera el contenido
de su interior. La lisis celular se lleva a cabo mediante muchos
métodos que conocen las personas expertas en la técnica. El método
se lleva a cabo, preferiblemente, mediante sonicación o técnicas de
cizalla y, más preferiblemente, mediante técnicas con
detergentes.
La terminología "anticuerpo", tal y como se
utiliza en la presente memoria, se refiere a una molécula de
proteína que se une específicamente a una proteína cinasa. Un
anticuerpo se une, preferiblemente, a una clase de proteína cinasa
y, más preferiblemente, se une específicamente a la proteína cinasa
RAF.
La terminología "se une específicamente",
tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un
anticuerpo que se une a una proteína cinasa con mayor afinidad que
a otra proteína cinasa o proteína celular. Un anticuerpo que se une
específicamente a una proteína cinasa unirá una mayor concentración
de la proteína cinasa específica que de cualquier otra proteína
cinasa o proteína celular.
La terminología "adsorber", tal y como se
utiliza en la presente memoria, se refiere a la unión de una
molécula a la superficie de un anticuerpo o un soporte sólido.
Ejemplos de soportes sólidos son la celulosa modificada
químicamente, como la fosfocelulosa o el nilón. Se pueden unir
anticuerpos a soportes sólidos con las técnicas que conocen bien
las personas expertas en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlo y
Lane, Antibodies, a laboratory manual, 1989, Cold Spring
Harbor Laboratories.
La terminología "midiendo la concentración de
fosfato", tal y como se utiliza en la presente memoria, se
refiere a las técnicas que conocen habitualmente las personas
expertas en la técnica. Estas técnicas pueden implicar cuantificar
la concentración de las concentraciones de fosfato en un sustrato o
determinar las cantidades relativas de fosfato en un sustrato.
Estas técnicas pueden incluir adsorber el sustrato a una membrana y
detectar la cantidad de fosfato en el sustrato mediante mediciones
radioactivas.
En otra realización preferida, la invención se
refiere al método para identificar los compuestos que modulan la
función de la cinasa de proteínas con serina o treonina que, además,
comprende las siguientes etapas: a) lisar las células para dar un
lisado que comprende la RAF, b) adsorber la RAF a un anticuerpo, c)
incubar la RAF adsorbida con la MEK y la MAPK y d) adsorber la MEK
y la MAPK a un soporte sólido o anticuerpo o anticuerpos. La etapa
de medir el efecto sobre las células comprende monitorizar la
concentración de fosfato de dichas MEK y
MAPK.
MAPK.
En una realización preferida, la invención se
refiere al método para identificar los compuestos que modulan la
función de la cinasa de proteínas con serina o treonina, en la que
el compuesto sobre la base de la 5-azaquinoxalina
tiene una estructura expuesta en la fórmula I tal y como se define
en la presente memoria o cualquiera de los subgrupos de la misma
expuestos en la presente memoria.
La terminología "compuesto" se refiere al
compuesto o a una sal farmacéuticamente aceptable, éster, amida,
profármaco, isómero o metabolito, del mismo.
La terminología "sal farmacéuticamente
aceptable" se refiere a una formulación de un compuesto que no
anula la actividad biológica y las propiedades del compuesto. Se
pueden obtener sales farmacéuticas al hacer reaccionar un compuesto
de la invención con ácidos orgánicos o inorgánicos como ácido
clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico,
ácido fosfórico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido
p-toluenosulfónico, ácido salicílico y
similares.
La terminología "profármaco" se refiere a
un agente que se convierte en el fármaco original in vivo.
Los profármacos pueden ser más fáciles de administrar que el
fármaco original en algunas situaciones. Por ejemplo, el profármaco
puede estar biodisponible por administración oral pero el original
no, o el profármaco puede mejorar la solubilidad para permitir la
administración intravenosa.
En otra realización preferida, la invención se
refiere al método para identificar los compuestos que modulan la
función de la cinasa de proteínas con serina o treonina, en la que
el compuesto sobre la base de la 5-azaquinoxalina
tiene una estructura expuesta en la fórmula I, en la que el
compuesto sobre la base de la 5-azaquinoxalina se
selecciona del grupo que consiste en compuestos SAQAR.
La terminología "compuestos SAQAR" se
refiere al grupo de los compuestos sobre la base de
5-azaquinoxalina que tienen una estructura expuesta
en la fórmula I y enumerados de A-1 hasta
A-90 en la siguiente tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la invención ofrece un método
para prevenir o tratar un estado anormal en un organismo. El método
comprende las siguientes etapas: a) administrar un compuesto de la
invención, como se especifica en la presente memoria mediante la
fórmula I con cualquiera de las limitaciones proporcionadas en la
presente memoria, a un organismo y b) favorecer o interrumpir la
interacción anormal.
La terminología "organismo" se refiere a
cualquier entidad viva que comprende, al menos, una célula. Un
organismo puede ser tan simple como una célula eucariótica o tan
complejo como un mamífero. En las realizaciones preferidas, un
organismo se refiere a humanos o mamíferos.
La terminología "prevenir" se refiere al
método de la invención que reduce la probabilidad, o elimina la
posibilidad, de que un organismo contraiga o desarrolle el estado
anormal.
La terminología "tratar" se refiere al
método de la invención que tiene un efecto terapéutico y que, al
menos, alivia parcialmente o anula el estado anormal en el
organismo.
La terminología "efecto terapéutico" se
refiere a la inhibición del crecimiento celular que causa o
contribuye a un estado anormal (p. ej., cáncer). La terminología
"efecto terapéutico" también se refiere a la inhibición de los
factores de crecimiento que causan o contribuyen al estado anormal.
Un efecto terapéutico alivia hasta cierto punto uno o más de los
síntomas del estado anormal. En referencia al tratamiento de un
cáncer, un efecto terapéutico se refiere a uno o más de entre los
siguientes: a) una reducción del tamaño del tumor, b) inhibición (a
saber, enlentecimiento o detención) de la metástasis tumoral, c)
inhibición del crecimiento del tumor y d) alivio hasta cierto punto
de uno o más de los síntomas asociados con el estado anormal. Tal y
como se describe en la presente memoria, se pueden identificar
compuestos que resultan eficaces contra las leucemias, salvo que en
lugar de inhibir la metástasis, los compuestos, en cambio, pueden
enlentecer o reducir la proliferación celular o el crecimiento
celular.
La terminología "estado anormal" se refiere
a una función en las células o los tejidos de un organismo que se
desvía de sus funciones normales en ese organismo. Un estado anormal
se puede referir a proliferación celular, diferenciación celular o
supervivencia celular.
Los estados de proliferación celular aberrante
incluyen cánceres como trastornos fibróticos y mesangiales,
angiogenia y vasculogenia anormales, cicatrización, psoriasis,
diabetes mellitus e inflamación.
Los estados de diferenciación aberrante
incluyen, pero sin limitarse a ellos, trastornos neurodegenerativos,
velocidades lentas de cicatrización y técnicas de injerto de
tejidos.
Los estados de supervivencia celular aberrante
se refieren a los estados en los que se activan o se anulan las
vías de la muerte celular programada (apoptosis). Una serie de
proteína cinasas se encuentran asociadas a las vías de la
apoptosis. Las aberraciones de la función de una cualquiera de las
proteína cinasas podrían llevar a la inmortalidad celular o a la
muerte celular prematura.
La proliferación, diferenciación y supervivencia
celular son fenómenos que se miden simplemente mediante los métodos
de la técnica. Estos métodos pueden implicar observar el número de
células o la apariencia de células al microscopio en relación con
el tiempo (por ejemplo, días).
La terminología "administrar" se refiere
ampliamente a la provisión de un organismo y, más específicamente,
a un método para incorporar un compuesto en las células o los
tejidos de un organismo. Se puede prevenir o tratar el estado
anormal cuando las células o los tejidos del organismo existen
dentro del organismo o fuera del organismo. Las células que existen
fuera del organismo se pueden mantener o hacer crecer en placas de
cultivo celular. Para las células que residen dentro del organismo,
existen muchos métodos en la técnica para administrar compuestos,
incluidas (pero sin limitarse a ellas) las aplicaciones oral,
parenteral, dérmica, inyectable y con aerosol. Para las células de
fuera del organismo, existen muchos métodos en la técnica para
administrar los compuestos, incluidas (pero sin limitarse a ellas)
las técnicas de microinyección de células, las técnicas de
transformación y las técnicas transportadoras.
En una realización preferida, la invención se
refiere a un método para prevenir o tratar un estado anormal en un
organismo, en la que el compuesto sobre la base de la
5-azaquinoxalina tiene una estructura expuesta en
la fórmula I tal y como se define en la presente memoria o
cualquiera de los subgrupos de la misma expuestos en la presente
memoria.
En otras realizaciones preferidas, la invención
se refiere a un método para prevenir o tratar un estado anormal en
un organismo, en las que el compuesto sobre la base de la
5-azaquinoxalina, que tiene una estructura expuesta
en la fórmula I, se selecciona del grupo que consiste en compuestos
SAQAR.
En otra realización preferida, la invención se
refiere a un método para prevenir o tratar un estado anormal en un
organismo, en la que el organismo es un mamífero.
La terminología "mamífero" se refiere
preferiblemente a organismos tales como ratones, ratas, conejos,
conejillos de indias y cabras, más preferiblemente, a monos y
simios y, lo más preferiblemente, a humanos.
Aún en otra realización preferida, la invención
se refiere a un método para prevenir o tratar un estado anormal en
un organismo, en la que el estado anormal es un cáncer o un
trastorno fibrótico.
En otra realización preferida, la invención se
refiere a un método para prevenir o tratar un estado anormal en un
organismo, en la que el cáncer se selecciona del grupo que consiste
en carcinoma broncopulmonar, cáncer de ovario, cáncer de mama,
cáncer de cerebro, cáncer de cerebro intraaxial, cáncer de colon,
cáncer de próstata, sarcoma, sarcoma de Kaposi, melanoma y
glioma.
En otra realización preferida más, la invención
se refiere a un método para prevenir o tratar un estado anormal en
un organismo, en la que el método se aplica a un estado anormal
asociado con una aberración en una vía de transducción de señales
caracterizada por una interacción entre una cinasa de proteínas con
serina o treonina y un asociado de unión natural.
La terminología "vías de transducción de
señales" se refiere a la propagación de una señal. En general,
una señal extracelular se transmite a través de la membrana celular
para convertirse en una señal intracelular. Luego, esta señal puede
estimular una respuesta celular. La terminología también abarca las
señales que se propagan completamente dentro de una célula. Las
moléculas de polipéptidos implicadas en los procesos de transducción
de señales son, típicamente, proteínas cinasas receptoras y
proteínas cinasas no receptoras, proteínas fosfatasas receptoras y
proteínas fosfatasas no receptoras, factores de intercambio de
nucleótidos y factores de transcripción.
