ES2261844T3 - Mimeticos de la fsh para el tratamiento de la infertilidad. - Google Patents
Mimeticos de la fsh para el tratamiento de la infertilidad.Info
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Abstract
Un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: 1-[3-(9-Etilcarbazolil)carbamoil]etilamino-N-metil- (2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida); 1-metil-1-[3-(9-etilcarbazolil)carbamoil]-etilamino- N-metil-(2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida); 1-[3-(9-Etilcarbazolil)carbamoil]isoamilamino-N- metil-(2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida); 1-[3-(9-Etilcarbazolil)carbamoil]isobutilamino-N- metil-(2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida); 1-[3-(9-Etilcarbazolil)carbamoil]feniletilamino-N- metil-(2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida); 1-[3-(9-Etilcarbazolil)carbamoil]2-hidroxietilamino- N-metil-(2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida); 1-[3-(9-Etilcarbazolil)carbamoil]metilamino-N-metil- (2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida); 1-[3-(9-Etilcarbazolil)carbamoil]metilamino-N-etil- (2-oxo-6-pentil-2H¿piran-3-carboxamida); y 1-Metil-1-[3-(9-etilcarbazolil)carbamoil]-etilamino- (2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida); o una sal de adición del mismo aceptable farmacéuticamente.
Description
Miméticos de la FSH para el tratamiento de la
infertilidad.
La presente invención se refiere a productos
derivados amino no peptídicos, su uso terapéutico, así como
composiciones farmacéuticas que comprenden estos productos
derivados. Los compuestos de la invención poseen actividad como
agonistas de la Hormona de Estimulación del Folículo (FSH) y son
útiles en el tratamiento de la infertilidad.
En los EE.UU. hay anualmente 2,4 millones de
parejas que sufren de infertilidad que son candidatos potenciales
para el tratamiento. La hormona de estimulación del folículo, o
extraída de la orina o producida por tecnología de NDA
recombinante, es un producto proteico que se administra por vía
parenteral utilizado por especialistas para la inducción de la
ovulación (OI) y para controlar la hiperestimulación de los ovarios
(COH). Aunque se indica un OI para conseguir que un folículo ovule,
se indica un COH para recoger múltiples oocitos para utilizar en
diversos tecnologías de reproducción asistida in vitro (por
ejemplo, para fertilización in vitro). El uso clínico de
preparaciones que contienen FSH comenzaron en los años 1960.
La hormona de estimulación del folículo (FSH) es
una hormona glicoproteica heterodimérica derivada de la pituitaria,
que comparte similitudes estructurales con la hormona de
lutenización (LH) y la hormona de estimulación del tiroides (TSH),
las cuales también se producen en la glándula pituitaria, y la
gonadotropina coriónica (CG), que se produce en la placenta. Las
hormonas son relativamente grandes (28-39
kilodaltons) y se componen de una subunidad \alpha común unida de
forma no covalente a una diferente subunidad \beta que confiere
especificidad de unión al receptor.
Se sabe que los receptores celulares para estas
hormonas son miembros de la clase de receptores unidos a membrana
acoplados a proteínas G, los cuales, cuando se activan, estimulan un
incremento en la actividad de la adenilil-ciclasa.
Esto da como resultado un incremento en el nivel del segundo
mensajero intracelular 3', 5'monofosfato de adenosina (cAMP), que a
su vez causa un aumento en la síntesis y secreción de esteroides.
Las representaciones de hidropaticidad de las secuencias de
aminoácidos de estos receptores revelan tres dominios generales: (1)
una región terminal de amino hidrófilo, que se considera un dominio
extracelular de terminal de amino, (2) siete segmentos hidrófobo de
longitud de apertura de membrana, que se considera un dominio de
transmembrana, y (3) una región carboxi-terminal
que contiene sitios de fosforilación potencial (residuos de serina,
treonina y tirosina), que se considera el dominio
carboxi-terminal intracelular o citoplásmico. La
familia de receptores de hormonas glicoproteicas se distinguen de
los otros receptores acoplados a proteínas G, tales como los
receptores \beta2-adrenérgico, rodopsina y
sustancia K, por el gran tamaño del dominio de terminal amino
hidrófilo, el cual está involucrado en la unión de la hormona.
El receptor de FSH se expresa en las células de
Sertoli testiculares y en las células granulosas de ovario. Aunque
se ha reconocido la necesidad de proporcionar esencialmente receptor
de FSH humano puro, no es práctica la purificación de preparaciones
naturales y serían probablemente insuficientes para permitir la
determinación de la secuencia de aminoácidos. Recientemente, un
grupo ha clonado el receptor de FSH de rata de codificación de
cDNA, deducido la secuencia de aminoácidos, y lo ha expresado en
células de mamífero (Sprengel, Mol. Endocrinol. 4; 525
(1990)). Otro grupo, intentando clonar el receptor de TSH,
aparentemente también clonó e identificó una porción de la región de
transmembrana del receptor de FSH humano (Parmentier, Science
246; 1620(1989)).
El uso de FSH está limitado por su alto coste,
la falta de dosificación por vía oral, y la necesidad de
monitorización extensiva por médicos especialistas. Por lo tanto,
es deseable la identificación de una molécula pequeña no peptídica
sustituta de la FSH que potencialmente pudiese desarrollarse para
administración por vía oral.
Los documentos
JP-A-53.031.669,
DE-A-3.636.278, Lasch et al.,
FEBS Lett. (1988), 227(2), Endröczi et al., Acta
Physiol. Hung. (1994), 82(2), 131-8, y
Yoshimoto et al., J. Biochem. (1985), 98(4),
975-9, describen todos ellos compuestos
heterocíclicos o compuestos no peptídicos.
