UA71555C2 - Methods for modulating function of serine/threonine protein kinases by 5-azaquinoline derivatives - Google Patents

Description

Опис винаходу

Наведений опис допомагає зрозуміти винахід, але не є рівнем техніки винаходу. 2 Клітинна сигналізація є фундаментальним механізмом, в якому зовнішні стимули регулюють різноманітні клітинні процеси. Одним з ключових біохімічних механізмів передачі сигналу є оборотне фосфорилування білків, що дозволяє регулювати активність повністю розвинутих білків, змінюючи їх структуру та функцію.

Найкраще описані протеїнкінази еукаріот, що фосфорилують білки по спиртовій групі серинових, треонінових та тирозинових залишків. Ці кінази поділяються на дві групи: специфічні до фосфорилування серину й треоніну; 0 | специфічні до фосфорилування тирозину. Деякі кінази, що мають "подвійну специфічність", здатні до фосфорилування по тирозину, а також по залишкам серину/тгреоніну.

Протеїнкінази можуть також бути охарактеризовані за їх розташуванням всередині клітини. Деякі кінази є трансмембранними рецепторними білками, здатними зв'язувати ліганди зовні клітинної мембрани. Зв'язування лігандів змінює рецепторну протеїнкіназну каталітичну активність. Інші є нерецепторними білками, що не 72 містять трансмембранного домену. Нерецепторні протеїнкінази знаходяться в багатьох клітинних компартментах від внутрішньої поверхні клітинної мембрани до ядра.

Багато кіназ беруть участь у регуляторних каскадах, де до їх субстратів можуть належати інші кінази, чия активність регулюється їх станом фосфорилування. Кінець кінцем, активність підлеглого ефектора модулюється фосфорилуванням внаслідок активації такого шляху.

До сімейства серинових/гтреонінових кіназ належать члени, що регулюють багато ланок каскадів сигналізації, включаючи каскади, що контролюють ріст клітини, міграцію, диференціацію, експресію генів, скорочення м'язів, метаболізм глюкози, синтез білків у клітині й регулювання клітинного циклу.

Прикладом нерецепторних протеїнкіназ, що фосфорилують білкові мішені по залишках серину та треоніну, є

КАР. КАРЕ модулює каталітичну активність інших протеїнкіназ, наприклад, протеїнкінази, що фосфорилує й таким с чином активує активовану мітогеном протеїнкіназу (МАРК). Сама КАРЕ активується мембранозв'язаним білком Ге)

КАЗ, який у свою чергу активується у відповідь на активовані лігандом рецепторні тирозинпротеїнкінази, такі як рецептор епідермального фактора росту (ЕСЕК) і рецептор тромбоцитарного фактора росту (РОСЕК).

Біологічна важливість КАРЕ у контролюванні клітинних процесів є особливою, зокрема завдяки тому факту, що змінені форми КАРЕ можуть викликати рак в організмах. Доказ важливості КАЕ у злоякісності наведений у Мопіа о ее а!., 1996, Майиге Меадісіпе 2:668, представлений тут шляхом посилання, включаючи всі малюнки та таблиці. ю

Для винайдення нових способів лікування раку й інших хвороб, дослідники в біомедичній галузі й хіміки розробили, синтезували й тестували молекули, що інгібують функцію протеїнкіназ. Деякі малі органічні молекули о утворюють клас сполук, що модулюють функцію протеїнкіназ. До прикладів молекул, що інгібують функцію -же протеїнкіназ, належать моноциклічні, біциклічні або гетероциклічні арильні сполуки (РСТ УУО 92/20642), такі як вінілен-азаіндольні похідні (РСТ УМО 94/14808), 1-циклопропіл-4-піридилхінолони (патент США Мо5330992), - стирилові сполуки (І емії2Кі, еї аІ., патент США Мо5217999, і "Стирилові сполуки, що інгібують ЕСЕ рецепторні тирозинкінази", Гуоп і Їусп, ЮосКеї Мо208/050), стирилзаміщені піридилові сполуки (патент США Мо5,302,606), певні хіназолінові похідні (Європейська патентна заявка Мо0566266 А), селеоїндоли та селеніди (РСТ УМО « 94/03427), трициклічні полігідроксильні сполуки (РСТ УУО 92/21660) і сполуки бензилфосфонової кислоти (РСТ З

МО 91/15495). с Сполуки, що можуть проникати крізь клітинні мембрани й є резистентними до кислотного гідролізу, є з» потенційно кращими терапевтичними засобами, оскільки вони можуть становитися високобіодоступними після орального введення пацієнтам. Проте, багато з цих інгібіторів протеїнкіназ лише слабко інгібують функцію протеїнкіназ. Крім того, багато з них інгібують багато протеїнкіназ і, таким чином, викликатимуть чисельні побічні ефекти в якості терапевтичного засобу проти хвороби. 7 Незважаючи на значний прогрес, що був досягнутий у створенні сполук для лікування раку, в галузі - залишається потреба ідентифікації окремих структур і протоколів заміщення, що дають змогу утворювати сполуки, здатні модулювати функції окремих протеїнкіназ. і-й Цей винахід частково стосується способів модулювання функції серинових/треонінових протеїнкіназ сл 20 сполуками - похідними 5-азахіноксаліну. Способи включають клітини, що експресують серинову/греонінову протеїнкіназу, таку як КАР. Крім того, винахід описує способи запобігання й лікування хвороб, пов'язаних з сл сериновою/греоніновою протеїнкіназою, у організмах сполукою, що визначається способами, описаними в цьому винаході. Крім того, винахід стосується фармацевтичних композицій, які складаються зі сполук, що визначаються способами, описаними в цьому винаході. 29 1. Способи скринінгу сполук, що модулюють функцію сериново/ї/гтреонінової протеїнкінази

ГФ) Способи цього винаходу пропонують засоби модулювання функцій рецепторних і цитозольних серинових/треонінових протеїнкіназ. Ці способи пропонують засоби модулювання ферментів іп міго та іп мімо. о Для застосування іп мйго способи винаходу стосуються частково способу ідентифікації сполук, що модулюють функцію серинових/гтреонінових протеїнкіназ. 60 Таким чином, у першому аспекті винахід стосується способу модулювання функції серинової/треонінової протеїнкінази сполукою - похідною азабензімідазолу. Азабензімідазолова сполука за бажанням заміщена органічними групами. Спосіб полягає у впливі сполуки на клітини, що експресують серинову/гтреонінову протеїнкіназу.

Термін "функція" стосується ролі серинової/треонінової протеїнкінази в клітині До сімейства бо серинових/треонінових протеїнкіназ належать члени, що регулюють багато ланок у сигнальних каскадах,

включаючи каскади, що контролюють ріст клітин, міграцію, диференціацію, експресію генів, скорочення м'язів, метаболізм глюкози, синтез білків в клітині й регулювання клітинного циклу.

Термін "каталітична активність" в контексті винаходу стосується швидкості, за якої протеїнкіназа фосфорилує субстрат. Каталітичну активність можна виміряти як функцію часу, наприклад, визначенням кількості субстрату, перетвореного на продукт. Фосфорилування субстрату відбувається в активному центрі протеїнкінази. Активний центр - це западина, в який субстрат зв'язується з протеїнкіназою й піддається фосфорилуванню.

Термін "субстрат", що використовується в цьому винаході, стосується молекули, що фосфорилується 7/0 бериновою/гтреоніновою протеїнкіназою. Краще, якщо субстратом є пептид, і ще краще - білок. Стосовно протеїнкінази КАРЕ, кращими субстратами є МЕК, а субстратом МЕК - МАРК.

Термін "активує" стосується підвищення клітинної функції протеїнкінази. Краще, якщо функцією протеїнкінази є взаємодія з природним партнером, що зв'язується з нею, і найкраща каталітична активність.

Термін "інгібувати" стосується зменшення функції протеїнкінази в клітині. Краще, якщо функцією /5 протеїнкінази є взаємодія з природним партнером, що зв'язується з нею, і найкраща каталітична активність.

Термін "модулює" стосується зміни функції протеїнкінази за рахунок підвищення або зменшення вірогідності того, що утворюється комплекс між протеїнкіназою й природним партнером, що зв'язується з нею. Краще, якщо модулятор підвищує вірогідність того, що такий комплекс утворюється між протеїнкіназою й природним партнером, що зв'язується з нею, ще краще, якщо підвищує або зменшує вірогідність того, що утворюється

Комплекс між протеїнкіназою й природним партнером, що зв'язується з нею, залежно від концентрації сполуки, яку перетворює протеїнкіназа, і найкраще, якщо зменшує вірогідність того, що утворюється комплекс між протеїнкіназою й природним партнером, що зв'язується з нею. Краще, якщо модулятор активує каталітичну активність протеїнкінази, ще краще, якщо активує або інгібує каталітичну активність протеїнкінази залежно від концентрації сполуки, що перетворює протеїнкіназа, або найкраще, якщо інгібує каталітичну активність сч г протеїнкінази.

Термін "комплекс" стосується з'єднання принаймні двох молекул, зв'язаних одна з одною. Комплекси (8) передачі сигналу часто містять принаймні дві білкових молекули, зв'язаних одна з одною. Наприклад, рецепторна тирозинова протеїнкіназа ОКВ2, 5О5, КАЕ і КАБ з'єднується з утворенням комплексу передачі сигналу у відповідь на мітогенний ліганд. ю зо Термін "природний зв'язуючий партнер" стосується поліпептидів, що зв'язуються з протеїнкіназою в клітинах. Природні партнери, що зв'язуються з протеїнкіназами, можуть відігравати певну роль у передачі о сигналу в процесі передачі сигналу протеїнкіназою. Зміна у взаємодії протеїнкінази й природного партнера, що ю зв'язується з нею, може виявитись як підвищена або зменшена вірогідність того, що утворюється взаємодія, або підвищена, або зменшена концентрація комплексу протеїнкінази/природного партнера, що зв'язується з нею. --

Природний партнер, що зв'язується з протеїнкіназою, може зв'язуватись з внутрішньоклітинною частиною ї- протеїнкінази з високою афінністю. Висока афінність представляє рівновагу константи зв'язування порядку 10-9М або менше. Крім того, природний партнер, що зв'язується з протеїнкіназою, може також короткочасно взаємодіяти з внутрішньоклітинною частиною протеїнкінази й хімічно модифікувати її. Природні партнери, що « зв'язуються з протеїнкіназою, вибрані з групи, до якої належать, крім іншого, гомологічні домени 5КС - 2 70 (ЗН2) або З (ЗНЗ), інші фосфорилтирозинзв'язуючі (РТВ) домени, фактори обміну гуанінових нуклеотидів, - с фосфатази білків та інші протеїнкінази. Легкодоступними є способи визначення змін у взаємодіях між ц протеїнкіназами та їх природними партнерами, що зв'язуються з ними. "» Термін "серинова/треонінова протеїнкіназа" стосується ферменту, що має послідовність амінокислот з принаймні 1095 амінокислотною ідентичністю у порівнянні з іншими ферментами, що фосфорилують білки по залишках серину та треоніну. Серинова/треонінова протеїнкіназа каталізує додавання фосфату до залишків -І серину та треоніну білків. Серинові/треонінові протеїнкінази можуть існувати як мембранозв'язані білки або цитозольні білки. - Термін "піддавання дії"? що використовується в цьому винаході, стосується змішування розчину, що ос складається з 5-азахіноксалінової сполуки винаходу, з рідким середовищем, що містить клітини згідно із способом. Розчин, що містить сполуку, може також містити інший компонент, такий як диметилсульфоксид і-й (ОМ50), який полегшує проникнення 5-азахіноксалінової сполуки або сполук у клітини згідно із способом. сл Розчин, що містить 5-азахіноксалінову сполуку, може бути доданий до середовища, що містить клітини, використовуючи пристрій для переносу, наприклад, такий, що в основі має піпетку або шприц.

Термін "5-азахіноксалінова сполука" стосується 5-азахіноксалінової органічної сполуки, заміщеної на

Хімічні замісники. 5-азахіноксалінові сполуки мають загальну структуру: юс ю СХ

М М

60 Термін "заміщений", у цьому винаході стосується 5-азахіноксалінової сполуки, що є похідною з будь-якою кількістю хімічних замісників.

У кращому втіленні винахід стосується способу модулювання функції серинової/гтреонінової протеїнкінази, де протеїнкіназою є КАРЕ.

Протеїнкіназа КАР фосфорилує білкові мішені по серинових або треонінових залишках. Однією такою б5 білковою мішенню є протеїнкіназа (МЕК), що фосфорилує й в результаті активує протеїнкіназу, що активується мітогеном (МАРК). Сам КАРЕ активується мембранозв'язаним гуанінтрифосфатгідролізуючим ферментом КАЗ у відповідь на рецепторні тирозинкінази, що активуються мітогеном, такі як рецептор епідермального фактора росту (ЕСЕК) і рецептор тромбоцитарного фактора росту (РОСЕК).

Способи цього винаходу можуть визначити сполуки, що модулюють функцію протеїнкінази КАЕ в клітинах.

КАР фосфорилує протеїнкіназу (МЕК), яка, у свою чергу, фосфорилує протеїнкіназу, що активується мітогеном (МАРК). Тести, що виявляють лише фосфорилування МЕК за допомогою КАРЕ, не є чутливими, тому що фосфорилування МЕК є незначним. Для подолання цієї проблеми проводять фосфорилування МЕК і МАРК у тестах цього винаходу. Сигнал фосфорилування МАРК підсилює сигнал фосфорилування МЕК і тому дозволяє виконувати КАРБ-залежне фосфорилування, таке як ферментний імуносорбентний аналіз. Крім того, тест /о Винаходу виконують з високим виходом так, що багато сполук можуть бути швидко виявлені за короткий проміжок часу.

В іншому аспекті винахід описує спосіб визначення сполук, що модулюють функцію сериново/ї/треонінової протеїнкінази, що складається з етапів піддавання клітин, що експресують серинову/гтреонінову протеїнкіназу, дії сполуки і виявлення впливу на клітини.

Термін "виявлення" стосується спостерігання ефекту додавання сполуки до клітин згідно із способом цього винаходу. Вплив може проявлятися як зміна фенотипу клітини, проліферації клітини, каталітичної активності протеїнкінази або як взаємодія між протеїнкіназою та природним партнером, що зв'язується з протеїнкіназою.

Термін "вплив" стосується зміни або відсутності зміни фенотипу клітини, або проліферації клітини. "Вплив" може також стосуватися зміни або відсутності зміни в каталітичній активності протеїнкінази. "Вплив" може го також стосуватися змін або відсутності зміни у взаємодії між протеїнкіназою й природним партнером, що зв'язується з протеїнкіназою.