La terminología "aberración", junto con un
proceso de transducción de señales, se refiere a una proteína cinasa
que está sobre- o subexpresada en un organismo, mutada de tal
manera que su actividad catalítica es menor o mayor que la
actividad de la proteína cinasa de tipo salvaje, mutada de tal
manera que ya no puede interaccionar con un asociado de unión
natural, que ya no puede ser modificada por otra proteína cinasa o
proteína fosfatasa o que ya no interacciona con un asociado de
unión natural.
La terminología "que facilita o interrumpe la
interacción anormal" se refiere a un método que se puede realizar
administrando un compuesto de la invención a las células o tejidos
de un organismo. Un compuesto puede favorecer una interacción entre
una proteína cinasa y los asociados de unión naturales formando
interacciones favorables con muchos átomos en la interfaz del
complejo. Alternativamente, un compuesto puede inhibir una
interacción entre una proteína cinasa y los asociados de unión
naturales poniendo en peligro las interacciones favorables formadas
entre átomos en la interfaz del complejo. En otra realización
preferida, la invención se refiere a un método para prevenir o
tratar un estado anormal en un organismo, en el que la cinasa de
proteínas con serina o treonina es RAF.
En otro aspecto, la invención ofrece compuestos
de 5-azaquinoxalina que tienen las estructuras
expuestas en la fórmula I:
en la
que
- a)
- R_{1}, R_{2} y R_{6} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en
- i)
- hidrógeno;
- ii)
- alquilo saturado o insaturado;
- iii)
- una amina de fórmula NX_{2}X_{3}, en la que X_{2} y X_{3} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo saturado o insaturado y restos de anillo de heteroarilo o arilo de cinco o seis eslabones;
- iv)
- halógeno o trihalometilo;
- v)
- una cetona de fórmula -CO-X_{4}, en la que X_{4} se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo y restos arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones;
- vi)
- un ácido carboxílico de fórmula -(X_{5})_{n}-COOH o éster de fórmula -(X_{6})_{n}-COO-X_{7}, en la que X_{5}, X_{6} y X_{7} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo y restos arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones, y en las que n es 0 ó 1;
- vii)
- un alcohol de fórmula (X_{6})_{n}-OH o un resto alcoxi de fórmula -(X_{6})_{n}-O-X_{9}, en las que X_{8} y X_{9} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo saturado o insaturado y restos de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones, en las que el anillo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster, y en las que n es 0 ó 1;
- viii)
- una amida de la fórmula -NHCOX_{10}, en la que X_{10} se selecciona del grupo que consiste en alquilo, hidroxilo y restos de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones, en la que el anillo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes que se seleccionan independiente del grupo que consiste en alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro o éster;
- ix)
- -SO_{2}NX_{11}X_{12}, en la que X_{11} y X_{12} se seleccionan del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo y restos de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones;
- x)
- un resto de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en restos alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster;
- xi)
- un aldehído de fórmula -CO-H; y
- xii)
- una sulfona de fórmula -SO_{2}-X_{13}, en la que X_{13} se selecciona del grupo que consiste en alquilo saturado o insaturado y restos arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones; y
- b)
- X_{1} se selecciona del grupo que consiste en nitrógeno o azufre.
La terminología "alquilo saturado" se
refiere a un resto alquilo que no contiene ningún resto alqueno o
alquino. El resto alquilo puede estar ramificado o sin
ramificar.
La terminología "alquilo insaturado" se
refiere a un resto alquilo que contiene, al menos, un resto alqueno
o alquino. El resto alquilo puede estar ramificado o sin
ramificar.
La terminología "amina" se refiere a un
resto químico de la fórmula NR_{1}R_{2} en la que R_{1} y
R_{2} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en
hidrógeno, alquilo saturado o insaturado y restos de anillo de
arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones, en la que el anillo
está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes que se
seleccionan independientemente del grupo que consiste en restos
alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster.
La terminología "arilo" se refiere a un
grupo aromático que tiene, al menos, un anillo que tiene un sistema
de electrones pi conjugados y que incluye tanto grupos arilo
carbocíclico (p. ej., fenilo) como arilo heterocíclico (p. ej.,
piridina). La terminología "carbocíclico" se refiere a un
compuesto que contiene estructuras de uno más anillos cerrados
covalentemente, y en el que los átomos que forman el esqueleto del
anillo son todos átomos de carbono. Así, el término distingue los
anillos carbocíclicos de los anillos heterocíclicos en los que el
esqueleto del anillo contiene, al menos, un átomo que es diferente
del carbono. La terminología "hetero-arilo" se
refiere a un grupo arilo que contiene, al menos, un anillo
heterocíclico.
La terminología "halógeno" se refiere a un
átomo que se selecciona del grupo que consiste en flúor, cloro,
bromo y yodo.
La terminología "cetona" se refiere a un
resto químico con la fórmula
-(R)_{n}-CO-R', en la que R
y R' se seleccionan del grupo que consiste en alquilo saturado o
insaturado y restos de arilo o heteroarilo de cinco o seis
eslabones y en la que n es 0 ó 1.
La terminología "ácido carboxílico" se
refiere a un resto químico con la fórmula
-(R)_{n}-COOH, en la que R se selecciona
del grupo que consiste en alquilo saturado o insaturado y restos
arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones, y en la que n es 0 ó
1.
La terminología "éster" se refiere a un
resto químico con la fórmula
-(R)_{n}-COOR', en la que R y R' se
seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo
saturado o insaturado y restos arilo o heteroarilo de cinco o seis
eslabones, y en la que n es 0 ó 1.
La terminología "alcohol" se refiere a un
sustituyente químico de fórmula -ROH, en la que R se selecciona del
grupo que consiste en hidrógeno, alquilo saturado o insaturado y
restos de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones,
en la que el anillo está opcionalmente sustituido con uno o más
sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que
consiste en restos alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato,
nitro y
éster.
éster.
La terminología "amida" se refiere a un
sustituyente químico de fórmula -NHCOR, en la que R se selecciona
del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, hidroxilo y restos de
anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones, en la que
el anillo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes
que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en
alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro o éster.
La terminología "resto alcoxi" se refiere a
un sustituyente químico de fórmula -OR, en la que R es hidrógeno o
un resto alquilo saturado o insaturado.
La terminología "aldehído" se refiere a un
resto químico con la fórmula -(R)_{n}-CHO,
en la que R se selecciona del grupo que consiste en alquilo
saturado o insaturado y resto arilo o heteroarilo de cinco o seis
eslabones y en la que n es 0 ó 1.
La terminología "sulfona" se refiere a un
resto químico con la fórmula -SO_{2}-R, en la que
R se selecciona del grupo que consiste en alquilo saturado o
insaturado y restos arilo o heteroarilo de cinco o seis
eslabones.
\newpage
En otra realización preferida, la invención se
refiere a un compuesto sobre la base de la
5-azaquinoxalina que tiene una estructura expuesta
en la fórmula I, en la que R_{3} y R_{4} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo
saturado o insaturado.
En otra realización preferida más, la invención
se refiere a un compuesto sobre la base de la
5-azaquinoxalina que tiene una estructura expuesta
en la fórmula I, en la que R_{3} y R_{4} son hidrógeno.
En otras realizaciones preferidas, la invención
se refiere a un compuesto sobre la base de la
5-azaquinoxalina que tiene una estructura expuesta
en la fórmula I, en la que R_{1} y R_{2} se seleccionan del
grupo que consiste en hidrógeno, alquilo saturado o insaturado, un
resto de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones
opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes que se
seleccionan independientemente del grupo que consiste en los restos
alquilo, halógeno, trihalometilo, hidroxi, alcoxi, carboxilato,
nitro y éster.
En otras realizaciones preferidas más, la
invención se refiere a un compuesto sobre la base de la
5-azaquinoxalina que tiene una estructura expuesta
en la fórmula I, en la que R_{1} es fenilo opcionalmente
sustituido con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en restos alquilo,
halógeno, hidroxi y alcoxi.
En otra realización preferida, la invención se
refiere a un compuesto sobre la base de la
5-azaquinoxalina que tiene una estructura expuesta
en la fórmula I, en la que R_{1} es fenilo.
En otra realización preferida más, la invención
se refiere a un compuesto sobre la base de la
5-azaquinoxalina que tiene una estructura expuesta
en la fórmula I, en la que R_{1} es
4-hidroxifenilo.
En otras realizaciones preferidas, la invención
se refiere a un compuesto sobre la base de la
5-azaquinoxalina que tiene una estructura expuesta
en la fórmula I, en la que R_{2} se selecciona del grupo que
consiste en hidrógeno, alquilo saturado o insaturado, y fenilo
opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes que se
seleccionan independientemente del grupo que consiste en restos
alquilo, halógeno, hidroxi y alcoxi.
En otra realización preferida, la invención se
refiere a un compuesto sobre la base de la
5-azaquinoxalina que tiene una estructura expuesta
en la fórmula I, en la que R_{2} es hidrógeno.
En otra realización preferida más, la invención
se refiere a un compuesto sobre la base de la
5-azaquinoxalina que tiene una estructura expuesta
en la fórmula I, en la que R_{2} es metilo.
En otra realización preferida más, la invención
se refiere a un compuesto sobre la base de la
5-azaquinoxalina que tiene una estructura expuesta
en la fórmula I, en la que R_{2} es fenilo.
En otra realización preferida, la invención se
refiere a un compuesto sobre la base de la
5-azaquinoxalina que tiene una estructura expuesta
en la fórmula I, en la que X_{1} es nitrógeno. En otras
realizaciones preferidas, la invención se refiere a un compuesto
sobre la base de la 5-azaquinoxalina que tiene una
estructura expuesta en la fórmula I, en la que R_{6} se
selecciona del grupo que consiste en hidrógeno; alquilo saturado o
insaturado opcionalmente sustituido con un resto de anillo de arilo
o heteroarilo de cinco o seis eslabones opcionalmente sustituido
con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en restos alquilo,
halógeno, trihalometilo, hidroxi, alcoxi, carboxilato, nitro y
éster; y un resto de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis
eslabones opcionalmente sustituido con uno, dos o tres
sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que
consiste en restos alquilo, halógeno, trihalometilo, hidroxi,
alcoxi, carboxilato, nitro y éster.
En otras realizaciones preferidas más, la
invención se refiere a un compuesto sobre la base de la
5-azaquinoxalina que tiene una estructura expuesta
en la fórmula I, en la que los restos R_{6} y X_{1} juntos
forman un compuesto que se selecciona del grupo que consiste en
sustituyentes SAQAR.