Ahora nosotros hemos encontrado compuestos no
peptídicos para el tratamiento de la infertilidad que imitan la
acción de la FSH. Tales compuestos tienen una utilidad de uso
superior comparada con la FSH debido a su biodisponibilidad por vía
oral. Son adecuados para la prescripción por un Ob/Gyn, requieren
supervisión mínima, y tiene costes sustancialmente más bajos
comparados con el tratamiento de la FSH.
La Figura 1 representa el esquema de la síntesis
de los compuestos comparativos de Fórmula XVI y Fórmula XVII.
La Figura 2 representa el esquema de la síntesis
del compuesto comparativo de Fórmula XVIII.
La Figura 3 representa el esquema de la síntesis
del compuesto comparativo de Fórmula XIX.
La Figura 4 representa el esquema de la síntesis
del compuesto comparativo de Fórmula XXV.
La Figura 5 representa el esquema de la síntesis
del compuesto comparativo de Fórmula XXVI.
La Figura 6 representa los resultados del
análisis de LDR de los compuestos comparativos XVI, XVII, y XIX
comparados con la FSH.
La Figura 7 representa los resultados del ensayo
biológico en células primarias de granulosa de rata para los
compuestos comparativos XVI y XVII, comparados con la FSH.
La presente invención proporciona los compuestos
que se definen en la reivindicación 1. Las realizaciones preferidas
son según se definen en las reivindicaciones 2 a 8. Los compuestos
preferidos son como se definen a continuación.
1-[3-(9-etilcarbazolil)carbomoil]etilamino-N-metil-(2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida);
1-Metil-1-[3-(9-etilcarbazolil)carbamoil]-etilamino-N-metil-(2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida);
1-[3-(9-Etilcarbazolil)carbamoil]isoamilamino-N-metil-(2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida);
1-[3-(9-Etilcarbazolil)carbamoil]isobutilamino-N-metil-(2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida);
1-[3-(9-Etilcarbazolil)carbamoil]feniletilamino-N-metil-(2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida);
1-[3-(9-Etilcarbazolil)carbamoil]2-hidroxietilamino-N-metil-(2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida);
1-[3-(9-Etilcarbazolil)carbamoil]metilamino-N-metil-(2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida);
1-[3-(9-Etilcarbazolil)carbamoil]metilamino-N-etil-(2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida);
y
1-Metil-1-[3-(9-etilcarbazolil)carbamoil]-etilamino-(2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida);
o una sal de adición del mismo
aceptable
farmacéuticamente.
Será apreciado por todos aquellos expertos en la
técnica que los compuestos de la invención pueden contener un
centro quiral y así existirán en dos formas enantioméricas. La
presente invención incluye el uso de los enantiómeros individuales
y las mezclas de los enantiómeros. Los enantiómeros pueden separarse
con métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, por
ejemplo por formación de complejos diastereoméricos o derivados que
puedan separarse, por ejemplo, por cristalización o separación
cromatográfica. Alternativamente, pueden sintetizarse enantiómeros
específicos por síntesis asimétrica utilizando reactivos,
substratos, catalizadores o disolventes ópticamente activos, o al
convertir un enantiómero en el otro por una transformación
asimétrica.
Los derivados amino no peptídicos de la presente
invención representan moléculas pequeñas sustitutos de la FSH para
el tratamiento de la infertilidad. Por tanto, la invención comprende
una composición farmacéutica que comprende un compuesto según se
define en la reivindicación 1 y un vehículo, diluyente, o excipiente
del mismo aceptable farmacéuticamente.
Adicionalmente la invención comprende una
composición farmacéutica que comprende un compuesto según se define
en la reivindicación 1 y un vehículo, diluyente, o excipiente del
mismo aceptable farmacéuticamente en combinación con la FSH.
Adicionalmente la invención comprende una
composición farmacéutica que comprende un compuesto según se define
en la reivindicación 1 y un vehículo, diluyente, o excipiente del
mismo aceptable farmacéuticamente en combinación con el compuesto
anti-estrógeno citrato de Clomifeno (Cassidenti,
et al. (1992) Hum. Reprod.,
7:344-348).
Adicionalmente la invención comprende una
composición farmacéutica que comprende un compuesto según se define
en la reivindicación 1 y un vehículo, diluyente, o excipiente del
mismo aceptable farmacéuticamente en combinación con la
gonadotropina coriónica humana (hCG) o la hormona luteinizante de la
pituitaria (LH) (Breckwoldt et al. (1971) Fer.
Steril., 22:451-455); Diedrich et al.
(1988) Hum. Reprod., 3:39-44).
Adicionalmente la invención comprende el uso de
un compuesto según se define en la reivindicación 1 para la
preparación de un medicamento.
Los compuestos pueden utilizarse para un
tratamiento de la infertilidad que comprende administrar una
cantidad eficaz como agonista de la FSH de una cualquiera de las
composiciones farmacéuticas citadas.