Краще втілення винаходу стосується способу визначення сполук що модулюють функцію серинової/греонінової протеїнкінази, де вплив виражається як зміна або відсутність зміни фенотипу клітини.

Термін "фенотип клітини" стосується зовнішнього вигляду клітини чи тканини або функції клітини чи сч ов тканини. До прикладів фенотипу клітини належать розмір клітини (зменшення або збільшення), проліферація клітини (підвищення або зменшення кількості клітин), диференціація клітин (зміна або відсутність зміни у і) формі клітини), виживаність клітин, апоптоз (смерть клітин), або використання метаболічної поживної речовини (наприклад, поглинання глюкози). Зміна або відсутність зміни фенотипу клітини легко визначаються способами, що відомі у галузі. ю зо В іншому кращому втіленні винахід стосується способу визначення сполук, що модулюють функцію серинової/греонінової протеїнкінази, де впливом є зміна або відсутність зміни в проліферації клітин. о

Термін "проліферація клітин" стосується швидкості, за якої група клітин ділиться. Кількість клітин, що ю зростають у посудині, може підрахувати фахівець шляхом звичайного візуального підрахунку кількості клітин у відомому об'ємі, використовуючи звичайний світловий мікроскоп. Як альтернатива, швидкість проліферації (7

Зз5 Клітин можна підрахувати за допомогою лабораторного пристрою, що оптично або за рахунок світлопровідності М. вимірює щільність клітин у певному середовищі.

В іншому кращому втіленні винахід стосується способу визначення сполук, що модулюють функцію серинової/треонінової протеїнкінази, де впливом є зміна або відсутність змін у взаємодії між сериновою/треоніновою протеїнкінази та природним партнером, що зв'язується з протеїнкіназою. «

Термін "взаємодія" в контексті винаходу описує комплекс, що утворюється між внутрішньоклітинною з с частиною протеїнкінази та природним партнером, що зв'язується з протеїнкіназою, або сполукою. Термін "взаємодія" може також стосуватися комплексу, що утворюється між сполукою винаходу з внутрішньоклітинними ;» частинами й зовнішньоклітинними частинами протеїнкінази, що досліджується. Хоча цитозольна протеїнкіназа не має зовнішньоклітинної частини, рецепторна протеїнкіназа має зовнішньоклітинну й внутрішньоклітинну частину.

Термін "внутрішньоклітична частина", що використовується в цьому винаході, стосується частини -І протеїнкінази, яка існує всередині клітини. Термін "зовнішньоклітинна частина", що використовується в цьому винаході, стосується частини протеїнкінази, яка існує назовні клітини. - У кращому втіленні винахід стосується способу визначення сполук, що модулюють функцію с серинової/треонінової протеїнкінази, що складається з наступних етапів: (а) лізису клітин для одержання 5о лізату, що містить серинову/треонінову протеїнкіназу; (б) адсорбції серинової/треонінової протеїнкінази до о антитіла; (в) інкубування адсорбованої серинової/треонінової протеїнкінази з субстратом або субстратами; і сп (г) адсорбції субстрату або субстратів до твердої основи або антитіла. Етап спостерігання впливу на клітини складається з вимірювання концентрації фосфату субстрату або субстратів.

Термін "лізис", що використовується в цьому винаході, стосується способу руйнування цілісності клітини дв так, що її внутрішній вміст вивільнюється. Лізис клітин виконується багатьма способами, відомими фахівцям у галузі. Краще, якщо за допомогою обробки ультразвуком або ще краще, якщо за допомогою детергенту.

Ф) Термін "антитіло", що використовується в цьому винаході, стосується білкової молекули, що специфічно ка зв'язується з протеїнкіназою. Краще, якщо антитіло зв'язується з одним класом протеїнкіназ, і ще краще, якщо специфічно зв'язується з протеїнкіназою КАБ. во Термін "специфічно зв'язує", що використовується в цьому винаході, стосується антитіла, що зв'язується з протеїнкіназою з вищою афінністю, ніж інша протеїнкіназа або клітинний білок. Антитіло, що специфічно зв'язується з протеїнкіназою, зв'язуватиме більшу концентрацію специфічної протеїнкінази, ніж будь-яка інша протеїнкіназа або клітинний білок.

Термін "адсорбування", що використовується в цьому винаході, стосується зв'язування молекули з 65 поверхнею антитіла або твердої основи. До прикладів твердих основ належать хімічно модифіковані целюлоза, наприклад, фосфоцелюлоза, та нейлон. Антитіла можуть бути зв'язані з твердими основами, використовуючи способи, добре відомі звичайним фахівцям у цій галузі. Див., наприклад, Нагіо «4. І апе, Апііродієз, А І арогайгу

Мапааї, 1989, Соїй 5ргіпд Нагбог І арогаюгіев.

Термін "вимірювання концентрації фосфату", що використовується в цьому винаході, стосується способів, що зазвичай відомі звичайним фахівцям у цій галузі. До цих способів можуть належати підрахування концентрації фосфорилованого субстрату або визначення відносної кількості фосфорилованого субстрату. Ці способи можуть включати адсорбцію субстрату до мембрани й визначення кількості фосфорилованого субстрату з використанням радіоактивних ізотопів.

В іншому кращому втіленні винахід стосується способу визначення сполук, які модулюють функцію /о беринових/треонінових протеїнкіназ, що складається з наступних етапів: (а) лізису клітин для одержання лізату, що містить КАЕ; (б) адсорбування КАБЕ до антитіла; (в) інкубування адсорбованої КАЕ з МЕК і МАРК; і (г) адсорбування МЕК і МАРК до твердої основи або антитіла чи антитіл. Етап визначення впливу на клітини складається з визначення концентрації фосфату вищезгаданих МЕК і МАРК.

У кращому втіленні винахід стосується способу визначення сполук, що модулюють функцію 7/5 беринової/треонінової протеїнкінази, де сполука - похідна 5-азахіноксаліну має структуру, наведену у формулі

Ї, як описано в цьому винаході, або будь-яку з її підгруп, наведених у цьому винаході.

Термін "сполука" стосується сполуки або її фармацевтично прийнятної солі, естеру, аміду, проліків, ізомеру або метаболіту.

Термін "фармацевтично прийнятна сіль" стосується композиції сполуки, що не змінює біологічну активність і 2о властивості сполуки. Фармацевтичні солі можуть бути одержані за допомогою реакції сполуки винаходу з неорганічними або органічними кислотами, такими як соляна кислота, бромводнева кислота, сірчана кислота, азотна кислота, фосфорна кислота, метансульфонова кислота, етансульфонова кислота, п-толуолсульфонова кислота, саліцилова кислота й подібні.

Термін "проліки" стосується агента, що перетворюється на вихідні ліки іп мімо. Проліки можна легше сч ов ВВОДИТИ, НІЖ вихідні ліки в деяких ситуаціях. Наприклад, проліки можуть бути біодоступними при оральному введенні, у той час як вихідні - не можуть, або проліки можуть покращувати розчинність, що робить їх і) придатними для внутрішньовенного введення.

В іншому кращому втіленні винахід стосується способу визначення сполук, що модулюють функцію серинової/треонінової протеїнкінази, де сполука є похідною 5-азахіноксаліну й має структуру, наведену у ю зо формулі І, де сполука, що є похідною 5-азахіноксаліну, вибрана з групи, що складається зі сполук ЗАОАК.

Термін "сполуки БАОАК" стосується групи сполук похідних 5-азахіноксаліну, що мають структуру, наведену у о формулі І, і номери А-1 - А-90 в наступній таблиці: ю

Ва . «- ї оба - чех М в () ч

З с г 5 в. - о

Фо сл й о ю 5 вв

А-25 НО 4-гідроксифеніл (4--трифторметил)бензиламіно о ів сч

2 о ю зо ю ю

-

з й

«

б з є г» в - щ с зо й сл зв о ю во

І. Способи запобігання або лікування хвороб

В іншому аспекті винахід стосується способу запобігання або лікування хвороби в організмі. Спосіб складається з наступних етапів: (а) уведення сполуки винаходу, що описується в цьому винаході формулою |, з будь-яким носієм в організмі; і (б) стимулювання або переривання ненормальної взаємодії.

Термін "організм" стосується будь-якої живої істоти, що складається з принаймні однієї клітини. Організм можуть бути таким простим, як одна еукаріотична клітина, або таким складним, як організм ссавців. У кращих втіленнях організм стосується людини або ссавців.

Термін "попередження" стосується способу винаходу, що зменшує вірогідність або позбавляє можливості то того, що організм набуває або створює умови для розвитку хвороби.

Термін "лікування" стосується способу винаходу, що чинить терапевтичний вплив і принаймні частково полегшує або позбавляє організм від хвороби.

Термін "терапевтичний вплив" стосується інгібування росту клітин, що викликають або роблять внесок в хворобу (наприклад рак), термін "терапевтичний вплив" також стосується інгібування факторів росту, що їз викликають або роблять внесок в розвиток хвороби. Терапевтичний вплив полегшує деякою мірою один або кілька з симптомів хвороби. Стосовно лікування раку терапевтичний вплив стосується одного або кілька з наступних етапів: (а) зменшення розміру пухлини; (б) інгібування (тобто уповільнення або зупинення) метастазування пухлини; (в) інгібування росту пухлини; і (г) полегшення деякою мірою одного або кількох симптомів, пов'язаних з хворобою. Сполуки, що можуть бути визначені, як описано в цьому винаході, виявили ефективність проти лейкемій, за винятком того, що поряд з інгібуванням метастазів сполуки можуть уповільнювати або зменшувати проліферацію клітин або ріст клітин.

Термін "хвороба" стосується функцій клітин або тканин організму, що відрізняються від їх нормальних функцій в організмі. Хвороба може стосуватися проліферації клітин, диференціації клітин або виживаності клітин.

Ненормальна проліферація клітин стосується раку, такого як фібрози й мезангіальні розлади, ненормальний сч ангіогенез і васкулогенез, загоєння ран, псоріаз, цукровий діабет та запалення. (о)

Ненормальна диференціація стосується, крім іншого, нейродегенеративних розладів, повільного загоєння ран, а також способів трансплантації тканин.

Ненормальна виживаність клітин стосується станів, в яких шляхи запрограмованої смерті клітин (апоптоз), ю активовані або інгібовані. Кілька протеїнкіназ пов'язані зі шляхами апоптозу. Відхилення у функції будь-якої однієї протеїнкінази може призвести до безсмертя клітин або передчасної смерті клітин. ІФ)

Проліферація клітин, диференціація й виживаність є феноменом, що просто вимірюється способами у галузі. ю

До цих способів можуть належати підрахунок кількості клітин або зовнішній вигляд клітин під мікроскопом у часі (наприклад, у днях). -

Термін "введення" стосується головним чином надходження до організму, а саме способу включення сполук м в клітини або тканини організму. Хвороби можна попереджати або лікувати, якщо клітини або тканини організму існують всередині організму або зовні організму. Клітини, що існують зовні організму, можуть утримуватись або вирощуватись в посудинах для культур клітин. Для клітин, що знаходяться всередині організму, існує багато способів введення сполук, включаючи (крім іншого) оральне, парентеральне, нашкірне, ін'єкційне й аерозольне « дю застосування. Для клітин, що знаходяться зовні організму існують чисельні способи введення сполуки, з включаючи (крім іншого) методи мікроін'єкції в клітини, способи трансформації та способи, що використовують с носії. :з» У кращому втіленні винахід стосується способу попередження або лікування хвороби в організмі, де сполука - похідна 5-азахіноксаліну має структуру, наведену у формулі І, як описано в цьому винаході, або будь-яка з її підгруп, наведена в цьому винаході. - 15 В інших кращих втіленнях винахід стосується способу попередження або лікування хвороби в організмі, де сполука - похідна 5-азахіноксаліну, що має структуру, наведену у формулі І, вибрана з групи, що складається - зі сполук ЗАОАК. сл в іншому кращому втіленні винахід стосується способу попередження або лікування хвороби в організмі, де організмом є організм ссавця. 1 20 Краще, якщо термін "ссавець" стосується таких організмів як миші, щури, кролі, морські свинки та козли, сп ще краще, якщо мавп і людиноподібних мавп, і найкраще, якщо людини.

У ще іншому кращому втіленні винахід стосується способу запобігання або лікування хвороби в організмі, де хворобою є рак або фіброз.

В іншому кращому втіленні винахід стосується способу запобігання або лікування хвороби в організмі, де рак вибраний з групи, що складається з раку легень, раку яєчників, раку грудей, раку мозку, міжвісьового раку

ГФ) мозку, раку товстої кишки, раку простати, саркоми, саркоми Капоші, меланоми та гліоми.

ГФ У ще одному кращому втілені винахід стосується способу запобігання або лікування хвороби в організмі, де спосіб стосується хвороби, пов'язаної з порушенням шляху передачі сигналу, що характеризується взаємодією між сериновою/треоніновою протеїнкіназою і природним партнером, який зв'язується з протеїнкіназою. бо Термін "шлях передачі сигналу" стосується розповсюдження сигналу. Взагалі, зовнішньоклітинний сигнал передається через клітинну мембрану з утворенням внутрішньоклітинного сигналу. Цей сигнал може потім стимулювати клітинну відповідь. Термін також стосується сигналів, що розповсюджуються цілком всередині клітини. Молекули поліпептидів, що беруть участь в процесах передачі сигналу, є типово рецепторними й нерецепторними протеїнкіназами, рецепторними й нерецепторними фосфатазами білків, факторами обміну 65 нуклеотидів і факторами транскрипції.

Термін "відхилення", у зв'язку з процесом передачу сигналу, стосується протеїнкінази, що надмірно або недостатньо експресується в організмі, піддана мутації таким чином, що її каталітична активність є нижчою або вищою, ніж активність протеїнкінази дикого типу, або піддана мутації таким чином, що вона більше не може взаємодіяти з природним партнером, що зв'язується з протеїнкіназою, більше не модифікується іншою протеїнкіназою або фосфатазою білка, або більше не взаємодіє з природним партнером, що зв'язується з протеїнкіназою.

Термін "стимулюючи або перериваючи ненормальну взаємодію" стосується способу, що може бути здійснений уведенням сполуки винаходу в клітини або тканини в організмі Сполука може стимулювати /о взаємодію між протеїнкіназою й природним партнером, що зв'язується з нею за рахунок утворення сприятливих взаємодій з чисельними атомами на поверхні місця утворення комплексу. Як альтернатива, сполука може інгібувати взаємодію між протеїнкіназою й природним партнерами, що зв'язуються з нею, за рахунок створення сприятливих взаємодій, що утворюються між атомами на поверхні місця утворення комплексу. В іншому кращому втіленні винахід стосується способу запобігання або лікування хвороби в організмі, де 7/5 бериновою/греоніновою протеїнкіназою є КАР.