La terminología "sustituyentes SAQAR" se
refiere al grupo de sustituyentes que consiste en bencilamino,
4-fluorobencilamino,
2-carboxibencilamino,
3-carboxibencilamino,
4-carboxibencilamino,
2-nitrobencilamino,
3-nitrobencilamino,
9-nitrobencilamino,
2-metilbencilamino,
3-metilbencilamino,
4-metilbencilamino,
2-clorobencilamino,
3-clorobencilamino,
4-clorobencilamino,
2-fluorobencilamino,
3-fluorobencilamino,
4-fluorobencilamino,
2-(trifluorometil)bencilamino,
3-(trifluorometil)bencilamino,
4-(trifluorometil)bencilamino,
fenetil-1-amino, fenilamino,
2-carboxifenilamino,
3-carboxifenilamino,
4-carboxifenilamino,
2-nitrofenilamino,
3-nitrofenilamino,
4-nitrofenilamino,
2-metilfenilamino,
3-metilfenilamino,
4-metilfenilamino,
2-clorofenilamino,
3-clorofenilamino,
4-clorofenilamino,
2-fluorofenilamino,
3-fluorofenilamino,
4-fluorofenilamino,
2-(trifluorometil)fenilamino,
3-(trifluorometil)fenilamino,
4-(trifluorometil)fenilamino,
pirid-2-amino,
pirid-3-amino,
pirid-4-amino y
pirid-2-metilamino.
\newpage
La terminología "bencilamino" se refiere a
un grupo que tiene una estructura expuesta en la siguiente
fórmula:
en la que el anillo de arilo puede
estar opcionalmente sustituido en la posición 2, 3 ó
4.
La terminología "fenilamino" se refiere a
un grupo que tiene una estructura expuesta en la siguiente
fórmula:
en la que el anillo de arilo puede
estar opcionalmente sustituido en la posición 2, 3 ó
4.
La terminología
"fenetil-1-amino" se refiere a
un grupo que tiene una estructura expuesta en la siguiente
fórmula:
La terminología
"pirid-2-amino" se refiere a un
anillo de piridina que está sustituido con un grupo NH en la
posición 2. De forma similar, las terminologías
"pirid-3-amino" y
"pirid-4-amino" se refieren a
un anillo de piridina que está sustituido con un grupo NH en las
posiciones 3 y 4, respectivamente.
Aún en otra realización preferida, la invención
se refiere a un compuesto sobre la base de la
5-azaquinoxalina que tiene una estructura expuesta
en la fórmula I, en la que el compuesto sobre la base de la
5-azaquinoxalina se selecciona del grupo que
consiste en compuestos SAQAR.
En otro aspecto, la invención ofrece una
composición farmacéutica que comprende un compuesto que tiene una
estructura de la fórmula I tal y como se define en la presente
memoria o cualquiera de los subgrupos de la misma expuestos en la
presente memoria, o su sal y un excipiente o diluyente
fisiológicamente aceptable.
En una realización preferida, la invención se
refiere a una composición farmacéutica, en la que el compuesto
sobre la base de la 5-azaquinoxalina se selecciona
del grupo que consiste en compuestos SAQAR.
La terminología "composición farmacéutica"
se refiere a una mezcla de un compuesto de
5-azaquinoxalina de la invención con otros
componentes químicos, como diluyentes o excipientes. La composición
farmacéutica facilita la administración del compuesto a un
organismo. Existen muchos métodos en la técnica para administrar un
compuesto incluidos, pero sin limitarse a ellos, la administración
oral, inyectada, con aerosol, parenteral y tópica. También se
pueden obtener composiciones farmacéuticas haciendo reaccionar los
compuestos con ácidos inorgánicos como ácido clorhídrico, ácido
bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido
metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido
p-toluenosulfónico, ácido salicílico y
similares.
La terminología "fisiológicamente
aceptable" define un excipiente o diluyente que no anula la
actividad biológica ni las propiedades del compuesto.
La terminología "excipiente" define un
compuesto químico que facilita la incorporación de un compuesto en
las células o tejidos. Por ejemplo, el dimetilsulfóxido (DMSO) es un
excipiente utilizado habitualmente, ya que facilita la captación de
muchos compuestos orgánicos en las células o los tejidos de un
organismo.
La terminología "diluyente" define los
compuestos químicos diluidos en agua que disolverán el compuesto de
interés además de estabilizar la forma biológicamente activa del
compuesto. En la técnica, se utilizan sales disueltas en
disoluciones tamponadas como diluyentes. Una disolución tamponada
utilizada habitualmente es la disolución salina tamponada con
fosfato porque imita las condiciones salinas de la sangre humana.
Dado que las sales tamponantes pueden controlar el pH de una
disolución a concentraciones bajas, un diluyente tamponado rara vez
modifica la actividad biológica de un compuesto.
Aún en otro aspecto, la invención ofrece un
método para sintetizar un compuesto de la invención, que comprende
las etapas de: a) hacer reaccionar la
2-amino-6-cloro-3-nitropiridina
con un segundo reactivo en un disolvente y en presencia de una
base, en la que el segundo reactivo se selecciona del grupo que
consiste en un alcohol y una amina para producir el primer
intermediario, b) hacer reaccionar el primer intermediario con una
1,2-diona en presencia de un catalizador y de un
reductor y c) purificar el producto final.
La terminología "1,2-diona"
se refiere a un resto químico de fórmula
R_{1}-C(O)C(O)-R_{2},
en la que R_{1} y R_{2} se seleccionan independientemente del
grupo que consiste en hidrógeno, alquilo saturado o insaturado
opcionalmente sustituido con un resto de anillo de arilo o
heteroarilo de cinco o seis eslabones opcionalmente sustituido con
uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente
del grupo que consiste en restos alquilo, halógeno, trihalometilo,
hidroxi, alcoxi, carboxilato, nitro y éster; y un resto de anillo
de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones opcionalmente
sustituido con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en restos alquilo,
halógeno, trihalometilo, hidroxi, alcoxi, carboxilato, nitro y
éster.
En una realización preferida, la invención se
refiere al método para sintetizar un compuesto de la invención en
la que el disolvente es n-butanol.
En otra realización preferida, la invención se
refiere al método para sintetizar un compuesto de la invención en
la que la base es carbonato de potasio en polvo.
Aún en otra realización preferida, la invención
se refiere al método para sintetizar un compuesto de la invención
en la que el segundo reactivo se selecciona del grupo que consiste
en reactivos SAQAR.
La terminología "reactivos SAQAR" se
refiere al grupo de reactivos que consiste en bencilamino,
4-fluorobencilamino,
2-carboxibencilamino,
3-carboxibencilamino,
4-carboxibencilamino,
2-nitrobencilamino,
3-nitrobencilamino,
4-nitrobencilamino,
2-metilbencilamino,
3-metilbencilamino,
4-metilbencilamino,
2-clorobencilamino,
3-clorobencilamino,
4-clorobencilamino,
2-fluorobencilamino,
3-fluorobencilamino,
4-fluorobencilamino,
2-(trifluorometil)bencilamino,
3-(trifluorometil)bencilamino,
4-(trifluorometil)bencilamino,
fenetil-1-amina, anilina,
2-carboxianilina, 3-carboxianilina,
4-carboxianilina, 2-nitroanilina,
3-nitroanilina, 4-nitroanilina,
2-toluidina, 3-toluidina,
4-toluidina, 2-cloroanilina,
3-cloroanilina, 4-cloroanilina,
2-fluoroanilina, 3-fluoroanilina,
4-fluoroanilina, 2-(trifluorometil)anilina,
3-(trifluorometil)anilina, 4-(trifluorometil)anilina,
2-aminopiridina, 3-aminopiridina,
4-aminopiridina y
2-metilaminopiridina.
En otra realización preferida más, la invención
se refiere al método para sintetizar un compuesto de la invención
en la que el tercer reactivo se selecciona del grupo que consiste en
4-hidroxifenilglioxal,
1-fenil-1,2-propanodiona
y bencilo.
La terminología "catalizador", tal y como
se utiliza en la presente memoria, se refiere a una molécula química
que, cuando se añade a un grupo de reactivos, puede aumentar la
velocidad a la que reaccionan los reactivos para formar los
productos. Los expertos en la técnica conocen bien muchos tipos de
catalizadores.
En una realización preferida, la invención se
refiere a los métodos para sintetizar los compuestos de la
invención, en la que el agente reductor es hidrógeno.
En otra realización preferida, la invención se
refiere a los métodos para sintetizar compuestos de la invención,
en la que el catalizador es níquel de Raney.
El compendio de la invención descrito
anteriormente no es limitante, y otras características y ventajas de
la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente
descripción de las realizaciones preferidas, y a partir de las
reivindicaciones.
La presente invención se refiere, en parte, a
los métodos para modular la función de las cinasas de proteínas con
serina o treonina con compuestos sobre la base de la
5-azaquinoxalina. Además, la invención se refiere,
en parte, a los métodos para identificar los compuestos que modulan
la función de las cinasas de proteínas con serina o treonina. Los
métodos incorporan células que expresan una cinasa de proteínas con
serina o treonina, como la RAF.
La RAF es una proteína cinasa no receptora que
se incorpora a la membrana celular cuando se une a la RAS activada,
una enzima que hidroliza guanina-trifosfato. La RAS
se activa cuando una proteína tirosina-cinasa
receptora, como el RFCE o el RFCDP, se une a una proteína
adaptadora, la GRB2, y a un factor de intercambio de nucleótidos de
guanina, el SOS. El SOS retira la guanina-difosfato
de la RAS, la reemplaza con una guanina-trifosfato
y, por lo tanto, activa la RAS. Luego, la RAS se une a la RAF y, en
consecuencia, activa la RAF. Luego, la RAF puede fosforilar otras
dianas proteicas en los restos de serina o treonina, como la cinasa
(MEK) que fosforila y, en consecuencia, activa la proteína cinasa
activada por mitógenos (MAPK). Así, la RAF sirve como un factor
controlador intermediario en la transducción de señales activada por
mitógenos.
Debido al importante papel regulador de la RAF
en las células, las modificaciones de la secuencia de aminoácidos
de la RAF pueden alterar su función y, por consiguiente, modificar
su comportamiento celular. El papel de la RAF en la proliferación
celular se pone de manifiesto por la observación de que las
mutaciones en la secuencia de aminoácidos de la RAF se han asociado
con tumores y cánceres. Dado que las mutaciones en la RAF que hacen
surgir el cáncer en las células lleva a que las moléculas de la RAF
muestren una actividad catalítica no regulada, los inhibidores de
la RAF pueden aliviar o incluso anular la proliferación celular que
conduce al cáncer en estas células.