Como agonistas de la FSH, los compuestos de la
invención son también herramientas de investigación útiles para el
estudio del papel de la FSH y del receptor de la FSH en procesos
biológicos in vitro.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden
un compuesto según se define en la reivindicación 1 y un vehículo,
diluyente o excipiente aceptable farmacéuticamente para el mismo
también están dentro del alcance de la presente invención. Así, la
presente invención también proporciona compuestos para uso como
medicamento. En particular, la invención proporciona los compuestos
según se definen en la reivindicación 1 para utilizarlos como
agonistas de la FSH, para el tratamiento de la infertilidad, o
solos o en combinación con otros medicamentos. En valoraciones
in vitro se encontró que estos compuestos imitan la acción de
la FSH ya que exhiben respuesta de dosis logarítmica positiva en
valoraciones de cribado de muestras (FSHR con luciferasa en CHO) y
son negativas en el ensayo de control (luciferasa en CHO).
Concordantemente, los compuestos de la invención son herramientas de
investigación útiles para analizar el papel de la FSH en los
procesos biológicos.
Los compuestos representativos también muestran
actividad en el ensayo biológico en células primarias de granulosa
de rata, que se utiliza para detectar la conversión de la
testosterona en estradiol en presencia de FSH o un agonista de la
FSH. El ensayo de la luciferasa en CHO y el ensayo biológico en
células primarias de granulosa de rata están descritos con detalle
más adelante en la presente memoria.
Los compuestos de la invención, junto con un
adyuvante, vehículo, diluyente o excipiente convencional pueden
colocarse en forma de composiciones farmacéuticos y dosificaciones
unitarias de los mismas, y en tal forma puede emplearse como
sólidos, tales como comprimidos o cápsulas rellenas, o líquidos
tales como disoluciones, suspensiones, emulsiones, elixires, o
cápsulas rellenas con ellos, todas para uso por vía oral, o en forma
de disoluciones inyectables estériles para vía parenteral
(incluyendo el uso subcutáneo). Tales composiciones farmacéuticas y
sus formas de dosificación unitarias pueden comprender ingredientes
en proporciones convencionales, con o sin compuestos o principios
activos adicionales, y tales formas de dosificación unitaria pueden
contener cualquier cantidad efectiva adecuada del ingrediente
activo proporcionado con el intervalo de dosis diaria pretendido a
ser empleado. Comprimidos conteniendo 10 miligramos de ingrediente
activo o, más ampliamente, 0,1 a 100 miligramos, por comprimido
son por consecuencia formas de dosificación unitarias
representativas adecuadas.
Los siguientes párrafos proporcionan
definiciones de los diversos restos químicos que completan los
compuestos de la invención y esta prevista su aplicación a lo largo
de la memoria y reivindicaciones a menos que se establezca
expresamente otra cosa.
La expresión "sales o complejos aceptables
farmacéuticamente" se refieren a sales o complejos que retienen
la actividad biológica deseada de los compuestos anteriormente
identificados y exhiben un efecto mínimo o ningún efecto
toxicológico no deseado. Ejemplos de tales sales incluyen, pero no
se limitan a sales de adición de ácidos formados con ácidos
inorgánicos (por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico,
ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y otros
semejantes), y sales formadas con ácidos orgánicos tales como ácido
acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido
málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tánico, ácido
pamoico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácido metanosulfónico,
ácido naftalenosulfónico, ácido naftalenodisulfónico, y ácido
poligalaturónico. También pueden administrarse los compuestos como
sales cuaternarias farmacéuticamente aceptables conocidas por
aquellos expertos de la técnica, las cuales incluyen
específicamente las sales de amonio cuaternario de fórmula -NR +
Z,
en las que R es hidrógeno, alquilo, o benzoílo, y Z es un ion de signo contrario, que incluye cloruro, bromuro, ioduro, -O-alquilo, toluensulfonato, metilsulfonato, sulfonato, fosfato, o carboxilato (tales como benzoato, succinato, acetato, glicolato, maleato, citrato, tartrato, ascorbato, benzoato, cinamoato, mandeloato, benziloato, y difenilacetato).
en las que R es hidrógeno, alquilo, o benzoílo, y Z es un ion de signo contrario, que incluye cloruro, bromuro, ioduro, -O-alquilo, toluensulfonato, metilsulfonato, sulfonato, fosfato, o carboxilato (tales como benzoato, succinato, acetato, glicolato, maleato, citrato, tartrato, ascorbato, benzoato, cinamoato, mandeloato, benziloato, y difenilacetato).
Paso
A
Se añadió gota a gota una disolución de
di-isopropil carbodiimida (DIC, 2,5 mmol) a una
disolución de Boc-L-prolina (6
mmol, Advanced ChemTech, Louisville, EE.UU.) en diclorometano (20
mL) enfriada a 0ºC. Después de que la disolución se hubiese agitado
a 0ºC durante 30 min, se filtró el subproducto sólido (DIC urea). Se
añadió al filtrado
3-amino-9-etilcarbazol
(5 mmol, Aldrich Chemical Company, Milwaukee, EE.UU.) y se agitó la
disolución durante 16 h a temperatura ambiente. Se monitorizó el
final de la reacción por TLC. Se evaporó la disolución hasta
sequedad bajo vacío. Se disolvió el residuo en acetato de etilo (250
mL) y se lavó sucesivamente con carbonato de sodio 10% acuoso,
ácido cítrico 10% acuoso, agua y salmuera saturada. Se secó la capa
orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se evaporó el
acetato de etilo para dar un producto oleoso
1-(t-Butoxicarbonil)-N-[3-(9-etilcarbazolil)]-2-pirrolidinacarboxamida
(rendimiento 75%); pureza por HPLC: 90%; Masa: deseada M+H
encontrada (Preceptive Biosystem's Voyager-Maldi
TOF). Este compuesto se utilizó en el paso siguiente sin
purificación adicional.