ІП. Сполуки та Фармацевтичні композиції винаходу

В іншому аспекті винахід стосується 5-азахіноксалінових сполук, що мають структури, наведені у формулі І: (1 ех "я де Га (а) Ку, Р» і Ко незалежно вибрані з групи, що складається з (Ї) водню; (8) (ї) насиченого або ненасиченого алкілу; (ії) аміну формули МХ»оХз, де Х» і Хз незалежно вибрані з групи, що складається з водню, насиченого або ненасиченого алкілу й п'ятичленних чи шестичленних арильних або гетероарильних кільцевих складових; ю зо (ім) галогену або тригалометилу; (М) кетону формули -СО-Ху, де Хі вибрано з групи, що складається з водню, алкілу й п'ятичленних чи о шестичленних арильних або гетероарильних складових; ю (мі) карбонової кислоти формули -(Хв)4-СООН або естеру формули -(Хв)-СОО-Х»7, де Хв, Хв і Х7 незалежно вибрані з групи, що складається з алкілу й п'ятичленних чи шестичленних арильних або гетероарильних --

Зв складових, і деп - це 0 або 1; ї- (мії) спирту формули (Хв)1-ОН або алкокси складової формули -(Хв)1-О-Хо, де Ха і Хо незалежно вибрані з групи, що складається з водню, насиченого або ненасиченого алкілу й п'ятичленних чи шестичленних арильних або гетероарильних складових, де кільце за бажанням заміщено на один або кілька замісників, незалежно вибраних з групи, що складається з алкілу, галогену, тригалометилу, карбоксилату, нітрогрупи та естеру, і де « п-- це 0 або 1; в с (мії) аміду формули -МНСОХ 0, де Х:іо вибрана з групи, що складається з алкілу, гідроксилу й п'ятичленних чи шестичленних арильних або гетероарильних складових, де кільце за бажанням заміщено на один або кілька ;» замісників, незалежно вибраних з групи, що складається з алкілу, галогену, тригалометилу, карбоксилату, нітрогрупи або естеру; (їх) -505МХ114Х32, де Х.і4 і Хі» вибрані з групи, що складається з водню, алкілу й п'ятичленних чи -І шестичленних арильних або гетероарильних кільцевих складових; (СО п'ятичленної або шестичленної арильної або гетероарильної кільцевої складової, за бажанням заміщеної - на один, два або три замісники, незалежно вибрані з групи, що складається зі складових алкілу, галогену, с тригалометилу, карбоксилату, нітрогрупи та естеру; (хі) альдегіду формули -СО-Н; і о (хі) сульфону формули -505-Х13, де Хіз вибрано з групи, що складається з насиченого або ненасиченого с алкілу й п'ятичленних чи шестичленних арильних або гетероарильних складових; і (б) Ху вибраний з групи, що складається з азоту, сірки та кисню.

Термін "насичений алкіл" стосується алкільної складової, що не містить будь-якої алкенової або алкінової

Б складової. Алкільна складова може бути розгалужена або нерозгалужена.

Термін "ненасичений алкіл" стосується алкільної складової що містить принаймні одну алкенову або (Ф, алкінову складову. Алкільна складова може бути розгалужена або нерозгалужена. ка Термін "амін" стосується хімічної складової формули МК Ко, де Кі і Ко незалежно вибрані з групи, що складається з водню, насиченого або ненасиченого алкілу й п'ятичленних чи шестичленних арильних або бор гетероарильних складових, де кільце за бажанням заміщено на один або кілька замісників, незалежно вибраних з групи, що складається зі складових алкілу, галогену, тригалометилу, карбоксилату, нітрогрупи та естеру.

Термін "арил" стосується ароматичної групи, яка має принаймні одне кільце, що має сполучену р-електронну систему й містить карбоциклічнии арил (наприклад, феніл) і гетероциклічний арил (наприклад, піридин). Термін "карбоциклічний" стосується сполуки, що містить одну або кілька ковалентно замкнутих кільцевих структур так, 65 ЩО всі атоми, які утворюють структуру кільця, є атомами вуглецю. Термін, таким чином, відокремлює карбоциклічні кільця від гетероциклічних кілець, в яких кільцева структура містить принаймні один атом, що відрізняється від вуглецю. Термін "гетероарил" стосується арильної групи, яка містить принаймні одне гетероциклічне кільце.

Термін "галоген" стосується атома, вибраного з групи, що складається зі фтору, хлору, брому та йоду.

Термін "кетон" стосується хімічної складової формули -(К) й-СО-К, де К і К вибрані з групи, що складається з насиченого або ненасиченого алкілу і п'ятичленних чи шестичленних арильних або гетероарильних складових, і де п - 0 або 1.

Термін "карбонова кислота" стосується хімічної складової формули -(К)-СООН, де К вибрана з групи, що складається з насиченого або ненасиченого алкілу й п'ятичленних чи шестичленних арильних або /о гетероарильних складових, ідеп-0 або 1.

Термін "естер" стосується хімічної складової формули -(К)4-СООК, де К і К' незалежно вибрані з групи, що складається з насиченого або ненасиченого алкілу й п'ятичленних чи шестичленних арильних або гетероарильних складових, і де п - 0 або 1.

Термін "спирт" стосується хімічного замісника формули -КОН, де К вибрана з групи, що складається з водню, /5 насиченого або ненасиченого алкілу й п'ятичленних чи шестичленних арильних або гетероарильних складових, де кільце за бажанням заміщено на один або кілька замісників, незалежно вибраних з групи, що складається зі складових алкілу, галогену, тригалометилу, карбоксилату, нітрогрупи та естеру.

Термін "амід" стосується хімічного замісника формули -МНСОК, де К вибрана з групи, що складається з водню, алкілу, гідроксилу й п'ятичленних чи шестичленних арильних або гетероарильних складових, де кільце за бажанням заміщено на один або кілька замісників, незалежно вибраних з групи, що складається з алкілу, галогену, тригалометилу, карбоксилату, нітрогрупи або естеру.

Термін "складова алкокси" стосується хімічного замісника формули -ОК, де К - це водень чи насичена або ненасичена алкільна складова.

Термін "альдегід" стосується хімічної складової формули -(К),-СНО, де К вибрана з групи, що складається з сч об насиченого або ненасиченого алкілу й п'ятичленних чи шестичленних арильних або гетероарильних складових, і де п -- 0 або 1. (8)

Термін "сульфон" стосується хімічної складової формули -505-К, де К вибрана з групи, що складається з насиченого або ненасиченого алкілу й п'ятичленних чи шестичленних арильних або гетероарильних складових.

В іншому кращому втіленні винахід стосується сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має структуру, ю зо наведену у формулі І, де Кз і Кі незалежно вибрані з групи, що складається з водню й насиченого або ненасиченого алкілу. юю

У ще одному кращому втіленні винахід стосується сполуки похідної 5-азахіноксаліну, що має структуру, ю наведену у формулі І, де К»з і Ку є атомами водню.

В інших кращих втіленнях винахід стосується сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має структуру, -- зв наведену у формулі І, де Ку і Ко» вибрані з групи, що складається з водню, насиченого або ненасиченого алкілу, ї- п'ятичленного чи шестичленного арилу або гетероарильної кільцевої складової, за бажанням заміщеної на один, два або три замісники, незалежно вибрані з групи, що складається зі складових алкілу, галогену, тригалометилу, гідрокси, алкокси, карбоксилату, нітрогрупи та естеру.

У інших кращих втіленнях винахід стосується сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має структуру, « наведену у формулі І, де К: - це феніл, за бажанням заміщений на один, два або три замісники, незалежно з с вибрані з групи, що складається з алкілу, галогену, гідрокси й алкокси складових.

В іншому кращому втіленні винахід стосується сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має структуру, ;» наведену у формулі І, де К. - це феніл.

У ще одному кращому втіленні винахід стосується сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має структуру, наведену у формулі І, де Ку - це 4-гідроксифеніл. -І В інших кращих втіленнях винахід стосується сполуки похідної 5-азахіноксаліну, що має структуру, наведену у формулі І, де Ко вибрано з групи, що складається з водню, насиченого або ненасиченого алкілу й фенілу, за - бажанням заміщеного на один, два або три замісники, незалежно вибрані з групи, що складається з алкілу, с галогену, гідрокси й алкокси складових.

В іншому кращому втіленні винахід стосується сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має структуру, о наведену у формулі І, де К» - це водень. сп У ще одному кращому втіленні винахід стосується сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має структуру, наведену у формулі І, де К» - це метил.

У ще одному кращому втіленні винахід стосується сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має структуру, ов наведену у формулі І, де К» - це феніл.

В іншому кращому втіленні винахід стосується сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має структуру,

Ф) наведену у формулі І, де Ху - це атом азоту або кисню. ка У ще одному кращому втіленні винахід стосується сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має структуру, наведену у формулі І, де Ху - це кисень. во У ще одному кращому втіленні винахід стосується сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має структуру, наведену у формулі І, де Ху - це атом азоту.

В інших кращих втіленнях винахід стосується сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має структуру, наведену у формулі І, де Ку; вибрано з групи, що складається з водню, насиченого або ненасиченого алкілу, за бажанням заміщеного на п'ятичленну чи шестичленну арильну або гетероарильну кільцеву складову, за 65 бажанням заміщену на один, два або три замісники, незалежно вибрані з групи, що складається зі складових алкілу, галогену, тригалометилу, гідрокси, алкокси, карбоксилату, нітрогрупи й естеру; і п'ятичленної чи шестичленної арильної або гетероарильної кільцевої складової, за бажанням заміщеної на один, два або три замісники, незалежно вибрані з групи, що складається зі складових алкілу, галогену, тригалометилу, гідрокси, алкокси, карбоксилату, нітрогрупи та естеру.

У інших кращих втіленнях винахід стосується сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має структуру, наведену у формулі І, де Кб і Х/ складові, взяті разом, утворюють сполуку, яка вибрана з групи, що складається із замісників ЗАОАНВ.

Термін "замісники ЗБАСАМК" стосується групи замісників, що складається з метокси, бензиламіно, 4-фторбензиламіно, 2-карбоксибензиламіно, З-карбоксибензиламіно, 4-карбоксибензиламіно, 70 2-нітробензиламіно, З-нітробензиламіно, 4-нітробензиламіно, 2-метилбензиламіно, З-метил-бензиламіно, 4-метилбензиламіно, 2-хлорбензиламіно, З-хлорбензиламіно, 4-хлорбензиламіно, 2-фторбензиламіно,

З-фторбензиламіно, 4-фторбензиламіно, 2-(трифторметил)бензиламіно, З-(трифторметил)бензиламіно, 4-(«трифторметил)бензиламіно, фенетил-1-аміно, феніламіно, 2-карбоксифеніламіно, З-карбоксифеніламіно, 4-карбоксифеніламіно, 2-нітрофеніламіно, З-нітрофеніламіно, 4-нітрофеніламіно, 2-метилфеніламіно, 7/5 З-метилфеніламіно, 4-метилфеніламіно, 2-хлорфеніламіно, З-хлорфеніламіно, 4-хлорфеніламіно, 2-фторфеніламіно, З-фторфеніламіно, 4-фторфеніламіно, 2-(трифторметил)фен(ламіно,

З-(трифторметил)феніламіно, 4-(трифторметил)феніламіно, пірид-2-аміно, пірид-З-аміно, пірид-4-аміно та пірид-2-метиламіно.

Термін "бензиламіно" стосується групи, що має структуру, наведену в наступній формулі:

Н, йо де арильне кільце може бути за бажанням заміщене у 2, З або 4 положенні.

Термін "феніламіно" стосується групи, що має структуру, наведену в наступній формулі: сч со о де арильне кільце може бути за бажанням заміщене в 2, З або 4 положенні. ІС о)

Термін "фенетил-1-аміно" стосується групи, що має структуру, наведену в наступній формулі: ою ето :

ЦІ «-

Зо Термін "пірид-2-аміно" стосується піридинового кільця, яке заміщене на МН-групу в 2 положенні. Таким ї- самим чином, терміни "пірид-З-аміно" і "пірид-4-аміно" стосуються піридинового кільця, яке заміщене на

МН-групу у З і 4 положеннях, відповідно.

У ще іншому кращому втіленні винахід стосується сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має структуру, « наведену у формулі І, де сполука - похідна 5-азахіноксаліну вибрана з групи, що складається зі сполук ЗАОАДК.

ІМ. Способи синтезу винаходу З с В іншому аспекті винахід стосується фармацевтичної композиції, що складається зі сполук, які мають "» структуру формули І, як описано в цьому винаході, або будь-якої з її підгруп, наведених в цьому винаході, або " її солі та фізіологічно прийнятного носія або розчинника.

У кращому втіленні винахід стосується фармацевтичної композиції, де сполука - похідна 5-азахіноксаліну вибрана з групи, що складається зі сполук ЗАОАВ. ш- Термін "фармацевтична композиція" стосується суміші сполуки 5-азахіноксаліну даного винаходу з іншими - хімічними компонентами, такими як розчинники або носії. Фармацевтична композиція полегшує введення сполуки в організм. У галузі існують чисельні способи введення сполук, включаючи, крім іншого, оральне, о ін'єкційне, аерозольне, парентеральне та місцеве введення. Фармацевтичні композиції можуть також бути с 20 одержані за допомогою реакції сполук з неорганічними кислотами, такими як соляна кислота, бромводнева кислота, сірчана кислота, азотна кислота, фосфорна кислота, метансульфонова кислота, етансульфонова сл кислота, п-толуолсульфонова кислота, саліцилова кислота й подібні.

Термін "фізіологічно прийнятний" стосується носія або розчинника, що не перешкоджає біологічній активності й властивостям сполуки. 59 Термін "носій" стосується хімічної сполуки, що сприяє включенню сполуки в клітини або тканини. Наприклад,

ГФ) диметилсульфоксид (ОМ5О) є носієм, що зазвичай використовується, оскільки він сприяє поглинанню багатьох органічних сполук в клітини або тканини організму. де Термін "розчинник" стосується хімічної сполуки, розведеної у воді, що розчиняє потрібну сполуку, а також стабілізує біологічно активні сполуки. Солі, розчинені у буферних розчинах, використовуються у галузі як 60 розчинники. Одним зазвичай використовуваним буферним розчином є фосфатний буферний розчин, тому що він нагадує сольовий стан крові людини. Оскільки буферні солі можуть контролювати рН розчину за низьких концентрацій, забуферений розчинник рідко модифікує біологічну активність сполуки.

У ще іншому аспекті винахід стосується способу синтезування сполук винаходу, що складається з етапів: (а) реакції 2-аміно-6-хлор-3-нітропіридину з другою реагуючою речовиною в розчиннику й у присутності основи, де бо» друга реагуюча речовина вибрана з групи, що складається зі спирту та аміну, з утворенням першого інтермедіату; (б) реакції першого інтермедіату з 1,2-діоном у присутності каталізатора і відновлюючого агента; і (г) очищення кінцевого продукту.