Los métodos de la presente invención pueden
detectar compuestos que modulan la función de la proteína cinasa
RAF en las células. La RAF fosforila una proteína cinasa (MEK) que,
a su vez, fosforila la proteína cinasa activada por mitógenos
(MAPK). Los análisis que monitorizan solamente la fosforilación de
la MEK por la RAF no son sensibles porque los niveles de
fosforilación de la MEK no son significativos. Para solventar este
dilema de sensibilidad, se sigue la fosforilación de la MEK y la
MAPK en los análisis de la presente invención. La señal de
fosforilación de la MAPK amplifica la señal de fosforilación de la
MEK y permite seguir la fosforilación dependiente de la RAF en
inmunoensayos enzimáticos. Además, el análisis de la invención se
realiza preferiblemente en un formato de gran producción de tal
manera que se puedan monitorizar muchos compuestos rápidamente en
un breve periodo.
Los métodos de la presente invención han
identificado compuestos que inhiben la función de la proteína cinasa
RAF. Estos compuestos consisten en derivados sobre la base de la
5-azaquinoxalina. Aunque se ha analizado la
capacidad para inhibir las enzimas de la síntesis de nucleótidos en
las bacterias que tienen los derivados basados en la
5-azaquinoxalina, muchos de estos compuestos todavía
no se han investigado significativamente en relación con la
inhibición de las proteína cinasas.
Dado que la RAF muestra una homología de
aminoácidos significativa con otras cinasas de proteínas con serina
o treonina, los compuestos de la invención sobre la base de la
5-azaquinoxalina probablemente puedan inhibir las
cinasas de proteínas con serina o treonina diferentes a la RAF. Así,
los métodos de la invención también se refieren a las cinasas de
proteínas con serina o treonina diferentes a la RAF, incluidas las
cinasas de proteínas con serina o treonina receptoras y no
receptoras.
Los métodos de la invención también conciernen a
otros compuestos que modulan la función de la RAF en las células ya
que la característica de gran producción de los métodos permite que
se prueben un amplio abanico de moléculas en poco tiempo. Por lo
tanto, los métodos de la invención pueden identificar moléculas
existentes no descritas en la presente invención que modulan la
función de la RAF.
Se comprobó la capacidad para inhibir la función
de la proteína cinasa RAF que poseen los compuestos de la presente
invención sobre la base de la 5-azaquinoxalina. En
la presente memoria se describen los análisis biológicos y los
resultados de estos estudios de inhibición. Los métodos utilizados
para medir la modulación de la función de la proteína cinasa que
tienen los compuestos sobre la base de la
5-azaquinoxalina son similares a los descritos en
la solicitud de los EE. UU. de n.º de serie 08/702 232, de Tang
et al., y titulada "Indolinone combinatorial libraries and
related products and methods for the treatment of disease", (Lyon
y Lyon Docket n.º 221/187), registrada el 23 de agosto de 1996, en
relación con la característica de gran producción del método. La
solicitud 08/702 232 se incorpora en la presente memoria por
referencia en su totalidad, incluidas las figuras.
Los métodos, compuestos y composiciones
farmacéuticas descritos en la presente memoria están diseñados para
inhibir los trastornos de proliferación celular mediante la
modulación de la función de la proteína cinasa RAF. Los trastornos
de proliferación dan lugar a una proliferación celular no deseada de
uno o más subgrupos de células en un organismo pluricelular, lo que
daña el organismo. Los métodos, compuestos y composiciones
farmacéuticas descritos en la presente invención también pueden ser
útiles para tratar y prevenir otros trastornos en los organismos,
como los trastornos relacionados con la muerte celular prematura (a
saber, enfermedades neurológicas) o la inflamación. Estos
trastornos pueden deberse a moléculas de la RAF que funcionan
inadecuadamente o ser el resultado de moléculas de proteínas
cinasas relacionadas con la RAF que funcionan de manera
inadecuada.
Las alteraciones de la función de la proteína
cinasa RAF o de las proteína cinasas relacionadas con la RAF pueden
conducir a un aumento o un descenso de los estados de proliferación
celular evidentes en algunas enfermedades. Los estados de
proliferación celular aberrante incluyen cánceres, trastornos
fibróticos, trastornos mesangiales, angiogenia y vasculogenia
anormales, cicatrización, psoriasis, restenosis e inflamación.
Los trastornos fibróticos se refieren a la
formación anormal de la matriz extracelular de la célula. Un ejemplo
de un trastorno fibrótico es la cirrosis hepática. La cirrosis
hepática se caracteriza por un aumento de la concentración de los
constituyentes de la matriz extracelular, lo que da lugar a la
formación de una cicatriz hepática. La cirrosis hepática puede
causar enfermedades como la cirrosis del hígado.
Los trastornos de proliferación de las células
mesangiales se producen debido a la proliferación anormal de las
células mesangiales. Los trastornos de proliferación mesangial
incluyen varias enfermedades renales humanas, como la
glomerulonefritis, la nefropatía diabética, la nefroesclerosis
maligna, los síndromes de microangiopatía trombótica, el rechazo de
trasplante y las glomerulopatías.
Los tipos preferidos de cánceres que se pueden
tratar con los métodos y los compuestos de la invención son el
carcinoma broncopulmonar, el cáncer de ovarios, el cáncer de mama,
el cáncer de cerebro, el cáncer de cerebro intraaxial, el cáncer de
colon, el cáncer de próstata, el sarcoma de Kaposi, el melanoma y el
glioma. En la presente memoria se proporcionan por referencia las
pruebas de que los compuestos y los métodos de la invención se
pueden utilizar eficazmente para reducir y revertir la proliferación
de las células cancerosas.
Los trastornos angiógenos y vasculógenos son el
resultado de una excesiva proliferación de los vasos sanguíneos. La
proliferación de los vasos sanguíneos es necesaria en numerosos
procesos fisiológicos normales tales como el desarrollo
embrionario, la formación del cuerpo lúteo, la cicatrización y la
regeneración de órganos. Sin embargo, la proliferación de los vasos
sanguíneos también es esencial en el desarrollo del tumor canceroso.
Otros ejemplos de trastornos de proliferación de los vasos
sanguíneos incluyen la artritis, en la que los vasos sanguíneos
capilares nuevos invaden la articulación y destruyen el cartílago.
Además, las enfermedades de proliferación de los vasos sanguíneos
incluyen enfermedades oculares, como la retinopatía diabética, en
la que nuevos capilares en la retina invaden el cuerpo vítreo,
sangran y causan ceguera. Y al revés, los trastornos relacionados
con la reducción, contracción y la oclusión de los vasos sanguíneos,
como la restenosis, también están implicados en la regulación
adversa de las proteína cinasas.
Además, la vasculogenia y la angiogenia están
asociadas con el crecimiento de tumores sólidos malignos y la
metástasis. Un tumor canceroso que crece vigorosamente requiere un
riego sanguíneo rico en nutrientes y oxígeno para continuar
creciendo. Como consecuencia, a menudo, una cantidad anormalmente
grande de vasos sanguíneos capilares crecen conjuntamente con el
tumor y actúan como líneas de suministro al tumor. Además, para
aportar nutrientes al tumor, los nuevos vasos sanguíneos integrados
en un tumor proporcionan una puerta por la que las células
tumorales entran en circulación y metastatizan hasta posiciones
lejanas en el organismo. Folkman, 1990, J. Natl. Cancer.
Inst. 82: 4-6.
La actividad inadecuada de la RAF puede
estimular los trastornos de proliferación celular. Se ha demostrado
que las moléculas específicamente diseñadas para modular la función
de la proteína cinasa RAF inhiben la proliferación celular.
Específicamente, las moléculas de ácidos nucleicos antisentido, que
están diseñadas tanto para unirse al ARN mensajero que codifica la
proteína cinasa RAF como para bloquear la traducción de ese mensaje,
revirtieron de manera eficaz la transformación de células A549
in vitro. Monia et al., 1996, Nature Medicine
2: 688, incorporada en la presente memoria por referencia en su
totalidad, incluidas todas las figuras y tablas. Las células A549
son células malignas humanas.
Estos estudios con antisentidos dirigidos
específicamente sobre la RAF prueban que las moléculas derivadas de
la 5-azaquinoxalina de la invención, que modulan la
función de la proteína cinasa RAF, pueden reducir, y probablemente
revertir, la proliferación de las células malignas en un organismo.
Estos compuestos de 5-azaquinoxalina se pueden
probar en los métodos in vitro que se proporcionan en la
presente memoria mediante ejemplos. Además, se puede comprobar el
efecto que los compuestos de 5-azaquinoxalina tienen
sobre células tumorales in vivo mediante los métodos de
xenoinjertos que también se proporcionan en la presente memoria
mediante ejemplos.
Existen, al menos, dos formas en las que la
actividad inadecuada de la RAF puede estimular la proliferación
celular indeseable de un determinado tipo de células: 1) estimulando
directamente el crecimiento de una determinada célula o 2)
aumentando la vascularización de una determinada zona, como un
tejido tumoral, por lo que se facilita el crecimiento del
tejido.
El uso de la presente invención se facilita si
primero se identifica de si el trastorno de proliferación celular
está originado por la RAF. Una vez que se han identificado estos
trastornos, se pueden identificar los pacientes que padecen este
trastorno mediante el análisis de sus síntomas utilizando
procedimientos que los médicos o los veterinarios expertos en la
técnica conocen bien. Luego, se pueden tratar a estos pacientes como
se describe en la presente memoria.
La determinación de si el trastorno de
proliferación celular está originado por la RAF se puede llevar a
cabo, primero, determinando el nivel de actividad de la RAF que se
produce en la célula o en una localización determinada del cuerpo
de un paciente. Por ejemplo, en el caso de las células cancerosas,
se puede comparar el nivel de las actividades de una o más RAF con
los cánceres no originados por la RAF y los cánceres originados por
la RAF. Si las células cancerosas tiene un mayor nivel de actividad
RAF que los cánceres originados por la RAF, preferiblemente igual o
mayor que la de los cánceres originados por la RAF, entonces se
pueden tratar con los métodos y los compuestos descritos en la
invención que modulan la RAF.
En el caso de los trastornos de proliferación
celular que surgen debido a la proliferación indeseable de células
no cancerosas, el nivel de la actividad de la RAF se compara con el
nivel que se produce en la población general (p. ej., el nivel
medio que se produce en la población general de personas o animales,
excluidas aquellas personas o animales que padecen un trastorno de
proliferación celular). Si el trastorno de proliferación celular
indeseable se caracteriza por un mayor nivel de la RAF que el que se
produce en la población general, entonces el trastorno se puede
tratar con los métodos y los compuestos descritos en la invención
que modulan la RAF.
Los métodos para preparar formulaciones
farmacéuticas de los compuestos, los métodos para determinar la
cantidad de los compuestos a administrar a un paciente y las
maneras de administrar los compuestos en un organismo se describen
en la solicitud de los EE. UU. de n.º de serie 08/702 232, de Tang
et al., y titulada "Indolinone combinatorial libraries and
related products and methods for the treatment of disease", (Lyon
y Lyon, Docket n.º 221/187), registrada el 23 de agosto de 1996, y
en la publicación de patente internacional WO n.º 96/22976, de
Buzzetti et al., y titulada "Hydrosoluble
3-arylidene-2-oxindole
derivatives as tyrosine kinase inhibitors", publicada el 1 de
agosto de 1996, las cuales se incorporan en la presente memoria por
referencia en su totalidad, incluidas las figuras. Los expertos en
la técnica apreciarán que estas descripciones son aplicables a la
presente invención y que se pueden adaptar fácilmente a ésta.