Paso
B
Se disolvió en ácido trifluoroacético/
diclorometano (25 mL) la
N-Boc-pirrolidinacarboxamida
obtenida en el paso A y se agitó durante 30 min a temperatura
ambiente. Se evaporó la disolución de TFA bajo vacío. Se disolvió
el residuo seco en DMF y se añadieron dos equivalentes de
trietilamina, seguido por un equivalente de un anhídrido simétrico
(generado in situ a partir de ácido
2-oxo-6-pentil-2H-piran-carboxílico
y diisopropilcaobodiimida) y se agitó la disolución durante 14 h.
Se evaporó la DMF bajo alto vacío. Se disolvió el residuo en acetato
de etilo, Se lavó la capa orgánica con carbonato de sodio 10%
acuoso, ácido cítrico 10% acuoso, agua y salmuera saturada. Se secó
la capa orgánica sobre sulfato de magnesio anhidro. Se decoloró la
capa orgánica con carbón y se evaporó bajo vacío para dar como
resultado un material gomoso marrón claro. Se purificó el material
crudo con HPLC de fase reversa preparativa utilizando
TFA-acetonitrilo al 1% y agua como fase móvil.
Pureza por HPLC > 95%. Masa: calculada para
C_{30}H_{33}N_{3}O_{4}: 499,6; encontrada:500,6 (M+H)
(Preceptive Biosystem's Voyager-Maldi TOF).
La síntesis de
3-(9-etilcarbazolil)amida del ácido
1-[(2-Oxo-6-pentil-2H-piran)-carbonil]-piperidin-2-carboxílico
(Fórmula XVII) se consiguió utilizando el mismo procedimiento que
antes utilizando ácido
N-Boc-pipecolínico hecho a partir
de ácido dl-pipecolínico (Aldrich Chemical Company,
Milwaukee, EE.UU.) en vez de
Boc-L-prolina.
Paso
A
Se hinchó con diclorometano durante 10 min
resina de amida de Rink F-moc (1,0 g. 0,45 mmol/g
sustitución), disponible en NovaBiochem (San Diego, EE.UU.).
Adicionalmente se lavó la resina tres veces con dimetilformamida.
Se eliminó el grupo F-moc con piperidina al 20% en
DMF durante 30 min. Se hicieron lavados repetidos adicionales con
DMF (3 x 2 min), diclorometano (DCM, 3 x 2 min), DMF (1 x 1 min).
Entonces se añadieron
N-Fmoc-D-histidina
(disponible en Advanced ChemTech, Louisville, EE.UU.) en DMF [10 mL,
2,0 mmol (4 equivalentes con respecto a la carga de resina)], 2
mmol de hexafluorofosfato de
O-(7-azabenzotriol-1-il)-1,1,3,3,-tetrametiluronio
(HATU) y 4 mmol de diisopropiletilamina (DIEA, 640 \muL) para
hacer una pasta. Se agitó esta pasta a temperatura ambiente durante
2 h. Se sometió una pequeña muestra de resina al ensayo de
Sarin-Kaiser para completar la reacción. Entonces
se filtró la resina y se lavó con DMF (3 x 2 min), MeOH (2 x 2 min),
diclorometano (2 x 2 min) y DMF
(2 x 2 min).
(2 x 2 min).
Paso
B
Se desprotegió el compuesto obtenido en el paso
A eliminando el grupo Fmoc- con piperidina al 20% en DMF durante 30
min. Se realizaron lavados de la resina adicionales con DMF (3 x 2
min), diclorometano (DCM, 3 x 2 min), DMF (1 x 1 min). Después se
añadieron ácido
(S)-(-)-1,2,3,4-tetrahidro-3-isoquinoleina
carboxílico (disponible en Advanced ChemTech, Louisville, EE.UU.)
en DMF [10 mL, 2,0 mmol (4 equivalentes con respecto a la carga de
resina), 2 mmol de HATU y 4 mmol de diisopropiletilamina (DIEA, 640
\muL) para hacer una pasta. Se agitó esta pasta a temperatura
ambiente durante 2 h. Se sometió una pequeña muestra de resina al
ensayo de Sarin-Kaiser para completar la reacción.
Entonces se filtró la resina y se lavó con DMF (3 x 2 min), MeOH (2
x 2 min), diclorometano (2 x 2 min) y DMF (2 x 2 min).
Paso
C
Se eliminó el grupo Fmoc- del nitrógeno de
tetrahidroisoquinolina por tratamiento con piperidina al 20% en DMF
durante 30 min. Entonces se lavó la resina con DMF (3 x 2 min),
diclorometano (3 x 2 min), y DMF (1 x 1 min). Después se añadió
disolución 0,2M de 2-etilhexanal (Aldrich Chemical
Company, Milwaukee, EE.UU.) en ácido acético al 2% en orto formiato
de trimetilo (TMOF) y se llevó a cabo la reacción durante 2 h para
formar un derivado de imina in situ. Después se añadió
disolución 0,2M de cianoborohidruro de sodio (NaCNBH_{3}) en TMOF
a la mezcla de reacción anterior para conseguir una concentración
final de 0,1M y se continuó la reacción a temperatura ambiente
durante 14 h. Se lavó la resina con TMOF (3 x 2 min), DMF (3 x 2
min), MeOH (3 x 2 min), diclorometano (2 x 2 min) y se secó bajo
vacío durante 4 h.