Термін "1,2-діон" стосується хімічної складової формули К 4-С(0)С(0)-Ко де К) і Ко незалежно вибрані з

Групи, що складається з водню; насиченого або ненасиченого алкілу, за бажанням заміщеного на п'ятичленну чи шестичленну арильну або гетероарильну кільцеву складову, за бажанням заміщену на один, два або три замісники, вибрані незалежно з групи, що складається зі складових алкілу, галогену, тригалометилу, гідрокси, алкокси, карбоксилату, нітрогрупи та естеру; і п'ятичленної чи шестичленної арильної або гетероарильної кільцевої складової, за бажанням заміщеної на один, два або три замісники, вибрані незалежно з групи, що 7/0 складається зі складових алкілу, галогену, тригалометилу, гідрокси, алкокси, карбоксилату, нітрогрупи та естеру.

У кращому втіленні винахід стосується способу синтезу сполук винаходу де розчинником є н-бутанол.

В іншому кращому втіленні винахід стосується способу синтезу сполук винаходу, де основою є карбонат калію у вигляді порошку.

У ще одному кращому втіленні винахід стосується способу синтезу сполуки винаходу, де друга реагуюча /5 речовина вибрана з групи, що складається з реагентів ЗАОАК.

Термін "реагенти БАСАК" стосується групи реагентів, що складається з метанолу, бензиламіну, 4-фторбензил аміну, 2-карбоксибензиламіну, З-карбоксибензиламіну, 4-карбоксибензиламіну, 2-нітробензиламіну, З-нітробензиламіну, 4-нітробензиламіну, 2-метилбензиламіну, З-метилбензиламіну, 4-метилбензиламіну, 2-хлорбензиламіну, З-хлорбензиламіну, 4-хлорбензиламіну, / 2-фторбензиламіну,

З-фторбензиламіну, 4-фторбензиламіну, 2-(трифторметил)бензиламіну, З-(трифторметил) бензиламіну, 4-(трифторметил)бензиламіну, фенетил-1-аміну, аніліну, 2-карбоксианіліну, З-карбоксианіліну, 4-карбоксианіліну, 2-нітроаніліну, З-нітроаніліну, 4-нітроаніліну, 2-толуїдину, З-толуїдину, 4-толуїдину, 2-хлораніліну, З-хлораніліну, 4-хлораніліну, 2-фтораніліну, З-фтораніліну, 4-фтораніліну, 2-(трифторметил)аніліну, З-«трифторметил)аніліну, 4-"«трифторметил)аніліну, 2-амінопіридину, З-амінопіридину, сч ов 4-амінопіридину та 2-метиламінопіридину.

У ще одному кращому втіленні винахід стосується способу синтезу сполуки винаходу, де третя реагуюча і) речовина вибрана з групи, що складається з 4-гідроксифенілгліоксалю, 1-феніл-1,2-пропандіону та бензилу.

Термін "каталізатор", що використовується в цьому винаході, стосується хімічної молекули, що при додаванні до групи реагентів може підвищувати швидкість, за якої реагенти реагують з утворенням продуктів. ю

Зо Багато типів каталізаторів є добре відомими звичайним фахівцям у цій галузі.

У кращому втіленні винахід стосується способів синтезування сполук винаходу, де відновлюючий агент - це юю водень. ю

В іншому кращому втіленні винахід стосується способів синтезування сполук винаходу, де каталізатором є нікелевий каталізатор Ренея. --

Короткий опис винаходу, наведений вище, не є обмежуючим, й інші риси та переваги винаходу стануть р. очевидними з наступного опису кращих втілень і формули винаходу.

Цей винахід частково спрямований на способи модулювання функції серинових/треонінових протеїнкіназ сполуками - похідними 5-азахіноксаліну. Крім того, винахід частково стосується способів ідентифікації сполук, що модулюють функцію серинових/треонінових протеїнкіназ. До способів належать клітини, що експресують « серинову/греонінову протеїнкіназу, таку як КАР. з с КАР - це нерецепторна протеїнкіназа, що зв'язана з клітинною мембраною, коли вона зв'язується з . активованою КАБ, гуанінтрифосфатгідролізуючим ферментом. КАБ активується, коли активована рецепторна и?» тирозинова протеїнкіназа, така як ЕСЕК або РОСЕК, зв'язується з адапторним білком - ЗКВ2, і фактор обміну гуанінових нуклеотидів - ЗХО5. 505 видаляє гуаніндифосфат з КА5, заміщує його на гуанінтрифосфат, і, таким чином, активує КАЗ. КАЗ потім зв'язує КАРЕ і таким чином активує КАР. КАР може потім фосфорилувати інші -І білкові мішені по залишкам серину та треоніну, таких як кіназа (МЕК), що фосфорилує і таким чином активує мітоген-активовану протеїнкіназу (МАРК). Таким чином, КАБ існує як проміжний контролюючий фактор у - мітоген-активованій передачі сигналу. с Завдяки важливий регуляторній ролі КАЕ в клітинах модифікації послідовності амінокислот КАЕ можуть 5о Змінити її функцію і, таким чином, модифікувати життєдіяльність клітини. Роль КАР у проліферації клітини є о значною, виходячи зі спостереження, що мутації послідовності амінокислот КАРЕ пов'язані з пухлинами та сп раками. Оскільки мутації КАЕ, що призводять до утворення раку в клітинах, виявляються такими, що їм властива нездатна до регулювання каталітична активність, то інгібітори КАБ можуть послаблювати або навіть перешкоджати проліферації клітини, що призводить до раку в цій клітині.

Способи цього винаходу можуть виявити сполуки, що модулюють функцію протеїнкінази КАЕ в клітинах. КАРЕ фосфорилує протеїнкіназу (МЕК), яка у свою чергу фосфорилує мітоген-активовану протеїнкіназу (МАРК). Тести,

Ф) що визначають лише фосфорилування МЕК за допомогою КАРЕ, не є чутливими, тому що рівень ка фосфорилування МЕК є значним. Для подолання цієї проблеми чутливості використовують фосфорилування

МЕК їі МАРК у тестах цього винаходу. Сигнал фосфорилування МАРК підсилює сигнал фосфорилування МЕК і бо приводить до КАР-залежного фосфорилування у ферментному імуносорбентному аналізі. Крім того, краще, якщо тест винаходу виконується так, що багато сполук можуть бути швидко виявлені за короткий проміжок часу.

Способи цього винаходу визначають сполуки, що інгібують функцію протеїнкінази КАР. Ці сполуки є похідними 5-азахіноксаліну. Хоча похідні 5-азахіноксаліну були перевірені на їх здатність |інгібувати ферменти, що приймають участь у синтезі нуклеотидів у бактерій, багато з цих сполук не були досліджені б5 стосовно інгібування протеїнкінази.

Оскільки КАЕ виявляє значну амінокислотну гомологію з іншими сериновими/треоніновими протеїнкіназами,

5-азахіноксалінові сполуки винаходу можуть імовірно інгібувати серинові/треонінові протеїнкінази, інші, ніж

КАР. Таким чином, способи винаходу також стосуються серинових/треонінових протеїнкіназ інших, ніж КАБЕ, включаючи рецепторні й нерецепторні серинові/треонінові протеїнкінази.

Способи винаходу також стосуються інших сполук, що модулюють функцію КАБ в клітинах, оскільки властивості способу дозволяють визначати багато молекул за короткий проміжок часу. Таким чином, способи винаходу можуть ідентифікувати існуючі молекули, не описані у цьому винаході, що модулюють функцію КАР.

Ї. Біологічна активність сполук похідних 5-азахіноксалину

Сполуки - похідні 5-азахіноксаліну цього винаходу перевіряли на їх здатність інгібувати функцію /о протеїнкінази КАР. У цьому винаході представлено біологічні тести й результати цих досліджень щодо інгібування. Способи, що використовуються для модулювання функції протеїнкіназ сполуками - похідними 5-азахіноксаліну, подібні до тих, що описані у заявці США Мо08/702232, на ім'я Тапод еї аїЇ., яка має назву: "Комбінаторні бібліотеки індолінолу й відповідні продукти та способи лікування хвороби" ((уоп 5 Іуоп ОоскКеї

Мо221/187), зареєстрована 23 серпня, 1996 року, стосовно аспекту високої ефективності цього способу. Заявка 08/702232 включена сюди шляхом посилання цілком, включаючи будь-які малюнки.

І. Хвороби, що лікуються сполуками похідними 1,4.5-триазанафталіну

Способи, сполуки та фармацевтичні композиції, описані в цьому винаході, розроблені для інгібування проліферативних розладів клітини модулюванням функції протеїнкінази КАР. Проліферативні розлади призводять до небажаної проліферації клітин одного або кількох осередків клітин у багатоклітинному організмі, що веде до пошкодження організму. Способи, сполуки та фармацевтичні композиції, описані в цьому винаході, можуть також бути корисними для лікування й попередження інших розладів в організмах, таких як завчасна смерть клітин (тобто, хвороби нервової системи) або запалення. Ці хвороби можуть прогресувати завдяки молекулам КАБ, що функціонують неналежним чином, або завдяки протеїнкіназам КАРЕ, що функціонують неналежним чином. с

Зміни функції протеїнкінази КАЕ або протеїнкіназ, пов'язаних з КАРЕ, можуть привести до підвищеної або зменшеної здатності клітин до проліферації за певних хвороб. До змінених умов проліферації клітин належать і) раки, фібрози, мезангіальні розлади, ненормальний ангіогенез і васкулогенез, загоєння ран, псоріаз, рестеноз і запалення.

Фібрози - це ненормальне утворення зовнішньоклітинного матриксу. Прикладом фіброзу є цироз печінки. ю

Зо Цироз печінки описується як підвищена концентрація складників зовнішньоклітинного матриксу, що призводить до утворення печінкового рубця. юю

Ненормальна проліферація клітин відбувається внаслідок ненормальної проліферації мезангіальних клітин. ю

До мезанпальних проліферативних розладів належать різні ниркові хвороби людини, такі як гломерулонефрити, діабетичні нефропатії, злоякісний нефросклероз, синдроми тромбічних ангіопатій, відторгнення трансплантатута її" гломерулопатії. ї-

До типів раку, що можна лікувати способами та сполуками винаходу, належать рак легень, рак яєчників, рак грудей, рак мозку, міжвісьовий рак мозку, рак товстої кишки, рак простати, саркома Капоші, меланома й гліома.

Доказ того, що сполуки та способи винаходу можуть ефективно бути використані для затримання й зупинення проліферації ракових клітин, наведений в цьому винаході шляхом посилання. «

Ангіогенні й васкулогенні розлади з'являються внаслідок надлишку проліферації кровоносних судин. з с Проліферація кровоносних судин є необхідною в багатьох нормальних фізіологічних процесах, таких як розвиток . ембріону, утворення жовтого тіла, загоєння ран і регенерація органів. Проте, проліферація кровоносних судин є и?» також необхідною для розвитку пухлини. До інших прикладів розладів проліферації кровоносних судин належать артрит, де нові капілярні кровоносні судини проникають крізь суглоб і руйнують хрящ. Крім того, до хвороб проліферації кровоносних судин належать хвороби ока, такі як діабетична ретинопатія, де нові капіляри в -І сітківці проникають крізь склоподібний елемент, починають кровоточити й викликати сліпоту. | навпаки, розлади, що стосуються звуження, скорочення або закривання кровоносних судин, такі як рестеноз, також - беруть участь у шкідливому регулюванні протеїнкіназ. с Крім того, васкулогенез і ангіогенез пов'язані з ростом злоякісних твердих пухлин і метастаз. Енергійно

Зростаюча пухлина потребує багато поживних речовин і кисню для продовження росту. Як наслідок, о ненормально велика кількість капілярів кровоносних судин часто виростає разом з пухлиною, і вони діють як с постачальники вищезгаданих компонентів пухлини. Крім того, для постачання поживних речовин до пухлини нові кровоносні судини, що пронизують пухлину, забезпечують прохід клітинам пухлини до кровообігу й метастазування у віддалених ділянках організму. ГоЇКтап, 1990, у). Май). Сапсег Іпві 82:4-6.

Ненормальна активність КАЕ може стимулювати розлади проліферації клітини. Виявилось, що молекули, які специфічно модулюють функцію протеїнкінази КАР, здатні інгібувати проліферацію клітин. Зокрема,

Ф) антизмістовні молекули нуклеїнової кислоти, які були створені для зв'язування з мРНК, що кодує протеїнкіназу ка КАРЕ їі блокує трансляцію цієї МРНК, ефективно попереджали трансформацію клітин А5б49 іп міго. Мопіа еї аї., 1996, Майшге Медадісіпе 2: 688, включений сюди цілююм шляхом посилання з усіма малюнками та таблицями. во Клітини А549 - це злоякісні клітини людини.

Ці спрямовані на КАР дослідження з використанням антизмістовних молекул РНК довели, що 5-азахіноксалінові молекули винаходу, які модулюють функцію протеїнкінази КАБ, можуть затримувати й імовірно зупиняти проліферацію злоякісних клітин в організмі. Ці сполуки 5-азахіноксаліну можуть бути перевірені способами іп міго, як наведено в цьому винаході за допомогою прикладів. Крім того, сполуки 65 5-азахіноксаліну можуть бути перевірені на їх вплив на клітини пухлин іп мімо способами з використанням ксенотрансплантата, як наведено в цьому винаході за допомогою прикладів.

Існують принаймні два шляхи, в яких ненормальна активність КАБ може стимулювати небажану проліферацію клітин окремого типу клітин: (1) прямо стимулюючи ріст окремих клітин, або (2) підвищуючи васкуляризацію окремих ділянок, таких як тканини пухлин, таким чином полегшуючи ріст тканин.

Використання цього винаходу полегшується завдяки ідентифікації того, чи є проліферація клітин

КАР-обумовленою. Як тільки це з'ясовано, пацієнти, що страждають на такий розлад, можуть бути визначені аналізуванням їх симптомів, використовуючи процедури, добре відомі лікарям або ветеринарам зі звичайним досвідом у галузі. Такі пацієнти можуть потім лікуватися, як описано в цьому винаході.

Визначення того, чи є розлад проліферації клітин КАБР-обумовленим, може бути здійснено спочатку /о визначенням рівня активності КАК в клітині або в окремих розташуваннях тіла пацієнта. Наприклад, у випадках раку рівень однієї або кількох активностей КАРЕ може бути порівняний з необумовленими КАРЕ-типами раку і

КАР-обумовленим типами раку. Якщо ракові клітини мають вищий рівень активності КАРЕ, ніж КАР-обумовлені типи раку, то краще, якщо такий самий або більший рівень, ніж КАР-обумовлені типи раку, тоді вони мають лікуватися, використовуючи описані способи модулювання КАБ і сполуки винаходу.