Los ejemplos siguientes no son limitantes y son
simplemente representativos de varios aspectos y características de
la presente invención. Los ejemplos describen métodos para
sintetizar los compuestos de la invención y métodos para medir un
efecto de un compuesto sobre la función de la proteína cinasa
RAF.
Las células utilizadas en los métodos están
comercialmente disponibles. También están comercialmente disponibles
los vectores de ácido nucleico albergados por las células, y se
puede acceder rápidamente a las secuencias de los genes de varias
proteínas cinasas en las bases de datos de secuencias. Así, una
persona experta en la técnica puede recrear fácilmente las estirpes
celulares de una manera oportuna al combinar las células
disponibles comercialmente, los vectores de ácido nucleico
disponibles comercialmente y los genes de las proteína cinasas
utilizando las técnicas fácilmente disponibles para las personas
expertas en la técnica.
Ejemplo
1
A continuación, se ilustrará la invención con
los siguientes ejemplos no limitantes en los que, a menos que se
mencione de otra manera:
- i)
- se realizaron las evaporaciones mediante evaporación con rotación al vacío;
- ii)
- se realizaron las operaciones en una atmósfera de un gas inerte como el nitrógeno;
- iii)
- se realizó la cromatografía líquida de gran resolución (HPLC) en sílice de fase invertida Merk LiChrosorb RP-18 obtenido de E. Merck, Darmstadt, Alemania;
- iv)
- se dan los rendimientos sólo para ilustrar y no son necesariamente lo máximo alcanzable;
- v)
- los puntos de fusión están sin corregir y se determinaron utilizando un aparato de puntos de fusión digital HWS Mainz SG 2000;
- vi)
- se confirmaron las estructuras de todos los compuestos de la fórmula (I) de esta invención mediante espectroscopia de resonancia magnética de protones sobre un espectrofotómetro Bruker AMX500-NMR, mediante microanálisis elemental y, en algunos casos, mediante espectroscopia de masas;
- vii)
- se realizó la pureza de las estructuras mediante cromatografía en capa fina (TLC) utilizando gel de sílice (Merck Silica Gel 60 F254) o mediante HPLC; y
- viii)
- generalmente, no se caracterizaron del todo los intermediarios, y se evaluó la pureza mediante cromatografía en capa fina (TLC) o mediante HPLC.
Compuesto
A-2
Se preparó el
4-hidroxifenilglioxal a partir de la
4-hidroxiacetofenona (Lancaster, Acros) de acuerdo
con el método publicado [J. Amer. Chem. Soc. 71, 1045
(1949)].
\newpage
Se preparó la
2-amino-6-bencilamino-3-nitropiridina
a partir de la
2-amino-6-cloro-3-nitropiridina
tal y como sigue: se calentaron
2-amino-6-cloro-3-nitropiridina
(17,35 g, 0,10 mol), bencilamina (Fluka) (10,72 g, 0,10 mol) y
carbonato de potasio en polvo (10,4 g, 0,035 mmol) en
n-butanol (100 mol) a reflujo durante 2 horas. Se
filtró la suspensión y, después de enfriarla a temperatura ambiente,
se recogió el sólido por filtración, se lavó con butanol y se secó
a 50ºC al vacío para dar la
2-amino-6-bencilamino-3-nitropiridina
(22,2 g, 91%, p. f. 145 a 146ºC).
Se preparó la
6-bencilamino-3-(4-hidroxifenil)-5-azaquinoxalina
a partir de la
2-amino-6-bencilamino-3-nitropiridina
tal y como sigue: se hidrogenó la
2-amino-6-bencilamino-3-nitropiridina
(25 g, 0, 10 mol) a 5,5 bar de H_{2} en presencia de 10 g de
Raney-Ni en 400 ml de dioxano a 60ºC. Después de 2
horas, se enfrió la mezcla de reacción a temperatura ambiente, se
filtró, se añadió el 4-hidroxifenilglioxal y se
agitó durante 2 horas en una atmósfera de argón. Luego, se diluyó
la suspensión con agua, se recogió el sólido mediante filtración,
se lavó con agua, se retrocristalizó de 2-propanol,
y se secó a 50ºC al vacío para dar la
6-bencilamino-3-(4-hidroxifenil)-5-azaquinoxalina
(8 g, 24,4%, p. f. 271 a 273ºC).
Compuesto
A-1
Al sustituir la bencilamina por fenilamina en el
procedimiento para el compuesto A-2, el mismo
procedimiento da la
6-fenilamino-3-(4-hidroxifenil)-5-azaquinoxalina.
Compuesto
A-5
Al sustituir el
4-hidroxifenilglioxal por la
1-fenil-1,2-propanodiona
y la bencilamina por la 4-fluorobencilamina en el
procedimiento para el compuesto A-2, el mismo
procedimiento da la
6-(4-fluorobencilamino)-2-metil-3-fenil-5-azaquinoxalina.
Compuesto
A-6
Al sustituir el
4-hidroxifenilglioxal por bencilo y la bencilamina
por la 4-fluorobencilamina en el procedimiento para
el compuesto A-2, el mismo procedimiento da la
2,3-difenil-6-(4-fluorobencilamino)-5-azaquinoxalina.
Compuesto
A-7
Al sustituir el
4-hidroxifenilglioxal por el fenilglioxal y la
bencilamina por la anilina en el procedimiento para el compuesto
A-2, el mismo procedimiento da la
3-fenil-6-fenilamino-5-azaquinoxalina.
\vskip1.000000\baselineskip
Compuestos A-8 a
A-26
Al sustituir la bencilamina por la bencilamina
sustituida adecuada en el procedimiento para el compuesto
A-2, el mismo procedimiento da los siguientes
compuestos:
Compuesto
A-8
Compuesto
A-9
Compuesto
A-10
Compuesto
A-11
\newpage
Compuesto
A-12
Compuesto
A-13
Compuesto
A-14
Compuesto
A-15
Compuesto
A-16
Compuesto
A-17
Compuesto
A-18
Compuesto
A-19
Compuesto
A-20
Compuesto
A-21
Compuesto
A-22
Compuesto
A-23
Compuesto
A-24
Compuesto
A-25
Compuesto
A-26
\vskip1.000000\baselineskip
Compuestos A-27 a
A-48
Al sustituir la bencilamina por la anilina
sustituida adecuada en el procedimiento para el compuesto
A-2, el mismo procedimiento da los siguientes
compuestos:
\newpage
Compuesto
A-27
Compuesto
A-28
Compuesto
A-29
Compuesto
A-30
Compuesto
A-31
Compuesto
A-32
Compuesto
A-33
Compuesto
A-34
Compuesto
A-35
Compuesto
A-36
Compuesto
A-37
Compuesto
A-38
Compuesto
A-39
Compuesto
A-40
Compuesto
A-41
Compuesto
A-42
\newpage
Compuesto
A-43
Compuesto
A-44
Compuesto
A-45
Compuesto
A-46
Compuesto
A-47
Compuesto
A-48
\vskip1.000000\baselineskip
Compuestos A-49 a
-A-67
Al sustituir la bencilamina por la bencilamina
sustituida adecuada y el 4-hidroxifenilglioxal por
el fenilglioxal en el procedimiento para el compuesto
A-2, el mismo procedimiento da los siguientes
compuestos:
Compuesto
A-49
Compuesto
A-50
Compuesto
A-51
Compuesto
A-52
Compuesto
A-53
Compuesto
A-54
Compuesto
A-55
Compuesto
A-56
Compuesto
A-57
\newpage
Compuesto
A-58
Compuesto
A-59
Compuesto
A-60
Compuesto
A-61
Compuesto
A-62
Compuesto
A-63
Compuesto
A-64
Compuesto
A-65
Compuesto
A-66
Compuesto
A-67
\vskip1.000000\baselineskip
Compuestos A-68 a
A-89
Al sustituir la bencilamina por la anilina
sustituida adecuada y el 4-hidroxifenilglioxal por
el fenilglioxal en el procedimiento para el compuesto
A-2, el mismo procedimiento da los siguientes
compuestos:
Compuesto
A-68
Compuesto
A-69
Compuesto
A-70
Compuesto
A-71
Compuesto
A-72
\newpage
Compuesto
A-73
Compuesto
A-74
Compuesto
A-75
Compuesto
A-76
Compuesto
A-77
Compuesto
A-78
Compuesto
A-79
Compuesto
A-80
Compuesto
A-81
Compuesto
A-82
Compuesto
A-83
Compuesto
A-84
Compuesto
A-85
Compuesto
A-86
Compuesto
A-87
Compuesto
A-88
\newpage
Compuesto
A-89
Compuesto
A-90
Al sustituir el 4-hidroxifenilo
por el 4-metoxifenilo en el procedimiento para el
compuesto A-1, el mismo procedimiento da la
6-fenilamino-3-(4-metoxifenil)-5-azaquinoxalina.
Ejemplo
2
El siguiente análisis describe la cantidad de
fosforilación catalizada por la RAF de su diana proteica MEK así
como de la diana de la MEK: la MAPK. La secuencia génica de la RAF
se describe en Bonner et al., 1985, Molec. Cell.
Biol. 5: 1400-1407, y se puede acceder a ella
fácilmente en las bases de datos que contienen numerosas secuencias
génicas. La construcción del vector de ácido nucleico y de las
estirpes celulares utilizadas para esta parte de la invención se
describen totalmente en Morrison et al., 1988, Proc. Natl.
Acad. USA 85: 8855-8859.
1. Células de Sf9 (Spodoptera
frugiperda); GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.
2. Tampón RIPA: 20 mM de Tris/HCl, pH 7,4, 137
Mm de NaCl, glicerol al 10%, 1 mM de PMSF, 5 mg/l de Aprotenin,
Triton X-100 al 0,5%;
3. Proteína de fusión
tiorredoxina-MEK (T-MEK): la
expresión y la purificación de la T-MEK por
cromatografía de afinidad se realizaron de acuerdo con los
procedimientos del fabricante. N.º 350-01 y R
350-40 del catálogo de Invitrogen Corp., San Diego,
CA (EE. UU.).
4. His-MAPK (ERK 2); la MAPK
etiquetada con His se expresó en las células XL1 Blue transformadas
con el vector pUC18 que codifica la His-MAPK. Se
purificó la His-MAPK por cromatografía de afinidad
de Ni. N.º 27-4949-01 del catálogo
de Pharmacia, Alameda, CA (EE. UU.), como se describe en la presente
memoria.