\newpage
Paso
D
Se añadió (10 mL/g) de reactivo de escisión
previamente enfriado (ácido trifluoracético/triisopropilsilano:
H_{2}O; 90:2,5:2,5:5; v/v) a la resina seca y se dejó agitando
durante 2 h a temperatura ambiente. Se filtró la mezcla de TFA a un
vial de 20 mL y se evaporó el TFA en un rotavapor bajo vacío. Se
añadió dietiléter para precipitar el compuesto junto con el alcohol
tritílico. Se disolvió la mezcla en acetonitrilo al 20% antes de la
purificación por HPLC en fase reversa.
Paso
E
Se disolvió el compuesto crudo del paso D en
acetonitrilo al 10% acuoso y se cargó en una columna C18 de HPLC
preparativa Delta. Se utilizó un gradiente lineal con TFA
acetonitrilo al 1% y agua como fase móvil. Pureza por HPLC >
95%. Masa (Perceptive Biosystem's Voyager.Maldi TOF): calculada para
C_{24}H_{30}N_{5}O_{2}: 425,6; encontrada 426,6 (M+H).
Paso
A
Se añadieron a intervalos de 5 min
hexafluorofosfato de
2-(1H-benzotriol-1-il)-1,1,3,3,-tetrametiluronio
(HBTU, 5 mmol), diisopropiletilamina (DIEA, 10 mmol) seguidos por
3-amino-9-etilcarbazol
(5 mmol, Aldrich Chemical Company, Milwaukee, EE.UU.) a una
disolución de
N-Boc-trans-hidroxi-L-prolina
(5 mmol, Sigma Chemical Company, St. Louis, EE.UU.) en
diclorometano (20 mL) a temperatura ambiente. Después de agitar
durante 1 h, se evaporó la disolución hasta sequedad bajo vacío. Se
disolvió el residuo en acetato de etilo (250 mL) y se lavó
sucesivamente con carbonato de sodio 10% acuoso, ácido cítrico 10%
acuoso, agua y salmuera saturada. Se secó la capa orgánica sobre
sulfato de sodio anhidro, se filtró y se evaporó el acetato de etilo
para dar un producto oleoso
1-(t-Butoxicarbonil)-4-hidroxipirrolidina-2-[3-(9-etilcarbazoil)]carboxamida
(rendimiento 85%); pureza por HPLC: 90%. Este compuesto se utilizó
en el paso siguiente sin purificación adicional.
Paso
B
Se disolvió en ácido trifluoroacético/
diclorometano (25 mL) la
1-(t-butoxicarbonil-4-hidroxipirrolidina-2-[3-(9-etilcarbazolil)]carboxamida
obtenida en el paso A y se agitó durante 30 min a temperatura
ambiente. Se evaporó la disolución de TFA bajo vacío. Se disolvió
el residuo seco en diclorometano y se añadieron al éster activado
del ácido
2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxílico
(generado in situ de 5 mmol de ácido
2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxílico,
5 mmol de HBTU y 10 mmol de diisopropiletilamina) y se agitó la
disolución durante 1 h. Se evaporó el disolvente bajo vacío y se
disolvió el residuo en acetato de etilo, Se lavó la capa orgánica
con carbonato de sodio 10% acuoso, ácido cítrico 10% acuoso, agua y
salmuera saturada. Se secó la capa orgánica sobre sulfato de
magnesio anhidro y después se evaporó bajo vacío para dar como
resultado un material gomoso marrón claro. Se purificó el material
crudo con HPLC de fase reversa preparativa utilizando
TFA-acetonitrilo al 1% y agua como fase móvil.
Pureza por HPLC > 95%. Masa: calculada para
C_{30}H_{33}N_{3}O_{5}: 415,6; encontrada:516 (Preceptive
Biosystem's Voyager-Maldi TOF).
Paso
A
Se hinchó con diclorometano durante 10 min
resina de amida de Rink F-moc (1,0 g. 0,45 mmol/g
sustitución), disponible en NovaBiochem (San Diego, EE.UU.).
Adicionalmente se lavó la resina tres veces con dimetilformamida.
Se eliminó el grupo F-moc con piperidina al 20% en
DMF durante 30 min. Se hicieron lavados repetidos adicionales con
DMF (3 x 2 min), diclorometano (DCM, 3 x 2 min), DMF (1 x 1 min).
Entonces se añadieron
N-Fmoc-D-histidina
(disponible en Advanced ChemTech, Louisville, EE.UU.) en DMF [10 mL,
2,0 mmol (4 equivalentes con respecto a la carga de resina)], 2
mmol de hexafluorofosfato de
O-(7-azabenzotriol-1-il)-1,1,3,3,-tetrametiluronio
(HATU) y 4 mmol de diisopropiletilamina (DIEA, 640 \muL) para
hacer una pasta. Se agitó esta pasta a temperatura ambiente durante
2 h. Se sometió una pequeña muestra de resina al ensayo de
Sarin-Kaiser para completar la reacción. Entonces
se filtró la resina y se lavó con DMF (3 x 2 min), MeOH (2 x 2 min),
diclorometano (2 x 2 min) y DMF (2 x 2 min).
Paso
B
Se desprotegió el compuesto obtenido en el paso
A eliminando el grupo Fmoc- con piperidina al 20% en DMF durante 30
min. Se realizaron lavados de la resina adicionales con DMF (3 x 2
min), diclorometano (DCM, 3 x 2 min), DMF (1 x 1 min). Después se
añadieron ácido
Fmoc-(D,L)-2-aminotetralina-carboxílico
(disponible en Acros) en DMF [10 mL, 2,0 mmol (4 equivalentes con
respecto a la carga de resina), 2 mmol de HATU y 4 mmol de
diisopropiletilamina (DIEA, 640 \muL) para hacer una pasta. Se
agitó esta pasta a temperatura ambiente durante 2 h. Se sometió una
pequeña muestra de resina al ensayo de Sarin-Kaiser
para completar la reacción. Entonces se filtró la resina y se lavó
con DMF (3 x 2 min), MeOH (2 x 2 min), diclorometano (2 x 2 min) y
DMF (2 x 2 min).