У випадках розладів проліферації клітин, що виникли завдяки небажаній проліферації неракових клітин, рівень активності КАЕ порівнюють з рівнем, що зустрічається в загальній популяції (наприклад, середній рівень в загальній популяції людини або тварин, за винятком тих людей або тварин, що страждають на розлад проліферації клітин). Якщо небажана проліферація клітин характеризується вищим рівнем КАБ, ніж у загальній популяції, тоді цей розлад потрібно лікувати, використовуючи описані способи й сполуки винаходу для Модулювання КАРЕ.

ІН. Фармацевтичні композиції й уведення сполук - похідних 5-азахіноксаліну

Способи приготування фармацевтичних композицій сполук, способи визначення кількості сполуки для введення пацієнтові й шляхи введення сполук в організм описані в заявці США Мо08/702232, Тапао еї аї., яка має назву: "Комбінаторні бібліотеки індолінолу й відповідні продукти та способи лікування хвороби" (Гуоп «є Іуоп с ов Боскеї Мо221/187), зареєстрована 23 серпня 1996 року, і міжнародна патентна заявка УМО 96/22976, Виггеці еї аі,, яка має назву "Водорозчинні похідні З-ариліден-2-оксіндол як інгібітори тирозинкінази", опублікована 1 (8) серпня 1996 року, обидві включені сюди цілююом шляхом посилання, включаючи будь-які малюнки. Фахівці у галузі визнаватимуть, що такі описи придатні до цього винаходу й можуть бути легко застосовані.

Приклади ю зо Нижченаведені приклади є необмежуючими й лише ілюструють різні аспекти й властивості цього винаходу.

Приклади описують способи синтезування сполук винаходу й способи вимірювання впливу сполуки на функцію юю протеїнкінази КАБК. ю

Клітини, що використовуються у способах, є комерційно доступними. Вектори нуклеїнових кислот, що потрапляють у клітину, є також комерційно доступними й послідовності генів для різних протеїнкіназ є легко -- з5 доступними в банках даних послідовностей. Таким чином, звичайний фахівець у галузі може легко відтворити М клітинні лінії своєчасно шляхом комбінування комерційно доступних клітин, комерційно доступних векторів нуклеїнових кислот і генів протеїнкіназ, використовуючи методи, що є у розпорядженні звичайних фахівців у цій галузі.

Приклад 1: Процедури синтезу сполук похідних 5-азахіноксаліну «

Винахід буде проілюстровано наступними прикладами, що не є обмеженими, в яких, якщо інше не вказано: в с (Ї) випаровування виконували обертальним випаровуванням у вакуумі; . (і) операції виконували в атмосфері інертного газу, такого як азот; и?» (ії) рідинну хроматографію високої розподільної здатності (НР С) виконували на Мегск ГіСпгозогь КР-18 силікагелі зі зворотною фазою, придбану у Е. Мегск, Дармштадт, Німеччина; (м) виходи наведені лише для ілюстрації і не обов'язково є максимально досяжними; -І (М) точки плавлення наведені без врахування поправки й визначались, використовуючи цифровий апарат для визначення точки плавлення НУУЗ Маїп2 ЗО 2000; - (мі) структури всіх сполук формули (І) цього винаходу підтверджували протонною магнітно-резонансною с спектроскопією на спектрофотометрі Вгикег АМХ500О-ММЕ, а також мікроаналізом елементів, і, в певних випадках, мас-спектроскопією; о (мії) чистоту структур перевіряли тонкошаровою хроматографією (ТІ С), використовуючи силікагель (Мегск сп Зіїйса Се! 60 Е254) або за допомогою НРІ С; і (мії) проміжні речовини повністю не були описані й чистоту оцінювали тонкошаровою хроматографією (ТІ С) або НРІ С. 5Б Процедури синтезу

Сполука А-2: б-бензиламіно-3-(4-гідроксиФеніл)-5-азахіноксалін

Ф) 4-Гідроксифенілгліоксаль одержували з 4-гідроксиацетофенону (І апсавіег, Асговз) згідно з опублікованим ка методом (у). Атег. Спет. ос, 71, 1045 (1949)). 2-Аміно-6-бензиламіно-З-нітропіридин одержували з 2-аміно-б-хлор-З-нітропіридину наступним чином: бо /2-аміно-б-хлор-З-нітропіридин (17,35г, 0,1Омоль), бензиламін (Ріка) (10,72г, О,1Омоль) і порошок карбонату калію порошок (10,4г, 0,0З3Б5моль) у н-бутанолі (100мл) нагрівали при дефлегмації протягом 2 годин. Суспензію фільтрували й після охолодження до кімнатної температури тверду речовину збирали за допомогою фільтрації, промивали бутанолом і висушували при 50"С у вакуумі для утворення 2-аміно-6-бензиламіно-3-нітропіридину (22,2г, 9190, т.пл. 145-1467С). 65 б-Бензиламіно-3-(4-гідроксифеніл)-5-азахіноксалін одержували з 2-аміно-б-бензиламіно-3-нітропіридину наступним чином: 2-аміно-б-бензиламіно-3-нітропіридин (25г, О,1Омоль) гідрогенізували під тиском в 5,5бар Но в присутності 1О0г нікелевого каталізатора Ренея у 400мл діоксану при 60"С. За 2 години реакційну суміш охолоджували до кімнатної температури, фільтрували й додавали 4-гідроксифенілгліоксаль і перемішували протягом 2 годин в атмосфері аргону. Суспензію потім розводили водою, тверду речовину збирали за

Допомогою фільтрації, промивали водою, рекристалізували з 2-пропанолом і висушували при 50"С у вакуумі для утворення б-бензиламіно-(4-гідроксифеніл)-5-азахіноксаліну (8г, 24490, т.пл. 271-273").

Сполука А-1: 6-Феніламіно-3-(4-гідроксифеніл)-5-азахіноксалін

Застосування феніламіну замість бензиламіну у процедурі для Сполуки А-2 та ідентичний процес дає б-феніламіно-3-(4-гідроксифеніл)-5-азахіноксалін. 70 Сполука А-3: б-метокси-2-метил-3-Феніл-5-азахіноксалін Застосування 1-феніл-1,2-пропандіону замість 4-гідроксифенілгліоксалю і метанолу замість бензиламіну у процедурі для Сполуки А-2 та ідентичний процес дає б-метокси-2-метил-З-феніл-5-азахіноксалін.

Сполука А-4: б-метокси-2,3-дифеніл-5-азахіноксалін

Застосування бензилу замість 4-гідроксифенілгліоксалю і метанолу замість бензиламіну у процедурі для

Сполуки А-2 та ідентичний процес дає б-метокси-2,3-дифеніл-5-азахіноксалін.

Сполука А-5: 6-(4-Фторбензиламіно)-2-метил-3-феніл-5-азахіноксалін

Застосування 1-феніл-1,2-пропандіону замість 4-гідроксифенілгліоксалу й 4-фторбензиламіну замість бензиламіну у процедурі для Сполуки А-2 та ідентичний процес дає 6-(4-фторбензиламіно)-2-метил-3-феніл-5-азахіноксалін.

Сполука А-6: 2,3-дифеніл-6-(4-фторбензиламіно)-5-азахіноксалін

Застосування бензилу замість 4-гідроксифенілгліосксалю й 4-фторбензиламіну замість бензиламіну у процедурі для Сполуки А-2 та ідентичний процес дає 2,3-дифеніл-6-(4-фторбензиламіно)-5-азахіноксалін.

Сполука А-7: З-феніл-б-феніламіно-5-азахіноксалін

Застосування фенілгліоксалю замість 4-гідроксифенілгліоксалю й аніліну замість бензиламіну у процедурі сч ов для Сполуки А-2 та ідентичний процес дає З-феніл-б6-феніламіно-5-азахіноксалін.

Сполука А-8: А-26 і)

Застосування належним чином заміщеного бензиламіну замість бензиламіну у процедурі для Сполуки А-2 та ідентичний процес дає наступні Сполуки:

Сполука А-8: 6-(2-Карбоксибензиламіно)-3-(4-гідроксифеніл)-5-азахіноксалін ю зо Сполука А-9: 6-(3-Карбоксибензиламіно)-3-(4-гідроксифеніл)-5-азахіноксалін

Сполука А-10: 6-(4-Карбоксибензиламіно)-3-(4-гідроксифеніл)-5-азахіноксалін о

Сполука А-11: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(2-нітробензиламіно)-5-азахіноксалін ю

Сполука А-12: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(3-нітробензиламіно)-5-азахіноксалін

Сполука А-13: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(4-нітробензиламіно)-5-азахіноксалін --

Сполука А-14: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(2-метилбензиламіно)-5-азахіноксалін ї-

Сполука А-15: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(3-метилбензиламіно)-5-азахіноксалін

Сполука А-16: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(4-метилбензиламіно)-5-азахіноксалін

Сполука А-17: 6-(2-Хлорбензиламіно)-3-(4-гідроксифеніл)-5-азахіноксалін

Сполука А-18: 6-(3-Хлорбензиламіно)-3-(4-гідроксифеніл)-5-азахіноксалін «

Сполука А-19: 6-(4-Хлорбензиламіно)-3-(4-гідроксифеніл)-5-азахіноксалін з с Сполука А-20: 6-(2-Фторбензиламіно)-3-(4-гідроксифеніл)-5-азахіноксалін . Сполука А-21: 6-(3-Фторбензиламіно)-3-(4-гідроксифеніл)-5-азахіноксалін и?» Сполука А-22: 6-(4-Фторбензиламіно)-3-(4-гідроксифеніл)-5-азахіноксалін

Сполука А-23: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(2-(трифторметил)бензиламіно)|-5-азахіноксалін

Сполука А-24: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-І(З--трифторметил)бензиламіно)|-5-азахіноксалін -І Сполука А-25: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-І(4-(трифторметил)бензиламіно)|-5-азахіноксалін

Сполука А-26: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(фенетил-1-аміно)-5-азахіноксалін. - Сполука А-27 - А-48 с Застосування належним чином заміщеного аніліну замість бензиламіну у процедурі для Сполуки А-2 та ідентичний процес дає наступні Сполуки: о Сполука А-27: 6-(2-Карбоксифеніламіно)-3-(4-гідроксифеніл)-5-азахіноксалін сп Сполука А-28: 6-(3-Карбоксифеніламіно)-3-(4-гідроксифеніл)-5-азахіноксалін

Сполука А-29: 6-(4-Карбоксифеніламіно)-3-(4-гідроксифеніл)-5-азахіноксалін

Сполука А-30: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(2-нітрофеніламіно)-5-азахіноксалін

Сполука А-31: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(З-нітрофеніламіно)-5-азахіноксалін

Сполука А-32: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(4-нітрофеніламіно)-5-азахіноксалін

Ф) Сполука А-33: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(2-метилфеніламіно)-5-азахіноксалін ка Сполука А-34: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(3-метилфеніламіно)-5-азахіноксалін

Сполука А-35: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(4-метилфеніламіно)-5-азахіноксалін во Сполука А-36: 6-(-2-Хлорфеніламіно) 3-(4-гідроксифеніл)-5-азахіноксалін

Сполука А-37: 6-(3-Хлорфеніламіно) 3-(4-гідроксифеніл)-5-азахіноксалін

Сполука А-38: 6-(4-Хлорфеніламіно) 3-(4-гідроксифеніл)-5-азахіноксалін

Сполука А-39: 6-(2-Фторфеніламіно) 3-(4-гідроксифеніл)-5-азахіноксалін

Сполука А-40: 6-(3-Фторфеніламіно) 3-(4-гідроксифеніл)-5-азахіноксалін 65 Сполука А-41: 6-(4-Фторфеніламіно) 3-(4-гідроксифеніл)-5-азахіноксалін

Сполука А-42: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(2-трифторметил)феніламіно|-5-азахіноксалін

Сполука А-43: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(З-трифторметил)феніламіно|-5-азахіноксалін

Сполука А-44: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(4-трифторметил)феніламіно|-5-азахіноксалін

Сполука А-45: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(пірид-2-аміно)-5-азахіноксалін

Сполука А-46: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(пірид-3-аміно)-5-азахіноксалін

Сполука А-47: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(пірид-4-аміно)-5-азахіноксалін

Сполука А-48: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(пірид-2-метиламіно)|-5-азахіноксалін

Сполуки А-49 - -А-67

Застосування належним чином заміщеного бензиламіну замість бензиламіну і фенілгліоксалю замість 7/0 4-гідроксифенілгліоксалю у процедурі для Сполуки А-2 та ідентичний процес дає наступні Сполуки:

Сполука А-49: 6-(2-Карбоксибензиламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін

Сполука А-50: 6-(3-Карбоксибензиламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін

Сполука А-51: 6-(4-Карбоксибензиламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін

Сполука А-52: 6-(2-Нітробензиламіно-3-феніл)-5-азахіноксалін

Сполука А-53: 6-(3-Нітробензиламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін

Сполука А-54: 6-(4-Нітробензиламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін

Сполука А-55: 6-(-2-Метилбензиламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін

Сполука А-56: 6-(3-Метилбензиламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін

Сполука А-57: 6-(4-Метилбензиламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін

Сполука А-58: 6-(2-Хлорбензиламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін

Сполука А-59: 6-(3-Хлорбензиламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін

Сполука А-60: 6-(4-Хлорбензиламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін

Сполука А-61: 6-(2-Фторбензиламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін

Сполука А-62: 6-(3-Фторбензиламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін сч

Сполука А-63: 6-(4-Фторбензиламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін

Сполука А-64: 3-Феніл-6-(2-(трифторметил)бензиламіно)|-5-азахіноксалін і)

Сполука А-65: 3-Феніл-6-(3--трифторметил)бензиламіно)|-5-азахіноксалін

Сполука А-66: 3-Феніл-6-(4--трифторметил)бензиламіно)|-5-азахіноксалін

Сполука А-67: 3-Феніл-6-(фенетил-1-аміно)-5-азахіноксалін ю зо Сполуки А-68 - А-89.