5. IgG de oveja contra ratón: Jackson
Laboratories, West Grove, PA (EE. UU.). N.º de catálogo
515-006-008, lote n.º 28563.
6. Anticuerpo específico contra la proteína
cinasa RAF-1: URP2653 de UBI.
7. Tampón de recubrimiento PBS; suspensión
salina tamponada con fosfato, GIBCO-BRL.
Gaithersburg, MD (EE. UU.).
8. Tampón de lavado. TBST; 50 mM de Tris/HCl, pH
7,2, 150 mM de NaCl, Triton X-100 al 0,1%.
9. Tampón de bloqueo: TBST, etanolamina al 0,1%,
pH 7,4.
10. DMSO, Sigma, St. Louis, MO EE. UU.).
11. Tampón de cinasa (KB): 20 mM de Hepes/HCl,
pH 7,2, 150 mM de NaCl, Triton X-100 al 0,1%, 1 mM
de PMSF, 5 mg/l de Aprotenin, 75 \muM de ortovanadato de sodio,
0,5 mM de DTT y 10 mM de MgCl_{2}.
12. Mezcla de ATP: 100 mM de MgCl_{2}, 300
\muM de ATP, 10 \muCi de \gamma-[^{33}P] ATP
(Dupont-NEN)/ml.
13. Disolución de parada: ácido fosfórico al 1%;
Fisher, Pittsburgh, PA (EE. UU.).
14. Protectores del filtro de fosfato de
celulosa de Wallac; Wallac, Turku, Finlandia.
15. Disolución de lavado del filtro: ácido
fosfórico al 1%, Fisher, Pittsburgh, PA (EE. UU.).
16. Recolector de placas Tomtec, Wallac, Turku,
Finlandia.
17. Lector beta de placas Wallac n.º 1205,
Wallac, Turku, Finlandia.
18. Placas de polipropileno con fondo en V de 96
pocillos de NUNC para compuestos de Applied Scientific, n.º de
catálogo AS-72092.
Las siguientes etapas se realizaron a
temperatura ambiente, a menos que se indique específicamente.
1. Recubrimiento de las placas de ELISA: se
recubrieron pocillos para ELISA con 100 \mul de antisuero de
oveja contra ratón purificado por afinidad (1 \mug/100 \mul del
tampón de recubrimiento) durante una noche a 4ºC. Las placas ELISA
se pueden utilizar durante dos semanas cuando se almacenan a
4ºC.
2. Inviértase la placa y retírese el líquido.
Añádanse 100 \mul de disolución de bloqueo e incúbese durante 30
minutos.
3. Retírese la disolución de bloqueo y lávese 4
veces con tampón de lavado. Dense golpecitos a la placa sobre una
toalla de papel para retirar el exceso de líquido.
4. Añádase 1 \mug de anticuerpo específico
contra RAF-1 a cada pocillo e incúbese durante 1
hora. Lávese como se describe en la etapa 3.
5. Descongélense los lisados de las células Sf9
infectadas con RAS/RAF y dilúyanse con TBST hasta 10 \mug/100
\mul. Añádanse 10 \mug del lisado diluido a los pocillos e
incúbese durante 1 hora. Agítese la placa durante la incubación.
Los controles negativos no reciben ningún lisado. Los lisados de las
células de insecto Sf9 infectadas con RAS/RAF se preparan después
de haber infectado las células con baculovirus recombinantes a una
MDI de 5 por cada virus, y se recogen 48 horas después. Las células
se lavan una vez con PBS y se lisan en tampón de RIPA. Se retira el
material insoluble mediante centrifugación (5 min a 10000 x g). Las
alícuotas de los lisados se congelan en hielo seco/etanol y se
almacenan a -80ºC hasta que se usen.
6. Retírese el material sin unir y lávese como
se describió anteriormente (etapa 3).
7. Añádanse 2 \mug de T-MEK y
2 \mug de His-MAEPK por pocillo y ajústese el
volumen a 40 \mul con un tampón de cinasa. Los métodos para
purificar T-MEK y MAPK a partir de extractos
celulares se proporcionan en la presente memoria mediante
ejemplos.
8. Predilúyanse los compuestos (solución madre
de 10 mg/ml de DMSO) o los extractos 20 veces en TBST más DMSO al
1%. Añádanse 5 \mul de los compuestos o extractos prediluidos a
los pocillos descritos en la etapa 6. Incúbese durante 20 minutos.
Los controles no reciben ningún fármaco.
9. Comiéncese la reacción de la cinasa al añadir
5 \mul de la mezcla de ATP; agítense las placas en un agitador de
placas de ELISA durante la incubación.
10. Párese la reacción de la cinasa después de
60 minutos añadiendo 30 \mul de la disolución de parada a cada
pocillo.
11. Colóquese el protector de fosfocelulosa y la
placa de ELISA en el recolector de placas de Tomtec. Recójase y
lávese el filtro con la disolución de lavado del filtro de acuerdo
con lo que recomiendan los fabricantes. Séquense los protectores
del filtro. Séllense los protectores del filtro y colóquense en el
soporte. Insértese el soporte en el aparato de detección de
radiactividad y cuantifíquese el fósforo radiactivo de los
protectores del filtro.
Alternativamente, se pueden transferir 40 \mul
de alícuotas de los pocillos individuales de la placa de análisis a
las posiciones correspondientes del protector del filtro de
fosfocelulosa. Después del secado al aire de los filtros,
colóquense los filtros en una bandeja. Balancéese suavemente la
bandeja, cambiando la disolución de lavado en intervalos de 15
minutos durante 1 hora. Séquense al aire libre los protectores del
filtro. Séllense los protectores del filtro y colóquense en un
soporte adecuado para medir el fósforo radiactivo en las muestras.
Insértese el soporte en un dispositivo de detección y cuantifíquese
el fósforo radiactivo sobre los protectores del filtro.
Los valores de la CI_{50} se midieron de
acuerdo con el protocolo para los siguientes compuestos sobre la
base de la 5-azaquinoxalina en el análisis de ELISA
de la RAF-1:
Un valor de CI_{50} es la concentración del
inhibidor sobre la base de la 5-azaquinoxalina
requerido para disminuir la cantidad máxima de la diana proteica
fosforilada o el crecimiento celular en torno al 50%. Los valores
de la CI_{50} en el análisis de fosforilación de la
RAF-1 se exponen en la tabla 1:
\vskip1.000000\baselineskip
| Compuesto | IC_{50} (\muM) |
| A-1 | 11,5 |
| A-2 | 7,8 |
| A-7 | 33 |
| A-36 | 45,6 |
| A-77 | 20,3 |
| A-90 | 98,0 |
Ejemplo
3
Las proteínas MAPK y MEK se expresan fácilmente
en las células con la subclonación de un gen que codifica estas
proteínas en un vector disponible comercialmente que expresa las
proteínas con una etiqueta de poli-histidina. Los
genes que codifican estas proteínas se pueden adquirir fácilmente de
los laboratorios que normalmente trabajan con estas proteínas o
mediante la clonación de estos genes a partir de las células que
contienen genotecas de ADNc. Las genotecas están disponibles
comercialmente fácilmente y cualquier persona experta en la técnica
puede diseñar fácilmente sondas de ácidos nucleicos homólogas a
moléculas de ADNc que codifican la MEK o la MAPK a partir de las
secuencias de ácidos nucleicos de la MEK y la MAPK disponibles en
numerosas bases de datos de genes, como Genbank. La clonación de un
gen se puede realizar en poco tiempo utilizando las técnicas
actualmente disponibles para las personas expertas en la
técnica.
La purificación de las proteínas MEK y MAPK a
partir de extractos celulares se puede realizar utilizando el
siguiente protocolo, que está adaptado de Robbins et al.,
1993, J. Biol. Chem. 268: 5097-5106:
1. Lísense las células mediante sonicación,
choque osmótico o técnicas con la prensa de French disponibles
fácilmente para las personas expertas en la técnica. Más abajo se
proporciona un tampón de sonicación adecua-
do.
do.
2. Equilíbrese un soporte sólido que esté
conjugado con níquel o cobalto con el tampón de equilibración
descrito más abajo. La etiqueta de poli-histidina se
une específicamente a los átomos de níquel y de cobalto sobre el
soporte sólido. La equilibración se puede alcanzar lavando la resina
tres veces con un volumen del tampón de equilibración igual a diez
veces el volumen del soporte sólido. El soporte sólido está
disponible fácilmente para las personas expertas en la técnica.
3. Añádase el lisado de células al soporte
sólido y equilíbrese en un vaso durante un tiempo. Alternativamente,
se puede empaquetar el soporte sólido en una columna de
cromatografía de proteínas y se puede hacer pasar el lisado a través
del soporte sólido.
4. Lávese el soporte sólido con el tampón de
lavado descrito más abajo.
5. Lávese la proteína MEK o MAPK del soporte
sólido con una cantidad de tampón de elución (proporcionado más
abajo) que retira del soporte sólido una porción significativa de la
proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón de sonicación
- Fosfato de sodio a 50 mM, pH 8.0
- Cloruro de sodio a 0,3 M
- \beta-Mercaptoetanol a 10 mM
- NP40 al 1%
- NaF a 10 mM
- Pefablock a 0,5 mM
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón de equilibración
- Fosfato de sodio a 50 mM, pH 8.0
- Cloruro de sodio a 0,3 M
- \beta-Mercaptoetanol a 10 mM
- NP40 al 1%
- NaF a 10 mM
- Imidazol a 1 mM
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón de lavado
- Fosfato de sodio a 50 mM, pH 8.0
- Cloruro de sodio a 0,3 M
- \beta-Mercaptoetanol a 10 mM
- NP40 al 1%
- NaF a 10 mM
- Imidazol a 10 mM
\newpage
Tampón de elución
- Fosfato de sodio a 50 mM, pH 8.0
- Cloruro de sodio a 0,3 M
- \beta-Mercaptoetanol a 10 mM
- NP40 al 1%
- NaF a 10 mM
- De 10 mM a 500 mM de imidazol
Ejemplo
4
Se midió la actividad cinasa del receptor del
FCE (análisis RFCE-NIH3T3) en las células enteras
como se describe en detalle en la publicación PCT internacional WO
9640116, registrada el 5 de junio de 1996, de Tang et al., y
titulada "Indolinone compounds for the treatment of disease",
que se incorpora en la presente memoria por referencia en su
totalidad, incluidas las figuras.
Los valores de la CI_{50} medidos en el
análisis de fosforilación del receptor del FCE se exponen en la
tabla 2:
\vskip1.000000\baselineskip
| Compuesto | IC_{50} (\muM) |
| A-2 | > 50 |
| A-5 | > 100 |
| A-6 | > 100 |
| A-7 | > 50 |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
El siguiente análisis mide la velocidad de
crecimiento de las células NIH-T3 que expresan la
RAS. El propósito del análisis es determinar los efectos de los
compuestos sobre el crecimiento de las células NIH 3T3 que
sobreexpresan la H-RAS.