Paso
C
Se eliminó el grupo Fmoc- del nitrógeno de
aminotetralina por tratamiento con piperidina al 20% en DMF durante
30 min. Entonces se lavó la resina con DMF (3 x 2 min),
diclorometano (3 x 2 min), y DMF (1 x 1 min). Después se añadió
disolución 0,2M de 2-etilhexanal (Aldrich Chemical
Company, Milwaukee, EE.UU.) en ácido acético al 2% en trimetil orto
formiato (TMOF) (10 mL/g de resina) y se llevó a cabo la reacción
durante 2 h para formar un derivado de imina in situ.
Después se añadió disolución 0,2M de cianoborohidruro de sodio
(NaCNBH_{3}) en TMOF a la mezcla de reacción anterior para
conseguir una concentración final de 0,1M y se continuó la reacción
a temperatura ambiente durante 14 h. Se lavó la resina con TMOF (3 x
2 min), DMF (3 x 2 min), MeOH (3 x 2 min), diclorometano (2 x 2 min)
y se secó bajo vacío durante 4 h.
Paso
D
Se añadió (10 mL/g) de reactivo de escisión
previamente enfriado (ácido
trifluoracético/triisopropilsilano:H_{2}O; 90:2,5:2,5:5; v/v) a
la resina seca y se dejó agitando durante 2 h a temperatura
ambiente. Se filtró la mezcla de TFA a un vial de 20 mL y se
evaporó el TFA en un rotavapor bajo vacío. Se añadió dietiléter para
precipitar el compuesto junto con el alcohol tritílico. Se disolvió
la mezcla en acetonitrilo al 20% antes de la purificación por HPLC
en fase reversa.
Paso
E
Se disolvió el compuesto crudo del paso D en
acetonitrilo al 10% acuoso y se cargó en una columna C18 de HPLC
preparativa Delta. Se utilizó un gradiente lineal con TFA
acetonitrilo al 1% y agua como fase móvil. Pureza por
HPLC > 95%. Masa (Perceptive Biosystem's Voyager.Maldi TOF): calculado para C_{24}H_{30}N_{5}O_{2}: 439,6; encontrada: 440,6 (M+H).
HPLC > 95%. Masa (Perceptive Biosystem's Voyager.Maldi TOF): calculado para C_{24}H_{30}N_{5}O_{2}: 439,6; encontrada: 440,6 (M+H).
Paso
A
Se añadió
2-amino-9-etilcarbazol
(5 mmol, Aldrich Chemical Company, Milwaukee, EE.UU.) a una
disolución de
2-cloro-3-nitropiridina
(5 mmol, Aldrich Chemical Company, Milwaukee, EE.UU.) en tolueno (10
mL) a temperatura ambiente. Se calentó la mezcla a reflujo durante
un periodo de 16 h. Después de enfriar a temperatura ambiente, se
diluyó la mezcla con acetato de etilo y se lavó sucesivamente con
bicarbonato de sodio y salmuera saturados. Se recogió la capa
orgánica, se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró
in vacuo para dar un producto oleoso. Este producto se
purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluyente: 1:1
acetato de etilo:hexano) para dar
2-[3-(9-Etilcarbazolil)amino]-3-nitropiridina
(rendimiento 68%); pureza por HPLC: > 95%;. Este compuesto se
utilizó en el paso siguiente.
Paso
B
Se añadió paladio 10% sobre carbón (10% p/p) a
una disolución metanólica de
2-[3-(9-Etilcarbazolil)amino]-3-nitropiridina
obtenida en el paso A y la mezcla se sometió a hidrogenación
utilizando un hidrogenador Parr a 40 psi durante un periodo de 12
h. Después se filtro la pasta formada por Celita para eliminar el
catalizador y se evaporó el filtrado hasta sequedad para obtener
como resultado un producto oleoso,
2-[3-(9-etilcarbazolil)amino]-3-aminopiridina.
Se utilizó en el siguiente paso.