Застосування належним чином заміщеного аніліну замість бензиламіну й фенілгліоксалю замість о 4-гідроксифенілгліоксалю у процедурі для сполуки А-2 та ідентичний процес дає наступні сполуки: ю

Сполука А-68: 6-(2-Карбоксифеніламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін

Сполука А-69: 6-(3-Карбоксифеніламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін --

Сполука А-70: 6-(4-Карбоксифеніламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін ї-

Сполука А-71: 6-(2-Нітрофеніламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін

Сполука А-72: 6-(3-Нітрофеніламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін

Сполука А-73: 6-(4-Нітрофеніламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін

Сполука А-74: 6-(-2-Метилфеніламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін «

Сполука А-75: 6-(3-Метилфеніламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін з с Сполука А-76: 6--4-Метилфеніламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін . Сполука А-77: 6-(-2-Хлорфеніламіно)-3-феніл-5-азахіноксалін и?» Сполука А-78: 6-(З-Хлорфеніламіно) З-феніл-5-азахіноксалін

Сполука А-79: 6-(4-Хлорфеніламіно) З-феніл-5-азахіноксалін

Сполука А-80: 6-(-2-Фторфеніламіно) З-феніл-5-азахіноксалін -І Сполука А-81: 6-(3-Фторфеніламіно) З-феніл-5-азахіноксалін

Сполука А-82: 6-(4-Фторфеніламіно) З-феніл-5-азахіноксалін - Сполука А-83: 3-Феніл-6-(2-трифторметил)феніламіно)|-5-азахіноксалін с Сполука А-84: 3-Феніл-6-((З-трифторметил)феніламіно)|-5-азахіноксалін

Сполука А-85: 3-Феніл-6-(4-трифторметил)феніламіно)|-5-азахіноксалін о Сполука А-86: 3-Феніл-б6-(пірид-2-аміно)-5-азахіноксалін сп Сполука А-87: З3-Феніл-6-(пірид-3-аміно|-5-азахіноксалін

Сполука А-88: 3-Феніл-б6-(пірид-4-аміно)-5-азахіноксалін

Сполука А-89: 3-Феніл-6-(пірид-2-метиламіно)-5-азахіноксалін

Сполука А-90: б-Феніламіно-3-(4-метоксифеніл)-5-азахіноксалін

Застосування 4-метоксифенілу замість 4-гідроксифенілу у процедурі для Сполуки А-1 та ідентичний процес

Ф) дає б-феніламіно-3-(4-меотксифеніл)-5-азахіноксалін. ка Приклад 2: Тест на вимірювання функції фосфорилування КАЕ

Наступний тест визначає кількість каталізованого КАБ фосфорилування його мішені-білка МЕК, а також во мішені МЕК - МАРК. Послідовність гена КАРЕ описана у Воппег еї аї., 1985, Моїес. СеїІ. Віоії. 5:1400-1407, і є легкодоступною у чисельних базах даних послідовність гена. Створення вектора нуклеїнової кислоти й клітинних ліній, використовуваних у цій частині винаходу, повністю описані у Могтізоп еї а, 1988, Ргос. Май. Асай.

Зсі. ОБА 85:8855-8859.

Матеріали та реактиви 65 1. 519 (Бродоріега Ігидірегаа) клітини; ІВСО-ВКІ,, Сайпегзриго, МО. 2. Буфер КІРА: 20мМ Трис/НСЇ рН 7,4; 137мМ Масі, 1090 гліцерин, 1ММ РМ5Е, 5мг/л Апротеніну, 0,595 Тритон х-100; 3. Рекомбінантний білок тіоредоксин-МЕК (Т-МЕК): Т-МЕК експресію й очищення виконували за допомогою афінної хроматографії згідно з інструкціями виробника.

Каталог Мо К 350-01 і К 350-400, Іпийгодеп Согр., Сан-Дієго, штат Каліфорнія, США. 4. Ніз-МАРК (ЕКК 2); Ніз-мічений МАРК експресували у "ХІ 1 Віце сеїІв", трансформованих русС18 вектором, що кодує Ніз-МАРК. Ніз-МАРК очищали Мі-афінною хроматографією. Каталог Мо27-4949-01, РПпагтасіа,

Аламеда, штат Каліфорнія, США, як описано в цьому винаході. 5. Антитіла вівці проти дО: Часквоп Іаброгагіез, МУезі Сгоме, штат Пенсильванія. Каталог Мо515-006-008, 7/0 Номер партії Мо28563 6. Антитіло, специфічне до протеїнкінази КАБ-1: ШКР2653 з ОВІ. 7. Буфер для інкубації: РВ5; фосфатний буферний розчин, СІВСО-ВКІ,, Сайпетгериго, МО. 8. Буфер для промивання: ТВ5Т - 50мММ Трис/НСї. рн 7,2, 150мМ Масі, 0,196 Тритон Х-100 9. Буфер для блокування: ТВ5Т, 0,195 етаноламін рН 7,4; 10. ОМ5О, Зідта, Св. Льюіс, штат Міссурі, США 11. Буфер для кінази (КВ): 20мМ Нерез/НСІ рН 7,2, 150мМ Масі, 0,195 Тритон Х-100, 1ММ РМ5Е, 5мг/л

Апротеніну, 75нм ортованадату натрію, 0,5МмМОТТт і 10мММ Маосі». 12. Суміш АТР: 100мМ Масі», ЗоОмкМ АТФ, 1ОмкКі ур АТФ (Вбиропі-МЕМ)Умл. 13. Розчин для зупинки реакції: 195 фосфорна кислота; Різпег, Піттсобург, штат Пенсильванія, США. 14. Підкладки У/аІІас СеїІшіозе Ріпозрпаї Рінег; У/аІМас, Турку, Фінляндія. 15. Розчин для промивання фільтрів: 195 фосфорна кислота, Різпег, Піттсобург, штат Пенсильванія, США. 16. Колектор для планшетів Топтіес ріа(е пагмевзієг, У/аІас, Турку, Фінляндія. 17. Зчитувач планшетів У/аЇІІас бейа ріаге геадег 2 1205, УМаІас, Турку, Фінляндія. 18. МОМС 96-коміркові з М-подібним дном поліпропіленові планшети для сполук Арріїеа Зсіепійіс Каталог Га Мод5Б-72092.

Процедура о

Усі з наступних етапів проводились за кімнатної температури, якщо додатково не зазначено. 1. Завантаження планшету для ЕГІБА: лунки для ЕГІЗА завантажували 100мкл антисироватки вівці проти миші, очищеної за допомогою афінної хроматографії (1мкг/10Омкл буфера для завантаження), протягом ночі при ю 4"С. Планшети для ЕГІЗА можуть використовуватись протягом двох тижнів при зберіганні при 47С. 2. Перегортали планшет і видаляли рідину. Додавали 100мкл розчину для блокування й інкубували протягом о

ЗОхв. ю 3. Видаляли розчин для блокування і промивали чотири рази буфером для промивання. Струшували планшет на паперовий рушник для видалення надлишку рідини. - 4. Додавали мкг антитіла, специфічного до КАБ-1, до кожної комірки й інкубували протягом 1 години. -

Промивали, як описано в етапі 3. 5. Розморожували лізати з КАБ/КАР-інфікованих клітин 519 і розводили ТВ5Т до 1Онг/10О0мкл. Додавали 10мкг розведеного лізату в лунки й інкубували протягом 1 години. Струшували планшет протягом інкубування. «

До негативних контрольних зразків не додавали лізату. Лізати КАБ/КАР-інфікованих клітин 519 комах 70 одержували після інфікування клітин рекомбінантними бакуловірусами при МОЇ-5 для кожного вірусу й збирали - с через 48 годин. Клітини промивали один раз РВ5 і лізували в буфері КІРА. Нерозчинний матеріал видаляли ц центрифугуванням (бхв при 10000025). Аліквоти лізатів заморожували в сухому льоді/етанолі і зберігали при - и"? 80"С до використання. 6. Видаляли матеріал, що не зв'язався, й промивали, як було описано вище (етап 3), 7. Додавали 2мкг Т-МЕК і 2мкг Ніз-МАЕРК на комірку і доводили об'єм до 40мкл кіназним буфером. Способи -І очищення Т-МЕК і МАРК з клітинних екстрактів наведені в цьому винаході шляхом прикладів. з 8. Сполуки попередньо розчиняли (вихідний розчин 1Омг/мл у ОМ5О) або екстрагували 20-кратною ТВ5Т та 196 ОМ5О. Додавали 5мкл попередньо розведених сполук/екстрактів в комірки, як описано в етапі 6. Інкубували ос протягом 20 хвилин. До контролю ліків не додавали. 9. Починали реакцію кінази з додаванням б5мкл суміші АТФ; струшували планшети на шейкері для ЕГІЗА і-й протягом інкубації. сл 10. Зупиняли реакцію кінази за 60 хвилин додаванням ЗОмкл розчину для зупинки реакції у кожну комірку. 11. Розміщували фосфоцелюлозну підкладку та планшет для ЕГ ІЗА у колектор для планшетів ТОМТЕС.

Збирали й промивали фільтр розчином для промивання згідно з інструкціями виробника. Висушували фільтрувальні підкладки. Розміщували фільтрувальні підкладки в утримувачі. Вставляли утримувач в апарат для визначення радіоактивності й вираховували радіоактивний фосфор на фільтрувальних підкладках. іФ) Як альтернатива, 4Омкл аліквот з окремих комірок планшету для дослідження переносили до відповідних ко положень на фосфоцелюлозній фільтрувальній підкладці. Після повітряного просушування фільтри переносили у піднос. Після м'якого струшування підносу змінювали розчин для промивання кожні 15 хвилин протягом години. бо Фільтрувальні підкладки висушували на повітрі. Розміщували фільтрувальні підкладки в утримувачі. Вставляли утримувач в апарат для визначення радіоактивності й вираховували кількість радіоактивного фосфору на фільтрувальних підкладках.

Значення ІСсо вимірювали згідно з протоколом для наступних сполук похідних 5-азахіноксаліну в тесті ЕГІЗА з використанням КАБ-1: б5

(А-1) (А-)

Ох

Ми до со, он н (А-7) (Д-36) шов очОові и Як с МОм он (А-77) (А-90)

ДОК ОМА о с М М М М осн

Значення ІС 5о - це концентрація інгібітора на основі 5-азахіноксаліну, потрібного для зменшення максимальної кількості фосфорилованого білка-мішені або росту клітини на 5095. Значення ІС со вимірювали у тесті з фосфорилуванням КАБЕ-1, як показано у Таблиці 1: сч о ю зо ю

ІС)

Приклад З: Очищення Марк і Мек

Білки МАРК їі МЕК легко експресуються в клітинах з допомогою субклонування гена, що кодує ці білки, у - комерційно доступний вектор, що експресує білки з полігістидиновою міткою. Гени, що кодують ці білки, є легко /-|ч« доступними у лабораторіях, що зазвичай працюють з цими білками або шляхом клонуванням цих генів з клітин, що містять бібліотеки кКДНК. Бібліотеки є комерційно доступними і фахівець у галузі може легко розробити зонди нуклеїнових кислот, гомологічних молекулі КДНК, що кодує МЕК або МАРК, з послідовності нуклеїнових кислот «

МЕК ї МАРК, доступних у чисельних базах даних генів, таких як Сепрапк. Клонування гена може відбуватись за

Короткий проміжок часу з використанням способів, зараз доступних фахівцям у галузі. - с Очищення білків МЕК і МАРК з клітинних екстрактів може бути виконано з використанням наступного ц протоколу, який був перейнятий у Кобрбіпз еї аї., 1993, у. ВіоІї. Спет. 268: 5097-5106: ,» 1. Лізис клітин шляхом обробки ультразвуком, осмотичного стресу або способами Егепсп Ргевзв, легко доступними фахівцям у галузі. Певний буфер для обробки ультразвуком наведений нижче. 2. Урівноваження твердої основи, яка зв'язана з нікелем або кобальтом, буфером для врівноваження, - І описаним нижче. Полігістидинова мітка специфічно зв'язується з атомами нікелю й кобальту на твердій основі. -з Врівноваження може бути досягнуто промиванням смоли тричі об'ємом буфера для врівноваження, що в 10 разів менше за об'єм твердої основи. Тверда основа є легко доступною звичайним фахівцям у галузі. с З. Додавали клітинний лізат до твердої основи й врівноважували в посудині протягом деякого часу. Як альтернатива, тверда основи може бути запакована всередині білкової хроматографічної колонки й лізат може й пропускатись через тверду основу. сл 4. Промивали тверду основу буфером для промивання, описаним нижче. 5. Елюювали білок МЕК або МАРК з твердої основи такою кількістю буфера для елюювання (наведений нижче), що видаляє значну частину білка з твердої основи.

Буфер для обробки ультразвуком: 5О0ММ фосфату натрію рН 8,0

ІФ) О,ЗМ хлориду натрію ко 10мМ дД-меркаптоетанолу 196 МРАО 60 10ММ Маг

О,5мМ Ретаріоск

Буфер для врівноваження: 5О0ММ фосфату натрію рН 8,0

О,ЗМ хлориду натрію бБ 10мМ дД-меркаптоетанолу 196 МРАО

10мМ Маг 1мММ Імідазолу

Буфер для промивання: 5О0ММ фосфату натрію рН 8,0

О,ЗМ хлориду натрію 10мМ р-меркаптоетанолу 196 МРАО 10мМ Маг 70 10мММ імідазолу

Буфер для елюювання: 5О0ММ фосфату натрію рН 8,0

О,ЗМ хлориду натрію 10мМ дД-меркаптоетанолу 196 МРАО 10мМ Маг 10-БООММ імідазолу

Приклад 4: Тест на вимірювання функції фосфорилування рецептора ЕСЕ

Кіназна активність рецептора ЕСЕ (ЕСЕК-МІНЗТЗ тест) в цілих клітинах вимірювали, як описано детально в 2о заявці РСТ УУО 9640116, зареєстрованій 5 червня, 1996, на ім'я Тапао еї а!., яка має назву "Сполуки індолінолу для лікування хвороб" та включена сюди цілком шляхом посилання, включаючи будь-які малюнки.

Значення ІСво, що вимірювали в тесті на фосфорилування рецептора ЕСЕ, зображені в Таблиці 2: сч о ю зо

Во

ІС)

Приклад 5: Тест на вплив сполук похідних 5-азахіноксаліну на ріст клітин, що експресують КА5

Наступний тест вимірює швидкість росту клітин МІН-3Т3, що експресують КАБ. Метою тесту є визначення --

Впливу сполук на ріст клітин МІН ЗТЗ, що надмірно експресують Н-Кав. ча

Матеріали: 96-коміркові стерильні планшети з плоским дном 96-коміркові стерильні планшети з круглим дном стерильні 25мл або 100мл посудини « піпетки, підставка для багатьох піпеток шщ с стерильні кінчики для піпетки й стерильні 15мл і 5Омл пробірки "» Реактиви 0,496 ЗКВ у 1 95 оцтова кислота 10мММ основи Трису -І 1095 ТСА 196 оцтова кислота - стерильний ЮОМ5О (Зідта) с сполука в ОМ5О (100мММ або менший вихідний розчин)

Трипсин-ЕОТА (СІВСО ВЕ) і-й Клітинна лінія: с ЗТ3/Н-Каз (МІН З3Т3З клон 7 клітин, що експресують геномніли фрагмент онкогенного Н-Казв).