Materiales
- Placas estériles con fondo llano de 96 pocillos
- Placas estériles con fondo redondeado de 96 pocillos
- Depósito estéril de 25 ml o 100 ml
- Pipeta, pipeteador Pipetman® multicanal
- Puntas estériles de pipetas
- Tubos estériles de 15 ml y 50 ml
\newpage
Reactivos
- SRB al 0,4% en ácido acético al 1%
- Tris base a 10 mM
- TCA al 10%
- Ácido acético al 1%
- DMSO estéril (Sigma)
- Compuesto en DMSO (100 mM o menos de la solución madre)
- Tripsina-EDTA (GIBCO BRL)
\vskip1.000000\baselineskip
Estirpe celular:
- 3T3/H-Ras (Clon 7 de NIH 3T3. Las células expresan el fragmento genómico de la H-RAS oncógena).
Se pueden construir las células utilizando el
siguiente protocolo:
1. Subclónese un fragmento génico que codifica
RAS en un vector disponible comercialmente que transfectará
establemente las células NIH-3T3. El fragmento es
del alelo transformador genómico de cHa-ras.
2. Transféctense las células
NIH-3T3 con el vector subclonado mediante un método
con fosfato de calcio. Selecciónense las células que expresan la
construcción con Ras en suero al 2% en DMEM. Se observan los focos
visibles después de 2 semanas. Agrúpense las células transformadas
para generar una estirpe celular transformada establemente.
\vskip1.000000\baselineskip
Medio del cultivo:
Suero de ternero al 2%/DMEM + 2 mM de glutamina,
Pen/Strep
\vskip1.000000\baselineskip
Protocolo:
Esta parte del análisis se realiza en una
campana de flujo laminar.
1. Trátense las células con tripsina.
Transfiéranse 200 \mul de la suspensión de células a 10 ml de
isotona. Recuéntense las células con un contador Coulter.
2. Dilúyanse las células en un medio de cultivo
hasta 60 000 células/ml. Transfiéranse 100 \mul de las células a
cada pocillo en una placa de fondo plano de 96 pocillos para dar 60
00 células/pocillo.
3. Utilícese media placa (4 filas) para cada
compuesto y póngase la misma concentración de cada compuesto en
cuatro pocillos, y una serie de 4 pocillos para el control con
medio.
4. Agítense suavemente las placas para permitir
una adhesión uniforme de las células
5. Incúbense las placas a 37ºC en un incubador
con CO_{2} al 10%.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta parte del análisis se realiza en una
campana de flujo laminar.
1. En una placa con fondo redondeado de 96
pocillos, añádanse 120 \mul del medio de crecimiento que contiene
el DMSO a 2X del % final encontrado en la concentración de detección
más alta del compuesto en las columnas 1 a 11. Por ejemplo, si la
mayor concentración es 100 \mul, y ésta se obtiene a partir de una
solución madre de 100 mM, el DMSO a 1X es 0,1%, por lo que el DMSO
a 2X es 0,2%. Esta placa se utiliza para titular el compuesto, con
4 filas por compuesto.
\newpage
2. En un tubo estéril de 15 ml, prepárese una
disolución 2X de la concentración de detección más alta del
compuesto en medio de crecimiento más DMSO 2X. Se necesita 1 ml por
estirpe celular. La concentración de partida del compuesto
normalmente es 100 \muM, pero esta concentración puede variar
dependiendo de la solubilidad del compuesto.
3. Transfiéranse 240 \mul de la disolución 2X
del compuesto de partida para cuadruplicar los pocillos en la
columna 12 de la placa con fondo redondeado de 96 pocillos. Háganse
diluciones seriadas 1:2 a lo largo de la placa de derecha a
izquierda transfiriendo 12 \mul de la columna 12 a la columna 11,
de la columna 11 a la columna 10 y así sucesivamente hasta la
columna 2. Transfiéranse 100 \mul de las diluciones del compuesto
y 100 \mul del medio en la columna 1, sobre 100 \mul del medio
que está sobre las células en los pocillos correspondientes de la
placa con fondo plano de 96 pocillos. El volumen total por pocillo
debe ser 200 \mul.
4. Devuélvase la placa al incubador e incúbese
durante 3 días.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta parte del análisis se realiza sobre la mesa
del laboratorio.
1. Aspírese o viértase el medio para eliminarlo.
Añádanse 200 \mul de TCA frío al 10% a cada pocillo para fijar
las células. Incúbese la placa durante, al menos, 60 minutos a
4ºC.
2. Deséchese el TCA y enjuáguense los pocillos 5
veces con agua corriente. Séquense las placas al revés sobre
toallas de papel.
3. Tíñanse las células con 100 \mul/ pocillo
de SRB al 0,4% durante 10 minutos.
4. Viértase el SRB y enjuáguense los pocillos 5
veces con ácido acético al 1%. Séquense las placas completamente al
revés sobre toallas de papel.
5. Solubilícese el colorante con 100
\mul/pocillo de Tris base a 10 mM durante 5 a 10 minutos en un
agitador.
6. Léanse las placas en un lector de placas de
ELISA de Dynatech a 570 nm con referencia a 630 nm.
Determinados compuestos inhibieron la velocidad
de crecimiento de las células que sobreexpresan la RAS tal y como
se ilustra en la tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
| Compuesto | CI_{50} (\mum) RAS/NIH3T3 |
| A-1 | 1,04 |
| A-2 | 7,6 |
| A-6 | 13,5 |
| A-36 | 0,18 |
| A-77 | 0,7 |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
El siguiente análisis mide la velocidad de
crecimiento de las células A549. El propósito del análisis es
determinar los efectos de los compuestos sobre el crecimiento de
las células A549 del carcinoma broncopulmonar humano. Se pueden
adquirir fácilmente las células A549 en las casas comerciales, como
ATCC (CCL 185).
\newpage
Materiales:
- Placas estériles con fondo plano de 96 pocillos
- Placas estériles con fondo redondeado de 96 pocillos
- Depósito estéril de 25 ml o 100 ml
- Pipetas, pipeteador Pipetman® multicanal
- Puntas estériles de pipetas
- Tubos estériles de 15 ml y 50 ml
\vskip1.000000\baselineskip
Reactivos:
- SRB al 0,4% en ácido acético al 1%
- Tris base a 10 mM
- TCA al 10%
- Ácido acético al 1%
- DMSO estéril (Sigma)
- Compuesto en DMSO (disolución madre a 100 mM o menos)
- Tripsina-EDTA (GIBCO BRL)
\vskip1.000000\baselineskip
Estirpe celular y medio de
crecimiento:
- Células A549 del carcinoma broncopulmonar humano (ATCC CCL185)
- Suero fetal de ternero al 10% en F12-K de Ham
\vskip1.000000\baselineskip
Protocolo:
Esta parte del análisis se realiza en una
campana de flujo laminar.
1. Trátense las células con tripsina.
Transfiéranse 200 \mul de la suspensión de células a 10 ml de
isotona. Recuéntense las células con un contador Coulter.
2. Dilúyanse las células en un medio de
crecimiento hasta 20 000 células/ml. Transfiéranse 100 \mul de las
células a cada pocillo a una placa con fondo plano de 96 pocillos
para dar 2000 células/pocillo.
3. Utilícese media placa (4 filas) para cada
compuesto y póngase la misma concentración de los compuestos en
cuatro pocillos, y una serie de 4 pocillos para el control con
medio.
4. Agítense suavemente las placas para permitir
una adhesión uniforme de las células.
5. Incúbense las placas a 37ºC en un incubador
con CO_{2} al 10%.
Esta parte del análisis se realiza en una
campana de flujo laminar.
1. En una placa con fondo redondeado de 96
pocillos, añádanse 120 \mul del medio de crecimiento que contiene
el DMSO final a 2X del % encontrado en la concentración de detección
más elevada del compuesto en las columnas 1 a 11. Por ejemplo, si
la concentración más elevada de detección es 100 \muM, y ésta se
obtiene a partir de una disolución madre a 100 mM, el DMSO a 1X es
0,1%, por lo que el DMSO a 2X es 0,2%. Esta placa se utiliza para
titular el compuesto, 4 filas por compuesto.
\global\parskip0.930000\baselineskip
2. En un tubo estéril de 15 ml, prepárese una
disolución a 2X de la concentración del compuesto de detección más
elevada en el medio de crecimiento más DMSO 2X. Se necesita 1 ml por
estirpe celular. Normalmente, la concentración de partida del
compuesto es 100 \muM pero esta concentración puede variar según
la solubilidad del compuesto.
3. Transfiéranse 240 \mul de la disolución del
compuesto de partida a 2X para cuadruplicar los pocillos en la
columna 12 de la placa con fondo redondeado de 96 pocillos. Háganse
diluciones seriadas a 1:2 a lo largo de la placa de derecha a
izquierda transfiriendo 120 \mul de la columna 12 a la columna 11,
de la columna 11 a la 10 y así sucesivamente hasta la columna 2.
Transfiéranse 100 \mul de las diluciones del compuesto, y 100
\mul del medio en la columna 1, sobre los 100 \mul de medio que
están sobre las células en los correspondientes pocillos de la
placa con fondo plano de 96 pocillos. El volumen total por pocillo
debe ser 200 \mul.
4. Devuélvase la placa al incubador e incúbese
durante 3 días.
Esta parte del análisis se realiza en la mesa
del laboratorio.
1. Aspírese o viértase el medio para eliminarlo.
Añádanse 200 \mul de TCA frío al 10% a cada pocillo para fijar
las células. Incúbese la placa durante, al menos, 60 minutos a
4ºC.
2. Deséchese el TCA y enjuáguense los pocillos 5
veces con agua corriente. Séquense las placas al revés sobre
toallas de papel.
3. Coloréense las células con 100 \mul/pocillo
de SRB al 0,4% durante 10 minutos.
4. Viértase el SRB y enjuáguense los pocillos 5
veces con ácido acético al 1%. Séquense las placas completamente al
revés sobre toallas de papel.
5. Solubilícese el colorante con 100
\mul/pocillo de Tris base a 10 mM durante 5 a 10 minutos en un
agitador.
6. Léanse las placas en un lector de placas de
ELISA de Dynatech a 570 nm con referencia a 630 min.
Determinados compuestos inhibieron la velocidad
de crecimiento de las células A549, como se ilustra en la tabla
4.
| Compuesto | CI_{50} (\muM) A549 |
| A-2 | 25,1 > 10 (STF al 2%) |
| A-6 | 23,8 > 10 (STF al 2%) |
Ejemplo
7
Se pueden utilizar los estudios con xenoinjertos
para monitorizar el efecto de los compuestos de la invención sobre
la inhibición de las células del tumor de ovario, el melanoma, el
tumor de próstata, el cáncer broncopulmonar y el cáncer de mama. El
protocolo del análisis se describe en detalle en la publicación PCT
internacional WO 9640116, registrada el 5 de junio de 1996, de Tang
et al., y titulada "Indolinone compounds for the treatment
of disease", que se incorpora en la presente memoria por
referencia en su totalidad, incluidas todas las figuras.