Paso
C
Se añadieron hexafluorofosfato de
2-(1H-benzotriol-1-il)-1,1,3,3,-tetrametiluronio
(HBTU, 3 mM; Advanced
ChemTech, Louisville, EE.UU.) seguidos de 6 mM de diisopropiletilamina (DIEA; Aldrich Chemical Company, Milwaukee, EE.UU.) a una disolución de ácido 2-Oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxílico (3 mM, Aldrich Chemical Company, Milwaukee, EE.UU.) en 10 mL de diclorometano a temperatura ambiente. Después de 10 min se añadió gota a gota una disolución de 3 mM de 2-[3-(9-etilcarbazolil)amino]-3-aminopiridina (obtenido en el paso B), y se agitó la mezcla resultante durante 2 h a temperatura ambiente. Se lavó la mezcla del producto crudo con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se cromatografió sobre gel de sílice (eluyente: 1:1 acetato de etilo:hexano hasta 100% de acetato de etilo) para conseguir un 71% de compuesto XXVI puro. Pureza por HPLC: > 95%;. Masa: calculada para C_{30}H_{30}N_{4}O_{3}: 495; encontrada:496 (M+H) (Finnigan LCQ),
ChemTech, Louisville, EE.UU.) seguidos de 6 mM de diisopropiletilamina (DIEA; Aldrich Chemical Company, Milwaukee, EE.UU.) a una disolución de ácido 2-Oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxílico (3 mM, Aldrich Chemical Company, Milwaukee, EE.UU.) en 10 mL de diclorometano a temperatura ambiente. Después de 10 min se añadió gota a gota una disolución de 3 mM de 2-[3-(9-etilcarbazolil)amino]-3-aminopiridina (obtenido en el paso B), y se agitó la mezcla resultante durante 2 h a temperatura ambiente. Se lavó la mezcla del producto crudo con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se cromatografió sobre gel de sílice (eluyente: 1:1 acetato de etilo:hexano hasta 100% de acetato de etilo) para conseguir un 71% de compuesto XXVI puro. Pureza por HPLC: > 95%;. Masa: calculada para C_{30}H_{30}N_{4}O_{3}: 495; encontrada:496 (M+H) (Finnigan LCQ),
Se guardaron todos los compuestos en placas de
pocillos profundos de 96 pocillos en DMSO a una concentración
nominal de 10 mM (asumiendo síntesis y rendimientos perfectos). Se
cribaron los compuestos buscando actividad de agonista en el
receptor de FSH utilizando el receptor de FSH recombinante
transfectado de forma estable y expresado en células de ovario de
hámster chino (células CHO) esencialmente como se describe en el
trabajo de Kelton, et al. (Molecular and Cellular
Endocrinology, 1992, 89,141-151). Dado que se conoce
que el receptor de FSH actúa vía una proteína G (Gs) para activar
la adenilil-ciclasa y por lo tanto aumenta los
niveles intracelulares de cAMP, el ensayo de cribado de alto
rendimiento (HTS) utilizó un sistema de genes indicadores que
consistía en el elemento de respuesta a cAMP acoplado corriente
arriba con respecto al gen indicador, que en este caso codificaba
la enzima luciferasa. Un agonista en el receptor de FSH aumenta el
cAMP en la célula, lo cual da como resultado una activación de CREB
(la proteína de unión al elemento de respuesta al cAMP). Esta
molécula interacciona con el elemento CRE corriente arriba con
respecto al gen y da como resultado un aumento en la transcripción
de los genes situados corriente abajo con respecto al elemento. Se
añadió el substrato para la luciferasa (Packard Instruments
Company, Meriden, CT, EE.UU.) a las células después de una
incubación apropiada con los compuestos de la invención o FSH
(utilizada como control positivo). Se midió la cantidad de
luciferasa expresada cuantificando la luminiscencia producida por
la enzima utilizando un contador de centelleo/luminiscencia
TopCount funcionando en el modo de contar un fotón único. Un
compuesto que actúe como agonista en el receptor debería producir
luz de las células tratadas en proporción a su concentración en la
incubación. La luminiscencia debería ser saturable a altas
concentraciones del
compuesto.
compuesto.
Los compuestos de la invención, en placas de
pocillo profundo (placas principales) se pusieron en un soporte
robotizado junto con un número apropiado de placas de ensayo y de
placas hijas. Se transfirió una parte alícuota de 10 \mul de cada
placa principal a la correspondiente placa hija y se añadieron 90
\mul de DME/F12 y se mezclaron en cada pocillo. Entonces se
tomaron 20 \mul de cada placa hija y se dispensaron en la placa
de ensayo. Después de la adición de una parte alícuota de FSH
(equivalente a una respuesta de EC_{100} de esta hormona
[concentración final de 5e-11 M]) a cada uno de tres
pocillos en la placa, se añadieron 80 \mul de medio (DME/F12 + 2%
de suero) y una parte alícuota de 100 \mul de células (4 x
10^{5}/mL en el mismo medio) y se incubó la placa a 37ºC durante
3 h 30 min. A este tiempo se sacó la placa del incubador y se aspiró
el medio en cada pocillo y se lavaron las células adheridas al
fondo de la placa con 300 \mul de PBS que contenían 1 mM de
Ca^{2+} y 1 mM de Mg^{2+}. Se aspiró el PBS y se añadieron 100
\mul de PBS a cada pocillo. Se añadieron 100 \mul de Luclita
(preparada como describe el fabricante) a cada pocillo y se agitó
suavemente la placa durante 40 s antes de colocarla en el lector de
placas Topcount, Después de dejar 3,5 min para que la placa se
adaptara a la obscuridad en la máquina, se cuantificó la cantidad de
luminiscencia generada utilizando el modo de contar un fotón único.
Se trasmitieron los datos electrónicamente del Topcount al terminal
del ordenador de proceso del robot y se redenominaron con una ID que
correspondía a la ID de la placa principal original. Se evaluaron
los datos utilizando un macro de Excel y se analizaron
posteriormente en el mismo ensayo a diferentes concentraciones los
compuestos que mostraban una actividad comparable a la producida
por una EC_{100} de la FSH misma. Se generaron curvas LDR
(dosis-respuesta logarítmicas) para estos
compuestos en células de CHO que contenían el receptor de FSH y
también se compararon estas curvas con aquellas en las que o las
células expresaban un receptor diferente ligado a Gs o en las que
las células carecían de cualquier receptor transfectado (para
confirmar la especificidad del receptor).
A los compuestos que mostraron especificidad por
el receptor y actividad a bajas concentraciones se les pasó a los
ensayos secundarios que incluyeron curvas de
dosis-respuesta en células Y1 que
co-expresaban el receptor de FSH humano o en células
de granulosa de rata.