Клітин можуть бути створені з використанням наступного протоколу: 1. Субклонували фрагмент гена, що кодує Каз, у комерційно доступний вектор, що стабільно трансфікуватиме клітини МІН-3Т3. Фрагмент брали з геномного трансформуючого алелю сНа-гав. 2. Трансфікували клітини МІН-3Т3 субклонованим вектором згідно зі способом з використанням фосфату

Ф, кальцію. Відбирали клітини, що експресують конструкт Каз У 295 сироватці у ОМЕМІ. Осередки, що видно ко неозброєним оком, можна зберігати після 2 тижнів. Збирали трансформовані клітини для створення стабільно трансформованої клітинної лінії. во Середовище для росту: 290 сироватки теляти/ОМЕМ «т 2мМ глутаміну, Реп/Зігер

Протокол:

День 0: Висадження клітин:

Ця частина тесту виконували у витяжній шафі з ламінарним потоком. 65 1. Клітини піддавали трипсинізації. Переносили 200мкл суспензії клітин до 1Омкл ізотонічного розчину.

Підраховували клітини лічильником СошГег.

2. Розводили клітини в середовищі для росту до б000Оклітин/мл. Переносили 1ООмкл клітин до кожної комірки у 96-комірковий планшет із плоским дном для створення бОООклітини/комірку. 3. Використання половини планшету (4 рядки) для кожної сполуки й у чотири рази більше лунок для кожної концентрації сполуки й 4 лунки для контролювання середовища. 4. Планшети помірно струшували для рівномірного прилипання клітин. 5. Інкубували планшети при 37"С у 1095 СО, інкубаторі.

День 1: Додавання сполуки:

Цю частину тесту виконували у витяжній шафі з ламінарним потоком. 70 1. У 96-комірковий планшет додавали 120мкл середовища для зростання, що містило подвійну кінцеву концентрацію ОМ5О, яку використовували при найвищій концентрації сполуки під час скринінгу, у колонки 1-11.

Наприклад, якщо найвища концентрація становить 1ООмкл, і яку створювали зі 100ММ вихідного розчину, то одинична концентрація ОМ5О становить 0,195, а подвійна концентрація ОМ5О становить 0,295. Цей планшет використовували для титрування сполуки - 4 рядки на сполуку. 2. У стерильній 15мл пробірці створювали подвійні розчин найвищої концентрації скринінгу сполуки у середовищі для росту плюс подвійний ОМ5О. Необхідним є мл на клітинну лінію. Початкова концентрація сполуки зазвичай становить 100мкМ, але ця концентрація може змінюватись залежно від розчинності сполуки.

З. Переносили 240мкл подвійного початкового розчину сполуки до лунок, яких у чотири рази більше, у колонку 12 з 96б-коміркового планшету з круглим дном. Проводили 1:2 послідовні розведення по планшету справа наліво за допомогою перенесення 12мкл з колонки 12 до колонки 11, з колонки 11 до 10 і так далі до колонки 2. Переносили 100мкл розведень сполуки і 100мкл середовища в колонку 1 на 100мкл середовища на клітини у відповідні лунки 96-коміркового планшету із плоским дном. Загальний об'єм на комірку має бути 20Омкл. 4. Повертали планшет до інкубатора й інкубували протягом З днів. сч

День 4: Проведення тесту

Цю частину тесту виконували в лабораторних умовах. і) 1. Видаляли рідину або зливали середовище. Додавали 200мкл охолодженого 1095 ТСА до кожної комірки для фіксації клітин. Інкубували планшет протягом принаймні бохв. при 4"С. 2. Видаляли ТСА і промивали лунки 5 разів водою з-під крана. Висушували планшети верхом донизу на ю зо паперових рушниках. 3. Фарбували клітини 10Омкл/комірку 0,495 5КВ протягом 1Охв. юю 4. Заливали ЗКВ і промивали лунки 5 разів 196 оцтовою кислотою. Висушували планшети повністю верхнім юку боком донизу на паперових рушниках. 5. Розчиняли барвник у 100мкл/комірку Т10мММ основи Трису протягом 5-10хв. на шейкері. -- 6. Зчитували планшети з допомогою планшетного зчитувача Бупаїесіп ЕГІЗА при 57Онм стосовно 6ЗОнм. ї-

Відбирали сполуки, що уповільнювали швидкість росту клітин, що занадто експресують КАБ, як проілюстровано в Таблиці 3. « о З - ї» 15 -І

Приклад 6: Тест на вплив сполук похідних 5-азахіноксаліну на ріст клітин А549 - Наступний тест вимірює швидкість росту для клітин АБ549. Метою тесту є визначення впливу сполуки на ріст с клітин карциноми легень людини А5Б49. Клітини А5бБ49 легко доступні від комерційних джерел, таких як АТСС (ССІ 185). о Матеріали: с 96-коміркові стерильні планшети з плоским дном 96-коміркові стерильні планшети з круглим дном стерильні 25мл або 100мл посудини піпетки, підставка для багатьох піпеток стерильні кінчики для піпетки (Ф) стерильні 15мл і 5Омл пробірки ко Реактиви: 0,495 5КВ у 196 оцтовій кислоті во 10мМ основи Трису 1096 СА 196 оцтова кислота стерильний ЮОМ5О (Зідта) сполука в ОМ5О (100мММ або менший вихідний розчин) в5 Трипсин-ЕОТА (СІВСО ВЕ)

Клітинна лінія та середовище для росту:

Клітини карциноми легень людини АБб49 (АТОСС СС 185) 1096 сироватки плоду великої рогатої худоби у середовищі Нат Е12-К

Протокол:

День 0: Висадження клітин:

Ця частина тесту виконували у витяжній шафі з ламінарним потоком. 1. Клітини піддавали трипсинізації. Переносили 200мкл суспензії клітин до 1Омкл ізотонічного розчину.

Підраховували клітини лічильником СошГег. 2. Розводили клітини в середовищі для росту до 20000Оклітин/мл. Переносили 1О0Омкл клітин до кожної комірки 7/0 У 96-комірковий планшет із плоским дном для створення 2000клітини/комірку. 3. Використання половини планшету (4 рядки) для кожної сполуки, у чотири рази більше лунок для кожної концентрації сполуки і 4 лунок для контролювання середовища. 4. Планшети помірно струшували для рівномірного прилипання клітин. 5. Інкубували планшети при 37"С у 1095 СО» інкубаторі.

День 1: Додавання сполуки:

Цю частину тесту виконували у витяжній шафі з ламінарним потоком. 1. У 96-комірковий планшет додавали 120мкл середовища для зростання, що містило подвійну кінцеву концентрацію ОМ5О, яку використовували при найвищій концентрації сполуки під час скринінгу, у колонки 1-11.

Наприклад, якщо найвища концентрація становить 100мкМ, і яку створювали зі 100ММ вихідного розчину, то одинична концентрація ОМЗО становить 0,196, а подвійна концентрація ОМ5О становить 0,295. Цей планшет використовували для титрування сполуки - 4 рядки на сполуку. 2. У стерильній 15мл пробірці створювали подвійні розчин найвищої концентрації для скринінгу сполуки у середовищі для росту плюс подвійний ОМ5О. Необхідним є мл на клітинну лінію. Початкова концентрація сполуки зазвичай становить 100мкМ, але ця концентрація може змінюватись залежно від розчинності сполуки. сч

З. Переносили 240мкл подвійного початкового розчину сполуки до лунок, яких у чотири рази більше, у колонку 12 з 96б-коміркового планшету з круглим дном. Проводили 1:2 послідовні розведення по планшету і) справа наліво за допомогою перенесення 12мкл з колонки 12 до колонки 11, з колонки 11 до 10 і так далі до колонки 2. Переносили 100мкл розведень сполуки і 100мкл середовища в колонку 1 на 100мкл середовища на клітини у відповідні лунки 96-коміркового планшету із плоским дном. Загальний об'єм на комірку має бути ю зо 2О0мкл. 4. Повертали планшет до інкубатора й інкубували протягом З днів. о

День 5: Проведення тесту ю

Цю частину тесту виконували в лабораторних умовах. 1. Видаляли рідину або зливали середовище. Додавали 200мкл охолодженого 1095 ТСА до кожної комірки -

Зв ДЛЯ фіксації клітин. Інкубували планшет протягом принаймні бОхв. при 47С. ї- 2. Видаляли ТСА і промивали лунки 5 разів водою з-під крана. Висушували планшети верхом донизу на паперових рушниках. 3. Фарбували клітини 10Омкл/комірку 0,495 5КВ протягом 1Охв. 4. Заливали ЗКВ і промивали лунки 5 разів 195 оцтовою кислотою. Висушували планшети повністю верхнім « боком донизу на паперових рушниках. в с 5. Розчиняли барвник у 100мкл/комірку Т10мММ основи Трису протягом 5-10хв. на шейкері. 6. Зчитували планшети з допомогою планшетного зчитувача Бупаїесіп ЕГІЗА при 57Онм стосовно 6ЗОнм. ;» Відбирали сполуки, що уповільнювали швидкість росту А5Б49 клітин, як проілюстровано в Таблиці 4. в - т

Приклад 7: Спосіб визначення біологічної активності модуляторів КАБ іп мімо о Дослідження з використанням ксенотрансплантатів можуть бути використані для визначення впливу сполуки сп винаходу на інгібування клітин пухлин яєчників, меланоми, простати, легень й молочних залоз. Протокол тесту описаний детально в публікації РСТ УУ09640116, зареєстрованій 5 червня 1996 року на ім'я Тапо еї аї!., що має назву "Сполуки індолінолу для лікування хвороби", включений сюди цілком шляхом посилання, з будь-якими

Малюнками.

Винахід, як приклад, описаний тут, може бути здійснений за відсутності будь-якого елемента або елементів, (Ф) обмеження або обмежень, як не специфічно описані в цьому винаході. Терміни й вирази, які були використані,

Ге використовуються як терміни опису, а не з метою обмеження, і не існує такого винаходу, в якому би використання таких термінів і виразів виключало будь-які еквіваленти властивостей, показаних і описаних, або во його частин, до того ж, треба зазначити, що різні модифікації можливі в межах об'єму винаходу. Таким чином, треба зрозуміти, що хоча цей винахід був специфічно описаний кращими втіленнями, властивості, модифікації та варіації концепції цього винаходу можуть бути зроблені фахівцями у галузі, і що такі модифікації і варіації вважаються такими, що не виходять за межі цього винаходу, і визначаються доданою формулою.

Ті посилання, попередньо не включені сюди шляхом посилання, включаючи як патентні, так і непатентні дб посилання, спеціально включені сюди шляхом посилання з будь-якою метою. Інші втілення знаходяться в межах наступної формули.

Claims (40)

Формула винаходу

1. Спосіб модулювання функції серинової/гтреонінової протеїнкінази, який включає стадію впливу на клітини, що експресують вищезгадану серинову/треонінову протеїнкіназу сполукою, що є похідною 5-азахіноксаліну.

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що вищезгаданою сериновою/тгтреоніновою протеїнкіназою є КАР.

З. Спосіб ідентифікації сполук, що модулюють функцію серинової/треонінової протеїнкінази, який включає 70 наступні стадії: вплив на клітини, що експресують вищезгадану серинову/гтреонінову протеїнкіназу, вищезгаданої сполуки, і моніторинг ефекту на вищезгадані клітини.

4. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що вищезгаданим ефектом є зміна або відсутність зміни фенотипу клітини.

5. Спосіб за п. З, який відрізняється тим, що вищезгаданим ефектом є зміна або відсутність зміни в проліферації клітини.

б. Спосіб за п. З, який відрізняється тим, що вищезгаданим ефектом є зміна або відсутність зміни в каталітичній активності вищезгаданої серинової/гтреонінової протеїнкінази.

7. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що вищезгаданим ефектом є зміна або відсутність зміни у взаємодії між вищезгаданою сериновою/треоніновою протеїнкіназою з природним партнером, що зв'язується з протеїнкіназою.

8. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що включає наступні стадії: лізис вищезгаданих клітин для одержання лізату, що містить серинову/гтреонінову протеїнкіназу, адсорбцію вищезгаданої серинової/греонінової протеїнкінази на антитілі, сч інкубацію вищезгаданої адсорбованої серинової/треонінової протеїнкінази з субстратом або субстратами, і адсорбцію вищезгаданого субстрату або субстратів на твердій основі або антитілі, о де вищезгадана стадія визначення моніторингу вищезгаданого ефекту на вищезгадані клітини включає вимірювання концентрації фосфату у вищезгаданому субстраті або субстратах.

9. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що вищезгаданою сериновою/треоніновою протеїнкіназою є КАК, і ю зо при цьому спосіб включає стадії: лізис вищезгаданих клітин з одержанням лізату, що містить КАК, Іс) адсорбцію вищезгаданого КАЕ на антитілі, ю інкубування адсорбованої КАЕ з МЕК і МАРК, і адсорбцію вищезгаданих МЕК і МАРК на твердій основі або антитілі, або антитілах, «- де вищезгадана стадія визначення моніторингу вищезгаданого ефекту на вищезгадані клітини включає їч- визначення концентрації фосфату у вищезгаданих МЕК і МАРК.

10. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що вищезгадана сполука є похідною 5-азахіноксаліну, яка має структуру, наведену в формулі І Кз « з Кк М. ОВ а хо АКА, . "» Е в рий - ХІМ МО, Ф, де - (а) Ку, Р» Ку, Р, і Ко незалежно вибирають з групи, яка складається з: - водню; насиченого або ненасиченого алкілу, необов'язково заміщеного п'ятичленним чи шестичленним арильним Мн або гетероарильним циклічним залишком, де вищезгаданий циклічний залишок необов'язково заміщений одним, 1 50 двома або трьома замісниками, які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, тригалогенметил, сл карбоксилат, нітро та складноефірні залишки; аміну формули МХ»оХ»з, де Х» і Хз незалежно вибрані з групи, яка включає водень, насичений або ненасичений алкіл і п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки; галогену або тригалогенметилу; 25 кетону формули -СО-Х,, де Ху; вибирають з групи, яка включає водень, алкіл та п'ятичленні або шестичленні ГФ) арильні або гетероарильні залишки; юю карбонової кислоти формули -(Хв)4-СООН або складного ефіру формули -(Хв)и-СОО-Х7, де Хв, Хв і Х7 незалежно вибрані з групи, яка включає алкіл та п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки, і де п - це 0 або 1; 60 спирту формули (Хв)4-ОН або алкокси-залишку формули -(Хв)и-О-Хо, де Хв і Хо незалежно вибрані з групи, яка включає водень, насичений або ненасичений алкіл і п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки, кільце яких необов'язково заміщене одним або кількома замісниками, незалежно вибраними з групи, яка включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки, і де п - це О або 1; бо аміду формули -МНСОХ.о, де Хіо вибирають з групи, яка включає алкіл, гідроксил і п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки, кільце яких необов'язково заміщене одним або кількома замісниками, які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нітро або складноефірні залишки; -5025МХ44Х12, де Х:ії і Хі»о незалежно вибирають з групи, яка включає водень, алкіл та п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні залишки; п'ятичленного чи шестичленного арильного або гетероарильного циклічного залишку, необов'язково заміщеного одним, двома або трьома замісниками, незалежно вибраними з групи, яка включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки; 70 альдегіду формули -СО-Н; та сульфону формули -505-Хі3, де Хіз вибраний з групи, яка включає насичений або ненасичений алкіл й п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні залишки; та (б) Ху вибирають з групи, яка складається з азоту, сірки та кисню.