La invención descrita de manera ilustrativa en
la presente memoria se puede llevar a la práctica en ausencia de
cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones que no se
describan específicamente en la presente memoria. La terminología y
las expresiones que se han empleado se utilizan como terminología de
descripción y no de limitación, y no hay ninguna intención en el
uso de tal terminología y expresiones de excluir cualquier
equivalente de las características que se muestran y se describen o
de porciones de las mismas, pero se reconoce que son posibles
varias modificaciones dentro del alcance de la invención
reivindicada. Por tanto, se debe entender que, aunque la presente
invención se ha descrito específicamente mediante las realizaciones
preferidas y las características opcionales, los expertos en la
técnica pueden recurrir a la modificación y la variación de los
conceptos descritos en la presente memoria, y que se considera que
tales modificaciones y variaciones se encuentran dentro del alcance
de esta invención como se define mediante las reivindicaciones
anexas.
Las referencias no incorporadas previamente en
la presente memoria por referencia, incluidas las referencias a
patentes y a no patentes, se incorporan expresamente en la presente
memoria por referencia para todos los propósitos. Otras
realizaciones se encuentran en las siguientes reivindicaciones.
Claims (18)
1. Un compuesto sobre las base de la
5-azaquinoxalina que tiene una estructura expuesta
en la fórmula I:
en la
que
- a)
- R_{1}, R_{2}, y R_{4} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en:
- i.
- hidrógeno;
- ii.
- alquilo saturado o insaturado opcionalmente sustituido con un resto de anillo de heteroarilo o arilo de cinco o seis eslabones, en la que dicho resto de anillo está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independiente del grupo que consiste en los restos alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster;
- iii.
- una amina de la fórmula NX_{2}X_{3}, en la que X_{2} y X_{3} se seleccionan independiente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo saturado o insaturado y restos de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones;
- iv.
- halógeno o trihalometilo;
- v.
- una cetona de fórmula -CO-X_{4}, en la que X_{4} se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo y restos arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones;
- vi.
- un ácido carboxílico de fórmula -(X_{5})_{n}-COOH o un éster de fórmula -(X_{6})_{n}-COO-X_{7}, en las que X_{5}, X_{6} y X_{7} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo y restos arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones, y en las que n es 0 ó 1;
- vii.
- un alcohol de fórmula (X_{8})_{n}-OH o un resto alcoxi de fórmula -(X_{8})_{n}-O-X_{9} en las que X_{8} y X_{9} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo saturado o insaturado, y restos de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones, en las que dicho anillo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster, y en las que n es 0 ó 1;
- viii.
- una amida de fórmula -NHCOX_{10}, en la que X_{10} se selecciona del grupo que consiste en alquilo, hidroxilo y restos de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones, en la que dicho anillo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro o éster;
- ix.
- -SO_{2}NK_{11}X_{12}, en la que X_{11} y X_{12} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo y restos de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones;
- x.
- un resto de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en los restos de alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster;
- xi.
- un aldehído de fórmula -CO-H;
- xii.
- una sulfona de fórmula SO_{2}-X_{13}, en la que X_{13} se selecciona del grupo que consiste en alquilo saturado o insaturado y restos arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones; y
- b)
- R_{6} se selecciona del grupo que consiste en:
- i.
- una amina de fórmula NK_{2}X_{3}, en la que X_{2} y X_{3} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo saturado o insaturado y restos de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones;
- ii.
- halógeno o trihalometilo;
- iii.
- una cetona de fórmula -CO-X_{4}, en la que X_{4} se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo y restos arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones;
- iv.
- un ácido carboxílico de fórmula -(X_{5})_{n}-COOH o éster de fórmula -(X_{6})-COO-X_{7}, en las que X_{5}, X_{6} y X_{7} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo y restos arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones, y en las que n es 0 ó 1;
- v.
- un alcohol de fórmula (X_{8})_{n}-OH o un resto alcoxi de fórmula -(X_{8})_{n}O-X_{9} en las que X_{8} y X_{9} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo saturado o insaturado y restos de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones, en las que dich o anillo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster, y en las que n es 0 ó 1;
- vi.
- una amida de fórmula -NHCOX_{10}, en la que X_{10} se selecciona del grupo que consiste en alquilo, hidroxilo y restos de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones, en la que dicho anillo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro o éster;
- vii.
- -SO_{2}NX_{11}X_{12}, en la que X_{11} y X_{12} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo y restos de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis miembros;
- viii.
- un resto de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en los restos alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster;
- ix.
- un aldehído de fórmula-CO-H;
- x.
- una sulfona de fórmula -SO_{2}-X_{13} en la que X_{13} se selecciona del grupo que consiste en alquilo saturado o insaturado y restos arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones;
- xi.
- alquilo saturado o insaturado opcionalmente sustituido con un resto de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones, en el que dicho resto está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en los restos alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster;
- c)
- X_{1} se selecciona del grupo que consiste en nitrógeno o azufre.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en el
que R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en:
- i.
- hidrógeno;
- ii.
- alquilo saturado o insaturado opcionalmente sustituido con un resto de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones, opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en los restos alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster; y
- iii.
- un resto de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en los restos alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster, y en el que R_{6} se selecciona de
- a)
- un resto de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis miembros opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en los restos alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster
- b)
- alquilo saturado o insaturado opcionalmente sustituido con un resto de anillo de arilo o heteroarilo de cinco o seis eslabones, opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes que se seleccionan independientemente del grupo que consiste en los restos alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster.
3. Los compuestos de la reivindicación 2, en los
que los dichos R_{3} y R_{4} son hidrógeno.
4. Los compuestos de la reivindicación 3, en los
que los dichos R_{1} y R_{2} se seleccionan independientemente
del grupo que consiste en:
- i.
- metilo opcionalmente sustituido con fenilo opcionalmente sustituido con sustituyentes que se seleccionan del grupo que consiste en los restos alquilo y halógeno; y
- ii.
- fenilo opcionalmente sustituido con sustituyentes que se seleccionan del grupo que consiste en los restos alquilo y halógeno.
5. El compuesto que se reivindica, en el que los
dichos R_{1} y R_{2} se seleccionan independientemente del grupo
que consiste en hidrógeno, metilo, fenilo y
4-hidroxifenilo.
6. Los compuestos de la reivindicación 4, en los
que dicho X_{1} es nitrógeno,
7. El compuesto de la reivindicación 6, en el
que los dichos sustituyentes R_{6} y X_{1} juntos forman un
resto que se selecciona del grupo que consiste en bencilamino,
4-fluorobencilamino,
2-carboxibencilamino,
3-carboxibencilamino,
4-carboxibencilamino,
2-nitrobencilamino,
3-nitrobencilamino,
4-nitrobencilamino,
2-metilbencilamino,
3-metilbencilamino,
4-metilbencilamino,
2-clorobencilamino,
3-clorobencilamino,
4-clorobencilamino,
2-fluorobencilamino,
3-fluorobencilamino,
4-fluorobencilamino,
2-(trifluorometil)bencilamino,
3-(trifluorometil)bencilamino,
4-(trifluorometil)bencilamino,
fenetil-1-amino, fenilamino,
2-carboxifenilamino,
3-carboxifenilamino,
4-carboxifenilamino,
2-nitrofenilamino,
3-nitrofenilamino,
4-nitrofenilamino,
2-metilfenilamino,
3-metilfenilamino,
4-metilfenilamino,
2-clorofenilamino,
3-clorofenilamino,
4-clorofenilamino,
2-fluorofenilamino,
3-fluorofenilamino,
4-fluorofenilamino,
2-(trifluorometil)fenilamino,
3-(trifluorometil)fenilamino,
4-(trifluorometil)fenilamino,
pirid-2-amino,
pirid-3-amino,
pirid-4-amino y
pirid-2-metilamino.
8. Una composición farmacéutica que comprende un
compuesto sobre la base de la 5-azaquinoxalina tal y
como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7,
o una sal del mismo, y un excipiente o diluyente fisiológicamente
aceptable.
9. Un compuesto sobre la base de la
5-azaquinoxalina tal y como se reivindica en una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una sal del mismo para el
uso en tratamientos.
10. Uso de un compuesto sobre la base de la
5-azaquinoxalina como se reivindica en una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para fabricar un
medicamento para el tratamiento de una enfermedad modulada por la
expresión celular de una cinasa de proteínas con serina o treonina,
en la que dicha enfermedad es un cáncer, en concreto, carcinoma
broncopulmonar, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de cerebro,
cáncer de cerebro intraaxial, cáncer de colon, cáncer de próstata,
sarcoma, sarcoma de Kaposi, melanoma y glioma, o un trastorno
fibrótico.
11. Uso de un compuesto sobre la base de la
5-azaquinoxalina tal y como se reivindica en una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para el tratamiento in
vitro para modular la función de una cinasa de proteínas con
serina o treonina.
12. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 10 a
11, en la que la cinasa de proteínas con serina o treonina es
RAF.
13. Uso de un compuesto sobre la base de la
5-azaquinoxalina tal y como se reivindica en una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para fabricar un
medicamento para el tratamiento del cáncer o de un trastorno
fibrótico.
14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en
el que dicho medicamento es para el tratamiento de un cáncer que se
selecciona del grupo que consiste en cáncer broncopulmonar, cáncer
de ovario, cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer de cerebro
intraaxial, cáncer de colon, cáncer de próstata, sarcoma, sarcoma de
Kaposi, melanoma y glioma.
15. Uso de acuerdo con la reivindicación 13 ó
14, en el que dicho medicamento es para el tratamiento de un estado
asociado a una aberración en una vía de transducción de señales que
se caracteriza por una interacción entre una cinasa de
proteínas con serina o treonina y un asociado de unión natural, en
la que el estado es un cáncer, en concreto, cáncer broncopulmonar,
cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer de
cerebro intraaxial, cáncer de colon, cáncer de próstata, sarcoma,
sarcoma de Kaposi, melanoma y glioma, o un trastorno fibrótico.
16. Uso de acuerdo con la reivindicación 15, en
la que la cinasa de proteínas con serina o treonina es RAF.
17. Un método para modular in vitro la
función de una cinasa de proteínas con serina o treonina que
comprende poner en contacto las células que expresan dicha cinasa de
proteínas con serina o treonina con un compuesto sobre la base de la
5-azaquinoxalina tal y como se reivindica en una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
18. Un método de acuerdo con la reivindicación
17, en el que la cinasa de proteínas con serina o treonina es
RAF.
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