La Figura 6 representa los resultados del ensayo
de FSH de los compuestos XVI, XVII y XIX. Para comparar, también se
muestran los resultados de la FSH. Se generaron y se representaron
las curvas de dosis-respuesta de cada compuesto.
Según la gráfica, la FSH tiene una EC_{50} de 1,47 pM, el
compuesto XVI tiene una EC_{50} de 38,8 nM, el compuesto XVII
tiene una EC_{50} de 3,9 nM, y el compuesto XIX tiene una
EC_{50} de 1,12 \muM. Está dibujada la línea que mejor se
ajusta a la FSH. También se muestran los resultados del ensayo
utilizando medio solamente y forskolina. El ensayo se realizó
utilizando muestras duplicadas de cada compuesto.
Esencialmente se realizó el ensayo biológico
para la FSH en células primarias de granulosa de rata como está
descrito (Dahl et al. (1989) Methods Enzymol., 168:
414-423). Se detectó la conversión de testosterona
en estradiol en presencia de concentraciones nanomolares bajas de
FSH utilizando este ensayo. En este ensayo in vitro, se
midió la conversión de androstendiona en estrógeno por células de la
granulosa en la presencia de FSH para los compuestos XVI y XVII.
Para comparar, también se evaluó la FSH en el ensayo.
Se pusieron en placas células a 5.000, 8.000,
10.000 y 20.000/células/pocillo/200 \mul de medio GAB en placas
de cultivo de tejidos de 96 pocillos recubiertos con
poli-D-lisina. Se incubaron las
placas a 37ºC en un incubador con 5% CO_{2}/95% de aire durante 3
días. Se lavaron los cultivos antes de la estimulación con FSH o LH.
Se añadieron a los cultivos 50 \mul de concentraciones 4 x de
rhFSH, rhLH o forskolina. Para definir el intervalo de la curva de
dosis-respuesta se diluyó el rhFSH de forma que la
concentración final sobre las células estaba entre 10^{-7} a
10^{-5} M con tres dosis por logaritmo a 1, 2 y 5. Se diluyó la
forskolina de forma que la concentración final sobre las células
era 1 \muM. Se incubaron las células a 37ºC en 5% de CO_{2}. Se
recogieron los sobrenadantes de las células tres días más tarde y se
diluyeron 1:100 con medio GAB para la medida de estradiol por RIA.
Se realizó el RIA de acuerdo con las indicaciones del fabricante
excepto porque se preparó un estándar de estradiol en etanol
absoluto a 100 ng/mL, y después se diluyó adicionalmente con medio
GAB, en vez de tampón del kit. Se representó la concentración de la
hormona en el eje de las X frente a la cantidad de estradiol
producida por las células en el eje de las Y utilizando el programa
de gráficos Origin.
Como se representa en la Figura 7, los
compuestos XVI y XVII muestran incremento en la producción de
estradiol al incrementar la dosis a concentraciones entre 200 nM y
5 \muM. Por encima de esta concentración el compuesto mostró un
decremento en la producción-presumiblemente porque
esto causaba una desensibilización de los receptores de FSH a
estimulación posterior. Los resultados muestran que los compuestos
XVI y XVII estimulaban la producción de estradiol con EC_{50} de
1,4 \muM y 1,2 \muM, respectivamente. También se muestran los
resultados del ensayo utilizando medio solamente.
Claims (8)
1. Un compuesto seleccionado del grupo que
consiste en:
1-[3-(9-Etilcarbazolil)carbamoil]etilamino-N-metil-(2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida);
1-metil-1-[3-(9-etilcarbazolil)carbamoil]-etilamino-N-metil-(2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida);
1-[3-(9-Etilcarbazolil)carbamoil]isoamilamino-N-metil-(2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida);
1-[3-(9-Etilcarbazolil)carbamoil]isobutilamino-N-metil-(2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida);
1-[3-(9-Etilcarbazolil)carbamoil]feniletilamino-N-metil-(2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida);
1-[3-(9-Etilcarbazolil)carbamoil]2-hidroxietilamino-N-metil-(2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida);
1-[3-(9-Etilcarbazolil)carbamoil]metilamino-N-metil-(2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida);
1-[3-(9-Etilcarbazolil)carbamoil]metilamino-N-etil-(2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida);
y
1-Metil-1-[3-(9-etilcarbazolil)carbamoil]-etilamino-(2-oxo-6-pentil-2H-piran-3-carboxamida);
o una sal de adición del mismo
aceptable
farmacéuticamente.
2. El compuesto según la reivindicación 1
para uso como medicamento.
3. Uso de un compuesto según la
reivindicación 1 ó 2 para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de la infertilidad.
4. Uso de un compuesto según la
reivindicación 1 ó 2 para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de trastornos mediados por la FSH.
5. Una composición farmacéutica que
comprende un compuesto según la reivindicación 1 ó 2 y un vehículo,
diluyente o excipiente del mismo aceptable farmacéuticamente.
6. Una composición farmacéutica que
comprende un compuesto según la reivindicación 1 ó 2 y un vehículo,
diluyente o excipiente del mismo aceptable farmacéuticamente, en
combinación con FSH.
7. Una composición farmacéutica que
comprende un compuesto según la reivindicación 1 ó 2 y un vehículo,
diluyente o excipiente del mismo aceptable farmacéuticamente, en
combinación con citrato de Clomifeno.
8. Una composición farmacéutica que
comprende un compuesto según la reivindicación 1 ó 2 y un vehículo,
diluyente o excipiente del mismo aceptable farmacéuticamente, en
combinación con gonadotropina coriónica humana (hCG) u hormona
luteinizante de la pituitaria humana.
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