11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що вищезгадані Ку, Ко Кз, К. і К5 незалежно вибрані з групи, яка /5 Включає водень; насичений або ненасичений алкіл, необов'язково заміщений п'ятичленним або шестичленним арильним або гетероарильним циклічним залишком, кільце якого необов'язково заміщене одним, двома або трьома замісниками, які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, тригалогенметил, гідрокси, алкокси, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки; і п'ятичленний або шестичленний арильний або гетероарильний циклічний залишок, необов'язково заміщений одним, двома або трьома замісниками, незалежно вибраними з групи, яка включає алкіл, галоген, тригалогенметил, гідрокси, алкокси, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки.

12. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що вищезгадані К. і Ко незалежно вибрані з групи, яка включає сч водень; і феніл, необов'язково заміщений замісником, вибраним з групи, яка включає алкіл, галоген, тригалогенметил, і) нітро, карбоксилат, гідрокси- та алкокси-залишки.

13. Спосіб за п. 12, який відрізняється тим, що вищезгаданий Х. - це азот або кисень.

14. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що вищезгадані замісники Кб і Х/ об'єднані та утворюють залишок ю зо РеХі акта» вибирають з групи, яка включає замісники, представлені в таблиці: ою Сполука Мо |К2 ВеХ. ІС) - - : - с п -і 7 я А-7 Феніламіно -

Фо. 08000000 бжоюиени 0 рарбоксибензиланіно сло : : 4-гідроксифеніл З-карбоксибензиламіно сл Ф) : : - : б5 Продовження таблиці

Бас НН ііі нів 111 тань ренееене

І 4-гідроксифеніл З-фторбензиламіно А-23 Н 4-гідроксифеніл 2-«(трифторметил) бензиламіно бензиламіно 4-гідроксифеніл 4-(«трифторметил) с бензиламіно о 4-гідроксифеніл 2-карбоксифеніламіно ою Щ АЕН Атідроксифеній З-карбоксифеніламіно ю ю 4-гідроксифеніл 4-карбоксифеніламіно - А-31 Н 4-гідроксифеніл З-нітрофеніламіно « ве еенмю|з

: ;»

З уеееня 00111111 уеоютьеня 1 ко бо Продовження таблиці б5

А-42 4-гідроксифеніл 2-(трифторметил) феніламіно А-43 4-гідроксифеніл З-(трифторметил) феніламіно А-44 4-гідроксифеніл 4-(трифторметил) феніламіно 70 екон о 17126611 рення Ко ннянннняо ю ою ер А-58 ШИ феніл 2-хлорбензиламіно « ОО ренвненне 5 хо 11 ення з 1 сл 20 А-64 Нн феніл 2-(трифторметил) бензиламіно сл д-65 Н З-«(«трифторметил) бензиламіно ря А-66 Н феніл 4-(трифторметил) бензиламіно о ко 60 Продовження таблиці 65

; 7 и кю ренненнь ПО сіння ННЯ » (5) ю ІС) А-83 феніл « 12-(«трифторметил) - феніламіно А-84 Н феніл 3-(трифторметил) феніламіно « д-85 Н феніл 4-(трифторметиял) т с феніламіно :

це. : - : "ОН сіни с со сів сл 50 сл

15. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що вищезгадана сполука є похідною 5-азахіноксаліну, яка вибрана з групи, що включає сполуки ЗАОАК, представлені у таблиці за п. 14. о 16. Спосіб запобігання або лікування хвороби в організмі, який відрізняється тим, що у вказаний організм вводять сполуки похідної 5-азахіноксаліну формули іме) Е З 60 Е рр Ко що Фе Ше Ме Я ФО б5 де (а) Ку, Р» Ку, Р, і Ко незалежно вибирають з групи, яка складається з:

водню; насиченого або ненасиченого алкілу, необов'язково заміщеного п'ятичленним чи шестичленним арильним або гетероарильним циклічним залишком, де вищезгаданий циклічний залишок необов'язково заміщений одним, двома або трьома замісниками, які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки; аміну формули МХ»оХ»з, де Х» і Хз незалежно вибрані з групи, яка включає водень, насичений або ненасичений алкіл і п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки; галогену або тригалогенметилу; 70 кетону формули -СО-Х,, де Ху; вибирають з групи, яка включає водень, алкіл та п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні залишки; карбонової кислоти формули -(Хв)4-СООН або складного ефіру формули -(Хв)и-СОО-Х7, де Хв, Хв і Х7 незалежно вибрані з групи, яка включає алкіл та п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки, і де п - це 0 або 1; спирту формули (Хв)4-ОН або алкокси-залишку формули -(Хв)и-О-Хо, де Хв і Хо незалежно вибрані з групи, яка включає водень, насичений або ненасичений алкіл і п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки, кільце яких необов'язково заміщене одним або кількома замісниками, незалежно вибраними з групи, яка включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки, і де п - це О або 1; аміду формули -МНСОХ.о, де Хіо вибирають з групи, яка включає алкіл, гідроксил і п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки, кільце яких необов'язково заміщене одним або кількома замісниками, які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нітро або складноефірні залишки; -5025МХ44Х12, де Х:ії і Хі»о незалежно вибирають з групи, яка включає водень, алкіл та п'ятичленні або сч г шестичленні арильні або гетероарильні залишки; п'ятичленного чи шестичленного арильного або гетероарильного циклічного залишку, необов'язково і) заміщеного одним, двома або трьома замісниками, незалежно вибраними з групи, яка включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки; альдегіду формули -СО-Н; та ю зо сульфону формули -505-Хі3, де Хіз вибраний з групи, яка включає насичений або ненасичений алкіл й п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні залишки; та о (б) Х/ вибирають з групи, яка складається з азоту, сірки та кисню. ю

17. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що Ку, К» Кз, РК. і К5 незалежно вибрані з групи, яка включає водень; -- насичений або ненасичений алкіл, необов'язково заміщений п'ятичленним або шестичленним арильним або ча гетероарильним циклічним залишком, кільце якого необов'язково заміщене одним, двома або трьома замісниками, які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, тригалогенметил, гідрокси, алкокси, карбоксилат, нітро- та складноефірні залишки; і п'ятичленний або шестичленний арильний або гетероарильний циклічний залишок, необов'язково заміщений « одним, двома або трьома замісниками, які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, в с тригалогенметил, гідрокси, алкокси, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки. .

18. Спосіб за п. 17, який відрізняється тим, що вищезгадані К. і Ко незалежно вибрані з групи, яка включає и?» метил, необов'язково заміщений фенілом, який необов'язково заміщений замісниками, які вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, гідрокси- і алкокси-залишки; і феніл, необов'язково заміщений замісниками, які вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, гідрокси- та -І алкокси-залишки.

19, Спосіб за п. 18, який відрізняється тим, що вищезгаданий Х./ є азотом або киснем. -

20. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що вищезгадані замісники К» і Х/ об'єднані та утворюють залишок с ЕвХу, а Ку та Ко» вибирають з групи, яка включає замісники ЗАОАК, представлені у таблиці за п.14.

21. Спосіб за п. 20, який відрізняється тим, що вищезгадана сполука є похідною 5-азахіноксаліну, яка о вибрана з групи, що включає сполуки ЗАОАК, представлені у таблиці за п.14. сп

22. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що вищезгаданим організмом є ссавець.

23. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що вищезгаданою хворобою є рак або фіброз.

24. Спосіб за п. 23, який відрізняється тим, що вищезгаданою хворобою є рак, вибраний з групи, яка включає ов рак легень, рак яєчників, рак грудей, рак мозку, внутрішньоаксіальний рак мозку, рак товстої кишки, рак простати, саркому, саркому Капоші, меланому та гліому. (Ф)

25. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що вищезгадана хвороба пов'язана з відхиленням у передачі ка сигналу шляхом, що характеризується взаємодією між сериновою/треоніновою протеїнкіназою й природним партнером, що зв'язується з протеїнкіназою. во

26. Спосіб за п. 25, який відрізняється тим, що вищезгаданою сериновою/треоніновою протеїнкіназою є КАР.

27. Сполука, що є похідною 5-азахіноксаліну та має структуру, наведену у формулі І: б5

Е З В, у б АК Е в - - ХІМ МО, Ф, де 70 (а) Ку, Р» Ку, Р, і Ко незалежно вибирають з групи, яка складається з: водню; насиченого або ненасиченого алкілу, необов'язково заміщеного п'ятичленним чи шестичленним арильним або гетероарильним циклічним залишком, де вищезгаданий циклічний залишок необов'язково заміщений одним, двома або трьома замісниками, які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки; т аміну формули МХ»оХ»з, де Х» і Хз незалежно вибрані з групи, яка включає водень, насичений або ненасичений алкіл і п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки; галогену або тригалогенметилу; кетону формули -СО-Х,, де Ху; вибирають з групи, яка включає водень, алкіл та п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні залишки; карбонової кислоти формули -(Хв)4-СООН або складного ефіру формули -(Хв)и-СОО-Х7, де Хв, Хв і Х7 незалежно вибрані з групи, яка включає алкіл та п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні залишки, і де п - це 0 або 1; спирту формули (Хв)4-ОН або алкокси-залишку формули -(Хв)и-О-Хо, де Хв і Хо незалежно вибрані з групи, яка включає водень, насичений або ненасичений алкіл і п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні сч 29 циклічні залишки, кільце яких необов'язково заміщене одним або кількома замісниками, незалежно вибраними з Ге) групи, яка включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки, і де п - це О або 1; аміду формули -МНСОХ.о, де Хіо вибирають з групи, яка включає алкіл, гідроксил і п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки, кільце яких необов'язково заміщене одним або й кількома замісниками, які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, МУ нітро або складноефірні залишки; -5025МХ44Х12, де Х:ії і Хі»о незалежно вибирають з групи, яка включає водень, алкіл та п'ятичленні або ю шестичленні арильні або гетероарильні залишки; - п'ятичленного чи шестичленного арильного або гетероарильного циклічного залишку, необов'язково заміщеного одним, двома або трьома замісниками, незалежно вибраними з групи, яка включає алкіл, галоген, ге тригалогенметил, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки; альдегіду формули -СО-Н; та сульфону формули -505-Х13, де Хіз вибраний з групи, яка включає насичений або ненасичений алкіл й « дю п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні залишки; та з (б) Х/ вибирають з групи, яка складається з азоту, сірки та кисню. с

28. Сполука за п. 27, яка відрізняється тим, що вищезгадані Ку, Ко Кз, К. і К5 незалежно вибрані з групи, яка :з» включає водень; насичений або ненасичений алкіл, необов'язково заміщений п'ятичленним або шестичленним арильним або -1 15 гетероарильним циклічним залишком, кільце якого необов'язково заміщене одним, двома або трьома замісниками, які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, тригалогенметил, гідрокси, алкокси, - карбоксилат, нітро та складноефірні залишки; і сл п'ятичленний або шестичленний арильний або гетероарильний циклічний залишок, необов'язково заміщений одним, двома або трьома замісниками, які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, 1 50 тригалогенметил, гідрокси, алкокси, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки. сп

29. Сполука за п. 28, яка відрізняється тим, що вищезгадані Кз і Ку є воднем.

30. Сполука за п. 29, яка відрізняється тим, що вищезгадані К. і Ко незалежно вибрані з групи, яка включає метил, необов'язково заміщений фенілом, який необов'язково заміщений замісниками, які вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, гідрокси- і алкокси-залишки; і феніл, необов'язково заміщений замісниками, які вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, гідрокси- та ГФ) алкокси-залишки. 7

31. Сполука за п. 29, яка відрізняється тим, що вищезгадані К. і Ко незалежно вибрані з групи, яка включає водень, метил, феніл і 4-гідроксифеніл.

32. Сполука за п. 30, яка відрізняється тим, що вищезгаданий Ху є азотом або киснем. 60

33. Сполука за п. 32, яка відрізняється тим, що вищезгадані замісники Ке і Хі об'єднані та утворюють залишок КеХ., а Ку та К» вибирають з групи, яка включає замісники ЗАОАК, представлені у таблиці за п.14.

34. Сполука за п. 33, яка відрізняється тим, що вищезгадана сполука є похідною 5-азахіноксаліну, яка вибрана з групи, що включає сполуки ЗАОАК, представлені у таблиці за п.14.

35. Фармацевтична композиція, яка включає сполуку 5-азахіноксаліну за будь-яким одним з пп. 27-34 або її бо сіль і фізіологічно прийнятний носій або розріджувач.

36. Спосіб синтезу сполуки за п. 27, який включає стадії взаємодію першого реагенту з другим реагентом в розчиннику та у присутності основи з утворенням першої проміжної речовини, де вищезгаданим першим реагентом є 2-аміно-6-хлор-З-нітропіридин і де вищезгаданим другим реагентом є спирт або амін, взаємодію вищезгаданої першої проміжної речовини з третім реагентом в присутності каталізатора та відновлюючого агента, де вищезгаданим третім реагентом є 1,2-діон, і очищення продукту.

37. Спосіб за п. 36, який відрізняється тим, що вищезгаданий другий реагент вибраний з групи, яка включає /о реагенти БАОАК, представлені у таблиці за п.14.

38. Спосіб за п. 36, який відрізняється тим, що вищезгаданий третій реагент вибраний з групи, яка включає 4-гідроксифенілгліоксал, 1-феніл-1,2-пропандіон та бензил.

39. Спосіб за п. 36, який відрізняється тим, що вищезгаданим відновлюючим агентом є водень.

40. Спосіб за п. 36, який відрізняється тим, що вищезгаданим каталізатором є нікелевий каталізатор Ренея.

0. й й й 0. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2004, М 12, 15.12.2004. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. с щі 6) ІФ) ІФ) ІФ) «- і - -

с . и? -І - 1 1 сл іме) 60 б5